RU2588480C2 - Antibody against lipoarabinomannan and immunoassay of infections caused by acid-fast bacilli, using antibody - Google Patents
Antibody against lipoarabinomannan and immunoassay of infections caused by acid-fast bacilli, using antibody Download PDFInfo
- Publication number
- RU2588480C2 RU2588480C2 RU2014138806/10A RU2014138806A RU2588480C2 RU 2588480 C2 RU2588480 C2 RU 2588480C2 RU 2014138806/10 A RU2014138806/10 A RU 2014138806/10A RU 2014138806 A RU2014138806 A RU 2014138806A RU 2588480 C2 RU2588480 C2 RU 2588480C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tuberculosis
- lam
- acid
- antibody
- bacillus
- Prior art date
Links
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 title claims abstract description 324
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 title claims abstract description 324
- 244000052616 bacterial pathogens Species 0.000 title abstract description 4
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 title description 20
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 title description 3
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 claims abstract description 471
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 152
- 102000005614 monoclonal antibodies Human genes 0.000 claims abstract description 130
- 108010045030 monoclonal antibodies Proteins 0.000 claims abstract description 130
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 44
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 17
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 376
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 366
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 claims description 348
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 168
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 139
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 96
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 81
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 claims description 39
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 35
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 35
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 34
- 229940072185 DRUGS FOR TREATMENT OF TUBERCULOSIS Drugs 0.000 claims description 33
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 claims description 33
- 239000000814 tuberculostatic agent Substances 0.000 claims description 32
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 22
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 21
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 17
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 14
- 210000001736 Capillaries Anatomy 0.000 claims description 11
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 10
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 6
- 210000001772 Blood Platelets Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000002365 anti-tubercular Effects 0.000 claims description 3
- 230000036961 partial Effects 0.000 claims description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 22
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 150
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 100
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 79
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 70
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 59
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 53
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 53
- 210000003802 Sputum Anatomy 0.000 description 53
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 48
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 48
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 45
- 241000186367 Mycobacterium avium Species 0.000 description 44
- 229960004689 BCG Vaccine Drugs 0.000 description 39
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 35
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 35
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 33
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 33
- 239000000047 product Substances 0.000 description 32
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 31
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 30
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 27
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 27
- 239000002609 media Substances 0.000 description 27
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 26
- 210000000952 Spleen Anatomy 0.000 description 25
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 25
- 238000011120 smear test Methods 0.000 description 25
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 24
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 21
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 20
- 230000000692 anti-sense Effects 0.000 description 19
- 102000005632 Single-Chain Antibodies Human genes 0.000 description 17
- 108010070144 Single-Chain Antibodies Proteins 0.000 description 17
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 17
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 17
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 16
- 230000000890 antigenic Effects 0.000 description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 16
- 102100008209 TSC1 Human genes 0.000 description 15
- 108060006881 kamA Proteins 0.000 description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 15
- 230000001954 sterilising Effects 0.000 description 15
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 14
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 14
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 13
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 13
- 210000004408 Hybridomas Anatomy 0.000 description 13
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 13
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 13
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 13
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 13
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 13
- 238000011161 development Methods 0.000 description 13
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 12
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 12
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 12
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 11
- 241000186364 Mycobacterium intracellulare Species 0.000 description 11
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 11
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 11
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 11
- 206010006049 Bovine tuberculosis Diseases 0.000 description 10
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 10
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 10
- 230000000240 adjuvant Effects 0.000 description 10
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 10
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 10
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 9
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 9
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 9
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 9
- 238000010517 secondary reaction Methods 0.000 description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 9
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 8
- 210000003296 Saliva Anatomy 0.000 description 8
- 238000004026 adhesive bonding Methods 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- -1 sticks Substances 0.000 description 8
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 7
- 210000002700 Urine Anatomy 0.000 description 7
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 7
- 108091008117 polyclonal antibodies Proteins 0.000 description 7
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 6
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N Imidazole Chemical compound C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 6
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 6
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 6
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 6
- 229920000126 Latex Polymers 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 229960000070 antineoplastic Monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 5
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 5
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 5
- 229960000060 monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N Ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 108010047814 Antigen-Antibody Complex Proteins 0.000 description 4
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 4
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001467553 Mycobacterium africanum Species 0.000 description 4
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 4
- 229940010383 Mycobacterium tuberculosis Drugs 0.000 description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- TWFZGCMQGLPBSX-UHFFFAOYSA-N carbendazim Chemical compound C1=CC=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=C1 TWFZGCMQGLPBSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000005591 charge neutralization Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 4
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 108090000745 Immune Sera Proteins 0.000 description 3
- 210000000214 Mouth Anatomy 0.000 description 3
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 3
- 241000187678 Nocardia asteroides Species 0.000 description 3
- 241001503673 Nocardia farcinica Species 0.000 description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 3
- 241000283898 Ovis Species 0.000 description 3
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 3
- 241000204063 Tsukamurella paurometabola Species 0.000 description 3
- 230000000721 bacterilogical Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000001010 compromised Effects 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 3
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 3
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 3
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 3
- 239000012209 synthetic fiber Substances 0.000 description 3
- 229960005486 vaccines Drugs 0.000 description 3
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 1-[(1S,2R,3R,4S,5R,6R)-3-carbamimidamido-6-{[(2R,3R,4R,5S)-3-{[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy}-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy}-2,4,5-trihydroxycyclohexyl]guanidine Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 241000186041 Actinomyces israelii Species 0.000 description 2
- 210000000628 Antibody-Producing Cells Anatomy 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 108091003117 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 2
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000002421 Cell Wall Anatomy 0.000 description 2
- 229920002301 Cellulose acetate Polymers 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 210000003608 Feces Anatomy 0.000 description 2
- 210000004051 Gastric Juice Anatomy 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- 102000018358 Immunoglobulins Human genes 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulins Proteins 0.000 description 2
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N Isoniazid Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N Kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 2
- 210000004072 Lung Anatomy 0.000 description 2
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 description 2
- 210000001819 Pancreatic Juice Anatomy 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene (PE) Substances 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 2
- 241000187436 Streptomyces globisporus Species 0.000 description 2
- YNXIUVSQFABKNJ-LMZYMKEFSA-N [2-formyloxy-3-[hydroxy-[(1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2,3,4,5-tetrahydroxy-6-[(2R,3S,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxycyclohexyl]oxyphosphoryl]oxypropyl] formate Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](OP(O)(=O)OCC(COC=O)OC=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O YNXIUVSQFABKNJ-LMZYMKEFSA-N 0.000 description 2
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 2
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 2
- 239000011358 absorbing material Substances 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 2
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 101700057991 invA4 Proteins 0.000 description 2
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000565 sealant Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 2
- JJGWLCLUQNFDIS-GTSONSFRSA-M sodium;1-[6-[5-[(3aS,4S,6aR)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]hexanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)CCCCCNC(=O)CCCC[C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1 JJGWLCLUQNFDIS-GTSONSFRSA-M 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 2
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HHEHWCIYDICHCG-ODZAUARKSA-N (Z)-but-2-enedioic acid;methoxyethene Chemical class COC=C.OC(=O)\C=C/C(O)=O HHEHWCIYDICHCG-ODZAUARKSA-N 0.000 description 1
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-dichloroethane Chemical compound ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHWMKUMDYANCKA-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid;sodium Chemical compound [Na].ON1C(=O)CC(S(O)(=O)=O)C1=O UHWMKUMDYANCKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZWUPPJBUPHOXQV-UHFFFAOYSA-M 2-(3-hydroxy-6-oxoxanthen-9-yl)benzoic acid;cyanate Chemical compound [O-]C#N.OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=CC(=O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C21 ZWUPPJBUPHOXQV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BTZVOUAMBYPYCC-UHFFFAOYSA-N 4-(dimethylamino)-2H-pyridine-1-carbonitrile;tetrafluoroborate Chemical compound F[B-](F)(F)F.CN(C)C1=CCN(C#N)C=C1 BTZVOUAMBYPYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000565 Acquired immunodeficiency syndrome Diseases 0.000 description 1
- IBVAQQYNSHJXBV-UHFFFAOYSA-N Adipic acid dihydrazide Chemical compound NNC(=O)CCCCC(=O)NN IBVAQQYNSHJXBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 1
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 1
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 101710029981 BLLF1 Proteins 0.000 description 1
- 210000001124 Body Fluids Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 Bovine Serum Albumin Drugs 0.000 description 1
- 229940105657 CATALASE Drugs 0.000 description 1
- 229920002574 CR-39 Polymers 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- AOGYCOYQMAVAFD-UHFFFAOYSA-N Chloroformic acid Chemical compound OC(Cl)=O AOGYCOYQMAVAFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N Cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010053835 EC 1.11.1.6 Proteins 0.000 description 1
- 102000016938 EC 1.11.1.6 Human genes 0.000 description 1
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- AEUTYOVWOVBAKS-UWVGGRQHSA-N Ethambutol Chemical compound CC[C@@H](CO)NCCN[C@@H](CC)CO AEUTYOVWOVBAKS-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 229960000285 Ethambutol Drugs 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 240000008528 Hevea brasiliensis Species 0.000 description 1
- 108010000345 Immobilized Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N Maleic anhydride Chemical class O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001147360 Microtus agrestis Species 0.000 description 1
- 210000004080 Milk Anatomy 0.000 description 1
- 241000186360 Mycobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000187919 Mycobacterium microti Species 0.000 description 1
- 241001049988 Mycobacterium tuberculosis H37Ra Species 0.000 description 1
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-ammonioethanesulfonate Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NRNCYVBFPDDJNE-UHFFFAOYSA-N Pemoline Chemical compound O1C(N)=NC(=O)C1C1=CC=CC=C1 NRNCYVBFPDDJNE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 1
- IPEHBUMCGVEMRF-UHFFFAOYSA-N Pyrazinamide Chemical compound NC(=O)C1=CN=CC=N1 IPEHBUMCGVEMRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005206 Pyrazinamide Drugs 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N RIFAMPICIN Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N Rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940081190 Rifampin Drugs 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 229960005322 Streptomycin Drugs 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 229920004894 Triton X-305 Polymers 0.000 description 1
- 238000006058 Ugi-reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036462 Unbound Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000001058 adult Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 230000024126 agglutination involved in conjugation with cellular fusion Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000956 alloy Substances 0.000 description 1
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- REDXJYDRNCIFBQ-UHFFFAOYSA-N aluminium(3+) Chemical class [Al+3] REDXJYDRNCIFBQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminum Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001458 anti-acid Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay method Methods 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 102000024070 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091007650 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 1
- 230000037348 biosynthesis Effects 0.000 description 1
- 201000004569 blindness Diseases 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- WGXQAZYFZVZEGQ-UHFFFAOYSA-N borax Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].O1B(O)O[B-]2(O)OB(O)O[B-]1(O)O2 WGXQAZYFZVZEGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001488 breeding Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 229920003211 cis-1,4-polyisoprene Polymers 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000020639 clam Nutrition 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cells Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 125000000664 diazo group Chemical group [N-]=[N+]=[*] 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin family Proteins 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical Effects 0.000 description 1
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious Effects 0.000 description 1
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 101700075443 invA3 Proteins 0.000 description 1
- 150000002513 isocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960003350 isoniazid Drugs 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 231100000864 loss of vision Toxicity 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 201000009671 multidrug-resistant tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 239000002365 multiple layer Substances 0.000 description 1
- 101700054071 myo1 Proteins 0.000 description 1
- 101700008033 myo2 Proteins 0.000 description 1
- 229920001194 natural rubber Polymers 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000011022 operating instruction Methods 0.000 description 1
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 244000052769 pathogens Species 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N phenol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OC1=CC=CC=C1 OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920001888 polyacrylic acid Polymers 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 229920003288 polysulfone Polymers 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000005871 repellent Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 125000003616 serine group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 231100000197 serious side effect Toxicity 0.000 description 1
- 231100000486 side effect Toxicity 0.000 description 1
- 229940074545 sodium dihydrogen phosphate dihydrate Drugs 0.000 description 1
- VBJGJHBYWREJQD-UHFFFAOYSA-M sodium;dihydrogen phosphate;dihydrate Chemical compound O.O.[Na+].OP(O)([O-])=O VBJGJHBYWREJQD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000057 synthetic resin Substances 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 1
- 238000004642 transportation engineering Methods 0.000 description 1
- 241001446247 uncultured actinomycete Species 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, которое специфически связывается с липоарабиноманнаном кислотоустойчивых бацилл, таких как бацилла туберкулеза, и, конкретно, к одноцепочечному антителу (scFv) и его мультивалентному антителу.The present invention relates to a monoclonal antibody that specifically binds to lipoarabinomannan acid-resistant bacilli, such as tuberculosis bacillus, and, in particular, to a single-chain antibody (scFv) and its multivalent antibody.
Настоящее изобретение дополнительно относится к способу обнаружения кислотоустойчивых бацилл с использованием антител, конкретно, к способу диагностирования туберкулеза или способу диагностики туберкулеза; и реагенту для обнаружения кислотоустойчивой бациллы (например, реагенту для обнаружения туберкулеза), и набору для обнаружения кислотоустойчивой бациллы (например, набору для диагностики туберкулеза), которые предназначены для использования в вышеуказанном способе.The present invention further relates to a method for detecting acid-resistant bacilli using antibodies, specifically, to a method for diagnosing tuberculosis or a method for diagnosing tuberculosis; and a reagent for detecting an acid-resistant bacillus (for example, a reagent for detecting tuberculosis), and a kit for detecting an acid-resistant bacillus (for example, a kit for diagnosing tuberculosis) that are intended for use in the above method.
Настоящее изобретение дополнительно относится к способу определения лечебного эффекта в отношении туберкулеза противотуберкулезного лекарственного средства с использованием антитела; и набору для определения лечебного эффекта в отношении туберкулеза противотуберкулезного лекарственного средства, которые предназначены для использования в вышеуказанном способе.The present invention further relates to a method for determining a therapeutic effect against tuberculosis of an anti-TB drug using an antibody; and a kit for determining a therapeutic effect in relation to tuberculosis of an anti-tuberculosis drug that is intended for use in the above method.
Уровень техникиState of the art
Туберкулез представляет собой инфекционное заболевание, которое досаждает людям в течение нескольких тысяч лет, и по оценкам, ¼ взрослого населения Европы в девятнадцатом веке умерло от туберкулеза. Благодаря улучшению жизненного уровня и открытию антибиотиков в двадцатом веке, туберкулез был практически искоренен в промышленных странах в 1950-е годы. Однако туберкулез все еще свирепствует как периодически повторяющееся заболевание. В настоящее время оценивают, что одна треть населения мира инфицирована туберкулезной бациллой (скрытая форма туберкулеза). Утверждают, что общее количество пациентов с впервые выявленным туберкулезом в мире составляет 9,4 миллиона, и оценивают, что 2 миллиона пациентов среди них умирают от него. В настоящее время, приблизительно 95% пациентов с активной формой туберкулеза живут в развивающихся странах, и 99% людей, которые умирают от туберкулеза, сконцентрированы в развивающихся странах.Tuberculosis is an infectious disease that has plagued people for several thousand years, and it is estimated that ¼ of the adult population of Europe in the nineteenth century died of tuberculosis. Thanks to improved living standards and the discovery of antibiotics in the twentieth century, tuberculosis was virtually eradicated in industrial countries in the 1950s. However, tuberculosis is still rampant as a recurring disease. It is currently estimated that one third of the world's population is infected with a tuberculous bacillus (latent form of tuberculosis). It is claimed that the total number of patients with newly diagnosed tuberculosis in the world is 9.4 million, and it is estimated that 2 million patients among them die from it. Currently, approximately 95% of patients with active tuberculosis live in developing countries, and 99% of people who die from tuberculosis are concentrated in developing countries.
В 1990-х годах, мировое сообщество осознало снова, что число случаев заболевания туберкулезом все еще продолжает возрастать, таким образом, туберкулез становится самым серьезным инфекционным заболеванием, становящимся центральной проблемой в развивающихся странах, требующей принятия полномасштабных мер. Мероприятия против туберкулеза проводятся в условиях глобального сотрудничества, такого как развертывание Непосредственно Наблюдаемого Лечения, с Сокращенным Курсом (DOTS), в наибольшей степени под эгидой Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ), основание “Партнерства для Прекращения Туберкулеза” для принятия мер при сотрудничестве стран, которых эта проблема непосредственно касается, стран, предоставляющих помощь, и организация помощи, и основание “Фонда Борьбы со СПИД, Туберкулезом и Малярией” как системы для предоставления финансовой поддержки. Многие из существующих технологий, которые применяют в качестве контрмер против туберкулеза, обычно применялись в течение нескольких десятков лет, без каких-либо улучшений. Следовательно, существует острая потребность в разработке новых технологий, которые являются эффективными в развивающихся странах.In the 1990s, the world community again realized that the number of cases of tuberculosis was still increasing, thus making tuberculosis the most serious infectious disease, becoming a central problem in developing countries requiring full-scale measures. Tuberculosis interventions are carried out in a global partnership, such as the deployment of Directly Observed Treatment, with the Reduced Course (DOTS), most under the auspices of the World Health Organization (WHO), the foundation of the “Partnership for Stopping Tuberculosis” to take measures in collaboration with countries that this problem is directly related to the countries providing aid, and the organization of assistance, and the foundation of the “Fund to Fight AIDS, Tuberculosis and Malaria” as a system for providing financial support. Many of the existing technologies that are used as countermeasures against tuberculosis have usually been used for several decades, without any improvement. Consequently, there is an urgent need to develop new technologies that are effective in developing countries.
При диагностики туберкулеза, наиболее важно обнаружить инфекцию туберкулезной бациллы на ранней стадии, чтобы начать терапию. В частности, поскольку пациенты, которые находятся в состоянии выделения бактерий, имеют крайне высокий риск распространения инфекции на окружающих людей, необходимо лечить этих пациентов в изолированном окружении, без какого-либо контакта с окружающими людьми. В качестве теста для этого существует “Бактериологический анализ туберкулеза” и тест на мазок мокроты, описанный в нем, применяют наиболее часто.When diagnosing tuberculosis, it is most important to detect an infection of the tuberculous bacillus at an early stage in order to start therapy. In particular, since patients who are in a state of bacterial isolation have an extremely high risk of spreading the infection to surrounding people, it is necessary to treat these patients in an isolated environment, without any contact with surrounding people. As a test for this, there is a “Bacteriological analysis of tuberculosis” and the sputum smear test described in it is used most often.
Тест мазка мокроты представляет собой метод для непосредственного наблюдения и обследования образца мазка мокроты под микроскопом (прямая микроскопия образца мазка мокроты), и был установлен Робертом Кохом более столетия назад. Микобактерий идентифицируют в клиническом тестируемом образце посредством окрашивания патогена туберкулеза. Метод диагностики туберкулеза, применяемый в настоящее время, был установлен посредством практического использования технологии, применяемой Кохом. Тест на туберкулезную бациллу в мазке является стандартным методом для диагностики туберкулеза в развивающихся странах, и его также применяют в качестве референтного при оценке эффективности осуществления нового метода тестирования.A sputum smear test is a method for directly observing and examining a sputum smear sample under a microscope (direct microscopy of a sputum smear sample), and was established by Robert Koch over a century ago. Mycobacteria are identified in a clinical test sample by staining the tuberculosis pathogen. The diagnostic method currently used for tuberculosis has been established through the practical use of technology used by Koch. A smear test for tuberculosis bacillus is a standard method for the diagnosis of tuberculosis in developing countries, and it is also used as a reference in evaluating the effectiveness of a new testing method.
Метод генной амплификации был установлен в качестве метода, который имеет более высокую чувствительность, чем тест мазка мокроты. Метод генной амплификации представляет собой метод для увеличения специфичного фрагмента ДНК по типу цепной реакции с использованием ДНК-полимеразы. Принцип этого метода состоит в амплификации ДНК, которая предназначена для тестирования, с использованием ДНК, подлежащей амплификации, одной пары ДНК-праймеров, которые являются комплементарными последовательностям по обоим концам ДНК, и термостойкой ДНК-полимеразы, и осуществлении повторяющихся температурных изменений. Несмотря на то что метод генной амплификации является удовлетворительным с позиций чувствительности, трудно применять данный метод в развивающихся странах вследствие пригодности к эксплуатации, оборудования и затрат.The method of gene amplification was established as a method that has a higher sensitivity than a sputum smear test. The method of gene amplification is a method for increasing a specific DNA fragment by the type of chain reaction using DNA polymerase. The principle of this method is the amplification of DNA, which is intended for testing, using DNA to be amplified, one pair of DNA primers that are complementary to the sequences at both ends of the DNA and heat-resistant DNA polymerase, and the implementation of repeated temperature changes. Despite the fact that the method of gene amplification is satisfactory in terms of sensitivity, it is difficult to apply this method in developing countries due to the suitability for operation, equipment and costs.
В качестве последней глобальной тенденции, вследствие распространения туберкулеза, резистентного к множеству лекарственных средств, интерес направлен в сторону необходимости теста культуры и теста с амплификацией нуклеиновой кислоты. Однако, среди разнообразных бактериологических методов диагностики, которые существуют, тест мазка мокроты (прямой микроскопии мокроты) все еще считают центральным ядром стратегий контрмер против туберкулеза. Особенно в бедных ресурсами развивающихся странах, в которых распространяется туберкулез, тест мазка мокроты является не только эффективным диагностическим методом, но также играет важную роль в качестве средства для определения терапевтического эффекта.As a recent global trend, due to the spread of multidrug-resistant tuberculosis, interest is directed towards the need for a culture test and a nucleic acid amplification test. However, among the diverse bacteriological diagnostic methods that exist, a sputum smear test (direct sputum microscopy) is still considered the central core of countermeasure strategies against tuberculosis. Especially in resource-poor developing countries where tuberculosis is spreading, a sputum smear test is not only an effective diagnostic method, but also plays an important role as a means to determine the therapeutic effect.
Как описано выше, несмотря на то что тест мазка мокроты является ядром базовой стратегии борьбы с туберкулезом, количество работников, которые проводят бактериологическое исследование, во многих развивающихся странах является абсолютно недостаточным, и считают, что профессиональные качества таких работников являются проблематичными. Поскольку эффективность этого теста зависит от квалификации лаборантов, ежедневное обучение и контроль качества являются существенными, а они являются причинами для чрезмерного увеличения общих затрат. В дополнение, развивающиеся страны имеют много проблем с социальной инфраструктурой, решение которых требуется для улучшения лабораторного окружения, инструментов тестирования, технологий тестирования и т.п. Эти факторы становятся запутанными сложным образом, и в результате, неблагоприятно влияют на качество теста в немалой степени.As described above, although a sputum smear test is the core of a basic tuberculosis control strategy, the number of workers who conduct bacteriological research in many developing countries is absolutely inadequate and consider the professional qualities of such workers to be problematic. Since the effectiveness of this test depends on the qualifications of laboratory assistants, daily training and quality control are essential, and they are reasons for an excessive increase in overall costs. In addition, developing countries have many problems with the social infrastructure, the solution of which is required to improve the laboratory environment, testing tools, testing technologies, etc. These factors become complicated in a complex way, and as a result, adversely affect the quality of the test to a large extent.
Кроме того, поскольку тест мазка мокроты является тестом для обнаружения и идентификации кислотоустойчивых бацилл, но не методом обнаружения туберкулезных бацилл, с помощью этого теста невозможно идентифицировать туберкулезные бациллы.In addition, since a sputum smear test is a test for the detection and identification of acid-resistant bacilli, but not a method for detecting tuberculosis bacilli, it is not possible to identify tuberculosis bacilli with this test.
Что касается терапии туберкулеза в развитых странах, то терапию с использованием химического средства инициируют после идентификации туберкулезной бациллы; в то время как программу DOTS, осуществляемую в развивающихся странах, терапию с использованием химического средства, начинают, когда кислотоустойчивую бациллу обнаруживают в тесте мазка мокроты без идентификации туберкулезной бациллы. В настоящем описании, несмотря на то, химические средства, используемые для инфекции туберкулезных бацилл и инфекции нетуберкулезных туберкулезных кислотоустойчивых бацилл, являются различными, терапию проводят для нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл, в основном, применяя химическое средство для туберкулезной бациллы, поскольку лекарственное средство с высоким терапевтическим эффектом для нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл не было разработано. Следовательно, пациент должен нести риск побочных эффектов от химического средства. Представительные примеры рисков, на которые было обращено внимание, включают серьезные побочные эффекты, такие как снижение функции печени и потеря зрения, и распространение резистентных к лекарственному средству нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл.As for the treatment of tuberculosis in developed countries, therapy using a chemical agent is initiated after the identification of a tuberculosis bacillus; while the DOTS program being implemented in developing countries, chemical therapy is started when an acid-resistant bacillus is found in a sputum smear test without identifying the tuberculosis bacillus. In the present description, although the chemicals used for infection of tuberculosis bacilli and infections of non-tuberculosis tuberculosis acid-resistant bacilli are different, the treatment is carried out for non-tuberculosis acid-resistant bacilli, mainly using a chemical agent for tuberculosis bacilli, since the drug has a high therapeutic effect acid-resistant bacilli have not been developed for non-tuberculosis. Therefore, the patient should bear the risk of side effects from the chemical. Representative examples of risks that have been addressed include serious side effects, such as decreased liver function and loss of vision, and the spread of drug-resistant, non-tuberculic, acid-resistant bacilli.
Как описано выше, несмотря на существование нескольких проблем в известной до настоящего времени диагностике туберкулеза и его терапии, метод тестирования мазка мокроты, разработанный Кохом в 1882 г., все еще применяется сейчас для диагностики туберкулеза без каких-либо крупных улучшений. С целью решения проблем в развивающихся странах и вновь появляющихся странах, касающихся социальной инфраструктуры, необходимой для лабораторного окружения, инструментов для тестирования, технологий тестирования и т.д.; возможными являются две меры, т.е. “установление высокочувствительного и низкозатратного метода тестирования, который позволяет проводить высокопроизводительную обработку образцов, собранных в ограниченных местах, укомплектованных энергоснабжением и оборудованием” или “установление Пункта оказания помощи при тестировании (РОСТ), который является высокочувствительным, быстрым, простым и низкозатратным и, который осуществляет работу без использования инструментария, который требует энергоснабжения”.As described above, despite the existence of several problems in the diagnosis of tuberculosis and its therapy known to date, the sputum smear test method developed by Koch in 1882 is still used to diagnose tuberculosis without any major improvements. In order to solve problems in developing countries and emerging countries regarding the social infrastructure necessary for the laboratory environment, testing tools, testing technologies, etc .; two measures are possible, i.e. “Establishing a highly sensitive and low-cost testing method that allows high-performance processing of samples collected in limited places, equipped with power supply and equipment” or “establishing a Test Assistance Point (GROWTH), which is highly sensitive, fast, simple and low-cost and that implements work without the use of tools that require power supply. "
Системы энергоснабжения и оборудование в развивающихся странах и вновь возникающих странах, также размещаются, если они находятся в очень ограниченной области. Дополнительно, центры тестирования, которые осуществляют относительно прогрессивные тесты, уже существуют в такой области, и некоторые здоровые пациенты могут использовать эти службы. Посредством использования таких центров тестирования, проблемы, такие как лабораторное оборудование, инструменты для тестирования, технологии тестирования и человеческие ресурсы, могут быть решены. В таком случае, необходимо транспортировать пациента или образец мокроты из места медицинского обследования в центр тестирования. Существуют несколько основных ограничений при транспортировке образцов мокроты, используемых для теста с амплификацией нуклеиновой кислоты или теста с культурой. Чтобы предотвратить загрязнение и рост нежелательных микробов, образцы должны быть немедленно помещены в холодильник после сбора мокроты, подлежащей транспортировке. Кроме того, поскольку для теста с культурой важно содержать бактерии в состоянии способности к росту, больше мер предосторожности требуется при сравнении с генетическим тестированием. Дополнительно, так как оба теста не могут осуществляться, когда с образцом проводят операцию по стерилизации, такую как тепловая обработка, образцы должны транспортироваться в строго контролируемом состоянии. Поскольку система, с помощью которой можно манипулировать такими ограничениями, включенная в транспорт образца, не установлена в развивающихся странах и вновь возникающих странах, важно установить аналитический тест, способный к обнаружению даже в образцах, прошедших операцию по стерилизации, применяемую к ним.Energy supply systems and equipment in developing countries and emerging countries are also located if they are in a very limited area. Additionally, testing centers that perform relatively advanced tests already exist in this area, and some healthy patients can use these services. Through the use of such testing centers, problems such as laboratory equipment, testing tools, testing technologies and human resources can be solved. In this case, it is necessary to transport the patient or sputum sample from the place of medical examination to the testing center. There are several major limitations when transporting sputum samples used for a nucleic acid amplification test or culture test. To prevent contamination and growth of unwanted microbes, samples should be immediately refrigerated after collecting sputum to be transported. In addition, since it is important to keep bacteria in a state of growth ability for a culture test, more precautions are required when compared with genetic testing. Additionally, since both tests cannot be carried out when a sterilization operation, such as heat treatment, is carried out on the sample, the samples must be transported in a strictly controlled condition. Since the system by which such restrictions can be manipulated, included in sample transport, is not installed in developing countries and newly emerging countries, it is important to establish an analytical test capable of detection even in samples that have undergone sterilization surgery applied to them.
При реализации РОСТ важно обеспечить анализ в условиях клиники в течение короткого периода времени без использования специального оборудования и инструментов. Технология, применяемая наиболее часто для РОСТ, представляет собой иммунохроматографический тест (ИХТ). В целом, считается, что ИХТ уступает методам иммунологического анализа, таким как ELISA, по чувствительности. Следовательно, если проблемы должны решаться с использованием РОСТ, будет важным установить аналитическую систему, способную к обнаружению с высокой чувствительностью. Кроме того, в случае с РОСТ, поскольку работникам трудно предпринять меры по предотвращению инфекции посредством использования безопасных кабинетов и т.п., применяемых в центрах тестирования, существенной является стерилизационная обработка для снижения риска инфекции от образца.When implementing ROST, it is important to provide analysis in a clinic for a short period of time without the use of special equipment and tools. The technology most commonly used for GROWTH is an immunochromatographic test (ICT). In general, it is believed that CPI is inferior to immunoassay methods, such as ELISA, in sensitivity. Therefore, if problems are to be solved using GROWTH, it will be important to establish an analytical system capable of detection with high sensitivity. In addition, in the case of GROWTH, since it is difficult for workers to take measures to prevent infection through the use of safe rooms and the like used in testing centers, sterilization treatment is essential to reduce the risk of infection from the sample.
Следовательно, является необходимым установить аналитический тест, способный к обнаружению с высокой чувствительностью в стерилизованных образцах для “установления высокочувствительного и низкозатратного метода тестирования, который обеспечивает высокопроизводительную обработку образцов, собранных в ограниченных местах, укомплектованных энергоснабжением и оборудованием” и “установление Пункта оказания помощи при тестировании (РОСТ), который является высокочувствительным, быстрым, простым и низкозатратным и, который осуществляет работу без использования инструмента, который требует энергоснабжения”. Чтобы это сделать, важным является выбор целевого антигена. В качестве антигенов, специфичных для туберкулезных бацилл, сообщают о белковых антигенах, таких как Ag85. Однако, поскольку белковые антигены являются быстроразрушаемыми и усваиваемыми in vivo, с ними едва ли может быть получена тонкая чувствительность.Therefore, it is necessary to establish an analytical test capable of detecting with high sensitivity in sterilized samples in order to “establish a highly sensitive and low-cost testing method that provides high-performance processing of samples collected in limited places equipped with power supply and equipment” and “establish a Test Assistance Point (GROWTH), which is highly sensitive, fast, simple and low cost and which It works without the use of a tool that requires power. ” To do this, the choice of the target antigen is important. As antigens specific for tuberculosis bacilli, protein antigens such as Ag85 are reported. However, since protein antigens are rapidly degradable and digestible in vivo, subtle sensitivity can hardly be obtained with them.
Основные антигены у кислотоустойчивых бацилл включают гликолипиды, которые являются основными составными частями клеточных мембран и клеточных стенок. Гликолипидные антигены считаются одним из типов перспективных целевых антигенов, поскольку они являются высокоустойчивыми in vivo. Среди них, ЛАМ составляет 15% от компонентов бактериальной клетки, и представляет собой антиген, который привлекает внимание также с позиций его количества. Существует несколько сообщений о создании PoAb и MoAb с целью обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл в живых образцах (см. Непатентные литературные источники 1-4 (НПЛ 1-4)). В двух из этих сообщений, применяют ELISA для обнаружения липоарабиноманнана (далее в настоящем описании, также именуемого “ЛАМ”) в мокроте или моче. Однако, основные структуры ЛАМов у кислотоустойчивых бацилл являются почти одинаковыми, за исключением небольшого различия, наблюдаемого в структуре маннозной верхушки. В частности, у Mycobacterium avium, которая является бактерией, вызывающей инфекции кислотоустойчивыми бациллами наиболее часто, находясь на втором месте после туберкулезной бациллы, структура маннозной верхушки является почти такой же, как и у туберкулезной бациллы (см. непатентная литература 5 (НПЛ 5)). Следовательно, существует потребность в моноклональном антителе, способном специфически обнаруживать ЛАМ туберкулезной бациллы среди кислотоустойчивых бацилл.Major antigens in acid-resistant bacilli include glycolipids, which are the main components of cell membranes and cell walls. Glycolipid antigens are considered one of the types of promising target antigens because they are highly resistant in vivo. Among them, LAM makes up 15% of the components of a bacterial cell, and is an antigen, which also attracts attention from the standpoint of its quantity. There are several reports of the creation of PoAb and MoAb in order to detect LAM of acid-resistant bacilli in living samples (see Non-Patent Literature 1-4 (NPL 1-4)). In two of these reports, ELISAs are used to detect lipoarabinomannan (hereinafter, also referred to as “LAM”) in sputum or urine. However, the basic structures of LAMs in acid-resistant bacilli are almost the same, with the exception of the slight difference observed in the structure of the mannose apex. In particular, in Mycobacterium avium, which is the bacterium that causes infection with acid-resistant bacilli most often, being in second place after the tuberculous bacillus, the structure of the mannose tip is almost the same as that of the tuberculous bacillus (see Non-Patent Literature 5 (NPL 5)) . Therefore, there is a need for a monoclonal antibody capable of specifically detecting LAM of a tuberculosis bacillus among acid-resistant bacilli.
Список цитируемых источниковList of cited sources
Непатентная литератураNon-Patent Literature
NPL 1: Aharona Glatman-Freedman et al., “Monoclonal antibodies to surface antigens of Mycobacterium tuberculosis and their use in a modified Enzyme-Linked Immunosorbent Spot Assay for detection of Mycobacteria,” Journal of Clinical Microbiology, Nov. 1996, pp. 2795-2802.NPL 1: Aharona Glatman-Freedman et al., “Monoclonal antibodies to surface antigens of Mycobacterium tuberculosis and their use in a modified Enzyme-Linked Immunosorbent Spot Assay for detection of Mycobacteria,” Journal of Clinical Microbiology, Nov. 1996, pp. 2795-2802.
NPL 2: Lenka M. Pereira Arias-Bouda et al., “Development of antigen detection assay for diagnosis of tuberculosis using sputum samples,” Journal of Clinical Microbiology, June 2000, pp. 2278-2283.NPL 2: Lenka M. Pereira Arias-Bouda et al., “Development of antigen detection assay for diagnosis of tuberculosis using sputum samples,” Journal of Clinical Microbiology, June 2000, pp. 2278-2283.
NPL 3: Beston Hamasur et al., “Rapid diagnosis of tuberculosis by detection of acid-fast bacillary lipoarabinomannan in urine,” Journal of Microbiological Methods, 45, 2001, pp. 41-52.NPL 3: Beston Hamasur et al., “Rapid diagnosis of tuberculosis by detection of acid-fast bacillary lipoarabinomannan in urine,” Journal of Microbiological Methods, 45, 2001, pp. 41-52.
NPL 4: C. Boehme et al., “Detection of acid-fast bacillary lipoarabinomannan with an antigen-capture ELISA in unprocessed urine of Tanzanian patients with suspected tuberculosis”, Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 99, 2005, pp. 893-900.NPL 4: C. Boehme et al., “Detection of acid-fast bacillary lipoarabinomannan with an antigen-capture ELISA in unprocessed urine of Tanzanian patients with suspected tuberculosis”, Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 99, 2005, pp. 893-900.
NPL 5: Lipoarabinomannans: from structure to biosynthesis. Jérôme Nigou, Martine Gilleron, Germain Puzo, Biochimie 85 (2003) 153-166.NPL 5: Lipoarabinomannans: from structure to biosynthesis. Jérôme Nigou, Martine Gilleron, Germain Puzo, Biochimie 85 (2003) 153-166.
NPL 6: Winter et al., Annu. Rev. Immunol., 12:433, 1994.NPL 6: Winter et al., Annu. Rev. Immunol., 12: 433, 1994.
NPL 7: K. Zuberbühler, Protein Engineering, Design & Selection, 22, 169 (2009).NPL 7: K. Zuberbühler, Protein Engineering, Design & Selection, 22, 169 (2009).
Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
Техническая проблемаTechnical problem
Целью настоящего изобретения является получение моноклонального антитела, которое специфически связывается с липоарабиноманнаном (далее в настоящем описании иногда называемым “ЛАМ”) кислотоустойчивых бацилл, таких как бацилла туберкулеза, и, конкретно, одноцепочечное антитело (scFv) и его мультивалентное антитело.An object of the present invention is to provide a monoclonal antibody that specifically binds to lipoarabinomannan (hereinafter sometimes referred to as “LAM”) of acid-resistant bacilli, such as tuberculosis bacillus, and specifically a single-chain antibody (scFv) and its multivalent antibody.
Еще одной целью настоящего изобретения является способ обнаружения кислотоустойчивых бацилл с использованием антитела или способ диагностики туберкулеза, реагент для обнаружения кислотоустойчивой бациллы (например, реагент для диагностики туберкулеза) и набор для обнаружения кислотоустойчивой бациллы (например, набор для диагностики туберкулеза) с использованием способа.Another objective of the present invention is a method for detecting acid-resistant bacilli using an antibody or a method for diagnosing tuberculosis, a reagent for detecting an acid-resistant bacillus (e.g., a reagent for diagnosing tuberculosis) and a kit for detecting an acid-resistant bacillus (e.g., a kit for diagnosing tuberculosis) using the method.
Дополнительной целью настоящего изобретения является способ определения лечебного эффекта в отношении туберкулеза противотуберкулезного лекарственного средства с использованием антител; и набор для определения лечебного эффекта в отношении туберкулеза противотуберкулезного лекарственного средства, которые предназначены для использования в вышеуказанном способе.An additional objective of the present invention is a method for determining the therapeutic effect against tuberculosis of an anti-TB drug using antibodies; and a kit for determining a therapeutic effect against tuberculosis of an anti-tuberculosis drug that is intended for use in the above method.
Решение проблемыSolution
Посредством разработки метода получения или селекции подходящих иммунного животного, иммуногена и MoAb, авторы настоящего изобретения успешно разработали антитело и способ анализа, который может различать ЛАМ кислотоустойчивых бацилл от ЛАМ других бактерий или мембранных антигенов, структурно сходных с ним и специфически обнаруживать ЛАМ кислотоустойчивых бацилл с высокой чувствительностью, которая сравнима с чувствительностью методов обнаружения с амплификацией генов. Дополнительно, авторы настоящего изобретения успешно разработали антитело, которое может различать ЛАМ туберкулезных бацилл и ЛАМ кислотоустойчивых нетуберкулезных бацилл, и специфически обнаруживать ЛАМ туберкулезных бацилл.By developing a method for producing or breeding a suitable immune animal, immunogen, and MoAb, the present inventors have successfully developed an antibody and an assay method that can distinguish LAMs of acid-resistant bacilli from LAMs of other bacteria or membrane antigens structurally similar to it and specifically detect LAMs of acid-resistant bacilli with high sensitivity, which is comparable to the sensitivity of detection methods with amplification of genes. Additionally, the authors of the present invention have successfully developed an antibody that can distinguish between LAM of tuberculosis bacilli and LAM of acid-resistant non-tuberculosis bacilli, and specifically detect LAM of tuberculosis bacilli.
Таким образом, настоящее изобретение включает следующие варианты осуществления.Thus, the present invention includes the following embodiments.
(I) Моноклональное антитело (I-1), которое специфически связывается с липоарабиноманнаном (ЛАМ) кислотоустойчивых бацилл.(I) Monoclonal antibody (I-1), which specifically binds to lipoarabinomannan (LAM) of acid-resistant bacilli.
(I-1) Моноклональное антитело, которое является способным к связыванию с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, антитело, приведенное в любом из (А)-(С) ниже:(I-1) A monoclonal antibody that is capable of binding to LAM acid resistant bacilli, the antibody shown in any of (A) to (C) below:
(А) моноклональное антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, соединенные через линкер, вариабельную область тяжелой цепи, содержащую тяжелые цепи CDR1-CDR3, показанные в (а)-(с) ниже, и легкие цепи, содержащие CDR1-CDR3, показанные в (d)-(f) ниже:(A) a monoclonal antibody containing the variable region of the heavy chain and the variable region of the light chain connected through a linker, the variable region of the heavy chain containing the heavy chains of CDR1-CDR3 shown in (a) to (c) below, and light chains containing CDR1 -CDR3 shown in (d) to (f) below:
(а) тяжелая цепь CDR1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1,(a) a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
(b) тяжелая цепь CDR2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2,(b) a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2,
(c) тяжелая цепь CDR3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3,(c) a heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3,
(d) легкая цепь CDR1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4,(d) a light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4,
(e) легкая цепь CDR2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5, и(e) a light chain CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and
(f) легкая цепь CDR3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6,(f) a light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6,
(B) моноклональное антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, соединенные через линкер, вариабельную область тяжелой цепи, содержащую тяжелые цепи CDR1-CDR3, показанные в (g)-(i) ниже, и легкие цепи, содержащие CDR1-CDR3, показанные в (j)-(l) ниже:(B) a monoclonal antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region linked through a linker, a heavy chain variable region containing CDR1-CDR3 heavy chains shown in (g) to (i) below, and light chains containing CDR1 -CDR3 shown in (j) to (l) below:
(g) тяжелая цепь CDR1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:31,(g) a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31,
(h) тяжелая цепь CDR2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:32,(h) a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32,
(i) тяжелая цепь CDR3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:33,(i) a heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33,
(j) легкая цепь CDR1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:34,(j) a light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34,
(k) легкая цепь CDR2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:35 и(k) a light chain CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 and
(l) легкая цепь CDR3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:36 и(l) a light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 and
(C) моноклональное антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, соединенные через линкер, вариабельную область тяжелой цепи, содержащую тяжелые цепи CDR1-CDR3, показанные в (m)-(o) ниже, и легкие цепи, содержащие CDR1-CDR3, показанные в (p)-(r) ниже:(C) a monoclonal antibody containing a heavy chain variable region and a light chain variable region linked through a linker, a heavy chain variable region containing CDR1-CDR3 heavy chains shown in (m) to (o) below, and light chains containing CDR1 -CDR3 shown in (p) to (r) below:
(m) тяжелая цепь CDR1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:47,(m) a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47,
(n) тяжелая цепь CDR2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:48,(n) a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48,
(o) тяжелая цепь CDR3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:49,(o) a heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49,
(p) легкая цепь CDR1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:50,(p) a light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50,
(q) легкая цепь CDR2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:51 и(q) a light chain CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 and
(r) легкая цепь CDR3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:52.(r) a light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52.
(I-2) Моноклональное антитело в соответствии с (I-1), где вариабельная область тяжелой цепи моноклонального антитела из (А) состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:7.(I-2) The monoclonal antibody according to (I-1), wherein the heavy chain variable region of the monoclonal antibody of (A) consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
(I-3) Моноклональное антитело в соответствии с (I-1) или (I-2), где вариабельная область тяжелой цепи моноклонального антитела из (А) состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:8.(I-3) The monoclonal antibody according to (I-1) or (I-2), wherein the heavy chain variable region of the monoclonal antibody of (A) consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
(I-4) Моноклональное антитело в соответствии с любым из от (I-1) до (I-3), где линкер моноклонального антитела из (А) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11.(I-4) The monoclonal antibody according to any one of (I-1) to (I-3), wherein the linker of the monoclonal antibody of (A) has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
(I-5) Моноклональное антитело в соответствии с любым из от (I-1) до (I-4), где моноклональное антитело из (А) состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.(I-5) A monoclonal antibody according to any one of (I-1) to (I-4), where the monoclonal antibody of (A) consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
(I-6) Моноклональное антитело в соответствии с любым из от (I-1) до (I-5), где моноклональное антитело из (А) способно к специфическому связыванию с ЛАМ туберкулезной бациллы, предпочтительно, туберкулезной бациллы человека (M. tuberculosis).(I-6) A monoclonal antibody according to any one of (I-1) to (I-5), wherein the monoclonal antibody of (A) is capable of specifically binding to a LAM of a tuberculosis bacillus, preferably a human tuberculosis bacillus (M. tuberculosis )
(I-7) Моноклональное антитело в соответствии с (I-1), где вариабельная область тяжелой цепи моноклонального антитела из (В) состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:37.(I-7) The monoclonal antibody according to (I-1), wherein the heavy chain variable region of the monoclonal antibody of (B) consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37.
(I-8) Моноклональное антитело в соответствии с (I-1) или (I-7), где вариабельная область легкой цепи моноклонального антитела из (В) состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:38.(I-8) A monoclonal antibody according to (I-1) or (I-7), wherein the light chain variable region of the monoclonal antibody of (B) consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38.
(I-9) Моноклональное антитело в соответствии с любым из (I-1), (I-7) и (I-8), где линкер моноклонального антитела из (В) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:40.(I-9) A monoclonal antibody according to any of (I-1), (I-7) and (I-8), wherein the linker of the monoclonal antibody of (B) has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40.
(I-10) Моноклональное антитело в соответствии с любым из (I-1) и (I-7)-(I-9), где моноклональное антитело из (В) состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:39.(I-10) A monoclonal antibody according to any one of (I-1) and (I-7) - (I-9), wherein the monoclonal antibody of (B) consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39.
(I-11) Моноклональное антитело в соответствии с (I-1), где вариабельная область тяжелой цепи моноклонального антитела из (С) состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:53.(I-11) The monoclonal antibody according to (I-1), wherein the heavy chain variable region of the monoclonal antibody of (C) consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53.
(I-12) Моноклональное антитело в соответствии с (I-1) или (I-11), где вариабельная область легкой цепи моноклонального антитела из (С) состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:54.(I-12) The monoclonal antibody according to (I-1) or (I-11), wherein the light chain variable region of the monoclonal antibody of (C) consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54.
(I-13) Моноклональное антитело в соответствии с любым из (I-1), (I-11) и (I-12), где линкер моноклонального антитела из (С) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11.(I-13) A monoclonal antibody according to any one of (I-1), (I-11) and (I-12), wherein the linker of the monoclonal antibody from (C) has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
(I-14) Моноклональное антитело в соответствии с любым из (I-1) и (I-11)-(I-13), где моноклональное антитело из (С) состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:30.(I-14) A monoclonal antibody according to any one of (I-1) and (I-11) to (I-13), wherein the monoclonal antibody of (C) consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30.
(I-15) Моноклональное антитело в соответствии с любым из (I-1) и (I-7)-(I-14), где моноклональное антитело из (В) или (С) способно специфически связываться с нетуберкулезной кислотоустойчивой бациллой.(I-15) A monoclonal antibody according to any one of (I-1) and (I-7) - (I-14), wherein the monoclonal antibody from (B) or (C) is capable of specifically binding to a non-tuberculosis acid-resistant bacillus.
(I-16) Моноклональное антитело в соответствии с любым из (I-1)-(I-15), где моноклональное антитело из любого из (А)-(С) является моновалентным или бивалентным антителом.(I-16) A monoclonal antibody according to any one of (I-1) - (I-15), wherein the monoclonal antibody from any of (A) - (C) is a monovalent or bivalent antibody.
(II) Способ иммунизации животного, не являющегося человеком, для продуцирования моноклонального антитела, которое специфически связывается с липоарабиноманнаном (ЛАМ) кислотоустойчивых бацилл, и способ получения моноклонального антитела.(II) A method for immunizing a non-human animal to produce a monoclonal antibody that specifically binds to lipoarabinomannan (LAM) of acid-resistant bacilli, and a method for producing a monoclonal antibody.
(II-1) Способ иммунизации животного, не являющегося человеком, для продуцирования моноклонального антитела, которое специфически связывается с липоарабиноманнаном (ЛАМ) кислотоустойчивых бацилл, способ, включающий введение БЦЖ в качестве иммуногена животному, не являющемуся человеком, чтобы индуцировать гуморальный иммунный ответ на БЦЖ.(II-1) A method of immunizing a non-human animal to produce a monoclonal antibody that specifically binds to lipoarabinomannan (LAM) of acid-resistant bacilli, a method comprising administering BCG as an immunogen to a non-human animal to induce a humoral immune response to BCG .
(II-2) Способ в соответствии с (II-1), где животное, не являющееся человеком, представляет собой кролика или цыпленка.(II-2) The method according to (II-1), wherein the non-human animal is a rabbit or chicken.
(II-3) Способ в соответствии с (II-1) или (II-2), где кислотоустойчивая бацилла представляет собой туберкулезную бациллу, предпочтительно, туберкулезную бациллу человека (M. tuberculosis).(II-3) The method according to (II-1) or (II-2), wherein the acid-resistant bacillus is a tuberculosis bacillus, preferably a human tuberculosis bacillus (M. tuberculosis).
(II-4) Способ получения моноклонального антитела, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, способ, включающий стадии:(II-4) A method for producing a monoclonal antibody that specifically binds to LAM of acid-resistant bacilli, a method comprising the steps of:
введения БЦЖ в качестве иммуногена животному, не являющемуся человеком, чтобы индуцировать гуморальный иммунный ответ на БЦЖ и продуцировать антитело, которое связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл; иadministering BCG as an immunogen to a non-human animal to induce a humoral immune response to BCG and produce an antibody that binds LAM to acid-resistant bacilli; and
сбор клеток, которые продуцируют антитело из животного, не являющегося человеком.collecting cells that produce an antibody from a non-human animal.
(II-5) Способ получения моноклонального антитела, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, способ, включающий стадии:(II-5) A method for producing a monoclonal antibody that specifically binds to LAM of acid-resistant bacilli, a method comprising the steps of:
введения BCG в качестве иммуногена животному, не являющемуся человеком, чтобы индуцировать гуморальный иммунный ответ на БЦЖ;administering BCG as an immunogen to a non-human animal in order to induce a humoral immune response to BCG;
получения мРНК, кодирующей антитело, которое связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл из животного, не являющегося человеком;obtaining mRNA encoding an antibody that binds to LAM acid-resistant bacilli from an animal that is not a person;
получения кДНК с использованием мРНК в качестве матрицы; иobtaining cDNA using mRNA as a template; and
сбора моноклональных антител, которые специфически связываются с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл посредством метода фагового дисплея с использованием кДНК.collection of monoclonal antibodies that specifically bind to LAM acid-resistant bacilli through phage display method using cDNA.
(II-6) Способ в соответствии с (II-4) или (II-5), где животное, не являющееся человеком, представляет собой кролика или цыпленка.(II-6) The method according to (II-4) or (II-5), wherein the non-human animal is a rabbit or chicken.
(II-7) Способ в соответствии с любым из (II-4)-(II-6), где кислотоустойчивая бацилла представляет собой туберкулезную бациллу, предпочтительно, туберкулезную бациллу человека (M. tuberculosis).(II-7) The method according to any one of (II-4) to (II-6), wherein the acid-resistant bacillus is a tuberculosis bacillus, preferably a human tuberculosis bacillus (M. tuberculosis).
(II-8) Способ в соответствии с любым из (II-4)-(II-7), где моноклональное антитело, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, представляет собой моноклональное антитело в соответствии с любым из (I-1)-(I-12).(II-8) The method in accordance with any of (II-4) to (II-7), where the monoclonal antibody that specifically binds to LAM acid-resistant bacilli is a monoclonal antibody in accordance with any of (I-1) - (I-12).
(II-9) Способ в соответствии с любым из (II-4)-(II-8), где моноклональное антитело, которое специфически связывается с ЛАМ туберкулезной бациллы, предпочтительно, туберкулезной бациллы человека (M. tuberculosis), представляет собой моноклональное антитело из (А) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6).(II-9) The method according to any one of (II-4) to (II-8), wherein the monoclonal antibody that specifically binds to the LAM of a tuberculosis bacillus, preferably a human tuberculosis bacillus (M. tuberculosis), is a monoclonal antibody from (A) in accordance with any of (I-1) to (I-6).
(II-10) Способ получения моноклонального антитела, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, способ, включающий стадии:(II-10) A method for producing a monoclonal antibody that specifically binds to LAM of acid-resistant bacilli, a method comprising the steps of:
введения комплекса ЛАМ и моноклонального антитела из (А) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6) в качестве иммуногена животному, не являющемуся человеком, для индуцирования гуморального иммунного ответа на комплекс; и получения антитела, которое связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл; иadministering a complex of LAM and the monoclonal antibody from (A) according to any one of (I-1) to (I-6) as an immunogen to an animal other than a human, to induce a humoral immune response to the complex; and obtaining antibodies that binds to LAM acid-resistant bacilli; and
сбора клеток, которые продуцируют антитело, из животного, не являющегося человеком.collecting cells that produce the antibody from an animal that is not a person.
(II-11) Способ получения моноклонального антитела, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, способ, включающий стадии:(II-11) A method for producing a monoclonal antibody that specifically binds to LAM of acid-resistant bacilli, a method comprising the steps of:
введения комплекса ЛАМ и моноклонального антитела из (А) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6) в качестве иммуногена животному, не являющемуся человеком, для индуцирования гуморального иммунного ответа на комплекс;administering a complex of LAM and the monoclonal antibody from (A) according to any one of (I-1) to (I-6) as an immunogen to an animal other than a human, to induce a humoral immune response to the complex;
получения мРНК, кодирующей антитело, которое связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, из животного, не являющегося человеком;obtaining mRNA that encodes an antibody that binds to LAM acid-resistant bacilli from an animal that is not a person;
получения кДНК с использованием мРНК в качестве матрицы; иobtaining cDNA using mRNA as a template; and
сбора моноклонального антитела, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, посредством метода фагового дисплея с использованием кДНК.collecting monoclonal antibodies, which specifically binds to LAM acid-resistant bacilli, using the phage display method using cDNA.
(II-12) Способ в соответствии с (II-10) или (II-11), где моноклональное антитело, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, представляет собой моноклональное антитело из (В) в соответствии с любым из (I-1) и (I-7)-(I-12).(II-12) The method according to (II-10) or (II-11), where the monoclonal antibody that specifically binds to LAM acid-resistant bacilli is a monoclonal antibody from (B) in accordance with any of (I-1 ) and (I-7) - (I-12).
(III) Способ обнаружения кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы.(III) A method for detecting acid-resistant bacilli, preferably a tuberculosis bacillus.
(III-1) Способ обнаружения кислотоустойчивой бациллы, предпочтительно, туберкулезной бациллы, способ, включающий стадии:(III-1) A method for detecting an acid resistant bacillus, preferably a tuberculosis bacillus, a method comprising the steps of:
(1) приведения моноклонального антитела в соответствии с любым из (I-1)-(I-16) в контакт с биологическим образцом индивида; и(1) bringing the monoclonal antibody in accordance with any of (I-1) to (I-16) in contact with a biological sample of an individual; and
(2) проведения анализа на кислотоустойчивую бациллу, предпочтительно, туберкулезную бациллу, которая существует в образце, с использованием, в качестве показателя, реакции связывания между моноклональным антителом и ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы.(2) analysis of an acid-resistant bacillus, preferably a tuberculosis bacillus, which exists in the sample, using, as an indicator, the binding reaction between the monoclonal antibody and LAM acid-resistant bacilli, preferably LAM tuberculosis bacillus.
(III-2) Способ в соответствии с (III-1), где в способе обнаружения туберкулезной бациллы используют моноклональное антитело из (А) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6).(III-2) The method according to (III-1), wherein the monoclonal antibody from (A) according to any of (I-1) to (I-6) is used in the method for detecting a tuberculous bacillus.
Среди приведенных выше способов обнаружения, способ обнаружения туберкулезной бациллы может быть перефразирован как способ диагностики туберкулеза у пациентов (способ диагностики туберкулеза).Among the above detection methods, a method for detecting a tuberculous bacillus can be rephrased as a method for diagnosing tuberculosis in patients (a method for diagnosing tuberculosis).
(IV) Реагент для диагностики туберкулеза и набор для диагностики туберкулеза.(IV) Reagent for the diagnosis of tuberculosis and a kit for the diagnosis of tuberculosis.
(IV-1) Реагент для диагностики туберкулеза, содержащий моноклональное антитело из (А) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6).(IV-1) A reagent for the diagnosis of tuberculosis containing the monoclonal antibody from (A) in accordance with any of (I-1) to (I-6).
(IV-2) Набор для диагностики туберкулеза, содержащий моноклональное антитело из (А) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6) в качестве реагента для обнаружения туберкулеза.(IV-2) A kit for diagnosing tuberculosis containing the monoclonal antibody from (A) according to any one of (I-1) to (I-6) as a reagent for detecting tuberculosis.
(V) Способ измерения содержания липоарабиноманнана кислотоустойчивых бацилл (ЛАМ).(V) A method for measuring the content of lipoarabinomannan acid-resistant bacilli (LAM).
(V-1) Способ измерения содержания ЛАМ кислотоустойчивых бацилл в тестируемом образце, включающий стадии:(V-1) A method for measuring LAM content of acid-resistant bacilli in a test sample, comprising the steps of:
(1) приведения моноклонального антитела в соответствии с любым из (I-1)-(I-6) в контакт с тестируемым образцом, который может содержать кислотоустойчивую бациллу; и(1) bringing the monoclonal antibody according to any one of (I-1) to (I-6) into contact with a test sample, which may contain an acid-resistant bacillus; and
(2) проведения анализа на ЛАМ кислотоустойчивых бацилл в тестируемом образце с использованием реакции связывания между моноклональным антителом и ЛАМ кислотоустойчивых бацилл в качестве показателя.(2) analysis of LAM acid resistant bacilli in the test sample using the binding reaction between the monoclonal antibody and LAM acid resistant bacilli as an indicator.
(V-2) Способ в соответствии с (V-1), который представляет собой способ качественной оценки ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, включающий обнаружение ЛАМ кислотоустойчивых бацилл как на стадии (2), или представляет собой способ количественной оценки ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, включающий количественное определение ЛАМ кислотоустойчивых бацилл как на стадии (2).(V-2) The method in accordance with (V-1), which is a method for the qualitative assessment of LAM of acid-resistant bacilli, comprising detecting LAM of acid-resistant bacilli as in step (2), or is a method of quantitative assessment of LAM of acid-resistant bacilli, including quantitative determination LAM of acid-resistant bacilli as in stage (2).
(V-3) Способ в соответствии с (V-1) или (V-2), где кислотоустойчивая бацилла представляет собой туберкулезную бациллу, предпочтительно, туберкулезную бациллу человека (M. tuberculosis).(V-3) The method according to (V-1) or (V-2), wherein the acid-resistant bacillus is a tuberculosis bacillus, preferably a human tuberculosis bacillus (M. tuberculosis).
(V-4) Способ в соответствии с (V-3), где моноклональное антитело представляет собой моноклональное антитело из (А) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6).(V-4) The method according to (V-3), wherein the monoclonal antibody is a monoclonal antibody from (A) in accordance with any of (I-1) to (I-6).
(VI) Реагент для обнаружения липоарабиноманнана (ЛАМ) кислотоустойчивых бацилл или набор для его обнаружения.(VI) Reagent for the detection of lipoarabinomannan (LAM) acid-resistant bacilli or kit for its detection.
(VI-1) Реагент для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, содержащий моноклональное антитело в соответствии с любым из (I-1)-(I-16).(VI-1) Reagent for the detection of LAM acid-resistant bacilli containing a monoclonal antibody in accordance with any of (I-1) - (I-16).
(VI-2) Реагент для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, содержащий моноклональное антитело из (А) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6).(VI-2) Reagent for the detection of LAM acid-resistant bacilli containing the monoclonal antibody from (A) in accordance with any of (I-1) - (I-6).
(VI-3) Реагент в соответствии с (VI-2), где кислотоустойчивая бацилла представляет собой туберкулезную бациллу, предпочтительно, туберкулезную бациллу человека (M. tuberculosis).(VI-3) The reagent according to (VI-2), wherein the acid-resistant bacillus is a tuberculosis bacillus, preferably a human tuberculosis bacillus (M. tuberculosis).
(VI-4) Набор для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, содержащий моноклональное антитело в соответствии с любым из (I-1)-(I-16) в качестве реагента для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл.(VI-4) A kit for the detection of LAM of acid-resistant bacilli containing a monoclonal antibody in accordance with any of (I-1) - (I-16) as a reagent for the detection of LAM of acid-resistant bacilli.
(VI-5) Набор для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл в соответствии с (VI-4), где моноклональное антитело представляет собой моноклональное антитело из (А) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6).(VI-5) A kit for the detection of LAM of acid-resistant bacilli in accordance with (VI-4), where the monoclonal antibody is a monoclonal antibody from (A) in accordance with any of (I-1) to (I-6).
(VI-6) Набор для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл в соответствии с (VI-5), где кислотоустойчивая бацилла представляет собой туберкулезную бациллу, предпочтительно, туберкулезную бациллу человека (M. tuberculosis).(VI-6) The LAM detection kit for acid resistant bacilli in accordance with (VI-5), wherein the acid resistant bacillus is a tuberculosis bacillus, preferably human tuberculosis bacillus (M. tuberculosis).
(VII) Анализ с использованием стерилизованного образца(VII) Analysis using a sterilized sample
(VII-1) Способ определения присутствия или отсутствия инфекции кислотоустойчивыми бациллами в тестируемом образце, включающий стадии:(VII-1) A method for determining the presence or absence of infection with acid-resistant bacilli in a test sample, comprising the steps of:
(1) стерилизации тестируемого образца кипячением, предпочтительно, автоклавированием;(1) sterilizing the test sample by boiling, preferably by autoclaving;
(2) приведения моноклонального антитела в соответствии с любым из (I-1)-(I-16), предпочтительно, моноклонального антитела из (А) или (В) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6) или (I-7)-(I-10), в контакт со стерилизованным образцом; и(2) bringing the monoclonal antibody in accordance with any of (I-1) - (I-16), preferably the monoclonal antibody in (A) or (B) in accordance with any of (I-1) - (I-6 ) or (I-7) - (I-10) in contact with a sterilized sample; and
(3) проведения анализа на ЛАМ кислотоустойчивых бацилл в тестируемом образце с использованием реакции связывания между моноклональным антителом и ЛАМ кислотоустойчивых бацилл в качестве показателя; и(3) analysis of LAM of acid-resistant bacilli in the test sample using the binding reaction between the monoclonal antibody and LAM of acid-resistant bacilli as an indicator; and
(4) определения того, что тестируемый образец инфицирован кислотоустойчивой бациллой, когда ЛАМ кислотоустойчивых бацилл обнаруживается в тестируемом образце.(4) determining that the test sample is infected with an acid resistant bacillus when an LAM of acid resistant bacilli is detected in the test sample.
(VII-2) Способ в соответствии с (VII-1), где моноклональное антитело представляет собой моноклональное антитело из (А) или (В) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6) или (I-7)-(I-10), и кислотоустойчивая бацилла представляет собой туберкулезную бациллу.(VII-2) The method according to (VII-1), where the monoclonal antibody is a monoclonal antibody from (A) or (B) in accordance with any of (I-1) - (I-6) or (I- 7) - (I-10), and the acid-resistant bacillus is a tuberculous bacillus.
(VIII) Способ определения лечебного эффекта противотуберкулезного лекарственного средства в отношении туберкулеза.(VIII) A method for determining the therapeutic effect of an anti-tuberculosis drug against tuberculosis.
(VIII-1) Способ определения лечебного эффекта противотуберкулезного лекарственного средства в отношении туберкулеза, включающий стадии:(VIII-1) A method for determining the therapeutic effect of an anti-tuberculosis drug against tuberculosis, comprising the steps of:
(1) приведения моноклонального антитела из (А) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6) в контакт с обоими тестируемыми образцами до и после введения противотуберкулезного лекарственного средства;(1) bringing the monoclonal antibody from (A) in accordance with any of (I-1) to (I-6) into contact with both test samples before and after administration of the anti-TB drug;
(2) проведения анализа ЛАМ туберкулезной бациллы в тестируемых образцах до и после введения противотуберкулезного лекарственного средства с использованием реакции связывания между моноклональным антителом и ЛАМ туберкулезной бациллы в качестве показателя; и(2) analysis of the LAM of the tuberculosis bacillus in the test samples before and after administration of the anti-tuberculosis drug using the binding reaction between the monoclonal antibody and the LAM of the tuberculosis bacillus as an indicator; and
(3) определения того, что противотуберкулезное лекарственное средство имеет лечебный эффект в отношении туберкулеза, когда ЛАМ туберкулезной бациллы обнаруживается в тестируемом образце перед введением противотуберкулезного лекарственного средства и, когда ЛАМ туберкулезной бациллы не обнаруживается в тестируемом образце после введения противотуберкулезного лекарственного средства.(3) determining that the anti-TB drug has a therapeutic effect against tuberculosis when the LAM of the tuberculosis bacillus is detected in the test sample before administration of the anti-tuberculosis drug and when the LAM of the tuberculosis bacillus is not detected in the test sample after administration of the anti-tuberculosis drug.
(VIII-2) Способ определения лечебного эффекта противотуберкулезного лекарственного средства в отношении туберкулеза, включающий стадии:(VIII-2) A method for determining the therapeutic effect of an anti-tuberculosis drug against tuberculosis, comprising the steps of:
(1) приведения моноклонального антитела из (А) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6) в контакт с обоими тестируемыми образцами до и после введения противотуберкулезного лекарственного средства;(1) bringing the monoclonal antibody from (A) in accordance with any of (I-1) to (I-6) into contact with both test samples before and after administration of the anti-TB drug;
(2) количественного определения ЛАМ туберкулезной бациллы в тестируемых образцах до и после введения противотуберкулезного лекарственного средства с использованием реакции связывания между моноклональным антителом и ЛАМ туберкулезной бациллы в качестве показателя; и(2) quantitatively determining the LAM of the tuberculosis bacillus in the test samples before and after the administration of the anti-tuberculosis drug using the binding reaction between the monoclonal antibody and the LAM of the tuberculosis bacillus as an indicator; and
(3) сравнения количества ЛАМ туберкулезной бациллы в тестируемом образце после введения противотуберкулезного лекарственного средства (измерение после введения) с количеством ЛАМ туберкулезной бациллы в тестируемом образце перед введением противотуберкулезного лекарственного средства (измерение перед введением); и определения того, что противотуберкулезное лекарственное средство имеет лечебный эффект в отношении туберкулеза, когда результат измерения после введения ниже результата измерения перед введением, и определения того, что противотуберкулезное лекарственное средство не имеет лечебного эффекта в отношении туберкулеза, когда результат измерения после введения не ниже результата измерения перед введением.(3) comparing the amount of LAM of a tuberculosis bacillus in a test sample after administration of an anti-TB drug (measurement after administration) with the amount of LAM of a tuberculosis bacillus in a test sample before administration of an anti-TB drug (measurement before administration); and determining that the anti-TB drug has a therapeutic effect in relation to tuberculosis when the measurement result after administration is lower than the measurement result before administration, and determining that the anti-TB drug does not have a therapeutic effect in relation to tuberculosis when the measurement result after administration is not lower than the result measurements before introduction.
(IX) Набор для определения лечебного эффекта противотуберкулезного лекарственного средства в отношении туберкулеза.(IX) A kit for determining the therapeutic effect of an anti-tuberculosis drug against tuberculosis.
(IX) Набор для определения лечебного эффекта противотуберкулезного лекарственного средства в отношении туберкулеза, содержащий моноклональное антитело из (А) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6).(IX) A kit for determining the therapeutic effect of an anti-tuberculosis drug against tuberculosis, containing the monoclonal antibody from (A) in accordance with any of (I-1) to (I-6).
(X) Устройство для обнаружения кислотоустойчивых бацилл (туберкулезной бациллы).(X) Device for detecting acid resistant bacilli (tuberculosis bacillus).
(Х-1) Устройство для обнаружения кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы, содержащее поглощающий раствор фрагмент, образованный из материала, способного к переносу тестируемого образца посредством капиллярного действия, поглощающий раствор фрагмент, содержащий:(X-1) A device for detecting acid-resistant bacilli, preferably a tuberculosis bacillus, containing a solution-absorbing fragment formed from a material capable of transferring a test sample by capillary action, a solution-absorbing fragment, containing:
(1) часть для сбора образца для поглощения и сбора тестируемого образца;(1) a sample collection portion for absorption and collection of the test sample;
(2) часть с мечеными антителами, являющуюся подложкой для меченого моноклонального антитела в соответствии с любым из (I-1)-(I-16), которое специфически реагирует с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл;(2) a labeled antibody portion that is a support for a labeled monoclonal antibody according to any one of (I-1) to (I-16) that specifically reacts with LAM acid-resistant bacilli;
(3) часть для определения, включающая часть отображения результата тестирования,(3) a determination part, including a display part of a test result,
(а) на которой иммобилизовано немеченое моноклональное антитело в соответствии с любым из (I-1)-(I-16), которое специфически реагирует с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл; и(a) on which an unlabeled monoclonal antibody is immobilized in accordance with any of (I-1) to (I-16), which specifically reacts with LAM acid-resistant bacilli; and
(4) часть для поглощения раствора для поглощения остающегося раствора тестируемого образца, которая прошла через часть для сбора образца, часть с мечеными антителами и часть для определения.(4) a portion for absorbing the solution for absorbing the remaining solution of the test sample that passed through the portion for collecting the sample, the portion with labeled antibodies and the portion for determination.
(Х-2) Устройство для обнаружения кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы в соответствии с (Х-1), где часть для определения (3) дополнительно содержит часть для контроля отображения (b), на которой иммобилизовано немеченое антитело, которое реагирует с меченым моноклональным антителом в соответствии с любым из (I-1)-(I-16), причем часть для контроля отображения расположена отдельно от части отображения результата тестирования (а).(X-2) A device for detecting acid-resistant bacilli, preferably a tuberculosis bacillus, in accordance with (X-1), where the determination part (3) further comprises a display control part (b) on which an unlabeled antibody that reacts with labeled with a monoclonal antibody in accordance with any of (I-1) to (I-16), the display control portion is separate from the display portion of the test result (a).
(Х-3) Устройство для обнаружения кислотоустойчивых бацилл в соответствии с (Х-1) или (Х-2), где моноклональное антитело представляет собой моноклональное антитело из (А) в соответствии с любым из (I-1)-(I-6), и кислотоустойчивая бацилла представляет собой туберкулезную бациллу, предпочтительно, туберкулезную бациллу человека (M. tuberculosis).(X-3) A device for detecting acid-resistant bacilli in accordance with (X-1) or (X-2), where the monoclonal antibody is a monoclonal antibody from (A) in accordance with any of (I-1) - (I- 6), and the acid-resistant bacillus is a tuberculosis bacillus, preferably human tuberculosis bacillus (M. tuberculosis).
Преимущественные эффекты изобретенияAdvantageous Effects of the Invention
В соответствии с настоящим изобретением, кислотоустойчивые бациллы, которые существуют в биологическом образце индивида (мокроте, слюне, крови, промывной жидкости из легких, желудочном соке, моче, фекалиях, коже или панкреатическом соке) могут быть отличены от других бактерий и специфически обнаружены. Способ обнаружения кислотоустойчивых бацилл в соответствии с настоящим изобретением имеет чувствительность и специфичность, которые сравнимы с чувствительностью и специфичностью способов обнаружения с использованием генной амплификации. Поскольку способ обнаружения кислотоустойчивых бацилл в соответствии с настоящим изобретением может определить количество кислотоустойчивых бацилл в живом организме, лечебный эффект по отношению к кислотоустойчивым бациллам, особенно при туберкулезе, может подвергаться мониторингу. Дополнительно, способ обнаружения кислотоустойчивых бацилл в соответствии с настоящим изобретением может надежно и точно обнаруживать кислотоустойчивые бациллы даже в стерилизованных целевых образцах проб в течение по меньшей мере одной недели после стерилизации. Следовательно, даже в области, не имеющей специальной системы транспортировки образцов для предотвращения инфекции, образцы, если они простерилизованы, могут перемещаться посредством общих систем транспортировки, таких как почта.In accordance with the present invention, acid-resistant bacilli that exist in a biological sample of an individual (sputum, saliva, blood, flushing fluid from the lungs, gastric juice, urine, feces, skin or pancreatic juice) can be distinguished from other bacteria and are specifically detected. The method for detecting acid-resistant bacilli in accordance with the present invention has a sensitivity and specificity that is comparable to the sensitivity and specificity of detection methods using gene amplification. Since the method for detecting acid-resistant bacilli in accordance with the present invention can determine the number of acid-resistant bacilli in a living organism, the therapeutic effect with respect to acid-resistant bacilli, especially with tuberculosis, can be monitored. Additionally, the method for detecting acid-resistant bacilli in accordance with the present invention can reliably and accurately detect acid-resistant bacilli even in sterilized target samples for at least one week after sterilization. Therefore, even in an area that does not have a special system for transporting samples to prevent infection, samples, if sterilized, can be transported through general transportation systems such as mail.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, туберкулезная бацилла, которая существует в биологическом образце пациента с туберкулезом, может быть отличена от нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл и специфически обнаружена. Следовательно, с помощью настоящего изобретения можно диагностировать инфекцию туберкулезной бациллы с высокой точностью. Кроме того, с высокой точностью могут быть определены лечебные эффекты противотуберкулезных лекарственных средств у пациентов с туберкулезом.According to a preferred embodiment of the present invention, a tuberculous bacillus that exists in a biological sample of a patient with tuberculosis can be distinguished from non-tuberculous acid-resistant bacilli and is specifically detected. Therefore, using the present invention, it is possible to diagnose an infection of a tuberculous bacillus with high accuracy. In addition, the therapeutic effects of anti-TB drugs in patients with tuberculosis can be determined with high accuracy.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
[ФИГ. 1] На фиг. 1 (А) и (В) представлены обе диаграммы, показывающие (вид сбоку) принципы работы устройства для обнаружения туберкулезной бациллы (устройства для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы) настоящего изобретения. Диаграмма (А) показывает режим работы, при котором часть для определения (3) имеет только часть для отображения результата тестирования (а), и диаграмма (В) показывает режим работы, при котором часть для определения (3) имеет как часть для отображения результата тестирования (а), так и часть контроля отображения (b). Условные обозначения на фигуре указывают следующее. 10: подложка, 21: образующая лист часть для сбора образца (1), 22: образующая лист часть меченого антитела (2), 23: образующая лист часть для определения (3), 24: образующая лист часть для поглощения раствора (4), (а) часть для отображения результата тестирования, (b) часть для контроля отображения, (1) часть для сбора образца, (2) часть для меченого антитела, (3) часть для определения, (4): часть для поглощения образца, Р: стрелка, показывающая направление потока тестируемого образца. (То же самое применяется к фиг. 2.)[FIG. 1] In FIG. 1 (A) and (B) are both diagrams showing (side view) the principles of operation of a device for detecting a tuberculous bacillus (device for detecting a LAM of a tuberculous bacillus) of the present invention. Diagram (A) shows the operating mode in which the part for determining (3) has only a part for displaying the test result (a), and diagram (B) shows the operating mode in which the part for determining (3) has as part for displaying the result testing (a) and part of the display control (b). The legend on the figure indicates the following. 10: substrate, 21: sheet forming part for collecting the sample (1), 22: sheet forming part of the labeled antibody (2), 23: sheet forming part for determining (3), 24: sheet forming part for absorbing the solution (4), (a) part for displaying the test result, (b) part for monitoring the display, (1) part for collecting the sample, (2) part for the labeled antibody, (3) part for determining, (4): part for absorbing the sample, P : arrow showing the direction of flow of the test sample. (The same applies to Fig. 2.)
[ФИГ. 2] Фиг. 2 показывает (вид в перспективе) один режим работы устройства для обнаружения туберкулезной бациллы (устройства для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы) по настоящему изобретению.[FIG. 2] FIG. 2 shows (perspective view) one operation mode of a tuberculosis bacillus detection device (tuberculosis bacillus LAM detection device) of the present invention.
[ФИГ. 3] Фиг. 3 показывает результат измерения титра антител в крови кроликов, каждого из которых подкожно иммунизировали с использованием вакцины БЦЖ или убитыми бактериальными клетками H37Ra, посредством метода ELISA с использованием антигенных планшетов с иммобилизованными на них ЛАМ M. tuberculosis (-■-) и ЛАМ M. avium (-●-) (Ссылочный Пример 1 (2)). (А) показывает результат у кроликов, иммунизированных вакциной БЦЖ, и (В) показывает результат у кроликов, иммунизированных убитыми бактериальными клетками H37Ra.[FIG. 3] FIG. Figure 3 shows the result of measuring the titer of antibodies in the blood of rabbits, each of which was subcutaneously immunized with BCG vaccine or killed H37Ra bacterial cells, by ELISA using antigenic plates immobilized with LAM M. tuberculosis (- ■ -) and LAM M. avium (- ● -) (Reference Example 1 (2)). (A) shows the result in rabbits immunized with BCG vaccine, and (B) shows the result in rabbits immunized with killed H37Ra bacterial cells.
[ФИГ. 4] Фиг. 4 показывает аминокислотные последовательности scFv, имеющих реактивность к ЛАМ. Более конкретно, сделано сравнение между верхним рядом, показывающим аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:30) scFv (Myco-scFv), полученную из клеток селезенки кролика, иммунизированного убитыми бактериальными клетками H37Ra и нижним рядом, показывающим аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:12) scFv (TB-scFv), полученную из клеток селезенки кролика, иммунизированного вакциной БЦЖ, вместе c соответствующими положениями областей CDR1-CDR3 в вариабельных областях тяжелой цепи, линкера и областей CDR1-CDR3 в вариабельных областях легкой цепи. Следует отметить, что по отношению к линкерной последовательности, имеющей четыре сериновых остатка, связанных с ее N-концом, аминокислотная область на N-концевой стороне показывает область VH, а область на С-концевой стороне показывает область VL.[FIG. 4] FIG. 4 shows the amino acid sequences of scFvs having LAM reactivity. More specifically, a comparison is made between the upper row showing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 30) of scFv (Myco-scFv) obtained from rabbit spleen cells immunized with killed H37Ra bacterial cells and the lower row showing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 12 ) scFv (TB-scFv) obtained from rabbit spleen cells immunized with BCG vaccine, together with the corresponding positions of the CDR1-CDR3 regions in the variable regions of the heavy chain, linker and regions of CDR1-CDR3 in the variable regions of the light chain. It should be noted that with respect to the linker sequence having four serine residues linked to its N-terminus, the amino acid region on the N-terminal side shows the VH region, and the region on the C-terminal side shows the VL region.
[ФИГ. 5] Фиг. 5 показывает результат оценки реактивности TB-scFv по отношению к ЛАМ. Реактивность TB-scFv к ЛАМ, полученных из кролика, иммунизированного вакциной БЦЖ, оценивали с помощью ELISA, используя планшеты, с иммобилизованными на них ЛАМ из M. tuberculosis и ЛАМ из M. avium. На ФИГ. 5 “■” указывает на реактивность против ЛАМ M. tuberculosis, а “●” указывает на реактивность против M. avium.[FIG. 5] FIG. 5 shows the result of evaluating the reactivity of TB-scFv against LAM. The reactivity of TB-scFv to LAMs obtained from a rabbit immunized with BCG vaccine was evaluated by ELISA using plates immobilized with LAM from M. tuberculosis and LAM from M. avium on them. In FIG. 5 “■” indicates reactivity against LAM of M. tuberculosis, and “●” indicates reactivity against M. avium.
[Фиг. 6] Фиг. 6 показывает результат оценки обнаружения с помощью ELISA ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и обнаружения с помощью ELISA ЛАМ туберкулезной бациллы. Реактивность против ЛАМ при обнаружении ЛАМ кислотоустойчивых бацилл с помощью ELISA и при обнаружении ЛАМ туберкулезной бациллы с помощью ELISA оценивали, используя очищенный ЛАМ из M. tuberculosis и ЛАМ из M. avium. На фиг. 6 “●” указывает на реактивность против ЛАМ M. tuberculosis при обнаружении ЛАМ кислотоустойчивых бацилл с помощью ELISA, “■” указывает на реактивность против ЛАМ M. avium при обнаружении ЛАМ кислотоустойчивых бацилл с помощью ELISA, “○” указывает на реактивность против ЛАМ M. tuberculosis при обнаружении ЛАМ туберкулезной бациллы с помощью ELISA, “□” указывает на реактивность против ЛАМ M. avium при обнаружении ЛАМ туберкулезной бациллы с помощью ELISA.[FIG. 6] FIG. 6 shows the result of an evaluation of the detection of acid-resistant bacilli by ELISA LAM and detection of tuberculosis bacillus by ELISA LAM. Reactivity against LAM in the detection of LAM of acid-resistant bacilli by ELISA and in the detection of LAM of tuberculosis bacillus by ELISA was evaluated using purified LAM from M. tuberculosis and LAM from M. avium. In FIG. 6 “●” indicates reactivity against LAM of M. tuberculosis when LAM is detected by acid-resistant bacilli using ELISA, “■” indicates reactivity against LAM of M. avium when detecting LAM of acid-resistant bacilli by ELISA, “○” indicates reactivity against LAM of M . tuberculosis in the detection of LAM of a tuberculous bacillus by ELISA, “□” indicates reactivity against LAM of M. avium in the detection of LAM of tuberculosis bacillus by ELISA.
[ФИГ. 7] Фиг. 7 показывает результат оценки комбинации антител. Оценку комбинации антител проводили с использованием обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл с помощью ELISA и обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы с помощью ELISA, применяя клинические изоляты кислотоустойчивых бацилл. Реактивность против каждого из штаммов показана с помощью плотности цвета. На фиг. 7, myco указывает на результаты обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл с помощью ELISA, а ТВ указывает на результаты обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы с помощью ELISA.[FIG. 7] FIG. 7 shows the result of evaluating a combination of antibodies. The combination of antibodies was evaluated using the detection of LAM of acid-resistant bacilli using ELISA and the detection of LAM of tuberculosis bacillus by ELISA using clinical isolates of acid-resistant bacilli. Reactivity against each strain is indicated by color density. In FIG. 7, myco indicates the results of the detection of LAM acid-resistant bacilli by ELISA, and TV indicates the results of the detection of LAM by tuberculosis bacilli by ELISA.
[ФИГ. 8] Фиг. 8 показывает результаты оценки иммунохроматографического теста обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и иммунохроматографического теста обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы. Реактивность против ЛАМ при иммунохроматографическом тесте обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и при иммунохроматографическом тесте обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, оценивали, используя очищенный ЛАМ из M. tuberculosis (А и В) и ЛАМ из M. avium (C и D). На каждой из фигур “myco” указывает на результат обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл при иммунохроматографическом тесте, а “ТВ” указывает на результат обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы при иммунохроматографическом тесте.[FIG. 8] FIG. 8 shows the results of the evaluation of an immunochromatographic test for the detection of LAM of acid-resistant bacilli and an immunochromatographic test for the detection of LAM of tuberculosis bacillus. Reactivity against LAM in the immunochromatographic test for the detection of LAM of acid-resistant bacilli and in the immunochromatographic test for the detection of LAM of a tuberculosis bacillus was evaluated using purified LAM from M. tuberculosis (A and B) and LAM from M. avium (C and D). On each of the figures, “myco” indicates the result of the detection of LAM of acid-resistant bacilli during the immunochromatographic test, and “TV” indicates the result of the detection of LAM of the tuberculosis bacillus during the immunochromatographic test.
[ФИГ. 9] Фиг. 9 показывает титр антител против ЛАМ в антисыворотке цыплят (Пример 5). На фиг. 9, “-●-” указывает на реактивность против очищенного ЛАМ штамма Аояма В туберкулезной бациллы (M. tuberculosis), а “-■-” указывает на реактивность против очищенного ЛАМ M. avium.[FIG. 9] FIG. 9 shows the antibody titer against LAM in chickens antiserum (Example 5). In FIG. 9, “- ● -” indicates reactivity against purified LAM of the Aoyama B strain of tuberculosis bacillus (M. tuberculosis), and “- ■ -” indicates reactivity against purified LAM of M. avium.
[ФИГ. 10] Фиг. 10 показывает аминокислотную последовательность одноцепочечного антитела G3-scFv, выделенного из библиотеки scFv курицы, вместе с положениями областей CDR1, CDR2 и CDR3 в вариабельной области тяжелой цепи, области GS-линкера и областями CDR1, CDR2 и CDR3 в вариабельной области легкой цепи.[FIG. 10] FIG. 10 shows the amino acid sequence of a single-chain G3-scFv antibody isolated from a chicken scFv library, together with the positions of the regions of the CDR1, CDR2 and CDR3 in the variable region of the heavy chain, the GS linker region and the regions of CDR1, CDR2 and CDR3 in the variable region of the light chain.
[ФИГ. 11] Фиг. 11 показывает реактивность обнаружения ЛАМ методом ELISA с использованием бивалентного антитела (Пример 7). На ФИГ. 11 “-●-” указывает на реактивность против БЦЖ в методе обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы с применением ELISA, а “-■-” указывает на реактивность против БЦЖ в методе обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацил с применением ELISA.[FIG. 11] FIG. 11 shows the reactivity of LAM detection by ELISA using a bivalent antibody (Example 7). In FIG. 11 “- ● -” indicates reactivity against BCG in the LAM detection method for tuberculosis bacilli using ELISA, and “- ■ -” indicates reactivity against BCG in the detection of LAM acid resistant bacilli using ELISA.
[ФИГ. 12] Фиг. 12 показывает чувствительность обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацил с применением ELISA с использованием бивалентного антитела (Пример 8). На чертеже таблица представляет собой сравнение чувствительности обнаружения между тестом с использованием амплификации нуклеиновой кислоты (NAAT) и обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацил с применением ELISA.[FIG. 12] FIG. 12 shows the sensitivity of the detection of LAM acid-resistant bacilli using ELISA using a bivalent antibody (Example 8). In the drawing, the table is a comparison of the detection sensitivity between the test using nucleic acid amplification (NAAT) and the detection of LAM acid-resistant bacilli using ELISA.
[ФИГ. 13] Фиг. 13 показывает результат теста на перекрестную реактивность для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацил с применением ELISA по отношению к бактериям полости рта (Пример 9). На чертеже, “Na” означает бактериальные клетки N. asteroides, “Nf” означает бактериальные клетки N. farcinica, “Sg” означает бактериальные клетки Streptomyces, “Ca” означает бактериальные клетки C. albicans, “Ai” означает бактериальные клетки Actinomycete и “Tp” означает бактериальные клетки T. paurometabolum. В настоящем описании показаны результаты обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацил с применением ELISA, проведенного с использованием ЛАМ, экстрагированного из каждого типа этих культивированных клеток и культивированных бактериальных клеток БЦЖ.[FIG. 13] FIG. 13 shows the result of a cross-reactivity test to detect LAMs of acid-resistant bacilli using ELISA against oral bacteria (Example 9). In the drawing, “Na” means bacterial cells of N. asteroides, “Nf” means bacterial cells of N. farcinica, “Sg” means bacterial cells of Streptomyces, “Ca” means bacterial cells of C. albicans, “Ai” means bacterial cells of Actinomycete and “ Tp ”means bacterial cells of T. paurometabolum. The present description shows the results of the detection of LAM acid-resistant bacilli using ELISA conducted using LAM extracted from each type of these cultured cells and cultured bacterial BCG cells.
[ФИГ. 14] Фиг. 14 показывает реактивность против клинических изолятов кислотоустойчивых бацил в методе обнаружения ЛАМ с применением ELISA с использованием бивалентного антитела (Пример 10). На чертеже, “A” показывает результаты анализа 38 клинических изолятов туберкулезной бациллы, а “B” показывает результаты анализа 29 штаммов нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл (23 штамма M. avium, 6 штаммов M. intracellulare). Как для А, так и для В, на чертеже, черные столбцы представляют результаты анализа на обнаружение ЛАМ кислотоустойчивых бацил с применением ELISA, а белые столбцы представляют результаты анализа на обнаружение ЛАМ туберкулезной бациллы с применением ELISA. Из 29 штаммов нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл на В № 1-23 представляют результаты для 23 штаммов M. avium, а номера 24-29 являются результатами для M. intracellulare.[FIG. 14] FIG. 14 shows the reactivity against clinical isolates of acid-resistant bacilli in a LAM detection method using ELISA using a bivalent antibody (Example 10). In the drawing, “A” shows the results of the analysis of 38 clinical isolates of the tuberculous bacillus, and “B” shows the results of the analysis of 29 strains of non-tuberculic acid-resistant bacilli (23 strains of M. avium, 6 strains of M. intracellulare). For both A and B, in the drawing, the black bars represent the results of the LAM detection of acid-resistant bacilli using ELISA, and the white columns represent the results of the analysis of LAM detection of acid-resistant bacilli using ELISA. Of 29 strains of non-tuberculosis acid-resistant bacilli, B No. 1-23 present results for 23 strains of M. avium, and numbers 24-29 are results for M. intracellulare.
[ФИГ. 15] Фиг. 15 показывает отношения (значение для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацил с применением ELISA/значение для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы с применением ELISA) реактивности при обнаружении ЛАМ кислотоустойчивых бацил с применением ELISA и обнаружении ЛАМ туберкулезной бациллы с применением ELISA.[FIG. 15] FIG. 15 shows the relationship (value for detecting LAM of acid-resistant bacilli using ELISA / value for detecting LAM of tuberculosis bacillus using ELISA) reactivity when detecting LAM of acid-resistant bacilli using ELISA and detecting LAM of tuberculosis bacillus using ELISA.
[ФИГ. 16] Фиг. 16 показывает реактивность против клинических образцов мокроты при обнаружении ЛАМ туберкулезной бациллы с применением ELISA (левый чертеж) и обнаружении ЛАМ кислотоустойчивых бацилл с применением ELISA с использованием бивалентного антитела (правый чертеж) (Пример 11). На чертеже “I” показывает результаты группы образцов, у которых обнаружена отрицательная реакция в тесте с мокротой, “II” показывает результаты образцов, которые являются “недостаточными” в тесте с мокротой, и у которых обнаружена отрицательная реакция в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты, “III” показывает результаты группы образцов, у которых обнаружена отрицательная реакция в тесте с мокротой и положительная реакция в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты, “IV” показывает результаты образцов, которые являются “недостаточными” в тесте с мокротой, и у которых обнаружена положительная реакция в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты, “V” показывает результаты группы образцов, которые имели балльную оценку 1+ в тесте с мокротой, “VI” показывает результаты группы образцов, которые имели балльную оценку 2+ в тесте с мокротой, и “VII” показывает результаты группы образцов, которые имели балльную оценку 3+ в тесте с мокротой. Следует отметить, что образцы, балльная оценка которых была равна и выше чем 1+ в тесте с мокротой, все имели положительную реакцию в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты. Кроме того, пунктирные линии показывают условные значения.[FIG. 16] FIG. 16 shows the reactivity against clinical sputum samples upon detection of a LAM of a tuberculosis bacillus using ELISA (left drawing) and detection of a LAM of acid-resistant bacilli using ELISA using a bivalent antibody (right drawing) (Example 11). In the drawing, “I” shows the results of a group of samples in which a negative reaction was detected in a sputum test, “II” shows the results of samples that are “insufficient” in a sputum test and in which a negative reaction was detected in a test with nucleic acid amplification, “III” shows the results of a group of samples in which a negative reaction was detected in the test with sputum and a positive reaction in the test with amplification of nucleic acid, “IV” shows the results of samples that are “deficient” full-time ”in the test with sputum, and in which a positive reaction was found in the test with amplification of nucleic acid,“ V ”shows the results of a group of samples that had a score of 1+ in the test with sputum,“ VI ”shows the results of a group of samples that had a score a 2+ score in a sputum test, and “VII” shows the results of a group of samples that had a 3+ score in a sputum test. It should be noted that the samples, the scoring of which was equal to and higher than 1+ in the sputum test, all had a positive reaction in the test with nucleic acid amplification. In addition, dashed lines show conditional values.
[ФИГ. 17] Фиг. 17 показывает корреляцию между числом бактериальных клеток и концентрацией ЛАМ, обнаруженного при обнаружении ЛАМ с помощью ELISA (Пример 11). На чертеже “I” показывает результаты группы образцов, у которых обнаружена отрицательная реакция в тесте с мокротой и отрицательная реакция в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты, “II” показывает результаты группы образцов, у которых обнаружена отрицательная реакция в тесте с мокротой и положительная реакция в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты, “III” показывает результаты группы образцов, которые являются “недостаточными” в тесте с мокротой, и у которых обнаружена положительная реакция в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты, “IV” показывает результаты группы образцов, которые имели балльную оценку 1+ в тесте с мокротой, “V” показывает результаты группы образцов, которые имели балльную оценку 2+ в тесте с мокротой, и “VI” показывает результаты группы образцов, которые имели балльную оценку 3+ в тесте с мокротой. Следует отметить, что образцы, балльная оценка которых была равна и выше, чем 1+ в тесте с мокротой, все имели положительную реакцию в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты. Кроме того, линия в каждой из групп образцов указывает среднее значение концентрации ЛАМ.[FIG. 17] FIG. 17 shows a correlation between the number of bacterial cells and the concentration of LAM detected when LAM was detected by ELISA (Example 11). In the drawing, “I” shows the results of a group of samples in which a negative reaction was detected in the test with sputum and a negative reaction in the test with amplification of nucleic acid, “II” shows the results of a group of samples in which a negative reaction was found in the test with sputum and a positive reaction in in a nucleic acid amplification test, “III” shows the results of a group of samples that are “deficient” in a sputum test and that have a positive reaction in a nucleic amplification test of acid, “IV” shows the results of a group of samples that had a score of 1+ in a sputum test, “V” shows the results of a group of samples that had a score of 2+ in a test with sputum, and “VI” shows the results of a group of samples, who had a 3+ score in the sputum test. It should be noted that the samples, the scoring of which was equal to and higher than 1+ in the sputum test, all had a positive reaction in the test with nucleic acid amplification. In addition, the line in each of the groups of samples indicates the average concentration of LAM.
[ФИГ. 18] Фиг. 18 показывает устойчивость ЛАМ кислотоустойчивых бацилл против стерилизационной обработки. Белые столбцы показывают результаты анализа бактериальных клеток, которые не были стерилизованы, черные столбцы показывают результаты анализа бактериальных клеток, которые кипятили при 100°С в течение 30 минут, и серые столбцы показывают результаты анализа бактериальных клеток, которые стерилизовали паром высокого давления (автоклавировали при 121°С в течение 15 минут) (Пример 12).[FIG. 18] FIG. 18 shows the resistance of LAM acid-resistant bacilli against sterilization treatment. The white columns show the results of the analysis of bacterial cells that have not been sterilized, the black columns show the results of the analysis of bacterial cells that were boiled at 100 ° C for 30 minutes, and the gray columns show the results of the analysis of bacterial cells that were sterilized with high pressure steam (autoclaved at 121 ° C for 15 minutes) (Example 12).
[ФИГ. 19] Фиг. 19 показывает стабильность ЛАМ при хранении после стерилизационной обработки паром высокого давления (автоклавирования). Белые столбцы показывают результаты анализа бактериальных клеток немедленно после стерилизационной обработки паром высокого давления, а черные столбцы показывают результаты анализа бактериальных клеток, которые были оставлены при 25°С в течение 7 дней после стерилизационной обработки паром высокого давления (Пример 12).[FIG. 19] FIG. 19 shows the stability of LAM during storage after sterilization treatment with high pressure steam (autoclaving). White columns show the results of the analysis of bacterial cells immediately after sterilization with high pressure steam, and black columns show the results of the analysis of bacterial cells that were left at 25 ° C for 7 days after sterilization with high pressure steam (Example 12).
Описание вариантов осуществленияDescription of Embodiments
(I) Моноклональное антитело, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл(I) A monoclonal antibody that specifically binds to LAM acid resistant bacilli
Туберкулезные бациллы принадлежат к роду Mycobacterium семейства Mycobacteriaceae и представляют собой тип бактериальной группы, именуемой вместе с другими бактериями, принадлежащими к роду Mycobacterium, кислотоустойчивые бациллы. Однако, туберкулезные бациллы отличаются от других кислотоустойчивых бацилл (нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл) по тому факту, что они могут расти при 37°С, но не при 28°С и по тому факту, что они имеют термостойкую каталазу. Известны четыре типа туберкулезных бацилл, т.е. туберкулезная бацилла (Mycobacterium tuberculosis, туберкулезная бацилла человека), бычья туберкулезная бацилла (M. bovis, бычья туберкулезная бацилла, бычья бацилла), Mycobacterium africanum (M. africanum), и туберкулезная бацилла серой полевки (M. microti). Среди них, туберкулезная бацилла человека (M. tuberculosis) является патогенной для человека в качестве бактерии, вызывающей туберкулез, а M. bovis и M. africanum инфицируют человека в редких случаях. M. microti не является патогенной для человека. Кроме того, БЦЖ получают посредством ослабления M. bovis через последовательное длительное субкультивирование, и применяют в качестве вакцины (вакцины с ослабленными живыми бактериями) для предотвращения туберкулеза.Tuberculosis bacilli belong to the genus Mycobacterium of the family Mycobacteriaceae and are a type of bacterial group called, together with other bacteria belonging to the genus Mycobacterium, acid-resistant bacilli. However, tuberculous bacilli differ from other acid-resistant bacilli (non-tuberculous acid-resistant bacilli) in that they can grow at 37 ° C, but not at 28 ° C and in the fact that they have heat-resistant catalase. Four types of tuberculosis bacilli are known, i.e. tuberculous bacillus (Mycobacterium tuberculosis, human tuberculous bacillus), bovine tuberculous bacillus (M. bovis, bovine tuberculous bacillus, bovine bacillus), Mycobacterium africanum (M. africanum), and M. tuberculosis bacillus. Among them, human tuberculosis bacillus (M. tuberculosis) is pathogenic for humans as the bacterium that causes tuberculosis, and M. bovis and M. africanum infect humans in rare cases. M. microti is not pathogenic to humans. In addition, BCG is obtained by attenuating M. bovis through successive long-term subculture, and is used as a vaccine (vaccine with attenuated living bacteria) to prevent tuberculosis.
Моноклональное антитело (далее в настоящем описании также именуемое как “MoAb”), которое является предметом (основным пунктом формулы) настоящего изобретения, представляет собой антитело, которое различает и специфически распознает кислотоустойчивые бациллы среди других бактерий, существующих in vivo. Более конкретно, оно является антителом, которое различает липоарабиноманнан (ЛАМ) кислотоустойчивых бацилл от других подобных ЛАМ антигенов или бактерий и специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл. ЛАМ, описанный в настоящем описании, представляет собой один из основных липогликанов, образующих клеточные мембраны и клеточные стенки бактерий у рода Mycobacterium (кислотоустойчивых бацилл), включающего туберкулезные бациллы. Обычно, ЛАМ включает якорный остаток маннозилфосфатидилинозита (МФИ), сахарный остов, содержащий центральную часть из D-маннана и домен D-арабинана и покрывающий мотив. Однако, в зависимости от типа бактерий, существуют различия по количеству остатков сахара (например, маннозы), включенных в молекулу, разветвленной структуре сахарной цепи, числу ацильных групп и типу жирных кислот, образующих ацильные группы.A monoclonal antibody (hereinafter also referred to as “MoAb”), which is the subject matter of the present invention, is an antibody that distinguishes and specifically recognizes acid-resistant bacilli among other bacteria existing in vivo. More specifically, it is an antibody that distinguishes lipoarabinomannan (LAM) of acid-resistant bacilli from other LAM-like antigens or bacteria and specifically binds to LAM of acid-resistant bacilli. The LAM described in the present description is one of the main lipoglycans that form cell membranes and cell walls of bacteria in the genus Mycobacterium (acid-resistant bacilli), including tuberculosis bacilli. Typically, LAM includes an anchor residue of mannosyl phosphatidylinositol (MFI), a sugar backbone containing a central portion of D-mannan and a D-arabinan domain and covering motif. However, depending on the type of bacteria, there are differences in the number of sugar residues (for example, mannose) included in the molecule, the branched structure of the sugar chain, the number of acyl groups and the type of fatty acids forming acyl groups.
Конкретно, MoAb по настоящему изобретению включает антитело со структурой, в которой вариабельная область тяжелой цепи, содержащая тяжелую цепь CDR1-CDR3 следующих (а)-(с) и вариабельная область легкой цепи, содержащая легкую цепь CDR1-CDR3 следующих (d)-(f), соединены через линкер. Для удобства это MoAb также называют “MoAb1”.Specifically, the MoAb of the present invention includes an antibody with a structure in which the variable region of the heavy chain containing the heavy chain CDR1-CDR3 of the following (a) - (c) and the variable region of the light chain containing the light chain CDR1-CDR3 of the following (d) - ( f) connected through a linker. For convenience, this MoAb is also called “MoAb1”.
(а) Тяжелая цепь CDR1, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1,(a) The heavy chain CDR1, consisting of a set of amino acid sequences of SEQ ID NO: 1,
(b) Тяжелая цепь CDR2, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2,(b) A heavy chain CDR2 consisting of a set of amino acid sequences of SEQ ID NO: 2,
(c) Тяжелая цепь CDR3, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3,(c) A heavy chain CDR3 consisting of a set of amino acid sequences of SEQ ID NO: 3,
(d) Легкая цепь CDR1, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4,(d) Light chain CDR1, consisting of a set of amino acid sequences of SEQ ID NO: 4,
(e) Легкая цепь CDR2, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5, и(e) Light chain CDR2, consisting of a set of amino acid sequences of SEQ ID NO: 5, and
(f) Легкая цепь CDR3, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6.(f) Light chain CDR3, consisting of a set of amino acid sequences of SEQ ID NO: 6.
Кроме того, особенным образом, MoAb по настоящему изобретению включает антитело со структурой, в которой вариабельная область тяжелой цепи, содержащая тяжелую цепь CDR1-CDR3 следующих (g)-(i), и вариабельная область легкой цепи, содержащая легкую цепь CDR1-CDR3 следующих (j)-(l), соединены через линкер. Для удобства это MoAb также называют “MoAb2”.In addition, in a particular way, the MoAb of the present invention includes an antibody with a structure in which a heavy chain variable region comprising a CDR1-CDR3 heavy chain of the following (g) - (i) and a light chain variable region containing a light chain of CDR1-CDR3 of the following (j) - (l) connected through a linker. For convenience, this MoAb is also called “MoAb2”.
(g) Тяжелая цепь CDR1, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:31,(g) The heavy chain CDR1, consisting of a set of amino acid sequences of SEQ ID NO: 31,
(h) Тяжелая цепь CDR2, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:32,(h) A heavy chain CDR2 consisting of a set of amino acid sequences of SEQ ID NO: 32,
(i) Тяжелая цепь CDR3, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:33,(i) A heavy chain CDR3 consisting of a set of amino acid sequences of SEQ ID NO: 33,
(j) Легкая цепь CDR1, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:34,(j) Light chain CDR1, consisting of a set of amino acid sequences of SEQ ID NO: 34,
(k) Легкая цепь CDR2, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:35, и(k) Light chain CDR2, consisting of a set of amino acid sequences of SEQ ID NO: 35, and
(l) Легкая цепь CDR3, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:36.(l) Light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence set of SEQ ID NO: 36.
Еще дополнительно, особенным образом, MoAb по настоящему изобретению включает антитело со структурой, в которой вариабельная область тяжелой цепи, содержащая тяжелую цепь CDR1-CDR3 следующих (m)-(o), и вариабельная область легкой цепи, содержащая легкую цепь CDR1-CDR3 следующих (p)-(r), соединены через линкер. Для удобства это MoAb также называют “MoAb3”.Still further, in a particular way, the MoAb of the present invention includes an antibody with a structure in which a heavy chain variable region comprising a CDR1-CDR3 heavy chain of the following (m) to (o) and a light chain variable region containing a light chain of CDR1-CDR3 of the following (p) - (r) are connected through a linker. For convenience, this MoAb is also called “MoAb3”.
(m) тяжелая цепь CDR1, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:47,(m) a heavy chain CDR1 consisting of a set of amino acid sequences of SEQ ID NO: 47,
(n) тяжелая цепь CDR2, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:48,(n) a heavy chain CDR2 consisting of a set of amino acid sequences of SEQ ID NO: 48,
(o) тяжелая цепь CDR3, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:49,(o) a heavy chain CDR3 consisting of a set of amino acid sequences of SEQ ID NO: 49,
(p) легкая цепь CDR1, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:50,(p) a light chain CDR1 consisting of a set of amino acid sequences of SEQ ID NO: 50,
(q) легкая цепь CDR2, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:51, и(q) a light chain CDR2, consisting of a set of amino acid sequences of SEQ ID NO: 51, and
(r) легкая цепь CDR3, состоящая из набора аминокислотной последовательности SEQ ID NO:52.(r) a light chain CDR3 consisting of a set of amino acid sequences of SEQ ID NO: 52.
В настоящем описании, “CDR” представляет собой сокращение от “Области определения комплементарности”, называемой также областью, определяющей комплементарность. CDR являются областями, которые существуют в вариабельной области иммуноглобулина, и представляют собой области, глубоко вовлеченные в специфическое связывание антитела с антигеном. Среди них, “CDR тяжелой цепи” относится к CDR, которая существует в вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, а “CDR легкой цепи” относится к CDR, которая существует в вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина.In the present description, “CDR” is an abbreviation of “Area of definition of complementarity,” also called the region that defines complementarity. CDRs are regions that exist in the variable region of an immunoglobulin and are regions that are deeply involved in the specific binding of an antibody to an antigen. Among them, a “heavy chain CDR” refers to a CDR that exists in the variable region of an immunoglobulin heavy chain, and a “light chain CDR” refers to a CDR that exists in an immunoglobulin variable region of a light chain.
Вариабельная область тяжелой цепи представляет собой область, содержащую CDR1-CDR3 тяжелой цепи, а вариабельная область легкой цепи представляет собой область, содержащую CDR1-CDR3 легкой цепи. Несмотря на то что не существует конкретного ограничения на порядок расположения этих CDR1-CDR3, предпочтительно, как в вариабельной области тяжелой цепи, так и в вариабельной области легкой цепи, CDR1, CDR2 и CDR3 расположены в этом порядке в направлении от N-концевой стороны до С-концевой стороны непрерывно или через другие аминокислотные последовательности.The heavy chain variable region is a region containing a heavy chain CDR1-CDR3, and the light chain variable region is a region containing a light chain CDR1-CDR3. Although there is no particular restriction on the arrangement of these CDR1-CDR3s, it is preferable that both in the variable region of the heavy chain and in the variable region of the light chain, CDR1, CDR2 and CDR3 are arranged in this order in the direction from the N-terminal side to C-terminal side continuously or through other amino acid sequences.
Вариабельная область тяжелой цепи и/или вариабельная область легкой цепи MoAb по настоящему изобретению могут иметь, в качестве других аминокислотных последовательностей, аминокислотную последовательность, называемую каркасной областью (далее в настоящем описании, просто именуемую “FR”) в области в описанных выше вариабельных областях, исключая CDR1-CDR3, описанные выше. Аминокислотная последовательность FR может являться аминокислотной последовательностью, являющейся производной из каркасной области (FR) вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, ее варианта или ее частичной модификации, полученной посредством введения сайта распознавания рестрикционного фермента по одной части аминокислотной последовательности, являющейся производной из FR.The heavy chain variable region and / or MoAb light chain variable region of the present invention may have, as other amino acid sequences, an amino acid sequence called a framework region (hereinafter, simply referred to as “FR”) in a region in the variable regions described above, excluding CDR1-CDR3 described above. Amino acid sequence of FR can be an amino acid sequence derived from the framework region (FR) of the variable region of the heavy chain or the variable region of the light chain of immunoglobulin, a variant thereof or its partial modification obtained by introducing a restriction enzyme recognition site for one part of the amino acid sequence derived from FR.
В вариабельных областях тяжелой цепи иммуноглобулина, например, область между N-концом вариабельной области тяжелой цепи и CDR1, описанной выше, определяют как “FR1”, область между CDR1 и CDR2 определяют как “FR2”, область между CDR2 и CDR3 определяют как “FR3”, область между CDR3 и С-концом вариабельной области тяжелой цепи определяют как “FR4”. Аналогично, в вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, например, область между N-концом вариабельной области легкой цепи и CDR1 определяют как “FR1”, область между CDR1 и CDR2 определяют как “FR2”, область между CDR2 и CDR3 определяют как “FR3”, и область между CDR3 и С-концом вариабельной области определяют как “FR4”.In the variable regions of the immunoglobulin heavy chain, for example, the region between the N-terminus of the variable region of the heavy chain and CDR1 described above is defined as “FR1”, the region between CDR1 and CDR2 is defined as “FR2”, the region between CDR2 and CDR3 is defined as “FR3 ”, The region between CDR3 and the C-terminus of the variable region of the heavy chain is defined as“ FR4 ”. Similarly, in the variable region of an immunoglobulin light chain, for example, the region between the N-terminus of the variable region of the light chain and CDR1 is defined as “FR1”, the region between CDR1 and CDR2 is defined as “FR2”, the region between CDR2 and CDR3 is defined as “FR3”, and the region between CDR3 and the C-terminus of the variable region is defined as “FR4".
Эти FR имеют функцию линкера, соединяющего каждую из описанных выше CDR1, CDR2 и CDR3, которые являются важными в качестве последовательностей распознавания антигена и представляют собой области, способствующие образованию трехмерной конформации вариабельных областей.These FRs have the function of a linker connecting each of the above CDR1, CDR2, and CDR3, which are important as antigen recognition sequences and are regions that facilitate the formation of three-dimensional conformation of variable regions.
В MoAb1 по настоящему изобретению, вариабельная область тяжелой цепи, предпочтительно, имеет аминокислотную последовательность из 119 аминокислотных остатков SEQ ID NO:7, а вариабельная область легкой цепи, предпочтительно, имеет аминокислотную последовательность из 112 аминокислотных остатков SEQ ID NO:8. В SEQ ID NO:7, показывающей аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, область от N-конца до 30-ой аминокислоты соответствует “FR1” вариабельной области тяжелой цепи, область аминокислот от 31-ой аминокислоты до 35-ой аминокислоты соответствует “CDR1” (SEQ ID NO:1) вариабельной области тяжелой цепи, область аминокислот от 36-ой аминокислоты до 49-ой аминокислоты соответствует “FR2”, область аминокислот от 50-ой аминокислоты до 65-ой аминокислоты соответствует “CDR2” (SEQ ID NO:2), область аминокислот от 66-ой аминокислоты до 96-ой аминокислоты соответствует “FR3”, область аминокислот от 97-ой аминокислоты до 106-ой аминокислоты соответствует “CDR3” (SEQ ID NO:3), и область аминокислот от 107-ой аминокислоты до 119-ой аминокислоты соответствует “FR4”.In MoAb1 of the present invention, the heavy chain variable region preferably has an amino acid sequence of 119 amino acid residues of SEQ ID NO: 7, and the light chain variable region preferably has an amino acid sequence of 112 amino acid residues of SEQ ID NO: 8. In SEQ ID NO: 7, showing the amino acid sequence of the variable region of the heavy chain, the region from the N-terminus to the 30th amino acid corresponds to “FR1” the variable region of the heavy chain, the amino acid region from the 31st amino acid to the 35th amino acid corresponds to “CDR1” (SEQ ID NO: 1) the variable region of the heavy chain, the amino acid region from the 36th amino acid to the 49th amino acid corresponds to “FR2”, the amino acid region from the 50th amino acid to the 65th amino acid corresponds to “CDR2” (SEQ ID NO: 2), the amino acid region from the 66th amino acid to the 96th amino acid the lot corresponds to “FR3”, the amino acid region from the 97th amino acid to the 106th amino acid corresponds to “CDR3” (SEQ ID NO: 3), and the amino acid region from the 107th amino acid to 119th amino acid corresponds to “FR4”.
Кроме того, в SEQ ID NO:8, показывающей аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи MoAb1 по настоящему изобретению, область от N-конца до 23-ей аминокислоты соответствует “FR1” вариабельной области легкой цепи, область аминокислот от 24-ой аминокислоты до 36-ой аминокислоты соответствует “CDR1” (SEQ ID NO:4) вариабельной области легкой цепи, область аминокислот от 37-ой аминокислоты до 51-ой аминокислоты соответствует “FR2”, область аминокислот от 52-ой аминокислоты до 58-ой аминокислоты соответствует “CDR2” (SEQ ID NO:5), область аминокислот от 59-ой аминокислоты до 89-ой аминокислоты соответствует “FR3”, область аминокислот от 90-ой аминокислоты до 102-ой аминокислоты соответствует “CDR3” (SEQ ID NO:6), и область аминокислот от 103-ей аминокислоты до 112-ой аминокислоты соответствует “FR4”.In addition, in SEQ ID NO: 8, showing the amino acid sequence of the variable region of the light chain of MoAb1 of the present invention, the region from the N-terminus to the 23rd amino acid corresponds to the “FR1" variable region of the light chain, the amino acid region from the 24th amino acid to 36 the amino acid corresponds to “CDR1” (SEQ ID NO: 4) of the variable region of the light chain, the amino acid region from the 37th amino acid to the 51st amino acid corresponds to “FR2”, the amino acid region from the 52nd amino acid to the 58th amino acid corresponds to “ CDR2 ”(SEQ ID NO: 5), amino acid region t from the 59th amino acid to the 89th amino acid corresponds to “FR3”, the amino acid region from the 90th amino acid to the 102nd amino acid corresponds to “CDR3” (SEQ ID NO: 6), and the amino acid region from the 103rd amino acid to 112 -th amino acid corresponds to “FR4”.
В MoAb2 по настоящему изобретению, вариабельная область тяжелой цепи, предпочтительно, имеет аминокислотную последовательность из 130 аминокислотных остатков, приведенных в SEQ ID NO:37, а вариабельная область легкой цепи, предпочтительно, имеет аминокислотную последовательность из 116 аминокислотных остатков SEQ ID NO:38. В SEQ ID NO:37, показывающей аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, область от N-конца до 35-ой аминокислоты соответствует “FR1” вариабельной области тяжелой цепи, область аминокислот от 36-ой аминокислоты до 40-ой аминокислоты соответствует “CDR1” (SEQ ID NO:31) вариабельной области тяжелой цепи, область аминокислот от 41-ой аминокислоты до 54-ой аминокислоты соответствует “FR2”, область аминокислот от 55-ой аминокислоты до 74-ой аминокислоты соответствует “CDR2” (SEQ ID NO:32), область аминокислот от 75-ой аминокислоты до 106-ой аминокислоты соответствует “FR3”, область аминокислот от 107-ой аминокислоты до 119-ой аминокислоты соответствует “CDR3” (SEQ ID NO:33), и область аминокислот от 120-ой аминокислоты до 130-ой аминокислоты соответствует “FR4”.In MoAb2 of the present invention, the heavy chain variable region preferably has an amino acid sequence of 130 amino acid residues shown in SEQ ID NO: 37, and the light chain variable region preferably has an amino acid sequence of 116 amino acid residues of SEQ ID NO: 38. In SEQ ID NO: 37, showing the amino acid sequence of the variable region of the heavy chain, the region from the N-terminus to the 35th amino acid corresponds to “FR1” the variable region of the heavy chain, the amino acid region from the 36th amino acid to the 40th amino acid corresponds to “CDR1” (SEQ ID NO: 31) the variable region of the heavy chain, the amino acid region from the 41st amino acid to the 54th amino acid corresponds to “FR2”, the amino acid region from the 55th amino acid to the 74th amino acid corresponds to “CDR2” (SEQ ID NO: 32), the amino acid region from the 75th amino acid to the 106th amino the acid corresponds to “FR3”, the amino acid region from the 107th amino acid to the 119th amino acid corresponds to “CDR3” (SEQ ID NO: 33), and the amino acid region from the 120th amino acid to 130th amino acid corresponds to “FR4”.
Кроме того, в SEQ ID NO:38, показывающей аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи MoAb2 по настоящему изобретению, область от N-конца до 20-ой аминокислоты соответствует “FR1” вариабельной области легкой цепи, область аминокислот от 21-ой аминокислоты до 28-ой аминокислоты соответствует “CDR1” (SEQ ID NO:34) вариабельной области легкой цепи, область аминокислот от 29-ой аминокислоты до 44-ой аминокислоты соответствует “FR2”, область аминокислот от 45-ой аминокислоты до 51-ой аминокислоты соответствует “CDR2” (SEQ ID NO:35), область аминокислот от 52-ой аминокислоты до 83-ей аминокислоты соответствует “FR3”, область аминокислот от 84-ой аминокислоты до 95-ой аминокислоты соответствует “CDR3” (SEQ ID NO:36), и область аминокислот от 96-ой аминокислоты до 116-ой аминокислоты соответствует “FR4”.In addition, in SEQ ID NO: 38, showing the amino acid sequence of the variable region of the light chain of MoAb2 of the present invention, the region from the N-terminus to the 20th amino acid corresponds to the “FR1" variable region of the light chain, the amino acid region from the 21st amino acid to 28 the amino acid corresponds to “CDR1” (SEQ ID NO: 34) of the variable region of the light chain, the amino acid region from the 29th amino acid to the 44th amino acid corresponds to “FR2”, the amino acid region from the 45th amino acid to the 51st amino acid corresponds to “ CDR2 ”(SEQ ID NO: 35), amino acid region from the 52nd amino acid to the 83rd amino acid corresponds to “FR3”, the amino acid region from the 84th amino acid to the 95th amino acid corresponds to “CDR3” (SEQ ID NO: 36), and the amino acid region from the 96th amino acid to 116 -th amino acid corresponds to “FR4”.
В MoAb3 по настоящему изобретению, вариабельная область тяжелой цепи, предпочтительно, имеет аминокислотную последовательность из 121 аминокислотного остатка SEQ ID NO:53, а вариабельная область легкой цепи, предпочтительно, имеет аминокислотную последовательность из 110 аминокислотных остатков SEQ ID NO:54. В SEQ ID NO:53, показывающей аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, область от N-конца до 30-ой аминокислоты соответствует “FR1” вариабельной области тяжелой цепи, область аминокислот от 31-ой аминокислоты до 35-ой аминокислоты соответствует “CDR1” (SEQ ID NO:47) вариабельной области тяжелой цепи, область аминокислот от 36-ой аминокислоты до 49-ой аминокислоты соответствует “FR2”, область аминокислот от 50-ой аминокислоты до 65-ой аминокислоты соответствует “CDR2” (SEQ ID NO:48), область аминокислот от 66-ой аминокислоты до 96-ой аминокислоты соответствует “FR3”, область аминокислот от 97-ой аминокислоты до 108-ой аминокислоты соответствует “CDR3” (SEQ ID NO:49), и область аминокислот от 109-ой аминокислоты до 121-ой аминокислоты соответствует “FR4”.In the MoAb3 of the present invention, the heavy chain variable region preferably has an amino acid sequence of 121 amino acid residues of SEQ ID NO: 53, and the light chain variable region preferably has an amino acid sequence of 110 amino acid residues of SEQ ID NO: 54. In SEQ ID NO: 53, showing the amino acid sequence of the variable region of the heavy chain, the region from the N-terminus to the 30th amino acid corresponds to “FR1” the variable region of the heavy chain, the amino acid region from the 31st amino acid to the 35th amino acid corresponds to “CDR1” (SEQ ID NO: 47) the variable region of the heavy chain, the amino acid region from the 36th amino acid to the 49th amino acid corresponds to “FR2”, the amino acid region from the 50th amino acid to the 65th amino acid corresponds to “CDR2” (SEQ ID NO: 48), the amino acid region from the 66th amino acid to the 96th amino slots corresponds to "FR3", the region of amino acids from the 97th amino acid to 108th amino acid corresponds to "CDR3" (SEQ ID NO: 49), and the region of amino acids from 109th amino acid to the 121st amino acids corresponding to "FR4".
Кроме того, в SEQ ID NO:54, показывающей аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи MoAb3 по настоящему изобретению, область от N-конца до 23-ей аминокислоты соответствует “FR1” вариабельной области легкой цепи, область аминокислот от 24-ой аминокислоты до 34-ой аминокислоты соответствует “CDR1” (SEQ ID NO:50) вариабельной области легкой цепи, область аминокислот от 35-ой аминокислоты до 49-ой аминокислоты соответствует “FR2”, область аминокислот от 50-ой аминокислоты до 56-ой аминокислоты соответствует “CDR2” (SEQ ID NO:51), область аминокислот от 57-ой аминокислоты до 87-ой аминокислоты соответствует “FR3”, область аминокислот от 88-ой аминокислоты до 100-ой аминокислоты соответствует “CDR3” (SEQ ID NO:52), и область аминокислот от 101-ой аминокислоты до 110-ой аминокислоты соответствует “FR4”.In addition, in SEQ ID NO: 54, showing the amino acid sequence of the variable region of the light chain of MoAb3 of the present invention, the region from the N-terminus to the 23rd amino acid corresponds to “FR1” of the variable region of the light chain, the amino acid region from the 24th amino acid to 34 amino acid corresponds to “CDR1” (SEQ ID NO: 50) of the variable region of the light chain, the amino acid region from the 35th amino acid to the 49th amino acid corresponds to “FR2”, the amino acid region from the 50th amino acid to the 56th amino acid corresponds to “ CDR2 ”(SEQ ID NO: 51), amino acid region from 57th amino acid to 87th amino acid corresponds to “FR3”, the amino acid region from 88th amino acid to 100th amino acid corresponds to “CDR3” (SEQ ID NO: 52), and the amino acid region from 101st amino acid to 110 -th amino acid corresponds to “FR4”.
Поскольку преимущественные эффекты MoAb1 и MoAb2 по настоящему изобретению не являются предметом компромисса, возможно вводить мутацию в любую из аминокислотных последовательностей, соответствующих FR1-FR4 вариабельной области тяжелой цепи, приведенных в SEQ ID NO:7, 37 и 53 и аминокислотных последовательностей, соответствующих FR1-FR4 вариабельной области легкой цепи, приведенных в SEQ ID NO:8, 38 и 54. В настоящем описании, если не упоминается иным образом, конкретно, “преимущественные эффекты MoAb1, MoAb2 и MoAb3 по настоящему изобретению” означает связывание с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и, предпочтительно, означает специфическое связывание с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл. В частности, “преимущественный эффект MoAb1 по настоящему изобретению” означает связывание с ЛАМ туберкулезной бациллы, предпочтительно, означает специфическое связывание с ЛАМ туберкулезной бациллы. Несмотря на то что не существует конкретного ограничения также по числу мутаций, которые могут быть введены, число введенных мутаций может быть установлено таким образом, что идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью перед мутацией составляет 85% или выше, предпочтительно, 90% или выше, более предпочтительно, 95% или выше и, особенно предпочтительно, 98% или выше. Следует отметить, что введение мутации, описанное в настоящем описании, может включать замещение, делецию и ввод аминокислоты. Кроме того, сайт распознавания рестрикционного фермента может быть введен в FR1 вариабельной области тяжелой цепи и/или FR4 вариабельных областей легкой/тяжелой цепи.Since the advantageous effects of MoAb1 and MoAb2 of the present invention are not compromised, it is possible to introduce a mutation into any of the amino acid sequences corresponding to the FR1-FR4 variable region of the heavy chain shown in SEQ ID NO: 7, 37 and 53 and the amino acid sequences corresponding to FR1- FR4 of the variable region of the light chain given in SEQ ID NO: 8, 38 and 54. In the present description, unless otherwise mentioned, specifically, “the primary effects of MoAb1, MoAb2 and MoAb3 of the present invention” means binding to LAM acid-resistant bacilli and, preferably, means specific binding to LAM acid-resistant bacilli. In particular, the “advantageous effect of MoAb1 of the present invention” means binding to a LAM of a tuberculosis bacillus, preferably means specific binding to a LAM of a tuberculosis bacillus. Although there is no particular restriction on the number of mutations that can be introduced, the number of introduced mutations can be established so that the amino acid sequence is identical with the amino acid sequence before the mutation is 85% or higher, preferably 90% or higher, more preferably 95% or higher, and particularly preferably 98% or higher. It should be noted that the introduction of the mutation described in the present description may include substitution, deletion and input of amino acids. In addition, a restriction enzyme recognition site can be introduced into the FR1 variable region of the heavy chain and / or FR4 variable regions of the light / heavy chain.
Кроме того, FR1-FR4 вариабельной области тяжелой цепи и FR1-FR4 вариабельной области легкой цепи, указанные в MoAb1 и MoAb3, все представляют собой аминокислотные последовательности, полученные из кроликов, в то время как FR1-FR4 вариабельной области тяжелой цепи и FR1-FR4 вариабельной области легкой цепи, указанные в MoAb2, все представляют собой аминокислотные последовательности, полученные из цыплят. Однако, поскольку преимущественный эффект MoAb по настоящему изобретению не является предметом компромисса, может применяться каркасная область, полученная из любого вида животных. Примеры таких видов животных могут включать, но конкретно не ограничиваются перечисленными, людей, кроликов, цыплят, лошадей, коров, коз, овец, собак, мышей, хомяков и крыс. Аминокислотные последовательности, предпочтительно, получают от кроликов, цыплят или людей, и, более предпочтительно, от людей. Следует отметить, что аминокислотные последовательности полученных от людей FR1-FR4 являются известными в данной области (Kabat, et al. US Department of Health AND human Services, NIH (1991), USA), и описаны, например, на вебсайте NCBI.In addition, FR1-FR4 of the variable region of the heavy chain and FR1-FR4 of the variable region of the light chain indicated in MoAb1 and MoAb3 are all amino acid sequences derived from rabbits, while FR1-FR4 of the variable region of the heavy chain and FR1-FR4 the light chain variable regions indicated in MoAb2 are all amino acid sequences derived from chickens. However, since the advantageous effect of the MoAb of the present invention is not compromised, a framework region obtained from any animal species can be used. Examples of such animal species may include, but are not limited to, humans, rabbits, chickens, horses, cows, goats, sheep, dogs, mice, hamsters and rats. Amino acid sequences are preferably obtained from rabbits, chickens or humans , and more preferably from humans. It should be noted that the amino acid sequences obtained from humans FR1-FR4 are known in the art (Kabat, et al. US Department of Health AND human Services, NIH (1991), USA), and are described, for example, on the NCBI website.
MoAb по настоящему изобретению имеет структуру, в которой вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи, имеющие описанную выше конфигурацию, соединены через линкер. В отношении “линкера” в настоящем описании не существует конкретного ограничения, поскольку преимущественный эффект MoAb по настоящему изобретению не является предметом компромисса, и его примеры могут включать пептид, имеющий линкерную последовательность, образованную из аминокислотной последовательности, чье число аминокислотных остатков обычно составляет приблизительно от 8 до 30, предпочтительно, приблизительно от 8 до 20 и, более предпочтительно, приблизительно от 8 до 15. Примеры предпочтительных линкерных последовательностей включают, но ими не ограничены, линкерную последовательность GS {(Gly-Gly-Gly-Ser: SEQ ID NO:9)n, (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser: SEQ ID NO:10)n; n является числом повторов] или т.п. Предпочтительно, в качестве линкера применяют пептид, имеющий последовательность с 1-3 (n является целым числом от 1 до 3) повторами такой линкерной последовательности GS. В Примерах, описанных позже, в качестве линкера применяют пептид (Пример 1), имеющий последовательность (GGGGSGGGGSGGGGS: SEQ ID NO:11) с тремя повторами линкерной последовательности GS и пептид (Пример 6), имеющий еще одну другую последовательность (GGGGSGGDGSGGGGS: SEQ ID NO:40).The MoAb of the present invention has a structure in which the variable region of the heavy chain and the variable region of the light chain having the configuration described above are connected through a linker. There is no particular limitation on the “linker” in the present description, since the advantageous effect of the MoAb of the present invention is not compromised, and examples thereof may include a peptide having a linker sequence formed from an amino acid sequence, whose number of amino acid residues is usually from about 8 up to 30, preferably about 8 to 20, and more preferably about 8 to 15. Examples of preferred linker sequences include the linker sequence GS {(Gly-Gly-Gly-Ser: SEQ ID NO: 9) n , (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser: SEQ ID NO: 10) n is felt, but not limited to; n is the number of repetitions] or the like Preferably, a peptide having a sequence of 1-3 (n is an integer from 1 to 3) repeats of such a GS linker sequence is used as a linker. In the Examples described later, the peptide (Example 1) having the sequence (GGGGSGGGGGSGGGGS: SEQ ID NO: 11) with three repeats of the GS linker sequence and the peptide (Example 6) having another different sequence (GGGGSGGDGSGGGGS: SEQ ID are used as a linker) NO: 40).
Предпочтительным осуществлением MoAb1 по настоящему изобретению может быть одноцепочечное антитело, состоящее из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12. Кроме того, предпочтительным осуществлением MoAb2 может быть одноцепочечное антитело, состоящее из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:39. Кроме того, предпочтительным осуществлением MoAb3 может быть одноцепочечное антитело, состоящее из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:30.A preferred embodiment of the MoAb1 of the present invention may be a single chain antibody consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12. In addition, a preferred embodiment of MoAb2 may be a single chain antibody consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39. In addition, a preferred embodiment of MoAb3 may be a single chain antibody consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30.
Такие моноклональные антитела по настоящему изобретению включают антитело, которое отличает и специфически распознает туберкулезную бациллу от нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл. Более конкретно, они включают антитело, которое различает липоарабиноманнан (ЛАМ) туберкулезной бациллы от ЛАМ нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл и специфически связывается с ЛАМ туберкулезной бациллы. Примеры моноклональных антител могут включать MoAb1, описанное выше. Туберкулезная бацилла, которая различается от нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл и специфически распознается MoAb1 по настоящему изобретению, является, предпочтительно, туберкулезной бациллой человека (M. tuberculosis) и бычьей туберкулезной бациллой (M. bovis), и, более предпочтительно, является туберкулезной бациллой человека (M. tuberculosis).Such monoclonal antibodies of the present invention include an antibody that distinguishes and specifically recognizes tuberculosis bacillus from non-tuberculosis acid-resistant bacilli. More specifically, they include an antibody that distinguishes a lipoarabinomannan (LAM) tuberculosis bacillus from a LAM of non-tuberculosis acid-resistant bacilli and specifically binds to a LAM of a tuberculosis bacillus. Examples of monoclonal antibodies may include MoAb1 described above. The tuberculosis bacillus, which differs from non-tuberculosis acid-resistant bacilli and is specifically recognized by MoAb1 of the present invention, is preferably human tuberculosis bacillus (M. tuberculosis) and bovine tuberculosis bacillus (M. bovis), and, more preferably, human tuberculosis (bacillus . tuberculosis).
Когда реакцию против ЛАМ туберкулезной бациллы сравнивают посредством метода конкуренции, можно утверждать, что специфическое связывание по отношению к ЛАМ туберкулезной бациллы происходит, когда требуемое количество ЛАМ нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл составляет 10-кратное или более количество от количества ЛАМ туберкулезной бациллы. Кроме того, когда ЛАМ обнаруживают посредством складывания в сэндвич иммобилизованного антитела и антитела обнаружения, MoAb по настоящему изобретению может быть определено, как имеющее более предпочтительную специфичность связывания по отношению к ЛАМ туберкулезной бациллы, если реактивность к ЛАМ нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл была снижена до 1/100 от реактивности к ЛАМ туберкулезной бациллы.When a reaction against a LAM of a tuberculous bacillus is compared using a competition method, it can be stated that specific binding to a LAM of a tuberculous bacillus occurs when the required number of LAM of non-tuberculosis acid-resistant bacilli is 10 times or more of the amount of LAM of a tuberculous bacillus. In addition, when LAM is detected by sandwiching an immobilized antibody and a detection antibody, the MoAb of the present invention can be defined as having a more specific binding specificity for the LAM of the tuberculosis bacillus if the reactivity to the LAM of non-tuberculic acid-resistant bacilli has been reduced to 1/100 from reactivity to LAM tuberculosis bacillus.
Аффинность антитела может быть легко измерена с помощью известной до настоящего времени технологии, например, измерения изотермы насыщения связывания 125I-меченого IgG или его фрагмента или посредством анализа нелинейной регрессии с использованием гомологичного замещения 125IgG немеченым IgG, как описано Motilsky в Analyzing Data with GraphPad Prizm (1999)), GraphPad Software Inc., San Diego, CA. Другие методы, известные в области, могут применяться для измерения, и метод, может представлять собой, например, метод, описанный в Scatchard et al. Ann. NY Acd. Sci., 51, 660 (1949).The affinity of an antibody can be easily measured using hitherto known technology, for example, measuring the saturation isotherm of binding of 125 I-labeled IgG or a fragment thereof or by non-linear regression analysis using homologous replacement of 125 IgG with unlabeled IgG, as described by Motilsky in Analyzing Data with GraphPad Prizm (1999)), GraphPad Software Inc., San Diego, CA. Other methods known in the art can be used for measurement, and the method can be, for example, the method described in Scatchard et al. Ann. NY Acd. Sci., 51, 660 (1949).
MoAb по настоящему изобретению может продуцироваться в соответствии с, но не ограничиваясь лишь им, методом фагового дисплея (G. Smith, Science, 228, 1315 (1985)) с использованием туберкулезной бациллы в качестве антигена. В настоящем описании, примеры туберкулезных бацилл могут включать описанную выше туберкулезную бациллу (Mycobacterium tuberculosis, туберкулезная бацилла человека), бычью туберкулезную бациллу (M. bovis, бычья туберкулезная бацилла, бычья бацилла), Mycobacterium africanum (M. africanum), и туберкулезную бациллу серой полевки. Туберкулезная бацилла (Mycobacterium tuberculosis, туберкулезная бацилла человека), бычья туберкулезная бацилла (M. bovis, бычья туберкулезная бацилла, бычья бацилла) и Mycobacterium africanum являются предпочтительными, и бычья туберкулезная бацилла является более предпочтительной. Как описано выше, БЦЖ получают посредством ослабления бычьей туберкулезной бациллы (M. bovis) через последовательное долговременное субкультивирование.The MoAb of the present invention can be produced in accordance with, but not limited to, the phage display method (G. Smith, Science, 228, 1315 (1985)) using a tuberculosis bacillus as an antigen. In the present description, examples of tuberculosis bacilli may include the tuberculosis bacillus described above (Mycobacterium tuberculosis, human tuberculosis bacillus), bovine tuberculosis bacillus (M. bovis, bovine tuberculosis bacillus, bovine tuberculosis bacillus), M. tuberculosis, African field voles. Tuberculosis bacillus (Mycobacterium tuberculosis, human tuberculosis bacillus), bovine tuberculosis bacillus (M. bovis, bovine tuberculosis bacillus, bovine bacillus) and Mycobacterium africanum are preferred, and bovine tuberculosis is more preferred. As described above, BCG is obtained by attenuating the bovine tuberculosis bacillus (M. bovis) through sequential long-term subculture.
Способ получения MoAb по настоящему изобретению с помощью фагового дисплея с использованием БЦЖ в качестве антигена описан в “Примерах”. Как описано выше, признак MoAb по настоящему изобретению состоит в различении и специфическом распознавании кислотоустойчивых бацилл от других бактерий, таких как бактерии полости рта, и, более конкретно, различении ЛАМ кислотоустойчивых бацилл от ЛАМ-подобных антигенов других бактерий и специфическом связывании с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл. Признак представляет собой, предпочтительно, различение туберкулезной бациллы от нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл и специфическое распознавание туберкулезной бациллы, и, более конкретно, различение ЛАМ туберкулезной бациллы от ЛАМ нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл и, конкретно, связывание с ЛАМ туберкулезной бациллы. Такое MoAb может продуцироваться с использованием БЦЖ в качестве иммуногена.The method for producing MoAb of the present invention using phage display using BCG as an antigen is described in “Examples”. As described above, the MoAb trait of the present invention is to distinguish and specifically recognize acid-resistant bacilli from other bacteria, such as oral bacteria, and more specifically, distinguish LAM from acid-resistant bacilli from LAM-like antigens of other bacteria and specifically bind LAM to acid-resistant bacilli . The sign is preferably a distinction between a tuberculosis bacillus and non-tuberculosis acid-resistant bacilli and specific recognition of a tuberculosis bacillus, and more specifically, a distinction between LAM of a tuberculosis bacillus and LAM of a non-tuberculosis acid-resistant bacillus and, specifically, binding to a LAM of tuberculosis bacillus. Such MoAb can be produced using BCG as an immunogen.
Следует отметить, что, как описано выше, БЦЖ представляет собой ослабленный штамм, получаемый из бычьей туберкулезной бациллы (M. bovis), и относится к бактериям, имеющим антигенность, но не имеющим токсичности или имеющим сниженную токсичность против человека. Однако, в настоящем изобретении, не только такую, но и вакцину БЦЖ, полученную с использованием бактерий, также называют “БЦЖ”.It should be noted that, as described above, BCG is a weakened strain obtained from bovine tuberculosis bacillus (M. bovis), and refers to bacteria that have antigenicity, but have no toxicity or have reduced toxicity against humans. However, in the present invention, not only such, but also the BCG vaccine obtained using bacteria is also called “BCG”.
Кроме того, моноклональное антитело по настоящему изобретению включает мультивалентное антитело, которое представляет собой одноцепочечное антитело, описанное выше. Несмотря на то что мультивалентные антитела включают бивалентные антитела, тривалентные антитела и тетравалентные антитела, бивалентные антитела являются предпочтительными. Эти мультивалентные антитела могут продуцироваться в соответствии с известным до настоящего времени методом (Непатентная Литература 7: K. Zuberbuhler, Protein Engineering, Design & Selection, 22, 169 (2009)). Конкретно, мультивалентное антитело может продуцироваться посредством, например, в случае бивалентного антитела, соединения генов тяжелой цепи и легкой цепи одноцепочечного антитела с использованием гена константной области, клонирования соединенных генов в вектор, способный к экспрессии его в клетках млекопитающих, трансформации клеток млекопитающих с вектором, включающим гены, и культивирования клеток.In addition, the monoclonal antibody of the present invention includes a multivalent antibody, which is a single chain antibody described above. Although multivalent antibodies include bivalent antibodies, trivalent antibodies and tetravalent antibodies, bivalent antibodies are preferred. These multivalent antibodies can be produced according to a method known to date (Non-Patent Literature 7: K. Zuberbuhler, Protein Engineering, Design & Selection, 22, 169 (2009)). Specifically, a multivalent antibody can be produced by, for example, a bivalent antibody, combining the heavy chain and light chain genes of a single chain antibody using a constant region gene, cloning the connected genes into a vector capable of expressing it in mammalian cells, transforming mammalian cells to a vector, including genes, and culturing cells.
(II) Способ иммунизации животного, не являющегося человеком, для получения моноклонального антитела, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы, и способ получения моноклонального антитела(II) A method for immunizing a non-human animal to produce a monoclonal antibody that specifically binds to LAM of acid-resistant bacilli, preferably a LAM of tuberculosis bacillus, and a method for producing a monoclonal antibody
Настоящее изобретение также относится к способу иммунизации животного, не являющегося человеком, для получения MoAb, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, и способу получения MoAb с использованием способа иммунизации. Более предпочтительно, настоящее изобретение относится к способу иммунизации животного, не являющегося человеком, для получения MoAb, которое специфически связывается с ЛАМ туберкулезной бациллы, и способу получения MoAb с использованием способа иммунизации.The present invention also relates to a method for immunizing a non-human animal to produce MoAb that specifically binds to LAM of acid-resistant bacilli, and to a method for producing MoAb using an immunization method. More preferably, the present invention relates to a method for immunizing a non-human animal to produce MoAb that specifically binds to a LAM of a tuberculous bacillus, and a method for producing MoAb using an immunization method.
(II-1) Способ иммунизации(II-1) Method of Immunization
Основные структуры ЛАМ кислотоустойчивых бацилл являются почти одинаковыми за исключением незначительных различий, распознаваемых в структуре маннозной верхушки. При получении антитела против такого ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, общепринятым является иммунизировать животное, не являющееся человеком, с использованием стандартного штамма туберкулезной бациллы человека, такого как H37Rv в качестве иммуногена. Посредством такого исполнения, может быть получено антитело, которое обширно реагирует с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл.The main structures of LAMs of acid-resistant bacilli are almost identical except for minor differences recognized in the structure of the mannose apex. When an antibody is obtained against such LAM of acid-resistant bacilli, it is generally accepted to immunize a non-human animal using a standard strain of human tuberculosis bacillus such as H37Rv as an immunogen. Through this embodiment, an antibody can be obtained that extensively reacts with LAM of acid-resistant bacilli.
С другой стороны, когда животное, не являющееся человеком, иммунизируют с использованием в качестве иммуногена БЦЖ, т.е. ослабленного штамма, полученного из бычьей туберкулезной бациллы (M. bovis), или вакцины, полученной из него; возможно получать высокоспецифичное антитело, которое специфически связывается с ЛАМ туберкулезной бациллы, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы человека, посредством различения его от ЛАМ нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл. Настоящее изобретение в качестве предпочтительного осуществления относится к способу иммунизации животного, не являющегося человеком, с использованием БЦЖ в качестве иммуногена (иммунизирующего антигена), в качестве способа иммунизации для получения MoAb, которое специфически связывается с ЛАМ туберкулезной бациллы человека.On the other hand, when a non-human animal is immunized using BCG as an immunogen, i.e. attenuated strain obtained from bovine tuberculosis bacillus (M. bovis), or a vaccine obtained from it; it is possible to obtain a highly specific antibody that specifically binds to the LAM of a tuberculosis bacillus, preferably a LAM of a human tuberculosis bacillus, by distinguishing it from a LAM of non-tuberculosis acid-resistant bacilli. The present invention, as a preferred embodiment, relates to a method for immunizing a non-human animal using BCG as an immunogen (immunizing antigen) as an immunization method for producing MoAb that specifically binds to LAM of a human tuberculosis bacillus.
В настоящем описании, животное, не являющееся человеком, может представлять собой животное, отличное от человека, и его примеры включают млекопитающих, таких как мышь, крыса, хомяк, морская свинка, кролик, обезьяна, собака, коза, овца, свинья, лошадь и корова, и птиц, таких как курица, утка, индейка и перепелка. Млекопитающие (небольшие животные), такие как мышь, крыса, хомяк, морская свинка и кролик являются более предпочтительными.As used herein, a non-human animal may be a non-human animal, and examples thereof include mammals such as a mouse, rat, hamster, guinea pig, rabbit, monkey, dog, goat, sheep, pig, horse, and a cow, and birds such as chicken, duck, turkey and quail. Mammals (small animals) such as mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit are more preferred.
Способ иммунизации по настоящему изобретению для получения MoAb, которое специфически связывается с ЛАМ туберкулезной бациллы, характеризуется иммунизацией животного, не являющегося человеком с использованием БЦЖ в качестве иммуногена (иммунизирующего антигена); и технология иммунизации не является конкретно ограниченной, а способ известный в данной области, может быть выбран соответствующим образом для использования.The method of immunization of the present invention to obtain MoAb, which specifically binds to the LAM of a tuberculosis bacillus, is characterized by immunization of an animal that is not a human using BCG as an immunogen (immunizing antigen); and the immunization technology is not specifically limited, and a method known in the art can be appropriately selected for use.
Его примеры включают способ введения посредством подкожной, внутривенной или интраабдоминальной инъекции БЦЖ вместе с, при необходимости, адъювантом. Подкожное введение является предпочтительным. Примеры адъюванта могут включать, но не ограничены лишь приведенными, полный адъювант Фрейнда и неполный адъювант Фрейнда. Следует отметить, что введение БЦЖ, предпочтительно, осуществляют приблизительно от 2 до 5 раз с интервалом в приблизительно 2 недели после первого введения (первой иммунизации).Examples thereof include a method of administration by subcutaneous, intravenous or intra-abdominal injection of BCG together with, if necessary, an adjuvant. Subcutaneous administration is preferred. Examples of an adjuvant may include, but are not limited to, Freund's complete adjuvant and Freund's incomplete adjuvant. It should be noted that the introduction of BCG is preferably carried out from about 2 to 5 times with an interval of about 2 weeks after the first injection (first immunization).
Клетки селезенки животного, не являющегося человеком, иммунизированного таким образом, являются применимыми в качестве клеток для продуцирования антитела, которое является высокоспецифичным к ЛАМ туберкулезной бациллы, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы человека. Селезенку удаляют из иммунизированного животного, не являющегося человеком, в течение от свыше десяти дней до нескольких месяцев после первой иммунизации БЦЖ, и применяют для продуцирования и получения антитела, которое является высокоспецифичным к ЛАМ туберкулезной бациллы, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы человека.Spleen cells of a non-human animal immunized in this way are useful as cells for producing an antibody that is highly specific for LAM of a tuberculous bacillus, preferably LAM of a human tuberculosis bacillus. The spleen is removed from the immunized non-human animal within more than ten days to several months after the first BCG immunization, and is used to produce and produce an antibody that is highly specific for LAM of a tuberculosis bacillus, preferably LAM of a human tuberculosis bacillus.
Конкретно, например, клетки (продуцирующие антитело клетки), полученные из селезенки, удаленной из животного, не являющегося человеком, гибридизируют с клетками миеломы в соответствии с известным до настоящего времени способом, применяя способ с полиэтиленгликолем или электрическую стимуляцию, и культивируют клетки в селекционной среде НАТ для получения гибридом. Затем посредством скрининга среди гибридом, может быть получена гибридома, которая продуцирует антитело, которое связывается с ЛАМ туберкулезной бациллы, применяя известный до настоящего времени способ, такой как анализ с ограничивающим разбавлением, гибридома, которая продуцирует MoAb, которое является высокоспецифичным к ЛАМ туберкулезной бациллы. Посредством культивирования с помощью известного до настоящего времени способа гибридомы, клонированной таким образом, является возможным приготовить и получить MoAb, которое является высокоспецифичным к ЛАМ желательной туберкулезной бациллы, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы человека.Specifically, for example, cells (antibody-producing cells) obtained from a spleen removed from a non-human animal are hybridized to myeloma cells in accordance with a method known to date using a polyethylene glycol method or electrical stimulation, and cells are cultured in a selection medium NAT to obtain hybridomas. Then, through screening among hybridomas, a hybridoma can be obtained that produces an antibody that binds to the LAM of a tuberculous bacillus using a method known to date, such as a limiting dilution assay, a hybridoma that produces MoAb that is highly specific to a LAM of a tuberculous bacillus. By culturing, using the hitherto known method of the hybridoma thus cloned, it is possible to prepare and obtain MoAb, which is highly specific for the LAM of the desired tuberculosis bacillus, preferably LAM of the human tuberculosis bacillus.
Вне зависимости от туберкулезной бациллы или нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл, примеры способа приготовления и получения MoAb, которое селективно связывается с ЛАМ широкого ряда кислотоустойчивых бацилл, могут включать способ выбора антитела с использованием комплекса ЛАМ и полученного выше антитела, которое является высокоспецифичным к ЛАМ туберкулезной бациллы, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы человека. В данном случае, технология иммунизации не является конкретно ограниченной, и способ, известный в данной области, может быть выбран соответствующим образом для использования. Следует отметить, что “комплекс”, как описан в настоящем описании, относится к образованию комплекса антиген-антитело из ЛАМ и антитела, которое является высокоспецифичным к ЛАМ туберкулезной бациллы, и генерация комплекса может быть подтверждена посредством анализа с использованием ELISA.Regardless of the tuberculosis bacillus or non-tuberculosis acid-resistant bacilli, examples of a method for preparing and preparing MoAb that selectively binds LAMs of a wide range of acid-resistant bacilli may include a method for selecting an antibody using the LAM complex and the antibody obtained above, which is highly specific for LAM tuberculosis bacilli, preferably , LAM of human tuberculosis bacillus. In this case, the immunization technology is not particularly limited, and a method known in the art can be appropriately selected for use. It should be noted that the “complex”, as described herein, refers to the formation of an antigen-antibody complex from LAM and an antibody that is highly specific for LAM of a tuberculous bacillus, and the generation of the complex can be confirmed by analysis using ELISA.
(II-2) Способ получения MoAb, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы(II-2) A method for producing MoAb that specifically binds to LAM of acid-resistant bacilli, preferably LAM of tuberculosis bacillus
MoAb, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы, может быть получено с использованием животного, не являющегося человеком (иммунизированного животного, не являющегося человеком), которое было иммунизировано описанным выше способом иммунизации.MoAb, which specifically binds to LAMs of acid-resistant bacilli, preferably a tuberculosis bacillus, can be obtained using a non-human animal (an immunized non-human animal) that has been immunized with the immunization method described above.
Примеры таких способов могут включать способ удаления селезенки из иммунизированного животного, не являющегося человеком, как описано выше, получения клеток (клеток, продуцирующих антитело) из удаленной селезенки, гибридизации клеток с клетками миеломы в соответствии с известным до настоящего времени способом, с использованием полиэтиленгликоля или электрической стимуляции для получения гибридом, выбора, из полученных гибридом, гибридом, которые продуцируют MoAb, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы, и культивирование гибридомы. Таким образом, возможно подготовить и получить MoAb, которое является высокоспецифичным к ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы, более предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы человека. В настоящем описании, культивирование гибридомы может проводиться внутрибрюшинно у животного, не являющегося человеком, такого как мышь или кролик, или может проводиться in vitro с использованием чашки или т.п. В первом способе, т.е. культивировании гибридомы у животного, не являющегося человеком, асцит животного, не являющегося человеком, собирают после культивирования, и желательное MoAb выделяют и очищают от асцита. Во втором способе, культивировании гибридомы in vitro, желательное MoAb выделяют и очищают от культуральной жидкой среды, полученной после культивирования. Примеры способа очистки моноклонального антитела могут включать способ, когда подклассом антитела является IgG, аффинную хроматографию с использованием белка А.Examples of such methods may include a method for removing a spleen from an immunized non-human animal as described above, obtaining cells (antibody producing cells) from a removed spleen, hybridizing cells with myeloma cells in accordance with a method known to date using polyethylene glycol or electrical stimulation to obtain hybridomas, the choice of hybridomas obtained, hybridomas that produce MoAb that specifically binds to LAM acid-resistant bacilli, preferably tuberculous bacillus, and hybridoma cultivation. Thus, it is possible to prepare and obtain MoAb, which is highly specific for LAM of acid-resistant bacilli, preferably tuberculosis bacillus, more preferably LAM of human tuberculosis bacillus. In the present description, cultivation of the hybridoma can be carried out intraperitoneally in a non-human animal, such as a mouse or rabbit, or can be carried out in vitro using a plate or the like. In the first method, i.e. by culturing a hybridoma in a non-human animal, the ascites of the non-human animal are collected after cultivation and the desired MoAb is isolated and purified from ascites. In a second method, in vitro hybridoma cultivation, the desired MoAb is isolated and purified from the culture liquid obtained after the cultivation. Examples of a method for purifying a monoclonal antibody may include a method where the subclass of the antibody is IgG, affinity chromatography using protein A.
Кроме того, MoAb, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы, может также быть получено с использованием метода фагового дисплея, разработанного в последние годы (Непатентная Литература 6: Winter et al., Annu. Rev. Immunol., 12: 433, 1994). Конкретно, селезенку удаляют из иммунизированного животного, не являющегося человеком, которое иммунизируют описанным выше способом, общую РНК или мРНК получают из удаленной селезенки, кДНК получают, используя РНК в качестве матрицы, и получают гены одноцепочечных антител (scFv: фрагмент вариабельной области с одиночной цепью), кодирующие вариабельные области антител. В настоящем описании, по отношению к вариабельным областям антител, поскольку каждая из них включает две области из вариабельной области тяжелой цепи (область VH) и вариабельной области легкой цепи (область LH), любой пептидный линкер может быть включен между областью VH и областью LH. Пептидный линкер может представлять собой, например, как описано в (I), пептид, имеющий линкерную последовательность, образованную из аминокислотной последовательности из приблизительно от 8 до 30 аминокислотных остатков, и примеры такой линкерной последовательности включают линкерную последовательность GS.In addition, MoAb, which specifically binds to LAM of acid-resistant bacilli, preferably a tuberculosis bacillus, can also be obtained using the phage display method developed in recent years (Non-Patent Literature 6: Winter et al., Annu. Rev. Immunol., 12 : 433, 1994). Specifically, the spleen is removed from an immunized non-human animal that is immunized as described above, total RNA or mRNA is obtained from the removed spleen, cDNA is obtained using RNA as a template, and single-chain antibody genes are obtained (scFv: single chain variable region fragment ) encoding the variable regions of antibodies. In the present description, with respect to the variable regions of antibodies, since each of them includes two regions from the variable region of the heavy chain (VH region) and the variable region of the light chain (LH region), any peptide linker can be inserted between the VH region and the LH region. The peptide linker may be, for example, as described in (I), a peptide having a linker sequence formed from an amino acid sequence of from about 8 to 30 amino acid residues, and examples of such a linker sequence include a GS linker sequence.
Гены клонируют в фагемидный вектор и вводят в Escherichia coli, которую затем инфицируют фагом для обеспечения экспрессии антител scFv на фаговых капсулах (получение библиотеки фагового дисплея scFv).Genes are cloned into a phagemid vector and introduced into Escherichia coli, which is then infected with phage to allow expression of scFv antibodies in phage capsules (obtaining a scFv phage display library).
Когда в качестве иммуногена (иммунизирующего антигена) применяют БЦЖ в способе иммунизации животного, не являющегося человеком, возможно получать и продуцировать моноклональное антитело (антитело scFv), которое специфически связывается с ЛАМ туберкулезной бациллы, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы человека, посредством осуществления биопэннинга с библиотекой фагового дисплея scFv, экспрессирующей антитела scFv, используя БЦЖ, который использовали в качестве иммунизирующего антигена, и последовательного осуществления биопэннинга с использованием планшета с антигеном, имеющего твердую фазу с ЛАМ туберкулезной бациллы, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы человека.When BCG is used as an immunogen (immunizing antigen) in a method of immunizing a non-human animal, it is possible to produce and produce a monoclonal antibody (scFv antibody) that specifically binds to a LAM of a tuberculous bacillus, preferably a LAM of a human tuberculosis bacillus, through biopanning from libraries phage display of scFv expressing scFv antibodies using BCG, which was used as an immunizing antigen, and sequential biopanning using the plate with the antigen, the solid phase having a LAM tubercle bacillus, preferably LAM human tubercle bacillus.
Дополнительно, в качества способа выбора MoAb (одноцепочечного антитела), которое является высокоспецифичным к ЛАМ микобактерий, возможно получать и продуцировать одноцепочечное антитело (антитело scFv), которое селективно связывается с ЛАМ широкого ряда кислотоустойчивых бацилл независимо от того, являются ли они туберкулезными бациллами или нетуберкулезными кислотоустойчивыми бациллами, посредством осуществления биопэннинга с библиотекой фагового дисплея scFv, экспрессирующей антитела scFv, используя комплекс антитело-антиген, в котором ЛАМ захватывается носителем, имеющим антитело против ЛАМ, в качестве твердой фазы.Additionally, as a method of selecting MoAb (single chain antibody), which is highly specific for LAM of mycobacteria, it is possible to produce and produce a single chain antibody (scFv antibody) that selectively binds to LAM of a wide range of acid-resistant bacilli, regardless of whether they are tuberculosis bacilli or non-tuberculosis acid-resistant bacilli by biopanning with a scFv phage display library expressing scFv antibodies using an antibody-antigen complex in which LAM is captured by a carrier having an anti-LAM antibody as a solid phase.
Следует отметить, что в отношении получения общей РНК или мРНК, получения кДНК, субклонирования в фагемид, введения в Escherichia coli, инфицирования фагом, и способа скрининга (биопэннинга) моноклонального антитела (антитела scFv), которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы и, более предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы человека; могут применяться способы, известные в данной области, и более конкретно, описанные выше стадии могут проводиться с использованием описанных ниже Примеров в качестве ссылки.It should be noted that in relation to obtaining total RNA or mRNA, obtaining cDNA, subcloning into phagemid, introducing into Escherichia coli, phage infection, and a method for screening (biopanning) of a monoclonal antibody (scFv antibody) that specifically binds LAM to acid-resistant bacilli, preferably LAM of tuberculosis bacillus and, more preferably, LAM of human tuberculosis bacillus; methods known in the art can be applied, and more specifically, the steps described above can be carried out using the Examples described below by reference.
(III) Способ обнаружения кислотоустойчивых бацилл, конкретно туберкулезной бациллы, и используемое в нем устройство для обнаружения кислотоустойчивой бациллы (в частности, туберкулезной бациллы)(III) A method for detecting acid-resistant bacilli, specifically a tuberculosis bacillus, and a device for detecting an acid-resistant bacillus (in particular, a tuberculosis bacillus) used therein
MoAb по настоящему изобретению, описанное выше, может применяться для обнаружения кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы. Другими словами, посредством использования MoAb по настоящему изобретению возможно определить является или нет индивид носителем кислотоустойчивых бацилл, в частности, туберкулезной бациллы. Другими словами, возможно диагностировать/тестировать инфицирован или не инфицирован индивид кислотоустойчивыми бациллами, в частности, туберкулезной бациллой.The MoAb of the present invention described above can be used to detect acid-resistant bacilli, preferably a tuberculosis bacillus. In other words, by using the MoAb of the present invention, it is possible to determine whether or not an individual is a carrier of an acid resistant bacillus, in particular a tuberculosis bacillus. In other words, it is possible to diagnose / test whether an individual is infected or not infected with acid-resistant bacilli, in particular, tuberculosis bacillus.
Обнаружение (диагностика/тестирование) кислотоустойчивых бацилл, в частности, туберкулезной бациллы по настоящему изобретению может проводиться посредством следующих стадий (1) и (2).Detection (diagnosis / testing) of acid-resistant bacilli, in particular the tuberculosis bacillus of the present invention, can be carried out by the following steps (1) and (2).
(1) стадии приведения MoAb по настоящему изобретению в контакт с биологическим образцом (тестируемым образцом) индивида; и(1) the steps of bringing the MoAb of the present invention into contact with a biological sample (test sample) of an individual; and
(2) стадии проведения анализа на туберкулезную бациллу, которая существует в тестируемом образце, с использованием в качестве показателя реакции связывания между MoAb по настоящему изобретению и ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, в частности, ЛАМ туберкулезной бациллы.(2) the steps of conducting an analysis for the tuberculosis bacillus that exists in the test sample using, as an indicator of the binding reaction between the MoAb of the present invention and the LAM of acid-resistant bacilli, in particular the LAM of the tuberculosis bacillus.
Биологический образец индивида (тестируемый образец), который приводится в контакт с MoAb по настоящему изобретению на стадии (1), может представлять собой биологический образец, в котором существуют кислотоустойчивые бациллы, в частности, туберкулезная бацилла, и примеры биологического образца могут включать мокроту, слюну, кровь (сыворотку, плазму), промывную жидкость из легких, желудочный сок, мочу, фекалии, кожу и панкреатический сок и т.д. Биологический образец, предпочтительно, представляет собой мокроту, слюну или кровь, и более предпочтительно, является мокротой или слюной.An individual’s biological sample (test sample) that is contacted with the MoAb of the present invention in step (1) may be a biological sample in which acid-resistant bacilli exist, in particular a tuberculous bacillus, and examples of the biological sample may include sputum, saliva , blood (serum, plasma), flushing fluid from the lungs, gastric juice, urine, feces, skin and pancreatic juice, etc. The biological sample is preferably sputum, saliva or blood, and more preferably is sputum or saliva.
В настоящем описании, индивид, которого подвергают анализу, является, предпочтительно, человеком, однако, отличающиеся от человека животные, такие как лошадь, корова, коза, овца, собака, курица, мышь, хомяк и крыса, могут также использоваться в качестве индивида.In the present description, the individual to be analyzed is preferably a human, however, non-human animals such as a horse, cow, goat, sheep, dog, chicken, mouse, hamster and rat can also be used as an individual.
Условие, при котором MoAb по настоящему изобретению и биологический образец приводятся в контакт друг с другом, не ограничивается конкретно, поскольку представляет собой условие, при котором реакция связывания между MoAb по настоящему изобретению и ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы не является предметом компромисса, и применяют общее условие для иммунной реакции. Примеры такого способа могут включать вызывание сосуществования MoAb по настоящему изобретению и биологического образца, содержащего кислотоустойчивые бациллы, предпочтительно, туберкулезные бациллы, при температурном состоянии, составляющем, как правило, 45°С или ниже, предпочтительно, приблизительно от 4 до 40°С и, более предпочтительно, приблизительно от 25 до 40°С; и оставление или инкубирование смеси в течение приблизительно 0,5-40 часов и, предпочтительно, приблизительно 1-20 часов. Кроме того, не существует также конкретного ограничения на растворитель, применяемый в реакции связывания, и его рН, постольку поскольку он не оказывает неблагоприятного эффекта на реакцию; и, в соответствии с известным до настоящего времени методом или подобно ему, буфер (например, цитратный буфер, фосфатный буфер, трис-солевой буфер, ацетатный буфер и т.д.) может использоваться таким образом, что рН становится равным приблизительно 5-9.The condition under which the MoAb of the present invention and the biological sample are brought into contact with each other is not particularly limited, since it is a condition under which the binding reaction between the MoAb of the present invention and the LAM of the acid resistant bacilli, preferably the LAM of the tuberculous bacillus, is not subject to compromise , and apply the general condition for the immune response. Examples of such a method may include causing the MoAb of the present invention to coexist with a biological sample containing acid resistant bacilli, preferably tuberculosis bacilli, at a temperature condition of typically 45 ° C or lower, preferably about 4 to 40 ° C, and more preferably about 25 to 40 ° C .; and leaving or incubating the mixture for about 0.5-40 hours, and preferably about 1-20 hours. In addition, there is also no particular restriction on the solvent used in the coupling reaction and its pH, insofar as it does not adversely affect the reaction; and, according to a method known to date, or the like, a buffer (e.g., citrate buffer, phosphate buffer, Tris-salt buffer, acetate buffer, etc.) can be used so that the pH becomes about 5-9 .
Стадия (I) может проводиться в состоянии, при котором MoAb по настоящему изобретению является иммобилизованным (находится в твердой фазе), (состояние, при котором MoAb связано с твердым носителем). Такая иммобилизация включает случаи, когда MoAb по настоящему изобретению являются связанными с твердым носителем как съемным образом, так и несъемным образом.Stage (I) can be carried out in a state in which the MoAb of the present invention is immobilized (in a solid phase), (a state in which MoAb is bound to a solid support). Such immobilization includes cases where the MoAb of the present invention are associated with a solid carrier both in a removable manner and in a non-removable manner.
В качестве твердого носителя, используемого для иммобилизации MoAb, могут использоваться разнообразные носители, обычно используемые в данной области, и их примеры могут включать широкий ряд изделий, таких как палочки, шарики, планшеты (включая микропланшеты), пробирки и т.п., образованные из разнообразных материалов, таких как стекло, целлюлозный порошок, Сефадекс, Сефароза, полистирол, фильтровальные бумаги, карбоксиметилцеллюлоза, нитроцеллюлоза, ионообменные смолы, декстран, пластиковые пленки, пластиковые трубки, найлон, стеклянные шарики, шелк, сополимеры полиамина-метилвинилового эфира-малеиновой кислоты, сополимеры аминокислот, сополимеры этилена-малеиновой кислоты.As the solid carrier used to immobilize MoAb, a variety of carriers commonly used in the art can be used, and examples thereof may include a wide variety of products, such as sticks, beads, tablets (including microplates), tubes, and the like, formed from a variety of materials, such as glass, cellulose powder, Sephadex, Sepharose, polystyrene, filter papers, carboxymethyl cellulose, nitrocellulose, ion exchange resins, dextran, plastic films, plastic tubes, nylon, glass sha iki, silk, polyamine-copolymer of methyl vinyl ether-maleic acids, amino acid copolymers, ethylene-maleic acid copolymers.
Метод иммобилизации не имеет конкретного ограничения, и может использоваться как физическая связь, так и химическая связь, в зависимости от разнообразных твердых носителей. Его примеры могут включать: химические реакции, такие как диазо-метод в качестве метода ковалентного связывания, пептидные методы (метод производного кислота-амид, метод карбоксилхлоридной смолы, метод карбодиимидной смолы, метод производного малеинового ангидрида, метод изоцианатного производного, метод полисахарида, активированного цианогенбромидом, метод карбонатного производного целлюлозы и метод с использованием реагента для конденсации), метод алкилирования, методы связывания носителя с использованием сшивающего реагента (например, с использованием глутаральдегида, гексаметиленизоцианата или т.п. в качестве сшивающего реагента) и метод связывания носителя с использованием реакции Уги; методы ионной связи с использованием носителя, такого как ионообменные смолы; и методы физической адсорбции с использованием, в качестве носителя, пористого стекла, такого как стеклянные шарики.The immobilization method has no particular limitation, and both physical bonding and chemical bonding can be used, depending on a variety of solid carriers. Examples thereof may include: chemical reactions, such as the diazo method as a covalent bonding method, peptide methods (acid-amide derivative method, carboxyl chloride resin method, carbodiimide resin method, maleic anhydride derivative method, isocyanate derivative method, cyanogen bromide activated polysaccharide method , the method of carbonate derivative of cellulose and a method using a reagent for condensation), an alkylation method, methods of binding a carrier using a crosslinking reagent (on Example using glutaraldehyde geksametilenizotsianata or the like as a crosslinking agent) and a carrier binding method using a Ugi reaction; ionic bonding techniques using a carrier such as ion exchange resins; and physical adsorption methods using, as a carrier, porous glass, such as glass beads.
На стадии (2), MoAb по настоящему изобретению может применяться в меченом состоянии с использованием любого метящего вещества. В настоящем описании, примеры вещества, несущего метку, могут включать: ферменты, такие как пероксидаза хрена (HRP) и щелочная фосфатаза; флуоресцентные вещества, такие как изоцианат флуоресцеина и родамин; радиоактивные вещества, такие как 32Р и 125I; красящие вещества (вещество окрашивания), такие как латекс, включающий природный каучуковый латекс и синтетический латекс, такой как полистироловый латекс, окрашенный металлическими коллоидами, такими как коллоид золота и белый коллоид, или пигментами из красного, синего или т.п.; и хемилюминесцентные вещества. Мечение MoAb этими метящими веществами может проводиться в соответствии со способом, известным до настоящего времени, в зависимости от разнообразных метящих веществ.In step (2), the MoAb of the present invention can be used in a labeled state using any labeling agent. As used herein, examples of a labeling substance may include: enzymes such as horseradish peroxidase (HRP) and alkaline phosphatase; fluorescent substances such as fluorescein isocyanate and rhodamine; radioactive substances such as 32 P and 125 I; colorants (colorant), such as latex, including natural rubber latex and synthetic latex, such as polystyrene latex, painted with metallic colloids, such as gold colloid and white colloid, or pigments of red, blue or the like; and chemiluminescent substances. Labeling MoAb with these labeling substances can be carried out in accordance with a method known to date, depending on a variety of labeling substances.
Стадия (2) представляет собой стадию обнаружения/анализа иммунного комплекса (вещества из связанных антигена-антитела), полученного посредством реакции связывания между MoAb по настоящему изобретению и ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы. В настоящем описании, обнаружение/анализ иммунного комплекса (вещества из связанных антигена-антитела) и условия для него не являются конкретно ограниченными, и могут применяться метод и условия, идентичные или подобные общепринятому методу иммунологического анализа. Конкретно, в зависимости от типа метящего вещества, применяемого для мечения MoAb, могут использоваться разнообразные методы, которые, как правило, применяются для иммунохимического анализа, такие как, например, радиоизотопный иммунологический анализ (метод РИА), метод ELISA, метод флуоресцентных антител, метод локального гемолиза в геле, споттинг-метод, метод агглютинации, метод Ухтерлони и т.д. (например, см. стр. 30-53 в “Hybridoma method and monoclonal antibody”, опубликованном R&D planning K.K., 5 Марта, 1982 г.). С точки зрения чувствительности и простоты, стадию (2) проводят в соответствии с методом ELISA и, более предпочтительно, сэндвич-методом.Stage (2) is the stage of detection / analysis of the immune complex (substances from the associated antigen-antibodies) obtained by the binding reaction between the MoAb of the present invention and LAM acid-resistant bacilli, preferably LAM tuberculosis bacilli. In the present description, the detection / analysis of the immune complex (substances from the associated antigen-antibodies) and its conditions are not specifically limited, and the method and conditions that are identical or similar to the conventional method of immunological analysis can be used. Specifically, depending on the type of labeling agent used to label MoAb, a variety of methods can be used, which are usually used for immunochemical analysis, such as, for example, radioisotope immunological analysis (RIA method), ELISA method, fluorescence antibody method, method local hemolysis in gel, spotting method, agglutination method, Uhterloni method, etc. (for example, see pages 30-53 in the Hybridoma method and monoclonal antibody published by R&D planning K.K., March 5, 1982). From the point of view of sensitivity and simplicity, stage (2) is carried out in accordance with the ELISA method and, more preferably, the sandwich method.
Например, когда используют твердофазный сэндвич-метод, мишень анализа, которая является кислотоустойчивой бациллой, предпочтительно, туберкулезной бациллой, может быть проанализирована в тестируемом образце, например, следующим образом.For example, when using the solid-phase sandwich method, an assay target that is an acid-resistant bacillus, preferably a tuberculosis bacillus, can be analyzed in a test sample, for example, as follows.
Сначала, биологический образец (например, мокрота, слюна или кровь и т.д.) добавляют в качестве тестируемого образца, содержащего мишень анализа, которой является кислотоустойчивая бацилла, предпочтительно, туберкулезная бацилла, к включенному в твердую фазу антителу, полученному иммобилизацией (включающей разъединяемую иммобилизацию) антитела, которое вызывает специфическую реакцию антиген-антитело с ЛАМ мишени анализа-кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы для обеспечения протекания реакции антиген-антитело. Далее, несвязанные вещества удаляют посредством, например, промывки; антитело, которое вызывает специфическую реакцию антиген-антитело с ЛАМ мишени анализа-кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы, добавляют для обеспечения протекания реакции с мишенью анализа-бактериями в веществе из связанных антигена-антитела, генерированном выше; и вещество из связанных антигена-антитела (комплекс “антитело-кислотоустойчивая бацилла-антитело” и, предпочтительно, комплекс “антитело-туберкулезная бацилла-антитело”), генерированное в реакции, обнаруживают (качественное измерение) или его количество измеряют (количественное измерение). Для данного способа, в настоящем изобретении, MoAb, предпочтительно, MoAb1 по настоящему изобретению, применяют в качестве антитела, которое вызывает специфическую реакцию антиген-антитело с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы.First, a biological sample (e.g., sputum, saliva or blood, etc.) is added as a test sample containing an assay target, which is an acid-resistant bacillus, preferably a tuberculous bacillus, to an antibody incorporated into the solid phase obtained by immobilization (including a separable immobilization) of an antibody that induces a specific antigen-antibody reaction with the LAM of the target of the analysis of acid-resistant bacilli, preferably a tuberculous bacillus, to ensure the progress of the antigen-antibody reaction lo. Further, unbound substances are removed by, for example, washing; an antibody that elicits a specific antigen-antibody reaction with the LAM of an acid-resistant bacillus analysis target, preferably a tuberculosis bacillus, is added to provide a reaction with the analysis target of the bacteria in the material from the associated antigen-antibody generated above; and a substance from associated antigen-antibody antibodies (the antibody-acid-resistant bacillus-antibody complex and, preferably, the antibody-tuberculosis bacillus-antibody complex) generated in the reaction is detected (qualitative measurement) or its amount is measured (quantitative measurement). For this method, in the present invention, MoAb, preferably MoAb1 of the present invention, is used as an antibody that elicits a specific antigen-antibody reaction with a LAM of an acid resistant bacillus, preferably a tuberculous bacillus.
Анализ вещества из связанных антигена-антитела (комплекса “антитело-кислотоустойчивая бацилла-антитело” и, предпочтительно, комплекса “антитело-туберкулезная бацилла-антитело”) может быть просто проведен посредством использования антитела (меченого антитела), которое метят любым из метящих веществ, описанных выше в качестве одного из антител (MoAb, предпочтительно, MoAb1 по настоящему изобретению) применяемого для проведения реакции антиген-антитело с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы. Для обеспечения более простого проведения анализа, например, возможно применять иммунохроматографию с использованием антитела, меченого окрашенными частицами латекса или т.п., таким как коллоид золота и т.д. Квалифицированный специалист в данной области будет хорошо осведомлен о выборе различных средств для этих методов анализа и их модификаций, и настоящее изобретение может быть реализовано с помощью одного из этих методов (см. “Clinical Test Method Manual” Kanehara Shuppan, 1995, и т.д.).Analysis of a substance from a coupled antigen-antibody antibody (antibody-acid-resistant bacillus-antibody complex and, preferably, antibody-tuberculosis bacillus-antibody complex) can simply be performed using an antibody (labeled antibody) that is labeled with any of the labeling substances, described above as one of the antibodies (MoAb, preferably MoAb1 of the present invention) used to conduct the antigen-antibody reaction with LAM acid-resistant bacilli, preferably tuberculosis bacilli. To provide an easier analysis, for example, it is possible to apply immunochromatography using an antibody labeled with colored latex particles or the like, such as a gold colloid, etc. A qualified specialist in this field will be well aware of the choice of various tools for these analysis methods and their modifications, and the present invention can be implemented using one of these methods (see “Clinical Test Method Manual” Kanehara Shuppan, 1995, etc. .).
Способ может быть проведен с использованием, например, устройства для обнаружения кислотоустойчивой бациллы, предпочтительно, устройства для обнаружения туберкулезной бациллы (далее в настоящем описании, также называемого “устройство для обнаружения”), имеющего следующую структуру. Устройство для обнаружения представляет собой устройство для определения существования кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы, в жидкости организма (включая мокроту, слюну и мочу) человека или животного, т.е. определения присутствия или отсутствия инфицирования кислотоустойчивыми бациллами, предпочтительно, туберкулезной бациллой; и включает поглощающий раствор фрагмент, образованный из материала, способного к переносу тестируемого образца посредством капиллярного действия.The method can be carried out using, for example, a device for detecting an acid-resistant bacillus, preferably a device for detecting a tuberculous bacillus (hereinafter, also referred to as a “detection device”), having the following structure. The detection device is a device for determining the existence of acid-resistant bacilli, preferably a tuberculosis bacillus, in a body fluid (including sputum, saliva and urine) of a person or animal, i.e. determining the presence or absence of infection with acid-resistant bacilli, preferably a tuberculosis bacillus; and includes a solution absorbing fragment formed from a material capable of transferring a test sample by capillary action.
Поглощающий раствор фрагмент включает:The absorbing solution fragment includes:
(i) часть для сбора образца для поглощения и сбора тестируемого образца;(i) a sample collection portion for absorption and collection of the test sample;
(ii) часть с мечеными антителами, являющуюся подложкой для меченого антитела против ЛАМ туберкулезной бациллы (MoAb по настоящему изобретению), которое специфически реагирует с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл; предпочтительно, туберкулезной бациллы, в тестируемом образце;(ii) a part with labeled antibodies, which is the substrate for a labeled antibody against LAM tuberculosis bacillus (MoAb of the present invention), which specifically reacts with LAM acid-resistant bacilli; preferably a tuberculosis bacillus in a test sample;
(iii) часть для определения, включающая часть отображения результата тестирования, описанную следующим образом;(iii) a determination part including a display part of a test result described as follows;
(а) часть отображения результата тестирования, на которой иммобилизовано немеченое антитело против ЛАМ туберкулезной бациллы (MoAb по настоящему изобретению), которое специфически реагирует с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл; предпочтительно, туберкулезной бациллы, и(a) a part of the display of the test result on which an unlabeled antibody against a LAM of a tuberculous bacillus (MoAb of the present invention) which specifically reacts with a LAM of acid-resistant bacilli is immobilized; preferably tuberculosis bacillus, and
(iv) часть для поглощения раствора для поглощения остающегося раствора тестируемого образца, которая прошла через часть для сбора образца, часть с мечеными антителами и часть для определения.(iv) a portion for absorbing a solution for absorbing the remaining solution of a test sample that has passed through a portion for collecting a sample, a portion with labeled antibodies and a portion for determination.
Следует отметить, что (iii) часть для определения включает дополнительно к (а) части отображения результата тестирования, часть для контроля отображения (b), расположенную отдельно от нее, описанную следующим образом:It should be noted that (iii) the determination part includes, in addition to (a) the display part of the test result, the part for monitoring the display (b), located separately from it, described as follows:
(b) часть для контроля отображения, на которой иммобилизовано немеченое антитело против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, немеченое антитело против ЛАМ туберкулезной бациллы (MoAb1 по настоящему изобретению), которое реагирует с меченым антителом против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, немеченым антителом против ЛАМ туберкулезной бациллы (MoAb1 по настоящему изобретению).(b) a display control portion on which an unlabeled anti-LAM antibody of acid-resistant bacilli LAM is immobilized (MoAb of the present invention), preferably an unlabeled anti-LAM antibody of tuberculosis bacillus (MoAb1 of the present invention) that reacts with a labeled anti-LAM acid-resistant bacillus antibody (MoAb according to the present invention), preferably, an unlabeled anti-LAM antibody of a tuberculosis bacillus (MoAb1 of the present invention).
С помощью устройства для обнаружения, возможно определить существование кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы, в тестируемом образце по присутствию или отсутствию окрашивания (а) части отображения результата тестирования.Using a detection device, it is possible to determine the existence of acid-resistant bacilli, preferably a tuberculosis bacillus, in the test sample by the presence or absence of staining (a) of the display part of the test result.
Устройство для обнаружения по настоящему изобретению включает поглощающий раствор фрагмент, образованный из материала, способного к переносу тестируемого образца посредством капиллярного действия или хроматографического действия (в настоящем изобретении их именуют как “капиллярное действие” в целом). Поглощающий раствор фрагмент может представлять собой фрагмент, который является пластинчатым (далее в настоящем описании называемый “пластинчатый фрагмент”), и пластинчатый фрагмент может быть образован из одиночного листа или может быть образован из множества слоев пластин, сложенных в стопку или соединенных друг с другом. Альтернативно, поглощающий раствор фрагмент может принимать разнообразные формы, способные к поглощению и передаче жидкости посредством капиллярного действия, такие как фрагмент в форме длинного и тонкого бруска или т.п. Следует отметить, что устройство для обнаружения по настоящему изобретению может дополнительно включать поддерживающий корпус для поддержки поглощающего раствор фрагмента.The detection device of the present invention includes an absorbing solution fragment formed from a material capable of transferring a test sample by capillary action or chromatographic action (in the present invention they are referred to as “capillary action” in general). The solution-absorbing fragment may be a fragment that is lamellar (hereinafter referred to as a “lamellar fragment”), and the lamellar fragment may be formed from a single sheet or may be formed from multiple layers of plates stacked or connected to each other. Alternatively, the solution-absorbing moiety may take a variety of forms capable of absorbing and transmitting liquid through capillary action, such as a moiety in the form of a long and thin bar or the like. It should be noted that the detection device of the present invention may further include a support housing for supporting the solution absorbing fragment.
Материал для поглощающего раствор фрагмента не является ограниченным конкретно, поскольку: материал имеет пористую структуру или капиллярную структуру, обеспечивающую проницаемость растворителя (воды, сыворотки, мочи и других биологических образцов), тестируемого компонента (кислотоустойчивых бацилл, таких как туберкулезная бацилла) и комплекса (например, комплекса [кислотоустойчивые бациллы, такие как туберкулезная бацилла] меченого антитела против ЛАМ туберкулезной бациллы (MoAb1 по настоящему изобретению), и туберкулезной бациллы, или комплекса [меченое антитело-туберкулезная бацилла-антитело] указанного комплекса и немеченого антитела против ЛАМ туберкулезной бациллы (MoAb1 по настоящему изобретению), включающего тестируемый компонент; и материал обеспечивает, когда тестируемый образец, содержащий тестируемый компонент наносят (собирают, капают, добавляют) на (1) часть для сбора образца, тестируемый образец переносится (распространяется) внутрь пористой структуры или капиллярной структуры даже тогда, когда тестируемый образец получает антитело против ЛАМ туберкулезной бациллы (MoAb1 по настоящему изобретению) и комплекс (меченое антитело-туберкулезная бацилла) во время переноса. Его примеры могут включать описанный выше твердый носитель. Из описанных выше, органический пористый корпус является предпочтительным. Следует отметить, что примеры органического пористого корпуса могут включать природные волокна, такие как целлюлоза, производные целлюлозы, такие как нитроцеллюлоза и полусинтетические волокна, такие как ацетат целлюлозы, волоконные агрегаты, образованные из синтетических волокон, таких как полиэтилен, полипропилен, найлон и сложный полиэфир, пористый полипропилен, пористый полистирол, пористый полиметилметакрилат, пористый найлон, пористый полисульфон, пористые фторсодержащие смолы и пористые синтетические смолы, такие как поливинилиденфторид, имеющие введенную в них гидрофильную группу. Природные волокна, такие как целлюлоза и производные целлюлозы, такие как нитроцеллюлоза и полусинтетические волокна, такие как ацетат целлюлозы, являются предпочтительными.The material for the solution-absorbing fragment is not specifically limited, because: the material has a porous structure or capillary structure that provides the permeability of the solvent (water, serum, urine and other biological samples), the test component (acid-resistant bacilli, such as tuberculosis bacillus), and the complex (e.g. a complex of [acid resistant bacilli, such as tuberculosis bacillus] of a labeled anti-LAM antibody of the tuberculosis bacillus (MoAb1 of the present invention), and a tuberculosis bacillus, and and the complex [labeled antibody-tuberculosis bacillus-antibody] of the complex and unlabeled anti-LAM antibody of the tuberculosis bacillus (MoAb1 of the present invention) comprising the test component; and the material provides when the test sample containing the test component is applied (collected, dripped, added) to (1) the sample collection portion, the test sample is transferred (spread) into the porous structure or capillary structure even when the test sample receives an antibody against LAM tuberculosis the bacillus heat (MoAb1 of the present invention) and the complex (labeled antibody-tuberculosis bacillus) during transfer. Examples thereof may include the solid carrier described above. Of the above, an organic porous body is preferred. It should be noted that examples of the organic porous body may include natural fibers such as cellulose, cellulose derivatives such as nitrocellulose and semi-synthetic fibers such as cellulose acetate, fiber aggregates formed from synthetic fibers such as polyethylene, polypropylene, nylon and polyester porous polypropylene, porous polystyrene, porous polymethylmethacrylate, porous nylon, porous polysulfone, porous fluorine resins and porous synthetic resins such as polyvinyl lidenfluoride having a hydrophilic group introduced therein. Natural fibers such as cellulose and cellulose derivatives such as nitrocellulose and semi-synthetic fibers such as cellulose acetate are preferred.
Не существует никакого конкретного ограничения по размеру поглощающего раствор фрагмента; и его предпочтительный размер имеет ширину (длину короткой стороны), равную приблизительно от 2 до 20 мм, предпочтительно, в интервале приблизительно от 4 до 10 мм, и длину (длину длинной стороны), равную от 20 до 200 мм, предпочтительно, в интервале от 30 до 150 мм.There is no particular limitation on the size of the absorbing fragment; and its preferred size has a width (short side length) of about 2 to 20 mm, preferably in the range of about 4 to 10 mm, and a length (long side length) of of 20 to 200 mm, preferably in the range from 30 to 150 mm.
Ниже, устройство для обнаружения в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения будет описано со ссылкой на чертежи.Below, a detection device in accordance with an embodiment of the present invention will be described with reference to the drawings.
(А) и (В) на фиг. 1 показывают одно воплощение устройства для обнаружения по настоящему изобретению. (А) и (В) на фиг. 1 представляют собой диаграммы, являющиеся видом сбоку устройства для обнаружения по настоящему изобретению. В устройстве для обнаружения, поглощающий раствор фрагмент включает часть для сбора образца (1) для сбора (добавления) тестируемого образца; часть с мечеными антителами (2), часть для определения (3), имеющая часть отображения результата тестирования (а) и часть для поглощения раствора (4) для поглощения остающегося раствора тестируемого образца, который прошел через часть для сбора образца, часть с мечеными антителами и часть для определения. (В) на фиг. 1 показывает устройство для обнаружения, включающее, на части для определения (3) часть для контроля отображения (b) в дополнение к части отображения результата тестирования (а).(A) and (B) in FIG. 1 show one embodiment of a detection device of the present invention. (A) and (B) in FIG. 1 are diagrams showing a side view of a detection apparatus of the present invention. In the detection device, the solution-absorbing fragment includes a sample collection part (1) for collecting (adding) a test sample; a part with labeled antibodies (2), a part for determining (3) having a part for displaying the test result (a) and a part for absorbing the solution (4) for absorbing the remaining solution of the test sample that passed through the part for collecting the sample, part with labeled antibodies and part for definition. (B) in FIG. 1 shows a detection apparatus including, on a determination part (3), a display monitoring part (b) in addition to a display part of the test result (a).
Несмотря на то что в примере, показанном на фиг. 1, поглощающий раствор фрагмент представляет собой пластинчатый фрагмент, образованный из множества фрагментов листов, пластинчатый фрагмент может быть образован из одиночного листа однородного материала или может быть образован как одиночный лист в целом, но из множества фрагментов листов из одинакового или различных материалов. Следует отметить, что цельный лист может быть образован из множества листов или может иметь часть, которая является частично образованной из множества листов.Although in the example shown in FIG. 1, a solution-absorbing fragment is a lamellar fragment formed from a plurality of sheet fragments, a lamellar fragment may be formed from a single sheet of uniform material or may be formed as a single sheet as a whole, but from a plurality of sheet fragments of the same or different materials. It should be noted that a solid sheet may be formed from multiple sheets or may have a part that is partially formed from multiple sheets.
В примере, показанном на фиг. 1, пластинчатый фрагмент приклеен на поддерживающий корпус (подложку) 10. Пластинчатый фрагмент включает, последовательно от одной концевой стороны к другой концевой стороне в направлении длинной стороны, лист 21, образующий часть для сбора образца (1), лист 22, образующий часть с меченым антителом (22), лист 23, образующий часть для определения (3), и лист 24, образующий часть для поглощения раствора (4). Кроме того, как показано на ФИГ. 2, возможно иметь конфигурацию, в которой концевая часть листа 21 перекрывает концевую часть листа 22, концевая часть листа 22 перекрывает концевую часть листа 23 и концевая часть листа 23 перекрывает концевую часть листа 24. Посредством такой конфигурации, движение раствора может быть сделано плавным.In the example shown in FIG. 1, the plate fragment is glued to the supporting body (substrate) 10. The plate fragment includes, sequentially from one end side to the other end side in the long side direction, a
Часть для сбора образца (1) представляет собой часть (часть для подачи тестируемого образца) для поглощения и сбора тестируемого образца, который является мишенью анализа. Примеры тестируемого образца могут включать биологический образец индивида, который является мишенью анализа настоящего изобретения.A sample collection part (1) is a part (a part for supplying a test sample) for absorbing and collecting a test sample that is a target of analysis. Examples of the test sample may include a biological sample of an individual that is the target of analysis of the present invention.
Как показано на фиг. 1 и фиг. 2, часть для сбора образца (1) может быть расположена в концевой части (ведущем конце) пластинчатого фрагмента.As shown in FIG. 1 and FIG. 2, the sample collection portion (1) may be located at the end portion (leading end) of the plate fragment.
Часть с меченым антителом (2) образуется в контакте с задним концом части для сбора образца (1), как описано выше (фиг. 1) или образована в состоянии частичного перекрывания с частью для сбора образца (1) (фиг. 2). Часть с меченым антителом (2) включает, разъединяемым образом, антитело, которое специфически реагирует и связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бактерий, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы, содержащимся в тестируемом образце. Конкретно, устройство для обнаружения по настоящему изобретению включает, на листе 22, образующем часть с меченым антителом (2) разъединяемым образом, антитело против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, антитело против ЛАМ туберкулезной бациллы (MoAb1 по настоящему изобретению), которое специфически связывается, посредством реакции антиген-антитело, с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы. В настоящем описании, MoAb по настоящему изобретению применяют в состоянии, в котором оно мечено любым из описанных выше несущих метку веществ, т.е. как меченое антитело против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченое MoAb по настоящему изобретению), а MoAb1 применяют как меченое антитело против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченое MoAb1 по настоящему изобретению).The labeled antibody part (2) is formed in contact with the rear end of the sample collection part (1) as described above (FIG. 1) or is formed in a state of partial overlap with the sample collection part (1) (FIG. 2). The labeled antibody portion (2) includes, in a separable manner, an antibody that specifically reacts and binds to LAM of acid-resistant bacteria, preferably the LAM of the tuberculous bacillus contained in the test sample. Specifically, the detection device of the present invention includes, on a
Среди материалов, принятых в пластинчатом фрагменте, часть с меченым антителом (2), предпочтительно, образуют из гидрофильного и водопоглощающего материала, который включает меченое антитело против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченое MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, меченое антитело против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченое MoAb1 по настоящему изобретению), разъединяемым образом, которое реагирует с тестируемым компонентом (кислотоустойчивыми бациллами, предпочтительно, туберкулезной бациллой) в тестируемом образце, который продвинулся из части для сбора образца (1) для образования комплекса антиген-антитело (комплекс ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и меченого антитела против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченого MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, комплекса ЛАМ туберкулезной бациллы и меченого антитела против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченого MoAb1 по настоящему изобретению). Материал имеет свойство, обеспечивающее движение комплекса в направлении, показанного стрелкой Р на фиг. 1, в ассоциации с движением тестируемого образца к части для определения (3).Among the materials adopted in the platelet fragment, the labeled antibody portion (2) is preferably formed from a hydrophilic and water-absorbing material that includes a labeled anti-LAM antibody of acid-resistant bacilli (the MoAb labeled of the present invention), preferably a labeled anti-LAM antibody of tuberculosis bacillus ( labeled MoAb1 of the present invention), in a separable manner that reacts with a test component (acid resistant bacilli, preferably a tuberculosis bacillus) in a test sample, cat the other has advanced from the sample collection portion (1) to form an antigen-antibody complex (a complex of LAM acid-resistant bacilli and a labeled antibody against LAM acid-resistant bacilli (labeled MoAb of the present invention), preferably a complex of LAM tuberculosis bacillus and labeled antibody against LAM tuberculosis bacillus ( labeled MoAb1 of the present invention.) The material has a property that allows the complex to move in the direction shown by arrow P in FIG. 1, in association with the movement of the test sample toward the portion to determine (3).
Следует отметить, что не существует ограничения по методу обеспечения в качестве подложки части с меченым антителом (2), разъединяемым образом, для меченого антитела против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченого MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, меченого антитела против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченого MoAb1 по настоящему изобретению); и его примеры включают метод импрегнирования части с меченым антителом (2) раствором, содержащим меченое MoAb по настоящему изобретению, предпочтительно, меченое MoAb1 по настоящему изобретению, и метод закрепления такого раствора на части с меченым антителом (2). Кроме того, с целью обеспечения для тестируемого компонента (кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы), содержащихся в тестируемом образце, полного связывания с частью с меченым антителом (2), предпочтительно, обеспечивать для части с меченым антителом (2) выполнение функции подложки для избыточного количества меченого MoAb по настоящему изобретению, предпочтительно, меченого MoAb1 по настоящему изобретению.It should be noted that there is no restriction on the method of providing the labeled antibody part (2) as a substrate in a separable manner for labeled anti-LAM antibodies of acid-resistant bacilli (labeled MoAb of the present invention), preferably labeled anti-LAM antibodies of tuberculosis bacillus (labeled MoAb1 according to the present invention); and examples thereof include a method for impregnating a portion with a labeled antibody (2) with a solution containing labeled MoAb of the present invention, preferably labeled MoAb1 of the present invention, and a method of fixing such a solution to a portion with labeled antibody (2). In addition, in order to ensure that the test component (acid-resistant bacilli, preferably tuberculosis bacilli) contained in the test sample is fully bound to the labeled antibody part (2), it is preferable to provide the labeled antibody part (2) with a support function for an excess of labeled MoAb of the present invention, preferably labeled MoAb1 of the present invention.
Часть для определения (3) представляет собой часть для дальнейшего переноса, к части для поглощения раствора (4), тестируемого образца, который продвинулся из части для сбора образца (1) через часть с меченым антителом (2). Часть для определения (3) включает, в ее области переноса, часть (часть отображения результата тестирования (а)) для захвата специфического компонента (комплекса ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и меченого антитела против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченого MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, комплекса ЛАМ туберкулезной бациллы и меченого антитела против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченого MoAb1 по настоящему изобретению)), содержащегося в тестируемом образце, который переносился, и отображения результата захвата. Поскольку возможно определить существование или отсутствие существования микобактерий, предпочтительно, туберкулезной бациллы, на основании результата, отображенного на части отображения результата тестирования (а) в тестируемом образце; область, включающую часть для отображения (а), называют “часть для определения (3)”.The part for determining (3) is a part for further transfer, to a part for absorbing the solution (4) of the test sample, which has advanced from the part for collecting the sample (1) through the part with labeled antibody (2). The part for determining (3) includes, in its transfer region, a part (part of displaying the test result (a)) for capturing a specific component (a complex of LAM acid-resistant bacilli and a labeled antibody against LAM of acid-resistant bacilli (labeled MoAb of the present invention), preferably a complex LAM of a tuberculosis bacillus and a labeled antibody against LAM of a tuberculosis bacillus (labeled MoAb1 of the present invention) contained in a test sample that was transferred and displaying the capture result. As it is possible to determine the existence or absence of the existence of mycobacteria, preferably a tuberculosis bacillus, based on the result displayed on the display part of the test result (a) in the test sample; an area including a part for displaying (a) is called a “part for determining (3)”.
В дополнение к части для отображения результата тестирования (а), устройство для обнаружения по настоящему изобретению может включать часть контроля отображения (b) в части определения (3). Следует отметить, что часть отображения результата тестирования (а) и часть контроля отображения (b) последовательно расположены с интервалом, установленным между ними.In addition to the display part of the test result (a), the detection device of the present invention may include a display control part (b) in the determination part (3). It should be noted that the display part of the test result (a) and the display control part (b) are sequentially arranged with the interval set between them.
Иммобилизованным на части отображения результата тестирования (а) в избыточном количестве является немеченое антитело (немеченое антитело против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл), которое специфически реагирует с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, немеченое антитело (немеченое антитело против ЛАМ туберкулезной бациллы), которое специфически реагирует с ЛАМ туберкулезной бациллы. Следовательно, кислотоустойчивые бациллы, которые связались с меченым MoAb по настоящему изобретению, предпочтительно, туберкулезная бацилла, которая связалась с меченым MoAb1 по настоящему изобретению, посредством реакции антиген-антитело на части с меченым антителом (2) захватываются на части отображения результата тестирования (а) в состоянии комплекса с меченым MoAb по настоящему изобретению, предпочтительно, меченым MoAb1 по настоящему изобретению; и окрашивание, отнесенное к метящему веществу проявляется с интенсивностью, которая зависит от захваченного количества.Immobilized on the part of the display of the test result (a) in excess is an unlabeled antibody (unlabeled antibody against LAM acid-resistant bacilli), which specifically reacts with LAM acid-resistant bacilli, preferably unlabeled antibody (unlabeled antibody against LAM of tuberculous bacillus), which specifically reacts with LAM tuberculous bacillus. Therefore, the acid-resistant bacilli that bind to the labeled MoAb of the present invention, preferably the tuberculosis bacillus that binds to the labeled MoAb1 of the present invention, are captured by the antigen-antibody reaction to the labeled antibody part (2) on the display part of the test result (a) in a complex state with labeled MoAb of the present invention, preferably labeled MoAb1 of the present invention; and the coloration attributed to the labeling agent appears with an intensity that depends on the amount captured.
Следует отметить, что антитело против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, образующее немеченое антитело против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, MoAb по настоящему изобретению, которое специфически связывается с ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (MoAb по настоящему изобретению) может применяться аналогично. Кроме того, так и антитело против ЛАМ туберкулезной бациллы, образующее немеченое антитело против ЛАМ туберкулезной бациллы, MoAb1 по настоящему изобретению, которое специфически связывается с ЛАМ туберкулезной бациллы (MoAb1 по настоящему изобретению) может применяться аналогично.It should be noted that the anti-LAM acid-resistant bacilli antibody forming an unlabeled anti-LAM acid-resistant bacillus antibody, MoAb of the present invention, which specifically binds to the LAM of acid-resistant bacilli (MoAb of the present invention) can be used similarly. In addition, the anti-LAM antibody of the tuberculosis bacillus forming the unlabeled anti-LAM antibody of the tuberculosis bacillus, MoAb1 of the present invention, which specifically binds to the LAM of the tuberculosis bacillus (MoAb1 of the present invention) can be used in a similar manner.
Иммобилизованным на части контроля отображения (b) является предварительно определенное количество немеченого антитела (второго антитела), которое реагирует с меченым антителом против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченым MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, меченым антителом против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченым MoAb1 по настоящему изобретению), включенным в часть с меченым антителом (2). Часть контроля отображения (b) может быть расположена отдельно от части отображения результата тестирования (а) в направлении движения (направление р на ФИГ. 1) тестируемого образца в порядке от части отображения результата тестирования (а) к части контроля отображения (b). Иммобилизованным на части контроля отображения (b) в избыточном количестве является избыточное количество немеченого антитела (второго антитела), которое реагирует с меченым антителом против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченым MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, антителом против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченым MoAb1 по настоящему изобретению), содержащемся в тестируемом образце, который продвинулся через предшествующий фрагмент листа.Immobilized on the display control part (b) is a predetermined amount of an unlabeled antibody (second antibody) that reacts with a labeled anti-LAM antibody of acid-resistant bacilli (MoAb labeled according to the present invention), preferably a labeled anti-LAM antibody of tuberculosis bacillus (labeled MoAb1 of the present invention ) included in the labeled antibody portion (2). The display control part (b) may be located separately from the display part of the test result (a) in the direction of movement (direction p in FIG. 1) of the test sample in order from the display part of the test result (a) to the display control part (b). Immobilized on the part of the imaging control (b) in excess is an excess of unlabeled antibody (second antibody) that reacts with a labeled anti-LAM antibody of acid-resistant bacilli (labeled MoAb of the present invention), preferably an anti-LAM antibody of tuberculosis bacillus (labeled MoAb1 of the present invention) contained in a test sample that has advanced through a preceding sheet fragment.
Следовательно, на части контроля отображения (b), меченое антитело против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченое MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, антитело против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченое MoAb1 по настоящему изобретению), которое отсоединилось от части с меченым антителом (2) и высвободилось в тестируемый образец, захватывается, и окрашивание, отнесенное к метящему веществу для меченого антитела против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченого MoAb по настоящему изобретению), антитела против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченого MoAb1 по настоящему изобретению), проявляется с интенсивностью, которая зависит от количества второго антитела, иммобилизованного на части контроля отображения (b).Therefore, in the imaging control part (b), a labeled anti-LAM antibody of acid-resistant bacilli (labeled MoAb of the present invention), preferably an anti-LAM antibody of a tuberculosis bacillus (labeled MoAb1 of the present invention), which is disconnected from the labeled antibody part (2) and released into the test sample, captured, and staining assigned to the labeling substance for labeled anti-LAM antibodies of acid-resistant bacilli (labeled MoAb of the present invention), anti-LAM antibodies of tuberculosis bacillus (sword MoAb1 of the present invention), appears with an intensity that depends on the amount of the second antibody immobilized on the part of the control display (b).
В настоящем описании, немеченое антитело (второе антитело) является достаточным, если оно является антителом, которое связывается с меченым антителом против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченым MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, антителом против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченым MoAb1 по настоящему изобретению). Несмотря на то что такое немеченое антитело (второе антитело) не является ограниченным, например, могут использоваться ЛАМ-связывающий белок кислотоустойчивых бацилл, анионные частицы и т.п.In the present description, an unlabeled antibody (second antibody) is sufficient if it is an antibody that binds to a labeled anti-LAM antibody of an acid resistant bacillus (labeled MoAb of the present invention), preferably an anti-LAM antibody of a tuberculosis bacillus (labeled MoAb1 of the present invention). Despite the fact that such an unlabeled antibody (second antibody) is not limited, for example, LAM-binding protein of acid-resistant bacilli, anionic particles, etc. can be used.
Анализ на туберкулезную бациллу с использованием устройства для определения по настоящему изобретению осуществляют, используя в качестве показателя, присутствие или отсутствие окрашивания на части отображения результата тестирования (а) части для определения (3). В этот момент, при необходимости, возможно использовать для определения присутствия или отсутствия окрашивания на части контроля отображения (b) части для определения (3). Даже тогда, когда окрашивание не является распознаваемым на части отображения результата тестирования (а), если окрашивание может быть распознано на части контроля отображения (b), анализ был проведен должным образом и результат анализа может быть определен как отрицательный. Однако, когда окрашивание не является распознаваемым на части контроля отображения (b), это указывает на то, что анализ не был проведен правильно, и результат части отображения результата тестирования (а) не может использоваться для определения как отрицательный.Analysis for tuberculosis bacillus using the device for determining the present invention is carried out using, as an indicator, the presence or absence of staining on the display part of the test result (a) of the part for determination (3). At this point, if necessary, it is possible to use for determining the presence or absence of staining on the display control part (b) of the part for determination (3). Even when the staining is not recognizable on the display part of the test result (a), if the staining can be recognized on the display control part (b), the analysis was carried out properly and the analysis result can be determined as negative. However, when the staining is not recognizable on the display control part (b), this indicates that the analysis was not carried out correctly, and the result of the display part of the test result (a) cannot be used to determine as negative.
Среди материалов, принятых для пластинчатого фрагмента, часть для определения (3), предпочтительно, образована из гидрофильного и водопоглощающего материала, который может продвигать тестируемый образец, содержащий разнообразные компоненты к части для поглощения раствора (4) посредством капиллярного действия, и имеет свойство устойчивой иммобилизации немеченого антитела против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченого MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, антитела против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченого MoAb1 по настоящему изобретению) на части отображения результата тестирования (а) или иммобилизации немеченого антитела (второго антитела) на части контроля отображения (b).Among the materials adopted for the lamellar fragment, the determination part (3) is preferably formed from a hydrophilic and water-absorbing material, which can promote a test sample containing various components to the solution absorption part (4) by capillary action, and has the property of stable immobilization unlabeled antibodies against LAM acid-resistant bacilli (labeled MoAb of the present invention), preferably antibodies against LAM of tuberculous bacilli (labeled MoAb1 of the present Bretenoux) on the test result display portion (a) or immobilization of unlabeled antibody (a second antibody) to control the display portion (b).
Часть для поглощения раствора (4) представляет собой часть для поглощения остающегося раствора тестируемого образца, который продвинулся в направлении стрелки Р от части для сбора образца (1) через часть с меченым антителом (2) и часть для определения (3) (часть отображения результата тестирования (а) или часть отображения результата тестирования (а) и часть контроля отображения (b)). Следовательно, среди материалов, принятых для пластинчатого фрагмента, часть для поглощения раствора (4), предпочтительно, образована из гидрофильного и абсорбентного материала и, более предпочтительно, материала, имеющего свойство не отталкивать поглощенный раствор, или эластичного материала. Конкретно, примеры такого материала могут включать нетканые материалы, такие как фильтровальные бумажные изделия и гидрофильные волокна, и ламинированные изделия из фильтровальной бумаги и нетканых материалов также могут применяться.The part for absorbing the solution (4) is a part for absorbing the remaining solution of the test sample, which advanced in the direction of the arrow P from the part for collecting the sample (1) through the part with labeled antibody (2) and the part for determining (3) (part of the result display testing (a) or part of the display of the test result (a) and part of the display control (b)). Therefore, among the materials adopted for the lamellar fragment, the part for absorbing the solution (4) is preferably formed from a hydrophilic and absorbent material and, more preferably, a material having the property not to repel the absorbed solution or elastic material. Specifically, examples of such a material may include non-woven materials such as filter paper products and hydrophilic fibers, and laminated products from filter paper and non-woven materials may also be used.
Несмотря на то что устройство для обнаружения по настоящему изобретению в-основном включает пластинчатый фрагмент, имеющий описанную выше конфигурацию, также является возможным включать подложку 10 в дополнение к пластинчатому фрагменту. Для подложки 10 не существует конкретного ограничения, поскольку она имеет конфигурацию и материал, способный к удерживанию пластинчатого фрагмента. Например, она может представлять собой пластинчатую подложку, ламинированную на задней поверхности (поверхности нижнего слоя) пластинчатого фрагмента, подлежащего применению, или подложка в форме корпуса для размещения пластинчатого фрагмента.Although the detection device of the present invention mainly includes a plate fragment having the configuration described above, it is also possible to include a
Примеры пластинчатой подложки могут включать листы, сделанные из разнообразных пластиков (пластиковых листов), твердых бумажных изделий, листов, изготовленных из металлов (включая сплав), таких как алюминий, многослойные бумажные изделия, полученные посредством склеивания вместе (приклеивания друг к другу) многослойных листов из, например, из гетерогенной бумаги или бумаги такого же качества, изделия, полученные посредством склеивания вместе (приклеивания друг к другу) пластикового листа и бумаги, изделия, полученные посредством склеивания вместе (приклеивания друг к другу) бумаги и металлического листа, изделия, полученные посредством склеивания вместе (приклеивания друг к другу) пластикового листа, бумаги и металлического листа, и бумаги, имеющие на них покрытие, такое как герметик и т.п. Предпочтительно подложка имеет функцию водонепроницаемости.Examples of the plate substrate may include sheets made of a variety of plastics (plastic sheets), hard paper products, sheets made of metals (including alloy), such as aluminum, multilayer paper products obtained by gluing together (gluing to each other) multilayer sheets from, for example, heterogeneous paper or paper of the same quality, products obtained by gluing together (gluing to each other) a plastic sheet and paper, products obtained by gluing together (gluing to each other) paper and metal sheet, products obtained by gluing together (gluing to each other) a plastic sheet, paper and a metal sheet, and paper coated thereon, such as sealant and the like. Preferably, the substrate has a waterproof function.
Подложка в форме корпуса, предпочтительно, представляет собой влагонепроницаемый материал, такой как поливинилхлорид, полипропилен, полиэтилен, полистирол, полимеры акриловой кислоты и т.п.; но изделие, сделанное из бумаги, может также применяться, если водоотталкивающая обработка осуществляется на его поверхности. На корпусе, предпочтительно, образовано по меньшей мере “окно для сбора раствора”, соответствующее части для сбора образца (1) пластинчатого фрагмента, помещенного в корпус, “окно для отображения определения”, соответствующее части отображения результата тестирования (а) части для определения (3), и “окно для контроля отображения”, соответствующее части контроля отображения (b). Следует отметить, что “окно для отображения определения” и “окно для контроля отображения” могут быть образованы индивидуально или могут быть образованы в виде одиночного окна.The body-shaped support is preferably a moisture-proof material such as polyvinyl chloride, polypropylene, polyethylene, polystyrene, acrylic acid polymers and the like; but a product made of paper can also be used if water-repellent treatment is carried out on its surface. Preferably, at least a “window for collecting the solution” is formed on the body, corresponding to the part for collecting a sample (1) of the plate fragment placed in the body, a “window for displaying the definition” corresponding to the display part of the test result (a) of the part for determining ( 3), and a “display control window” corresponding to the display control part (b). It should be noted that the “window for displaying the definition” and “the window for controlling the display” can be individually formed or can be formed as a single window.
Чтобы применять устройство для обнаружения по настоящему изобретению, включающее пластинчатый фрагмент, описанный выше, сначала, часть для сбора образца (1) импрегнируют тестируемым образцом. Посредством этого действия, тестируемый образец, поглощаемый частью для сбора образца (1), проходит через пластинчатый фрагмент посредством капиллярного действия, и сначала достигает части с меченым антителом (2), служащей подложкой, разъединяемым образом, для меченого антитела против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченого MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, антитела против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченого MoAb1 по настоящему изобретению). В настоящем описании, посредством реакции антиген-антитело, тестируемый компонент (туберкулезная бацилла) в тестируемом образце специфически связывается с меченым антителом против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченым MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, антителом против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченым MoAb1 по настоящему изобретению). Далее, тестируемый образец достигает части отображения результата тестирования (а) части для определения (3), будучи сопровождаемым “комплексом кислотоустойчивых бацилл и меченого антитела против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченого MoAb по настоящему изобретению)” (“комплексом туберкулезной бациллы и антитела против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченого MoAb1 по настоящему изобретению)”) и “избыточным меченым антителом против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченым MoAb по настоящему изобретению), которое не связывается с туберкулезной бациллой” (“избыточным меченым антителом против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченым MoAb1 по настоящему изобретению), которое не связывается с туберкулезной бациллой”). Поскольку немеченое антитело против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (MoAb по настоящему изобретению), которое специфически связывается с кислотоустойчивыми бациллами, предпочтительно, немеченое антитело против ЛАМ туберкулезной бациллы (MoAb1 по настоящему изобретению), которое специфически связывается с туберкулезной бациллой, устойчиво иммобилизуют на части отображения результата тестирования (а); “меченое антитело против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченое MoAb по настоящему изобретению), которое специфически связалось с кислотоустойчивыми бациллами”, предпочтительно, “меченое антитело против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченое MoAb1 по настоящему изобретению), которое специфически связалось с туберкулезной бациллой”, в тестируемом образце захватывается и накапливается. В результате, часть отображения результата тестирования (а) проявляет окрашивание с интенсивностью, которая зависит от количества кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезных бацилл, содержащихся в тестируемом образце, на основании метящего вещества в захваченном меченом антителе против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченом MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, в захваченном меченом антителе против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченом MoAb1 по настоящему изобретению). Вместе с этим, присутствие или отсутствие и количественная пропорция кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, туберкулезной бациллы, в тестируемом образце могут быть обнаружены.In order to use the detection device of the present invention, including the plate fragment described above, first, the sample collection portion (1) is impregnated with the test sample. Through this action, the test sample absorbed by the sample collection part (1) passes through the lamellar fragment by capillary action, and first reaches the part with the labeled antibody (2), serving as a separable substrate for the labeled anti-LAM antibody of acid-resistant bacilli (labeled MoAb of the present invention), preferably an anti-LAM antibody of a tuberculosis bacillus (labeled MoAb1 of the present invention). In the present description, through the antigen-antibody reaction, the test component (tuberculosis bacillus) in the test sample specifically binds to the labeled anti-LAM antibody of acid-resistant bacilli (labeled MoAb of the present invention), preferably the anti-LAM antibody of the tuberculosis bacillus (labeled MoAb1 of the present invention) . Further, the test sample reaches the display part of the test result (a) of the determination part (3), being accompanied by a “complex of acid-resistant bacilli and labeled anti-LAM antibodies of acid-resistant bacilli (labeled MoAb of the present invention)” (“complex of tuberculous bacilli and anti-LAM antibodies of tuberculosis bacillus (labeled MoAb1 of the present invention) ”) and“ excess labeled anti-LAM antibody of the tuberculous bacillus (labeled MoAb of the present invention), which does not bind to the tuberculous bacillus loya ”(“ excess labeled antibody against LAM of a tuberculous bacillus (labeled MoAb1 of the present invention), which does not bind to a tuberculous bacillus ”). Since an unlabeled anti-LAM antibody of acid-resistant bacilli (MoAb of the present invention) that specifically binds to acid-resistant bacilli, preferably, an unlabeled anti-LAM antibody of Lamb of the tuberculosis bacillus (MoAb1 of the present invention) that specifically binds to the tuberculosis bacillus is immobilized (but); “Labeled anti-LAM antibody of acid-resistant bacilli (labeled MoAb of the present invention) that specifically binds to acid-resistant bacilli”, preferably “labeled anti-LAM antibody of Lamb of the tuberculosis bacillus (MoAb1 labeled of the present invention) that specifically binds to the tuberculosis bacillus” the sample is captured and accumulated. As a result, part of the display of the test result (a) exhibits staining with an intensity that depends on the number of acid-resistant bacilli, preferably tuberculosis bacilli contained in the test sample, based on the labeling substance in the captured acid-resistant bacilli labeled anti-LAM antibody (labeled MoAb of the present invention ), preferably, in the captured labeled anti-LAM antibody of the tuberculosis bacillus (labeled MoAb1 of the present invention). At the same time, the presence or absence and quantitative proportion of acid-resistant bacilli, preferably a tuberculosis bacillus, can be detected in the test sample.
Далее, тестируемый образец достигает части контроля отображения (b) части определения (3), будучи сопровождаемый “избыточным меченым антителом против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченым MoAb по настоящему изобретению), которое не связалось с кислотоустойчивыми бациллами”, предпочтительно, “избыточным меченым антителом против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченым MoAb1 по настоящему изобретению), которое не связалось с туберкулезной бациллой”. Поскольку второе антитело (немеченое антитело), которое связывается с меченым антителом против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (меченым MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, второе антитело (немеченое антитело), которое связывается с меченым антителом против ЛАМ туберкулезной бациллы (меченым MoAb1 по настоящему изобретению), является устойчиво иммобилизованным на части контроля отображения (b) в определенном количестве; меченое антитело против кислотоустойчивых бацилл (меченое MoAb по настоящему изобретению), предпочтительно, меченое антитело против туберкулезной бациллы (меченое MoAb1 по настоящему изобретению), которое избыточно включено в тестируемый образец захватывается и накапливается. В результате, часть контроля отображения (b) проявляет окрашивание с интенсивностью, которая зависит от количества второго антитела (или количества меченого антитела, которое связалось со вторым антителом), иммобилизованном на часть контроля отображения (b).Further, the test sample reaches the display control part (b) of the definition part (3), being accompanied by an “excess labeled anti-LAM acid-resistant bacilli antibody (MoAb-labeled according to the present invention) that did not bind to acid-resistant bacilli”, preferably an “excess labeled anti-Bacillus” LAM of a tuberculous bacillus (labeled MoAb1 of the present invention) that has not been associated with a tuberculous bacillus. " Since the second antibody (unlabeled antibody) that binds to the labeled anti-LAM antibody of acid-resistant bacilli (labeled MoAb of the present invention), preferably the second antibody (unlabeled antibody) that binds to the labeled anti-LAM antibody of tuberculosis bacillus (labeled MoAb1 of the present invention) is stably immobilized on the part of the display control (b) in a certain amount; a labeled anti-acid-resistant bacillus antibody (labeled MoAb of the present invention), preferably a labeled anti-tuberculosis bacillus antibody (labeled MoAb of the present invention) that is excessively incorporated into the test sample is captured and accumulated. As a result, the imaging control part (b) exhibits staining with an intensity that depends on the amount of the second antibody (or the amount of labeled antibody that binds to the second antibody) immobilized to the imaging control part (b).
Отличные от тех, что описаны выше, могут быть сделаны разнообразные модификации устройства для обнаружения по настоящему изобретению без отступления от объема притязаний настоящего изобретения. К устройству для обнаружения по настоящему изобретению возможно прикрепить спецификационный документ, описывающий, как использовать устройство для обнаружения и способ определения, и, таким образом, настоящее изобретение предоставляет набор для определения, который представляет собой комплект, включающий спецификационный документ и устройство для обнаружения.Various from those described above, various modifications of the detection apparatus of the present invention can be made without departing from the scope of the claims of the present invention. It is possible to attach a specification document to the detection device of the present invention describing how to use the detection device and the detection method, and thus, the present invention provides a determination kit, which is a kit including the specification document and the detection device.
(IV) Средство для диагностики туберкулеза или набор для диагностики(IV) Tuberculosis Diagnostic Tool or Diagnostic Kit
Способ обнаружения кислотоустойчивой бациллы и устройство для обнаружения кислотоустойчивой бациллы, описанные выше, применяют для обнаружения существования кислотоустойчивых бацилл в биологическом образце индивида. В частности, когда MoAb1 по настоящему изобретению применяют в качестве моноклонального антитела, туберкулезная бацилла может являться иллюстрацией предпочтительного примера кислотоустойчивых бацилл. Таким образом, способ обнаружения кислотоустойчивой бациллы и устройство для обнаружения кислотоустойчивой бациллы, описанные выше, применяют для диагностики присутствия или отсутствия инфицирования кислотоустойчивыми бациллами, в особенности, туберкулезной бациллой.The method for detecting an acid-resistant bacillus and the device for detecting an acid-resistant bacillus described above are used to detect the existence of acid-resistant bacilli in a biological sample of an individual. In particular, when the MoAb1 of the present invention is used as a monoclonal antibody, the tuberculous bacillus may illustrate a preferred example of acid-resistant bacilli. Thus, the method for detecting an acid-resistant bacillus and the device for detecting an acid-resistant bacillus described above are used to diagnose the presence or absence of infection with an acid-resistant bacillus, especially a tuberculosis bacillus.
Следовательно, MoAb, предпочтительно, MoAb1 по настоящему изобретению, описанное выше, является применимым как средство для диагностики туберкулеза, и настоящее изобретение относится к средству для диагностики туберкулеза, содержащему MoAb, предпочтительно, MoAb1 по настоящему изобретению. MoAb по настоящему изобретению может быть разъединяемым образом или неразъединяемым образом иммобилизовано на любом твердом носителе или может быть мечено любым метящим веществом.Therefore, MoAb, preferably MoAb1 of the present invention described above is applicable as a tool for diagnosing tuberculosis, and the present invention relates to a tool for diagnosing tuberculosis containing MoAb, preferably MoAb1 of the present invention. The MoAb of the present invention may be releasably or non-releasably immobilized on any solid support or may be labeled with any labeling agent.
Кроме того, когда способ обнаружения кислотоустойчивых бацилл, в частности, туберкулезной бациллы, по настоящему изобретению подлежит осуществлению, способ может быть проведен просто посредством применения набора для диагностики туберкулеза, содержащего в качестве реагента для обнаружения туберкулезной бациллы, MoAb, предпочтительно, MoAb1 по настоящему изобретению. Следовательно, настоящее изобретение относится к набору для диагностики туберкулеза для осуществления способа обнаружения туберкулеза. Набор для диагностики туберкулеза представляет собой набор реагентов для анализа обнаружения туберкулезной бациллы, существующей в тестируемом образце, с использованием реакции антиген-антитело. Является достаточным, когда набор содержит MoAb, предпочтительно, MoAb1 по настоящему изобретению; и набор может включать устройство для обнаружения туберкулезной бациллы, описанное выше, второе антитело, которое реагирует с MoAb, предпочтительно, MoAb1 по настоящему изобретению; и реагент для обнаружения антитела и т.п. Кроме того, для удобства проведения анализа, набор для диагностики может дополнительно включать подходящий реакционный раствор, раствор для разбавления, промывочный раствор, раствор для остановки реакции, реагент для измерения меченой активности и т.п.Furthermore, when the method for detecting acid-resistant bacilli, in particular the tuberculosis bacillus, of the present invention is to be carried out, the method can be carried out simply by using a tuberculosis diagnostic kit containing, as a reagent for detecting the tuberculosis bacillus, MoAb, preferably MoAb1 of the present invention . Therefore, the present invention relates to a kit for diagnosing tuberculosis for implementing a method for detecting tuberculosis. A tuberculosis diagnostic kit is a reagent kit for analyzing the detection of a tuberculous bacillus existing in a test sample using an antigen-antibody reaction. Sufficient when the kit contains MoAb, preferably MoAb1 of the present invention; and the kit may include a tuberculosis bacillus detection device described above, a second antibody that reacts with MoAb, preferably MoAb1 of the present invention; and a reagent for detecting antibodies and the like. In addition, for ease of analysis, the diagnostic kit may further include a suitable reaction solution, a dilution solution, a washing solution, a solution to stop the reaction, a reagent for measuring labeled activity, and the like.
(V) Аналитический тест на ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (конкретно, ЛАМ туберкулезной бациллы) и средство для обнаружения или набор для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (конкретно, ЛАМ туберкулезной бациллы)(V) An analytical test for LAM of acid-resistant bacilli (specifically, LAM of tuberculosis bacillus) and a means for detection or kit for detection of LAM of acid-resistant bacilli (specifically, LAM of tuberculosis bacillus)
MoAb по настоящему изобретению представляет собой антитело, которое специфически распознает липоарабиноманнан (ЛАМ) кислотоустойчивых бацилл и связывается с ним. Следовательно, способ обнаружения кислотоустойчивой бациллы по настоящему изобретению, описанный выше, может также применяться для анализа ЛАМ кислотоустойчивых бацилл.The MoAb of the present invention is an antibody that specifically recognizes and binds to lipoarabinomannan (LAM) acid resistant bacilli. Therefore, the method for detecting an acid resistant bacillus of the present invention described above can also be used to analyze LAM acid resistant bacilli.
Конкретно, аналитический тест на ЛАМ кислотоустойчивых бацилл по настоящему изобретению может проводиться посредством следующих стадий:Specifically, the LAM test of acid-resistant bacilli of the present invention can be carried out by the following steps:
(1) стадии приведения MoAb по настоящему изобретению в контакт с тестируемым образцом, который может содержать кислотоустойчивые бациллы;(1) the steps of bringing the MoAb of the present invention into contact with a test sample, which may contain acid resistant bacilli;
(2) стадии аналитического теста на ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, которые существуют в тестируемом образце, с использованием, в качестве показателя, реакции связывания между MoAb по настоящему изобретению и ЛАМ кислотоустойчивых бацилл.(2) the steps of an analytical test for LAM of acid-resistant bacilli that exist in the test sample using, as an indicator, the binding reaction between the MoAb of the present invention and LAM of acid-resistant bacilli.
Эти стадии (1) и (2) являются стадиями, соответствующими соответственно стадиям (1) и (2), приведенным в “(III) Способ обнаружения кислотоустойчивых бацилл, конкретно туберкулезной бациллы и кислотоустойчивой бациллы и устройство для определения кислотоустойчивой бациллы (в частности, туберкулезной бациллы) используемое в нем”, описанном выше, и описание, предоставленное выше в (III), может также использоваться в настоящем описании в качестве ссылки. В дополнение, аналитический тест на ЛАМ кислотоустойчивых бацилл может осуществляться аналогично с использованием устройства для обнаружения кислотоустойчивых бацилл, приведенном в (III), описанном выше (следует отметить, что в этом случае, возможно перефразировать его как “устройство для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл”).These steps (1) and (2) are the steps corresponding to steps (1) and (2) respectively given in “(III) A method for detecting acid-resistant bacilli, specifically a tuberculosis bacillus and acid-resistant bacillus, and a device for determining an acid-resistant bacillus (in particular, tuberculosis bacillus) used in it ”described above, and the description provided above in (III) can also be used in the present description by reference. In addition, an analytical test for LAM of acid-resistant bacilli can be carried out similarly using the device for detecting acid-resistant bacilli described in (III) described above (it should be noted that in this case it is possible to rephrase it as a “device for detecting LAM of acid-resistant bacilli”) .
Следует отметить, что в отношении MoAb по настоящему изобретению, поскольку MoAb1 представляет собой антитело, которое специфически распознает липоарабиноманнан (ЛАМ) туберкулезной бациллы и связывается с ним, способ обнаружения кислотоустойчивой бациллы по настоящему изобретению, описанный выше, может также применяться в качестве способа обнаружения туберкулезной бациллы для аналитического теста на ЛАМ туберкулезной бациллы.It should be noted that with respect to the MoAb of the present invention, since MoAb1 is an antibody that specifically recognizes and binds to the lipoarabinomannan (LAM) of the tuberculous bacillus, the method for detecting the acid-resistant bacillus of the present invention described above can also be used as a method for detecting tuberculous bacilli for an analytical test for LAM tuberculosis bacilli.
В настоящем описании, аналитический тест на ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы, включает качественное измерение для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы, и количественное измерение для измерения количества ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы. Примеры количественного измерения могут включать, но не ограничены лишь приведенными, метод создания заранее стандартной кривой по результатам реакции между MoAb по настоящему изобретению и известным количеством ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы, и вычисления неидентифицированного количества ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, предпочтительно, ЛАМ туберкулезной бациллы, содержащегося в тестируемом образце по стандартной кривой.In the present description, an analytical test for LAM of acid-resistant bacilli, preferably LAM of tuberculosis bacillus, includes a qualitative measurement to detect LAM of acid-resistant bacilli, preferably LAM of tuberculosis bacillus, and a quantitative measurement to measure the number of LAM of acid-resistant bacilli, preferably LAM of tuberculosis bacillus. Examples of quantitative measurements may include, but are not limited to, the method of creating a pre-standard curve based on the reaction between the MoAb of the present invention and a known number of LAM acid-resistant bacilli, preferably LAM of acid-resistant bacilli, and calculating an unidentified amount of LAM acid-resistant bacilli, preferably, LAM of tuberculosis bacilli contained in the test sample according to a standard curve.
При таком анализе, MoAb по настоящему изобретению является применимым в качестве реагента для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, и настоящее изобретение относится к средству для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, содержащему MoAb по настоящему изобретению в качестве реагента для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл. Конкретно, MoAb1 по настоящему изобретению является применимым в качестве реагента для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, и настоящее изобретение относится к средству для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, содержащему MoAb1 по настоящему изобретению в качестве реагента для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы. Эти MoAb по настоящему изобретению могут быть разъединяемым образом или неразъединяемым образом иммобилизованы на любом твердом носителе или могут быть мечены любым метящим веществом.In such an analysis, the MoAb of the present invention is useful as a reagent for detecting LAM of acid-resistant bacilli, and the present invention relates to a tool for detecting LAM of acid-resistant bacilli containing MoAb of the present invention as a reagent for detecting LAM of acid-resistant bacilli. Specifically, the MoAb1 of the present invention is useful as a reagent for detecting a LAM of a tuberculosis bacillus, and the present invention relates to an agent for detecting a LAM of a tuberculosis bacillus containing MoAb1 of the present invention as a reagent for detecting a LAM of a tuberculous bacillus. These MoAb of the present invention can be separably or non separably immobilized on any solid carrier or can be labeled with any labeling substance.
Когда аналитический тест на ЛАМ кислотоустойчивых бацилл по настоящему изобретению подлежит осуществлению, анализ может быть проведен просто посредством применения набора для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, включающего MoAb по настоящему изобретению в качестве реагента для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл. Кроме того, когда аналитический тест на ЛАМ туберкулезной бациллы по настоящему изобретению подлежит осуществлению, анализ может быть проведен просто посредством применения набора для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, включающего среди MoAb по настоящему изобретению, MoAb1, в качестве реагента для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы.When an analytical test for LAM of acid-resistant bacilli of the present invention is to be carried out, the analysis can be carried out simply by using a kit for the detection of LAM of acid-resistant bacilli, including MoAb of the present invention as a reagent for the detection of LAM of acid-resistant bacilli. Furthermore, when the LAM test of the tuberculosis bacillus of the present invention is to be carried out, the analysis can be carried out simply by using the LAM detection kit of the tuberculosis bacillus, including MoAb1 among the MoAb of the present invention, as a reagent for detecting the LAM of the tuberculosis bacillus.
Следовательно, настоящее изобретение относится к набору для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл для проведения анализа на ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, в частности, набору для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы для проведения анализа на ЛАМ туберкулезной бациллы. Набор для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл для проведения анализа на ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, в частности, набор для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, представляет собой набор реагентов для анализа на обнаружение ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, в частности, туберкулезной бациллы, существующих в тестируемом образце, с использованием реакции антиген-антитело. Набор для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл включает MoAb по настоящему изобретению. Является достаточным, когда набор для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы включает MoAb1 по настоящему изобретению, и набор может включать устройство для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (или устройство для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы), второе антитело, которое реагирует с MoAb (или MoAb1) по настоящему изобретению, реагент для обнаружения антитела и т.п. Кроме того, для удобства проведения анализа, набор для диагностики может дополнительно содержать подходящий раствор для реакции, раствор для разбавления, промывочный раствор, раствор для остановки реакции, реагент для измерения меченой активности и т.п.Therefore, the present invention relates to a kit for the detection of LAM of acid-resistant bacilli for analysis of LAM of acid-resistant bacilli, in particular, a kit for detection of LAM of tuberculosis bacillus for analysis of LAM of tuberculosis bacillus. A kit for detecting LAM of acid-resistant bacilli for analysis on LAM of acid-resistant bacilli, in particular, a kit for detecting LAM of acid-resistant bacilli, is a set of reagents for analysis for detecting LAM of acid-resistant bacilli, in particular, tuberculosis bacillus existing in the test sample, using the reaction antigen antibody. The acid-resistant bacillus LAM detection kit includes the MoAb of the present invention. It is sufficient when the LAM detection kit for a tuberculosis bacillus LAM includes MoAb1 of the present invention, and the kit may include an acid resistant bacillus detection LAM (or a detection device for LAM tuberculosis bacillus), a second antibody that reacts with MoAb (or MoAb1) of the present invention , reagent for detecting antibodies and the like. In addition, for the convenience of analysis, the diagnostic kit may further comprise a suitable reaction solution, a dilution solution, a washing solution, a solution to stop the reaction, a reagent for measuring labeled activity, and the like.
(VI) Анализ стерилизованного образца(VI) Analysis of the sterilized sample
Способ обнаружения кислотоустойчивых бацилл или туберкулезной бациллы по настоящему изобретению, описанный выше в (III) может применяться в качестве аналитического теста, не представляющего биологическую опасность. Конкретно, аналитический тест, не представляющий биологическую опасность, по настоящему изобретению может быть проведен посредством следующих стадий.The method for detecting acid-resistant bacilli or tuberculosis bacillus of the present invention described above in (III) can be used as an analytical test that does not pose a biological hazard. Specifically, a non-biohazard assay test of the present invention can be carried out by the following steps.
(1) стерилизация тестируемого образца кипячением, предпочтительно, стерилизации паром высокого давления;(1) sterilization of the test sample by boiling, preferably sterilization with high pressure steam;
(2) стадия приведения MoAb, предпочтительно, MoAb1 по настоящему изобретению в контакт со стерилизованным тестируемым образцом; и(2) the step of bringing the MoAb, preferably MoAb1 of the present invention into contact with a sterilized test sample; and
(3) стадия проведения анализа на ЛАМ туберкулезной бациллы в тестируемом образце с использованием в качестве показателя реакции связывания между MoAb, предпочтительно, MoAb1 по настоящему изобретению и ЛАМ туберкулезной бациллы; и(3) the step of conducting an LAM analysis of the tuberculosis bacillus in the test sample using, as an indicator of the binding reaction between the MoAb, preferably MoAb1 of the present invention, and the LAM of the tuberculosis bacillus; and
(4) стадия определения того, что тестируемый образец инфицирован туберкулезной бациллой, когда ЛАМ туберкулезной бациллы был обнаружен в тестируемом образце.(4) a step of determining that a test sample is infected with a tuberculosis bacillus when a LAM of a tuberculosis bacillus has been detected in the test sample.
(VII) Способ определения лечебного эффекта противотуберкулезного лекарственного средства в отношении туберкулеза(VII) a Method for determining the therapeutic effect of an anti-tuberculosis drug against tuberculosis
Способ обнаружения кислотоустойчивых бацилл, в частности, туберкулезной бациллы по настоящему изобретению, описанный выше в (III) может применяться для определения лечебного эффекта противотуберкулезного лекарственного средства в отношении туберкулеза.The method for detecting acid-resistant bacilli, in particular the tuberculosis bacillus of the present invention described above in (III) can be used to determine the therapeutic effect of the anti-tuberculosis drug against tuberculosis.
Конкретно, способ определения лечебного эффекта противотуберкулезного лекарственного средства в отношении туберкулеза по настоящему изобретению может осуществляться посредством следующих стадий.Specifically, a method for determining the therapeutic effect of an anti-tuberculosis drug against tuberculosis of the present invention can be carried out by the following steps.
(1) стадия приведения MoAb, предпочтительно, MoAb1 по настоящему изобретению в контакт с обоими тестируемыми образцами до и после введения противотуберкулезного лекарственного средства;(1) the step of bringing the MoAb, preferably MoAb1 of the present invention, into contact with both test samples before and after administration of the anti-TB drug;
(2) стадия проведения анализа на ЛАМ туберкулезной бациллы в тестируемых образцах до и после введения противотуберкулезного лекарственного средства с использованием, в качестве показателя, реакции связывания между MoAb, предпочтительно, MoAb1 по настоящему изобретению, и ЛАМ туберкулезной бациллы; и(2) the step of conducting an LAM analysis of the tuberculosis bacillus in the test samples before and after administration of the anti-TB drug using, as an indicator, the binding reaction between the MoAb, preferably the MoAb1 of the present invention, and the LAM of the tuberculosis bacillus; and
(3) стадия определения того, что противотуберкулезное лекарственное средство имеет лечебный эффект в отношении туберкулеза, когда ЛАМ туберкулезной бациллы обнаруживается в тестируемом образце перед введением противотуберкулезного лекарственного средства и, когда ЛАМ туберкулезной бациллы не обнаруживается в тестируемом образце после введения противотуберкулезного лекарственного средства.(3) the step of determining that the anti-tuberculosis drug has a therapeutic effect against tuberculosis when the LAM of the tuberculosis bacillus is detected in the test sample before administration of the anti-tuberculosis drug and when the LAM of the tuberculosis bacillus is not detected in the test sample after administration of the anti-tuberculosis drug.
Эти стадии (1) и (2) представляют собой стадии, соответствующие соответственно стадиям (1) и (2), приведенным в “(III) Способ обнаружения микобактерий, конкретно туберкулезной бациллы”, описанном выше, и способ, описанный в (III) выше, может быть осуществлен аналогично, за исключением того, что тестируемый образец представляет собой тестируемый образец пациента с туберкулезом, который заразился туберкулезом (инфицирован туберкулезной бациллой), и того, что тестируемые образцы, подвергнутые воздействию способа, представляют собой тестируемый образец перед введением противотуберкулезного лекарственного средства (перед лечением туберкулеза) и тестируемый образец после введения противотуберкулезного лекарственного средства (после лечения туберкулеза). Дополнительно, анализ на ЛАМ туберкулезной бациллы, проведенный на (2), может быть аналогично проведен с использованием устройства для обнаружения туберкулезной бациллы, приведенного в “(III) Способ обнаружения кислотоустойчивых бацилл, в частности, туберкулезной бациллы”, описанном выше (следует отметить, что в данном случае, воможно перефразировать его как “устройство для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы”).These steps (1) and (2) are the steps corresponding to steps (1) and (2), respectively, given in “(III) The method for detecting mycobacteria, specifically tuberculosis bacilli” described above, and the method described in (III) above can be carried out similarly, except that the test sample is a test sample of a patient with tuberculosis who has contracted tuberculosis (infected with a tuberculosis bacillus) and that the test samples exposed to the method are a test sample TB sample was before administration of the drug (pre-treatment of tuberculosis) and after administration of the test sample antitubercular drug (after treatment of tuberculosis). Additionally, the LAM analysis of the tuberculous bacillus carried out on (2) can be similarly carried out using the device for detecting the tuberculous bacillus described in “(III) The method for detecting acid-resistant bacilli, in particular, the tuberculous bacillus” described above (it should be noted that in this case, it is possible to rephrase it as “a device for the detection of LAM tuberculosis bacillus”).
В качестве противотуберкулезного лекарственного средства, описанного в настоящем описании, могут применяться лекарственные средства, которые известны в данной области до настоящего времени, такие как рифампицин, изониазид (гидразид изоникотиновой кислоты), пиразинамид, стрептомицин и его соль, и этамбутол и его соль. Однако, противотуберкулезное лекарственное средство не ограничено лишь ими, и включает разрешенные или еще не разрешенные к применению лекарственные средства, которые проявляют бактерицидное действие (противотуберкулезную активность) против туберкулезных бацилл.As the anti-tuberculosis drug described herein, drugs that are known in the art to date, such as rifampicin, isoniazid (isonicotinic acid hydrazide), pyrazinamide, streptomycin and its salt, and ethambutol and its salt can be used. However, the anti-TB drug is not limited only to them, and includes approved or not yet approved for use drugs that exhibit bactericidal action (anti-TB activity) against tuberculosis bacilli.
В результате стадии (2), описанной выше, когда ЛАМ туберкулезной бациллы, другими словами туберкулезная бацилла, обнаруживается в тестируемом образце перед введением противотуберкулезного лекарственного средства, и, когда ЛАМ туберкулезной бациллы (туберкулезная бацилла) не обнаруживается в тестируемом образце после введения противотуберкулезного лекарственного средства; может быть определена эффективность противотуберкулезного лекарственного средства, поскольку противотуберкулезное лекарственное средство имело лечебный эффект в отношении туберкулеза на индивиде-пациенте с туберкулезом.As a result of step (2) described above, when a LAM of a tuberculosis bacillus, in other words, a tuberculosis bacillus, is detected in the test sample before administration of the anti-TB drug, and when the LAM of the tuberculosis bacillus (tuberculosis bacillus) is not detected in the test sample after the administration of the anti-TB drug ; the effectiveness of the anti-tuberculosis drug can be determined, since the anti-tuberculosis drug had a therapeutic effect on tuberculosis in the individual patient with tuberculosis.
С другой стороны, в результате стадии (2), описанной выше, когда ЛАМ туберкулезной бациллы, другими словами туберкулезная бацилла, обнаруживается в тестируемом образце перед введением противотуберкулезного лекарственного средства, и, когда ЛАМ туберкулезной бациллы (туберкулезная бацилла) также обнаруживается в тестируемом образце после введения противотуберкулезного лекарственного средства, количество туберкулезной бациллы, обнаруженной перед введением и после введения противотуберкулезного лекарственного средства может сравниваться. В настоящем описании, когда наблюдают снижение количества туберкулезной бациллы перед введением и после введения противотуберкулезного лекарственного средства, предполагают возможный лечебный эффект в отношении туберкулеза от противотуберкулезного лекарственного средства на индивида-пациента с туберкулезом, и терапевтический выбор к продолжению применения противотуберкулезного лекарственного средства может быть предоставлен для медицинского работника. С другой стороны, когда не наблюдают снижения количества туберкулезной бациллы перед введением и после введения противотуберкулезного лекарственного средства, это указывает на то, что противотуберкулезное лекарственное средство не обладает лечебным эффектом в отношении туберкулеза на индивида-пациента с туберкулезом. Следовательно, терапевтический выбор остановки применения противотуберкулезного лекарственного средства и переключения на еще одну другую терапию может быть предоставлен для медицинского работника.On the other hand, as a result of step (2) described above, when a LAM of a tuberculosis bacillus, in other words a tuberculosis bacillus, is detected in the test sample before administration of the anti-TB drug, and when the LAM of the tuberculosis bacillus (tuberculosis bacillus) is also found in the test sample after administration of the anti-TB drug, the amount of tuberculosis bacillus detected before and after the administration of the anti-TB drug can compare to be. In the present description, when there is a decrease in the number of tuberculosis bacillus before and after administration of the anti-TB drug, a potential therapeutic effect for TB from the anti-TB drug is suggested for the individual patient with tuberculosis, and a therapeutic choice to continue the use of the anti-TB drug may be provided for medical worker. On the other hand, when there is no decrease in the number of tuberculosis bacillus before and after administration of the anti-TB drug, this indicates that the anti-TB drug does not have a therapeutic effect on tuberculosis on an individual patient with tuberculosis. Therefore, the therapeutic choice of stopping the use of an anti-tuberculosis drug and switching to another other therapy can be made available to the healthcare professional.
В способе, описанном выше, MoAb, в частности, MoAb1 по настоящему изобретению, является применимым в качестве реагента для определения лечебного эффекта в отношении туберкулеза, и настоящее изобретение относится к средству для определения лечебного эффекта в отношении туберкулеза, содержащему MoAb, в частности, MoAb1 по настоящему изобретению, в качестве реагента для определения лечебного эффекта в отношении туберкулеза. MoAb, в частности, MoAb1 по настоящему изобретению может разъединяемым образом или неразъединяемым образом иммобилизовано на любом твердом носителе или может быть мечено любым метящим веществом.In the method described above, MoAb, in particular, MoAb1 of the present invention, is applicable as a reagent for determining the therapeutic effect of tuberculosis, and the present invention relates to a means for determining the therapeutic effect of tuberculosis, containing MoAb, in particular MoAb1 according to the present invention, as a reagent for determining the therapeutic effect against tuberculosis. The MoAb, in particular the MoAb1 of the present invention, can be immobilized in a releasable manner or in a non-separable manner on any solid support, or may be labeled with any labeling agent.
Кроме того, когда способ определения по настоящему изобретению, описанный выше, подлежит осуществлению, способ может быть проведен просто посредством применения набора для определения лечебного эффекта в отношении туберкулеза, включающего в качестве реагента для определения лечебного эффекта в отношении туберкулеза противотуберкулезного лекарственного средства MoAb, предпочтительно, MoAb1 по настоящему изобретению. Следовательно, настоящее изобретение относится к набору для определения лечебного эффекта в отношении туберкулеза для осуществления способа определения лечебного эффекта в отношении туберкулеза для противотуберкулезного лекарственного средства. Набор для определения лечебного эффекта в отношении туберкулеза представляет собой набор реагентов для определения терапевтического эффекта противотуберкулезного средства у пациента с туберкулезом, посредством анализа на обнаружение ЛАМ туберкулезной бациллы, существующей в тестируемых образцах до и после терапии с использованием реакции антиген-антитело. Является достаточным, когда набор включает MoAb, предпочтительно, MoAb1 по настоящему изобретению; и набор может включать устройство для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, описанное выше, второе антитело, которое реагирует с MoAb по настоящему изобретению, реагент для обнаружения антитела и т.п. Кроме того, для удобства проведения анализа, набор для диагностики может дополнительно включать подходящий реакционный раствор, раствор для разбавления, промывочный раствор, раствор для остановки реакции, реагент для измерения меченой активности и т.п.Furthermore, when the determination method of the present invention described above is to be carried out, the method can be carried out simply by using a tuberculosis treatment effect determination kit, including MoAb as a reagent for determining the treatment effect of tuberculosis, preferably MoAb1 of the present invention. Therefore, the present invention relates to a kit for determining a therapeutic effect in relation to tuberculosis for implementing a method for determining a therapeutic effect in relation to tuberculosis for an anti-TB drug. The tuberculosis therapeutic effect kit is a kit of reagents for determining the therapeutic effect of an anti-tuberculosis drug in a patient with tuberculosis by analyzing for the detection of LAM tuberculosis bacillus that exists in test samples before and after therapy using the antigen-antibody reaction. Sufficient when the kit includes MoAb, preferably MoAb1 of the present invention; and the kit may include a LAM detection device for a tuberculosis bacillus described above, a second antibody that reacts with the MoAb of the present invention, an antibody detection reagent, and the like. In addition, for ease of analysis, the diagnostic kit may further include a suitable reaction solution, a dilution solution, a washing solution, a solution to stop the reaction, a reagent for measuring labeled activity, and the like.
Терапию активной формы туберкулеза, как правило, проводят посредством введения четырех или более типов терапевтических средств в течение шести месяцев. Когда существует подозрение на туберкулезную инфекцию, сначала проводят тест мазка с использованием окрашивания Циля-Нильсена или флуоресцентное окрашивание. Если бактерии существуют в количестве 10000 или более в 1 мл образца мокроты, он считается “положительным мазком”. Пациент с положительным результатом теста мазка мокроты является особенно важным в качестве источника инфекции, клинически и с точки зрения общественного здоровья. Следовательно, пациент с положительным результатом теста мазка требует больничного лечения в туберкулезном отделении. Одним показателем переключения на амбулаторное лечение является получение отрицательных результатов теста мазка в течение трех последовательных дней. Способ обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы по настоящему изобретению может количественно оценить концентрацию ЛАМ в биологическом образце, таком как мокрота, слюна и кровь. Следовательно, посредством аналитического теста на ЛАМ в биологическом образце, таком как мокрота, слюна и кровь, является возможным проводить мониторинг эффективности терапевтического средства, и настоящее изобретение является также применимым для определения инфекционно-отрицательного состояния по бактериям для выписки пациента.Therapy for active tuberculosis is usually carried out by administering four or more types of therapeutic agents over a period of six months. When tuberculosis infection is suspected, a smear test is first performed using Ziehl-Nielsen staining or fluorescent staining. If bacteria exist in an amount of 10,000 or more in 1 ml of a sputum sample, it is considered a “positive smear”. A patient with a positive sputum smear test is especially important as a source of infection, both clinically and in terms of public health. Therefore, a patient with a positive smear test requires hospital treatment in the tuberculosis ward. One indicator of switching to outpatient treatment is to get a negative smear test for three consecutive days. The LAM detection method for a tuberculosis bacillus of the present invention can quantify the concentration of LAM in a biological sample, such as sputum, saliva and blood. Therefore, by means of an analytical test for LAM in a biological sample, such as sputum, saliva and blood, it is possible to monitor the effectiveness of the therapeutic agent, and the present invention is also applicable to determine the infectious negative state by bacteria for patient discharge.
ПримерыExamples
Настоящее изобретение и его эффекты описаны ниже со ссылкой на “Примеры”. Однако, объем притязаний изобретения не ограничивается данными Примерами.The present invention and its effects are described below with reference to “Examples”. However, the scope of the claims of the invention is not limited to these Examples.
Примеры 1-4Examples 1-4
1. Подготовка материалов1. Preparation of materials
(1-1) Подготовка олиго-ЛАМ и получение иммуногена(1-1) Preparation of oligo-LAM and preparation of an immunogen
ЛАМ туберкулезной бациллы человека M. tuberculosis (3 мг) (полученный из штамма Aoyama B, Nacalai Tesque) диализовали против 50 мМ ацетатного буфера (рН 4,5) и доводили до концентрации 1 мг/мл. Последовательно, к нему добавляли 150 мкл 200 мМ водного раствора перйодной кислоты, и смесь перемешивали при 4°С в течение 7 минут, при обеспечении защиты от света. После перемешивания, к нему добавляли 35 мкл этиленгликоля, и смесь подвергали гель-фильтрации (0,1 М бикарбоната натрия, рН 8,3), используя небольшую колонку PD-10 (производимую компанией GE), и фракционировали на части по 1 мл. Фракционированные образцы тестировали на сахар методом фенол-серной кислоты; и фракции, в которых был обнаружен сахар диализовали против чистой воды и затем лиофилизировали.LAM of human tuberculosis bacillus M. tuberculosis (3 mg) (obtained from Aoyama B strain, Nacalai Tesque) was dialyzed against 50 mM acetate buffer (pH 4.5) and adjusted to a concentration of 1 mg / ml. Subsequently, 150 μl of a 200 mM aqueous solution of periodic acid was added thereto, and the mixture was stirred at 4 ° C. for 7 minutes, while providing protection from light. After stirring, 35 μl of ethylene glycol was added thereto, and the mixture was subjected to gel filtration (0.1 M sodium bicarbonate, pH 8.3) using a small PD-10 column (manufactured by GE) and fractionated into 1 ml portions. Fractionated samples were tested for sugar by phenol sulfuric acid; and the fractions in which sugar was detected were dialyzed against pure water and then lyophilized.
Лиофилизированный олиго-ЛАМ (3 мг) растворяли в 0,5 мл чистой воды. После добавления к нему 12 мкл 100 мг/мл тетрафторбората 1-циано-4-диметиламинопиридина, растворенного в ацетонитриле и перемешивания смеси в течение приблизительно 1 минуты, к смеси добавляли 12 мкл 0,2 М триэтиламина, и смесь перемешивали в течение 2 минут. Затем к смеси добавляли 0,53 мл 0,6 М дигидразида адипиновой кислоты, растворенного в 0,5 М натрийбикарбонатного буфера (рН 8,5), и смесь перемешивали при 4°С в течение 10 часов, и затем диализовали против чистой воды в течение около 1 часа.Lyophilized oligo-LAM (3 mg) was dissolved in 0.5 ml of pure water. After adding to it 12 μl of 100 mg / ml of 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate dissolved in acetonitrile and stirring the mixture for about 1 minute, 12 μl of 0.2 M triethylamine was added to the mixture, and the mixture was stirred for 2 minutes. Then, 0.53 ml of 0.6 M adipic acid dihydrazide dissolved in 0.5 M sodium bicarbonate buffer (pH 8.5) was added to the mixture, and the mixture was stirred at 4 ° C for 10 hours, and then dialyzed against pure water in for about 1 hour.
К раствору, полученному после диализа, добавляли 300 мкг гемоцианина устья моллюска (KLH), 30 мкл 200 мМ фосфатного буфера (рН 5,0) и 45 мкл 100 мМ N-гидроксисульфосукцинимида натрия. Последовательно, к смеси дополнительно добавляли 65 мкл 1 М дихлорида этилена, и смесь перемешивали при 4°С в течение 3 часов или более. Окончательно, полученную в результате смесь диализовали против фосфатного буфера с получением олиго-ЛАМ-KLH для иммуногена. Олиго-ЛАМ-KLH смешивали с адъювантом (Полный или Неполный адъювант Фрейнда, производимый Difco) при соотношении 1:1 (олиго-ЛАМ-KLH:адъювант (массовое отношение)), и использовали в качестве иммуногена.To the solution obtained after dialysis, 300 μg of clam mouth hemocyanin (KLH), 30 μl of 200 mM phosphate buffer (pH 5.0) and 45 μl of 100 mM N-hydroxysulfosuccinimide sodium were added. Subsequently, 65 μl of 1 M ethylene dichloride was additionally added to the mixture, and the mixture was stirred at 4 ° C. for 3 hours or more. Finally, the resulting mixture was dialyzed against phosphate buffer to give oligo-LAM-KLH for the immunogen. Oligo-LAM-KLH was mixed with an adjuvant (Freund's Complete or Incomplete adjuvant manufactured by Difco) at a 1: 1 ratio (oligo-LAM-KLH: adjuvant (mass ratio)), and used as an immunogen.
(1-2) Подготовка вакцины БЦЖ и иммуногена(1-2) Preparation of BCG vaccine and immunogen
В качестве БЦЖ-вакцины, применяли лиофилизированную вакцину БЦЖ (номер авторизации: 20300AMZ00767000), производимую Japan BCG Laboratory. Для иммунизации, применяли смесь из 100 мг (влажной массы) лиофилизированной вакцины БЦЖ и 1 мл физиологического раствора.As a BCG vaccine, a lyophilized BCG vaccine (authorization number: 20300AMZ00767000) manufactured by Japan BCG Laboratory was used. For immunization, a mixture of 100 mg (wet weight) of the lyophilized BCG vaccine and 1 ml of saline was used.
(1-3) Получение убитых бактериальных клеток H37Ra и иммуногена(1-3) Obtaining killed bacterial cells H37Ra and immunogen
В качестве убитых бактериальных клеток H37Ra, использовали M. tuberculosis H37Ra (лиофилизированный продукт), производимый Difco. Для иммунизации использовали смесь из 100 мг (влажной массы) лиофилизированных убитых бактериальных клеток H37Ra и 1 мл физиологического раствора.As killed H37Ra bacterial cells, M. tuberculosis H37Ra (lyophilized product) manufactured by Difco was used. For immunization, a mixture of 100 mg (wet weight) of lyophilized killed H37Ra killed bacterial cells and 1 ml of physiological saline was used.
(1-4) Получение праймеров для получения фрагментов scFv(1-4) Obtaining primers to obtain scFv fragments
В Таблице 1 показаны наименования, последовательности оснований и применение праймеров, используемых для получений одноцепочечных антител (scFv). Были синтезированы следующие праймеры: четыре смысловых праймера и один антисмысловой праймер в качестве праймеров для амплификации области VH, четыре смысловых праймера и четыре антисмысловых праймера в качестве праймеров для амплификации области VL, один смысловой праймер и один антисмысловой праймер в качестве праймеров для амплификации линкера (GS-линкера), который объединяет фрагмент вариабельной области тяжелой цепи и фрагмент вариабельной области легкой цепи, и два праймера для амплификации областей распознавания рестрикционного фермента (SfiI, NotI). Аминокислотные последовательности SEQ ID NO:13-29 списка последовательностей, соответствуют аминокислотным последовательностям праймеров, перечисленных в Таблице 1, в порядке сверху-вниз.Table 1 shows the names, base sequences and use of primers used to prepare single chain antibodies (scFv). The following primers were synthesized: four sense primers and one antisense primer as primers for amplification of the VH region, four sense primers and four antisense primers as primers for amplification of the VL region, one sense primer and one antisense primer as primers for amplification of the linker (GS -linker), which combines a fragment of the variable region of the heavy chain and a fragment of the variable region of the light chain, and two primers for amplification of recognition regions of restriction o enzyme (SfiI, NotI). The amino acid sequences of SEQ ID NOs: 13-29 of the sequence listing correspond to the amino acid sequences of the primers listed in Table 1, in order from top to bottom.
(1-5) Получение библиотеки фагов scFv(1-5) Obtaining scFv phage library
Кролика иммунизировали, используя вакцину БЦЖ или убитые бактериальные клетки H37Ra в качестве иммуногена (см. (1-2) и (1-3) выше и Ссылочный Пример 1 (2)). После завершения иммунизации, отбирали селезенку кролика, ткань растворяли в среде RPMI (бессывороточной), общую РНК экстрагировали, и кДНК синтезировали из полученной общей РНК. Общую РНК экстрагировали с использованием набора для экстракции (Qiagen) в соответствии с инструкцией по эксплуатации. кДНК синтезировали из общей РНК, используя набор для синтеза кДНК в соответствии с инструкцией по эксплуатации.The rabbit was immunized using BCG vaccine or killed H37Ra bacterial cells as an immunogen (see (1-2) and (1-3) above and Reference Example 1 (2)). After completion of the immunization, the rabbit spleen was taken, the tissue was dissolved in RPMI medium (serum free), the total RNA was extracted, and the cDNA was synthesized from the resulting total RNA. Total RNA was extracted using an extraction kit (Qiagen) in accordance with the instructions for use. cDNA was synthesized from total RNA using a cDNA synthesis kit in accordance with the instruction manual.
Синтезированную кДНК использовали в качестве матрицы, и амплификацию фрагмента гена VH и амплификацию фрагмента гена VL осуществляли, используя специфичные праймеры, описанные в Таблице 1 выше. Конкретно, амплификацию фрагмента гена VH проводили, используя четыре набора праймеров: RabVH-F1 и RabVH-R, RabVH-F2 и RabVH-R, RabVH-F3 и RabVH-R, RabVH-F4 и RabVH-R. Амплификацию фрагмента гена VL проводили, используя 10 наборов праймеров: RabVk-F1 и RabVκ-R1, RabVκ-F1 и RabVκ-R2, RabVκ-F1 и RabVκ-R3, RabVκ-F2 и RabVκ-R1, RabVκ-F2 и RabVκ-R2, RabVκ-F2 и RabVκ-R3, RabVκ-F3 и RabVκ-R1, RabVκ-F3 и RabVκ-R2, RabVκ-F3 и RabVκ-R3, RabVλ-F и RabVλ-R. Полученные продукты генной амплификации разделяли посредством электрофореза на 1,5% агарозном геле. Продукты генной амплификации желательной молекулярной массы экстрагировали из геля и очищали.The synthesized cDNA was used as a template, and the amplification of the VH gene fragment and the amplification of the VL gene fragment was carried out using the specific primers described in Table 1 above. Specifically, amplification of the VH gene fragment was performed using four sets of primers: RabVH-F1 and RabVH-R, RabVH-F2 and RabVH-R, RabVH-F3 and RabVH-R, RabVH-F4 and RabVH-R. The VL gene fragment was amplified using 10 primer sets: RabVk-F1 and RabVκ-R1, RabVκ-F1 and RabVκ-R2, RabVκ-F1 and RabVκ-R3, RabVκ-F2 and RabVκ-R1, RabVκ-F2 and RabVκ-R2 , RabVκ-F2 and RabVκ-R3, RabVκ-F3 and RabVκ-R1, RabVκ-F3 and RabVκ-R2, RabVκ-F3 and RabVκ-R3, RabVλ-F and RabVλ-R. The resulting gene amplification products were separated by electrophoresis on a 1.5% agarose gel. Gene amplification products of the desired molecular weight were extracted from the gel and purified.
Очищенный продукт амплификации гена VH и продукт амплификации гена VL объединяли, используя GS-линкер (GGGGSGGGGSGGGGS: SEQ ID NO:11). RS1, имеющий последовательность, гомологичную 3′-концу продукта амплификации гена VH, смешивали с геном VH, и ПЦР осуществляли в течение 5 циклов для добавления GS-линкера к 3′-концу продукта амплификации гена VH. Аналогично, RS2, имеющий последовательность, гомологичную 5′-концу продукта амплификации гена VL, смешивали с геном VL, и ПЦР осуществляли в течение 5 циклов для добавления GS-линкера к 5′-концу продукта амплификации гена VL. Продукт амплификации гена VH с добавленным GS-линкером и продукт амплификации гена VL с добавленным линкером смешивали, и ПЦР осуществляли в течение 10 циклов для получения гена scFv (ген VH/GS-линкер/ген VL), в котором ген VH и ген VL были объединены через GS-линкер. Полученный таким образом ген scFv использовали в качестве матрицы, амплифицированной посредством осуществления ПЦР в течение 30 циклов с использованием праймеров, в которые добавляют последовательность фермента рестрикции (см. “RS-Sfi” и “RS-Not” в Таблице 1), и окончательно расщепляют с помощью ферментов рестрикции SfiI и NotI.The purified VH gene amplification product and the VL gene amplification product were combined using a GS linker (GGGGSGGGGSGGGGS: SEQ ID NO: 11). RS1 having a sequence homologous to the 3 ′ end of the VH gene amplification product was mixed with the VH gene and PCR was performed for 5 cycles to add a GS linker to the 3 ′ end of the VH gene amplification product. Similarly, RS2 having a sequence homologous to the 5′-end of the VL gene amplification product was mixed with the VL gene and PCR was performed for 5 cycles to add a GS linker to the 5′-end of the VL gene amplification product. The amplification product of the VH gene with the added GS linker and the amplification product of the VL gene with the added linker were mixed and PCR was carried out for 10 cycles to obtain the scFv gene (VH gene / GS linker / VL gene), in which the VH gene and VL gene were combined through a GS linker. The scFv gene thus obtained was used as a template amplified by PCR for 30 cycles using primers to which the restriction enzyme sequence was added (see “RS-Sfi” and “RS-Not” in Table 1), and finally digested using restriction enzymes SfiI and NotI.
Ген scFv, обработанный рестрикционными ферментами, затем вводили в сайты SfiI и NotI фагемидного вектора отображения антитела pCANTAB5E (прооизводимого GE) и трансформировали в JM109 E. coli посредством электропорации. Последовательно, трансформант культивировали в течение ночи при 37°C в среде на агаре LB-Amp/Glu (среда LB, содержащая 150 мкг/мл ампициллина, 1% глюкозы и 1,5% агара), и все полученные в результате колонии собирали.The restriction enzyme scFv gene was then introduced into the SfiI and NotI sites of the phagemid antibody mapping vector pCANTAB5E (produced by GE) and transformed into E. coli JM109 by electroporation. Subsequently, the transformant was cultured overnight at 37 ° C in LB-Amp / Glu agar medium (LB medium containing 150 μg / ml ampicillin, 1% glucose and 1.5% agar), and all the resulting colonies were collected.
После доведения трансформированной E. coli в среде LB до значения поглощения при длине волны 600 нм (OD600), равного 0,2, трансформант смешивали с хелперным фагом М13К07 (производимым Invitrogen) (1012 кое), затем статически культивировали в течение 30 минут при 37°C; и дополнительно культивировали при 37°C в 1 л жидкой среды на агаре LB-Amp/Kan (среда LB, содержащая 150 мкг/мл ампициллина и 100 мкг/мл канамицина) с получением библиотеки фагового дисплея scFv.After adjusting the transformed E. coli in LB medium to an absorbance value at a wavelength of 600 nm (OD 600 ) of 0.2, the transformant was mixed with the helper phage M13K07 (manufactured by Invitrogen) (10 12 cf), then statically cultured for 30 minutes at 37 ° C; and further cultured at 37 ° C. in 1 L of liquid medium on LB-Amp / Kan agar (LB medium containing 150 μg / ml ampicillin and 100 μg / ml kanamycin) to obtain a scFv phage display library.
Окончательно, библиотеку фагового дисплея scFv концентрировали в растворе ПЭГ/NaCl и доводили с помощью PBS до концентрации, приблизительно равной 1×1012 кое/мл, и полученную в результате библиотеку применяли для биопэннинга.Finally, the scFv phage display library was concentrated in PEG / NaCl solution and adjusted with PBS to a concentration of approximately 1 × 10 12 cfu / ml, and the resulting library was used for biopanning.
(1-6) Получение растворимого scFv (одноцепочечные антитела)(1-6) Preparation of soluble scFv (single chain antibodies)
Растворимое scFv получали, используя вектор экспрессии pET22b(+) E. coli (производимый Novagen). Ген-мишень scFv амплифицировали с использованием смысловых и антисмысловых праймеров, посредством этого добавляя последовательность рестрикционного фермента NotI к 5′-концу и последовательность рестрикционного фермента NcoI к 3′-концу.Soluble scFv was prepared using the expression vector pET22b (+) of E. coli (manufactured by Novagen). The scFv target gene was amplified using sense and antisense primers, thereby adding the NotI restriction enzyme sequence to the 5′-end and the NcoI restriction enzyme sequence to the 3′-end.
Ген scFv, обработанный NotI и NcoI вводили в вектор экспрессии pET22b(+) E. coli и затем трансформировали в хозяйскую E. coli Rosetta (Novagen). Трансформированную E. coli культивировали в течение ночи при 37°C в среде на агаре LB-Amp/Kan, и колонии культивировали в течение 8 часов при 25°C в 2 мл жидкой среды LB-Amp. Культуру (2 мл) добавляли к 200 мл жидкой среды LB-Amp, и культивировали в течение 16 часов при 30°C для секреции растворимого scFv (одноцепочечные антитела) в супернатант культуры.The scFv gene treated with NotI and NcoI was introduced into the E. coli pET22b (+) expression vector and then transformed into the host E. coli Rosetta (Novagen). Transformed E. coli was cultured overnight at 37 ° C in LB-Amp / Kan agar medium, and colonies were cultured for 8 hours at 25 ° C in 2 ml of LB-Amp liquid medium. A culture (2 ml) was added to 200 ml of LB-Amp liquid medium, and cultured for 16 hours at 30 ° C. to secrete soluble scFv (single chain antibodies) into the culture supernatant.
Очистку растворимого scFv из супернатанта культуры осуществляли посредством аффинной очистки с использованием колонки, заполненной Ni-Сефарозой (Ni-колонки) (производимой GE). Трехкратное количество 100 мМ фосфатного буфера добавляют к супернатанту культуры, и смесь добавляют к Ni-колонке для обеспечения связывания растворимого scFv. Колонку промывают 100 мМ фосфатным буфером, содержащим 10 мМ имидазола, и затем растворимое scFv элюируют 100 мМ фосфатным буфером, содержащим 500 мМ имидазола.Purification of soluble scFv from the culture supernatant was carried out by affinity purification using a column filled with Ni-Sepharose (Ni-columns) (produced by GE). A three-fold amount of 100 mM phosphate buffer was added to the culture supernatant, and the mixture was added to the Ni column to allow soluble scFv to bind. The column is washed with 100 mM phosphate buffer containing 10 mM imidazole, and then soluble scFv is eluted with 100 mM phosphate buffer containing 500 mM imidazole.
Элюат последовательно диализуют против фосфатного буфера в течение ночи для удаления имидазола, и получают растворимое scFv (одноцепочечное антитело).The eluate is sequentially dialyzed against phosphate buffer overnight to remove imidazole to give soluble scFv (single chain antibody).
(1-7) Мечение антител биотином(1-7) Labeling of antibodies with biotin
Мечение биотином поликлонального (PoAb), и полученное выше одноцепочечное антитело scFv осуществляли с использованием набора для мечения Sulfo-NHS-LC-Biotin от Pierce, в соответствии с рекомендованной методикой эксплуатации набора.Biotin polyclonal (PoAb) labeling and the scFv single chain antibody obtained above were performed using the Sulfo-NHS-LC-Biotin labeling kit from Pierce, in accordance with the recommended method of using the kit.
2. Анализ2. Analysis
(2-1) Измерение титра антител в крови (ELISA)(2-1) Measurement of antibody titer in the blood (ELISA)
С использованием сыворотки, собранной от кроликов и мышей, иммунизированных каждым антигеном, титр антител в крови подтверждали посредством ELISA, описанного ниже.Using serum collected from rabbits and mice immunized with each antigen, the antibody titer in the blood was confirmed by ELISA described below.
Очищенный ЛАМ туберкулезной бациллы человека M. tuberculosis (полученный из штамма Aoyama B, Nacalai Tesque) и очищенный ЛАМ нетуберкулезной кислотоустойчивой бациллы M. avium (полученный из штамма серотипа В, Nacalai Tesque) индивидуально доводили с помощью PBS до концентрации 100 мкл/мл. Каждый из растворов ЛАМ индивидуально добавляли в каждую лунку раздельных 96-луночных микропланшетов в количестве, равном 100 мкл/лунку и давали возможность реагировать в течение ночи при 4°С, и затем проводили блокирование в фосфатном буфере, содержащем 1% снятого молока для получения антигенных планшетов.Purified LAM of human tuberculosis bacillus M. tuberculosis (obtained from Aoyama B strain, Nacalai Tesque strain) and purified LAM of non-tuberculous acid-resistant M. avium bacillus (obtained from serotype B strain, Nacalai Tesque) were individually adjusted using PBS to a concentration of 100 μl / ml. Each LAM solution was individually added to each well of separate 96-well microplates in an amount of 100 μl / well and allowed to react overnight at 4 ° C, and then blocking was carried out in phosphate buffer containing 1% skim milk to produce antigenic tablets.
Первичную реакцию осуществляли посредством добавления 100 мкл сыворотки кролика или мыши, разбавленной реакционным буфером (Трис-буфер с рН 7,8, содержащим 1% БСА (зародышевый бычий альбумин), 1% снятого молока, 0,14 М NaCl и 0,1% Твин 20) в каждую лунку указанных выше антигенных планшетов, и посредством осуществления протекания реакции при 25°С в течение 1 часа. Непрореагировавшие антитела затем удаляли промывкой 3 раза. Вторичную реакцию осуществляли добавлением 100 мкл HRP-меченых против-кроличьих IgG (произведенных Epitomics) или HRP меченых против-мышиных IgG (произведенных Zymed), разбавленных 5000-кратно реакционным буфером, к указанному выше первичному раствору реакции, и обеспечивая протекание реакции при 25°С в течение 1 часа. Непрореагировавшие антитела затем удаляли промывкой 3 раза.The initial reaction was carried out by adding 100 μl of rabbit or mouse serum diluted with reaction buffer (Tris buffer, pH 7.8, containing 1% BSA (germinal bovine albumin), 1% skim milk, 0.14 M NaCl and 0.1% Tween 20) to each well of the above antigenic plates, and by effecting the reaction at 25 ° C. for 1 hour. Unreacted antibodies were then removed by washing 3 times. The secondary reaction was carried out by adding 100 μl of HRP-labeled anti-rabbit IgG (manufactured by Epitomics) or HRP-labeled anti-mouse IgG (manufactured by Zymed) diluted 5,000-fold with reaction buffer to the above primary reaction solution, and allowing the reaction to proceed at 25 ° C for 1 hour. Unreacted antibodies were then removed by washing 3 times.
Реакцию проявления цвета осуществляли добавлением 100 мкл раствора TMB (3,3′,5,5′-тетраметилбензидина) к продукту вторичной реакции, и оставляя смесь отстаиваться при комнатной температуре в течение 10 минут. После проявления цвета, реакцию останавливали добавлением 100 мкл раствора 1 н серной кислоты. Обнаружение осуществляли посредством измерения поглощения при длинах волн 450-650 нм (OD450-650 нм).The color development reaction was carried out by adding 100 μl of a TMB solution (3.3 ′, 5.5′-tetramethylbenzidine) to the product of the secondary reaction, and leaving the mixture to settle at room temperature for 10 minutes. After color development, the reaction was stopped by adding 100 μl of a solution of 1 n sulfuric acid. Detection was carried out by measuring absorbance at wavelengths of 450-650 nm (OD 450-650 nm ).
(2-2) Биопэннинг(2-2) Biopanning
Биопэннинг осуществляли в четыре стадии, состоящие из стадий 1-4.Biopanning was carried out in four stages, consisting of stages 1-4.
На стадиях 1-3, клоны фага, связанные с иммуногеном (БЦЖ-вакцина или убитые бактериальные клетки H37Ra) концентрировали. Библиотеку фагового дисплея scFv (см. (1-5) “1. Получение материалов)” доведенную до концентрации 1×1011 кое/500 мкл реакционным буфером (Трис-буфер с рН 7,8, содержащий 1% БСА, 1% снятого молока, 0,14 М NaCl и 0,1% Твин 20), смешивали с 1 мг БЦЖ-вакцины или убитых бактериальных клеток H37Ra и обеспечивали реакцию при 25°С в течение 2 часов. После реакции, клетки собирали центрифугированием (при 10000 об/мин в течение 10 минут), и супернатант культуры удаляли. После добавления PBS к собранным клеткам и смешивания, клетки собирали повторно центрифугированием для промывки клеток. Операцию промывки проводили 5 раз. Фаги, связанные с клетками, элюировали 500 мкл элюента (раствор 0,1 н HCl, содержащий 0,1% БСА, и доведенный до рН 2,2 раствором 1М глицина), и нейтрализовали добавлением 500 мкл нейтрализационной жидкости (1М Трис-буфер, рН 9,1). Нейтрализованный пул фага инфицировали E. coli JM109, и культивировали при 37°C в среде на агаре LB-Amp/Glu в течение ночи; и колонии собирали. Далее трансформированная E. coli, доведенная в среде LB, чтобы иметь OD600 нм=0,2, и хелперный фаг М13К07 (производство Invitrogen) (1012 кое) статически культивировали при 37°C в течение 30 минут, добавляли 100 мл жидкой среды LB-Amp/Kan, и клетки культивировали в течение ночи при 37°C. Культуру фага концентрировали в растворе ПЭГ/NaCl и доводили до концентрации приблизительно 1×1012 кое/мл фосфатным буфером. Биопэннинг на клетках проводили 3 раза.In steps 1-3, phage clones associated with the immunogen (BCG vaccine or killed H37Ra bacterial cells) were concentrated. ScFv phage display library (see (1-5) “1. Preparation of materials)” adjusted to a concentration of 1 × 10 11 cfu / 500 μl with reaction buffer (Tris buffer, pH 7.8, containing 1% BSA, 1% removed milk, 0.14 M NaCl and 0.1% Tween 20) were mixed with 1 mg of BCG vaccine or killed H37Ra bacterial cells and the reaction was maintained at 25 ° C for 2 hours. After the reaction, the cells were collected by centrifugation (at 10,000 rpm for 10 minutes), and the culture supernatant was removed. After adding PBS to the harvested cells and mixing, the cells were re-centrifuged to wash the cells. The washing operation was carried out 5 times. Cell-associated phages were eluted with 500 μl of eluent (0.1 N HCl solution containing 0.1% BSA and adjusted to pH 2.2 with 1M glycine solution) and neutralized by adding 500 μl of neutralization liquid (1M Tris buffer, pH 9.1). The neutralized pool of phage was infected with E. coli JM109, and cultured at 37 ° C in LB-Amp / Glu agar medium overnight; and the colonies were collected. Next, transformed E. coli brought in LB medium to have OD 600 nm = 0.2, and helper phage M13K07 (manufactured by Invitrogen) (10 12 cfu) were statically cultured at 37 ° C for 30 minutes, 100 ml of liquid medium was added LB-Amp / Kan, and cells were cultured overnight at 37 ° C. The phage culture was concentrated in a PEG / NaCl solution and adjusted to a concentration of approximately 1 × 10 12 cfu / ml with phosphate buffer. Cell biopanning was performed 3 times.
На стадии 4, биопэннинг осуществляли, используя антигенный планшет, на котором был иммобилизован ЛАМ M. tuberculosis или очищенный ЛАМ M. avium (микротитровальный планшет с иммобилизованным очищенным ЛАМ). Конкретно, пул фага, связанный с клетками, полученный на стадии 3, добавляли в микротитровальный планшет с иммобилизованным очищенным ЛАМ, и обеспечивали протекание реакции при 25°С в течение 2 часов. Последовательно, непрореагировавшие фаги удаляли промывкой реакционным буфером 10 раз. Фаги, связанные с ЛАМ, элюировали 100 мкл элюента и затем нейтрализовали добавлением 100 мкл жидкости для нейтрализации (1М Трис-буфер, рН 9,1). Нейтрализованный пул фага инфицировали E. coli JM109, и культивировали при 37°С в среде на агаре LB-Amp/Glu в течение ночи.In
Ссылочный Пример 1. Получение антисыворотки против ЛАМReference Example 1. Obtaining antiserum against LAM
(1) Для получения поликлонального антитела (PoAb) против ЛАМ кроликов иммунизировали с использованием олиго-ЛАМ. В качестве олиго-ЛАМ, использовали, конкретно, олиго-ЛАМ-KLH, полученный как иммуноген способом, описанным в упомянутом выше (1-1) из “1. Получение материалов”. Олиго-ЛАМ-KLH смешивали с адъювантом (неполным адъювантом Фрейнда), при соотношении 1:1 (олиго-ЛАМ-KLH:адъювант (массовое отношение), и 100 мкг смеси подкожно вводили кроликам (два кролика: Rab-1 и 2). Далее иммунизацию осуществляли 4 раза с 14-дневными интервалами. После завершения пятой иммунизации, проводили забор крови, и титры антител в крови против ЛАМ туберкулезной бациллы человека (M. tuberculosis) и ЛАМ нетуберкулезной кислотоустойчивой бациллы (M. Avium) измеряли в соответствии с методом ELISA, описанном в указанном выше (2-1) из “2. Анализ”.(1) To obtain a polyclonal antibody (PoAb) against LAM, rabbits were immunized using oligo LAM. As oligo-LAM, specifically, oligo-LAM-KLH obtained as an immunogen by the method described in the above (1-1) of “1. Receiving materials. ” Oligo-LAM-KLH was mixed with adjuvant (Freund's incomplete adjuvant), at a ratio of 1: 1 (oligo-LAM-KLH: adjuvant (mass ratio), and 100 μg of the mixture was subcutaneously administered to rabbits (two rabbits: Rab-1 and 2). Immunization was then carried out 4 times at 14-day intervals.After the fifth immunization, blood sampling was performed and antibody titers in blood against human LAM tuberculosis bacillus (M. tuberculosis) and LAM non-tuberculosis acid-resistant bacillus (M. Avium) were measured in accordance with the method ELISA described in the above (2-1) of “2. Analysis”.
В результате оценки с использованием антигенного планшета, на котором был иммобилизован ЛАМ M. tuberculosis достаточное увеличение титров антител было подтверждено в сыворотках, разбавленных 384000-кратно у двух подкожно иммунизированных кроликов (Rab-1 и 2). Антисыворотки этих кроликов (Rab-1 и 2) также проявляли реактивность связывания с антигенным планшетом на котором был иммобилизован ЛАМ M. Avium, и проявляли сходную реактивность как к ЛАМ M. tuberculosis, так и ЛАМ M. Avium. Конкретно, антисыворотки кролика (поликлональное антитело), полученное с использованием олиго-ЛАМ (олиго-ЛАМ-KLH) в качестве иммуногена, имели реактивность к ЛАМ кислотоустойчивых бацилл в целом, и никакой специфичности по отношению к ЛАМ туберкулезной бациллы не наблюдали.As a result of the evaluation using an antigenic plate on which M. tuberculosis LAM was immobilized, a sufficient increase in antibody titers was confirmed in sera diluted 384,000-fold in two subcutaneous immunized rabbits (Rab-1 and 2). The antisera of these rabbits (Rab-1 and 2) also showed binding reactivity with the antigenic plate on which M. Avium LAM was immobilized, and showed similar reactivity to both M. tuberculosis LAM and M. Avium LAM. Specifically, rabbit antisera (polyclonal antibody) obtained using oligo-LAM (oligo-LAM-KLH) as an immunogen had reactivity to LAM of acid-resistant bacilli in general, and no specificity for LAM of tuberculosis bacillus was observed.
(2) Далее, кролика иммунизировали, используя БЦЖ-вакцину в качестве иммуногена, и кролика иммунизировали, используя убитые бактериальные клетки H37Ra в качестве иммуногена. Каждого кролика подкожно иммунизировали 4 раза при 14-дневных интервалах таким же образом, что и выше. Конкретно, каждого кролика подкожно иммунизировали, с использованием, в целом, на иммунизацию 1 мл физиологического раствора, содержащего 100 мг БЦЖ-вакцины или убитых бактериальных клеток H37Ra, полученных способом, описанным в указанном выше (1-2) или (1-3) из “1. Получение материалов”.(2) Next, the rabbit was immunized using a BCG vaccine as an immunogen, and the rabbit was immunized using killed H37Ra bacterial cells as an immunogen. Each rabbit was subcutaneously immunized 4 times at 14-day intervals in the same manner as above. Specifically, each rabbit was subcutaneously immunized using, in general, 1 ml of saline containing 100 mg of BCG vaccine or killed H37Ra bacterial cells obtained by the method described in (1-2) or (1-3) above for immunization from “1. Receiving materials. ”
Титр антител в крови каждого кролика после второй иммунизации измеряли таки же образом, что и выше, посредством метода ELISA, описанного в указанном выше (2-1) из “2. Анализ”. Конкретно, титры антител сывороток, полученных из кролика, иммунизированного БЦЖ-вакциной, и кролика, иммунизированного убитыми бактериальными клетками H37Ra, оценивали, используя антигенный планшет, на котором был иммобилизован очищенный ЛАМ M. tuberculosis, и антигенный планшет, на котором был иммобилизован очищенный ЛАМ M. avium. Фиг. 3 (А) показывает результаты, когда в качестве иммуногена использовали БЦЖ-вакцину, а фиг. 3 (В) показывает результаты, когда использовали убитые бактериальные клетки H37Ra. На чертежах “-■-” указывает на реактивность к ЛАМ M. tuberculosis, а “-●-” указывает на реактивность к ЛАМ M. avium.The titer of antibodies in the blood of each rabbit after the second immunization was measured in the same manner as above, using the ELISA method described in the above (2-1) from “2. Analysis". Specifically, antibody titers of sera obtained from rabbit immunized with BCG vaccine and rabbit immunized with killed H37Ra bacterial cells were evaluated using an antigenic plate on which purified M. tuberculosis LAM was immobilized and an antigenic plate on which purified LAM was immobilized M. avium. FIG. 3 (A) shows the results when a BCG vaccine was used as the immunogen, and FIG. 3 (B) shows the results when killed H37Ra bacterial cells were used. In the drawings, “- ■ -” indicates reactivity to LAM of M. tuberculosis, and “- ● -” indicates reactivity to LAM of M. avium.
Как показано на фиг. 3, как в случае использования БЦЖ-вакцины, так и в случае использования убитых бактериальных клеток H37Ra, было подтверждено, что титры антител к ЛАМ значительно возрастали концентрационно-зависимым образом. Далее, сходная реактивность проявлялась как к ЛАМ M. tuberculosis, так и ЛАМ M. avium.As shown in FIG. 3, both in the case of using BCG vaccine and in the case of using killed H37Ra bacterial cells, it was confirmed that antibody titers to LAM significantly increased in a concentration-dependent manner. Further, similar reactivity was manifested both for LAM of M. tuberculosis and LAM of M. avium.
Как описано выше, когда олиго-ЛАМ, БЦЖ-вакцина и убитые бактериальные клетки H37Ra индивидуально применялись в качестве иммуногенов, все антисыворотки (поликлональные антитела) против этих антигенов имели реактивность к ЛАМ кислотоустойчивых бацилл в целом, и никакой специфичности к ЛАМ туберкулезной бациллы не наблюдали.As described above, when the oligo-LAM, BCG vaccine and killed H37Ra bacterial cells were individually used as immunogens, all antisera (polyclonal antibodies) against these antigens were reactive to LAM of acid-resistant bacilli in general, and no specificity for LAM of tuberculous bacillus was observed .
Пример 1. Получение одноцепочечных антител (scFv) против ЛАМExample 1. Obtaining single-chain antibodies (scFv) against LAM
(1) Получение scFv против ЛАМ(1) Obtaining scFv against LAM
Одноцепочечные антитела scFv выделяли из клеток селезенки кроликов, иммунизированных с использованием олиго-ЛАМ, БЦЖ-вакцины и убитых бактериальных клеток H37Ra в Ссылочном Примере 1.Single-chain scFv antibodies were isolated from rabbit spleen cells immunized with oligo-LAM, BCG vaccine and killed H37Ra bacterial cells in Reference Example 1.
Конкретно, в соответствии со способом, описанным в (1-5) из “1. Получение материалов”, общую РНК получали из селезенки каждого кролика, и ПЦР осуществляли, используя кДНК, синтезированную из общей РНК в качестве матрицы, и используя разнообразные праймеры, описанные в Таблице 1 для получения продуктов амплификации генов VH и VL.Specifically, in accordance with the method described in (1-5) of “1. Preparation of Materials ”, total RNA was obtained from the spleen of each rabbit, and PCR was performed using cDNA synthesized from total RNA as a template, and using the various primers described in Table 1 to obtain amplification products of the VH and VL genes.
Последовательно, получали гены scFv, каждый имеющий ген VH и ген VL, объединенные через GS-линкер (GGGGSGGGGSGGGGS: SEQ ID NO:11) (ген VH/GS-линкер/ген VL), и затем из них получали библиотеки фагового дисплея scFv, в соответствии со способом, описанном в (1-5) из “1. Получение материалов”. Титр каждой библиотеки составлял приблизительно 106 кое, и, таким образом, предполагали, что каждая библиотека имела диверсифицирование, равное 106.In sequence, scFv genes were obtained, each having a VH gene and a VL gene, combined through a GS linker (GGGGSGGGGSGGGGS: SEQ ID NO: 11) (VH gene / GS linker / VL gene), and then scFv phage display libraries were obtained from them, in accordance with the method described in (1-5) of “1. Receiving materials. ” The title of each library was approximately 10 6 cfu, and thus it was assumed that each library had a diversification of 10 6 .
Для библиотеки фагового дисплея scFv, полученной из клеток селезенки кролика, иммунизированного БЦЖ-вакциной, биопэннинг с использованием в качестве антигена БЦЖ-вакцины (см.(2-2) из “2. Анализ”) осуществляли 3 раза, и затем четвертый биопэннинг осуществляли, используя микропланшет, на котором был иммобилизован ЛАМ M. tuberculosis.For the scFv phage display library obtained from rabbit spleen cells immunized with BCG vaccine, biopanning using the BCG vaccine as antigen (see (2-2) from “2. Analysis”) was performed 3 times, and then the fourth biopanning was performed using a microplate on which M. tuberculosis LAM was immobilized.
Аналогично, для библиотеки фагового дисплея scFv, полученной из клеток селезенки кролика, иммунизированного убитыми бактериальными клетками H37Ra, биопэннинг с использованием в качестве антигена убитые бактериальные клетки H37Ra осуществляли 3 раза, и затем четвертый биопэннинг осуществляли, используя микропланшет, на котором был иммобилизован ЛАМ M. tuberculosis.Similarly, for a scFv phage display library obtained from rabbit spleen cells immunized with killed H37Ra bacterial cells, biopanning using antigen killed H37Ra bacterial cells was performed 3 times, and then the fourth biopanning was performed using a microplate on which LAM M was immobilized. tuberculosis.
В конечном счете, 200 клонов были статистически выбраны из полученного пэннинга, и клоны, реактивные к ЛАМ были подвергнуты скринингу. В результате, приблизительно 10 ЛАМ-реактивных клонов были получены из каждой библиотеки.Ultimately, 200 clones were statistically selected from the resulting panning, and LAM reactive clones were screened. As a result, approximately 10 LAM-reactive clones were obtained from each library.
В результате анализа последовательности оснований, было подтверждено, что последовательности оснований клонов, полученных из каждой библиотеки, были почти идентичными.As a result of the analysis of the base sequence, it was confirmed that the base sequences of the clones obtained from each library were almost identical.
Посредством указанных выше операций, одиночный клон scFv (одноцепочечные антитела) был успешно выделен из каждой библиотеки фагового дисплея scFv, полученной из клеток селезенки кролика, иммунизированного с использованием БЦЖ-вакцины, библиотеки фагового дисплея scFv, полученной из клеток селезенки кролика, иммунизированного с использованием убитых бактериальных клеток H37Ra.Through the above operations, a single scFv clone (single chain antibodies) was successfully isolated from each scFv phage display library obtained from rabbit spleen cells immunized using BCG vaccine, the scFv phage display library obtained from rabbit spleen cells immunized using killed bacterial cells H37Ra.
Фиг. 4 показывает аминокислотную последовательность одноцепочечного антитела scFv (Myco-scFv), полученного из клеток селезенки кролика, иммунизированного с использованием убитых бактериальных клеток H37Ra (SEQ ID NO:30) и аминокислотную последовательность одноцепочечного антитела scFv (ТВ-scFv), полученного из клеток селезенки кролика, иммунизированного с использованием БЦЖ-вакцины (SEQ ID NO:12) вместе с положениями областей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи; GS-линкера; и областей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи.FIG. 4 shows the amino acid sequence of a single chain scFv antibody (Myco-scFv) obtained from rabbit spleen cells immunized using killed H37Ra bacterial cells (SEQ ID NO: 30) and the amino acid sequence of a single chain scFv antibody (TB-scFv) obtained from rabbit spleen cells immunized using BCG vaccine (SEQ ID NO: 12) together with the provisions of the regions of CDR1, CDR2 and CDR3 of the variable region of the heavy chain; GS linker; and regions of CDR1, CDR2 and CDR3 of the variable region of the light chain.
(2) Реактивность scFv к ЛАМ(2) Reactivity of scFv to LAM
Реактивность к ЛАМ оценивали у одноцепочечного антитела scFv (ТВ-scFv), полученного из библиотеки фагового дисплея scFv, полученной из клеток селезенки кролика, иммунизированного с использованием БЦЖ-вакцины, и у одноцепочечного антитела scFv (Myco-scFv), полученного из библиотеки фагового дисплея scFv, полученной из клеток селезенки кролика, иммунизированного с использованием убитых бактериальных клеток H37Ra.LAM reactivity was evaluated in a single-chain scFv antibody (TB-scFv) obtained from a scFv phage display library obtained from rabbit spleen cells immunized with BCG vaccine and a single-chain scFv antibody (Myco-scFv) obtained from a phage display library scFv obtained from rabbit spleen cells immunized with killed H37Ra bacterial cells.
Конкретно, каждое из одноцепочечных антител (ТВ-scFv и Myco-scFv) солюбилизировали в соответствии со способом, описанным в (1-6) из “1. Получение материалов” для получения растворимого scFv. Растворимое scFv затем метили биотином в соответствии со способом, описанным в (1-7) из того же раздела; и реактивность к антигенным планшетам (микротитровальным планшетам с иммобилизованным очищенным ЛАМ), т.е. планшету, на котором был иммобилизован очищенный ЛАМ M. tuberculosis, и планшету, на котором был иммобилизован очищенный ЛАМ M. avium, оценивали методом ELISA, описанным в (2-1) из “2. Анализ”.Specifically, each of the single chain antibodies (TB-scFv and Myco-scFv) was solubilized in accordance with the method described in (1-6) of “1. Preparation of Materials ”to obtain soluble scFv. Soluble scFv was then labeled with biotin in accordance with the method described in (1-7) from the same section; and reactivity to antigenic plates (microtiter plates with immobilized purified LAM), i.e. the tablet on which the purified M. tuberculosis LAM was immobilized, and the tablet on which the purified M. avium LAM was immobilized, was evaluated by the ELISA method described in (2-1) from “2. Analysis".
Фиг. 5 показывает реактивность одноцепочечного антитела ТВ-scFv к ЛАМ M. tuberculosis “-■-” и к ЛАМ M. avium “-●-”. Как показано на Фиг. 5, результаты, полученные посредством реакции ТВ-scFv при концентрациях, равных 1000 нг/мл, 500 нг/мл, 250 нг/мл, 125 нг/мл, 62,5 нг/мл, 31,25 нг/мл, 15,625 нг/мл и 7,8125 нг/мл с ЛАМ M. tuberculosis и ЛАМ M. avium в антигенных планшетах с иммобилизованным ЛАМ, подтверждали, что реактивность ТВ-scFv к ЛАМ M. tuberculosis “-■-” достигала максимального значения при концентрации 250 нг/мл со значением OD (450 нм) большим, чем 3, в то время как реактивность ТВ-scFv к ЛАМ M. avium “-●-” не достигала максимального значения даже при концентрации, равной 1000 нг/мл со значением OD (450 нм), равным приблизительно 2. Несмотря на то что результаты не показаны, Myco-scFv проявляло почти такую же реактивность как к ЛАМ M. tuberculosis, так и к ЛАМ M. avium.FIG. 5 shows the reactivity of the single-chain antibody TB-scFv to M. tuberculosis LAM “- ■ -” and M. avium “- ● -” LAM. As shown in FIG. 5, the results obtained by the TB-scFv reaction at concentrations of 1000 ng / ml, 500 ng / ml, 250 ng / ml, 125 ng / ml, 62.5 ng / ml, 31.25 ng / ml, 15.625 ng / ml and 7.8125 ng / ml with LAM M. tuberculosis and LAM M. avium in antigenic plates with immobilized LAM, confirmed that the reactivity of TB-scFv to LAM M. tuberculosis “- ■ -” reached a maximum value at a concentration of 250 ng / ml with an OD value (450 nm) greater than 3, while the reactivity of TB-scFv to LAM M. avium “- ● -” did not reach its maximum value even at a concentration of 1000 ng / ml with an OD value (450 nm), approximately 2. N Although the results are not shown, Myco-scFv showed almost the same reactivity to LAM M. tuberculosis and LAM M. avium.
Приведенные выше результаты подтверждали, что одноцепочечное антитело ТВ-scFv, полученное посредством использования БЦЖ-вакцины в качестве иммуногена, представляет собой специфичное антитело, имеющее более сильную реактивность к ЛАМ туберкулезной бациллы человека M. tuberculosis, чем к ЛАМ нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл M. avium.The above results confirmed that the single-chain TB-scFv antibody obtained by using the BCG vaccine as an immunogen is a specific antibody that has a higher reactivity to LAM of M. tuberculosis human bacillus than to LAM of non-tuberculic acid-resistant M. avium bacilli.
Пример 2Example 2
Конструкция обнаружения ЛАМ посредством ELISALAM Detection Design by ELISA
Характеристики трех типов антител, полученных в Ссылочном Примере 1 и Примере 1 (поликлональное антитело от кролика, иммунизированного олиго-ЛАМ (далее в настоящем описании именуемое как “Myco-Poly”) (Ссылочный Пример 1) и моноклональное антитело от кролика, иммунизированного убитыми бактериальными клетками H37Ra (Myco-scFv) и моноклональное антитело от кролика, иммунизированного БЦЖ-вакциной (ТВ-scFv) (Пример 1)) были обобщены в Таблице 2.Characteristics of the three types of antibodies obtained in Reference Example 1 and Example 1 (polyclonal antibody from a rabbit immunized with oligo-LAM (hereinafter referred to as “Myco-Poly”) (Reference Example 1) and a monoclonal antibody from a rabbit immunized with killed bacterial H37Ra cells (Myco-scFv) and a monoclonal antibody from a rabbit immunized with BCG vaccine (TB-scFv) (Example 1)) were summarized in Table 2.
На основании реакционной специфичности этих антител, антитела были объединены для конструирования двух типов ELISA:Based on the reactive specificity of these antibodies, antibodies were combined to construct two types of ELISA:
ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы.ELISA for detecting LAM of acid-resistant bacilli and ELISA for detecting LAM of tuberculosis bacillus.
(1) Подготовка ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл(1) Preparation of ELISA for the detection of LAM acid resistant bacilli
Для конструкции ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл Myco-Poly иммобилизовывали в качестве иммобилизованного антитела на планшете, а Myco-scFv метили биотином и применяли как антитело для обнаружения.For the ELISA construct for the detection of LAM, acid-resistant Myco-Poly bacilli were immobilized as an immobilized antibody on a plate, and Myco-scFv was labeled with biotin and used as an antibody for detection.
Myco-Poly доводили до концентрации 10 мкг/мл фосфатным буфером. Myco-Poly добавляли к 96-луночный микропланшет в количестве 100 мкл/лунку и обеспечивали протекание реакции в течение ночи при 4°С; затем блокирование проводили в фосфатном буфере, содержащем 1% снятого молока для получения планшета с антителом.Myco-Poly was adjusted to a concentration of 10 μg / ml with phosphate buffer. Myco-Poly was added to a 96-well microplate in an amount of 100 μl / well and the reaction was allowed to proceed overnight at 4 ° C; then blocking was carried out in phosphate buffer containing 1% skim milk to obtain an antibody plate.
Первичную реакцию осуществляли следующим образом. Применяли тестируемый образец, который может содержать кислотоустойчивые бациллы, и 100 мкл тестируемого образца, разбавленного реакционным буфером (Трис-буфер с рН 7,8, содержащий 1% БСА, 1% снятого молока, 0,14 М NaCl и 0,1% Твин 20) добавляли в каждую лунку указанного выше планшета с антителом. Обеспечивали протекание реакции при 25°С в течение 1 часа, и планшет затем промывали 3 раза. Вторичную реакцию осуществляли добавлением 100 мкл биотин-меченых-против Myco-scFv, разбавленных 5000-кратно реакционным буфером, в каждую лунку планшета с антителом, обеспечивая протекание реакции при 25°С в течение 1 часа и удаляя непрореагировавшие антитела посредством промывки 3 раза. Третичную реакцию осуществляли добавлением к смеси 100 мкл авидин-меченых HRP (произведенных Millipore), разбавленных 10000-кратно реакционным буфером, обеспечивая протекание реакции при 25°С в течение 1 часа, и затем удаляя непрореагировавшие авидин-меченые HRP посредством промывки 3 раза.The primary reaction was carried out as follows. A test sample was used, which may contain acid-resistant bacilli, and 100 μl of the test sample diluted with reaction buffer (Tris buffer, pH 7.8, containing 1% BSA, 1% skim milk, 0.14 M NaCl and 0.1% Tween 20) was added to each well of the above antibody plate. The reaction was allowed to proceed at 25 ° C. for 1 hour, and the plate was then washed 3 times. The secondary reaction was carried out by adding 100 μl of biotin-labeled anti-Myco-scFv diluted 5,000 times with reaction buffer to each well of the antibody plate, allowing the reaction to proceed at 25 ° C for 1 hour and removing unreacted antibodies by washing 3 times. The tertiary reaction was carried out by adding to the
Реакцию проявления цвета осуществляли добавлением 100 мкл раствора TMB в каждую лунку, и оставляя смесь отстаиваться при комнатной температуре в течение 10 минут. После проявления цвета, реакцию останавливали добавлением 100 мкл раствора 1 н серной кислоты. Интенсивность проявления цвета обнаруживали посредством измерения поглощения при длинах волн 450-650 нм.The color development reaction was carried out by adding 100 μl of TMB solution to each well, and leaving the mixture to stand at room temperature for 10 minutes. After color development, the reaction was stopped by adding 100 μl of a solution of 1 n sulfuric acid. The intensity of color development was detected by measuring the absorption at wavelengths of 450-650 nm.
(2) Подготовка ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы(2) Preparation of ELISA for the detection of LAM tuberculosis bacillus
ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы был построен с использованием ТВ-scFv как в качестве иммобилизованного антитела, так и антитела для обнаружения. ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы был подготовлен таким же образом, что описан выше в (1), за исключением того, что ТВ-scFv использовали как в качестве иммобилизованного антитела, так и антитела для обнаружения.An ELISA for detecting LAM of a tuberculosis bacillus was constructed using TB-scFv both as an immobilized antibody and an antibody for detection. An ELISA for the detection of LAM of a tuberculosis bacillus was prepared in the same manner as described above in (1), except that TB-scFv was used both as an immobilized antibody and an antibody for detection.
(3) Оценка обнаружения каждого ЛАМ с помощью ELISA(3) Evaluation of the detection of each LAM using ELISA
ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, подготовленные в (1) и (2), соответственно, оценивали на реактивность к ЛАМ, используя очищенный ЛАМ туберкулезной бациллы человека (M. Tuberculosis), и очищенный ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (M. Avium).ELISA for the detection of LAM of acid-resistant bacilli and ELISA for detection of LAM of tuberculosis bacilli prepared in (1) and (2), respectively, were evaluated for reactivity to LAM using purified LAM of human tuberculosis bacillus (M. Tuberculosis) and purified LAM of acid-resistant bacilli ( M. Avium).
Фиг. 6 показывает результаты. На чертеже ● указывает на реактивность к ЛАМ M. tuberculosis при ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, ■ указывает на реактивность к M. avium при ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, ○ указывает на реактивность к ЛАМ M. tuberculosis при ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, □ указывает на реактивность к ЛАМ M. avium при ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы.FIG. 6 shows the results. In the drawing, ● indicates reactivity to LAM of M. tuberculosis in ELISA for the detection of LAM of acid-resistant bacilli, ■ indicates reactivity to LAM of M. tuberculosis in ELISA for the detection of LAM of acid-resistant bacilli, ○ indicates reactivity to LAM of M. tuberculosis in ELISA for detection of LAM of tuberculosis bacilli, □ indicates reactivity to LAM of M. avium during ELISA to detect LAM of tuberculosis bacillus.
Как становится ясно из фиг. 6, было возможно обнаружить ЛАМ M. tuberculosis (-■-) и ЛАМ M. avium (-●-) эквивалентно при проведении ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл. С другой стороны, при проведении ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, было потверждено, что реактивность к ЛАМ туберкулезной бациллы M. tuberculosis почти достигала максимального значения при концентрации 100 нг/мл со значением OD 450 нм, равным 3 или более, в то время как почти никакой реактивности к ЛАМ кислотоустойчивых бацилл M. avium не проявлялось даже при концентрации 100 нг/мл.As it becomes clear from FIG. 6, it was possible to detect LAM of M. tuberculosis (- ■ -) and LAM of M. avium (- ● -) equivalently by ELISA to detect LAM of acid-resistant bacilli. On the other hand, when conducting an ELISA to detect LAM of a tuberculous bacillus, it was confirmed that the reactivity to the LAM of the tuberculous bacillus M. tuberculosis almost reached its maximum value at a concentration of 100 ng / ml with an OD value of 450 nm of 3 or more, while almost no reactivity to LAM of acid-resistant M. avium bacilli was manifested even at a concentration of 100 ng / ml.
Пример 3Example 3
Оценка реактивности антитела к ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ЛАМ туберкулезной бациллы при проведении ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы (использование клинических изолятов кислотоустойчивых бацилл)Evaluation of the reactivity of antibodies to LAM of acid-resistant bacilli and LAM of tuberculosis bacilli during ELISA to detect LAM of acid-resistant bacilli and ELISA to detect LAM of tuberculosis bacilli (using clinical isolates of acid-resistant bacilli)
Применяли ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, сконструированные в Примере 2, и реактивность антитела к ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ЛАМ туберкулезной бациллы оценивали, используя клинические изоляты разнообразных кислотоустойчивых бацилл, показана на фиг. 7.ELISA was used to detect LAM of acid-resistant bacilli and ELISA to detect LAM of tuberculosis bacillus, constructed in Example 2, and the reactivity of the antibody to LAM of acid-resistant bacilli and LAM of tuberculosis bacillus was evaluated using clinical isolates of various acid-resistant bacilli, shown in FIG. 7.
Конкретно, в качестве клинических изолятов кислотоустойчивых бацилл использовали культуры 38 штаммов M. tuberculosis (см. Таблицы А и В, фиг. 7), культуры 23 штаммов M. avium и культуры 6 штаммов M. intracellulare (см. Таблицы C и D, фиг. 7). Штаммы M. avium и штаммы M. intracellulare представляют собой патогенные бактерии заболевания MAC. Каждый клинический изолят кислотоустойчивых бацилл культивировали до слияния при 37°С в жидкой среде (бульон 7Н9, производимый BD, содержащий обогащение 10% ADC, производимое BD), и культуру консервировали замораживанием при -80°С.Specifically, cultures of 38 strains of M. tuberculosis (see Tables A and B, FIG. 7), cultures of 23 strains of M. avium and cultures of 6 strains of M. intracellulare (see Tables C and D, FIG. 2) were used as clinical isolates of acid-resistant bacilli. . 7). Strains of M. avium and strains of M. intracellulare are pathogenic bacteria of the disease MAC. Each clinical isolate of acid-resistant bacilli was cultured before fusion at 37 ° C in a liquid medium (7H9 broth produced by BD containing 10% ADC enrichment produced by BD), and the culture was preserved by freezing at -80 ° C.
Культуру, консервированную замораживанием оттаивали и затем смешивали с эквивалентным количеством Y-PER (реагентом для экстракции белка, производимым Thermo), и смесь последовательно нагревали в течение 10 минут при 95°С. После сбора клеток посредством центрифугирования (10000 об/мин, 10 минут), отбирали супернатант. К отобранному супернатанту добавляли 4-кратное количество реакционного буфера (фосфатный буфер, содержащий 1% снятого молока, 0,5% БСА, 0,05% Твин 20 и 0,1% XL-II), 100 мкл смеси подвергали ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, сконструированные в Примере 2, и измеряли реактивность антитела к ЛАМ.The frozen canned culture was thawed and then mixed with an equivalent amount of Y-PER (Thermo Protein Extraction Reagent), and the mixture was successively heated for 10 minutes at 95 ° C. After collecting the cells by centrifugation (10,000 rpm, 10 minutes), the supernatant was collected. A 4-fold amount of reaction buffer (phosphate buffer containing 1% skim milk, 0.5% BSA, 0.05
Результаты измерений, полученные посредством каждого из ELISA, оценивали посредством сравнения с реактивностью антитела к очищенному ЛАМ M. tuberculosis, используемому в качестве стандарта. На фиг. 7 показаны результаты.The measurement results obtained by each ELISA were evaluated by comparison with the reactivity of the antibody to purified M. tuberculosis LAM, used as a standard. In FIG. 7 shows the results.
Как показано на фиг. 7, при проведении ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (см. столбец “myco” в каждой таблице фиг. 7), реактивность проявлялась ко всем из 38 штаммов M. tuberculosis, 23 штаммов M. avium и 6 штаммов M. intracellulare. С другой стороны, при проведении ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы (см. столбцы “TB” в каждой таблице фиг. 7), реактивность к 34 из 38 штаммов M. tuberculosis проявлялась в высокой степени, но никакой реактивности к 23 штаммам M. avium и 6 штаммам M. intracellulare не было проявлено.As shown in FIG. 7, when conducting an ELISA to detect LAMs of acid-resistant bacilli (see the “myco” column in each table of FIG. 7), reactivity was manifested for all of 38 strains of M. tuberculosis, 23 strains of M. avium and 6 strains of M. intracellulare. On the other hand, when conducting an ELISA to detect LAM of a tuberculosis bacillus (see the “TB” columns in each table of Fig. 7), reactivity to 34 of 38 strains of M. tuberculosis was highly manifested, but no reactivity to 23 strains of M. avium and 6 strains of M. intracellulare were not shown.
Как показано выше, было продемонстрировано, что ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, сконструированный в Примере 2, имел высокую реактивность к ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, и обладал способностью к широкому обнаружению ЛАМ кислотоустойчивых бацилл. С другой стороны, при ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, сконструированном в Примере 2, существовало различие в реактивности среди штаммов, и реакция была специфичной по сравнению с ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл. Конкретно, ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, сконструированный в Примере 2, специфически обнаруживал ЛАМ туберкулезной бациллы и проявлял хорошие результаты с чувствительностью 90% и специфичностью 100%.As shown above, it was demonstrated that the ELISA for the detection of LAM acid-resistant bacilli, constructed in Example 2, had a high reactivity to LAM acid-resistant bacilli, and was able to widely detect LAM acid-resistant bacilli. On the other hand, with ELISA for the detection of LAM of the tuberculosis bacillus constructed in Example 2, there was a difference in reactivity among the strains, and the reaction was specific compared to ELISA for detection of LAM of acid-resistant bacilli. Specifically, an ELISA for the detection of a LAM of a tuberculous bacillus constructed in Example 2 specifically detected a LAM of a tuberculous bacillus and showed good results with a sensitivity of 90% and a specificity of 100%.
Исходя из приведенных выше результатов, было подтверждено, что ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, сконструированный в Примере 2 (иммобилизованное антитело: Myco-Poly и антитело для обнаружения: Myco-scFv), может широко обнаруживать ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, а ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, сконструированный в Примере 2 (иммобилизованное антитело: TB-scFv и антитело для обнаружения: TB-scFv), может специфически обнаруживать ЛАМ туберкулезной бациллы с четким отличием от ЛАМ нетуберкулезных бацилл.Based on the above results, it was confirmed that an ELISA for the detection of LAM acid resistant bacilli, constructed in Example 2 (immobilized antibody: Myco-Poly and an antibody for detection: Myco-scFv), can widely detect LAM acid-resistant bacilli, and ELISA for detecting LAM the tuberculosis bacillus constructed in Example 2 (immobilized antibody: TB-scFv and antibody for detection: TB-scFv) can specifically detect LAM of the tuberculosis bacillus with a clear difference from LAM of non-tuberculosis bacilli.
Пример 4. Конструкция иммунохроматографических методов обнаружения ЛАМExample 4. The design of immunochromatographic methods for the detection of LAM
Иммунохроматографические тесты для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы были сконструированы с использованием пар антител, подвергнутых оценке посредством ELISA.Immunochromatographic tests for the detection of LAM of acid-resistant bacilli and the detection of LAM of tuberculosis bacillus were constructed using pairs of antibodies evaluated by ELISA.
(1) Иммунохроматографический метод для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл(1) Immunochromatographic method for the detection of LAM acid-resistant bacilli
Для конструирования иммунохроматографического теста на обнаружение ЛАМ кислотоустойчивых бацилл Myco-Poly, иммобилизованное на нитроцеллюлозной мембране использовали в качестве иммобилизованного антитела, а Myco-scFv, меченый коллоидом золота, использовали в качестве антитела для обнаружения.To construct an immunochromatographic test for the detection of LAM of acid-resistant Myco-Poly bacilli, immobilized on a nitrocellulose membrane was used as an immobilized antibody, and Myco-scFv, labeled with gold colloid, was used as an antibody for detection.
Myco-Poly (иммобилизованное антитело) наносили на нитроцеллюлозную мембрану (производимую Millipore, время капиллярного протока: 240) до концентрации 3,0 мг/мл (фосфатный буфер) и высушивали при 50°С в течение 20 часов. Получали иммунохроматографическую полоску, содержащую нитроцеллюлозный субстрат и поглощающую подложку, наклеенную на него. К ним присоединяли ламинатный герметик, и полученную в результате полоску нарезали на полоски шириной 4 мм, которые использовали для одного теста.Myco-Poly (immobilized antibody) was applied to a nitrocellulose membrane (manufactured by Millipore, capillary flow time: 240) to a concentration of 3.0 mg / ml (phosphate buffer) and dried at 50 ° C for 20 hours. An immunochromatographic strip was obtained containing a nitrocellulose substrate and an absorbent substrate adhered to it. A laminate sealant was attached to them, and the resulting strip was cut into 4 mm wide strips, which were used for one test.
Для получения меченого коллоидным золотом Myco-scFv применяли коллоид золота с размером 40 нм. Myco-scFv добавляли к коллоидному золоту (OD=1) до концентрации 2,0 мкг/мл и обеспечивали реакцию при комнатной температуре в течение 20 минут. В качестве буфера для связывания антитела применяли 2 мМ TES (N-Трис(гидроксиметил)метил-2-аминоэтансульфоновую кислоту) (рН 7,5). После мечения коллоидным золотом блокировку осуществляли посредством обеспечения протекания реакции в буфере, содержащем 2 мМ Боракс (декагидрат тетрабората натрия) и 1,5 БСА (рн 9,0) при 300 об/мин при комнатной температуре в течение 5 минут. После блокировки, проводили центрифугирование при 4620×g в течение 20 минут при 4°С, и супернатант культуры удаляли. Полученный в результате осадок суспендировали в растворе для разбавления антитела, меченого коллоидным золотом (10 мМ Боракс, 5% сахарозы и 1% БСА (рН 9,0)), и затем отфильтровывали через 0,1 мкм фильтр.To obtain colloidal gold-labeled Myco-scFv, a gold colloid with a size of 40 nm was used. Myco-scFv was added to colloidal gold (OD = 1) to a concentration of 2.0 μg / ml and was allowed to react at room temperature for 20 minutes. As an antibody binding buffer, 2 mM TES (N-Tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid) (pH 7.5) was used. After colloidal gold labeling, blocking was performed by allowing the reaction to proceed in a buffer containing 2 mM Borax (sodium tetraborate decahydrate) and 1.5 BSA (pH 9.0) at 300 rpm at room temperature for 5 minutes. After blocking, centrifugation was performed at 4620 × g for 20 minutes at 4 ° C, and the culture supernatant was removed. The resulting precipitate was suspended in a dilution solution for colloidal gold labeled antibody (10 mM Borax, 5% sucrose and 1% BSA (pH 9.0)), and then filtered through a 0.1 μm filter.
Анализ проводили следующим образом. После разбавления тестируемого образца, который мог содержать кислотоустойчивые бациллы, экстракционным буфером (72 мМ дигидрата дигидрофосфата натрия, 4,5% бычьего сывороточного альбумина, 0,9% казеина, 0,09% Тритона-Х305, 0,1% азида натрия, 10,0% Y-PER и подходящее количество хлористоводородной кислоты, рН 7,0) добавляли подходящее количество раствора антитела, меченого коллоидным золотом. Полоску, полученную выше, погружали в эту жидкость для проявления тестируемого образца. Через семь минут после начала проявления, полоску удаляли и промывали фосфатным буфером, содержащим поверхностно-активное вещество (0,1% Твин 20) в течение 8 минут, после чего оценку осуществляли невооруженным глазом для определения того, был ли образец положительным или отрицательным.The analysis was carried out as follows. After dilution of the test sample, which could contain acid-resistant bacilli, with extraction buffer (72 mM sodium dihydrogen phosphate dihydrate, 4.5% bovine serum albumin, 0.9% casein, 0.09% Triton-X305, 0.1% sodium azide, 10 , 0% Y-PER and a suitable amount of hydrochloric acid, pH 7.0), a suitable amount of colloidal gold labeled antibody solution was added. The strip obtained above was immersed in this liquid to develop a test sample. Seven minutes after the onset of development, the strip was removed and washed with phosphate buffer containing a surfactant (0.1% Tween 20) for 8 minutes, after which evaluation was performed with the naked eye to determine whether the sample was positive or negative.
(2) Иммунохроматографический метод обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы(2) Immunochromatographic method for the detection of LAM tuberculosis bacillus
Иммунохроматографический тест для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы был сконструирован образом, аналогичным методу построения и методу анализа, описанным выше в (1), за исключением того, что TB-scFv использовали в качестве как иммобилизованного антитела, так и антитела для обнаружения.An immunochromatographic test for the detection of LAM of a tuberculous bacillus was constructed in a manner similar to the construction method and analysis method described in (1) above, except that TB-scFv was used both as an immobilized antibody and an antibody for detection.
(3) Оценка каждого иммунохроматографического метода обнаружения ЛАМ(3) Evaluation of each immunochromatographic method for detecting LAM
Реактивность против ЛАМ в иммунохроматографических тестах для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, сконструированных в (1) и (2), оценивали, используя очищенный ЛАМ M. tuberculosis и ЛАМ M. avium.Reactivity against LAM in immunochromatographic tests for the detection of LAM acid-resistant bacilli and the detection of LAM tuberculosis bacillus constructed in (1) and (2) was evaluated using purified LAM M. tuberculosis and LAM M. avium.
На фиг. 8 показаны результаты.In FIG. 8 shows the results.
ЛАМ M. tuberculosis измеряли посредством иммунохроматографических методов обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы. Линию подтверждали невооруженным глазом в обоих иммунохроматографических тестах (myco: для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл; и ТВ: для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы (Фиг. 8А и 8В). Аналогично, ЛАМ M. avium измеряли, используя обе аналитические системы. Как показано на Фиг. 8С и 8D, в иммунохроматографическом тесте для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, линию, сравнимую с линией, наблюдаемой в анализе ЛАМ M. tuberculosis, подтверждали невооруженным глазом. Напротив, никакую линию не обнаруживали, даже при такой высокой концентрации как 1000 нг/мл, в иммунохроматографическом тесте для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы (ТВ) (Фиг. 8D).LAM of M. tuberculosis was measured by immunochromatographic methods for the detection of LAM of acid-resistant bacilli and the detection of LAM of tuberculosis bacillus. The line was confirmed with the naked eye in both immunochromatographic tests (myco: for detecting LAM of acid-resistant bacilli; and TV: for detecting LAM of tuberculosis bacillus (Figs. 8A and 8B). Similarly, M. avium LAM was measured using both assay systems. As shown in FIG. .8C and 8D, in an immunochromatographic test to detect LAM of acid-resistant bacilli, a line comparable to the line observed in the LAM of M. tuberculosis was confirmed with the naked eye. On the contrary, no line was detected, even at such a
Приведенные выше результаты указывают на то, что одноцепочечное антитело TB-scFv, полученное с использованием БЦЖ-вакцины в качестве иммуногена может специфически обнаруживать туберкулезную бациллу человека (M. Tuberculosis) в иммунохроматографических тестах.The above results indicate that a single-chain antibody TB-scFv obtained using BCG vaccine as an immunogen can specifically detect human tuberculosis bacillus (M. Tuberculosis) in immunochromatographic tests.
Как показано в Примерах 1-4, авторы настоящего изобретения успешно выделили одноцепочечное антитело (scFv (TB-scFv)), которое специфически реагирует с ЛАМ туберкулезной бациллы, и установили систему иммунологического анализа, которая может специфически обнаруживать ЛАМ туберкулезной бациллы посредством измерения ЛАМ с помощью TB-scFv. Аналитическая система с использованием TB-scFv является применимой для ELISA и иммунохроматографических тестов и обеспечивает быструю и простую диагностику туберкулезной инфекции.As shown in Examples 1-4, the inventors have successfully isolated a single chain antibody (scFv (TB-scFv)) that specifically reacts with a LAM of a tuberculosis bacillus and have established an immunological analysis system that can specifically detect a LAM of a tuberculosis bacillus by measuring LAM using TB-scFv. The TB-scFv assay system is applicable for ELISA and immunochromatographic tests and provides quick and easy diagnosis of tuberculosis infection.
Примеры 5-12Examples 5-12
3. Получение материалов3. Receiving materials
(3-1) Получение БЦЖ-вакцины и иммуногена(3-1) Obtaining BCG vaccine and immunogen
В качестве БЦЖ-вакцины, применяли лиофилизированную вакцину БЦЖ (номер авторизации: 20300AMZ00767000), производимую Japan BCG Laboratory. Для иммунизации, использовали смесь из 100 мг (влажной массы) лиофилизированной вакцины БЦЖ и 1 мл физиологического раствора.As a BCG vaccine, a lyophilized BCG vaccine (authorization number: 20300AMZ00767000) manufactured by Japan BCG Laboratory was used. For immunization, a mixture of 100 mg (wet weight) of the lyophilized BCG vaccine and 1 ml of saline was used.
(3-2) Получение библиотеки фагов scFv курицы(3-2) Obtaining chicken scFv phage library
Цыпленка иммунизировали, используя вакцину БЦЖ в качестве иммуногена (см. (3-1) выше и Пример 6). После завершения иммунизации, селезенку иссекали из цыпленка и ткань растворяли в среде RPMI (бессывороточной). Общую РНК экстрагировали, с использованием набора для экстракции РНК (производимого Qiagen) в соответствии с инструкцией по эксплуатации. кДНК синтезировали из общей РНК, используя набор для синтеза кДНК (производимый Invitrogen) в соответствии с инструкцией по эксплуатации.The chicken was immunized using BCG vaccine as an immunogen (see (3-1) above and Example 6). After completion of the immunization, the spleen was excised from the chicken and the tissue was dissolved in RPMI medium (serum free). Total RNA was extracted using an RNA extraction kit (manufactured by Qiagen) in accordance with the instructions for use. cDNA was synthesized from total RNA using a cDNA synthesis kit (manufactured by Invitrogen) in accordance with the instructions for use.
Фрагмента гена VH и гена VL амплифицировали, используя синтезированную кДНК в качестве матрицы, и с использованием праймеров, перечисленных в Таблице 3. Конкретно, амплификацию фрагмента гена VH проводили, используя набор праймеров из Sfi1-CκVH F и GSL-CκVH R, в то время как фрагмент гена VL амплифицировали с использованием набора праймеров GSL-CκVL F и Not1-CκVL R.The VH gene fragment and the VL gene were amplified using the synthesized cDNA as the template and using the primers listed in Table 3. Specifically, the VH gene fragment was amplified using a set of primers from Sfi1-CκVH F and GSL-CκVH R, while as a fragment of the VL gene was amplified using a set of primers GSL-CκVL F and Not1-CκVL R.
Полученные продукты генной амплификации разделяли посредством электрофореза на 1,5% агарозном геле. Продукты генной амплификации желательной молекулярной массы экстрагировали из геля и очищали.The resulting gene amplification products were separated by electrophoresis on a 1.5% agarose gel. Gene amplification products of the desired molecular weight were extracted from the gel and purified.
Очищенный продукт гена VH и очищенный продукт гена VL объединяли, используя GS-линкер (SEQ ID NO:40). CκVL-GSL-VH R (SEQ ID NO:46), имеющий последовательность, гомологичную 3′-концу продукта гена VH, смешивали с геном VH, и ПЦР осуществляли в течение 5 циклов для добавления GS-линкера к 3′-концу гена VH. Аналогично, CκVH-GSL-VL F (SEQ ID NO:45), имеющий последовательность, гомологичную 5′-концу продукта гена VL, смешивали с геном VL, и ПЦР осуществляли в течение 5 циклов для добавления GS-линкера к 5′-концу гена VL. Ген VH с добавленным GS-линкером и ген VL с добавленным GS-линкером смешивали, и ПЦР осуществляли в течение 10 циклов для получения гена scFv (ген scFv курицы), имеющего ген VH, ген GS-линкера и ген VL, соединенные вместе. Окончательно, ген scFv расщепляли с помощью ферментов рестрикции SfiI и NotI.The purified VH gene product and the purified VL gene product were combined using a GS linker (SEQ ID NO: 40). A CκVL-GSL-VH R (SEQ ID NO: 46) having a sequence homologous to the 3′-end of the VH gene product was mixed with the VH gene and PCR was performed for 5 cycles to add a GS linker to the 3′-end of the VH gene . Similarly, CκVH-GSL-VL F (SEQ ID NO: 45) having a sequence homologous to the 5′-end of the VL gene product was mixed with the VL gene and PCR was performed for 5 cycles to add the GS linker to the 5′-end gene VL. The VH gene with the added GS linker and the VL gene with the added GS linker were mixed and PCR was performed for 10 cycles to obtain the scFv gene (chicken scFv gene) having the VH gene, the GS linker gene and the VL gene linked together. Finally, the scFv gene was digested with the restriction enzymes SfiI and NotI.
Последовательно, ген scFv, обработанный рестрикционными ферментами, вводили в сайты SfiI и NotI фагемидного вектора отображения антитела pCANTAB5E и трансформировали в JM109 E. coli посредством электропорации. Трансформант культивировали в течение ночи при 37°C в среде на агаре LB-Amp/Glu (среда LB, содержащая 150 мкг/мл ампициллина, 1% глюкозы и 1,5% агара), и все генерированные колонии собирали.Subsequently, the scFv gene treated with restriction enzymes was introduced into the SfiI and NotI sites of the phagemid antibody mapping vector pCANTAB5E and transformed into E. coli JM109 by electroporation. The transformant was cultured overnight at 37 ° C. in LB-Amp / Glu agar medium (LB medium containing 150 μg / ml ampicillin, 1% glucose and 1.5% agar), and all generated colonies were collected.
После доведения трансформированной E. coli в среде LB до значения поглощения при 600 нм (OD600 нм), равного 0,2, трансформант смешивали с хелперным фагом М13К07 (1012 кое), затем статически культивировали при 37°C в течение 30 минут; и дополнительно культивировали в течение ночи при 37°C в 1 л жидкой среды на агаре LB-Amp/Kan (среда LB, содержащая 150 мкг/мл ампициллина и 100 мкг/л канамицина) с получением библиотеки фагового дисплея scFv курицы.After adjusting the transformed E. coli in LB medium to an absorbance value at 600 nm (OD 600 nm ) of 0.2, the transformant was mixed with the helper phage M13K07 (10 12 cfu), then statically cultured at 37 ° C for 30 minutes; and further cultured overnight at 37 ° C. in 1 L of liquid medium on LB-Amp / Kan agar (LB medium containing 150 μg / ml ampicillin and 100 μg / l kanamycin) to obtain a chicken scFv phage display library.
Окончательно библиотеку фагового дисплея scFv концентрировали в растворе ПЭГ/NaCl и доводили с помощью PBS до концентрации, приблизительно равной 1×1012 кое/мл, и полученную в результате библиотеку применяли для биопэннинга.Finally, the scFv phage display library was concentrated in PEG / NaCl solution and adjusted with PBS to a concentration of approximately 1 × 10 12 cfu / ml, and the resulting library was used for biopanning.
(3-3) Антигенный биопэннинг с использованием библиотеки scFv курицы(3-3) Antigenic biopanning using chicken scFv library
Антигенный биопэннинг осуществляли в четыре стадии, состоящих из стадий 1-4.Antigenic biopanning was carried out in four stages, consisting of stages 1-4.
На стадиях 1-3, клоны фага, связанные с иммуногеном (БЦЖ-вакцина) концентрировали. Библиотеку фагового дисплея scFv курицы, доведенную до концентрации 1×1011 кое/500 мкл реакционным буфером (Трис-буфер с рН 7,8, содержащий 1% БСА, 1% снятого молока, 0,14 М NaCl и 0,1% Твин 20) (см. (3-2) из “3. Получение материалов”), смешивали с 1 мг БЦЖ-вакцины и обеспечивали реакцию при 25°С в течение 2 часов. После реакции, клетки собирали центрифугированием (при 10000 об/мин в течение 10 минут), и супернатант культуры удаляли. После добавления PBS к собранным клетках и смешивания, клетки собирали повторно центрифугированием для промывки клеток. Операцию промывки проводили 5 раз. Фаги, связанные с клетками, элюировали 500 мкл элюента (раствор 0,1 N HCl, содержащий 0,1% БСА, и доведенный до рН 2,2 раствором 1М глицина), и нейтрализовали добавлением 500 мкл нейтрализационной жидкости (1М Трис-буфер, рН 9,1). Нейтрализованный пул фага инфицировали E. coli JM109, и культивировали при 37°С в среде на агаре LB-Amp/Glu в течение ночи; и колонии собирали. После того, как трансформированную E. coli, полученную в среде LB, с OD600 нм = 0,2, и хелперный фаг М13К07 (1012 кое) статически культивировали в течение 30 минут, добавляли 100 мл жидкой среды LB-Amp/Kan, и клетки культивировали при 37°С в течение ночи. Культуру фага концентрировали в растворе ПЭГ/NaCl и доводили до концентрации приблизительно 1×1012 кое/мл фосфатным буфером. Биопэннинг на клетках проводили 3 раза.At stages 1-3, phage clones associated with the immunogen (BCG vaccine) were concentrated. Chicken scFv phage display library adjusted to a concentration of 1 × 10 11 cfu / 500 μl reaction buffer (Tris buffer, pH 7.8, containing 1% BSA, 1% skim milk, 0.14 M NaCl and 0.1% Tween 20) (see (3-2) of “3. Preparation of materials”), mixed with 1 mg of BCG vaccine and provided a reaction at 25 ° C for 2 hours. After the reaction, the cells were collected by centrifugation (at 10,000 rpm for 10 minutes), and the culture supernatant was removed. After adding PBS to the harvested cells and mixing, the cells were re-centrifuged to wash the cells. The washing operation was carried out 5 times. Cell-associated phages were eluted with 500 μl of eluent (0.1 N HCl solution containing 0.1% BSA and adjusted to pH 2.2 with 1M glycine solution) and neutralized by adding 500 μl of neutralization liquid (1M Tris buffer, pH 9.1). The neutralized pool of phage was infected with E. coli JM109, and cultured at 37 ° C in LB-Amp / Glu agar medium overnight; and the colonies were collected. After the transformed E. coli obtained in LB medium with OD 600 nm = 0.2 and the helper phage M13K07 (10 12 cfu) were statically cultured for 30 minutes, 100 ml of LB-Amp / Kan liquid medium was added. and the cells were cultured at 37 ° C. overnight. The phage culture was concentrated in a PEG / NaCl solution and adjusted to a concentration of approximately 1 × 10 12 cfu / ml with phosphate buffer. Cell biopanning was performed 3 times.
На стадии 4 очищенный ЛАМ M. tuberculosis реагировал с иммобилизованным на планшете ТВ-scFv и биопэннинг осуществляли, используя комплекс ТВ-scFv и ЛАМ. Конкретно, 10 мкг очищенного ЛАМ M. tuberculosis добавляли в микротитровальный планшет с иммобилизованным на нем ТВ-scFv при концентрации 5 мкг/мл, и обеспечивали протекание реакции при 25°С в течение 1 часа. После промывки, добавляли пул фага, связанный с клетками, полученными на стадии 3, и обеспечивали протекание реакции при 25°С в течение 2 часов. Последовательно, непрореагировавшие фаги удаляли промывкой реакционным буфером 10 раз. Фаг, связанный с комплесом ТВ-scFv и ЛАМ, элюировали 100 мкл элюента и затем нейтрализовали добавлением 100 мкл жидкости для нейтрализации (1М Трис-буфер, рН 9,1). Нейтрализованный пул фага инфицировали E. coli JM109, и культивировали при 37°С в среде на агаре LB-Amp/Glu в течение ночи.At
(3-4) Селекция ЛАМ-связывающего клона scFv курицы(3-4) Selection of LAM-binding chicken scFv clone
Для ЛАМ-связывающего scFv клоны фага, которые специфически реагировали с ЛАМ, были подвергнуты селекции с использованием ELISA фагов. Пул фага, полученный на стадии 4 антигенного биопэннинга с использованием библиотеки scFv курицы, объясненный в (3-3), культивировали в виде одиночной колонии, и полученную одиночную колонию культивировали в 50 мкл среды LB-Amp при 37°С в течение 8 часов. После инфицирования клеток 50 мкл раствора хелперного фага M13K07 (1012 кое/мл), добавляли 400 мкл жидкой среды LB-Amp/Kan и культивировали при 37°С в течение ночи для получения культуры клонов одиночного фага.For LAM-binding scFv phage clones that specifically reacted with LAM were selected using phage ELISA. The phage pool obtained in
ELISA фага осуществляли добавлением 10 мкл очищенного ЛАМ M. tuberculosis в микротитровальный планшет с иммобилизованным на нем ТВ-scFv при концентрации 5 мкг/мл, обеспечивая протекание реакции при 25°С в течение 1 часа для получения комплекса ТВ-scFv и ЛАМ, и проводя скрининг клонов, способных реагировать с комплексом. Первичную реакцию осуществляли посредством добавления 90 мкл реакционного буфера (фосфатный буфер, содержащий 1% БСА, 1% снятого молока, и 0,05% Твина 20) и 10 мкл культуры фагового дисплея scFv в планшет с иммобилизованным ЛАМ, и обеспечения протекания реакции при 25°С в течение 1 часа. Последовательно, непрореагировавшие фаги удаляли промывкой 3 раза. Вторичную реакцию осуществляли добавлением к раствору первичной реакции 100 мкл HRP-меченого антитела против-белка р8 фага М13, разбавленного 5000-кратно таким же реакционным буфером, как и выше, и обеспечивая протекание реакции при 25°С в течение 1 часа. Последовательно, непрореагировавшие антитела удаляли промывкой 3 раза. Реакцию проявления цвета осуществляли добавлением 100 мкл раствора TMB к продукту вторичной реакции, и обеспечивая протекание реакции при комнатной температуре в течение 10 минут. После проявления цвета, к ней добавляли 100 мкл раствора 1 н серной кислоты для остановки реакции. Обнаружение осуществляли посредством измерения поглощения (OD450-650 нм) при длинах волн 450-650 нм.Phage ELISA was carried out by adding 10 μl of purified M. tuberculosis LAM to a microtiter plate with TB-scFv immobilized on it at a concentration of 5 μg / ml, providing a reaction at 25 ° C for 1 hour to obtain a TB-scFv and LAM complex, and screening for clones capable of reacting with the complex. The initial reaction was carried out by adding 90 μl of the reaction buffer (phosphate buffer containing 1% BSA, 1% skimmed milk, and 0.05% Tween 20) and 10 μl of the scFv phage display culture to the immobilized LAM plate and allowing the reaction to proceed at 25 ° C for 1 hour. Subsequently, unreacted phages were removed by washing 3 times. The secondary reaction was carried out by adding 100 μl of the HRP-labeled anti-p8 anti-protein of phage M13 to the primary reaction solution, diluted 5,000-fold with the same reaction buffer as above, and allowing the reaction to proceed at 25 ° С for 1 hour. Consistently, unreacted antibodies were removed by washing 3 times. The color development reaction was carried out by adding 100 μl of a TMB solution to the product of the secondary reaction, and allowing the reaction to proceed at room temperature for 10 minutes. After color development, 100 μl of a solution of 1 N sulfuric acid was added to stop the reaction. Detection was carried out by measuring absorbance (OD 450-650 nm ) at wavelengths of 450-650 nm.
Клон, реактивный к ЛАМ подвергали ПЦР для амплификации гена scFv, и последовательность гена определяли методом прямого секвенирования.A LAM reactive clone was subjected to PCR to amplify the scFv gene, and the gene sequence was determined by direct sequencing.
(3-5) Образцы, используемые для оценки ELISA с использованием бивалентного антитела(3-5) Samples Used for Evaluation of ELISA Using a Bivalent Antibody
ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы с использованием бивалентных антител оценивали, используя клинические изоляты кислотоустойчивых бацилл (38 штаммов M. tuberculosis, 23 штамма M. avium и 6 штаммов M. intracellulare), БЦЖ, шесть типов бактерий полости рта (N. asteroides, N. farcinica, S. globisporus, C. albicans, A. israelii и T. paurometabolum) и образцы мокроты (54 образца). Все экстракции ЛАМ из культиврованных бактериальных клеток и из образцов мокроты осуществляли при одинаковых условиях. После добавления NaOH к каждому образцу до конечной концентрации, равной 0,4 М и смешивания, смесь кипятили в течение 30 минут. После кипячения, смесь нейтрализовали добавлением фосфатного буфера.ELISA for detecting LAM of acid-resistant bacilli and ELISA for detecting LAM of tuberculosis bacilli using bivalent antibodies were evaluated using clinical isolates of acid-resistant bacilli (38 strains of M. tuberculosis, 23 strains of M. avium and 6 strains of M. intracellulare), BCG, six types of cavity bacteria mouth (N. asteroides, N. farcinica, S. globisporus, C. albicans, A. israelii and T. paurometabolum) and sputum samples (54 samples). All LAM extractions from cultured bacterial cells and from sputum samples were performed under the same conditions. After adding NaOH to each sample to a final concentration of 0.4 M and mixing, the mixture was boiled for 30 minutes. After boiling, the mixture was neutralized by the addition of phosphate buffer.
4. Анализ4. Analysis
(4-1) Получение бивалентного антитела(4-1) Obtaining a Bivalent Antibody
Одноцепочечное антитело scFvA было модифицировано в бивалентное антитело посредством общепринятого метода. Гены областей VH и VL были клонированы из Myco-scFv (SEQ ID NO:30), TB-scFv (SEQ ID NO:12) и G3-scFv (SEQ ID NO:39) в векторы экспрессии клеток млекопитающих, имеющие константную кроличью область (торговые наименования pFUSEss-CHIg-rG*03 и pFUSE2ss-CLIg-rk1, производимые InvivoGen) для получения векторов экспрессии VH и VL. Экспрессионные векторы VH и VL смешивали и трансфицировали в клетки СНО. После культивирования вектор-трансфицированных клеток в течение 4 дней, бивалентные антитела (бивалентное Myco-scFv, бивалентное TB-scFv и бивалентное G3-scFv) были выделены и очищены от супернатантов с использованием белка А (производимого Bio-Rad).The single-chain scFvA antibody has been modified into a bivalent antibody by a conventional method. The genes of the VH and VL regions were cloned from Myco-scFv (SEQ ID NO: 30), TB-scFv (SEQ ID NO: 12) and G3-scFv (SEQ ID NO: 39) into mammalian cell expression vectors having a constant rabbit region (trade names pFUSEss-CHIg-rG * 03 and pFUSE2ss-CLIg-rk1 manufactured by InvivoGen) to obtain VH and VL expression vectors. The expression vectors VH and VL were mixed and transfected into CHO cells. After culturing the vector-transfected cells for 4 days, bivalent antibodies (bivalent Myco-scFv, bivalent TB-scFv and bivalent G3-scFv) were isolated and purified from supernatants using protein A (produced by Bio-Rad).
(4-2) Мечение бивалентного антитела биотином(4-2) Labeling a Bivalent Antibody with Biotin
Мечение биотином каждого бивалентного антитела осуществляли с использованием набора для мечения Sulfo-NHS-LC-Biotin от Pierce, в соответствии с инструкцией по эксплуатации, приложенной к набору. Биотин-меченое антитело использовали для конструирования системы ELISA.Biotin labeling of each bivalent antibody was performed using the Sulfo-NHS-LC-Biotin labeling kit from Pierce, in accordance with the operating instructions attached to the kit. Biotin-labeled antibody was used to construct the ELISA system.
(4-3) Конструкция ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл с использованием бивалентного антитела(4-3) ELISA Design for the Detection of LAM Acid-Resistant Bacilli Using a Bivalent Antibody
ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл с использованием бивалентных антител был сконструирован с применением, бивалентного TB-scFv, бивалентного G3-scFv и бивалентного Myco-scFv (см. (4-1) “Получение бивалентного антитела”).An ELISA for the detection of LAM of acid-resistant bacilli using bivalent antibodies was constructed using bivalent TB-scFv, bivalent G3-scFv and bivalent Myco-scFv (see (4-1) “Preparation of Bivalent Antibodies”).
Бивалентное TB-scFv и бивалентное G3-scFv смешивали в равных количествах и доводили до концентрации 5 мкг/мл фосфатным буфером. Полученную в результате смесь добавляли в 96-луночный микропланшет при пропорции, равной 100 мкл/лунку, и обеспечивали протекание реакции при 4°С в течение ночи, после чего проводили блокирование в фосфатном буфере, содержащем 1% снятого молока, таким образом, получая планшет с иммобилизованными на нем антителами.Bivalent TB-scFv and bivalent G3-scFv were mixed in equal amounts and adjusted to a concentration of 5 μg / ml with phosphate buffer. The resulting mixture was added to a 96-well microplate at a ratio of 100 μl / well and the reaction was allowed to proceed at 4 ° C. overnight, after which it was blocked in phosphate buffer containing 1% skimmed milk, thereby obtaining a plate with antibodies immobilized on it.
Первичную реакцию осуществляли посредством добавления 100 мкл образца, разбавленного реакционным буфером (Трис-буфер, содержащий 1% БСА, 1% снятого молока, 0,14 М NaCl и 0,1% Твин 20) в лунки указанного выше планшета с антителами, и обеспечения протекания реакции при 25°С в течение 1 часа и 30 минут. Далее, планшет промывали 3 раза. Вторичную реакцию осуществляли добавлением к раствору первичной реакции 100 мкл биотин-меченого бивалентного Myco-scFv, разбавленного 5000-кратно тем же реакционным буфером, что и выше, и обеспечивая протекание реакции при 25°С в течение 1 часа и 30 минут. Последовательно, непрореагировавшие антитела удаляли промывкой 3 раза. Третичную реакцию осуществляли, добавляя к раствору вторичной реакции 100 мкл авидин-меченого HRP, разбавленного 10000-кратно тем же реакционным буфером, что и выше, и обеспечивая протекание реакции при 25°С в течение 1 часа и 30 минут. Последовательно, непрореагировавшее авидин-меченое HRP удаляли промывкой 3 раза. Реакцию проявления цвета осуществляли добавлением 100 мкл раствора TMB к раствору третичной реакции, и обеспечивая протекание реакции при комнатной температуре в течение 10 минут. После проявления цвета, добавляли 100 мкл раствора 1N серной кислоты для остановки реакции. Обнаружение проводили посредством измерения поглощения (OD450-650 нм) при длинах волн 450-650 нм.The initial reaction was carried out by adding 100 μl of a sample diluted with reaction buffer (Tris buffer containing 1% BSA, 1% skim milk, 0.14 M NaCl and 0.1% Tween 20) to the wells of the above antibody plate and providing the reaction at 25 ° C for 1 hour and 30 minutes. Next, the tablet was washed 3 times. The secondary reaction was carried out by adding 100 μl of biotin-labeled bivalent Myco-scFv to the primary reaction solution, diluted 5000-fold with the same reaction buffer as above, and allowing the reaction to proceed at 25 ° С for 1 hour and 30 minutes. Consistently, unreacted antibodies were removed by washing 3 times. The tertiary reaction was carried out by adding to the
(4-4) Конструкция ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы с использованием бивалентного антитела(4-4) ELISA construct for detecting LAM of a tuberculosis bacillus using a bivalent antibody
ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы с использованием бивалентных антител был сконструирован таким же образом, как и ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, описанный в (4-3) выше, за исключением того, что бивалентное TB-scFv использовали в качестве иммобилизованного антитела, а биотин-меченое бивалентное Myco-scFv применяли в качестве антитела для обнаружения.An ELISA for detecting LAM of a tuberculosis bacillus using bivalent antibodies was constructed in the same way as an ELISA for detecting LAM of acid-resistant bacilli described in (4-3) above, except that bivalent TB-scFv was used as an immobilized antibody, and Biotin-labeled bivalent Myco-scFv was used as an antibody for detection.
Пример 5. Иммунизация цыплят и оценка титра антител куриной антисыворотки против ЛАМExample 5. Immunization of chickens and assessment of antibody titer of chicken antiserum against LAM
Иммунизацию цыплят проводили через подкожную иммунизацию полного количества БЦЖ-вакцины (100 мг чистой массы/1 мл физиологического раствора), полученной посредством способа, описанного в (3-1) из “3. Подготовка материалов”. Иммунизацию проводили 4 раза с 14-дневными интервалами, и титр антител в крови цыплят оценивали посредством ELISA.The chickens were immunized via subcutaneous immunization of the full amount of BCG vaccine (100 mg net weight / 1 ml saline) obtained by the method described in (3-1) from “3. Preparation of materials. ” Immunization was performed 4 times at 14-day intervals, and the antibody titer in the blood of chickens was evaluated by ELISA.
Очищенный ЛАМ туберкулезной бациллы человека M. tuberculosis (полученный из штамма Aoyama B, Nacalai Tesque) или очищенный ЛАМ нетуберкулезной кислотоустойчивой бациллы M. avium (полученный из штамма серотипа В, Nacalai Tesque) доводили с помощью PBS до концентрации 100 мкл/мл. Раствор ЛАМ добавляли в 96-луночный микропланшет в количестве, равном 100 мкл/лунку и давали возможность реагировать в течение ночи при 4°С, и проводили блокирование в фосфатном буфере, содержащем 1% снятого молока, для получения антигенного планшета.Purified LAM of human tuberculosis bacillus M. tuberculosis (obtained from Aoyama B strain, Nacalai Tesque strain) or purified LAM of non-tuberculous acid-resistant M. avium bacillus (obtained from serotype B strain, Nacalai Tesque) was adjusted with PBS to a concentration of 100 μl / ml. A LAM solution was added to a 96-well microplate in an amount of 100 μl / well and allowed to react overnight at 4 ° C., and blocking was performed in phosphate buffer containing 1% skim milk to obtain an antigenic plate.
Первичную реакцию осуществляли посредством добавления 100 мкл куриной сыворотки, разбавленной реакционным буфером (Трис-буфер с рН 7,8, содержащим 1% БСА, 1% снятого молока, 0,14 М NaCl и 0,1% Твин 20) в каждую лунку антигенного планшета, и обеспечивая протекание реакции при 25°С в течение 1 часа. Последовательно, непрореагировавшие антитела удаляли промывкой 3 раза. Вторичную реакцию осуществляли добавлением к раствору первичной реакции, 100 мкл HRP-меченого против-куриного IgY, разбавленного 5000-кратно тем же самым реакционным буфером, и обеспечивая протекание реакции при 25°С в течение 1 часа. Последовательно, непрореагировавшие антитела удаляли промывкой 3 раза. Реакцию проявления цвета осуществляли добавлением 100 мкл раствора TMB к продукту вторичной реакции, и обеспечивая протекание реакции при комнатной температуре в течение 10 минут. После проявления цвета, реакцию останавливали добавлением 100 мкл раствора 1N серной кислоты. Обнаружение осуществляли посредством измерения поглощения при длинах волн 450-650 нм (OD450-650 нм).The initial reaction was carried out by adding 100 μl of chicken serum diluted with reaction buffer (Tris buffer, pH 7.8, containing 1% BSA, 1% skim milk, 0.14 M NaCl and 0.1% Tween 20) to each well of antigenic tablet, and providing the reaction at 25 ° C for 1 hour. Consistently, unreacted antibodies were removed by washing 3 times. The secondary reaction was carried out by adding to the solution of the primary reaction, 100 μl of HRP-labeled anti-chicken IgY diluted 5000-fold with the same reaction buffer, and allowing the reaction to proceed at 25 ° C for 1 hour. Consistently, unreacted antibodies were removed by washing 3 times. The color development reaction was carried out by adding 100 μl of a TMB solution to the product of the secondary reaction, and allowing the reaction to proceed at room temperature for 10 minutes. After color development, the reaction was stopped by adding 100 μl of a 1N sulfuric acid solution. Detection was carried out by measuring absorbance at wavelengths of 450-650 nm (OD 450-650 nm ).
Результаты показаны на Фиг. 9. На чертеже “-■-” представляет реактивность куриной антисыворотки к очищенному ЛАМ M. tuberculosis, а “-●-” представляет реактивность куриной антисыворотки к очищенному ЛАМ M. avium. Как показано на Фиг. 9, было подтверждено, что иммунизация цыплят БЦЖ-вакциной в достаточной степени увеличивала титр антител против ЛАМ. В дополнение, аналогичную реактивность наблюдали как к ЛАМ туберкулезной бациллы, так и ЛАМ кислотоустойчивых бацилл.The results are shown in FIG. 9. In the drawing, “- ■ -” represents the reactivity of the chicken antiserum to purified LAM of M. tuberculosis, and “- ● -” represents the reactivity of the chicken antiserum to purified LAM of M. avium. As shown in FIG. 9, it was confirmed that immunization of chickens with BCG vaccine sufficiently increased the titer of antibodies against LAM. In addition, a similar reactivity was observed for both LAM of the tuberculosis bacillus and LAM of acid-resistant bacilli.
Пример 6. Получение куриного scFv (одноцепочечные антитела) против ЛАМExample 6. Obtaining chicken scFv (single chain antibodies) against LAM
(1) Получение куриного scFv (одноцепочечные антитела) против ЛАМ(1) Obtaining chicken scFv (single chain antibodies) against LAM
Одноцепочечные антитело scFv было выделено из клеток селезенки цыплят, иммунизированных с использованием БЦЖ-вакцины. Конкретно, в соответствии с методом, описанным в (3-2) из “3. Подготовка материалов”, общую РНК получали из селезенки цыплят, и ПЦР осуществляли, используя кДНК, синтезированную из общей РНК в качестве матрицы и разнообразные праймеры, описанные в Таблице 3, для получения продуктов амплификации гена VH и продуктов амплификации гена VL. Далее, получали одноцепочечные антитела курицы (ген VH/GS-линкер/ген VL), каждое имеющее ген VH и ген VL, объединенные вместе через GS-линкер (SEQ ID NO:40), и из них получали библиотеки фагового дисплея scFv. Поскольку титр каждой библиотеки составлял приблизительно 106 кое, предполагали, что каждая библиотека имела диверсифицирование, равное 106.The single-chain scFv antibody was isolated from chicken spleen cells immunized with BCG vaccine. Specifically, in accordance with the method described in (3-2) of “3. Preparation of Materials ”, total RNA was obtained from chickens spleen, and PCR was performed using cDNA synthesized from total RNA as a template and various primers described in Table 3 to obtain amplification products of the VH gene and amplification products of the VL gene. Next, chicken single chain antibodies (VH / GS linker / VL gene) were prepared, each having the VH gene and VL gene combined together through a GS linker (SEQ ID NO: 40), and scFv phage display libraries were obtained from them. Since the title of each library was approximately 10 6 cfu, it was assumed that each library had a diversification of 10 6 .
Используя полученные библиотеки фагового дисплея scFv, биопэннинг проводили 3 раза с БЦЖ-вакциной. С целью выделения одноцепочечные антитела scFv, которое распознает эпитоп, который отличается от эпитопа TB-scFv, для четвертого биопэннинга применяли комплекс, образованный посредством реакции ЛАМ M. tuberculosis (полученной из штамма Аояма В) с TB-scFv, которое было иммобилизовано на микропланшете. Обеспечивали реакцию раствора ЛАМ M. tuberculosis на микропланшете, имеющем иммобилизованное на нем TB-scFv, микропланшет промывали 3 раза, к нему добавляли пул фагов пэннинга БЦЖ, и обеспечивали протекание реакции при 25°С в течение 2 часов. После реакции, микропланшет промывали 3 раза, и ЛАМ-связывающие фаги элюировали. В конечном счете, 200 клонов были статистически выбраны из пула пэннинга, и был проведен скрининг клонов, реактивных к ЛАМ, с использованием комплекса TB-scFv и ЛАМ. Приблизительно 10 ЛАМ-реактивных клонов были получены из каждой библиотеки. В результате анализа последовательности оснований, было подтверждено, что последовательности клонов, полученных из каждой библиотеки, были почти идентичными.Using the obtained scFv phage display libraries, biopanning was performed 3 times with BCG vaccine. In order to isolate single-chain scFv antibodies that recognize an epitope that is different from the TB-scFv epitope, a complex formed by the LAM reaction of M. tuberculosis (obtained from Aoyama B strain) with TB-scFv that was immobilized on a microplate was used for the fourth biopanning. The LAM solution of M. tuberculosis was provided on a microplate having TB-scFv immobilized on it, the microplate was washed 3 times, a pool of BCG panning phages was added to it, and the reaction was allowed to proceed at 25 ° C for 2 hours. After the reaction, the microplate was washed 3 times, and LAM-binding phages were eluted. Ultimately, 200 clones were statistically selected from the panning pool, and LAM reactive clones were screened using the TB-scFv and LAM complex. Approximately 10 LAM-reactive clones were obtained from each library. As a result of the analysis of the base sequence, it was confirmed that the sequence of clones obtained from each library were almost identical.
В результате, одиночный клон scFv одноцепочечного антитела (G3-scFv) был успешно выделен из библиотеки фагового дисплея scFv, полученной из клеток селезенки цыплят, иммунизированных с использованием БЦЖ-вакцины. Фиг. 10 показывает аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:39) одноцепочечного антитела G3-scFv, выделенного из библиотеки клеток селезенки цыплят, вместе с положениями областей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи; GS-линкера; и областей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи.As a result, a single scFv clone of a single chain antibody (G3-scFv) was successfully isolated from a scFv phage display library obtained from spleen cells of chickens immunized with BCG vaccine. FIG. 10 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 39) of a single chain G3-scFv antibody isolated from a chicken spleen cell library, together with the positions of the heavy chain variable region CDR1, CDR2, and CDR3 regions; GS linker; and regions of CDR1, CDR2 and CDR3 of the variable region of the light chain.
(2) Реактивность куриного scFv (одноцепочечные антитела) к ЛАМ(2) Reactivity of chicken scFv (single chain antibodies) to LAM
Реактивность полученного G3-scFv, как описано выше, к ЛАМ оценивали, используя планшет, на котором был иммобилизован очищенный ЛАМ M. tuberculosis, и планшет, на котором был иммобилизован очищенный ЛАМ M.avium. Конкретно, G3-scFv солюбилизировали в соответствии со способом, описанным в (1-6) из “1. Получение материалов” для получения солюбилизированного G3-scFv. Затем мечение биотином проводили в соответствии со способом, описанным в (1-7) из того же раздела; и реактивность к антигенным планшетам (микротитровальным планшетам с иммобилизованным очищенным ЛАМ), т.е. планшету, на котором был иммобилизован очищенный ЛАМ M. tuberculosis, и планшету, на котором был иммобилизован очищенный ЛАМ M. avium, оценивали посредством анализа методом ELISA.The reactivity of the obtained G3-scFv, as described above, to LAM was evaluated using a plate on which the purified M. tuberculosis LAM was immobilized, and a plate on which the purified M.avium LAM was immobilized. Specifically, G3-scFv was solubilized in accordance with the method described in (1-6) of “1. Preparation of Materials ”to obtain solubilized G3-scFv. Then biotin labeling was carried out in accordance with the method described in (1-7) from the same section; and reactivity to antigenic plates (microtiter plates with immobilized purified LAM), i.e. a tablet on which the purified M. tuberculosis LAM was immobilized, and a tablet on which the purified M. avium LAM was immobilized, was evaluated by ELISA.
В результате, G3-scFv проявлял аналогичную реактивность как к ЛАМ туберкулезной бациллы, так и ЛАМ кислотоустойчивых бацилл. Исходя из данного результата, был сделан вывод, что одноцепочечное антитело G3-scFv курицы является антителом, имеющим реактивность против ЛАМ кислотоустойчивых бацилл в целом, включая ЛАМ туберкулезной бациллы.As a result, G3-scFv showed similar reactivity to both LAM tuberculosis bacilli and LAM acid-resistant bacilli. Based on this result, it was concluded that the single-chain chicken G3-scFv antibody is an antibody having reactivity against LAM of acid-resistant bacilli in general, including LAM of tuberculosis bacillus.
Пример 7. Конструкция ELISA для обнаружения ЛАМ с использованием бивалентных антителExample 7. Construction of an ELISA for the detection of LAM using bivalent antibodies
Имея намерение довести настоящее изобретение до практического применения, три типа одноцепочечных антител scFv (Myco-scFv, TB-scFv и G3-scFv), полученные в Примерах 1 и 6, модифицировали в бивалентные антитела в соответствии с методом, описанным в (4-1) из “Получение бивалентного антитела”, и два типа ELISA, ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бактерий и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, были сконструированы на основании реакционной специфичности бивалентных антител. Конкретно, в случае ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бактерий, бивалентное TB-scFv и бивалентное G3-scFv смешивали и иммобилизовывали на планшете в качестве иммобилизованных антител, а бивалентное Myco-scFv, которое было мечено биотином, использовали в качестве антитела для обнаружения. В случае ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, бивалентное TB-scFv было иммобилизовано на планшете в качестве иммобилизованного антитела, а бивалентное Myco-scFv, которое было мечено биотином, использовали в качестве антитела для обнаружения. Подробности иммобилизации описаны в (4-3) и (4-4) из “4. Анализ”.Intending to bring the present invention to practical use, the three types of scFv single chain antibodies (Myco-scFv, TB-scFv and G3-scFv) obtained in Examples 1 and 6 were modified into bivalent antibodies in accordance with the method described in (4-1 ) from “Obtaining a Bivalent Antibody”, and two types of ELISA, ELISA for detecting LAM of acid-resistant bacteria and ELISA for detecting LAM of tuberculosis bacillus, were constructed based on the reactive specificity of bivalent antibodies. Specifically, in an ELISA for detecting LAM of acid-resistant bacteria, bivalent TB-scFv and bivalent G3-scFv were mixed and immobilized on a plate as immobilized antibodies, and the bivalent Myco-scFv, which was labeled with biotin, was used as an antibody for detection. In an ELISA for detecting LAM of a tuberculous bacillus, bivalent TB-scFv was immobilized on a plate as an immobilized antibody, and bivalent Myco-scFv, which was labeled with biotin, was used as an antibody for detection. Details of immobilization are described in (4-3) and (4-4) of “4. Analysis".
Оценку сконструированных ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бактерий и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы проводили посредством анализа ЛАМ, экстрагированного из культивированных бактериальных клеток БЦЖ (Фиг. 11). В результате, как показано на Фиг. 11, как при проведении ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бактерий (-■-), так и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы (-●-), было возможно обнаружить ЛАМ БЦЖ с эквивалентной чувствительностью.The designed ELISA for the detection of LAM of acid-resistant bacteria and the ELISA for the detection of LAM of a tuberculous bacillus were evaluated by analysis of a LAM extracted from cultured BCG bacterial cells (Fig. 11). As a result, as shown in FIG. 11, both when conducting an ELISA to detect LAM of acid-resistant bacteria (- ■ -) and an ELISA to detect LAM of tuberculosis bacillus (- ● -), it was possible to detect LAM of BCG with equivalent sensitivity.
Пример 8. Оценка чувствительности обнаружения при обнаружении ЛАМ методом ELISA с использованием бивалентных антителExample 8. Evaluation of detection sensitivity when detecting LAM by ELISA using bivalent antibodies
Чтобы провести оценку чувствительности ELISA с использованием бивалентных антител, культивированные бактериальные клетки БЦЖ разбавляли в ряде от 106 кое/мл до 61 кое/мл, и часть каждого из растворов разбавления применяли для экстракции геномной ДНК для осуществления теста с амплификацией нуклеиновой кислоты (NAAT), а еще одну их часть применяли для экстракции ЛАМ для осуществления ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бактерий.To evaluate ELISA sensitivity using bivalent antibodies, cultured BCG bacterial cells were diluted in a range of 10 6 cfu / ml to 61 cfu / ml, and part of each dilution solution was used to extract genomic DNA to perform a nucleic acid amplification test (NAAT) , and another part was used for the extraction of LAM for the implementation of ELISA for the detection of LAM acid-resistant bacteria.
Результат ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бактерий показан на фиг. 12. Как видно из таблицы на Фиг. 12, чувствительность обнаружения теста с амплификацией нуклеиновой кислоты (NAAT) составляла приблизительно 500 кое/мл, в то время как чувствительность обнаружения ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бактерий составляла приблизительно 250 кое/мл. Повторяющаяся последовательность, которая является мишенью теста с амплификацией нуклеиновой кислоты, является различной, в зависимости от бактериального штамма с точки зрения числа повторов, и утверждают, что чувствительность обнаружения может быть различной в зависимости от бактериального штамма. Несмотря на то что чувствительность генетического тестирования была низкой, поскольку повторяющаяся последовательность в БЦЖ является небольшой, утверждают, что бактериальный штамм, имеющий большую повторяющуюся последовательность, как правило, приводит в результате к чувствительности обнаружения, равной 100 кое/мл.The ELISA result for the detection of acid resistant bacteria LAM is shown in FIG. 12. As can be seen from the table in FIG. 12, the detection sensitivity of the nucleic acid amplification test (NAAT) was approximately 500 cfu / ml, while the ELISA detection sensitivity for the detection of acid-resistant bacteria LAM was approximately 250 cfu / ml. The repeating sequence that is the target of the nucleic acid amplification test is different, depending on the bacterial strain in terms of the number of repeats, and it is stated that the detection sensitivity may be different depending on the bacterial strain. Although the sensitivity of genetic testing was low because the repeating sequence in BCG is small, it is argued that a bacterial strain having a large repeating sequence typically results in a detection sensitivity of 100 cfu / ml.
Имея результат, описанный выше, было доказано, что ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бактерий с использованием бивалентных антител по настоящему изобретению является очень высокочувствительным методом иммунологического анализа с чувствительностью обнаружения, которая является эквивалентной или более высокой, чем чувствительность обнаружения теста с амплификацией нуклеиновой кислоты.Having the result described above, it was proved that an ELISA for the detection of LAM acid-resistant bacteria using bivalent antibodies of the present invention is a very highly sensitive method of immunological analysis with a detection sensitivity that is equivalent to or higher than the detection sensitivity of a nucleic acid amplification test.
Пример 9. Тест на перекрестную реактивность при обнаружении ЛАМ методом ELISA с использованием бивалентных антителExample 9. Test for cross-reactivity in the detection of LAM by ELISA using bivalent antibodies
У бактерий полости рта, существуют виды, которые имеют мембранный антиген со структурой, сходной с компонентом ЛАМ. Когда нужно обнаружить ЛАМ кислотоустойчивых бактерий и ЛАМ туберкулезной бациллы в образце мокроты, перекрестная реактивность с этими бактериями полости рта становится очень проблематичной, и это является одним из препятствий для установления иммунологического анализа для обнаружения кислотоустойчивых бактерий и туберкулезной бациллы с использованием мокроты.In oral bacteria, there are species that have a membrane antigen with a structure similar to the LAM component. When it is necessary to detect LAM of acid-resistant bacteria and LAM of tuberculosis bacillus in a sputum sample, cross-reactivity with these oral bacteria becomes very problematic, and this is one of the barriers to establishing an immunological analysis for the detection of acid-resistant bacteria and tuberculosis bacilli using sputum.
В настоящем описании, для исследования перекрестной реактивности к бактериям полости рта при обнаружении ЛАМ методом ELISA, получали жидкие культуры каждого из N. asteroides (сокращаемого как “Na”), N. farcinica (сокращаемого как “Nf”), S. globisporus (сокращаемого как “Sg”), C. albicans (сокращаемого как “Ca”), A. israelii (сокращаемого как “Ai”) и T. paurometabolum (сокращаемого как “Tp”). Жидкие культуры доводили до 106 кое/мл и 108 кое/мл (107 кое/мл только для Ca), и из них экстрагировали ЛАМ, как из культивируемых бактериальных клеток БЦЖ для анализа обнаружения ЛАМ методом ELISA.In the present description, to study the cross-reactivity to oral bacteria when LAM was detected by ELISA, liquid cultures of each of N. asteroides (abbreviated as “Na”), N. farcinica (abbreviated as “Nf”), S. globisporus (abbreviated as “Sg”), C. albicans (abbreviated as “Ca”), A. israelii (abbreviated as “Ai”) and T. paurometabolum (abbreviated as “Tp”). Liquid cultures were adjusted to 10 6 cfu / ml and 10 8 cfu / ml (10 7 cfu / ml only for Ca), and LAM was extracted from them, as from cultured BCG bacterial cells for analysis of LAM detection by ELISA.
Как может быть понятно из Фиг. 13, хотя реактивность БЦЖ, используемой в качестве контроля, достигала максимального значения при концентрации 105 кое/мл, каждая из бактерий полости рта совсем не проявляла реактивности при высоких уровнях концентрации, равных 108 кое/мл. Полностью такой же результат наблюдали при обнаружении методом ELISA ЛАМ туберкулезной бациллы.As can be understood from FIG. 13, although the reactivity of BCG used as a control reached its maximum value at a concentration of 10 5 cfu / ml, each of the bacteria in the oral cavity showed no reactivity at high levels of concentration equal to 10 8 cfu / ml. Completely the same result was observed when a tuberculosis bacillus was detected by LAM ELISA.
Описанные выше результаты доказали, что одноцепочечные антитела, scFv (Myco-scFv, TB-scFv и G3-scFv), полученные авторами изобретения, имеют высокое сродство к ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ЛАМ туберкулезной бациллы, и то, что возможно обнаруживать кислотоустойчивые бациллы (включая туберкулезную бациллу) при чувствительности, настолько же высокой, как чувствительность теста с амплификацией нуклеиновой кислоты, посредством комбинирования этих антител в виде бивалентного антитела, и то, что предоставлены анализ и антитела, которые являются очень селективными и специфичными при полном отсутствии перекрестной реактивности с бактериями полости рта.The results described above proved that single chain antibodies, scFvs (Myco-scFv, TB-scFv and G3-scFv) obtained by the inventors have a high affinity for LAM acid-resistant bacilli and LAM-tuberculous bacilli, and that it is possible to detect acid-resistant bacilli (including tuberculosis bacillus) with a sensitivity as high as that of a test with amplification of a nucleic acid by combining these antibodies as a bivalent antibody, and the analysis and antibodies that are very satisfactory objective and specific in the complete absence of cross-reactivity with oral bacteria.
Пример 10. Оценка обнаружения ЛАМ методом ELISA с использованием бивалентных антител с клиническими изолятамиExample 10. Evaluation of the detection of LAM by ELISA using bivalent antibodies with clinical isolates
С применением клинических изолятов кислотоустойчивых бацилл, оценивали ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы с использованием бивалентных антител.Using clinical isolates of acid-resistant bacilli, ELISA was evaluated to detect LAM of acid-resistant bacilli and ELISA to detect LAM of tuberculosis bacillus using bivalent antibodies.
В качестве клинических изолятов использовали 38 штаммов M. tuberculosis, 23 штамма M. avium и 6 штаммов M. intracellulare. Штаммы M. avium и штаммы M. intracellulare представляют собой патогенные бактерии заболевания MAC. ЛАМ экстрагировали из культивируемых бактериальных клеток этих штаммов, и осуществляли ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы с использованием бивалентных антител. Результаты показаны на фиг. 14.As clinical isolates, 38 strains of M. tuberculosis, 23 strains of M. avium and 6 strains of M. intracellulare were used. Strains of M. avium and strains of M. intracellulare are pathogenic bacteria of the disease MAC. LAM was extracted from cultured bacterial cells of these strains, and ELISA was performed to detect LAM of acid-resistant bacilli and ELISA to detect LAM of tuberculous bacillus using bivalent antibodies. The results are shown in FIG. fourteen.
На фиг. 14 “A” показывает результаты ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (черный столбец) и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы (белый столбец), осуществляемых на 38 штаммах клинических изолятов туберкулезной бациллы (M. tuberculosis). “B” показывает результаты ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл (черный столбец) и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы (белый столбец), осуществляемых на 29 штаммах нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл (23 штамма M. avium и 6 штаммов M. intracellulare).In FIG. 14 “A” shows ELISA results for the detection of LAM of acid-resistant bacilli (black column) and ELISA for detection of LAM of tuberculosis bacillus (white column) carried out on 38 strains of clinical isolates of tuberculosis bacillus (M. tuberculosis). “B” shows ELISA results for the detection of LAM of acid-resistant bacilli (black column) and ELISA for detection of LAM of tuberculosis bacillus (white column) carried out on 29 strains of non-tuberculic acid-resistant bacilli (23 strains of M. avium and 6 strains of M. intracellulare).
Как при ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, так и при ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, наблюдали реактивность у всех из 38 штаммов M. tuberculosis, 23 штаммов M. avium и 6 штаммов M. intracellulare. Несмотря на то что метод ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл проявлял эквивалентную реакцию для туберкулезных бацилл и нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл, ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы проявлял низкую реактивность к нетуберкулезным кислотоустойчивым бациллам.Both ELISA for the detection of LAM of acid-resistant bacilli and ELISA for the detection of LAM of a tuberculous bacillus, reactivity was observed in all of 38 strains of M. tuberculosis, 23 strains of M. avium and 6 strains of M. intracellulare. Although the ELISA method for the detection of LAM acid-resistant bacilli showed an equivalent reaction for tuberculosis bacilli and non-tuberculosis acid-resistant bacilli, the ELISA for the detection of LAM acid tuberculosis bacilli showed low reactivity to non-tuberculosis acid-resistant bacilli.
С целью дифференциации туберкулезных бацилл от нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл исключительно по результату обнаружения ЛАМ методом ELISA, рассчитывали отношение (значение от ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл/значение от ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы) значения от ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл к значению от ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы (фиг. 15). В результате, в случае туберкулезной бациллы, из 38 штаммов, был только 1 штамм, который имел отношение двух значений измерения, превышающее 3. С другой стороны, в случае нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл, 23 штамма из 29 штаммов имели отношение 3 или более.In order to differentiate tuberculosis bacilli from non-tuberculosis acid-resistant bacilli solely from the results of LAM detection by ELISA, the ratio (value from ELISA to detect LAM of acid-resistant bacilli / value from ELISA to detect LAM of tuberculosis bacillus) was calculated from the ELISA to detect LAM of acid-resistant bacillus to for the detection of LAM tuberculosis bacillus (Fig. 15). As a result, in the case of a tuberculous bacillus, out of 38 strains, there was only 1 strain that had a ratio of two measurement values exceeding 3. On the other hand, in the case of non-tuberculous acid-resistant bacilli, 23 strains of 29 strains had a ratio of 3 or more.
Результат, описанный выше, указывает на то, что метод обнаружения ЛАМ посредством ELISA может обнаруживать ЛАМ почти без влияния от различий между штаммами. Дополнительно, было доказано, что посредством расчета отношения (значение от ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл/значение от ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы) от обеих аналитических систем, возможно дифференцировать (различать) туберкулезные бациллы от нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл с превосходной оценкой, составляющей 97% чувствительности и 80% специфичности, и то, что способ по настоящему изобретению представляет собой первую в мире иммуноаналитическую систему в качестве обнаружения ЛАМ посредством ELISA “способную к обнаружению кислотоустойчивых бацилл в целом, а также различению туберкулезных бацилл от нетуберкулезных кислотоустойчивых бацилл”.The result described above indicates that a method for detecting LAM by ELISA can detect LAM with almost no effect from differences between strains. Additionally, it was proved that by calculating the ratio (value from ELISA for detecting LAM of acid-resistant bacilli / value from ELISA for detecting LAM of tuberculous bacillus) from both analytical systems, it is possible to differentiate (distinguish) tuberculous bacilli from non-tuberculic acid-resistant bacilli with an excellent score of 97 % sensitivity and 80% specificity, and the fact that the method of the present invention is the world's first immunoassay system as detecting LAM through ELISA "is able to detect acid-fast bacilli in general and also distinguishing tuberculosis from nontuberculous acid-fast bacilli Bacillus".
Пример 11. Оценка обнаружения ЛАМ методом ELISA с использованием бивалентных антител с клиническими образцами мокротыExample 11. Evaluation of the detection of LAM by ELISA using bivalent antibodies with clinical samples of sputum
Чтобы оценить способность обнаружения ЛАМ методом ELISA с использованием бивалентных антител, сконструированных в Примере 7, проводили оценку с использованием клинических образцов мокроты от 54 медицинских случаев. Оценку проводили посредством как прямого теста мазка (Мазок), так и теста с амплификацией нуклеиновой кислоты (NAAT). Результаты прямого теста мазка и теста с амплификацией нуклеиновой кислоты обобщены в Таблице 4.In order to evaluate the ability to detect LAM by ELISA using bivalent antibodies constructed in Example 7, an assessment was performed using clinical sputum samples from 54 medical cases. Evaluation was performed using both a direct smear test (Smear) and a nucleic acid amplification test (NAAT). The results of a direct smear test and a nucleic acid amplification test are summarized in Table 4.
По результатам прямого теста мазка, имели место 43 положительных случая (3+, 2+, 1+, Недостаточно); а теста с амплификацией нуклеиновой кислоты, 45 положительных случаев (+). Из этих случаев, 42 были положительными в обоих тестах, 8 случаев были отрицательными и 3 теста были положительными только в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты.According to the results of a direct smear test, there were 43 positive cases (3+, 2+, 1+, Not enough); a nucleic acid amplification test, 45 positive cases (+). Of these cases, 42 were positive in both tests, 8 were negative and 3 tests were positive only in the nucleic acid amplification test.
ЛАМы экстрагировали из клинических образцов мокроты и анализировали с использованием метода ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, и результаты каждого из них показаны в Таблице 5 и на Фиг. 16. В Таблице 5 показаны вместе показатели обнаружения метода ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы.LAMs were extracted from clinical sputum samples and analyzed using an ELISA method for detecting LAM acid resistant bacilli and ELISA for detecting LAM tuberculosis bacillus, and the results of each are shown in Table 5 and in FIG. 16. Table 5 shows together the detection rates of the ELISA method for detecting LAM of acid-resistant bacilli and ELISA for detecting LAM of tuberculosis bacillus.
Как показано в Таблице 5, результаты метода ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл и ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы были почти идентичными. В группах, с подтвержденной балльной оценкой 1+ или выше, с точки зрения числа бактериальных клеток в тесте мазка, реактивность ELISA достигала максимального значения у большинства образцов. Даже с оценкой “Недостаточно”, в которых число бактериальных клеток было малым, реактивность ELISA достигала максимального значения у 50% образцов. Кроме того, даже в 3 случаях, которые имели очень малое число бактериальных клеток и были определены как положительные только в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты, более высокие значения получали во всех из них, в отличие от образцов, которые были определены как отрицательные в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты. В методе ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, хотя ЛАМ был обнаружен во всех образцах, которые были определены как положительные в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты, ЛАМ не смогли обнаружить даже в единичном случае в образцах, которые были определены как отрицательные в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты. Таким образом, чувствительность и специфичность ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл совпадали на 100% при сравнении с тестом с амплификацией нуклеиновой кислоты. Во всех случаях совпадение чувствительности и специфичности в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты также имело место с тестом ELISA для обнаружения ЛАМ туберкулезной бациллы, за исключением того что в одном случае, определенном как положительный в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты и как “недостаточно” в тесте мазка, не было совпадения с результатом теста с амплификацией нуклеиновой кислоты. Кроме того, один случай, в котором не было совпадения, находился только незначительно ниже критического значения.As shown in Table 5, the results of the ELISA method for detecting LAM of acid-resistant bacilli and ELISA for detecting LAM of tuberculosis bacillus were almost identical. In groups with a confirmed score of 1+ or higher, in terms of the number of bacterial cells in the smear test, ELISA reactivity reached its maximum value in most samples. Even with the “Not enough” score, in which the number of bacterial cells was small, ELISA reactivity reached its maximum value in 50% of the samples. In addition, even in 3 cases, which had a very small number of bacterial cells and were identified as positive only in the test with amplification of nucleic acids, higher values were obtained in all of them, in contrast to samples that were determined as negative in the test with nucleic acid amplification. In the ELISA method for detecting LAMs of acid-resistant bacilli, although LAM was detected in all samples that were identified as positive in the nucleic acid amplification test, LAMs could not be detected even in a single case in samples that were detected as negative in the nucleic acid amplification test acids. Thus, the sensitivity and specificity of ELISA for the detection of LAM acid-resistant bacilli coincided 100% when compared with the test with amplification of nucleic acids. In all cases, the coincidence of sensitivity and specificity in the test with nucleic acid amplification also took place with the ELISA test for the detection of LAM of a tuberculous bacillus, except in one case defined as positive in the test with amplification of nucleic acid and as “insufficient” in the smear test , there was no coincidence with the result of the test with amplification of nucleic acids. In addition, one case in which there was no coincidence was only slightly below the critical value.
Описанные выше результаты указывают на то, что ELISA для обнаружения ЛАМ по настоящему изобретению представляет собой тест, способный производить скрининг и отбор пациентов, инфицированных кислотоустойчивыми бациллами, с чувствительностью и специфичностью, эквивалентными этим показателям для теста с амплификацией нуклеиновой кислоты.The results described above indicate that the ELISA for detecting LAM of the present invention is a test capable of screening and selection of patients infected with acid-resistant bacilli, with sensitivity and specificity equivalent to those for the nucleic acid amplification test.
Далее, чтобы подтвердить существование корреляции между значением в ELISA для обнаружения ЛАМ и количеством бактерий, проводили измерение разбавлений.Further, to confirm the existence of a correlation between the value in the ELISA for detecting LAM and the number of bacteria, dilutions were measured.
Экстракционные растворы из образцов мокроты разбавляли 5-кратно, 25-кратно 125-кратно, и разбавленные растворы анализировали вместе с очищенным ЛАМ, который применяли в качестве стандартного препарата, и концентрации ЛАМ в них были рассчитаны. Результат показан на фиг. 17.Extraction solutions from sputum samples were diluted 5-fold, 25-fold 125-fold, and diluted solutions were analyzed together with purified LAM, which was used as a standard preparation, and LAM concentrations in them were calculated. The result is shown in FIG. 17.
Образцы были разделены на группы (I: отрицательные как в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты и тесте мазка, II: положительные в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты и отрицательные в тесте мазка, III: положительные в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты и “недостаточно” в тесте мазка, IV: 1+ в тесте мазка, V: 2+ в тесте мазка; VI: 3+ в тесте мазка) с использованием теста с амплификацией нуклеиновой кислоты и количества бактерий на основании теста мазка, в сравнении с концентрацией ЛАМ (пг/мл). В результате, как показано на Фиг. 17, поскольку среднее значение концентрации ЛАМ возрастает от группы с небольшим количеством бактерий к группе с большим количеством бактерий (I к VI), это показывает, что существует положительная корреляция между количеством бактерий и концентрацией ЛАМ. Из результата, описанного выше, было показано, что количество бактерий может быть предсказано посредством количественного определения концентрации ЛАМ.Samples were divided into groups (I: negative as in the test with nucleic acid amplification and smear test, II: positive in the test with nucleic acid amplification and negative in the smear test, III: positive in test with nucleic acid amplification and “not enough” in the test smear, IV: 1+ in a smear test, V: 2+ in a smear test; VI: 3+ in a smear test) using a test with amplification of nucleic acid and the number of bacteria based on a smear test, in comparison with the concentration of LAM (pg / ml ) As a result, as shown in FIG. 17, since the average LAM concentration increases from the group with a small number of bacteria to the group with a large number of bacteria (I to VI), this shows that there is a positive correlation between the number of bacteria and the concentration of LAM. From the result described above, it was shown that the number of bacteria can be predicted by quantifying the concentration of LAM.
Эти результаты показали, что способ по настоящему изобретению имеет чувствительность и специфичность, эквивалентную чувствительности и специфичности в тесте с амплификацией нуклеиновой кислоты, и представляет собой тест, способный к дополнительному определению количества бактерий, и способ оказался применимым для терапевтического мониторинга и т.д. туберкулеза.These results showed that the method of the present invention has sensitivity and specificity equivalent to sensitivity and specificity in a nucleic acid amplification test, and is a test capable of further determining the number of bacteria, and the method has proved to be useful for therapeutic monitoring, etc. tuberculosis.
Пример 12. Оценка стабильности ЛАМExample 12. Assessment of the stability of LAM
При транспортировке образцов мокроты, необходимо транспортировать образцы под жестким контролем вследствие проблемы инфекционности. В таком случае, стоимость становится высокой, и доступные области становятся ограниченными. Если образец мокроты стерилизован после сбора, его обычная транспортировка становится возможной. Чтобы полностью стерилизовать кислотоустойчивые бациллы, обработки, такие как кипячение в течение 30 минут или дольше, и стерилизация паром под давлением (автоклав и т.д.) являются необходимыми. Когда осуществляют такие обработки, можно предсказать, что структура ЛАМ становится измененной. Авторы изобретения исследовали, является или нет сконструированный метод ELISA для определения ЛАМ, описанный выше, резистентным к жесткой стерилизационной обработке и может ли точно обнаруживать ЛАМ.When transporting sputum samples, it is necessary to transport samples under tight control due to the problem of infectivity. In this case, the cost becomes high and the available areas become limited. If a sputum sample is sterilized after collection, its normal transport becomes possible. To completely sterilize acid-resistant bacilli, treatments such as boiling for 30 minutes or longer, and steam sterilization under pressure (autoclave, etc.) are necessary. When such treatments are performed, it can be predicted that the LAM structure becomes altered. The inventors examined whether or not the constructed ELISA method for determining LAM, described above, is resistant to severe sterilization treatment and can accurately detect LAM.
Каждый из ЛАМ экстрагировали из бактериальных клеток (автоклавированных бактерий), полученных автоклавированием (121°С, 20 минут) культивированных бактериальных клеток БЦЖ, бактериальных клеток, которые кипятили в течение 30 минут при 100°С (обработанных кипячением бактерий), и необработанных бактерий, и с ними осуществляли анализ, применяя ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл. Результаты показаны на Фиг. 18. Когда сравнивают необработанные бактерии (белый столбец), обработанные кипячением бактерии (черный столбец) и автоклавированные бактерии (серый столбец), значения были полностью идентичными для всех них, указывая на то, что возможно также анализировать ЛАМ у бактериальных клеток, подвергнутых жестким обработкам, таким как кипячение и автоклавирование, аналогично необработанным бактериям.Each LAM was extracted from bacterial cells (autoclaved bacteria) obtained by autoclaving (121 ° C, 20 minutes) cultured BCG bacterial cells, bacterial cells that were boiled for 30 minutes at 100 ° C (treated with boiling bacteria), and untreated bacteria, and they were analyzed using ELISA to detect LAM acid resistant bacilli. The results are shown in FIG. 18. When comparing untreated bacteria (white column), boiled bacteria (black column) and autoclaved bacteria (gray column), the values were completely identical for all of them, indicating that it is also possible to analyze LAM in hard-treated bacterial cells such as boiling and autoclaving, similar to untreated bacteria.
В дополнение, оценку стабильности при хранении проводили, используя бактериальные клетки, которые были автоклавированы (121°С, 20 минут), что является наиболее жесткой обработкой. После оставления автоклавированных бактериальных клеток БЦЖ при 25°С на 7 дней, ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл осуществляли на ЛАМ, экстрагированных из них. Фиг. 19 показывает результаты (черный столбец), и результаты (белый столбец) ELISA для обнаружения ЛАМ кислотоустойчивых бацилл, осуществляемого на ЛАМ, экстрагированном из бактериальных клеток БЦЖ немедленно после автоклавирования. Как может быть понято из Фиг. 19, не было почти никакого различия между ними двумя, и результат, аналогичный результату для бактериальной клетки немедленно после обработки, был получен для бактериальных клеток, оставленных на 7 дней после автоклавирования. Этот факт указывает на то, анализ возможен в течение по меньшей мере одной недели после стерилизационной обработки.In addition, storage stability was assessed using bacterial cells that were autoclaved (121 ° C, 20 minutes), which is the most stringent treatment. After autoclaved BCG bacterial cells were left at 25 ° C for 7 days, ELISAs for detecting LAMs of acid-resistant bacilli were performed on LAMs extracted from them. FIG. 19 shows the results (black column) and the results (white column) of an ELISA for the detection of LAM acid-resistant bacilli carried out on LAM extracted from BCG bacterial cells immediately after autoclaving. As can be understood from FIG. 19, there was almost no difference between the two, and a result similar to the result for the bacterial cell immediately after treatment was obtained for bacterial cells left for 7 days after autoclaving. This fact indicates that analysis is possible for at least one week after sterilization treatment.
Исходя из результатов, полученных выше, было подтверждено, что с аналитической системой по настоящему изобретению, анализ возможен даже тогда, когда целевыми клетками являются бактериальные клетки, с которые претерпели жесткие обработки, такие как стерилизация паром под давлением (автоклавирование), и анализ может осуществляться стабильно в течение по меньшей мере одной недели после обработки.Based on the results obtained above, it was confirmed that with the analytical system of the present invention, analysis is possible even when the target cells are bacterial cells that have undergone rigorous treatments, such as steam sterilization under pressure (autoclaving), and analysis can be carried out stable for at least one week after treatment.
Следовательно, даже в области, в которой отсутствует специальная транспортная система образцов, доставка образца возможна с использованием обычных транспортных систем, таких как почта и т.п. Кроме того, с точки зрения времени, поскольку существует период отсрочки, равный приблизительно одной неделе, возможно, что задержка при транспорте образца не будет являться проблемой.Therefore, even in an area in which there is no special transport system of samples, sample delivery is possible using conventional transport systems, such as mail, etc. In addition, in terms of time, since there is a grace period of approximately one week, it is possible that the delay in transporting the sample will not be a problem.
Свободный текстFree text
SEQ ID NO:9 и 10 показывают единичные аминокислотные последовательности последовательностей GS-линкера, а SEQ ID NO:11 и 40 показывают аминокислотные последовательности линкерных последовательностей, применяемых в настоящем изобретении. SEQ ID NO:13-16 показывают аминокислотные последовательности смысловых праймеров вариабельной области тяжелой цепи антитела; SEQ ID NO:17 показывает аминокислотную последовательность антисмыслового праймера вариабельной области тяжелой цепи антитела; SEQ ID NO:18-20 и 24 показывают аминокислотные последовательности смысловых праймеров вариабельной области легкой цепи антитела; SEQ ID NO:21-23 и 25 показывают аминокислотные последовательности антисмысловых праймеров вариабельной области легкой цепи антитела; SEQ ID NO:26 показывает аминокислотную последовательность смыслового праймера GS-линкера; SEQ ID NO:27 показывает аминокислотную последовательность антисмыслового праймера GS-линкера; SEQ ID NO:28 показывает аминокислотную последовательность праймера сайта рестрикционного фермента (SfiI); и SEQ ID NO:29 показывает аминокислотную последовательность праймера сайта рестрикционного фермента (NotI) (см. Таблицу 1).SEQ ID NO: 9 and 10 show the single amino acid sequences of the GS linker sequences, and SEQ ID NO: 11 and 40 show the amino acid sequences of the linker sequences used in the present invention. SEQ ID NO: 13-16 show the amino acid sequences of the sense primers of the variable region of the antibody heavy chain; SEQ ID NO: 17 shows the amino acid sequence of an antisense primer of an antibody heavy chain variable region; SEQ ID NO: 18-20 and 24 show the amino acid sequences of the sense primers of the variable region of the light chain of an antibody; SEQ ID NOs: 21-23 and 25 show the amino acid sequences of antisense primers of the variable region of the light chain of an antibody; SEQ ID NO: 26 shows the amino acid sequence of a sense primer of a GS linker; SEQ ID NO: 27 shows the amino acid sequence of the GS-linker antisense primer; SEQ ID NO: 28 shows the amino acid sequence of a restriction enzyme site primer (SfiI); and SEQ ID NO: 29 shows the amino acid sequence of the restriction enzyme (NotI) site primer (see Table 1).
SEQ ID NO:41 показывает аминокислотную последовательность смыслового праймера вариабельной области тяжелой цепи антитела; SEQ ID NO:42 показывает аминокислотную последовательность антисмыслового праймера вариабельной области тяжелой цепи антитела; SEQ ID NO:43 показывает аминокислотную последовательность смыслового праймера вариабельной области легкой цепи антитела; SEQ ID NO:44 показывает аминокислотную последовательность антисмыслового праймера вариабельной области легкой цепи антитела; SEQ ID NO:45 показывает аминокислотную последовательность смыслового праймера GS-линкера; и SEQ ID NO:46 показывает аминокислотную последовательность антисмыслового праймера GS-линкера (см. Таблицу 3).SEQ ID NO: 41 shows the amino acid sequence of a sense primer of an antibody heavy chain variable region; SEQ ID NO: 42 shows the amino acid sequence of an antisense primer of an antibody heavy chain variable region; SEQ ID NO: 43 shows the amino acid sequence of a sense primer of an antibody light chain variable region; SEQ ID NO: 44 shows the amino acid sequence of an antisense primer of an antibody light chain variable region; SEQ ID NO: 45 shows the amino acid sequence of a sense primer of a GS linker; and SEQ ID NO: 46 shows the amino acid sequence of the GS-linker antisense primer (see Table 3).
Claims (18)
(А) моноклональное антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, соединенные через линкер, вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1-CDR3 тяжёлой цепи, показанные в (а)-(с) ниже, и легкой цепи, содержащую CDR1-CDR3, показанные в (d)-(f) ниже:
(a) CDR1 тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(b) CDR2 тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2,
(c) CDR3 тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3,
(d) CDR1 легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4,
(e) CDR2 легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, и
(f) CDR3 легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6.1. A monoclonal antibody that is capable of binding to lipoarabinomannan acid-resistant bacilli, the antibody shown in (A) below:
(A) a monoclonal antibody containing the variable region of the heavy chain and the variable region of the light chain connected through a linker, the variable region of the heavy chain containing CDR1-CDR3 of the heavy chain shown in (a) to (c) below, and a light chain containing CDR1 -CDR3 shown in (d) to (f) below:
(a) a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
(b) a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2,
(c) a heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3,
(d) Light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4,
(e) a light chain CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and
(f) Light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
(1) приведения моноклонального антитела по п. 3 в контакт с биологическим образцом индивида; и
(2) проведения анализа на микобактерии в образце с использованием реакции связывания между моноклональным антителом и липоарабиноманнаном кислотоустойчивых бацилл в качестве показателя.4. A method for detecting mycobacteria, comprising the steps of:
(1) bringing the monoclonal antibody of claim 3 into contact with a biological sample of an individual; and
(2) analysis of mycobacteria in the sample using the binding reaction between the monoclonal antibody and lipoarabinomannan acid-resistant bacilli as an indicator.
(1) приведения моновалентного или бивалентного моноклонального антитела по п. 3 в контакт с тестируемым образцом, который может содержать микобактерию; и
(2) проведения анализа на липоарабиноманнан кислотоустойчивых бацилл в тестируемом образце с использованием реакции связывания между моноклональным антителом и липоарабиноманнаном кислотоустойчивых бацилл в качестве показателя.10. A method for measuring the content of lipoarabinomannan acid-resistant bacilli in a test sample, comprising the steps of:
(1) bringing the monovalent or bivalent monoclonal antibody of claim 3 into contact with a test sample that may contain mycobacteria; and
(2) analysis of lipoarabinomannan acid resistant bacilli in the test sample using the binding reaction between the monoclonal antibody and lipoarabinomannan acid resistant bacilli as an indicator.
(1) приведения моноклонального антитела по п. 1 или 2 в контакт с обоими тестируемыми образцами до и после введения противотуберкулезного лекарственного средства;
(2) проведения анализа липоарабиноманнана туберкулезной бациллы в тестируемых образцах до и после введения противотуберкулезного лекарственного средства с использованием реакции связывания между моноклональным антителом и липоарабиноманнаном туберкулезной бациллы в качестве показателя; и
(3) определения того, что противотуберкулезное лекарственное средство имеет лечебный эффект в отношении туберкулеза, когда липоарабиноманнан туберкулезной бациллы обнаруживается в тестируемом образце перед введением противотуберкулезного лекарственного средства и, когда липоарабиноманнан туберкулезной бациллы не обнаруживается в тестируемом образце после введения противотуберкулезного лекарственного средства.13. A method for determining the therapeutic effect of an anti-tuberculosis drug against tuberculosis, comprising the steps of:
(1) bringing the monoclonal antibody of claim 1 or 2 into contact with both test samples before and after administration of the anti-tuberculosis drug;
(2) analysis of the lipoarabinomannan tuberculosis bacillus in test samples before and after administration of the anti-tuberculosis drug using the binding reaction between the monoclonal antibody and lipoarabinomannan tuberculosis bacillus as an indicator; and
(3) determining that the anti-tuberculosis drug has a therapeutic effect on tuberculosis when the lipoarabinomannan of the tuberculous bacillus is detected in the test sample before administration of the anti-tuberculosis bacillus and is not detected in the test sample after the administration of the anti-tuberculosis drug.
(1) приведения моноклонального антитела по п. 1 или 2 в контакт с обоими тестируемыми образцами до и после введения противотуберкулезного лекарственного средства;
(2) количественного определения липоарабиноманнана туберкулезной бациллы в тестируемых образцах до и после введения противотуберкулезного лекарственного средства с использованием реакции связывания между моноклональным антителом и липоарабиноманнаном туберкулезной бациллы в качестве показателя; и
(3) сравнения количества липоарабиноманнана туберкулезной бациллы в тестируемом образце после введения противотуберкулезного лекарственного средства (измерение после введения) с количеством липоарабиноманнана туберкулезной бациллы в тестируемом образце перед введением противотуберкулезного лекарственного средства (измерение перед введением); и
определения того, что противотуберкулезное лекарственное средство имеет лечебный эффект в отношении туберкулеза, когда результат измерения после введения ниже результата измерения перед введением, и определения того, что противотуберкулезное лекарственное средство не имеет лечебного эффекта в отношении туберкулеза, когда результат измерения после введения не ниже результата измерения перед введением.14. A method for determining the therapeutic effect of an anti-tuberculosis drug against tuberculosis, comprising the steps of:
(1) bringing the monoclonal antibody of claim 1 or 2 into contact with both test samples before and after administration of the anti-tuberculosis drug;
(2) the quantification of lipoarabinomannan tuberculosis bacilli in test samples before and after administration of the anti-TB drug using the binding reaction between the monoclonal antibody and lipoarabinomannan tuberculosis bacillus as an indicator; and
(3) comparing the amount of lipoarabinomannan tuberculosis bacillus in the test sample after administration of the anti-TB drug (measurement after administration) with the amount of lipoarabinomannan tuberculosis bacillus in the test sample before administration of the anti-tuberculosis drug (measurement before administration); and
determining that the anti-tuberculosis drug has a therapeutic effect against tuberculosis when the measurement result after administration is lower than the measurement result before administration, and determining that the anti-TB drug does not have a therapeutic effect against tuberculosis when the measurement result after administration is not lower than the measurement result before the introduction.
(a) часть для сбора образца для поглощения и сбора тестируемого образца;
(b) часть с мечеными антителами, являющуюся подложкой для меченого моноклонального антитела по любому из пп. 1-3, которое специфически реагирует с липоарабиноманнаном кислотоустойчивых бацилл;
(c) часть для определения, включающая часть отображения результата тестирования, на которой иммобилизовано немеченое моноклональное антитело по любому из пп. 1-3, которое специфически реагирует с липоарабиноманнаном кислотоустойчивых бацилл; и
(d) часть для поглощения остающегося раствора тестируемого образца, которая прошла через часть для сбора образца, часть с мечеными антителами и часть для определения; причем
часть для сбора образца располагается на ведущем конце пластинчатого поглощающего раствор фрагмента;
часть с меченым антителом находится в контакте с задним концом части для сбора образца, или находится в состоянии частичного перекрывания с частью для сбора образца;
часть для определения представляет собой часть для дальнейшего переноса к части для поглощения раствора тестируемого образца, который продвигается из части для сбора образца через часть с меченым антителом.16. A device for detecting mycobacteria, containing a solution-absorbing fragment, which contains a platelet fragment formed from a material capable of transferring the test sample by capillary action, a platelet solution-absorbing fragment, containing sequentially from one end side to the other end side in the direction of the long side:
(a) a sample collection portion for absorption and collection of the test sample;
(b) a part with labeled antibodies, which is the substrate for a labeled monoclonal antibody according to any one of paragraphs. 1-3, which specifically reacts with lipoarabinomannan acid-resistant bacilli;
(c) a determination part, including a display part of a test result on which an unlabeled monoclonal antibody is immobilized according to any one of claims. 1-3, which specifically reacts with lipoarabinomannan acid-resistant bacilli; and
(d) a part for absorbing the remaining solution of the test sample that has passed through the part for collecting the sample, part with labeled antibodies and part for determination; moreover
a sample collection portion is located at the leading end of the plate solution-absorbing fragment;
the labeled antibody portion is in contact with the rear end of the sample collection portion, or is in a state of partial overlap with the sample collection portion;
the determination part is a part for further transfer to the part for absorbing the solution of the test sample, which advances from the part for collecting the sample through the part with the labeled antibody.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012044796 | 2012-02-29 | ||
| JP2012-044796 | 2012-02-29 | ||
| PCT/JP2013/055591 WO2013129634A1 (en) | 2012-02-29 | 2013-02-28 | Anti-lipoarabinomannan antibody and immunoassay for mycobacteriosis using said antibody |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2014138806A RU2014138806A (en) | 2016-04-20 |
| RU2588480C2 true RU2588480C2 (en) | 2016-06-27 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2350352C2 (en) * | 2002-11-25 | 2009-03-27 | Институто Финли. Сентро Де Инвестигасион-Продуксион Де Вакунас И Суэрос | Preparations, containing human antibodies applied in treatment of microbacterial infections |
| WO2011049082A1 (en) * | 2009-10-21 | 2011-04-28 | 国立大学法人広島大学 | INTEGRIN α8Β1-SPECIFIC MONOCLONAL ANTIBODY |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2350352C2 (en) * | 2002-11-25 | 2009-03-27 | Институто Финли. Сентро Де Инвестигасион-Продуксион Де Вакунас И Суэрос | Preparations, containing human antibodies applied in treatment of microbacterial infections |
| WO2011049082A1 (en) * | 2009-10-21 | 2011-04-28 | 国立大学法人広島大学 | INTEGRIN α8Β1-SPECIFIC MONOCLONAL ANTIBODY |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6622363B2 (en) | Anti-lipoarabinomannan antibody and immunoassay for mycobacterial disease using the antibody | |
| JP2023052239A (en) | Assays for igfbp7 having improved performance in biological samples | |
| JP2011512817A (en) | Antibodies against Clostridium difficile spores and uses thereof | |
| JP2006284567A (en) | Diagnostic method and kit for helicobacter pylori infection | |
| JPH07507387A (en) | Broadly reactive opsonic antibodies that react with common staphylococcal antigens | |
| RU2588480C2 (en) | Antibody against lipoarabinomannan and immunoassay of infections caused by acid-fast bacilli, using antibody | |
| US20210324055A1 (en) | Methods, Devices, Kits and Compositions for Detecting Tapeworm | |
| US8338566B2 (en) | Characterization of BBK07 antigen of Borrelia burgdorferi and methods of use | |
| US20210024644A1 (en) | N-cadherin binding molecules and uses thereof | |
| RU2782463C1 (en) | Methods, devices, kits, and compositions for detection of tapeworms | |
| US20220381779A1 (en) | Methods for the diagnosis of buruli ulcer | |
| WO2017204349A1 (en) | Methods and assays for estimating acid-fast bacteria viability, and kits therefor | |
| KR101779443B1 (en) | Kit for fluorescence-linked immunochromatographic assay to diagnose brucellosis | |
| CN117683129A (en) | Fully human neutralizing antibody against Yersinia pestis, and preparation method and application thereof | |
| Deckers | Serological markers for improved diagnosis of porcine cysticercosis | |
| KR20200049387A (en) | Monoclonal antibody specifically binding to OMP28 in Brucella suis, Hybridoma cell line procuding the same and use thereof | |
| JP2007300817A (en) | Method for detecting bacteria, detection reagent and detection kit | |
| WO2014188763A1 (en) | An antibody that binds to leptospiral antigen |