RU2596920C2 - Method of producing antigen-specific cytotoxic cells having activity against breast cancer cells - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to biotechnology, protein engineering and medicine. Described is a method of producing antigen-specific cytotoxic cells with anticancer activity against breast cancer cells. Present invention provides generation in vitro of antigen-specific clones of T-cells with activity of CD8 + T-cells and T-helpers type 1, required for formation of effective anticancer response against breast cancer cells.

EFFECT: invention can be used in medicine.

1 cl, 2 dwg, 4 tbl

Description

Изобретение относится к биотехнологии, белковой инженерии и медицине, конкретно к способу стимуляции антиген-специфических клеток с цитотоксической активностью против аутологичных клеток рака молочной железы.The invention relates to biotechnology, protein engineering and medicine, specifically to a method for stimulating antigen-specific cells with cytotoxic activity against autologous breast cancer cells.

Злокачественные опухоли молочной железы (20,1%) являются ведущей онкологической патологией у женского населения России по данным на 2009 год [29]. При сравнении данного показателя с 1999 годом к 2009 наблюдался рост заболеваемости раком молочной железы (РМЖ) на 15,9%. В возрастной группе от 30 до 59 лет злокачественные новообразования молочной железы имеют наибольший удельный вес (15,2%) при сравнении с лицами пожилого возраста, где РМЖ составляет 8,5% в структуре онкологической заболеваемости. Эти данные указывают на важнейшее социальное значение данной патологии у женщин репродуктивного возраста и раннего постменопаузального возраста. В структуре смертности женщин также наибольший удельный вес имеют злокачественные новообразования молочной железы (17,4%). В возрастной группе 30-39 лет смертность от РМЖ занимает 2 место (17,2%), уступая только смертности от рака шейки матки (23,2%). В возрастной группе 40-49 лет РМЖ выходит на первое место у женщин в структуре смертности от онкологических заболеваний (26,3%). В старших возрастных группах сохраняется ведущее место РМЖ как причины смерти: в возрасте 50-59 лет - 24,8%, в возрасте 60-69 лет - 18,7% [29]. Перечисленные данные указывают на несостоятельность современных методов диагностики, лечения и профилактики рака молочной железы. Все это делает актуальным поиск новых способов лечения, которые будут направлены как на первичный очаг онкологического процесса, так и на циркулирующие и диссеминированные опухолевые клетки, которые являются основной причиной развития метастазов и рецидивов заболевания.Malignant breast tumors (20.1%) are the leading oncological pathologies in the female population of Russia according to 2009 data [29]. When comparing this indicator with 1999, by 2009 there was an increase in the incidence of breast cancer (breast cancer) by 15.9%. In the age group from 30 to 59 years, malignant neoplasms of the mammary gland have the largest share (15.2%) when compared with the elderly, where breast cancer accounts for 8.5% in the structure of cancer incidence. These data indicate the most important social significance of this pathology in women of reproductive age and early postmenopausal age. In the structure of mortality of women, the largest share is also attributed to malignant neoplasms of the breast (17.4%). In the age group of 30-39 years, mortality from breast cancer takes 2nd place (17.2%), second only to mortality from cervical cancer (23.2%). In the age group of 40-49 years, breast cancer ranks first among women in the structure of mortality from cancer (26.3%). In older age groups, the leading place of breast cancer as a cause of death remains: at the age of 50-59 years - 24.8%, at the age of 60-69 years - 18.7% [29]. These data indicate the failure of modern methods of diagnosis, treatment and prevention of breast cancer. All this makes it relevant to search for new methods of treatment that will be directed both to the primary focus of the oncological process, and to circulating and disseminated tumor cells, which are the main cause of the development of metastases and relapses of the disease.

Клетки, связанные с врожденным и приобретенным иммунитетом, играют ведущую роль в регуляции опухолевого роста [11]. На сегодняшний день, раковый процесс связывают с хроническим воспалением из-за присутствия в микроокружении опухоли клеток врожденного иммунного ответа, которые секретируют вещества, стимулирующие ангиогенез и пролиферацию раковых клеток [5, 20]. Однако растет число фактов, указывающих на то, что у некоторых пациентов с онкопроцессом возрастает усиливается (приобретенный) иммунный ответ, специфически направленный против антигенных белков, экспрессирующихся в различных опухолях. T-клетки, которые секретируют цитокины, такие как интерферон-γ (ИФНγ), вызывают острое воспаление, которое приводит к увеличению цитотоксических T-клеток (ЦТЛ), разрушению опухолевой ткани и возможно ограничению развития или даже элиминации раковой опухоли [12]. Адаптивный T-клеточный ответ, который необходим для узнавания антигена, осуществляется как цитотоксическими CD8+ T-клетками, так и CD4+ T-клетками. CD4+ T-клетки-хелперы (Th) могут секретировать различные цитокины, участвующие в регуляции и распространении острого воспалительного ответа. В организме человека выделяют несколько фенотипов T-клеток-хелперов, отличающихся по выполняемой ими функции и секреции цитокинов: Th1 клетки секретируют цитокины, такие как ИФНγ, ФНОα и ИЛ-2, и поддерживают функционирование ЦТЛ и разрушение опухоли; Th2 клетки секретируют цитокины, такие как ИЛ-10, ИЛ-4 и ИЛ-5, и ограничивают пролиферацию ЦТЛ; Th17 клетки секретируют ИЛ-17 и действуют при аутоиммунных заболеваниях; и Трег клетки секретируют ИЛ-10 и TGF-β, которые подавляют иммунный ответ [23].Cells associated with innate and acquired immunity play a leading role in the regulation of tumor growth [11]. To date, the cancer process is associated with chronic inflammation due to the presence of an innate immune response in the tumor microenvironment, which secrete substances that stimulate the angiogenesis and proliferation of cancer cells [5, 20]. However, a growing number of facts indicate that in some patients with the oncological process, the (acquired) immune response increases, specifically directed against antigenic proteins expressed in various tumors. T cells that secrete cytokines, such as interferon-γ (IFNγ), cause acute inflammation, which leads to an increase in cytotoxic T cells (CTLs), destruction of tumor tissue and possibly limiting the development or even elimination of a cancer tumor [12]. The adaptive T-cell response, which is necessary for antigen recognition, is carried out by both cytotoxic CD8 + T cells and CD4 + T cells. Helper CD4 + T cells (Th) can secrete various cytokines involved in the regulation and spread of the acute inflammatory response. Several phenotypes of helper T cells are distinguished in the human body, differing in their function and secretion of cytokines: Th1 cells secrete cytokines, such as IFNγ, TNFα and IL-2, and support the functioning of CTLs and tumor destruction; Th2 cells secrete cytokines, such as IL-10, IL-4 and IL-5, and restrict the proliferation of CTLs; Th17 cells secrete IL-17 and act in autoimmune diseases; and Treg cells secrete IL-10 and TGF-β, which suppress the immune response [23].

Рядом авторов было показано, что в лимфатических узлах при онкопатологии, в том числе и при раке молочной железы, присутствуют инфильтрирующие T-лимфоциты и дендритные клетки (ДК), причем уменьшение количества ДК непосредственно коррелирует с увеличенным количеством метастазов в лимфатические узлы и плохим прогнозом выживания [16, 15]. Уменьшение циркулирующих T-клеток также коррелирует с плохим прогнозом выживания [4]. Все существующие доказательства показывают развитие недостаточности местного и системного иммунного ответа при прогрессировании роста опухоли молочной железы [4, 16]. Kohrt H.E. с соавторами исследовали клеточный состав дренирующих лимфатических узлов при раке молочной железы. [16]. Ими показано, что в лимфатических узлах больных РМЖ снижено содержание как CD4+, так и CD8+ T-клеток при сравнении со здоровой группой, при повышенном содержании в подмышечном лимфатическом узле (ЛУ) CD1a ДК. Содержание CD1a ДК резко снижается (больше, чем в 4 раза) при наличии метастазов в ЛУ. Снижение количества популяции CD4+ T-клеток было в 10 раз выше, чем CD8+ T-клеток в сторожевых ЛУ. Причем это снижение популяции CD4+ клеток наблюдалось не зависимо от вовлечения ЛУ в онкологический процесс. Авторами было высказано предположение, что эти изменения не являются отражением опухолевой инвазии. Таким образом, активация антиген-презентирующих клеток (а именно дендритных клеток) и дифференцировки и пролиферации T-клеток - включая ЦТЛ и Th1 клетки, стимулирующих иммунный процесс, который способствует развитию опухоли, в сторону активного (острого), способствующего разрушению опухоли, на сегодняшний день рассматривается одним из перспективных методов борьбы с опухолевой прогрессией.A number of authors have shown that in oncopathology lymph nodes, including breast cancer, there are infiltrating T-lymphocytes and dendritic cells (DC), and a decrease in the number of DCs directly correlates with an increased number of lymph node metastases and a poor prognosis of survival [16, 15]. A decrease in circulating T cells also correlates with a poor prognosis of survival [4]. All existing evidence shows the development of insufficiency of the local and systemic immune response with progression of breast tumor growth [4, 16]. Kohrt H.E. et al. studied the cellular composition of draining lymph nodes in breast cancer. [16]. They showed that in the lymph nodes of breast cancer patients, the content of both CD4 + and CD8 + T cells was reduced when compared with a healthy group, with an increased content of CD1a DC in the axillary lymph node (LN). The content of CD1a DC decreases sharply (more than 4 times) in the presence of metastases in LN. The decrease in the population of CD4 + T cells was 10 times higher than that of CD8 + T cells in sentinel lymph nodes. Moreover, this decrease in the population of CD4 + cells was observed regardless of the involvement of LU in the oncological process. The authors suggested that these changes are not a reflection of tumor invasion. Thus, the activation of antigen-presenting cells (namely dendritic cells) and the differentiation and proliferation of T cells - including CTL and Th1 cells, stimulating the immune process, which promotes the development of the tumor, towards active (acute), contributing to the destruction of the tumor, today day is considered one of the promising methods of combating tumor progression.

Среди антиген-презентирующих клеток, именно дендритные рассматриваются как наиболее мощные клетки для захвата и презентации различных видов антигенов [2]. ДК характеризуются способностью захватывать АГ, экспрессией молекул ГКНС I и II класса и молекул-костимуляторов, таких как В7-1 (CD80), В7-2 (CD86), CD40, адгезивными молекулами CD11b, CD11c и внутриклеточными адгезивными молекулами (ICAMs)-ICAM-1 (CD54), и их жизненно важной ролью в запуске иммунного ответа [27]. В последнее десятилетие интенсивно изучаются их функции и иммунотерапевтический потенциал. В зависимости от происхождения АГ (внутриклеточный или внеклеточный), его презентация может происходить в комплексе с ГКНС I или II соответственно. Однако возможен механизм кросс-презентации, когда внеклеточный АГ презентируется в комплексе с ГКНС I класса. При взаимодействии с T-клеточным рецептором, в зависимости от экспрессии I или II класса молекул ГКНС будут активироваться CD8+ или CD4+ T-клетки соответственно [1]. Взаимодействие между ДК и наивными T-клетками обеспечивается 2 основными сигналами. Первый сигнал - это уже упоминавшееся взаимодействие комплекса ГКГС-пептид с T-клеточным рецептором. Вторым сигналом является взаимодействие костимуляторных молекул, экспрессирующих на поверхности АПК, таких как В7-1 (CD80), В7-2 (CD86) и др., с костимуляторными молекулами на поверхности T-клеток, например CD28 для упоминавшихся рецепторов В7-1 и В7-2. В отсутствие костимуляторного сигнала не происходит активации T-клеток, и они становятся толерогенными или входят в состоянии анергии. Кроме того, активация T-хелперов является ключевым моментом для запуска иммунного ответа активированными АГ-специфическими эффекторными клетками и для вовлечения клеток во врожденный иммунный ответ [14].Among antigen-presenting cells, it is dendritic cells that are considered as the most powerful cells for capturing and presenting various types of antigens [2]. DCs are characterized by the ability to capture AG, the expression of GKNS molecules of class I and II and costimulatory molecules such as B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD40, adhesive molecules CD11b, CD11c and intracellular adhesive molecules (ICAMs) -ICAM -1 (CD54), and their vital role in triggering an immune response [27]. In the last decade, their functions and immunotherapeutic potential have been intensively studied. Depending on the origin of hypertension (intracellular or extracellular), its presentation can occur in combination with GKNS I or II, respectively. However, a cross-presentation mechanism is possible when extracellular hypertension is presented in combination with GKNS class I. When interacting with a T-cell receptor, depending on the expression of class I or II of GKNS molecules, CD8 + or CD4 + T-cells, respectively, will be activated [1]. The interaction between DCs and naive T cells is provided by 2 main signals. The first signal is the interaction of the HCH-peptide complex with the T-cell receptor already mentioned. The second signal is the interaction of co-stimulatory molecules expressing on the surface of the APC, such as B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), etc., with co-stimulatory molecules on the surface of T cells, for example CD28 for the mentioned receptors B7-1 and B7 -2. In the absence of a co-stimulatory signal, T-cells do not activate, and they become tolerogenic or enter a state of anergy. In addition, the activation of T-helpers is a key point for triggering an immune response by activated AH-specific effector cells and for involving cells in an innate immune response [14].

При взаимодействии ДК-T-клетки третьим сигналом, который определяет путь дифференцировки T-клеток, являются цитокины, которые содержатся в микроокружении взаимодействующих клеток. На сегодняшний день известно, что семейство интерферонов (ИФН) играет важную роль в регуляции и связывании клеток врожденного и приобретенного иммунитета и, как было недавно показано, играет облигатную (необходимую) роль в удалении опухоли [12]. Источником эндогенного ИФНγ в организме являются активированные НК, НКТ и T-клетки. Такие цитокины, как ИЛ-12 и ИЛ-18, регулируют продукцию ИФНγ как во врожденном, так и в приобретенном иммунных ответах и формируют цитотоксический тип иммунного ответа [10]. При этом ИЛ-18 сильнее, чем ИЛ-12, усиливает продукцию IFNγ T-клетками и цитотоксическими НК-клетками, а также их пролиферацию [3]. Помимо влияния на продукцию цитокина, ИЛ-12 оказывается влияние на активацию, дифференцировку и выживаемость ЦТЛ in vivo, в его присутствии значительно возрастает литическая способность CD8+ T-клеток [26]. ИЛ-12 также оказывает влияние на мобилизацию внутриклеточного кальция и дегрануляцию ЦТЛ при контакте со специфическими таргетными клетками. На мышиных моделях было показано, что продукция перфорина, порообразующего белка, не зависела от присутствия или отсутствия ИЛ-12, однако продукция гранзима В - грануло-ассоциированной сериновой протеазы, активирующая каскад каспаз внутри клетки-мишени, являющаяся инициатором апоптоза клеток - сильно зависела от добавления ИЛ-12. При этом уровень продукции гранзима В коррелировал с уровнем цитотоксического потенциала клеток [8]. Основываясь на перечисленных данных, использование таких цитокинов, как ИЛ-12 и ИЛ-18, является перспективным для культивирования клеток и стимуляции эндогенной продукции данных цитокинов с целью модуляции иммунного ответа.In the interaction of DC-T cells, the third signal that determines the pathway for T-cell differentiation is cytokines, which are contained in the microenvironment of interacting cells. Today it is known that the family of interferons (IFN) plays an important role in the regulation and binding of cells of innate and acquired immunity and, as has recently been shown, plays an obligate (necessary) role in tumor removal [12]. The source of endogenous IFNγ in the body is activated NK, tubing and T cells. Cytokines such as IL-12 and IL-18 regulate the production of IFNγ in both innate and acquired immune responses and form a cytotoxic type of immune response [10]. Moreover, IL-18 is stronger than IL-12, enhances the production of IFNγ by T cells and cytotoxic NK cells, as well as their proliferation [3]. In addition to influencing cytokine production, IL-12 also affects the activation, differentiation, and survival of CTLs in vivo; in its presence, the lytic ability of CD8 + T cells significantly increases [26]. IL-12 also affects the mobilization of intracellular calcium and CTL degranulation upon contact with specific target cells. In mouse models, it was shown that the production of perforin, a pore-forming protein, was independent of the presence or absence of IL-12, but the production of granzyme B, a granule-associated serine protease that activates the caspase cascade inside the target cell, which initiates cell apoptosis, was highly dependent on additions of IL-12. Moreover, the level of production of granzyme B correlated with the level of cytotoxic potential of cells [8]. Based on the data listed, the use of cytokines such as IL-12 and IL-18 is promising for cell culture and stimulation of the endogenous production of these cytokines in order to modulate the immune response.

Если роль ГКНС I-связанных CD8+ лимфоцитов в уничтожении опухолевого процесса давно известна, то только в последние годы наблюдается более глубокое понимание роли ГКНС II-связанных CD4+ T-клеток в противоопухолевом иммунитете. Можно выделить несколько причин для этого. Во-первых, концептуально более просто представить ЦТЛ, хорошо известные для запуска прямого киллинга клеток, пораженных вирусом, поражающим и запускающим киллинг опухолевых клеток. Во вторых, солидные опухоли редко экспрессируют молекулы HLA II класса, в отличие от молекул HLA I класса, которые делают опухолевые клетки видимыми для прямого поражения CD8+ T-клетками. И последнее, в ранних исследованиях на мышах показана более выраженная зависимость резекции опухоли от ЦТЛ, и относительная легкость получения CD8+ T-клеток из опухоли укрепила репутацию ЦТЛ как первичных эффекторов противоопухолевого иммунитета [17]. Однако постепенно накопленные знания указывают, что Th-клетки не только важны для противоопухолевой активности, но также иногда способны опосредовать резекцию опухоли без видимого участия CD8+ ЦТЛ [14, 9]. Также было показано, что Th сами непосредственно могут запускать апоптоз опухолевых клеток через Fas/FasL или TRAIL-опосредованный механизм апоптоза [25, 28]. Также Th-клетки способствуют активации ЦТЛ посредством 3 основных механизмов: во-первых, классический механизм, Th-клетки участвуют в аутокринной/паракринной секреции T-клеточного ростового фактора ИЛ-2, который в большинстве случаев требуется ЦТЛ, но который они сами не секретирую; во-вторых, это одновременный контакт 3 клеток - АПК (ДК), ЦТЛ и Th-клетки, который обеспечивает специфическую активацию Th, и они уже стимулируют повышающую регуляцию CD40L, вызывая дальнейшую активацию ДК, и уже только потом активируют ЦТЛ; и в-третьих, был определен растворимый фактор семейства ФНО, который называется TRANCE (ФНО-связанный стимулирующий активацию цитокин), который оказывается важным для CD40-независимого механизма помощи T-клеткам [17].If the role of GKNS of I-linked CD8 + lymphocytes in the destruction of the tumor process has long been known, then only in recent years there has been a deeper understanding of the role of GKNS of II-linked CD4 + T cells in antitumor immunity. There are several reasons for this. First, it is conceptually simpler to imagine CTLs that are well known for triggering direct killing of cells affected by a virus that infects and triggers the killing of tumor cells. Secondly, solid tumors rarely express class II HLA molecules, unlike class I HLA molecules, which make tumor cells visible for direct damage to CD8 + T cells. Lastly, earlier studies in mice showed a more pronounced dependence of tumor resection on CTLs, and the relative ease of obtaining CD8 + T cells from a tumor strengthened the reputation of CTLs as primary effectors of antitumor immunity [17]. However, gradually accumulated knowledge indicates that Th cells are not only important for antitumor activity, but are also sometimes able to mediate tumor resection without the visible involvement of CD8 + CTL [14, 9]. It was also shown that Th themselves can directly trigger apoptosis of tumor cells through the Fas / FasL or TRAIL-mediated apoptosis mechanism [25, 28]. Th cells also contribute to CTL activation by 3 main mechanisms: firstly, the classical mechanism, Th cells participate in the autocrine / paracrine secretion of T-cell growth factor IL-2, which in most cases requires CTL, but which they themselves do not secrete ; secondly, it is the simultaneous contact of 3 cells - APC (DC), CTL and Th cells, which provides specific activation of Th, and they already stimulate upregulation of CD40L, causing further activation of DC, and only then activate CTL; and thirdly, a soluble factor of the TNF family was identified, which is called TRANCE (TNF-linked stimulating cytokine activation), which is important for the CD40-independent mechanism of T-cell assistance [17].

Уникальная иммуномодулирующая активность ДК сделала их привлекательной моделью для иммунотерапевтической модуляции иммунного ответа как in vitro, так и с последующим возможным использованием in vivo [17]. ДК способны доставлять опухолевые АГ, полученные из различных источников, что позволяет эффективно привлекать клетки приобретенного иммунного ответа для запуска элиминации опухоли. Однако в начальных исследованиях были получены данные, указывающие на функциональную несостоятельность ДК, полученных от пациентов с онкологической патологией [22, 18]. Поэтому использование наивной популяции для модуляции противоопухолевого иммунного ответа вызывает ряд сомнений. Лучшим выходом считается получение функционально компетентных ДК из клеток-предшественников ex vivo с последующей нагрузкой их опухолевыми антигенами. В различных моделях in vitro ДК получают из прилипающей фракции мононуклеарных клеток, выделенных из цельной периферической крови. Для получения незрелых ДК, способных к захвату и презентации антигена, в среду добавляют различные цитокины, например рчГМ-КСФ и рчИЛ-4. Для созревания ДК применяют либо определенный набор цитокинов, таких как TNFα, IFNα, IL-15, IFNγ, PGE2 и т.д., либо отдельное использование какого-либо цитокина с митогенными стимулами (ЛПС, ФГА и т.д.) [2].The unique immunomodulatory activity of DCs made them an attractive model for immunotherapeutic modulation of the immune response both in vitro and with subsequent possible use in vivo [17]. DKs are capable of delivering tumor AH obtained from various sources, which makes it possible to efficiently attract cells of the acquired immune response to trigger tumor elimination. However, in initial studies, data were obtained indicating the functional failure of DC obtained from patients with oncological pathology [22, 18]. Therefore, the use of the naive population to modulate the antitumor immune response raises a number of doubts. The best way is to obtain functionally competent DCs from ex vivo progenitor cells, followed by loading them with tumor antigens. In various in vitro models, DCs are obtained from the adherent fraction of mononuclear cells isolated from whole peripheral blood. To obtain immature DCs capable of capturing and presenting antigen, various cytokines, for example rhGM-KSF and rhIL-4, are added to the medium. For DC maturation, either a specific set of cytokines, such as TNFα, IFNα, IL-15, IFNγ, PGE2, etc., or a separate use of a cytokine with mitogenic stimuli (LPS, PHA, etc.) is used [2 ].

Опухолевые клетки экспрессируют на своей поверхности антигены, которые могут быть потенциальной мишенью для запуска цитотоксического ответа. ДК способны доставлять опухолевые АГ, полученные из различных источников, что позволяет эффективно привлекать клетки приобретенного иммунного ответа для запуска элиминации опухоли. Для активации ДК могут использоваться источники опухолевых антигенов: РНК, ДНК, рекомбинантные белки, лизаты опухолевых клеток и т.д. [21]. Для рационального выбора источника опухолевого антигена для ДК необходимо учитывать ряд факторов, а именно:Tumor cells express antigens on their surface, which may be a potential target for triggering a cytotoxic response. DKs are capable of delivering tumor AH obtained from various sources, which makes it possible to efficiently attract cells of the acquired immune response to trigger tumor elimination. Sources of tumor antigens can be used to activate DC: RNA, DNA, recombinant proteins, tumor cell lysates, etc. [21]. For a rational choice of the source of tumor antigen for DC, a number of factors must be taken into account, namely:

1) определенные пептидные/ДНК/РНК молекулы несут эпитопы, специфичные к определенному HLA типу, и соответственно, их применение приводит к ограничению развития эффективного иммунного ответа в зависимости от HLA типа человека;1) certain peptide / DNA / RNA molecules carry epitopes specific for a specific HLA type, and accordingly, their use leads to a limitation of the development of an effective immune response depending on the human HLA type;

2) наличие ограниченного набора хорошо охарактеризованных опухоль-ассоциированных антигенов;2) the presence of a limited set of well-characterized tumor-associated antigens;

3) при использовании определенных пептидных/ДНК/РНК молекул происходит ограничение репертуара T-клеточных клонов и, соответственно, ограничение возможности иммунной системе развивать сильный поликлональный противоопухолевый ответ.3) when using certain peptide / DNA / RNA molecules, the repertoire of T-cell clones is limited and, accordingly, the ability of the immune system to develop a strong polyclonal antitumor response is limited.

Однако, несмотря на эти ограничения, ведутся активные исследования активации ДК с использованием плазмидных векторов, несущих ДНК/РНК опухолевого антигена или его отдельных эпитопов. Использование ДНК-конструкций позволяет прицельно модулировать иммунный ответ против опухолевых клеток, экпрессирующих определенные антигены, при этом в одну плазмиду возможно включение эпитопов из нескольких генов (в том числе отличающихся по специфичности к гаплотипу HLA), кодирующих различные антигены. После обработки в клетке осуществляется экспрессия антигенов в их нативной форме, что облегчает процессинг и презентацию их иммунной системе. Использование моноэпитопных ДНК-конструкций является наиболее специфичным методом нацеливания T-клеток против раковых клеток. Использование полиэпитопных конструкций позволяет запускать поликлональную реакцию T-клеток, обеспечивающих запуск более мощного иммунного ответа против различных раковых клеток, составляющих опухоль, а кроме того, позволяет преодолевать возможную потерю экспрессии данного эпитопа в опухолевых клетках. Дополнительное проведение HLA-типирования позволяет выбирать только те эпитопы, которые увеличивают шанс развития специфического CD8+ или CD4+ T-клеточного ответа, или обоих одновременно. Также данный способ уменьшает риск возникновения аутоиммунных реакций, т.к. используются только эпитопы опухолевого белка, исключая возможность развития перекрестной реакции на собственные ткани.However, despite these limitations, active studies of DC activation are being carried out using plasmid vectors carrying the tumor antigen DNA / RNA or its individual epitopes. The use of DNA constructs allows targeted modulation of the immune response against tumor cells expressing certain antigens, while epitopes from several genes (including those that differ in specificity for the HLA haplotype) encoding various antigens can be included in one plasmid. After processing, the expression of antigens in their native form is carried out in the cell, which facilitates the processing and presentation of their immune system. The use of monoepitope DNA constructs is the most specific method for targeting T cells against cancer cells. The use of polyepitope constructs allows triggering the polyclonal reaction of T cells, which trigger a more powerful immune response against various cancer cells that make up the tumor, and also allows overcoming the possible loss of expression of this epitope in tumor cells. Additional HLA typing allows you to select only those epitopes that increase the chance of developing a specific CD8 + or CD4 + T-cell response, or both at the same time. Also, this method reduces the risk of autoimmune reactions, because only tumor protein epitopes are used, excluding the possibility of developing a cross-reaction to their own tissues.

Известен способ, включающий получение ДК и нагрузку их полиэпитопной pVax1/pet-neu конструкцией, несущей HLA-A*0201-специфичные эпитопы белка Her2 [24]. В работе использовались мононуклеарные клетки периферической крови условно здоровых доноров. Дендритные клетки получали из прилипающей фракции МНК при добавлении в культуру 50 нг/мл гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и 0,5 нг/мл интерлейкина (ИЛ)-4. Через 7 дней 100 тыс. ДК трансфецировались 1 мкг pVax1/pet-neu с использованием трансфецирующего реагента «Effecten» (Qiagen). Трансфецированные ДК облучали и добавляли в культуру лимфоцитов (неприлипшая фракция МНК) в соотношении ДК/МНК=1:5. Далее, совместную культуру инкубировали в течение 5 дней. Далее, в течение 10 дней продолжали культивирование в присутствии ИЛ-2 (20 МЕ/мл) с заменой среды и цитокина каждые 3 дня. Для постановки цитотоксического теста клетки-мишени C1R-A2 (клеточная линия, стабильно трансфецированная геном HLA-A*0201 и неэкспрессирующая другие типы молекул HLA) метились 150 мк Ci⁵¹Cr, помещались в 96-луночные круглодонные планшеты и потом, когда необходимо, нагружались пептидом (1 мкмоль/л) в течение 90 минут. Эффекторы добавлялись к таргетным клеткам в различных соотношениях и инкубировались в течение 6 часов. После инкубации собирались супернатанты и измерялась радиоактивность на гамма счетчике. Процент специфического лизиса рассчитывался как (эксперимент спонтанный/максимум спонтанный ⁵¹Cr)×100. Исследователями было показано, что уровень ЦТЛ ответа варьировал в зависимости от донора, иммуногенности эпитопа опухоль - ассоциированного гена Her2, а также от соотношения таргетных и эффекторных клеток.A known method, including obtaining DCs and loading them with a polyepitope pVax1 / pet-neu construct carrying HLA-A * 0201-specific epitopes of Her2 protein [24]. Mononuclear cells of peripheral blood of conditionally healthy donors were used in the work. Dendritic cells were obtained from the adherent fraction of MNCs when 50 ng / ml granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and 0.5 ng / ml interleukin (IL) -4 were added to the culture. After 7 days, 100 thousand DCs were transfected with 1 μg pVax1 / pet-neu using the Effecten transfection reagent (Qiagen). Transfected DCs were irradiated and added to the lymphocyte culture (non-adherent MNC fraction) in the ratio DC / MNC = 1: 5. Next, the co-culture was incubated for 5 days. Further, cultivation was continued for 10 days in the presence of IL-2 (20 IU / ml) with medium and cytokine replacement every 3 days. For the cytotoxic test of the target cell C1R-A2 (a cell line stably transfected with the HLA-A * 0201 gene and non-expressing other types of HLA molecules) 150 μi Ci ⁵¹ Cr were labeled, placed in 96-well round-bottom plates and then, when necessary, loaded peptide (1 μmol / L) for 90 minutes. Effectors were added to target cells in various ratios and incubated for 6 hours. After incubation, supernatants were collected and radioactivity was measured on a gamma counter. The percentage of specific lysis was calculated as (spontaneous experiment / maximum spontaneous ⁵¹ Cr) × 100. The researchers showed that the level of CTL response varied depending on the donor, the immunogenicity of the tumor epitope - the associated Her2 gene, as well as on the ratio of target and effector cells.

Описанный способ получения антиген-активированных дендритных клеток достаточно длителен (12 суток), требует использования большого количества рекомбинантных цитокинов (рчГМ-КСФ, рчИЛ-4 и рчИЛ-2), что ведет к значительному удорожанию технологии, так и обладает недостаточной цитотоксической активностью.The described method for producing antigen-activated dendritic cells is quite long (12 days), requires the use of a large number of recombinant cytokines (rhGM-CSF, rhIL-4 and rhIL-2), which leads to a significant increase in the cost of the technology, and it has insufficient cytotoxic activity.

Новой задачей является создание эффективного и экономичного способа получения антигенспецифических цитотоксических лимфоцитов из мононуклеарных клеток периферической крови больных раком молочной железы, обладающих достаточной эффективностью для индукции цитотоксического ответа против аутологичных опухолевых клеток in vitro.A new task is to create an effective and economical method for producing antigen-specific cytotoxic lymphocytes from mononuclear cells of peripheral blood of patients with breast cancer, which are sufficiently effective to induce a cytotoxic response against autologous tumor cells in vitro.

Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

Из прилипающей фракции мононуклеарных клеток периферической крови человека получают последовательно незрелые и зрелые ДК с использованием рчГМ-КСФ+рчИЛ-4 и рчФНОа соответственно. Антигенную активацию зрелых ДК проводят с помощью магнитной трансфекции, используя различные полиэпитопные конструкции ["Polyepitope constructs and methods for their preparation and use", Application No.: 61/311,981, дата подачи 09.03.2010, international publication number: WO 2011/110953 A2]. Далее, неприлипшую фракцию мононуклеарных клеток периферической крови культивируют с антиген-активированными ДК в соотношении 10:1. Для улучшения модуляции специфического противоопухолевого иммунного ответа в совместную культуру МНК и ДК добавляют рчИЛ-12 и рчИЛ-18, что позволяет повысить потенциал цитотоксической активности мононуклеарных антиген-специфических клеток, обуславливая цитотоксическую направленность T-клеток при их пролиферации и дифференцировки в эффекторные клетки.Consecutively immature and mature DCs are obtained from the adherent fraction of mononuclear cells of human peripheral blood using rhGM-CSF + rhIL-4 and rhFNOa, respectively. Antigenic activation of mature DCs is carried out by magnetic transfection using various polyepitope constructs ["Polyepitope constructs and methods for their preparation and use", Application No .: 61 / 311,981, filing date 09.03.2010, international publication number: WO 2011/110953 A2 ]. Further, the non-adherent fraction of peripheral blood mononuclear cells was cultured with antigen-activated DC in a ratio of 10: 1. To improve the modulation of a specific antitumor immune response, rhIL-12 and rhIL-18 are added to the co-culture of MNCs and DCs, which increases the potential of the cytotoxic activity of mononuclear antigen-specific cells, causing the cytotoxic orientation of T cells during their proliferation and differentiation into effector cells.

Принципиальным отличием разработанного способа от прототипа является:The fundamental difference between the developed method and the prototype is:

1. Использование рчФНОа для созревания культуры дендритных клеток, что позволяет сократить процесс созревания ДК до 4-5 суток.1. The use of rhFNOa for maturation of a dendritic cell culture, which reduces the maturation of DCs to 4-5 days.

2. Использование рчИЛ-12 и рчИЛ-18 при сокультивировании ДК и МНК, что повышает эффективность стимуляции и направленную дифференцировку наивных T-клеток в T-хелперы 1 типа,2. The use of rchIL-12 and rchIL-18 in the co-cultivation of DCs and MNCs, which increases the efficiency of stimulation and directed differentiation of naive T cells into type 1 T-helpers,

3. Применение протоколов активации и созревания ДК, включающих использование полиэпитопных моно- или полииммунногенных конструкций, что активирует ДК против наиболее иммуногенных эпитопов основных опухоль-ассоциированных антигенов РМЖ, тем самым увеличивая специфический цитотоксический ответ, предупреждая возможное развитие цитотоксических процессов против собственных клеток организма, неэкспрессирующих данные АГ, а также сокращает стадию получения зрелых антиген-активированных ДК до 4-5 суток.3. The use of activation and maturation protocols for DCs, including the use of polyepitope mono- or polyimmunogenic constructs, which activates DCs against the most immunogenic epitopes of the main tumor-associated BC antigens, thereby increasing the specific cytotoxic response, preventing the possible development of cytotoxic processes against the body’s own cells that are not expressing AG data, and also reduces the stage of obtaining mature antigen-activated DCs to 4-5 days.

Соответственно, настоящее изобретение относится к способу получения антиген-специфических цитотоксических клеток, обладающих противоопухолевой активностью против клеток рака молочной железы, включающий следующие стадии:Accordingly, the present invention relates to a method for producing antigen-specific cytotoxic cells having antitumor activity against breast cancer cells, comprising the following steps:

а) выделение мононуклеарных клеток (МНК) из периферической крови пациента;a) the selection of mononuclear cells (MNCs) from the peripheral blood of the patient;

б) культивирование МНК с разделением клеток на прилипающую и неприлипающую фракции;b) the cultivation of MNCs with the separation of cells into adherent and non-adherent fractions;

в) выращивание прилипающей фракции МНК в присутствии ростовых факторов с получением зрелых дендритных клеток (ДК);c) growing the adherent fraction of MNCs in the presence of growth factors to obtain mature dendritic cells (DC);

г) трансфекция зрелых ДК экспрессионными плазмидами, содержащими ДНК-вакцинными конструкциями, кодирующими универсальные и HLA-A*0201-специфичные эпитопы основных опухоль-ассоциированных антигенов, узнаваемые цитотоксическими T-лимфоцитами (ЦТЛ) и T-клетками-хелперами (Th);d) transfection of mature DCs with expression plasmids containing DNA vaccine constructs encoding universal and HLA-A * 0201-specific epitopes of the main tumor-associated antigens recognized by cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) and helper T-cells (Th);

д) совместное культивирование зрелых ДК, полученных на стадии г), и неприлипающей фракции МНК в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-12 и рекомбинантного человеческого интерлейкина-18.e) co-cultivation of mature DCs obtained in step d) and a non-adherent MNC fraction in the presence of recombinant human interleukin-12 and recombinant human interleukin-18.

В предпочтительном варианте реализации в качестве ростовых факторов при выращивании прилипающей фракции МНК используют гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) человека и интерлейкин-4 (ИЛ-4) человека.In a preferred embodiment, human growth factors and human interleukin-4 (IL-4) are used as growth factors in the growth of the adherent fraction of MNCs using human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF).

Предлагаемое изобретение повышает эффективность генерации цитотоксических клеток, а также позволяет сократить сроки сокультивирования ДК и МНК, что в итоге приводит к снижению стоимости способа.The present invention improves the efficiency of generation of cytotoxic cells, and also allows to reduce the time of co-cultivation of DCs and MNCs, which ultimately leads to lower costs of the method.

Техническим результатом изобретения является генерация in vitro антиген-специфических клонов T-клеток с активностью CD8+ T-клеток и T-хелперов 1 типа, необходимых для формирования эффективного противоопухолевого ответа против клеток рака молочной железы.The technical result of the invention is the generation of in vitro antigen-specific T-cell clones with the activity of CD8 + T-cells and type 1 T-helpers necessary for the formation of an effective antitumor response against breast cancer cells.

Краткое описание графических материалов.A brief description of the graphic materials.

Фиг.1 - Экспрессия перфорина в совместной культуре МНК больных раком молочной железы и аутологичных трансфецированных ДК. Результаты представлены в виде среднего и ошибки среднего;Figure 1 - Expression of perforin in a joint culture of MNCs in patients with breast cancer and autologous transfected DC. Results are presented as mean and mean error;

Фиг.2 - Продукция ИФН-гамма в совместной культуре МНК больных раком молочной железы и ДК, активированных лизатом аутологичных опухолевых клеток ДКFigure 2 - Production of IFN-gamma in a joint culture of MNCs of patients with breast cancer and DC, activated by a lysate of autologous tumor cells DC

Примеры осуществления изобретенияExamples of carrying out the invention

Выделенная из периферической крови больных раком молочной железы прилипающая фракция мононуклеарных клеток культивируется в концентрации 1 млн/мл в полной среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES, 5×10^-5 мМ 2-меркаптоэтанола, 80 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл ампициллина в атмосфере 5% CO₂ при 37°C с добавлением рчГМ-КСФ (50 нг/мл) и рчИЛ-4 (100 нг/мл). Через 96 часа культивирования для созревания незрелых дендритных клеток в культуру вносится рчФНО-α в дозе 25 нг/мл. Через 24 часа после добавления ФНО-α проводится магнитная трансфекция полученных зрелых ДК различными полиэпитопными конструкциями, универсальной или HLA-А*0201-специфичной ["Polyepitope constructs and methods for their preparation and use", Application No.: 61/311,981, дата подачи 09.03.2010, international publication number: WO 2011/110953 A2], с использованием реагентов коммерческого набора компании «Promokine» согласно инструкции производителя.The adherent fraction of mononuclear cells isolated from the peripheral blood of breast cancer patients is cultured at a concentration of 1 million / ml in complete medium containing 10% fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 5 × 10 ^-5 mM 2-mercaptoethanol, 80 μg / ml gentamicin, 100 μg / ml ampicillin in an atmosphere of 5% CO ₂ at 37 ° C with the addition of rhGM-CSF (50 ng / ml) and rhIL-4 (100 ng / ml). After 96 hours of cultivation, rhFNO-α at a dose of 25 ng / ml is introduced into the culture to mature immature dendritic cells. 24 hours after the addition of TNF-α, magnetic transfection of the obtained mature DCs with various polyepitope constructs, universal or HLA-A * 0201-specific, is carried out ["Polyepitope constructs and methods for their preparation and use", Application No .: 61 / 311.981, filing date 03/09/2010, international publication number: WO 2011/110953 A2], using reagents from the Promokine commercial kit according to the manufacturer's instructions.

Таблица 1Table 1 Краткое описание основных ДНК-конструкций, содержащих эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов при раке молочной железы.A brief description of the main DNA constructs containing epitopes of tumor-associated antigens in breast cancer. ПлазмидаPlasmid Краткое описаниеShort description Плазмида UPlasmid U Универсальная конструкция содержит набор эпитопов белка Her2/neu, узнаваемых ЦТЛ и Тх и специфичных широкому спектру наиболее распространенных гаплотипов человека.The universal design contains a set of epitopes of the Her2 / neu protein, recognizable by CTL and Tx and specific to a wide range of the most common human haplotypes. Плазмида APlasmid A HLA-A*0201-специфическая конструкция содержит HLA-A*0201-специфичные эпитопы основных опухоль-ассоциированных антигенов для стимуляции высокоэффективных специфических ЦТЛ и Тх.The HLA-A * 0201-specific construct contains HLA-A * 0201-specific epitopes of the main tumor-associated antigens to stimulate highly effective specific CTLs and Tx. Плазмида p5Plasmid p5 Нативный вектор pDNAVACCultra 5 не содержит вставок иммуногенных пептидов.The native pDNAVACCultra 5 vector does not contain immunogenic peptide inserts.

Использованные в экспериментах плазмиды имели следующие последовательности:The plasmids used in the experiments had the following sequences:

Плазмида U:Plasmid U:

Плазмида A:Plasmid A:

Полученные дендритные клетки культивируются с неприлипшей фракцией мононуклеарных клеток в соотношении 1:10 с добавлением рчИЛ-12 в дозе 10 нг/мл и рчИЛ-18 в дозе 100 нг/мл в течение 72 часов.The obtained dendritic cells were cultured with a non-adherent fraction of mononuclear cells in a ratio of 1:10 with the addition of rhIL-12 at a dose of 10 ng / ml and rhIL-18 at a dose of 100 ng / ml for 72 hours.

Способность полученных трансфецированных плазмидами ДК стимулировать прямую цитотоксическую активность против опухолевых клеток, как аутологичных, так и специфической линии, оценивалась по уровню высвобождения внутриклеточного фермента (лактатдегидрогеназы) с помощью коммерческого набора фирмы «Promega» согласно протоколу производителя. Если коротко, то для праймирования опухолевых антигенов полученные ДК, трансфецированные плазмидами, совместно культивировали с неприлипшей фракцией МНК в соотношении 1:10. Также оценивался цитотоксический ответ МНК в зависимости от добавления в культуру рчИЛ-18 и рчИЛ-12. Во все группы через 48 часов сокультивирования вносились аутологичные опухолевые клетки. Показано достоверное повышение значения цитотоксичности, что служит показателем активации противоопухолевых цитотоксических клеток, необходимых для уничтожения опухолевых клеток (табл.2, 3).The ability of the obtained plasmid transfected DCs to stimulate direct cytotoxic activity against tumor cells, both autologous and a specific line, was assessed by the level of release of the intracellular enzyme (lactate dehydrogenase) using a commercial Promega kit according to the manufacturer's protocol. Briefly, to prime tumor antigens, the obtained DCs transfected with plasmids were jointly cultivated with a non-adherent fraction of MNCs in a ratio of 1:10. The cytotoxic response of MNCs was also evaluated depending on the addition of rhIL-18 and rhIL-12 to the culture. Autologous tumor cells were introduced into all groups after 48 hours of co-cultivation. A significant increase in the value of cytotoxicity was shown, which serves as an indicator of the activation of antitumor cytotoxic cells necessary for the destruction of tumor cells (Tables 2, 3).

При сравнении способности ДК, трансфецированных различными вариантами плазмид (универсальной и HLA-A*0201-специфической), праймировать МНК и, соответственно, стимулировать цитотоксическую активность МНК, были получены результаты, показывающие эффективность применения данного протокола для получения функционально зрелых антиген-нагруженных ДК (табл.2). А именно: аллельспецифическая конструкция, содержащая HLA-A*0201-специфичные ЦТЛ и Тх пептидные эпитопы различных опухоль-ассоциированных антигенов рака молочной железы, достоверно выше стимулирует цитотоксическую активность прилипшей фракции МНК при сравнении с группами контроля (МНК и МНК+ДК0). Добавление рчИЛ-12 и рчИЛ-18 статистически достоверно увеличивает цитотоксический потенциал ДК, трансфецированных как универсальной плазмидой, так и аллель-специфической, по сравнению со всеми группами контроля (МНК+рчИЛ-12+рчИЛ18, МНК+ДК0+рчИЛ-12+рчИЛ18, МНК+ДКр5+рчИЛ-12+рчИЛ-18) и спонтанными группами антиген-активированных ДК.When comparing the ability of DCs transfected with different variants of plasmids (universal and HLA-A * 0201-specific) to prime MNCs and, accordingly, stimulate the cytotoxic activity of MNCs, results were obtained that show the effectiveness of using this protocol to obtain functionally mature antigen-loaded DCs ( table 2). Namely: an allele-specific construct containing HLA-A * 0201-specific CTLs and Tx peptide epitopes of various tumor-associated breast cancer antigens significantly higher stimulates the cytotoxic activity of the adherent MNC fraction when compared with control groups (MNC and MNK + DK0). The addition of rhIL-12 and rhIL-18 statistically significantly increases the cytotoxic potential of DCs transfected with both a universal plasmid and allele-specific compared to all control groups (MNK + rchIL-12 + rchIL18, MNK + DK0 + rchIL-12 + rchIL18 , MNC + DCR5 + rchIL-12 + rchIL-18) and spontaneous groups of antigen-activated DC.

На основании полученных результатов можно сделать вывод, подтверждающий эффективность применения данного протокола для получения зрелых дендритных клеток, способных стимулировать цитотоксический потенциал МНК против аутологичных опухолевых клеток. Добавление в совместную культуру МНК и антиген-активированных ДК рчИЛ-12 и рчИЛ-18 является эффективным способом усиления генерации специфических цитотоксических клеток мононуклеарного происхождения.Based on the results obtained, a conclusion can be drawn confirming the effectiveness of the use of this protocol for the production of mature dendritic cells capable of stimulating the cytotoxic potential of MNCs against autologous tumor cells. Adding rhIL-12 and rhIL-18 antigen-activated DCs to the co-culture of MNCs is an effective way of enhancing the generation of specific cytotoxic cells of mononuclear origin.

При сравнении цитотоксического ответа МНК, праймированных дендритными клетками, трансфецированными универсальной или HLA-A*0201-специфичной плазмидой против аутологичных опухолевых клеток получены статистически достоверные различия при дополнительной стимуляции цитокинами рчИЛ-12 и рчИЛ-18 (табл.3).When comparing the cytotoxic response of MNCs primed with dendritic cells transfected with a universal or HLA-A * 0201-specific plasmid against autologous tumor cells, statistically significant differences were obtained with additional cytokine stimulation of rhIL-12 and rhIL-18 (Table 3).

Таблица 3Table 3 Сравнение цитотоксического ответа неприлипшей фракции МНК против аутологичных опухолевых клеток (N=40). Данные представлены в виде среднего и ошибки среднего.Comparison of the cytotoxic response of a non-adherent MNC fraction against autologous tumor cells (N = 40). Data are presented as mean and mean error. Группы антиген-активированных ДКGroups of antigen-activated DC Уровень цитотоксического ответа МНК против аутологичных опухолевых клетокThe level of MNC cytotoxic response against autologous tumor cells МКН+ДК U+рчИЛ-12+рчИЛ-18MKN + DC U + rchIL-12 + rchIL-18 41,06±4,0641.06 ± 4.06 МКН+ДК A+рчИЛ-12+рчИЛ-18MKN + DC A + rchIL-12 + rchIL-18 45,66±4,2445.66 ± 4.24 Примечание:Note: МНК+ДК(U) - совместная культура МНК и ДК, трансфецированных универсальной плазмидой U;MNC + DC (U) - a joint culture of MNCs and DCs transfected with universal plasmid U; МНК+ДК(A) - совместная культура МНК и ДК, трансфецированных плазмидой A, специфичной для гаплотипа HLA-A*0201;MNC + DC (A) - a joint culture of MNCs and DCs transfected with plasmid A specific for the HLA-A * 0201 haplotype; +рчИЛ-12+рчИЛ-18 - сокультивирование МНК и ДК при добавлении рчИЛ12 и рчИЛ-18+ rchIL-12 + rchIL-18 - co-cultivation of MNCs and DCs with the addition of rchIL12 and rchIL-18

Таким образом, в результате проведенных исследований разработан способ генерации противоопухолевых цитотоксических клеток с помощью антиген-активированных аутологичных дендритных клеток и рчИЛ-12 и рчИЛ-18 in vitro.Thus, as a result of the studies, a method for generating antitumor cytotoxic cells using antigen-activated autologous dendritic cells and rhIL-12 and rhIL-18 in vitro was developed.

Существуют данные, согласно которым пептиды, представляемые с помощью ДК, могут стимулировать CD8+ T-клеточный ответ, ограниченный молекулами HLA I класса и HLA-A2. Для этого группа больных РМЖ делилась в зависимости от HLA гаплотипа. В каждой отдельной выборке пациентов оценивался цитотоксический потенциал МНК, активированных ДК, трансфецированными плазмидами (универсальной и несущей HLA-A*0201-специфические эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов). Результаты показаны в табл.4.There is evidence that peptides presented by DC can stimulate the CD8 + T cell response, limited to HLA class I and HLA-A2 molecules. For this, a group of breast cancer patients was divided depending on the HLA haplotype. In each individual patient sample, the cytotoxic potential of MNCs activated by DCs transfected with plasmids (universal and HLA-A * 0201-specific tumor-associated antigen epitopes) was evaluated. The results are shown in table 4.

Полученные данные показывают, что в группе HLA-A*0201-позитивных больных ДК, нагруженные специфической HLA-A*0201-связанной плазмидой, достоверно выше стимулируют цитотоксический ответ МНК против аутологичных опухолевых клеток, как в сравнении с другими контрольными группами (МНК, ДК0, ДКр5), в спонтанных культурах и при стимуляции цитокинами (рчИЛ-12, рчИЛ-18), а также достоверно выше модулируют цитотоксический ответ по сравнению с ДК, нагруженными плазмидами, несущие универсальные эпитопы ОАА, независимо от гаплотипа HLA-A*0201. В группе HLA-A*0201-негативных больных РМЖ только в стимулированных цитокинами группах сокультивируемых МНК и ДК, трансфецированных универсальной и специфической плазмидами, получены статистически достоверные различия со всеми группами контроля. В спонтанных группах, только ДК, трансфецированные плазмидой, несущей универсальные эпитопы, показана достоверно лучшая стимуляция цитотоксической активности неприлипшей фракции мононуклеарных клеток по сравнению с группами МНК и ДК0.The data obtained show that in the group of HLA-A * 0201-positive patients, DC loaded with a specific HLA-A * 0201-linked plasmid significantly higher stimulate the cytotoxic response of MNCs against autologous tumor cells, as compared to other control groups (MNC, DK0 , DCr5), in spontaneous cultures and when stimulated with cytokines (rchIL-12, rchIL-18), and also significantly higher modulate the cytotoxic response compared to DC loaded with plasmids carrying universal OAA epitopes, regardless of the HLA-A * 0201 haplotype. In the group of HLA-A * 0201-negative breast cancer patients only in cytokine-stimulated groups of co-cultured MNCs and DCs transfected with universal and specific plasmids, statistically significant differences were obtained with all control groups. In spontaneous groups, only DCs transfected with a plasmid carrying universal epitopes showed significantly better stimulation of the cytotoxic activity of the non-adherent fraction of mononuclear cells compared to the MNC and DK0 groups.

Исследования возможности модуляции цитотоксического ответа мононуклеарных клеток против аутологичных опухолевых клеток у больных раком молочной железы, несущих разные аллели HLA, показали, что стимулирующая активность ДК, трансфецированных универсальной плазмидой (несет неспецифические по HLA-A*0201 эпитопы пептидов), лучше проявляется в группе HLA-A*0201-негативных пациентов. Для ДК, трансфецированных аллель-специфической плазмидой, стимулирующая активность ДК показана достоверно выше в группе больных, несущих аллель HLA-A*0201.Studies on the possibility of modulating the cytotoxic response of mononuclear cells against autologous tumor cells in breast cancer patients carrying different HLA alleles showed that the stimulating activity of DC transfected with a universal plasmid (carries non-specific for HLA-A * 0201 peptide epitopes) is better manifested in the HLA group -A * 0201-negative patients. For DCs transfected with an allele-specific plasmid, the stimulating activity of DCs is shown to be significantly higher in the group of patients carrying the HLA-A * 0201 allele.

Цитотоксические CD8+ T-клетки осуществляют свою активность против инфицированных или измененных собственных клеток через дегрануляцию и высвобождение особых литических молекул. Основными, среди них, являются перфорин и гранзим B. Вкратце, при взаимодействии цитотоксической и опухолевой клетки происходит узнавание последней через комплексы ГКНС I класса-пептид, активация внутриклеточных цитотоксических гранул и высвобождение ферментов в область межклеточного взаимодействия. Перфорин является основным порообразующим белком, который при полимеризации образует «туннели» в таргетной клетке, через которые основной литический компонент данной системы - гранзим B - проникает внутрь клетки и запускает внутриклеточный каскад каспаз, приводящий в итоге к апоптозу таргетной клетки. Существуют данные, указывающие, что отсутствие белка перфорина делает невозможным проникновение гранзима В внутрь клетки и, соответственно, удаление поврежденных или измененных клеток [7, 30].Cytotoxic CD8 + T cells carry out their activity against infected or altered own cells through degranulation and release of specific lytic molecules. The main ones, among them, are perforin and granzyme B. In short, when the cytotoxic and tumor cells interact, the latter is recognized through GKNS complexes of class I-peptide, activation of intracellular cytotoxic granules and the release of enzymes in the region of intercellular interaction. Perforin is the main pore-forming protein that forms “tunnels” in the target cell during polymerization, through which the main lytic component of this system — granzyme B — penetrates the cell and triggers the intracellular cascade of caspases, which ultimately leads to apoptosis of the target cell. There is evidence that the absence of perforin protein makes it impossible for granzyme B to enter the cell and, accordingly, remove damaged or altered cells [7, 30].

Помимо CD8+ T-клеток, в запуске цитотоксического ответа принимают участие CD4+ T хелперы 1 типа. Помимо опосредующего влияния на функцию CD8+ T-клеток, они способны продуцировать цитокин ИФНγ, необходимый для элиминации опухоли.In addition to CD8 + T cells, type 1 CD4 + T helpers are involved in triggering the cytotoxic response. In addition to mediating the function of CD8 + T cells, they are capable of producing the cytokine IFNγ, which is necessary for the elimination of the tumor.

Для оценки потенциальной цитотоксической активности мононуклеарных клеток, больных раком молочной железы, культивированных с антиген-стимулированными дендритными клетками, определяли содержание внутриклеточного мономерного белка перфорина и продукцию ИФНγ (фиг.1, 2). Для этого неприлипшая фракция МНК сокультивировалась с ДК, трансфецированными различными вариантами плазмид в течение 96 часов. Для оценки потенциальной антиген-активированной продукции перфорина и иммунорегуляторного цитокина ИФНγ через 48 часов после начала сокультивирования в часть культур клеток добавлялись лизат аутологичных опухолевых клеток и иммунорегулирующие цитокины (рчИЛ-12 и рчИЛ-18). Таким образом, в ходе культивирования МНК дважды «встречались» с опухолевыми антигенами: первый раз, при представлении им опухолевого антигена ДК, трансфецированными плазмидами, несущими иммуногенные эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов, и второй раз - при повторном добавлении лизата аутологичных опухолевых клеток в совместную культуру МНК и ДК. Результате показаны на фиг.1.To assess the potential cytotoxic activity of mononuclear cells with breast cancer cultured with antigen-stimulated dendritic cells, the content of intracellular monomer protein perforin and IFNγ production were determined (Figs. 1, 2). For this, the non-adherent MNC fraction was co-cultured with DC transfected with various plasmid variants for 96 hours. To assess the potential antigen-activated production of perforin and the immunoregulatory cytokine IFNγ, autologous tumor cell lysate and immunoregulatory cytokines (rhIL-12 and rhIL-18) were added to some cell cultures 48 hours after the start of co-cultivation. Thus, during the cultivation, MNCs twice “met” with tumor antigens: the first time, when they presented the tumor antigen of DC, transfected with plasmids carrying immunogenic epitopes of tumor-associated antigens, and the second time, when lysate of autologous tumor cells was added again to the joint culture OLS and DC. The result is shown in figure 1.

При исследовании перфорин-продуцирующей способности совместной культуры МНК и антиген-активированных ДК не получено достоверных различий между спонтанными и стимулированными группами клеток. Во всех группах отмечено достоверное увеличение стимуляции внутриклеточного образования белка перфорина в ответ на сокультивирование МНК и ДК, трансфецированных аллель-специфическими плазмидами, а также в ответ на сокультивирование МНК и ДК, трансфецированных универсальной плазмидой при всех стимуляциях, кроме изолированного использования рчИЛ-12 и рчИЛ-18.When studying the perforin-producing ability of a joint culture of MNCs and antigen-activated DCs, no significant differences were obtained between spontaneous and stimulated cell groups. All groups showed a significant increase in the stimulation of the intracellular formation of perforin protein in response to the co-cultivation of MNCs and DCs transfected with allele-specific plasmids, as well as in response to the co-cultivation of MNCs and DCs transfected with a universal plasmid during all stimulations, except for the isolated use of rhIL-12 and rhIL -eighteen.

Таким образом, совместное культивирование зрелых аутологичных антиген-активированных дендритных клеток и неприлипающей фракции мононуклеарных клеток совместно с рчИЛ-12 и рчИЛ-18, при повторном добавлении лизата или без него, приводит к достоверному повышению содержания перфорин-позитивных клеток с потенциальной цитотоксической активностью.Thus, co-cultivation of mature autologous antigen-activated dendritic cells and a non-adherent fraction of mononuclear cells together with rchIL-12 and rchIL-18, with or without lysate re-addition, leads to a significant increase in the content of perforin-positive cells with potential cytotoxic activity.

Эти данные показаны на фиг. 2.These data are shown in FIG. 2.

Под действием аутологичных ДК, трансфецированных различными типами плазмид, получено статистически достоверное увеличение продукции иммунорегуляторного цитокина ИФНγ по сравнению с нативной популяцией МНК по всем группам стимуляций. Повторное добавление лизата не оказывает достоверного влияния на продукцию цитокина, а добавление рчИЛ-12 и рчИЛ-18 статистически достоверно повышает продукцию ИФНγ по сравнению со спонтанной и стимулированной только лизатом группами. В стимулированной цитокинами группе показано статистически достоверное влияние ДК, трансфецированных универсальной плазмидой, на продукцию ИФНγ при сравнении как с контрольными группами (МНК и ДК0), так и с ДК, трансфецированными HLA-A*0201-специфической плазмидой.Under the influence of autologous DC transfected with various types of plasmids, a statistically significant increase in the production of immunoregulatory cytokine IFNγ was obtained compared with the native population of MNCs in all stimulation groups. Repeated addition of the lysate does not have a significant effect on cytokine production, and the addition of rchIL-12 and rchIL-18 statistically significantly increases the production of IFNγ compared to spontaneous and stimulated only by the lysate groups. The cytokine-stimulated group showed a statistically significant effect of DCs transfected with a universal plasmid on IFNγ production when compared with both control groups (MNCs and DC0) and DCs transfected with an HLA-A * 0201-specific plasmid.

Полученные данные по продукции иммунорегуляторного цитокина ИФНγ подтверждают результаты цитотоксического теста о возможности модуляции иммунного ответа с помощью разработанного протокола в сторону Т-хелпер 1 го типа.The obtained data on the production of immunoregulatory cytokine IFNγ confirm the results of the cytotoxic test about the possibility of modulating the immune response using the developed protocol in the direction of type 1 T-helper.

Источники информацииInformation sources

Все перечисленные ниже источники полностью включены в настоящее описание путем ссылки.All of the following sources are fully incorporated into this description by reference.

1. Ackerman A.L. and Cresswell P. Cellular mechanisms governing cross-presentation of exogenous antigens. // Nat Immunol. - 2004. - Vol.5 - p.678-684.1. Ackerman A.L. and Cresswell P. Cellular mechanisms governing cross-presentation of exogenous antigens. // Nat Immunol. - 2004 .-- Vol.5 - p. 678-684.

2. Banchereau J. and Palucka A.K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. // Nat Rev Immunol. - 2005. - Vol.5. - p.296-306.2. Banchereau J. and Palucka A.K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. // Nat Rev Immunol. - 2005 .-- Vol.5. - p. 296-306.

3. Barbulescu K, Becker C, Schlaak JF, et al. IL-12 and IL-18 differentially regulate the transcriptional activity of the human IFN-gamma promoter in primary CD4+ T lymphocytes. // J Immunol. - 1998. - №160. - P.3642-3647.3. Barbulescu K, Becker C, Schlaak JF, et al. IL-12 and IL-18 differentially regulate the transcriptional activity of the human IFN-gamma promoter in primary CD4 + T lymphocytes. // J Immunol. - 1998. - No. 160. - P.3642-3647.

4. Blake-Mortimer JS, Sephton SE, Carlson RW, Stites D, Spiegel D Cytotoxic T lymphocyte count and survival time in women with metastatic breast cancer. // Breast J. - 2004. - Vol.10, - p.195-199.4. Blake-Mortimer JS, Sephton SE, Carlson RW, Stites D, Spiegel D Cytotoxic T lymphocyte count and survival time in women with metastatic breast cancer. // Breast J. - 2004. - Vol. 10, - p. 195-199.

5. Coussens L.M. and Werb Z. Inflammation and cancer. // Nature. - 2002. - Vol.420 (6917). - p.860-867.5. Coussens L.M. and Werb Z. Inflammation and cancer. // Nature. - 2002 .-- Vol. 420 (6917). - p. 860-867.

6. Coventry BJ, Morton J. CD1a-positive infiltrating-dendritic cell density and 5-year survival from human breast cancer. // Br J Cancer. - 2003. - Vol.89. - p.533-538.6. Coventry BJ, Morton J. CD1a-positive infiltrating-dendritic cell density and 5-year survival from human breast cancer. // Br J Cancer. - 2003. - Vol. 89. - p. 543-538.

7. Cullen SP, Brunet M, Martin SJ Granzymes in cancer and immunity. // Cell Death and Differentiation. - 2010. - №17. - P.616-623.7. Cullen SP, Brunet M, Martin SJ Granzymes in cancer and immunity. // Cell Death and Differentiation. - 2010. - No. 17. - P.616-623.

8. Curtsinger JM, Gerner MY, Lins DC, Mescher MF. Signal 3 availability limets the CD8 T cell response to a solid tumor. // J Immunol. - 2007. - Vol.178. - p.6752-6760.8. Curtsinger JM, Gerner MY, Lins DC, Mescher MF. Signal 3 availability limets the CD8 T cell response to a solid tumor. // J Immunol. - 2007. - Vol. 178. - p. 6752-6760.

9. Daniel D, et al. CD4 T cell-mediated antigen-specific immunotherapy in a mouse model of cervical cancer. // Cancer Res. - 2005. - Vol.65 - p.2018-2025.9. Daniel D, et al. CD4 T cell-mediated antigen-specific immunotherapy in a mouse model of cervical cancer. // Cancer Res. - 2005. - Vol.65 - p.2018-2025.

10. De Jong E.C., Smits H.H., Kapsenberg M.L. Dendritic cell-mediated T cell polarization. // Springer Semin Immun. - 2004. - №26. - P.289-307.10. De Jong E.C., Smits H.H., Kapsenberg M.L. Dendritic cell-mediated T cell polarization. // Springer Semin Immun. - 2004. - No. 26. - P.289-307.

11. Disis M.L. Immune regulation of cancer. // J Clin Oncol. - 2010. - Vol.28. - p.4531-4538.11. Disis M.L. Immune regulation of cancer. // J Clin Oncol. - 2010 .-- Vol. 28. - p. 4531-4538.

12. Dunn G.P., Koebel C.M. and Schreiber R.D. Interferons, immunity and cancer immunoediting. // Nat Rev Immunol. - 2006. - Vol.6 (11). - p.836-848.12. Dunn G.P., Koebel C.M. and Schreiber R. D. Interferons, immunity and cancer immunoediting. // Nat Rev Immunol. - 2006 .-- Vol.6 (11). - p. 836-848.

13. Georgiannos SN, Renaut A, Goode AW, Sheaff M. The immunophenotype and activation status of the lymphocytic infiltrate in human breast cancers, the role of the major histocompatibility complex in cell-mediated immune mechanisms, and their association with prognostic indicators. // Surgery. - 2003. - Vol.134. - p.827-834.13. Georgiannos SN, Renaut A, Goode AW, Sheaff M. The immunophenotype and activation status of the lymphocytic infiltrate in human breast cancers, the role of the major histocompatibility complex in cell-mediated immune mechanisms, and their association with prognostic indicators. // Surgery. - 2003 .-- Vol.134. - p. 827-834.

14. Hung K., Hayashi R., Lafond-Walker A., Lowenstein C., Pardoll D., Levitsky H. The Central Role of CD4+ T Cells in the Antitumor Immune Response. // J Exp Med. - 1998. - Vol.188 (12). - 2357-2368.14. Hung K., Hayashi R., Lafond-Walker A., Lowenstein C., Pardoll D., Levitsky H. The Central Role of CD4 + T Cells in the Antitumor Immune Response. // J Exp Med. - 1998 .-- Vol. 188 (12). - 2357-2368.

15. Iwamoto M, Shinohara H, Miyamoto A, Okuzawa M, Mabuchi H, et al. Prognostic value of tumor-infiltrating dendritic cells expressing CD83 in human breast carcinomas. // Int J Cancer. - 2003. - Vol.104. - p.92-97.15. Iwamoto M, Shinohara H, Miyamoto A, Okuzawa M, Mabuchi H, et al. Prognostic value of tumor-infiltrating dendritic cells expressing CD83 in human breast carcinomas. // Int J Cancer. - 2003 .-- Vol.104. - p. 92-97.

16. Kohrt HE, Nouri N., Nowels K., Johnson D., Holmes S., Lee P.P. Profile of immune cells in axillary lymph nodes predicts disease-free survival in breast cancer. // PLoS Med. - 2005. - Vol.2 (e284). - p.904-919.16. Kohrt HE, Nouri N., Nowels K., Johnson D., Holmes S., Lee P.P. Profile of immune cells in axillary lymph nodes predicts disease-free survival in breast cancer. // PLoS Med. - 2005 .-- Vol.2 (e284). - p.904-919.

17. Koski G.K., Cohen P.A., Roses R.E., Xu S., Czerniecki B.J. Reengineering dendritic cell-based anti-cancer vaccines. // Immunol Rev. - 2008. - Vol.222. - p.256-276.17. Koski G.K., Cohen P.A., Roses R.E., Xu S., Czerniecki B.J. Reengineering dendritic cell-based anti-cancer vaccines. // Immunol Rev. - 2008 .-- Vol.222. - p. 256-276.

18. Lee H. The Clinical Impact of the Dendritic Cell-based Cancer Vaccine: the Role in the Inflammatory Tumor Micro-environment. // Chonnam Medical Journal. - 2010. - Vol.46. - p.1-6.18. Lee H. The Clinical Impact of the Dendritic Cell-based Cancer Vaccine: the Role in the Inflammatory Tumor Micro-environment. // Chonnam Medical Journal. - 2010 .-- Vol. 46. - p. 1-6.

19. Liyanage UK, Moore TT, Joo HG, Tanaka Y, Herrmann V, et al. Prevalence of regulatory T cells is increased in peripheral blood and tumor microenvironment of patients with pancreas or breast adenocarcinoma. // J Immunol. - 2002. - Vol.169. - p.2756-2761.19. Liyanage UK, Moore TT, Joo HG, Tanaka Y, Herrmann V, et al. Prevalence of regulatory T cells is increased in peripheral blood and tumor microenvironment of patients with pancreas or breast adenocarcinoma. // J Immunol. - 2002. - Vol. 169. - p. 2756-2761.

20. Mantovani A. Inflammation and cancer: the Macrophage connection. // Medicina. - 2007. - Vol.67 (Supl. II). - p.32-34.20. Mantovani A. Inflammation and cancer: the Macrophage connection. // Medicina. - 2007 .-- Vol.67 (Supl. II). - p.32-34.

21. Palucka K. et al. Recent developments in cancer vaccines. // J Immunol. - 2011. - N 186 (3). - p.1325-1331.21. Palucka K. et al. Recent developments in cancer vaccines. // J Immunol. - 2011 .-- N 186 (3). - p.1325-1331.

22. Pinzon-Charry A, Maxwell T, López JA. Dendritic cell dysfunction in cancer: a mechanism for immunosuppression. // Immunol Cell Biol. - 2005. - Vol.83. - p.451-61.22. Pinzon-Charry A, Maxwell T, López JA. Dendritic cell dysfunction in cancer: a mechanism for immunosuppression. // Immunol Cell Biol. - 2005 .-- Vol.83. - p. 451-61.

23. Sallusto F, Lanzavecchia A: Heterogeneity of CD4+ memory T cells: Functional modules for tailored immunity. // Eur J Immunol. - 2009. - Vol.39. - p.2076-2082.23. Sallusto F, Lanzavecchia A: Heterogeneity of CD4 + memory T cells: Functional modules for tailored immunity. // Eur J Immunol. - 2009. - Vol. 39. - p.2076-2082.

24. Scardino A., Alimandi M., Correale P., et al. A Polyepitope DNA Vaccine Targeted to Her-2/ErbB-2 Elicits a Broad Range of Human and Murine CTL Effectors to Protect against Tumor Challenge. // Cancer Res. - 2007. - Vol.67 (14). - p.7028-7036.24. Scardino A., Alimandi M., Correale P., et al. A Polyepitope DNA Vaccine Targeted to Her-2 / ErbB-2 Elicits a Broad Range of Human and Murine CTL Effectors to Protect against Tumor Challenge. // Cancer Res. - 2007 .-- Vol.67 (14). - p.7028-7036.

25. Schattner EJ, et al. CD41 T-cell induction of Fas-mediated apoptosis in Burkitt′s lymphoma В cells. // Blood. - 1996. - Vol.88. - p.1375-1382.25. Schattner EJ, et al. CD41 T-cell induction of Fas-mediated apoptosis in Burkitt′s lymphoma B cells. // Blood. - 1996. - Vol. 88. - p.1375-1382.

26. Schmidt CS, Mescher MF. Peptide antigen priming of naive, but not memory, CD8 T cells requires a third signal that can be provided by IL-12. // J Immunol. - 2002. - Vol.68. - р.5521-5529.26. Schmidt CS, Mescher MF. Peptide antigen priming of naive, but not memory, CD8 T cells requires a third signal that can be provided by IL-12. // J Immunol. - 2002. - Vol. 68. - p. 5521-5529.

27. Steinman M.R. The dendritic cell and its role in immunogenicity. // Annu. Rev. Immunol. - 1991. - Vol.9. - p.271-96.27. Steinman M.R. The dendritic cell and its role in immunogenicity. // Annu. Rev. Immunol. - 1991 .-- Vol. 9. - p. 271-96.

28. Thomas WD, Hersey P. TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) induces apoptosis in Fas ligand-resistant melanoma cells and mediates CD4 T cell killing of target cells. // J Immunol. - 1998. - Vol.161. - p.2195-2200.28. Thomas WD, Hersey P. TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) induces apoptosis in Fas ligand-resistant melanoma cells and mediates CD4 T cell killing of target cells. // J Immunol. - 1998 .-- Vol. 161. - p. 2195-2200.

29. Злокачественные новообразования в России в 2009 году (заболеваемость и смертность). // Под ред. В.И. Чиссова, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. М.: ФГУ «МНИОИ им. П.А. Герцена Минздравсоцразвития России». - 2011. - 260 с.: ил.29. Malignant neoplasms in Russia in 2009 (morbidity and mortality). // Ed. IN AND. Chissova, V.V. Starinsky, G.V. Petrova. M .: FGU "MNIII named after P.A. Herzen of the Ministry of Health and Social Development of Russia. " - 2011 .-- 260 p.: Ill.

30. Trapani J.A. and Smyth M.J. Functional significance of the perforin|granzyme cell death pathway. // Nat Rev. - 2002. - Vol.2 - p.735-747.30. Trapani J.A. and Smyth M.J. Functional significance of the perforin | granzyme cell death pathway. // Nat Rev. - 2002. - Vol. 2 - p. 735-747.

Claims (2)

1. Способ получения антиген-специфических цитотоксических клеток, обладающих противоопухолевой активностью против клеток рака молочной железы, включающий следующие стадии:
а) выделение мононуклеарных клеток (МНК) из периферической крови пациента;
б) культивирование МНК с разделением клеток на прилипающую и неприлипающую фракции;
в) выращивание прилипающей фракции МНК в присутствии ростовых факторов с получением зрелых дендритных клеток (ДК);
г) трансфекция зрелых ДК экспрессионными плазмидами, содержащими ДНК-вакцинные конструкции, кодирующие универсальные и HLA-A*0201-специфичные эпитопы основных опухоль-ассоциированных антигенов, узнаваемые цитотоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ) и Т-клетками-хелперами (Th);
д) совместное культивирование зрелых ДК, полученных на стадии г), и неприлипающей фракции МНК в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-12 и рекомбинантного человеческого интерлейкина-18.1. The method of obtaining antigen-specific cytotoxic cells with antitumor activity against breast cancer cells, comprising the following stages:
a) the selection of mononuclear cells (MNCs) from the peripheral blood of the patient;
b) the cultivation of MNCs with the separation of cells into adherent and non-adherent fractions;
c) growing the adherent fraction of MNCs in the presence of growth factors to obtain mature dendritic cells (DC);
d) transfection of mature DCs with expression plasmids containing DNA vaccine constructs encoding the universal and HLA-A * 0201-specific epitopes of the main tumor-associated antigens recognized by cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) and helper T-cells (Th);
e) co-cultivation of mature DCs obtained in step d) and a non-adherent MNC fraction in the presence of recombinant human interleukin-12 and recombinant human interleukin-18. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве ростовых факторов при выращивании прилипающей фракции МНК используют гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) человека и интерлейкин-4 (ИЛ-4) человека. 2. The method according to claim 1, characterized in that as the growth factors when growing the adherent fraction of MNCs, a granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) of a person and human interleukin-4 (IL-4) are used.

Images