RU2593943C1

RU2593943C1 - Apparatus for synthesis of oligo(poly)nucleotides

Info

Publication number: RU2593943C1
Application number: RU2015140819/10A
Authority: RU
Inventors: Юрий Геннадьевич Средин; Сергей Владимирович Власов
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "БИОССЕТ"
Priority date: 2015-09-24
Filing date: 2015-09-24
Publication date: 2016-08-10

Abstract

FIELD: biology.

SUBSTANCE: invention relates to devices for synthesis of DNA and RNA molecule fragments in automatic mode, is used in molecular biology, genetic engineering, medicine. Apparatus for synthesis of oligo(poly)nucleotides comprises a reaction column with a solid-phase carrier placed therein, container with reagents for synthesis and auxiliary reagents, means of feeding reactants into reaction column and means to remove reagents therefrom, excess pressure gas source, vessel with flushing liquid, gas and fluid valves. Device is equipped with control and monitoring means in form of a programmable computer. Reaction column is in form of cylindrical container with a piston located in cavity thereof, installed with possibility of movement along axis of vessel. Reaction column is equipped with piston position sensor and drive and has at least two inputs for supply and removal of reactants. One of inputs is located in piston, and second is located opposite - in base of cylindrical vessel.

EFFECT: higher quality of synthesis of oligo(poly)nucleotides using solid-phase carrier with possibility of changing their volume during synthesis and reduced consumption of reactants.

4 cl, 1 dwg

Description

Изобретение относится к устройствам для осуществления синтеза фрагментов молекул ДНК и РНК в автоматическом режиме, и может использоваться в молекулярной биологии, генной инженерии, медицине и других отраслях человеческой деятельности.The invention relates to devices for the synthesis of fragments of DNA and RNA molecules in an automatic mode, and can be used in molecular biology, genetic engineering, medicine, and other branches of human activity.

Аппараты для синтеза олиго(поли)нуклеотидов известны и используются на практике.Devices for the synthesis of oligo (poly) nucleotides are known and used in practice.

Например, известен аппарат для синтеза пептидов и других органических соединений, содержащий реакционную ячейку с твердофазным носителем, емкости с различными реактивами и емкость для пробы, средства для выборочного подключения емкости для пробы с одной из емкостей для реактивов и реакционной ячейкой, а также средство для переноса реактивов из емкостей с реактивами в реакционную ячейку и средство ускорения названного переноса реактивов с помощью источника газа под давлением, источник пониженного давления и средство выборочного соединения источника газа под давлением и источника пониженного давления с реакционной ячейкой [Патент США №3647390, МПК: С40В 60/14, B01J 14/00, С40В 40/10]. В этом аппарате перемещение реактивов из емкостей с реактивами в реакционную ячейку происходит за счет избыточного давления газа, а удаление отработанных реактивов из реакционной ячейки - за счет пониженного давления газа.For example, there is a known apparatus for synthesizing peptides and other organic compounds, containing a reaction cell with a solid phase carrier, containers with various reagents and a sample container, means for selectively connecting a sample vessel with one of the reagent containers and the reaction cell, as well as a means for transferring reagents from containers with reagents into the reaction cell and means for accelerating the named transfer of reagents using a gas source under pressure, a source of reduced pressure and a means of selective connection eniya gas source under pressure and a reduced pressure source to the reaction cell [US Patent №3647390, IPC: S40V 60/14, B01J 14/00, S40V 40/10]. In this apparatus, the movement of reagents from containers with reagents to the reaction cell occurs due to excessive gas pressure, and the removal of spent reagents from the reaction cell due to the reduced gas pressure.

В качестве твердофазного носителя для синтеза в этом аппарате используется стеклянный носитель с порами контролируемого размера (controlled pore glass - CPG) или полистирольный носитель. В процессе синтеза исходный объем твердофазного носителя увеличивается за счет прироста на его поверхности синтезируемых фрагментов молекул, поэтому расход реактивов, требуемый для проведения синтеза, возрастает. Чем больше начальная загрузка твердофазного носителя, тем больше изменяется его исходный объем в процессе синтеза и тем больше требуется рабочих реактивов для синтеза. Например, при синтезе олигонуклеотида, длиной 50 мономеров с использованием 3 миллиграмм стеклянного носителя (CPG), с начальной загрузкой 40-45 микромоль/грамм, исходный объем носителя увеличивается на (20-25)% за счет прироста синтезируемых олигонуклеотидов. Этот эффект наблюдается для всех известных твердофазных носителей.As a solid-phase carrier for synthesis, this apparatus uses a glass carrier with controlled pore glass (CPG) or a polystyrene carrier. During the synthesis process, the initial volume of the solid-phase carrier increases due to the increase in the synthesized fragments of molecules on its surface, therefore, the reagent consumption required for the synthesis increases. The larger the initial loading of the solid-phase carrier, the more its initial volume changes during the synthesis process and the more working reagents are required for synthesis. For example, in the synthesis of an oligonucleotide, 50 monomers long using 3 milligrams of glass carrier (CPG), with an initial loading of 40-45 micromol / gram, the initial volume of the carrier increases by (20-25)% due to the increase in the synthesized oligonucleotides. This effect is observed for all known solid-phase carriers.

Известен аппарат для синтеза пептидов и олигонуклеотидов, в котором используются твердофазные носители на полистирольной основе, включающий емкости с реактивами для синтеза пептидов или олигонуклеотидов, вспомогательными и промывочными жидкостями, реакционную колонку, средства для жидкостного соединения реакционной колонки и средств подачи жидкостей различного назначения [Патент США №5112575 МПК: C07K 1/04, С40В 40/06, С40В 60/14, B01J 19/00].A known apparatus for the synthesis of peptides and oligonucleotides, which uses solid-phase media on a polystyrene basis, including containers with reagents for the synthesis of peptides or oligonucleotides, auxiliary and flushing liquids, a reaction column, means for fluid connection of the reaction column and means for supplying liquids for various purposes [US Patent No. 5112575 IPC: C07K 1/04, C40B 40/06, C40B 60/14, B01J 19/00].

Также известен аппарат для твердофазного синтеза олигонуклеотидов, имеющий в своем составе реакционную колонку с верхним вводом в нее жидкостей и газов, и нижним вводом, снабженным пропускающим жидкости фильтром, средством для подачи газов и растворов в реакционную колонку, а также средством подачи в колонку газа для вытеснения из нее жидкостей [Патент США №6033631 МПК: С40В 50/06, B01J 4/00, С40В 40/02].An apparatus for solid-phase synthesis of oligonucleotides is also known, having in its composition a reaction column with an upper inlet of liquids and gases, and a lower inlet equipped with a liquid-passing filter, means for supplying gases and solutions to the reaction column, and also means for supplying a gas to the column for displacing liquids from it [US Patent No. 6033631 IPC: C40B 50/06, B01J 4/00, C40B 40/02].

Этот аппарат является ближайшим аналогом предлагаемого аппарата для синтеза олиго(поли)нуклеотидов и принят за прототип изобретения.This apparatus is the closest analogue of the proposed apparatus for the synthesis of oligo (poly) nucleotides and is adopted as a prototype of the invention.

Реакционная ячейка в прототипе имеет цилиндрическую форму, или форму усеченного конуса и постоянный объем.The reaction cell in the prototype has a cylindrical shape, or the shape of a truncated cone and a constant volume.

В таком аппарате при использовании твердофазных носителей возникает повышенный расход реагентов. Это объяснятся тем фактом, что исходный объем такого носителя увеличивается в процессе синтеза как за счет прироста синтезируемых молекул, так и за счет набухания носителя при смачивании его теми или иными реактивами, используемыми в процессе синтеза. Поэтому при заполнении носителем реакционной колонки постоянного объема значительную часть объема колонки оставляют пустой. Пустой объем заполняется носителем при увеличении его объема в ходе синтеза. Наличие пустых объемов приводит к избыточному расходу реактивов при проведении синтеза.In such an apparatus, when using solid-phase carriers, an increased consumption of reagents occurs. This is explained by the fact that the initial volume of such a carrier increases during the synthesis process, both due to the growth of the synthesized molecules and due to the swelling of the carrier when it is wetted by certain reagents used in the synthesis process. Therefore, when the carrier is filled with a constant volume reaction column, a significant portion of the column volume is left blank. An empty volume is filled with a carrier with an increase in its volume during synthesis. The presence of empty volumes leads to an excess consumption of reagents during the synthesis.

В данном аппарате при использовании твердофазных носителей на основе полистирола реакционная ячейка может быть заполнена не более чем на половину объема, свободное место в колонке должно быть оставлено для последующего увеличения объема носителя. При этом в ходе синтеза реакционная колонка должна заполняться реактивом полностью, т.к. в случае частичного заполнения полистирольный носитель может всплыть, и химическая реакция для всплывшей части носителя не выполнится, что приведет к резкому снижению эффективности синтеза или к синтезу олигонуклеотидов с неправильной структурой. Объемный избыток реактива, необходимый для обеспечения качественного синтеза, является причиной повышенного расхода реактивов.In this apparatus, when using solid-phase polystyrene-based carriers, the reaction cell can be filled no more than half the volume, free space in the column should be left for a subsequent increase in the volume of the carrier. Moreover, during the synthesis, the reaction column should be completely filled with reagent, because in the case of partial filling, the polystyrene carrier may emerge, and the chemical reaction for the floating part of the carrier will not be performed, which will lead to a sharp decrease in the synthesis efficiency or to the synthesis of oligonucleotides with an irregular structure. The volume excess of reagent necessary to ensure high-quality synthesis is the reason for the increased consumption of reagents.

Изобретение решает задачу снижения расхода реактивов при синтезе олиго(поли)нуклеотидов в реакционной колонке с использованием твердофазных носителей путем изменения объема колонки в процессе синтеза.The invention solves the problem of reducing the consumption of reagents in the synthesis of oligo (poly) nucleotides in a reaction column using solid-phase carriers by changing the volume of the column during the synthesis.

Поставленная задача решается тем, что предлагается аппарат для синтеза олиго(поли)нуклеотидов, включающий соединенные между собой, как показано на фиг. 1, реакционную колонку с размещенным в ней твердофазным носителем, емкости с реактивами для синтеза и вспомогательными реактивами, средство подачи реактивов в названную реакционную колонку и средство удаления из нее реактивов, источник газа избыточного давления, емкость с промывочной жидкостью, газовые и жидкостные клапаны, причем аппарат снабжен средством управления и контроля, выполненным в форме программируемой ЭВМ, реакционная колонка выполнена в форме цилиндрической емкости с размещенным в ее полости поршнем, установленным с возможностью его перемещения вдоль оси названной емкости для изменения ее объема во время синтеза, и как минимум двумя вводами для подачи и удаления реактивов, один из которых размещен в поршне, а второй размещен напротив - в основании цилиндрической емкости, и снабжена датчиком положения поршня и имеет привод.The problem is solved by the fact that the proposed apparatus for the synthesis of oligo (poly) nucleotides, including interconnected, as shown in FIG. 1, a reaction column with a solid-phase carrier placed therein, containers with synthesis reagents and auxiliary reagents, means for supplying reagents to the said reaction column and means for removing reagents from it, a source of overpressure gas, a tank with washing liquid, gas and liquid valves, the apparatus is equipped with control and monitoring means made in the form of a programmable computer, the reaction column is made in the form of a cylindrical tank with a piston placed in its cavity, mounted with It can be moved along the axis of the named container to change its volume during synthesis, and at least two inputs for supplying and removing reagents, one of which is placed in the piston, and the second is placed opposite - at the base of the cylindrical container, and is equipped with a piston position sensor and has drive unit.

Предпочтительно использовать шаговый двигатель с приводом, соединяющим его с поршнем реакционной колонки для приведения последнего в движение.It is preferable to use a stepper motor with a drive connecting it to the piston of the reaction column to set the latter in motion.

Средство удаления реактивов из реакционной колонки может содержать источник инертного газа, подаваемого в реакционную колонку под избыточным давлением.The means for removing reagents from the reaction column may contain a source of inert gas supplied to the reaction column under overpressure.

Средство удаления реактивов из реакционной камеры может быть снабжено вакуумным насосом.Means for removing reagents from the reaction chamber may be equipped with a vacuum pump.

Схема предлагаемого аппарата приведена на фиг. 1, где 1 -источник газа избыточного давления, 2-9 - газовые клапаны, 10 - емкость с промывочной жидкостью, 11-20 - емкости с реактивами, 21-34 - жидкостные клапаны, 35 - привод, предназначенный для изменения объема реакционной колонки, 36 - реакционная колонка, 36а - подвижная часть реакционной колонки (поршень), 36б - неподвижная часть реакционной колонки (цилиндр), 37 - емкость для отработанных реактивов.The proposed apparatus is shown in FIG. 1, where 1 is the source of overpressure gas, 2-9 are gas valves, 10 is a tank with flushing liquid, 11-20 are tanks with reagents, 21-34 are liquid valves, 35 is a drive designed to change the volume of the reaction column, 36 — reaction column, 36a — movable part of the reaction column (piston), 36b — stationary part of the reaction column (cylinder), 37 — capacity for spent reagents.

Предлагаемый аппарат для синтеза олиго(поли)нуклеотидов работает следующим образом.The proposed apparatus for the synthesis of oligo (poly) nucleotides works as follows.

В реакционную колонку 36 помещают твердофазный носитель, на котором осуществляют синтез целевого олиго(поли)нуклеотида. Этот носитель может быть выполнен из стекла, полистирола и других пригодных для этих целей материалов.A solid phase carrier is placed in the reaction column 36, on which the desired oligo (poly) nucleotide is synthesized. This carrier may be made of glass, polystyrene and other materials suitable for this purpose.

Реакционная колонка 36 может быть выполнена в виде цилиндрической емкости 36б, в полости которой установлен поршень 36а, с возможностью перемещения в объеме колонки с помощью привода с шаговым двигателем 35. Посредством трубопроводов реакционная колонка соединена с емкостями, содержащими реактивы, 11-20 и емкостью для отработанных реактивов 37. Подача того или иного реактива в реакционную колонку и удаление отработанных реактивов из колонки происходит за счет избыточного давления газа, подаваемого в емкости из источника газа 1, посредством открывания и закрывания соответствующих газовых клапанов 2-9 и жидкостных клапанов 21-34.The reaction column 36 can be made in the form of a cylindrical tank 36b, in the cavity of which a piston 36a is mounted, with the possibility of moving in the column volume using a drive with a stepper motor 35. Through pipelines, the reaction column is connected to containers containing reagents, 11-20 and a tank for spent reagents 37. The supply of a particular reagent to the reaction column and the removal of spent reagents from the column is due to the excess pressure of the gas supplied to the tank from the gas source 1, by opening tearing and closing the corresponding gas valves 2–9 and liquid valves 21–34.

Датчик положения поршня колонки (не показан) сообщает ЭВМ данные о положении поршня 36а. На основании этих данных при необходимости происходит перемещение поршня 36а внутри цилиндра 36б вдоль ее оси для увеличения или уменьшения объема полости реакционной колонки. Используемая реакционная колонка изменяет объем автоматически по программе в соответствии с ожидаемым на определенной стадии синтеза объемом носителя. Изменение объема реакционной колонки в зависимости от объема носителя позволяет оптимизировать расход подаваемых в колонку реактивов, и в итоге приводит к снижению затрат реактивов на синтез.The column piston position sensor (not shown) informs the computer of the position of the piston 36a. Based on these data, if necessary, the piston 36a moves inside the cylinder 36b along its axis to increase or decrease the volume of the cavity of the reaction column. The reaction column used changes the volume automatically according to the program in accordance with the volume of the carrier expected at a certain stage of the synthesis. Changing the volume of the reaction column depending on the volume of the carrier allows you to optimize the flow rate of the reagents supplied to the column, and ultimately leads to a decrease in the cost of reagents for synthesis.

Работой аппарата управляет программируемая ЭВМ, по командам которой открываются и закрываются газовые клапаны 2-9 и жидкостные клапаны 21-34, а также происходит перемещение подвижной части реакционной колонки - поршня 36а. Те или иные реактивы подаются в реакционную колонку 36 в зависимости от технологического регламента проводимого синтеза. Реактивы из соответствующих емкостей 11-20 при открытии жидкостных клапанов 6 поступают в реакционную колонку 36, после этого реактивы на определенное программой ЭВМ время остаются в реакционной колонке 36 и потом удаляются в сливную емкость 37 посредством подачи газа из источника избыточного давления 1 и открытия клапанов 9 и 34, или прокачкой промывочной жидкости из емкости 10 через реакционную колонку 36 в сливную емкость 37 посредством открытия клапанов 2, 21, 32 и 33.The operation of the apparatus is controlled by a programmable computer, by the commands of which gas valves 2–9 and liquid valves 21–34 are opened and closed, and the moving part of the reaction column, the piston 36a, is moved. One or another reagent is fed into the reaction column 36, depending on the technological regulation of the synthesis. The reagents from the respective containers 11-20 when opening the liquid valves 6 enter the reaction column 36, after which the reagents remain in the reaction column 36 for a certain period of time by the computer program and then are removed to the drain tank 37 by supplying gas from the overpressure source 1 and opening the valves 9 and 34, or by pumping the washing liquid from the tank 10 through the reaction column 36 into the drain tank 37 by opening the valves 2, 21, 32 and 33.

Таким образом, предлагаемый аппарат синтеза олиго(поли)нуклеотидов работает в оптимальных условиях, что позволяет снизить расход реактивов при синтезе с использованием твердофазных носителей, способных изменять свой объем в процессе синтеза, при этом качество синтезируемых олиго(поли)нуклеотидов сохраняется.Thus, the proposed apparatus for the synthesis of oligo (poly) nucleotides operates under optimal conditions, which allows to reduce the consumption of reagents during synthesis using solid-phase carriers capable of changing their volume during the synthesis, while the quality of the synthesized oligo (poly) nucleotides is preserved.

Claims

1. Аппарат для синтеза олиго(поли)нуклеотидов, включающий соединенные между собой, как показано на фиг. 1, реакционную колонку с размещенным в ней твердофазным носителем, емкости с реактивами для синтеза и вспомогательными реактивами, средство подачи реактивов в названную реакционную колонку и средство удаления из нее реактивов, источник газа избыточного давления, емкость с промывочной жидкостью, газовые и жидкостные клапаны, причем аппарат снабжен средством управления и контроля, выполненным в форме программируемой ЭВМ, реакционная колонка выполнена в форме цилиндрической емкости с размещенным в ее полости поршнем, установленным с возможностью его перемещения вдоль оси названной емкости для изменения ее объема во время синтеза, и как минимум двумя вводами для подачи и удаления реактивов, один из которых размещен в поршне, а второй размещен напротив - в основании цилиндрической емкости, и снабжена датчиком положения поршня и имеет привод.1. Apparatus for the synthesis of oligo (poly) nucleotides, including interconnected, as shown in FIG. 1, a reaction column with a solid-phase carrier placed therein, containers with synthesis reagents and auxiliary reagents, means for supplying reagents to the said reaction column and means for removing reagents from it, a source of overpressure gas, a tank with washing liquid, gas and liquid valves, the apparatus is equipped with control and monitoring means made in the form of a programmable computer, the reaction column is made in the form of a cylindrical tank with a piston placed in its cavity, mounted with It can be moved along the axis of the named container to change its volume during synthesis, and at least two inputs for supplying and removing reagents, one of which is placed in the piston, and the second is placed opposite - at the base of the cylindrical container, and is equipped with a piston position sensor and has drive unit.

2. Аппарат по п. 1, отличающийся тем, что поршень реакционной колонки приводится в движение шаговым двигателем с приводом.2. The apparatus according to claim 1, characterized in that the piston of the reaction column is driven by a stepper motor with a drive.

3. Аппарат по п. 1, отличающийся тем, что средство удаления реактивов из реакционной колонки содержит источник инертного газа, подаваемого в реакционную колонку.3. The apparatus according to claim 1, characterized in that the means for removing the reagents from the reaction column contains a source of inert gas supplied to the reaction column.

4. Аппарат по п. 1, отличающийся тем, что средство удаления реактивов из реакционной камеры снабжено вакуумным насосом. 4. The apparatus according to claim 1, characterized in that the means for removing reagents from the reaction chamber is equipped with a vacuum pump.