RU2595398C1 - Kit of reagents for detection of neisseria gonorrhoeae dna and use thereof - Google Patents
Kit of reagents for detection of neisseria gonorrhoeae dna and use thereof Download PDFInfo
- Publication number
- RU2595398C1 RU2595398C1 RU2015108676/10A RU2015108676A RU2595398C1 RU 2595398 C1 RU2595398 C1 RU 2595398C1 RU 2015108676/10 A RU2015108676/10 A RU 2015108676/10A RU 2015108676 A RU2015108676 A RU 2015108676A RU 2595398 C1 RU2595398 C1 RU 2595398C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- neisseria gonorrhoeae
- dna
- chain reaction
- detection
- polymerase chain
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Группа изобретений относится к медицине, более конкретно к лабораторной диагностике и может быть использована для выявления ДНК Neisseria gonorrhoeae в биологических образцах.The group of inventions relates to medicine, more specifically to laboratory diagnostics and can be used to detect Neisseria gonorrhoeae DNA in biological samples.
Уровень техникиState of the art
Neisseria gonorrhoeae (гонококк) - облигатный внутриклеточный бактериальный патоген человека. Гонококк является этиологическим агентом гонореи - инфекционного заболевания, передающегося половым путем. Гонорея является вторым по распространенности бактериальным инфекционным заболеванием, передающимся половым путем (после хламидиоза), инфицируя ежегодно свыше 60 миллионов человек [WHO. Global prevalence and incidence of selected curable sexually transmitted infections: overview and estimates. Geneva: World Health Organization, 2001].Neisseria gonorrhoeae (gonococcus) is an obligate intracellular bacterial human pathogen. Gonococcus is the etiological agent of gonorrhea, a sexually transmitted infection. Gonorrhea is the second most common bacterial sexually transmitted infection (after chlamydia), infecting more than 60 million people each year [WHO. Global prevalence and incidence of selected curable sexually transmitted infections: overview and estimates. Geneva: World Health Organization, 2001].
Гонококки поражают преимущественно отделы урогенитального тракта, выстланные цилиндрическим эпителием: слизистые оболочки цервикального канала, уретры, парауретральные и/или большие вестибулярные железы. При попадании инфекции в урогенитальный тракт возможно развитие воспалительных заболеваний, таких как цервицит, уретрит, парауретрит, бартолинит. За пределами урогенитального тракта гонококки поражают слизистые оболочки глотки, прямой кишки, конъюнктиву и могут вызывать фарингит, тонзиллит, стоматит, проктит, конъюнктивит [Под ред. Савельевой Г.М., Бреусенко В.Г. Гинекология: Учебник. Москва, «ГЭОТАРМЕД», 2004].Gonococci affect mainly the parts of the urogenital tract lined with a cylindrical epithelium: mucous membranes of the cervical canal, urethra, paraurethral and / or large vestibular glands. If an infection enters the urogenital tract, the development of inflammatory diseases, such as cervicitis, urethritis, paraurethritis, bartholinitis, is possible. Outside the urogenital tract, gonococci affect the mucous membranes of the pharynx, rectum, conjunctiva and can cause pharyngitis, tonsillitis, stomatitis, proctitis, conjunctivitis [Ed. Savelyeva G.M., Breusenko V.G. Gynecology: Textbook. Moscow, "GEOTARMED", 2004].
Клинические симптомы гонореи могут иметь неспецифический характер, перекрываться с симптомами других инфекций, передающихся половым путем (ИППП). Более 50% случаев гонококковой инфекции цервикального канала имеют бессимптомное течение [Bignell С. et al. European Guideline on the Diagnosis and Treatment of Gonorrhoea in Adults, 2012]. Инфекции, протекающие бессимптомно, часто остаются не диагностированными и, следовательно, пациентам не назначается адекватная терапия в течение длительного периода времени. В отсутствие лечения гонорейная инфекция приводит к таким серьезным последствиям, как воспалительные заболевания органов малого таза у женщин, патология беременности, мужское и женское бесплодие, синдром хронической тазовой боли, конъюнктивит у новорожденных [WHO. Global prevalence and incidence of selected curable sexually transmitted infections: overview and estimates. Geneva: World Health Organization, 2001]. Кроме того, гонорея является одним из кофакторов передачи ВИЧ-инфекции [Verma et al. Diagnostic implications of 16S ribosomal assay for gonorrhoea. Sex Transm Infect. 2010 Nov; 86(6): 461-464].The clinical symptoms of gonorrhea may be non-specific, overlapping with the symptoms of other sexually transmitted infections (STIs). More than 50% of cases of gonococcal cervical canal infection are asymptomatic [C. Bignell et al. European Guideline on the Diagnosis and Treatment of Gonorrhoea in Adults, 2012]. Asymptomatic infections often remain undiagnosed and, therefore, patients are not prescribed adequate therapy for a long period of time. If untreated, gonorrhea infection leads to such serious consequences as inflammatory diseases of the pelvic organs in women, pathology of pregnancy, male and female infertility, chronic pelvic pain syndrome, conjunctivitis in newborns [WHO. Global prevalence and incidence of selected curable sexually transmitted infections: overview and estimates. Geneva: World Health Organization, 2001]. In addition, gonorrhea is one of the cofactors of HIV transmission [Verma et al. Diagnostic implications of 16S ribosomal assay for gonorrhoea. Sex Transm Infect. 2010 Nov; 86 (6): 461-464].
В связи с затрудненной клинической диагностикой трудно переоценить важность надежной и эффективной лабораторной диагностики гонореи. Для выявления этиологического агента гонореи - гонококков - широко применяются традиционные методы лабораторной диагностики бактериальных инфекций - бактериоскопический (микроскопический) и бактериологический (культуральный).Due to the difficult clinical diagnosis, it is difficult to overestimate the importance of reliable and effective laboratory diagnosis of gonorrhea. To identify the etiological agent of gonorrhea - gonococci - traditional methods of laboratory diagnosis of bacterial infections are widely used - bacterioscopic (microscopic) and bacteriological (cultural).
Микроскопическое исследование мазков, окрашенных метиленовым синим и по Граму, представляет собой простой и быстрый метод выявления гонококков. Однако метод субъективен, обладает низкой чувствительностью (45-80%) и специфичностью (38%), особенно при наличии обильной сопутствующей микрофлоры [Под ред. Савельевой Г.М., Бреусенко В.Г. Гинекология: Учебник. Москва, «ГЭОТАРМЕД», 2004].Microscopic examination of smears stained with methylene blue and Gram is a simple and quick method for detecting gonococci. However, the method is subjective, has low sensitivity (45-80%) and specificity (38%), especially in the presence of abundant concomitant microflora [Ed. Savelyeva G.M., Breusenko V.G. Gynecology: Textbook. Moscow, "GEOTARMED", 2004].
«Золотым стандартом» диагностики гонореи в большинстве стран мира остается бактериологический (культуральный) метод, обладающий высокой специфичностью. Однако культуральный метод требует наличия живых микроорганизмов в анализируемом образце, а гонококки являются микроорганизмами с низкой устойчивостью к воздействию факторов внешней среды и ограниченной жизнеспособностью вне организма человека. Вследствие этого чувствительность метода варьирует в широких пределах и находится в сильной зависимости от типа и качества отбора биологических образцов, условий их транспортировки и хранения, а также условий культивирования. Данный недостаток метода в совокупности с его трудоемкостью, длительными сроками культивирования и сложностями стандартизации и автоматизации заставляют исследователей искать новые возможности диагностики гонореи.The “gold standard” for the diagnosis of gonorrhea in most countries of the world remains the bacteriological (cultural) method, which is highly specific. However, the cultural method requires the presence of live microorganisms in the analyzed sample, and gonococci are microorganisms with low resistance to environmental factors and limited viability outside the human body. As a result of this, the sensitivity of the method varies widely and is highly dependent on the type and quality of the selection of biological samples, the conditions for their transportation and storage, and also the cultivation conditions. This drawback of the method, together with its complexity, long cultivation periods and the difficulties of standardization and automation, compel researchers to look for new diagnostic options for gonorrhea.
Современные молекулярно-биологические методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот (МАНК), имеют ряд преимуществ перед традиционными методами диагностики: более высокая чувствительность, независимость от жизнеспособности гонококков в анализируемом образце, быстрота выполнения, возможность стандартизации и автоматизации анализа. Наибольшее распространение среди МАНК получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для некоторых ИППП, например, для хламидийной инфекции, ПЦР с успехом заменяет и вытесняет традиционные методы диагностики [Lanjouw Е. et al. European guideline for the management of Chlamydia trachomatis infections, 2010]. Однако для диагностики гонореи метод ПЦР оказался не столь успешен: существуют объективные затруднения в разработке тест-системы (набора реагентов) для выявления гонококков методом ПЦР, которая обладала бы одновременно высокой чувствительностью и высокой специфичностью [Verma et al. Diagnostic implications of 16S ribosomal assay for gonorrhoea. Sex Transm Infect. 2010 Nov; 86(6): 461-464]. Это связано с уникальными свойствами ДНК гонококков.Modern molecular biological methods based on the amplification of nucleic acids (MANK) have several advantages over traditional diagnostic methods: higher sensitivity, independence from the viability of gonococci in the analyzed sample, speed of execution, the ability to standardize and automate the analysis. The polymerase chain reaction (PCR) method was most widely used among IASCs. For some STIs, for example, for chlamydial infection, PCR successfully replaces and displaces traditional diagnostic methods [Lanjouw E. et al. European guideline for the management of Chlamydia trachomatis infections, 2010]. However, for the diagnosis of gonorrhea, the PCR method was not so successful: there are objective difficulties in developing a test system (set of reagents) for the detection of gonococcus by PCR, which would have both high sensitivity and high specificity [Verma et al. Diagnostic implications of 16S ribosomal assay for gonorrhoea. Sex Transm Infect. 2010 Nov; 86 (6): 461-464]. This is due to the unique properties of gonococcal DNA.
Во-первых, между Neisseria gonorrhoeae и другими видами бактерий рода Neisseria существует необычно высокая степень гомологии последовательностей ДНК. Гомология с патогенным представителем рода Neisseria - Neisseria meningitidis (менингококком) объясняется происхождением в процессе эволюции от общего предшественника. Гомология с непатогенным представителями (комменсалами) рода Neisseria - N. subflava, N. cinerea, N. flavescens, N. lactamica, N. sicca и другими - объясняется необычно высокой склонностью бактерий рода Neisseria к межвидовому горизонтальному переносу генов. Высокая степень межвидовой гомологии нейссерий является причиной фундаментальной проблемы недостаточной специфичности многих известных тест-систем для выявления гонококков: кросс-реактивность с негонококковыми нейссериями приводит к большому количеству ложноположительных результатов анализа [Whiley D.M. et al. Nucleic acid amplification testing for Neisseria gonorrhoeae: an ongoing challenge. J Mol Diagn. 2006 Feb; 8(1): 3-15. Review].First, an unusually high degree of homology of DNA sequences exists between Neisseria gonorrhoeae and other species of bacteria of the genus Neisseria. Homology with a pathogenic representative of the genus Neisseria - Neisseria meningitidis (meningococcus) is explained by the origin in the process of evolution from a common predecessor. The homology with non-pathogenic representatives (commensals) of the genus Neisseria - N. subflava, N. cinerea, N. flavescens, N. lactamica, N. sicca and others - is explained by the unusually high tendency of bacteria of the genus Neisseria to interspecific horizontal gene transfer. The high degree of interspecies homology of the neisseries is the cause of the fundamental problem of the lack of specificity of many known test systems for the detection of gonococci: cross-reactivity with non-gonococcal neisseria leads to a large number of false-positive analysis results [Whiley D.M. et al. Nucleic acid amplification testing for Neisseria gonorrhoeae: an ongoing challenge. J Mol Diagn. 2006 Feb; 8 (1): 3-15. Review].
Во-вторых, вид Neisseria gonorrhoeae представлен большим количеством штаммов, демонстрирующих необычно высокую степень генетического полиморфизма. Распределение штаммов внутри человеческой популяции весьма неоднородно, то есть существенно различается на разных территориях, в различных группах пациентов, а также меняется с течением времени. Такая вариабельность является причиной проблемы недостаточной чувствительности некоторых известных тест-систем для выявления гонококков: утрата некоторыми штаммами последовательности-мишени ПЦР приводит к появлению ложноотрицательных результатов анализа [Whiley D.M. et al. Nucleic acid amplification testing for Neisseria gonorrhoeae: an ongoing challenge. J Mol Diagn. 2006 Feb; 8(1): 3-15. Review].Secondly, the species Neisseria gonorrhoeae is represented by a large number of strains showing an unusually high degree of genetic polymorphism. The distribution of strains within the human population is very heterogeneous, that is, it varies significantly in different territories, in different groups of patients, and also changes over time. This variability is the cause of the lack of sensitivity of some known test systems for detecting gonococci: the loss of the PCR target sequence by some strains leads to the appearance of false negative results of the analysis [Whiley D.M. et al. Nucleic acid amplification testing for Neisseria gonorrhoeae: an ongoing challenge. J Mol Diagn. 2006 Feb; 8 (1): 3-15. Review].
Именно вышеописанные особенности генетического материала гонококков делают очень нетривиальной задачей создание тест-системы для выявления гонококков методом ПЦР, которая обладала бы одновременно высокой чувствительностью и высокой специфичностью. Поскольку чувствительность и специфичность ПЦР тест-системы в значительной степени зависит от мишени ПЦР, создание оптимальной тест-системы прежде всего означает выбор наиболее подходящего гена-мишени и разработку оптимальных олигонуклеотидных праймеров, обеспечивающих специфическую амплификацию фрагмента гена-мишени. Существует большое количество «in house» («домашних») и серийно выпускаемых (коммерческих) наборов реагентов (тест-систем) для выявления ДНК Neisseria gonorrhoeae методом ПЦР, но многие из них демонстрируют неоптимальный выбор мишени ПЦР и соответствующих олигонуклеотидных праймеров и, как следствие, проблемы с чувствительностью и/или специфичностью анализа.It is the above-described features of the genetic material of gonococci that make it a very non-trivial task to create a test system for detecting gonococci by PCR, which would have both high sensitivity and high specificity. Since the sensitivity and specificity of the PCR test system largely depends on the target PCR, the creation of an optimal test system primarily means choosing the most suitable target gene and developing optimal oligonucleotide primers that provide specific amplification of a fragment of the target gene. There are a large number of “in house” and commercially available (commercial) reagent kits (test systems) for detecting Neisseria gonorrhoeae DNA by PCR, but many of them demonstrate suboptimal selection of the PCR target and the corresponding oligonucleotide primers and, as a result , problems with the sensitivity and / or specificity of the analysis.
Так, широко применяемый международный коммерческий набор реагентов COBAS® AMPLICOR производства компании Roche Molecular Systems, Inc. для одновременного выявления двух патогенов, Chlamydia trachomatis и Neisseria gonorrhoeae [Регистрационное удостоверение № ФСЗ 2011/09814 25.05.2011], в качестве мишени для выявления Neisseria gonorrhoeae использует фрагмент гена цитозин-ДНК-метилтрансферазы [ЕР 0630971 В1]. Набор обладает высокой чувствительностью, однако его специфичность недостаточно высока: была продемонстрирована кросс-реактивность набора с нейссериями-комменсалами, представителями видов N. subflava, N. cinerea, N. flavescens, N. lactamica, N. sicca и даже с лактобактериями [Luijt D.S. et al. Comparison of COBAS AMPLICOR Neisseria gonorrhoeae PCR, including confirmation with N. gonorrhoeae-specific 16S rRNA PCR, with traditional culture. J Clin Microbiol. 2005 Mar; 43(3): 1445-1447]. Недостаточная специфичность приводит к получению большого количества ложноположительных результатов. Так, в исследовании Luijt D.S. et al., 2005 чувствительность набора для выявления Neisseria gonorrhoeae составила 100%, специфичность - 97.6%, что в популяции с уровнем распространенности гонореи 2.8% дало прогностическую значимость положительного результата всего 54.8%, что является неудовлетворительным. Согласно европейскому руководству 2012 года по диагностике и лечению гонореи у взрослых, рекомендуется использовать для выявления гонококков только тест-системы с прогностической значимостью положительного результата не менее 90% [Bignell С. et al. European Guideline on the Diagnosis and Treatment of Gonorrhoea in Adults, 2012]. Таким образом данный набор не подходит в качестве единственной тест-системы для диагностики гонореи и требует дополнительного «подтверждающего» теста.So, the widely used international commercial COBAS® AMPLICOR reagent kit manufactured by Roche Molecular Systems, Inc. for the simultaneous detection of two pathogens, Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae [Registration certificate No. FSZ 2011/09814 05/25/2011], a gene fragment of the cytosine DNA methyltransferase [EP 0630971 B1] is used as a target for detecting Neisseria gonorrhoeae. The kit is highly sensitive, but its specificity is not high enough: the cross-reactivity of the kit was demonstrated with commensals neisseries, representatives of the species N. subflava, N. cinerea, N. flavescens, N. lactamica, N. sicca and even with lactobacilli [Luijt D.S. et al. Comparison of COBAS AMPLICOR Neisseria gonorrhoeae PCR, including confirmation with N. gonorrhoeae-specific 16S rRNA PCR, with traditional culture. J Clin Microbiol. 2005 Mar; 43 (3): 1445-1447]. Lack of specificity leads to a large number of false-positive results. So, in a study by Luijt D.S. et al., 2005, the sensitivity of the kit for detecting Neisseria gonorrhoeae was 100%, the specificity was 97.6%, which in a population with a gonorrhea prevalence rate of 2.8% yielded a predictive value of a positive result of only 54.8%, which is unsatisfactory. According to the 2012 European guidelines for the diagnosis and treatment of gonorrhea in adults, it is recommended that only test systems with a predictive value of a positive result of at least 90% be used to detect gonococcus [Bignell C. et al. European Guideline on the Diagnosis and Treatment of Gonorrhoea in Adults, 2012]. Thus, this kit is not suitable as the only test system for the diagnosis of gonorrhea and requires an additional "confirmatory" test.
Известен набор реагентов для обнаружения Гонококка (Neisseria gonorrhoeae) методом полимеразной цепной реакции (ГОНОПОЛ) производства ООО НПФ «ЛИТЕХ» [Регистрационное удостоверение № ФСР 2007/01271 от 22.11.2007]. В данном наборе в качестве мишени ПЦР используется фрагмент гена сррВ, расположенного на криптической плазмиде [Шипицына Е.В. и др. Оценка методов амплификации нуклеиновых кислот, применяемых для выявления Neisseria gonorrhoeae в России. Журнал акушерства и женских болезней. 2009, том LVIII, выпуск 1, с. 60-70]. Криптическая плазмида Neisseria gonorrhoeae мультикопийна, что теоретически дает более высокую аналитическую чувствительность тест-систем с данной мишенью по сравнению с тест-системами с однокопийными хромосомными мишенями. Однако многоцентровая валидация данной мишени в исследовании Bruisten S.M. et al., 2004 показало: она отсутствует в 5.8% штаммов Neisseria gonorrhoeae, соответственно эти штаммы дают ложноотрицательные результаты. Таким образом чувствительность тест-систем с мишенью сррВ никогда не превысит 94%, что является неприемлемым [Bruisten S.M. et al. Multicenter validation of the cppB gene as a PCR target for detection of Neisseria gonorrhoeae. J Clin Microbiol. 2004 Sep; 42(9): 4332-4334]. Специфичность тест-систем с мишенью сррВ также неоптимальна: показана кросс-реактивность с негонококковыми нейсериями: N. meningitides, N. subflava, N. cinerea [Palmer H.M. et al. Evaluation of the specificities of five DNA amplification methods for the detection of Neisseria gonorrhoeae. J Clin Microbiol. 2003 Feb; 41(2): 835-837; Boel C.H. et al. Evaluation of conventional and real-time PCR assays using two targets for confirmation of results of the COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae test for detection of Neisseria gonorrhoeae in clinical samples. J Clin Microbiol. 2005 May; 43(5): 2231-2235; Whiley D.M. et al. Nucleic acid amplification testing for Neisseria gonorrhoeae: an ongoing challenge. J Mol Diagn. 2006 Feb; 8(1): 3-15. Review]. В совокупности это делает сррВ неподходящей мишенью для выявления Neisseria gonorrhoeae.A known set of reagents for the detection of Gonococcus (Neisseria gonorrhoeae) by the method of polymerase chain reaction (GONOPOL) manufactured by NPF LITECH LLC [Registration certificate No. FSR 2007/01271 of 11/22/2007]. In this kit, a fragment of the cprB gene located on a cryptic plasmid is used as a PCR target [Shipitsyna E.V. et al. Evaluation of nucleic acid amplification methods used to detect Neisseria gonorrhoeae in Russia. Journal of Obstetrics and Women's Diseases. 2009, Volume LVIII,
Известен набор реагентов для выявления ДНК Нейссерии гонореи (Neisseria gonorrhoeae) методом полимеразной цепной реакции (ГОНО-ГЕН) производства ООО «НПО ДНК-Технология» [Регистрационное удостоверение № ФСР 2008/03850 от 26.04.2010]. В данном наборе в качестве мишени ПЦР используется фрагмент псевдогена porA [Шипицына Е.В. и др. Оценка методов амплификации нуклеиновых кислот, применяемых для выявления Neisseria gonorrhoeae в России. Журнал акушерства и женских болезней. 2009, том LVIII, выпуск 1, с. 60-70]. Псевдоген porA отсутствует у нейссерий-комменсалов, значительно отличается у Neisseria meningitidis, но в тоже время является высококонсервативным среди различных штаммов гонококков, что делает его очень ценной мишенью для выявления гонококков методом ПЦР. Тест-системы с этой мишенью считаются одними из самых надежных и широко используются в качестве референсных при валидации новых тест-систем. Однако и эта мишень имеет недостатки. Псевдоген porA - однокопийная мишень, что может негативно сказаться на чувствительности тест-системы. Кроме того, в 2011 году были опубликованы данные о клиническом изоляте Neisseria gonorrhoeae, имеющем последовательность porA, на 99% гомологичную последовательности porA одного из штаммов Neisseria meningitidis. За счет этого данный изолят демонстрирует ложноотрицательный результат при анализе методом ПЦР с porA в качестве мишени [Whiley D.M. et al. False-negative results using Neisseria gonorrhoeae porA pseudogene PCR - a clinical gonococcal isolate with an N. meningitidis porA sequence, Australia, March 2011. Euro Surveill. 2011 May 26; 16(21). pii: 19874].A known set of reagents for detecting Neisseria gonorrhea DNA (Neisseria gonorrhoeae) by the polymerase chain reaction (GONO-GEN) manufactured by NPO DNA-Technology LLC [Registration certificate No. FSR 2008/03850 of 04/26/2010]. In this kit, a fragment of the pseudogen porA is used as a target for PCR [Shipitsyna E.V. et al. Evaluation of nucleic acid amplification methods used to detect Neisseria gonorrhoeae in Russia. Journal of Obstetrics and Women's Diseases. 2009, Volume LVIII,
Одним из путей решения проблемы трудности создания тест-системы, совмещающей высокую чувствительность и специфичность, является введение дополнительной мишени для ПЦР в рамках одной тест-системы или использование комбинации двух и более тест-систем с различными мишенями. Такой подход, несомненно, повышает надежность выявления Neisseria gonorrhoeae, однако повышает трудоемкость, стоимость и сроки исполнения анализа. Кроме того, данный подход - увеличение количества мишеней для выявления одного патогена - снижает возможности одновременного выявления нескольких патогенов в одной пробирке на имеющемся в лаборатории оборудовании, что не вполне отвечает современным потребностям лабораторной диагностики урогенитальных заболеваний, часто протекающих по типу микст-инфекций.One way to solve the problem of creating a test system that combines high sensitivity and specificity is to introduce an additional target for PCR within one test system or to use a combination of two or more test systems with different targets. This approach undoubtedly increases the reliability of the detection of Neisseria gonorrhoeae, but it increases the complexity, cost and time of execution of the analysis. In addition, this approach - an increase in the number of targets for identifying a single pathogen - reduces the possibility of simultaneously identifying several pathogens in a single tube using laboratory equipment, which does not fully meet the modern needs of laboratory diagnostics of urogenital diseases, often occurring as mixed infections.
Раскрытие группы изобретений.Disclosure of a group of inventions.
Задачами настоящей группы изобретений являются: разработка и валидация набора реагентов, позволяющего с высокой чувствительностью и высокой специфичностью выявлять все клинически значимые штаммы Neisseria gonorrhoeae с помощью единственной мишени полимеразной цепной реакции, с возможностью как самостоятельного использования для выявления ДНК одного патогена - Neisseria gonorrhoeae, так и в составе мультиплексного набора для выявления ДНК нескольких патогенов, с возможностью количественного определения ДНК Neisseria gonorrhoeae.The objectives of this group of inventions are: the development and validation of a reagent kit that allows with high sensitivity and high specificity to identify all clinically significant strains of Neisseria gonorrhoeae using a single target of the polymerase chain reaction, with the possibility of independent use of one pathogen, Neisseria gonorrhoeae, to detect DNA as part of a multiplex kit for detecting the DNA of several pathogens, with the possibility of quantifying the DNA of Neisseria gonorrhoeae.
Поставленные задачи решены созданием набора реагентов для выявления ДНК Neisseria gonorrhoeae в образце методом полимеразной цепной реакции, включающего по меньшей мере два олигонуклеотидных праймера для полимеразной цепной реакции, отличающегося тем, что один олигонуклеотидный праймер из указанных двух олигонуклеотидных праймеров имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 1, второй олигонуклеотидный праймер из указанных двух олигонуклеотидных праймеров имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 2.The tasks are solved by creating a set of reagents for detecting Neisseria gonorrhoeae DNA in a sample by polymerase chain reaction, comprising at least two oligonucleotide primers for the polymerase chain reaction, characterized in that one oligonucleotide primer of these two oligonucleotide primers has a sequence that is at least homologous 90% of the sequence of SEQ ID NO: 1, the second oligonucleotide primer of these two oligonucleotide primers has a sequence homologous to at least 90% of the sequence of SEQ ID NO: 2.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что один олигонуклеотидный праймер из указанных двух олигонуклеотидных праймеров имеет последовательность SEQ ID NO: 1, второй олигонуклеотидный праймер из указанных двух олигонуклеотидных праймеров имеет последовательность SEQ ID NO: 2.In a particular embodiment, the kit according to the invention is characterized in that one oligonucleotide primer from the two oligonucleotide primers has the sequence SEQ ID NO: 1, the second oligonucleotide primer from the two oligonucleotide primers has the sequence SEQ ID NO: 2.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что дополнительно содержит олигонуклеотидный зонд для детекции ДНК Neisseria gonorrhoeae в режиме реального времени, где указанный зонд на 5′-конце содержит флуоресцентный краситель, на 3′-конце содержит гаситель флуоресценции.In a particular embodiment, the kit according to the invention is characterized in that it further comprises an oligonucleotide probe for real-time detection of Neisseria gonorrhoeae DNA, where the probe at the 5′-end contains a fluorescent dye, at the 3′-end contains a fluorescence quencher.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что флуоресцентный краситель выбран из группы: JOE, FAM, R6G, ROX, Су5, Су5.5, HEX.In the particular case of execution, the kit according to the invention is characterized in that the fluorescent dye is selected from the group: JOE, FAM, R6G, ROX, Cy5, Cy5.5, HEX.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что гаситель флуоресценции выбран из группы: BHQ1, BHQ2, BHQ3, RTQ.In the particular case of execution, the kit according to the invention is characterized in that the fluorescence quencher is selected from the group: BHQ1, BHQ2, BHQ3, RTQ.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что олигонуклеотидный зонд имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 3.In the particular case of execution, the kit according to the invention is characterized in that the oligonucleotide probe has a sequence homologous to at least 90% of the sequence of SEQ ID NO: 3.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что олигонуклеотидный зонд имеет последовательность SEQ ID NO: 3.In the particular case of execution, the kit according to the invention is characterized in that the oligonucleotide probe has the sequence of SEQ ID NO: 3.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что олигонуклеотидный зонд представляет собой (FAM)-CCGACATCGGCCGCCGATATTGGCA-(BHQ1).In a particular embodiment, the kit of the invention is characterized in that the oligonucleotide probe is (FAM) -CCGACATCGGCCGCCGATATTGGCA- (BHQ1).
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что дополнительно содержит термостабильную ДНК-полимеразу, буферный раствор для ПЦР, дезоксинуклеозидтрифосфаты.In the particular case of execution, the kit according to the invention is characterized in that it further comprises a thermostable DNA polymerase, a buffer solution for PCR, deoxynucleoside triphosphates.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что дополнительно содержит по меньшей мере один калибратор для количественной оценки содержания ДНК Neisseria gonorrhoeae в образце, содержащий известные концентрации фрагмента ДНК Neisseria gonorrhoeae, используемого для выявления ДНК Neisseria gonorrhoeae.In a particular embodiment, the kit of the invention is characterized in that it further comprises at least one calibrator for quantifying the content of Neisseria gonorrhoeae DNA in a sample containing known concentrations of the Neisseria gonorrhoeae DNA fragment used to detect Neisseria gonorrhoeae DNA.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что дополнительно содержит реагенты для выявления в образце методом мультиплексной полимеразной цепной реакции ДНК по меньшей мере одного дополнительного микроорганизма, выбранного из группы: Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium.In a particular embodiment, the kit according to the invention is characterized in that it further comprises reagents for detecting at least one additional microorganism selected from the group: Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium in the sample by the method of multiplex polymerase chain reaction of DNA.
В частном случае выполнения набор по изобретению характеризуется тем, что образец выбран из группы: соскоб из цервикального канала, соскоб из уретры, мазок из влагалища, моча, семенная жидкость, мазок из прямой кишки, мазок из глотки, мазок с конъюнктивы, спинно-мозговая жидкость, кровь.In the particular case of execution, the kit according to the invention is characterized in that the sample is selected from the group: scraping from the cervical canal, scraping from the urethra, swab from the vagina, urine, seminal fluid, swab from the rectum, swab from the pharynx, swab from the conjunctiva, spinal cord fluid, blood.
Объем притязаний включает также применение вышеописанных наборов реагентов для выявления ДНК Neisseria gonorrhoeae в биологических образцах.The scope of the claims also includes the use of the above reagent kits for detecting Neisseria gonorrhoeae DNA in biological samples.
Созданный в рамках настоящего изобретения набор реагентов использует в качестве мишени ПЦР фрагмент мультикопийного гена 16s rRNA Neisseria gonorrhoeae. Разработанные олигонуклеотидные праймеры, обеспечивающие специфическую амплификацию данного фрагмента, имеют оптимальную олигонуклеотидную последовательность: с одной стороны, достаточно высококонсервативную среди многообразия штаммов Neisseria gonorrhoeae для того, чтобы выявлять все штаммы, с другой стороны, высокоспецифичную для вида Neisseria gonorrhoeae, характеризующуюся степенью межвидовой гомологии, достаточно низкой для отсутствия кросс-реактивности с негонококковыми видами нейссерий и другими бактериями. Олигонуклеотидные праймеры, имеющие последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, обеспечивают амплификацию фрагмента гена 16s rRNA размером 85 нуклеотидов. Именно такой размер амплифицируемого фрагмента, как оказалось, придает процессу амплификации минимальную восприимчивость как к примесям-ингибиторам ПЦР, так и к конкуренции со стороны других ПЦР мишеней, что дополнительно увеличивает чувствительность и специфичность анализа.The reagent kit created within the framework of the present invention uses a fragment of the multicopy 16s rRNA Neisseria gonorrhoeae gene as a PCR target. The designed oligonucleotide primers providing specific amplification of this fragment have the optimal oligonucleotide sequence: on the one hand, it is highly conserved among the variety of strains of Neisseria gonorrhoeae in order to identify all strains, on the other hand, it is highly specific for the Neisseria gonorrhoeae species that low for the lack of cross-reactivity with non-gonococcal species of neysseries and other bacteria. Oligonucleotide primers having the sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 provide amplification of a fragment of the 16s rRNA gene with a size of 85 nucleotides. It was such a size of the amplified fragment that, as it turned out, gives the amplification process minimal susceptibility to both PCR inhibitor impurities and competition from other PCR targets, which further increases the sensitivity and specificity of the analysis.
Использование группы изобретений позволяет достичь следующего технического результата: выявление с высокой чувствительностью и специфичностью всех клинически значимых штаммов Neisseria gonorrhoeae с помощью единственной мишени полимеразной цепной реакции; при этом высокая специфичность достигается в том числе для образцов, взятых из мест колонизации негонококковых нейссерий. В частном случае выполнения группа изобретений позволяет определять ДНК Neisseria gonorrhoeae в количественном формате, что может быть полезно для уточнения диагноза при сомнительных/дискордантных результатах анализа. Кроме того, уровень бактериальной нагрузки может иметь патогенетическое и прогностическое значение и оказывать влияние на выбор тактики этиотропной терапии. В частном случае выполнения группа изобретений позволяет выявлять одновременно несколько возбудителей инфекций, передаваемых половым путем, что может быть полезно для диагностики часто встречающихся микст-инфекций урогенитального тракта.Using the group of inventions allows to achieve the following technical result: identification with high sensitivity and specificity of all clinically significant strains of Neisseria gonorrhoeae using a single target polymerase chain reaction; at the same time, high specificity is achieved, including for samples taken from colonization sites of non-gonococcal neisseries. In the particular case of the invention, the group of inventions allows to determine the DNA of Neisseria gonorrhoeae in a quantitative format, which may be useful for clarifying the diagnosis with doubtful / discordant results of the analysis. In addition, the level of bacterial load can have pathogenetic and prognostic value and influence the choice of etiotropic therapy tactics. In the particular case of the invention, the group of inventions makes it possible to simultaneously identify several sexually transmitted infections, which may be useful for the diagnosis of frequently occurring mixed infections of the urogenital tract.
Осуществление группы изобретенийThe implementation of the group of inventions
Пример 1. Выявление (качественное определение) ДНК Neisseria gonorrhoeae в биологических образцах.Example 1. Detection (qualitative determination) of Neisseria gonorrhoeae DNA in biological samples.
В исследование были включены 319 пациентов женского пола с жалобами на наличие зуда/жжения в области половых органов и/или дизурии. От каждого пациента получали по два биологических образца - соскоба из цервикального канала. Взятые у пациентов цервикальные образцы помещали в 1 мл сахарозо-фосфатного буфера. Первый образец исследовали методом полимеразной цепной реакции с использованием референсного набора реагентов для выявления ДНК Neisseria gonorrhoeae, ранее прошедшего международную валидацию (Hjelmevoll S.O. et al. Clinical validation of a real-time polymerase chain reaction detection of Neisseria gonorrheae porA pseudogene versus culture techniques. Sex Transm Dis. 2008 May; 35(5): 517-520). Второй образец исследовали методом полимеразной цепной реакции с использованием набора реагентов для выявления ДНК Neisseria gonorrhoeae по изобретению. Далее проводилось сопоставление результатов, полученных двумя наборами реагентов.The study included 319 female patients with complaints of itching / burning in the genital area and / or dysuria. Two biological samples were obtained from each patient — scrapings from the cervical canal. Cervical samples taken from patients were placed in 1 ml of sucrose-phosphate buffer. The first sample was studied by polymerase chain reaction using a reference set of reagents for the detection of Neisseria gonorrhoeae DNA that had previously undergone international validation (Hjelmevoll SO et al. Clinical validation of a real-time polymerase chain reaction detection of Neisseria gonorrheae por A pseudogene versus culture techniques. Sex Transm Dis. 2008 May; 35 (5): 517-520). The second sample was investigated by polymerase chain reaction using a kit of reagents for the detection of DNA Neisseria gonorrhoeae according to the invention. Next, we compared the results obtained with two sets of reagents.
Исследование образцов с использованием референсного метода.Examination of samples using the reference method.
Выделение ДНК из биологических образцов проводили с использованием набора реагентов MagNa Pure LC DNA Isolation kit I (Roche Molecular Biochemicals, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Объем элюции составил 100 мкл, далее образец разводили в 2 раза, добавляя еще 100 мкл буфера. Для амплификации ДНК методом полимеразной цепной реакции использовали 11,5 мкл полученного элюата. Постановку полимеразной цепной реакции и интерпретацию результатов исследования осуществляли как описано ранее (Hjelmevoll S.O. et al. Clinical validation of a real-time polymerase chain reaction detection of Neisseria gonorrheae porA pseudogene versus culture techniques. Sex Transm Dis. 2008 May; 35(5): 517-520).DNA was isolated from biological samples using the MagNa Pure LC DNA Isolation kit I reagent kit (Roche Molecular Biochemicals, Germany) in accordance with the manufacturer's instructions. The elution volume was 100 μl, then the sample was diluted 2 times, adding another 100 μl of buffer. For amplification of DNA by polymerase chain reaction, 11.5 μl of the obtained eluate was used. The polymerase chain reaction and interpretation of the results of the study were carried out as described previously (Hjelmevoll SO et al. Clinical validation of a real-time polymerase chain reaction detection of Neisseria gonorrheae por A pseudogene versus culture techniques. Sex Transm Dis. 2008 May; 35 (5): 517-520).
Исследование образцов с использованием набора реагентов по изобретению.Examination of samples using the reagent kit of the invention.
Выделение ДНК из биологических образцов проводили с использованием набора реагентов ДНК-Сорб-АМ (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, кат. №102-22). До выделения ДНК в пробирки вносили по 10 мкл препарата внутреннего контрольного образца (ВКО). Для амплификации ДНК методом полимеразной цепной реакции использовали 10 мкл полученного элюата (объем полученного элюата после экстракции составлял 100 мкл).DNA was isolated from biological samples using a DNA-Sorb-AM reagent kit (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Moscow, cat. No. 102-22). Prior to DNA isolation, 10 μl of the preparation of the internal control sample (CTP) was added to the tubes. For amplification of DNA by polymerase chain reaction, 10 μl of the obtained eluate was used (the volume of the obtained eluate after extraction was 100 μl).
Реакционную смесь для полимеразной цепной реакции готовили следующим образом. Сначала готовили ПЦР-смесь-1, содержащую олигонуклеотидные праймеры, олигонуклеотидные зонды для детекции и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты в буфере ТЕ. Состав ПЦР-смеси-1 приведен в таблице 1.The reaction mixture for the polymerase chain reaction was prepared as follows. First, a PCR mixture-1 was prepared containing oligonucleotide primers, oligonucleotide probes for detection, and deoxyribonucleoside triphosphates in TE buffer. The composition of the PCR mixture-1 is shown in table 1.
Затем в каждую реакционную пробирку вносили по 10 мкл ПЦР-смеси-1, по 5 мкл ПЦР-смеси-2 red (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, кат. №863), содержащей Taq-полимеразу, и по 10 мкл элюата, полученного при выделении ДНК из биологических образцов.Then, 10 μl of PCR mixture-1, 5 μl of PCR mixture-2 red (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Moscow, Cat. No. 863) containing Taq polymerase and 10 μl of the eluate obtained were added to each reaction tube when isolating DNA from biological samples.
Амплификацию проводили на приборе «Rotor-Gene Q» (QIAGEN, Германия).Amplification was performed on a Rotor-Gene Q instrument (QIAGEN, Germany).
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам - анализировались с помощью программного обеспечения прибора «Rotor-Gene Q». Сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК Neisseria gonorrhoeae, детектировался по каналу Green, ДНК ВКО детектировался по каналу Yellow. Результаты интерпретировались на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что определяет наличие (или отсутствие) для данной пробы ДНК значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов.The data obtained — the fluorescence signal accumulation curves for two channels — were analyzed using the Rotor-Gene Q software. A signal indicating the accumulation of the amplification product of the Neisseria gonorrhoeae DNA fragment was detected via the Green channel, the DNA of the CTP was detected via the Yellow channel. The results were interpreted on the basis of the presence (or absence) of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line set at the appropriate level, which determines the presence (or absence) for this DNA sample of the value of the threshold cycle “Ct” in the corresponding column in the results table.
Результаты интерпретировались следующим образом:The results were interpreted as follows:
- ДНК Neisseria gonorrhoeae обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу Green определено значение порогового цикла Ct. При этом кривая флуоресценции данной пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.- Neisseria gonorrhoeae DNA is detected if the threshold cycle Ct value is determined for this sample in the results table on the Green channel. In this case, the fluorescence curve of this sample should cross the threshold line at the site of a characteristic exponential rise in fluorescence.
- ДНК Neisseria gonorrhoeae не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу Green не определено (отсутствует) значение порогового цикла Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице результатов по каналу Yellow определено значение порогового цикла Ct, не превышающее 33.- Neisseria gonorrhoeae DNA is not detected if the threshold cycle Ct value is not defined (missing) in the results table for the Green channel (the fluorescence curve does not cross the threshold line), and the threshold cycle value Ct is determined for the channel channel not exceeding 33.
- Результат анализа невалидный, если для данной пробы не определено (отсутствует) или превышает 33 значение порогового цикла Ct по каналу для детекции Yellow и не определено (отсутствует) значение порогового цикла Ct по каналу Green.- The result of the analysis is invalid if for a given sample it is not determined (absent) or exceeds 33 the value of the threshold cycle Ct on the channel for detection Yellow and the value of the threshold cycle Ct is not determined (missing) on the Green channel.
Результаты исследования цервикальных образцов от 319 пациенток приведены в таблице 2.The results of the study of cervical samples from 319 patients are shown in table 2.
Было получено 100%-ное совпадение при тестировании набора по изобретению относительно референсного набора реагентов. Таким образом, диагностическая чувствительность, диагностическая специфичность, прогностическая значимость положительного результата и прогностическая значимость отрицательного результата набора по изобретению составили 100%.A 100% match was obtained when testing the kit of the invention with respect to the reference kit of reagents. Thus, the diagnostic sensitivity, diagnostic specificity, prognostic significance of a positive result and the prognostic significance of a negative result of a kit according to the invention were 100%.
Также было продемонстрировано, что набор по изобретению позволяет достоверно выявлять наличие ДНК Neisseria gonorrhoeae в биологических образцах методом мультиплексной полимеразной цепной реакции одновременно с выявлением ДНК других возбудителей инфекций, передаваемых половым путем: Chlamydia trahomatis, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium.It was also demonstrated that the kit according to the invention can reliably detect the presence of Neisseria gonorrhoeae DNA in biological samples by the method of multiplex polymerase chain reaction simultaneously with the detection of DNA of other sexually transmitted infection pathogens: Chlamydia trahomatis, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium.
Пример 2. Количественное определение ДНК Neisseria gonorrhoeae в биологических образцах.Example 2. Quantification of Neisseria gonorrhoeae DNA in biological samples.
Проводили исследование биологических образцов, описанных в примере 1, с использованием дополнительного набора реагентов для выявления ДНК Neisseria gonorrhoeae ГОНОПОЛ-РВ (ООО «НПФ Литех», Россия).The biological samples described in Example 1 were studied using an additional set of reagents for detecting Neisseria gonorrhoeae DNA GONOPOL-RV (NPF Litekh LLC, Russia).
Результаты исследования цервикальных образцов от 319 пациенток приведены в таблице 3. При анализе результатов исследования выявлен дискордантный образец №124.The results of the study of cervical samples from 319 patients are shown in table 3. When analyzing the results of the study revealed discordant sample No. 124.
Далее все образцы, в которых была выявлена ДНК Neisseria gonorrhoeae, исследовали методом количественной полимеразной цепной реакции с применением набора по изобретению.Further, all samples in which Neisseria gonorrhoeae DNA was detected were examined by the method of quantitative polymerase chain reaction using the kit of the invention.
Количественное определение ДНК микроорганизма основывается на существовании линейной зависимости между циклом начала увеличения флуоресценции образца (пороговый цикл, Cycle threshold, Ct) и исходной концентрацией ДНК-мишени. Для реализации количественного определения в реакции амплификации параллельно используются ДНК-калибраторы - образцы с известной концентрацией ДНК Neisseria gonorrhoeae. По результатам амплификации ДНК-калибраторов выстраивается калибровочная прямая, по которой происходит определение концентрации ДНК Neisseria gonorrhoeae в образцах.Quantification of microorganism DNA is based on the existence of a linear relationship between the cycle of the onset of increase in sample fluorescence (threshold cycle, Cycle threshold, Ct) and the initial concentration of the target DNA. To implement a quantitative determination in the amplification reaction, DNA calibrators are used in parallel - samples with a known concentration of Neisseria gonorrhoeae DNA. According to the results of amplification of DNA calibrators, a calibration line is built, according to which the concentration of Neisseria gonorrhoeae DNA in the samples is determined.
Калибраторы (К1 и К2) готовили путем разведения стандартного образца производства (СОП) №181 Neisseria gonorrhoeae ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, содержащего фрагмент 16S rRNA Neisseria gonorrhoeae, клонированный по сайтам EcoRI в плечи фага λ - λgt10. Для разведения исходного СОП используется ДНК-буфер с poly(A). Конечная концентрация для калибратора К1 составляет 1*106 ГЭ/мл; для калибратора К2 - 1*104 ГЭ/мл.Calibrators (K1 and K2) were prepared by diluting a production standard sample (SOP) No. 181 of Neisseria gonorrhoeae FBSI Central Research Institute of Epidemiology of the Federal Service for Surveillance in Consumer Rights Protection and Human Welfare, containing a 16S rRNA fragment of Neisseria gonorrhoeae cloned at EcoRI sites into the shoulders of λ - λgt10 phage. A DNA buffer with poly (A) is used to dilute the initial SOP. The final concentration for the K1 calibrator is 1 * 10 6 GE / ml; for the K2 calibrator - 1 * 10 4 GE / ml.
Амплификацию проводили на приборе «Rotor-Gene Q» (QIAGEN, Германия). Значения пороговых циклов калибраторов и исследуемых образцов анализировались программой автоматического учета результатов. В соответствии с этими значениями автоматически была построена калибровочная прямая и рассчитаны концентрации ДНК Neisseria gonorrhoeae в исследованных цервикальных образцах от 6 пациенток (таблица 4).Amplification was performed on a Rotor-Gene Q instrument (QIAGEN, Germany). The values of the threshold cycles of calibrators and test samples were analyzed by the program of automatic calculation of results. In accordance with these values, a calibration line was automatically constructed and the concentration of Neisseria gonorrhoeae DNA in the studied cervical samples from 6 patients was calculated (table 4).
Установлено, что в дискордантном образце концентрация ДНК Neisseria gonorrhoeae самая низкая из всех исследованных образцов и составляет 2,50Е+02 ГЭ/мл. Данная концентрация ДНК N. gonorrhoeae лежит ниже границы аналитической чувствительности набора реагентов ГОНОПОЛ-РВ, что и объясняет получение отрицательного результата при исследовании с использованием этого набора.It was found that in the discordant sample, the concentration of Neisseria gonorrhoeae DNA is the lowest of all the studied samples and is 2.50 E + 02 GE / ml. This concentration of N. gonorrhoeae DNA lies below the analytical sensitivity limit of the GONOPOL-RV reagent kit, which explains the negative result when tested using this kit.
Количественное определение ДНК Neisseria gonorrhoeae может быть полезно для различных клинико-лабораторных и научно-исследовательских целей, таких как уточнение диагноза при сомнительных/дискордантных результатах анализа, определении чувствительности различных методов диагностики, мониторинга эффективности терапии.Quantitative determination of Neisseria gonorrhoeae DNA can be useful for various clinical, laboratory and research purposes, such as clarifying the diagnosis for questionable / discordant analysis results, determining the sensitivity of various diagnostic methods, and monitoring the effectiveness of therapy.
Пример 3. Исследование специфичности набора реагентов для выявления ДНК Neisseria gonorrhoeae по изобретению.Example 3. The study of the specificity of the reagent kit for detecting Neisseria gonorrhoeae DNA according to the invention.
Проблема недостаточной специфичности наборов реагентов для выявления ДНК Neisseria gonorrhoeae стоит особенно остро для образцов, взятых из мест колонизации негонококковых нейссерий, прежде всего глотки. Поэтому исследование специфичности набора реагентов по изобретению было проведено на образцах, взятых из глотки.The problem of the lack of specificity of the reagent kits for detecting Neisseria gonorrhoeae DNA is especially acute for samples taken from colonization sites of non-gonococcal neisseries, especially the pharynx. Therefore, the study of the specificity of the reagent kit according to the invention was carried out on samples taken from the throat.
В исследование были включены 80 здоровых добровольцев. От каждого добровольца получали биологический образец - мазок со слизистой задней стенки глотки. Взятые образцы помещали в 1 мл 0.9% раствора хлорида натрия и выделяли ДНК как описано в примере 1. Далее каждый образец исследовали методом полимеразной цепной реакции с использованием:The study included 80 healthy volunteers. A biological sample was obtained from each volunteer - a smear from the mucosa of the posterior pharyngeal wall. The samples were placed in 1 ml of a 0.9% sodium chloride solution and DNA was isolated as described in example 1. Next, each sample was investigated by the polymerase chain reaction using:
1) набора реагентов, содержащего родоспецифические праймеры к Neisseria spp. LU3 и NSN [Платонов А.Е. и др. Генодиагностика бактериальных менингитов и генотипирование их возбудителей. Пособие для врачей. Министерство здравоохранения Российской Федерации, Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии. Москва, 2001];1) a reagent kit containing rhodospecific primers for Neisseria spp. LU3 and NSN [Platonov A.E. Genodiagnosis of bacterial meningitis and genotyping of their pathogens. Manual for doctors. Ministry of Health of the Russian Federation, Central Research Institute of Epidemiology. Moscow, 2001];
2) набора реагентов для выявления ДНК Neisseria gonorrhoeae в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле «АмплиСенс® Neisseria gonorrhoeae-EPh» [Регистрационное удостоверение № ФСР 2009/04067 от 18.11.2011]2) a set of reagents for the detection of Neisseria gonorrhoeae DNA in clinical material by polymerase chain reaction (PCR) with electrophoretic detection of amplification products in agarose gel AmpliSens® Neisseria gonorrhoeae-EPh [Registration certificate No. FSR 2009/04067 of 11/18/2011]
3) набора реагентов по изобретению.3) a set of reagents according to the invention.
При исследовании образцов с использованием набора реагентов, содержащего родоспецифические праймеры к Neisseria spp. LU3 и NSN, все 80 образцов (100%) дали положительный результат. Это свидетельствует о том, что во всех образцах присутствовали представители Neisseria spp. - негонококковые нейссерии. При исследовании образцов с использованием набора реагентов «АмплиСенс® Neisseria gonorrhoeae-EPh», 10 образцов (12.5%) дали положительный результат. В данном наборе используются две мишени ПЦР, сррВ ген и ген цитозин-ДНК-метилтрансферазы; образец считается положительным только в случае положительных результатов в обеих реакциях. При исследовании образцов с использованием набора реагентов по изобретению ни один из образцов не дал положительный результат. Результаты секвенирования амплифицированных фрагментов подтвердили наличие в 10 образцах, положительных согласно набору «АмплиСенс® Neisseria gonorrhoeae-EPh», представителей Neisseria spp.: N. meningitidis, N. subflava, N. cinerea, N. flavescens, N. lactamica, N. sicca и других негонококковых нейссерий. Таким образом 10 положительных результатов, полученных при исследовании образцов с использованием этого набора, представляли собой ложноположительные результаты. Набор по изобретению не дал ни одного ложноположительного результата, таким образом его специфичность в данном эксперименте составила 100%.When examining samples using a reagent kit containing gender-specific primers for Neisseria spp. LU3 and NSN, all 80 samples (100%) gave a positive result. This indicates that representatives of Neisseria spp were present in all samples. - non-gonococcal neisseria. When examining samples using the AmpliSens® Neisseria gonorrhoeae-EPh reagent kit, 10 samples (12.5%) gave a positive result. This kit uses two PCR targets, the cprB gene and the cytosine DNA methyltransferase gene; the sample is considered positive only in the case of positive results in both reactions. When examining samples using the reagent kit of the invention, none of the samples gave a positive result. Sequencing of amplified fragments confirmed the presence in 10 samples positive according to the AmpliSens® Neisseria gonorrhoeae-EPh set of representatives of Neisseria spp .: N. meningitidis, N. subflava, N. cinerea, N. flavescens, N. lactamica, N. sicca and other non-gonococcal neisseries. Thus, 10 positive results obtained in the study of samples using this kit, were false positive results. The kit according to the invention did not give any false positive result, so its specificity in this experiment was 100%.
Claims (8)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015108676/10A RU2595398C1 (en) | 2015-03-12 | 2015-03-12 | Kit of reagents for detection of neisseria gonorrhoeae dna and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015108676/10A RU2595398C1 (en) | 2015-03-12 | 2015-03-12 | Kit of reagents for detection of neisseria gonorrhoeae dna and use thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2595398C1 true RU2595398C1 (en) | 2016-08-27 |
Family
ID=56891878
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015108676/10A RU2595398C1 (en) | 2015-03-12 | 2015-03-12 | Kit of reagents for detection of neisseria gonorrhoeae dna and use thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2595398C1 (en) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5432271A (en) * | 1989-05-24 | 1995-07-11 | Amoco Corporation | Nucleic acid probes for the detection of Neisseria gonorrhoeae |
| US5908744A (en) * | 1989-07-11 | 1999-06-01 | Gen-Probe Incorporated | Detecting Mycobacterium tuberculosis by nucleic acid sequence amplification |
| RU2348695C2 (en) * | 2006-05-23 | 2009-03-10 | Закрытое акционерное общество "Молекулярно-медицинские технологии" | Differentiating and specific oligonucleotids for dna sequence identification for infection agents in biological materials, method of species identification of infection agents, biochip and method implementation kit |
| RU2380408C1 (en) * | 2008-10-23 | 2010-01-27 | Федеральное Государственное Учреждение "Государственный Научный Центр Дерматовенерологии Федерального Агентства По Высокотехнологичной Медицинской Помощи" | METHOD FOR MOLECULAR TYPING OF Neisseria gonorrhoeae |
| JP2013188181A (en) * | 2012-03-14 | 2013-09-26 | Tosoh Corp | Method and reagent for detecting gonococcus |
-
2015
- 2015-03-12 RU RU2015108676/10A patent/RU2595398C1/en active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5432271A (en) * | 1989-05-24 | 1995-07-11 | Amoco Corporation | Nucleic acid probes for the detection of Neisseria gonorrhoeae |
| US5908744A (en) * | 1989-07-11 | 1999-06-01 | Gen-Probe Incorporated | Detecting Mycobacterium tuberculosis by nucleic acid sequence amplification |
| RU2348695C2 (en) * | 2006-05-23 | 2009-03-10 | Закрытое акционерное общество "Молекулярно-медицинские технологии" | Differentiating and specific oligonucleotids for dna sequence identification for infection agents in biological materials, method of species identification of infection agents, biochip and method implementation kit |
| RU2380408C1 (en) * | 2008-10-23 | 2010-01-27 | Федеральное Государственное Учреждение "Государственный Научный Центр Дерматовенерологии Федерального Агентства По Высокотехнологичной Медицинской Помощи" | METHOD FOR MOLECULAR TYPING OF Neisseria gonorrhoeae |
| JP2013188181A (en) * | 2012-03-14 | 2013-09-26 | Tosoh Corp | Method and reagent for detecting gonococcus |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| KAMEL A. ABD-ELSALAM, Bioinformatic tools and guideline for PCR primer design, African Journal of Biotechnology, 2003, v. 2, no. 5, p. 91-95. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10584392B2 (en) | Method for simultaneous detection and discrimination of bacterial, fungal, parasitic and viral infections of eye and central nervous system | |
| Gdoura et al. | Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, Mycoplasma hominis and Mycoplasma genitalium infections and semen quality of infertile men | |
| RU2625006C1 (en) | Method for target amplification of human reproductive organs infectors genomes for simultaneous identification of infectors with primer set | |
| CN103409509B (en) | Group B streptococcus fluorescence PCR detection kit | |
| CN103866034A (en) | Multiple real-time fluorescence quantification PCR (polymerase chain reaction) detection kit and detection method for helicobacter pylori in gastric juice | |
| CN107686863A (en) | The method that loop-mediated isothermal amplification technique detects three kinds of Urogenital Mycoplasmas | |
| Zhao et al. | Establishment and application of multiple cross displacement amplification coupled with lateral flow biosensor (MCDA-LFB) for visual and rapid detection of Candida albicans in clinical samples | |
| Shipitsyna et al. | Evaluation of polymerase chain reaction assays for the diagnosis of Trichomonas vaginalis infection in Russia | |
| CN109112186B (en) | Method for detecting leptospira by combining multi-cross amplification with nano biosensor | |
| CN103409508A (en) | Gonococcus/ureaplasma urealyticum/chlamydia trachomatis triple nucleic acid detection kit | |
| CN103725798A (en) | Primer, kit and detection method of detecting haemorrhagic fever with renal syndrome virus by RT-LAMP (Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification) method | |
| CN113186309A (en) | Urinary system bacterial infection detection system and kit and application thereof | |
| CN111088380A (en) | Brucella LF-RPA detection primer, probe and detection kit | |
| CN107460255A (en) | A kind of RT LAMP primers group, kit and application for detecting pig fourth type coronavirus | |
| US20120107809A1 (en) | Method for simultaneously detecting histoplasma capsulatum and paracoccidioides brasiliensis | |
| Gal et al. | Application of a polymerase chain reaction to detect Burkholderia pseudomallei in clinical specimens from patients with suspected melioidosis | |
| RU2646123C1 (en) | Method for identification of mutations resistant to resistance in mycoplasma genitalium and mycoplasma pneumoniae to macrolid antibiotics | |
| RU2715333C1 (en) | Kit of reagents for detection and identification of dna of brucellosis agents by real-time polymerase chain reaction om-screen-brucellosis-rv | |
| RU2486255C1 (en) | OLIGONUCLEOTIDES AND METHOD OF DETERMINING DNA OF BACTERIA BELONGING TO FAMILY Chlamydiaceae | |
| Mania‐Pramanik et al. | Diagnosis of Chlamydia trachomatis infection | |
| RU2595398C1 (en) | Kit of reagents for detection of neisseria gonorrhoeae dna and use thereof | |
| JP2013504319A (en) | Peptide nucleic acid probe, kit and method for detecting Helicobacter pylori and / or clarithromycin resistance, and use thereof | |
| CN106048051B (en) | A kind of candida krusei fluorescence PCR detection reagent kit | |
| RU2621863C2 (en) | Reagent kit for chlamydia trachomatis dna detection and its application | |
| WO2005030027A2 (en) | Salmonella detection identification |