RU2588442C2 - Хелперный пептид ракового антигена - Google Patents
Хелперный пептид ракового антигена Download PDFInfo
- Publication number
- RU2588442C2 RU2588442C2 RU2011147479/10A RU2011147479A RU2588442C2 RU 2588442 C2 RU2588442 C2 RU 2588442C2 RU 2011147479/10 A RU2011147479/10 A RU 2011147479/10A RU 2011147479 A RU2011147479 A RU 2011147479A RU 2588442 C2 RU2588442 C2 RU 2588442C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- peptide
- cells
- cancer
- drb1
- mhc class
- Prior art date
Links
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 54
- 101800000324 Immunoglobulin A1 protease translocator Proteins 0.000 title description 76
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title description 2
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 title description 2
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 title description 2
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 claims abstract description 55
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 49
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 38
- 229920000023 polynucleotide Polymers 0.000 claims abstract description 32
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 32
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 29
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 26
- 210000002443 helper T lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract 3
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims description 91
- 108091007937 major histocompatibility complex family Proteins 0.000 claims description 91
- 101700020122 DRB1 Proteins 0.000 claims description 79
- 101700016627 DRB8 Proteins 0.000 claims description 79
- 102100001312 RBM45 Human genes 0.000 claims description 79
- 101700059484 RBM45 Proteins 0.000 claims description 79
- 210000003283 T-Lymphocytes, Helper-Inducer Anatomy 0.000 claims description 74
- 101710035186 BoLA-DQB Proteins 0.000 claims description 49
- 210000000612 Antigen-Presenting Cells Anatomy 0.000 claims description 40
- 210000003819 Peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 33
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 15
- 108010049080 WT1 Proteins Proteins 0.000 claims description 12
- 102000008999 WT1 Proteins Human genes 0.000 claims description 12
- 230000000240 adjuvant Effects 0.000 claims description 11
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 11
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 claims description 9
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 claims description 9
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000003394 haemopoietic Effects 0.000 claims description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 7
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 7
- 101700074458 DRB6 Proteins 0.000 claims description 6
- 101710031355 HLA-DRB5 Proteins 0.000 claims description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 6
- 206010024324 Leukaemias Diseases 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 206010017758 Gastric cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 4
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 4
- 206010025310 Other lymphomas Diseases 0.000 claims description 4
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 4
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010046766 Uterine cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000009251 multiple myeloma Diseases 0.000 claims description 4
- 201000003793 myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 claims description 4
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 claims description 2
- 102100008060 WT1 Human genes 0.000 claims 8
- 210000004907 Glands Anatomy 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 3
- 102000027675 major histocompatibility complex family Human genes 0.000 description 82
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 35
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 35
- 210000000952 Spleen Anatomy 0.000 description 29
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 23
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 17
- 102100016020 IFNG Human genes 0.000 description 14
- 101700086956 IFNG Proteins 0.000 description 14
- 125000004432 carbon atoms Chemical group C* 0.000 description 12
- URRBLVUOXIGNQR-HXUWFJFHSA-N [(1R)-1-phenylethyl] N-(2-aminoethyl)-N-[(3-methoxy-4-phenylmethoxyphenyl)methyl]carbamate Chemical compound C1([C@@H](C)OC(=O)N(CCN)CC=2C=C(C(=CC=2)OCC=2C=CC=CC=2)OC)=CC=CC=C1 URRBLVUOXIGNQR-HXUWFJFHSA-N 0.000 description 11
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 11
- 210000001744 T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 10
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 10
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 9
- 230000000890 antigenic Effects 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 230000001472 cytotoxic Effects 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 210000003719 B-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 8
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 8
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 8
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 8
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 8
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 description 7
- 210000004443 Dendritic Cells Anatomy 0.000 description 6
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 6
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 6
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 5
- 210000004698 Lymphocytes Anatomy 0.000 description 5
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 5
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 5
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 5
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 4
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 4
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 4
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 4
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 4
- 210000002540 Macrophages Anatomy 0.000 description 4
- 208000008383 Wilms Tumor Diseases 0.000 description 4
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 4
- -1 cycloalkyl ester Chemical class 0.000 description 4
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 4
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 201000008026 nephroblastoma Diseases 0.000 description 4
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 101710009008 HLA-B Proteins 0.000 description 3
- 102100020459 HLA-B Human genes 0.000 description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 3
- 230000002998 immunogenetic Effects 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 3
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 2
- 210000001124 Body Fluids Anatomy 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione Transferase family Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione Transferase family Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 2
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 2
- 102000035443 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005771 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 229940094937 Thioredoxin Drugs 0.000 description 2
- 101000051520 WT1 Proteins 0.000 description 2
- 101000218881 Wilms tumor protein homolog Proteins 0.000 description 2
- 125000004453 alkoxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 201000009030 carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 2
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000037240 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 102000026582 human WT1 protein Human genes 0.000 description 2
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive Effects 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 102000002933 thioredoxin family Human genes 0.000 description 2
- 108060008226 thioredoxin family Proteins 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K Aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- SXPWTBGAZSPLHA-UHFFFAOYSA-M Cetalkonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 SXPWTBGAZSPLHA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N D-serine Chemical compound OC[C@@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010010378 HLA-DP Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000015789 HLA-DP Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010062347 HLA-DQ Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010029657 HLA-DRB1*04:01 antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010024996 HLA-DRB1*04:05 antigen Proteins 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 229940076144 Interleukin-10 Drugs 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 229940028885 Interleukin-4 Drugs 0.000 description 1
- 125000003412 L-alanyl group Chemical group [H]N([H])[C@@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 1
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000003338 L-glutaminyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 1
- 125000002061 L-isoleucyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000003290 L-leucino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000002435 L-phenylalanyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000000773 L-serino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])*)C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 125000002707 L-tryptophyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C(C([C@](N([H])[H])(C(=O)[*])[H])([H])[H])=C([H])N([H])C2=C1[H] 0.000 description 1
- 125000003798 L-tyrosyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000002041 N(2)-L-arginino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 description 1
- 101710040924 Os07g0604000 Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 229940092253 Ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004681 Ovum Anatomy 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000724205 Rice stripe tenuivirus Species 0.000 description 1
- 210000000400 T-Lymphocytes, Cytotoxic Anatomy 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K Trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating Effects 0.000 description 1
- 125000004390 alkyl sulfonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 125000000000 cycloalkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 201000003741 gastrointestinal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000005658 halogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic Effects 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000002075 main ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 108091005593 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 108010045030 monoclonal antibodies Proteins 0.000 description 1
- 102000005614 monoclonal antibodies Human genes 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atoms Chemical group N* 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003170 phenylsulfonyl group Chemical group C1(=CC=CC=C1)S(=O)(=O)* 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 108091008117 polyclonal antibodies Proteins 0.000 description 1
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000006277 sulfonation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 102000003995 transcription factors Human genes 0.000 description 1
- 108090000464 transcription factors Proteins 0.000 description 1
- 239000011778 trisodium citrate Substances 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой пептид, который имеет аминокислотную последовательность, состоящую из смежных аминокислот, полученных из белка WT1, и индуцирует WT1-специфические хелперные Т-клетки связыванием с молекулой МНС класса II. Такая аминокислотная последовательность выбрана из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO: 3; аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO: 4; аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO: 5. Изобретение касается также экспрессирующего вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий пептид, антитела против пептида, фармацевтической композиции, содержащей пептид, способа лечения рака путем введения пептида субъекту. Изобретение позволяет получить эффективное средство для индукции WT1-специфических хелперных Т-клеток связыванием с молекулой МНС класса II и использовать его для лечения рака. 14 н. и 3 з.п. ф-лы, 18 ил., 9 табл., 5 пр.
Description
2420-180885RU/015
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Данное изобретение относится к хелперному пептиду WT1, полинуклеотиду, кодирующему этот пептид, WT1-специфическим хелперным Т-клеткам, индуцируемым этим пептидом, фармацевтической композиции для лечения/предупреждения рака, содержащей их, и т.п. Данная заявка заявляет приоритет в отношении Японской патентной заявки № 2009-105286, поданной 23 апреля 2009 года, причем описание Японской патентной заявки № 2009-105286 включено здесь посредством ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Ген WT1 (ген опухоли Вильмса 1) является геном, идентифицированным в качестве этиологического фактора опухоли Вильмса, которая является раком почки у детей (непатентные документы 1 и 2), и представляет собой фактор транскрипции, имеющий структуру “цинковых пальцев”. Сначала этот ген WT1 считали геном-супрессором рака. Однако, последующее исследование показало, что вышеуказанный ген служит скорее в качестве ракового гена в опухолях гемопоэтических органов и солидных раковых опухолях (непатентные документы 3-6).
Поскольку ген WT1 высоко экспрессируется во многих злокачественных опухолях, продукт гена WT1, который является аутобелком, не имеющим мутации, проверяли на наличие или отсутствие иммуногенности in vivo. В результате, было показано, что белок, полученный из этого гена WT1, экспрессируемый в высокой степени в опухолевых клетках, фрагментируется внутриклеточным процессингом, и полученный пептид образует комплекс с молекулой МНС класса I, который экспонируется (представляется) на поверхности клетки, и что цитотоксические Т-клетки (далее называемые здесь CTL), узнающие такой комплекс, могут индуцироваться вакцинацией пептидом WT1 (непатентные документы 7-9). Было также показано, что мыши, иммунизированные пептидом WT1 или кДНК WT1, отторгают имплантируемые WT1-ген-экспрессирующие опухолевые клетки в высокой степени (непатентные документы 7 и 10), но нормальные ткани, эндогенно экспрессирующие ген WT1, не повреждаются индуцированными CTL. До этого, предполагали с большой уверенностью, что можно индуцировать WT1-специфическиие CTL не только в мышах, но также и в человеке, и что такие CTL имеют цитотоксическую активность против опухолевых клеток, экспрессирующих в высокой степени ген WT1, но не имеют цитотоксической активности против нормальных клеток, эндогенно экспрессирующих этот ген WT1 (непатентные документы 7 и 10-14).
С другой стороны, сообщалось, что присутствие хелперных Т-клеток, специфических в отношении ракового антигена, является важным для эффективной индукции CTL (непатентный документ 15). Эти хелперные Т-клетки (CD-4-положительные Т-клетки) индуцируются, пролиферируют и активируются узнаванием комплекса молекулы МНС класса II с антигенным пептидом на антигенпрезентирующих клетках. Активированные хелперные Т-клетки продуцируют цитокины, такие как IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, или интерферон (IFN) и стимулируют пролиферацию, дифференцировку и созревание В-клеток и других субпопуляций Т-клеток. Таким образом, считается, что связывание антигенного пептида с молекулой МНС класса II эффективно активирует CTL и другие клетки посредством индукции хелперных Т-клеток и усиливает иммунную функцию (непатентный документ 16). До этого сообщалось только связывание антигенного пептида с HLA-DRB1*0401 и HLA-DRB1*0405 молекулы МНС класса II в отношении WT1 (непатентный документ 17 и патентный документ 1), и необходимо было найти антигенные пептиды для других подтипов.
ДОКУМЕНТЫ ИЗВЕСТНОГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ
Непатентные документы
Патентный документ 1: International Publication № WO 2005/045027
Непатентные документы:
Непатентный документ 1: Daniel A. Harber et al., Cell. 1990 Jun 29; 61(7): 1257-69.
Непатентный документ 2: Call K.M. et al., Cell. 1990 Feb 9; 60(3): 509-20.
Непатентный документ 3: Menke A.L., Int Rev. Cetol. 1998; 181: 151-212. Review.
Непатентный документ 4: Yamagami T. Et al., Blood. 1996 Apr 1: 87(7): 2878-84.
Непатентный документ 5: Inoue K. et al., Blood. 1998 Apr 15; 91(8): 2969-76.
Непатентный документ 6: Tsuboi A. et al., Leuk Res. 1999 May; 23(5): 499-505.
Непатентный документ 7: Oka Y. et al., J. Immunol. 2000 Feb 15; 164(4): 1873-80.
Непатентный документ 8: Melief C.J. et al., Immunol. Rev. 1995 Jun; 145: 167-77.
Непатентный документ 9: Ritz J, J. Clin. Oncol. 1994 Feb; 12(2): 237-8.
Непатентный документ 10: Tsuboi A. Et al., J. Clin. Immunol. 2000 May; 20(3): 195-202.
Непатентный документ 11: Oka Y. et al., J. Immunogenetics. 2000 Feb; 51(2): 99-107.
Непатентный документ 12: Ohminami H. et al., Blood. 2000 Jan 1; 95(1): 286-93.
Непатентный документ 13: Gao L. et al., Blood. 2000 Apr 1; 95(7): 2198-203.
Непатентный документ 14: Ohminami H. et al., Blood. 2000 Jan 1; 95(1): 286-93.
Непатентный документ 15: Cancer. Res. 62: 6438, 2002.
Непатентный документ 16: J. Immunol. Immunother., 24: 195, 2001.
Непатентный документ 17: Cancer. Immunol. Immunother. 51: 271, 2002.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ПРОБЛЕМЫ, ПОДЛЕЖАЩИЕ РЕШЕНИЮ ЭТИМ ИЗОБРЕТЕНИЕМ
Таким образом, целью, которая должна быть достигнута данным изобретением, является обеспечение пептида, индуцирующего WT1-специфические хелперные Т-клетки связыванием с различными молекулами МНС класса II, полинуклеотида, кодирующего этот пептид, WT1-хелперных Т-клеток, индуцируемых этим пептидом, и фармацевтической композиции для лечение/предупреждения рака, содержащей их.
СПОСОБЫ РЕШЕНИЯ ЭТИХ ПРОБЛЕМ
Авторы этого изобретения провели интенсивные исследования для достижения этой цели. В результате, они обнаружили, что пептид, имеющий часть последовательности смежных аминокислот, представляющей белок WT1, функционирует в качестве ракового антигенного хелперного пептида, другими словами, этот пептид экспонируется (представляется) на антигенпрезентирующих клетках связыванием с молекулой МНС класса II и индуцирует WT1-специфические хелперные Т-клетки, и показали, что этот пептид может быть использован в фармацевтической композиции для лечения/предупреждения рака.
Таким образом, данное изобретение обеспечивает:
(1) Пептид, который имеет аминокислотную последовательность, состоящую из смежных аминокислот, полученную из белка WT1, и индуцирует WT1-специфические хелперные Т-клетки связыванием с молекулой МНС класса II, где эта аминокислотная последовательность выбрана из группы, состоящей из:
(а) аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO:3;
(b) аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO:4;
(с) аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO:5, и
(d) аминокислотной последовательности, в которой одна или несколько аминокислот являются замещенными, делетированными или добавленными в аминокислотных последовательностях, изображенных в (а)-(с);
(2) Пептид по (1), где этой аминокислотной последовательностью является аминокислотная последовательность, изображенная в SEQ ID NO:3;
(3) Пептид по (1) или (2), где эта молекула МНС класса II выбрана из группы, состоящей из DRB1* 0101, DRB1* 0405, DRB1* 0802, DRB1* 0803, DRB1* 0901, DRB1* 1201, DRB1* 1403, DRB1* 1501, DRB1* 1502, DPB1* 0201, DPB1* 0202, DPB1* 0402, DPB1* 0501, DPB1* 0901, DQB1* 0301, DQB1* 0302, DQB1* 0401, DQB1* 0501, DQB1* 0601, DQB1* 0602 и DRB5* 0102;
(4) Пептид по (1) или (2), где эта молекула МНС класса II выбрана из группы, состоящей из DRB1* 0101, DRB1* 0405, DRB1* 1502, DPB1* 0201, DPB1* 0202 и DQB1* 0601;
(5) Полинуклеотид, кодирующий пептид по любому из (1)-(4);
(6) Экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид по (5);
(7) Антитело против пептида по любому из (1)-(4) или полинуклеотид по (5);
(8) Фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения рака, содержащая пептид по любому из (1)-(4), полинуклеотид по (5) или вектор по (6);
(9) Способ лечения или предупреждения рака, который предусматривает введение эффективного количества пептида по любому из (1)-(4), полинуклеотида по (5) или вектора по (6) субъекту, имеющему молекулу МНС класса II по (3) или (4);
(10) Применение пептида по любому из (1)-(4), полинуклеотида по (5) или вектора по (6) для лечения или предупреждения рака;
(11) Антигенпрезентирующие клетки, которые экспонируют (представляют) пептид по любому из (1)-(4) посредством молекулы МНС класса II по (3) или (4);
(12) Способ индукции антигенпрезентирующих клеток, который предусматривает культивирование незрелых антигенпрезентирующих клеток в присутствии пептида по любому из (1)-(4) и индукцию антигенпрезентирующих клеток, которые экспонируют (представляют) этот пептид посредством молекулы МНС класса II по (3) или (4), из незрелых антигенпрезентирующих клеток;
(13) WT1-специфические хелперные Т-клетки, которые индуцируются пептидом по любому из (1)-(4);
(14) Способ индукции WT1-специфических хелперных Т-клеток, который предусматривает культивирование мононуклеарных клеток периферической крови в присутствии пептида по любому из (1)-(4) и индукцию WT1-специфических хелперных Т-клеток из этих мононуклеарных клеток периферической крови;
(15) Набор для индукции WT1-специфических хелперных Т-клеток, содержащий, в качестве существенного ингредиента, пептид по любому из (1)-(4);
(16) Набор для предупреждения или лечения рака, содержащий, в качестве существенного ингредиента, пептид по любому из (1)-(4), полинуклеотид по (5) или вектор по (6);
(17) Способ определения присутствия или количества WT1-специфических хелперных Т-клеток в субъекте, имеющем молекулу МНС класса II по (3) или (4), причем указанный способ предусматривает стадии:
(а) реакции пептида по любому из (1)-(4) с пробой, полученной из этого субъекта; и затем
(b) определения присутствия или количества цитокина, содержащегося в этой пробе.
ЭФФЕКТЫ ЭТОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно данному изобретению, можно получать хелперные пептиды WT1, которые связываются со многими типами молекул МНС класса II, такими как DRB1* 0101, DRB1* 0405, DRB1* 0802, DRB1* 0803, DRB1* 0901, DRB1* 1201, DRB1* 1403, DRB1* 1501, DRB1* 1502, DPB1* 0201, DPB1* 0202, DPB1* 0402, DPB1* 0501, DPB1* 0901, DQB1* 0301, DQB1* 0302, DQB1* 0401, DQB1* 0501, DQB1* 0601, DQB1* 0602 и DRB5* 0102, фармацевтическую композицию для лечения/предупреждения рака, включающую в себя их и т.п. Таким образом, становится возможной индукция WT1-специфических хелперных Т-клеток in vivo и in vitro в различных субъектах (в частности, большинство японцев имеют вышеуказанные молекулы). Поскольку WT1-специфические хелперные Т-клетки индуцируются данным изобретением, можно также эффективно активировать Т-клетки и В-клетки в раке, экспрессирующем WT1 в высокой степени.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1 показывает результаты, полученные измерением пролиферации клеток после стимуляции каждой пептид-специфической Т-клеточной линии, которую получали обработкой в импульсном режиме каждым из трех пептидов (mWT135, mWT186 и mWT1294), с каждым пептидом. На этом рисунке, символ “-“ показывает отсутствие стимуляции пептидом.
Фиг.2 показывает результаты, полученные измерением пролиферации клеток после стимуляции каждой пептид-специфической Т-клеточной линии, которую получали обработкой в импульсном режиме тремя пептидами (mWT135, mWT186 и mWT1294), с каждым соответствующим пептидом в присутствии анти-МНС класса I или II-антитела. На этом рисунке, символ “-“ показывает отсутствие стимуляции пептидом. Символ “имп/мин” в ординате показывает количество импульсов в минуту.
Фиг.3 показывает результаты, полученные измерением пролиферации клеток каждой WT1-пептид-специфической Т-клеточной линии в ответ на клетки С1498, клетки С1498, обработанные в импульсном режиме тремя пептидами (mWT135, mWT186 и mWT1294), а также клетки С1498, имеющие усиленную экспрессию белка WT1. Символ “имп/мин” в ординате показывает количество импульсов в минуту.
Фиг.4 показывает результаты, полученные измерением IFN-γ-продуцирующей способности в каждой пептид-специфической Т-клеточной линии, полученной обработкой в импульсном режиме тремя пептидами (mWT135, mWT186 и mWT1294).
Фиг.5 показывает результаты, полученные измерением CTL-цитотоксической активности трех пептидов (mWT135, mWT186 и mWT1294). ● показывает результаты экспериментов, проводимых с использованием клеток RMAS, обработанные в импульсном режиме пептидом WT1126 (рестриктированным МНС класса I пептидом). ○ показывает результаты экспериментов, проводимых с использованием контрольных клеток RMAS.
Фиг.6 показывает схематическое изображение временного ряда при проведении имплантации опухоли и иммунизации в эксперименте с имплантацией опухоли. Иммунизацию хелперным пептидом mWT135 проводили в 7-й, 14-й и 21-й дни после подкожной имплантации WT1-экспрессирующих лейкозных клеток мышам и вскрытие проводили в 29-й день. Направленные вниз белые стрелки показывают временные точки, в которых внутрикожно вводили контроль (ЗФР) (IFA/30 мкл). Направленные вниз черные стрелки показывают временные точки, в которых внутрикожно вводили хелперный пептид mWT135 (50 мкМ/IFA/30 мкл).
Фиг.7 показывает размеры опухолей в мышах, иммунизированных хелперным пептидом mWT135, и долю не имеющих заболевания популяций мышей. В мышах, иммунизированных хелперным пептидом mWT135, 4 из 10 мышей не имели заболевания. С другой стороны, в мышах, иммунизированных контролем, в 9 мышах не было мышей без заболевания.
Фиг.8 показывает коэффициент выживаемости без заболевания в мышах, иммунизированных хелперным пептидом mWT135.
Фиг.9 показывает цитотоксическую активность CTL в мышах, иммунизированных хелперным пептидом mWT135. ● показывает результаты экспериментов, проводимых с использованием клеток RMAS, обработанных в импульсном режиме пептидом mWT1126 (пептидом МНС I). ○ показывает результаты экспериментов, проводимых с использованием контрольных клеток RMAS. Число в скобках обозначает размер опухоли (мм).
Фиг.10 показывает цитотоксическую активность mWT1-специфических CTL в контрольных мышах. ● показывает результаты экспериментов, проводимых с использованием клеток RMAS, обработанных в импульсном режиме пептидом mWT1126 (пептидом МНС I). ○ показывает результаты экспериментов, проводимых с использованием контрольных клеток RMAS. Число в скобках обозначает размер опухоли (мм).
Фиг.11 показывает цитотоксическую активность mWT1126 специфических CTL (слева) и долю WT1126 тетрамер-положительных Т-клеток (справа) при введении пептида WT135.
Фиг.12 показывает результаты, полученные измерением пролиферации клеток посредством стимуляции пептидом WT135, в мононуклеарных клетках периферической крови каждого здорового субъекта, имеющего молекулы МНС класса I.
Фиг.13 показывает результаты, полученные измерением пролиферации клеток при лечении Респондера [PBMC, полученных из DRB1* 0101/0405-, DPB1* 0201/0402- и DQB1* 0401/0501-положительного здорового субъекта (здорового субъекта А)] Стимулятором [PBMC, полученными из DRB1* 0405/0901-, DPB1* 0201/0501- и DQB1* 0303/0401-положительного субъекта (здорового субъекта В)]. Ордината показывает количество включенного 3Н-тимидина (имп/мин). Абсцисса показывает типы различных добавленных антител (без антитела, анти-HLA-DR-антитела, анти-HLA-DP-антитела и анти-HLA-DQ-антитела).
Фиг.14 показывает результаты, полученные измерением пролиферации клеток при лечении Респондера [PBMC, полученных из DRB1* 0101/0405-, DPB1* 0201/0402- и DQB1* 0401/0501-положительного здорового субъекта (здорового субъекта А)] Стимулятором [PBMC, полученными из DRB1* 0405/0803-, DPB1* 0202/0501- и DQB1* 0401/0601-положительного субъекта (здорового субъекта G)]. Ордината показывает количество включенного 3Н-тимидина (имп/мин). Абсцисса показывает типы различных добавленных антител (без антитела, анти-HLA-DR-антитела, анти-HLA-DP-антитела и анти-HLA-DQ-антитела).
Фиг.15 показывает результаты, полученные измерением пролиферации клеток при лечении Респондера [PBMC, полученных из DRB1* 0101/0405-, DPB1* 0201/0402- и DQB1* 0401/0501-положительного здорового субъекта (здорового субъекта А)] Стимулятором [PBMC, полученными из DRB1* 0101/0803-, DPB1* 0501/- и DQB1* 0501/0601-положительного субъекта (здорового субъекта Н)]. Ордината показывает количество включенного 3Н-тимидина (имп/мин). Абсцисса показывает типы различных добавленных антител (без антитела, анти-HLA-DR-антитела, анти-HLA-DP-антитела и анти-HLA-DQ-антитела).
Фиг.16 показывает результаты, полученные измерением IFN-γ-продуцирующей способности при лечении Респондера [PBMC, полученных из DRB1* 0405/0803-, DPB1* 0202/0501- и DQB1* 0401/0601-положительного здорового субъекта (здорового субъекта G)] Стимулятором [l-клетки, содержащие включенный ген DQB1* 0601]. Ордината показывает долю количества IFN-γ в Т-клетках. Абсцисса показывает присутствие или отсутствие IFN-γ (+ или -) импульса с пептидом WT135.
Фиг.17 показывает результаты, полученные измерением пролиферации клеток при лечении Респондера [PBMC, полученных из DRB1* 1502/1502-, DPB1* 0201/0901- и DQB1* 0601/0601-положительного здорового субъекта (здорового субъекта D)] Стимулятором [PBMC, полученными из того же самого здорового субъекта, что и в случае респондера). Ордината показывает количество включенного 3Н-тимидина (имп/мин). Абсцисса показывает типы различных добавленных антител (без антитела, анти-HLA-DR-антитела, анти-HLA-DP-антитела и анти-HLA-DQ-антитела).
Фиг.18 показывает результаты, полученные измерением IFN-γ-продуцирующей способности при лечении Респондера [PBMC, полученных из DRB1* 0101/1501-, DPB1* 0201/0402- и DQB1* 0501/0602-положительного здорового субъекта (здорового субъекта I)] Стимулятором [PBMC, полученными из того же самого здорового субъекта, что и в случае респондера). Ордината показывает долю количества IFN-γ в Т-клетках. Абсцисса показывает присутствие или отсутствие IFN-γ (+ или -) импульса с пептидом WT135.
СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном аспекте, данное изобретение относится к пептиду, имеющему аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислот, полученных из белка WT1 мыши или человека. Ген WT1 экспрессируется в высокой степени, например, в опухолях гемопоэтических органов, таких как лейкоз; миелодиспластический синдром, множественная миелома и злокачественная лимфома; солидных раках, таких как рак желудка, рак кишечника, рак легкого, рак молочной железы, рак половых клеток, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак шейки матки и рак яичника. Таким образом, пептид данного изобретения присутствует в раковых клетках, экспрессирующих в большом количестве ген WT1.
Пептид данного изобретения является пептидом, который имеет аминокислотную последовательность, состоящую из смежных аминокислот, полученных из белка WT1 человека, изображенную в SEQ ID NO:2, сохраняет способность связываться с молекулами МНС класса II, как показано ниже, и имеет способность индуцировать WT1-специфические хелперные Т-клетки. Не существует конкретного ограничения в отношении этой аминокислотной последовательности и длины пептида данного изобретения, пока этот пептид имеет вышеуказанные признаки. Однако слишком длинный пептид чувствителен к действию протеаз, а слишком короткий пептид не может связываться с пептидом, приспособленным к углублению бороздки. Длина пептида данного изобретения равна предпочтительно 10-25 аминокислотам, более предпочтительно 15-21 аминокислотам, еще более предпочтительно 16-20 аминокислотам, например, 17 аминокислотам, 18 аминокислотам или 19 аминокислотам. Конкретными примерами пептида данного изобретения являются пептиды, имеющие аминокислотную последовательность, изображенную в SEQ ID NO:3; аминокислотную последовательность, изображенную в SEQ ID NO:4, и аминокислотную последовательность, изображенную в SEQ ID NO:5.
Пептид данного изобретения включает в себя также варианты вышеупомянутых пептидов. Эти варианты могут содержать, например, пептид, выбранный из группы, состоящей из пептидов, имеющих аминокислотную последовательность, которая имеет замену, делецию или добавление нескольких аминокислот, например, 1-9, предпочтительно 1-5, 1-4, 1-3, более предпочтительно 1-2 аминокислот, еще более предпочтительно одной аминокислоты в одной из указанных выше аминокислотных последовательностей. Замена аминокислот в пептидах может проводиться в любых положениях и любыми типами аминокислот. Предпочтительными являются консервативные аминокислотные замены. Например, остаток Glu может быть заменен остатком Asp, остаток Phe остатком Tyr, остаток Leu остатком Ile, остаток Ala остатком Ser, остаток His остатком Arg. Добавление или делеция аминокислот может проводиться предпочтительно на N-конце и С-конце в пептидах, но может проводиться во внутренней последовательности. Предпочтительный конкретный пример пептида данного изобретения имеет последовательность SEQ ID NO:3. В этой связи, все вышеуказанные пептиды должны сохранять способность связываться с молекулой МНС класса II и быть способными индуцировать WT1-специфические хелперные Т-клетки.
В этой связи, молекула МНС класса II, с которой связывается пептид данного изобретения, может принадлежать к любому подклассу HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP. Предпочтительно, молекула МНС класса II является молекулой, выбранной из группы, состоящей из DRB1* 0101, DRB1* 0405, DRB1* 0802, DRB1* 0803, DRB1* 0901, DRB1* 1201, DRB1* 1403, DRB1* 1501, DRB1* 1502, DPB1* 0201, DPB1* 0202, DPB1* 0402, DPB1* 0501, DPB1* 0901, DQB1* 0301, DQB1* 0302, DQB1* 0401, DQB1* 0501, DQB1* 0601, DQB1* 0602 и DRB5* 0102. Более предпочтительно, молекулой МНС класса II является DRB1* 0101, DRB1* 0405, DRB1* 1403, DRB1* 1502, DPB1* 0201, DPB1* 0202, DPB1* 0901, DQB1* 0301, DQB1* 0601 или DRB5* 0102 и наиболее предпочтительно DRB1* 0101, DRB1* 0405, DRB1* 1502, DPB1* 0201, DPB1* 0202 или DQB1* 0601. В данном описании, пептид, который сохраняет способность индуцировать WT1-специфические хелперные Т-клетки, называют хелперным пептидом WT1. В описанных ниже примерах, пептид, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную в SEQ ID NO:3, называют также пептидом WT135, хелперным пептидом WT135 или пептидом WT135.
Пептид данного изобретения может быть также пептидом, имеющим аминокислотную последовательность, состоящую из смежных аминокислот, полученную из белка WT1 мыши, изображенную в SEQ ID NO:1, и вышеуказанная аминокислотная последовательность может быть пептидом (SEQ ID NO:6), в котором аминокислотный остаток в положении 9 в аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO:4, заменен лейцином; или пептидом (SEQ ID NO:7), в котором аминокислотный остаток в положении 11 в аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO:5, заменен серином. Кроме того, пептид данного изобретения может содержать пептид, выбранный из группы, состоящей из пептидов, имеющих аминокислотную последовательность, которая имеет замену, делецию или добавление нескольких аминокислот, например, 1-9, предпочтительно 1-5, 1-4, 1-3, более предпочтительно 1-2 аминокислот, еще более предпочтительно одной аминокислоты в аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:7. В описанных ниже примерах, пептид, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную в SEQ ID NO:6, называют также пептидом WT186 или хелперным пептидом WT186, и пептид, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную в SEQ ID NO:7, пептидом WT1294, хелперным пептидом WT1294.
Пептид данного изобретения может быть произведен из белка WT1 и может состоять из вышеуказанной последовательности смежных аминокислот или содержать эту последовательность. Таким образом, пептид данного изобретения может быть, например, пептидом, состоящим из самой вышеуказанной аминокислотной последовательности, или белком WT1, содержащим вышеуказанную аминокислотную последовательность или ее часть. Пептид данного изобретения может быть также пептидом, полученным модификацией вышеуказанной аминокислотной последовательности. Аминокислотные остатки в вышеуказанной аминокислотной последовательности могут быть модифицированы известным способом. Такой модификацией может быть например, эстерификация, алкилирование, галогенирование, фосфорилирование, сульфирование, амидирование и т.п. на функциональной группе в боковой цепи аминокислотного остатка, входящего в состав пептида. Можно также связывать различные вещества с N-концом и/или С-концом пептида, содержащего вышеуказанную аминокислотную последовательность. Например, с этим пептидом могут быть связаны аминокислота, пептид, его аналог и т.п. В случае, если эти вещества связаны с пептидом данного изобретения, они могут быть обработаны, например, ферментом in vivo и т.п., или с использованием такого способа, как внутриклеточный процессинг, таким образом, что, в конечном счете, генерируют пептид, состоящий из вышеуказанной аминокислотной последовательности, которая представлена на поверхности клетки в виде комплекса с молекулой МНС класса II, являющийся посредством этого способным к генерированию эффекта индукции хелперных Т-клеток. Эти вещества могут быть веществами, регулирующими растворимость пептида этого изобретения, веществами, улучшающими стабильность этого пептида, например, устойчивость к протеазам, веществами, делающими возможной специфическую доставку пептида данного изобретения, например, к конкретной ткани или конкретному органу, или веществами, имеющими усиливающее действие на эффективность поглощения антигенпрезентирующих клеток или другое действие. Эти вещества могут быть также веществами, увеличивающими способность индукции CTL, например, хелперными пептидами, другими, чем пептид данного изобретения.
Модификация пептида данного изобретения может быть модификацией аминогруппы на N-концевой аминокислоте или карбоксильной группы на С-концевой аминокислоте этого пептида. Модифицирующие группы аминокислотной группы на N-концевой аминокислоте включают в себя, например, одну-три алкильные группы, имеющие 1-6 атомов углерода, фенильные группы, циклоалкильные группы и ацильные группы. Конкретные примеры ацильной группы включают в себя алканоильную группу, имеющую 1-6 атомов углерода, алканоильную группу, имеющую 1-6 атомов углерода, замещенную фенильной группой, карбонильную группу, замещенную циклоалкильной группой, имеющей 5-7 атомов углерода, алкилсульфонильную группу, имеющую 1-6 атомов углерода, фенилсульфонильную группу, алкоксикарбонильную группу, имеющую 2-6 атомов углерода, алкоксикарбонильную группу, замещенную фенильной группой, карбонильную группу, замещенную циклоалкоксигруппой, имеющей 5-7 атомов углерода, феноксикарбонильную группу и т.п. Пептиды, имеющие модификацию карбоксильной группы на С-концевой аминокислоте, включают в себя, например, эстерифицированные и амидированные пептиды. Конкретные примеры этого сложного эфира включают в себя сложный алкиловый эфир, имеющий 1-6 атомов углерода, сложный алкиловый эфир, имеющий 0-6 атомов углерода, замещенный фенильной группой, сложный циклоалкиловый эфир, имеющий 5-7 атомов углерода и т.п., и конкретные примеры амида включают в себя амид, амид, замещенный одной или двумя алкильными группами, имеющими 1-6 атомов углерода, амид, замещенный одной или двумя алкильными группами, имеющими 0-6 атомов углерода, замещенными фенильной группой, амид, образующий 5-, 7-членный азоциклоалкан, включающий в себя атом азота амидной группы, и т.п.
Модификация пептида данного изобретения может проводиться также связыванием аминокислотных остатков друг с другом через связь, другую чем пептидная связь, такую как связь углерод-углерод и связь углерод-сера. Кроме того, пептид данного изобретения может содержать одну или несколько D-аминокислот.
Вышеупомянутые пептиды, вариантные пептиды и модифицированные пептиды согласно данному изобретению являются только иллюстративными, и специалисты с квалификацией в данной области могут легко допустить, получить, оценить и использовать другие вариации вышеуказанных пептидов.
Пептид данного изобретения может быть синтезирован с использованием способа, рутинно используемого в данной области или его модифицированного способа. Такой способ синтеза описан, например, в Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol.2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1975; Basis and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1985; Development of Medicines (continuation), Vol.14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten Co., 1991 и т.п. Пептид данного изобретения может быть получен с использованием способа генетической инженерии на основе информации нуклеотидной последовательности, кодирующей пептид данного изобретения. Такой способ генетической инженерии хорошо известен квалифицированным в данной области специалистам. Такой способ может проводиться в соответствии со способом, описанным в литературе [Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983); DNA Cloning, DM. Glover. IRL PRESS (1985)], как описано выше, или способом, описанным ниже, и другими способами.
Можно определить, связывается ли пептид данного изобретения или его кандидатный пептид с вышеуказанной молекулой МНС класса II и индуцирует ли хелперные Т-клетки, известным способом, например, таким как способ, описанный в Cancer Immunol. Immunother. 51:271 (2002), или способ, описанный в примерах данного описания, и другими способами.
Поскольку пептид данного изобретения активирует хелперные Т-клетки (CD4-положительные Т-клетки), этот пептид индуцирует и поддерживает дифференцировку CTL и проявляет действие активации эффекторных клеток, таких как макрофаги. Таким образом, можно использовать пептид данного изобретения для эффективного лечения или предупреждения рака.
В другом аспекте, данное изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему вышеуказанный хелперный пептид WT1 (далее называемый здесь полинуклеотидом WT1). Полинуклеотид данного изобретения может быть ДНК или РНК. Последовательность оснований полинуклеотида данного изобретения может быть определена на основе аминокислотной последовательности вышеуказанного хелперного пептида WT1. Этот полинуклеотид может быть получен, например, способом синтеза ДНК или РНК, ПЦР-способом и т.п.
Полинуклеотид данного изобретения включает в себя полинуклеотид, который гибридизуется с комплементарной последовательностью полинуклеотида, кодирующего пептид данного изобретения, при строгих условиях и кодирует пептид, имеющий активность, сравнимую с активностью пептида данного изобретения. Что касается термина “гибридизуются при строгих условиях”, используемая здесь гибридизация может проводиться в соответствии с общепринятым способом, описанным, например, в Molecular Cloning, 2nd edition, Sambrook, J., Frisch, E.F., Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) и т.п. Термин “строгие условия” включает в себя, например, условия, в которых гибрид образуется в растворе, содержащем 6×SSC (10×SSC является раствором, содержащим 1,5 М NaCl и 0,15 М тринатрийцитрат) и 50% формамид, при 45°С и затем промывают 2×SSC при 50°С (Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1.-6.3.6) и т.п.
Еще в одном аспекте, данное изобретение относится к экспрессирующему вектору, содержащему вышеуказанный полинуклеотид (далее называемому здесь также экспрессирующим вектором WT1). Тип экспрессирующих векторов, других последовательностей, содержащихся, наряду с вышеуказанной полинуклеотидной последовательностью, и т.п. может быть выбран должным образом в зависимости от типа хозяев, в которые вводят эти экспрессирующие векторы, от цели этого введения и т.п. Примеры этого экспрессирующего вектора включают в себя плазмиды, фаговые векторы, вирусные векторы и т.п. В случае, когда хозяином являются клетки Escherichia coli, примеры этого вектора включают в себя плазмидные векторы, такие как pUC118, pUC119, pBR322 и pCR3, а также фаговые векторы, такие как λZAPII и λgt11. В случае, когда хозяином являются дрожжевые клетки, примеры этого вектора включают в себя pYES2, pYEUra3 и т.п. В случае, когда хозяином являются клетки насекомых, примером этого вектора является pAcSGHisNT-A и т.п. В случае, когда хозяином являются клетки животного, примеры этого вектора включают в себя плазмидные векторы, такие как pKCR, pCDM8, pGL2, pcDNA3.1, pRc/RSV и pRc/CMV, вирусные векторы, такие как ретровирусный вектор, аденовирусный вектор и аденоассоциированный вирусный вектор. Этот вектор может необязательно содержать такие факторы, как индуцируемый экспрессией промотор, ген, кодирующий сигнальную последовательность, маркерный ген для отбора и терминатор. Для легкого выделения и легкой очистки к этому вектору могут быть добавлены последовательность, экспрессируемая в виде слитого белка с тиоредоксином, His-метка, GST (глутатион-S-трансфераза) и т.п. В этом случае, можно использовать GST-слитый белковый вектор (pGEX4T и другие), имеющий подходящий промотор (lac, tac, trc, trp, CMV, ранний промотор SV40 и т.д.), функциональный в клетках-хозяевах, вектор (pcDNA3.1/Myc-His, и т.д.), имеющий последовательность-метку, такую как Myc и His, а также вектор (pET32a), экспрессирующий слитый белок с тиоредоксином и His-метку, и т.п.
При введении экспрессирующего вектора данного изобретения субъекту для получения хелперного пептида WT1 in vivo, WT1-специфические хелперные Т-клетки, индуцированные этим пептидом, продуцируют различные цитокины (например, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 или интерферон (IFN), и т.д.) и стимулируют пролиферацию, дифференцировку и созревание В-клеток и других Т-клеток. Таким образом, опухолевые клетки, которые имеют молекулу МНС класса II и экспрессируют в высокой степени WT1, могут повреждаться специфически с использованием этого экспрессирующего вектора WT1 данного изобретения.
В другом аспекте, данное изобретение относится к антителу против вышеуказанного хелперного пептида WT1 или полинуклеотида, кодирующего этот пептид (далее называемому здесь антителом WT1). Антитело данного изобретения может быть либо поликлональным антителом, либо моноклональным антителом. Способ получения такого антитела уже известен, и антитело данного изобретения может быть получено также в соответствии с таким общепринятым способом (Current protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., (ed.), 1987, John Wiley and Sons (pub.), Section 11.12-11.13, Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H.D. et al., (ed.), Cold Spring Harber Laboratory Press (pub.), New York, 1989).
Данное изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения или предупреждения рака, содержащей вышеуказанный хелперный пептид WT1, полинуклеотид WT1 или экспрессирующий вектор WT1. Ген WT1 экспрессируется в высокой степени, например, в опухолях гемопоэтических органов, таких как лейкоз, миелодиспластический синдром, множественная миелома и злокачественная лимфома, а также солидных раках, таких как рак желудка, рак кишечника, рак легкого, рак молочной железы, рак половых клеток, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак шейки матки и рак яичника, и, следовательно, эту фармацевтическую композицию данного изобретения можно использовать для лечения или предупреждения рака, экспрессирующего ген WT1. При введении фармацевтической композиции данного изобретения субъекту, имеющему молекулу МНС класса II, WT1-специфические хелперные Т-клетки, индуцируемые хелперным пептидом WT1, содержащимся в этой фармацевтической композиции, продуцируют различные цитокины (например, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 или интерферон (IFN), и т.д.) и стимулируют пролиферацию, дифференцировку и созревание В-клеток и других субпопуляций Т-клеток. Таким образом, опухолевые клетки, которые имеют молекулу МНС класса I и экспрессируют в высокой степени WT1, могут специфически повреждаться с использованием пептида данного изобретения.
Фармацевтическая композиция данного изобретения может содержать, например, носитель, эксципиент и т.п., наряду с вышеуказанным хелперным пептидом WT1, полинуклеотидом WT1 или экспрессирующим вектором WT1, в качестве эффективного компонента. Хелперный пептид WT1, содержащийся в фармацевтической композиции данного изобретения, индуцирует WT1-специфические хелперные Т-клетки, и, следовательно, фармацевтическая композиция данного изобретения может содержать подходящий адъювант или может вводиться с подходящим адъювантом для усиления эффективности индукции. Примеры предпочтительного адъюванта включают в себя, но не ограничиваются ими, полный или неполный адъювант Фрейнда, гидроксид алюминия и т.п. Фармацевтическая композиция данного изобретения может также содержать известный антигенный пептид рака, другой, чем вышеуказанный хелперный пептид WT1, например, пептид WT1126, индуцирующий WT1-специфические CTL, в качестве эффективного компонента (Oka et al., “Cancer immunotherapy targeting Wilms' tumor gene WT1 product”, Journal of Immunology, 164:1873-1880, 2000; и Oka et al., “Human cytotoxic T-lymphocyte responses specific for peptides of the wild-type Wilms' tumor gene (WT1) product”, Immunogenetics, 51: 99-107, 2000).
Кроме того, фармацевтическая композиция данного изобретения может вводиться в комбинации с известным раковым антигенным пептидом. Например, известный раковый антигенный пептид, например, пептид WT1126, может вводиться до или после введения фармацевтической композиции данного изобретения. Фармацевтическая композиция данного изобретения имеет признак, который активирует В-клетки или другие Т-клетки индуцированием WT1-специфических хелперных Т-клеток, и, следовательно, можно дополнительно усиливать активность CTL, индуцированных введением известного ракового антигенного пептида, и значительно увеличивать терапевтические действия.
Способ введения фармацевтической композиции данного изобретения может быть соответствующим образом выбран в зависимости от таких условий, как тип заболеваний, состояние субъектов и сайты нацеливания. Примеры способа введения включают в себя, но не ограничиваются ими, внутрикожное введение, подкожное введение, внутримышечное введение, внутривенное введение, трансназальное введение, пероральное введение и т.п. Способом введения может быть также терапия с использованием лимфоцитов или терапия с использованием DC (дендритных клеток). Количество пептида, содержащееся в фармацевтической композиции данного изобретения, форма и частота введения этой фармацевтической композиции и т.п. могут быть соответствующим образом выбрано в зависимости от таких условий, как тип заболеваний, состояние субъектов и сайты нацеливания. Обычно, количество пептида, вводимого на одну дозу, равно 0,0001-1000 мг и предпочтительно 0,001-10000 мг.
В другом аспекте, данное изобретение относится к способу лечения или предупреждения рака, который предусматривает введение эффективного количества вышеописанной фармацевтической композиции субъекту, имеющему вышеупомянутую молекулу МНС класса II. Подлежащими лечению карциномами могут быть любые карциномы, пока они экспрессируют ген WT1, и включают в себя, например, опухоли гемопоэтических органов, такие как лейкоз, миелодиспластический синдром, множественную миелому и злокачественную лимфому, а также солидные типы раков, такие как рак желудка, рак кишечника, рак легкого, рак молочной железы, рак половых клеток, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак шейки матки и рак яичника.
В другом аспекте, данное изобретение относится к применению вышеуказанного хелперного пептида WT1, полинуклеотида WT1 или экспрессирующего вектора WT1 для лечения или предупреждения рака.
Еще в одном аспекте, данное изобретение относится к применению хелперного пептида WT1 для получения фармацевтической композиции для лечения или предупреждения рака.
Еще в одном другом аспекте, данное изобретение относится к применению полинуклеотида WT1 или экспрессирующего вектора WT1 для получения фармацевтической композиции, содержащей вышеуказанные полинуклеотид WT1 или экспрессирующий вектор WT1.
В другом аспекте, данное изобретение относится к клеткам, включающим в себя вышеуказанные хелперный пептид WT1, полинуклеотид WT1 или экспрессирующий вектор WT1. Эти клетки данного изобретения могут быть получены, например, трансформацией клеток-хозяев, таких как клетки Escherichia coli, дрожжевые клетки, клетки насекомых и клетки животных, с использованием вышеуказанного экспрессирующего вектора. Трансформация клеток-хозяев экспрессирующим вектором может проводиться с использованием различных способов, выбранных должным образом. Пептид данного изобретения может быть получен культивированием трансформированных клеток и извлечением и очисткой продуцируемого ими хелперного пептида WT1.
Еще в одном аспекте, данное изобретение относится к антигенпрезентирующим клеткам (например, дендритным клеткам, В-лимфоцитам, макрофагам и т.д.), которые экспонируют (представляют) вышеописанный хелперный пептид WT1 посредством молекулы МНС класса II. Антигенпрезентирующие клетки данного изобретения индуцируются вышеуказанным хелперным пептидом WT1. WT1-специфические хелперные Т-клетки эффективно индуцируются с использованием антигенпрезентирующих клеток данного изобретения.
Еще в одном другом аспекте, данное изобретение относится к способу индуцирования антигенпрезентирующих клеток, которые экспонируют (представляют) хелперный пептид WT1 посредством молекулы МНС класса II, причем этот способ предусматривает культивирование незрелых антигенпрезентирующих клеток в присутствии хелперного пептида WT1 и индуцирование антигенпрезентирующих клеток, которые экспонируют (представляют) вышеописанный хелперный пептид WT1 посредством молекулы МНС класса II, из этих незрелых антигенпрезентирующих клеток. В данном описании, незрелыми антигенпрезентирующими клетками называют клетки, которые могут стать антигенпрезентирующими клетками, такие как, например, дендритные клетки, В-лимфоциты и макрофаги, после созревания. Субъекты, из которых получают незрелые антигенпрезентирующие клетки, могут быть любыми субъектами, пока они имеют молекулу МНС класса II. Поскольку незрелые антигенпрезентирующие клетки содержатся, например, в мононуклеарных клетках периферической крови и т.п., такие клетки можно культивировать в присутствии вышеописанного хелперного пептида WT1.
В другом аспекте, данное изобретение относится к способу лечения или предупреждения рака, предусматривающему введение антигенпрезентирующих клеток, которые экспонируют (представляют) хелперный пептид WT1 посредством вышеописанной молекулы МНС класса II, субъекту, имеющему ту же самую молекулу, что и вышеописанная молекула МНС класса II. Способ введения антигенпрезентирующих клеток может быть соответствующим образом выбран в зависимости от таких условий, как тип заболеваний, состояние субъектов и сайты нацеливания. Примеры этого способа включают в себя, но не ограничиваются ими, внутривенное введение, внутрикожное введение, подкожное введение, внутримышечное введение, трансназальное введение, пероральное введение и т.п.
Еще в одном аспекте, данное изобретение относится к способу предупреждения или лечения рака индукцией антигенпрезентирующих клеток, которые экспонируют (представляют) вышеописанный хелперный пептид WT1 посредством молекулы МНС класса II, причем этот способ предусматривает стадии:
(а) реакции пробы с нуклеотидной последовательностью, кодирующей аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:2) белка WT1, или нуклеиновой кислотой, имеющей ее частичную последовательность, или вышеуказанным хелперным пептидом WT1;
(b) получения антигенпрезентирующих клеток, которые экспонируют (представляют) хелперный пептид WT1, содержащийся в этой пробе, посредством вышеуказанной молекулы МНС класса II; и
(с) введения антигенпрезентирующих клеток субъекту, имеющему ту же самую молекулу, что и вышеуказанная молекула МНС класса II.
Пробами в вышеуказанном способе могут быть любые пробы, пока они имеют возможность содержания лимфоцитов или дендритных клеток и включают в себя, например, полученные из субъекта пробы, такие как кровь, растворы культуры клеток и т.п. Реакция в вышеуказанном способе может проводиться с использованием общепринятого способа и предпочтительно с использованием электропорации. Получение антигенпрезентирующих клеток может проводиться с использованием способа, известного квалифицированным в данной области специалистам. Условия культивирования клеток в пробе в каждой стадии могут быть определены соответствующим образом квалифицированными в данной области специалистами. Способ введения этих антигенпрезентирующих клеток может быть способом, описанным выше.
В следующем аспекте, данное изобретение относится к WT1-специфическим хелперным Т-клеткам, индуцированным вышеуказанным хелперным пептидом WT1. Хелперные Т-клетки данного изобретения индуцируются, пролиферируют и активируются при узнавании комплекса хелперного пептида WT1 с молекулой МНС класса II. Эти активированные WT1-специфические хелперные Т-клетки продуцируют цитокины, такие как IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, или интерферон (IFN) и стимулируют пролиферацию, дифференцировку и созревание В-клеток и других субпопуляций Т-клеток. Таким образом, опухолевые клетки, которые имеют молекулу МНС класса I и экспрессируют в высокой степени WT1, могут специфически повреждаться с использованием хелперных Т-клеток данного изобретения.
В другом аспекте, данное изобретение относится к способу индуцирования WT1-специфических хелперных Т-клеток, предусматривающему культивирование мононуклеарных клеток периферической крови в присутствии хелперного пептида WT1 и индуцирование WT1-специфических хелперных Т-клеток из мононуклеарных клеток периферической крови. Субъекты, из которых получают мононуклеарные клетки периферической крови, могут быть любыми субъектами, пока они имеют вышеуказанную молекулу МНС класса II. Культивированием мононуклеарных клеток периферической крови в присутствии хелперного пептида WT1, WT1-специфические хелперные Т-клетки индуцируются из клеток-предшественников хелперных Т-клеток в мононуклеарных клетках периферической крови. Можно лечить или предупреждать опухоли гемопоэтических органов и солидные опухоли в субъекте введением WT1-специфических хелперных Т-клеток, полученных согласно данному изобретению, субъекту, имеющему вышеуказанную молекулу МНС класса II. В этой связи, мононуклеарные клети периферической крови в данном изобретении включают в себя незрелые антигенпрезентирующие клетки (например, клетки-предшественники дендритных клеток, В-лимфоциты, макрофаги и т.д.). Поскольку незрелые антигенпрезентирующие клетки содержатся, например, в мононуклеарных клетках периферической крови и т.п., такие клетки можно культивировать в присутствии вышеописанного хелперного пептида WT1.
Еще в одном аспекте, данное изобретение относится к набору для индукции WT1-специфических хелперных Т-клеток, содержащему вышеописанный хелперный пептид WT1 в качестве существенного ингредиента. Предпочтительно, этот набор используют в вышеуказанном способе индуцирования WT1-специфических хелперных Т-клеток. Этот набор данного изобретения может содержать, например, средства для получения мононуклеарных клеток периферической крови, адъювант, реакционный сосуд и другие компоненты, наряду с вышеописанным хелперным пептидом WT1. Обычно, этот набор сопровождается инструкциями. WT1-специфические хелперные Т-клетки могут быть эффективно индуцированы с использованием набора этого изобретения.
Еще в одном аспекте, данное изобретение относится к способу лечения или предупреждения рака, предусматривающему введение WT1-специфических хелперных Т-клеток субъекту, имеющему молекулу МНС класса II. Способ введения WT1-специфических хелперных Т-клеток может быть должным образом выбран в зависимости от таких условий, как тип заболеваний, состояние субъектов и сайты нацеливания. Примеры способа введения включают в себя, но не ограничиваются ими, внутривенное введение, внутрикожное введение, подкожное введение, внутримышечное введение, трансназальное введение, пероральное введение и т.п.
Кроме того, данное изобретение относится к набору для предупреждения или лечения рака, содержащему вышеописанный хелперный пептид WT1, полинуклеотид WT1 или экспрессирующий вектор WT1 в качестве существенного ингредиента. Этот набор является набором, характеризующимся индукцией антигенпрезентирующих клеток, которые экспонируют (представляют) хелперный пептид WT1 посредством вышеописанной молекулы МНС класса II. Набор данного изобретения может также содержать, например, средства для получения проб, реакционный сосуд и другие компоненты, наряду с вышеописанным основным ингредиентом. Обычно, этот набор сопровождается инструкциями. Антигенпрезентирующие клетки, которые экспонируют (представляют) хелперный пептид WT1 посредством вышеописанной молекулы МНС класса II, могут быть эффективно получены с использованием этого набора данного изобретения и использованы для лечения или предупреждения рака посредством их введения.
В другом аспекте, данное изобретение относится к способу определения присутствия или количества WT1-специфических хелперных Т-клеток в субъекте, имеющем вышеуказанную молекулу МНС класса II, предусматривающему стадии:
(а) реакции комплекса вышеуказанного хелперного пептида WT1 с вышеуказанной молекулой МНС класса II с пробой, полученной из этого субъекта; и затем
(b) определения присутствия или количества хелперных Т-клеток, узнающих комплекс, содержащийся в этой пробе.
Пробами, полученными из субъектов, могут быть любые пробы, пока они имеют возможность содержания лимфоцитов, и они включают в себя, например, биологические жидкости, такие как кровь, лимфатическая жидкость, ткани и т.п. Комплекс WT1-специфических хелперных Т-клеток с молекулой МНС класса II может находиться, например, в форме тетрамера, пентамера и т.п., например, с использованием способа, известного квалифицированным в данной области специалистам, такого как способ с использованием биотина-стрептавидина. Присутствие или количество хелперных Т-клеток, узнающих такой комплекс, может быть определено способом, известным квалифицированным в данной области специалистам. В этом аспекте данного изобретения вышеуказанный комплекс может быть меченым. В качестве метки, могут быть использованы известные метки, такие как флуоресцентная метка и радиоактивная метка. Посредством мечения присутствие или количество хелперных Т-клеток может быть просто и быстро определено. С использованием способа этого аспекта данного изобретения, становятся возможными диагностика и прогноз и т.п. рака.
Таким образом, данное изобретение обеспечивает также композицию, содержащую комплекс хелперного пептида WT1 с вышеуказанной молекулой МНС класса II, для определения присутствия или количества WT1-специфических хелперных Т-клеток в субъекте, имеющем вышеуказанную молекулу МНС класса II.
Кроме того, данное изобретение обеспечивает набор, содержащий комплекс хелперного пептида WT1 с вышеуказанной молекулой МНС класса II, для определения присутствия или количества WT1-специфических хелперных Т-клеток в субъекте, имеющем вышеуказанную молекулу МНС класса II.
Еще в одном аспекте, данное изобретение относится к способу определения присутствия или количества WT1-специфических хелперных Т-клеток в субъекте, имеющем вышеуказанную молекулу МНС класса II, предусматривающему стадии:
(а) реакции вышеуказанного хелперного пептида WT1 с пробой, полученной из этого субъекта; и
(b) определения присутствия или количества цитокина, содержащегося в этой пробе.
Пробами, полученными из субъектов могут быть любые пробы, пока они имеют возможность содержания лимфоцитов и включают в себя, например, мононуклеарные клетки периферической крови, кровь, биологические жидкости, ткани и другие, и предпочтительно мононуклеарные клетки периферической крови. Реакция в вышеуказанной стадии (а) может проводиться реакцией вышеуказанного хелперного пептида WT1 в вышеуказанной пробе, полученной из субъекта, с использованием общепринятого способа. Условия культивирования клеток в пробе в каждой стадии могут быть определены должным образом квалифицированными в данной области специалистами. Присутствие или количество цитокина, содержащегося в пробе, может быть измерено способом, известным квалифицированным в данной области специалистам. Этот цитокин может быть цитокином, способным индуцироваться хелперными Т-клетками, таким как интерферон-γ и интерлейкин-10. В этом аспекте данного изобретения, вышеуказанный цитокин может быть меченым. В качестве меток могут быть использованы известные метки, такие как флуоресцентная метка и радиоактивная метка. С использованием этого присутствия или количества вышеуказанного цитокина в качестве индикатора становится возможным простое и быстрое определение присутствия или количества WT1-специфических хелперных Т-клеток.
В следующем аспекте, данное изобретение относится к способу получения WT1-специфических хелперных Т-клеток с использованием комплекса хелперного пептида WT1 с молекулой МНС класса II, предусматривающему стадии:
(а) реакции пробы с этим комплексом; и
(b) получения хелперных Т-клеток, которые содержатся в этой пробе и узнают этот комплекс.
Комплекс хелперного пептида WT1 с молекулой МНС класса II является таким, как комплекс, описанный выше. Пробами могут быть любые пробы, пока они имеют возможность содержания лимфоцитов и включают в себя, например, полученные из субъекта пробы, такие как кровь, растворы культуры ткани и т.п. Получение хелперных Т-клеток, узнающих этот комплекс, может проводиться, например, с использованием способа, известного квалифицированным в данной области специалистам, такого как FACS и MACS. Можно культивировать полученные WT1-специфические хелперные Т-клетки и использовать их для лечения и предупреждения различных раков.
Таким образом, данное изобретение относится также к WT1-специфическим хелперным Т-клеткам, которые могут быть получены способом получения WT1-специфических хелперных Т-клеток с использованием комплекса хелперного пептида WT1 с вышеуказанной молекулой МНС класса II.
Кроме того, данное изобретение относится к набору для получения WT1-специфических хелперных Т-клеток, содержащему комплекс хелперного пептида WT1 с вышеуказанной молекулой МНС класса II.
Еще в одном аспекте, данное изобретение относится к способу диагностики рака, который предусматривает использование вышеуказанных WT1-специфических хелперных Т-клеток, вышеуказанных антигенпрезентирующих клеток, которые экспонируют (представляют) хелперный пептид WT1 посредством молекулы МНС класса II, или вышеуказанного антитела. Предпочтительно, для способа диагностики рака данного изобретения используют WT1-специфические хелперные Т-клетки. Например, вышеуказанные хелперные Т-клетки, антигенпрезентирующие клетки или антитело могут инкубироваться с пробой, полученной из субъекта, имеющего молекулу МНС класса II, или вводиться субъекту, имеющему молекулу МНС класса II, и затем, например, могут быть определены местоположение, участок, количество и т.п. этих хелперных Т-клеток, антигенпрезентирующих клеток или антитела для диагностики рака. Вышеуказанные хелперные Т-клетки, антигенпрезентирующие клетки или антитело могут быть мечеными. Посредством мечения, можно эффективно проводить способ диагностики рака данного изобретения.
Еще в одном аспекте, данное изобретение относится к набору для диагностики рака, содержащему вышеуказанные WT1-специфические хелперные Т-клетки, антигенпрезентирующие клетки, которые экспонируют (представляют) хелперный пептид WT1 посредством вышеуказанной молекулы МНС класса II, или антитело против хелперного пептида WT1 или антитела против полинуклеотида, кодирующего этот пептид, в качестве существенного ингредиента.
Данное изобретение будет описано конкретно и описано подробно ниже при помощи примеров, но они не должны пониматься как ограничивающие данное изобретение.
Пример 1
Отбор кандидатных пептидов WT1, связывающихся с молекулами МНС класса II
Для поиска пептидных последовательностей, которые связываются с молекулами МНС класса II, использовали способ показанный Rammensee et al. (Rammensee et al, Immunogenetics 41:178-228, 1995). Конкретно, отбор проводили с использованием программ, описанных в столбце правой стороны в таблицах вместе с законом Rammensee et al. Согласно этому способу, пептиды WT135 сужались до пептидных последовательностей, показанных в таблицах 1 и 2, пептиды WT186 до пептидных последовательностей, показанных в таблицах 3 и 4 и пептиды WT1294 до пептидных последовательностей, показанных в таблицах 5 и 6. Столбец левой стороны в таблицах 1-6 обозначает “пригодность” в качестве кандидатной пептидной последовательности. Чем больше число “О”, тем выше пригодность в законе Rammensee et al. Отсутствие какой-либо метки показывает слабую пригодность. Группа аминокислот в скобках столбца “кандидатных пептидных последовательностей, связывающихся с молекулами МНС класса II”, в таблицах 1-6 показывает, что одна аминокислота может быть выбрана из группы аминокислот, перечисленных в этих скобках. Например, описание [FLM] означает одну аминокислоту, выбранную из группы аминокислот F, L и M. Описание [VYI(AL)] также означает одну аминокислоту, выбранную из группы аминокислот V, Y и I, или одну аминокислоту из группы аминокислот А и L. “x” показывает, что эта аминокислота может быть любой аминокислотой. Столбец правой стороны показывает “название программы” программ, используемых для списка кандидатных пептидных последовательностей.
Затем кандидатные пептиды WT1 визуально выбирали из таблиц 1-6, пептиды, показанные в следующей таблице 7, идентифицировали в качестве предпочтительных кандидатных пептидов для молекул МНС класса II и анализировали фактические функции этих пептидов, как описано ниже.
Таблица 7 | |||
Идентификация пептидных кандидатов для молекул МНС класса II мыши |
|||
WT135 | WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:3) | 18-мер | MW 1819,01 |
WT186 | EQCLSAFTLHFSGQFTG (SEQ ID NO:6) | 17-мер | MW 1944,01 |
WT1294 | FRGIQDVRRVSGVAPTLVR (SEQ ID NO:7) | 19-мер | MW 2126,48 |
Получение WT1-пептид-специфических клеточных линий и измерение способности пролиферации клеток
Сначала, вышеуказанные пептиды WT1 эмульгировали с неполным адъювантом Фрейнда (Montanide ISA 51) и мышей внутрикожно инокулировали каждым пептидом WT1 в количестве, соответствующем 100 мкг/мышь. Иммунизацию проводили 3 раза с интервалами периода одной недели, селезенку удаляли после недели 1 конечной иммунизации и получали клетки селезенки. Эти клетки селезенки стимулировали 3 раза с интервалами 10 дней с использованием клеток селезенки неиммунизированных мышей, которые обрабатывали в импульсном режиме тем же самым пептидом WT1, который использовали для иммунизации каждой мыши, и облучали, в качестве стимулятора. Затем, проводили 4-ую стимуляцию с использованием клеток селезенки неиммунизированных мышей, которые обрабатывали в импульсном режиме каждым пептидом (пептидом WT135, WT186 или WT1294), как показано в таблице 7, и облучали, в качестве стимулятора, и реакцию пролиферации в ответ на каждый стимулятор измеряли в эксперименте с 3Н-включением. Пептид OVA (овальбумин), не относящийся к пептидам WT1, использовали в качестве контроля. В результате, клетки селезенки мыши, иммунизированные пептидом WT135, пептидом WT186 или пептидом WT1294, в каждом случае отвечали на стимулятор, действующий в импульсном режиме с пептидом WT135, пептидом WT186 или пептидом WT1294, и пролиферировали (фиг.1А-1С).
Как описано выше, клетки селезенки стимулировали in vitro 3 раза с интервалами 10 дней с использованием клеток селезенки неиммунизированных мышей, которые обрабатывали в импульсном режиме каждым пептидом WT1 и облучали. При проведении затем 4-ой стимуляции с использованием клеток селезенок неиммунизированных мышей, которые обрабатывали в импульсном режиме каждым пептидом, описанным выше, и облучали, в качестве стимулятора, и измеряли реакцию пролиферации, антитело МНС класса I (Db-антитело) или антитело МНС класса II (Ab-антитело) добавляли к культуральному раствору и измеряли 3Н-включение. В результате, реакция пролиферации в ответ на стимулятор, подаваемый в импульсном режиме с каждым из пептида WT135, пептида WT186 и пептида WT1294, подавлялась добавлением антитела МНС класса II (фиг.2А-2С).
Как описано выше, клетки селезенки стимулировали in vitro 3 раза с интервалами 10 дней с использованием клеток селезенки неиммунизированных мышей, которые обрабатывали в импульсном режиме каждым пептидом WT1 и облучали. Затем измеряли реакцию пролиферации по 3Н-включению с использованием облученных клеток С1498, не экспрессирующих белка WT1, клеток С1498, обработанных в импульсном режиме каждым из вышеуказанных пептидов WT1, или клеток С1498, экспрессирующих белок WT1 вследствие введения гена WT1, в качестве стимулятора. В результате, эта реакция пролиферации была получена в ответ на клетки С1498, обработанные в импульсном режиме тем же самым пептидом WT1, который использовали в иммунизации in vivo, и клетки С1498, экспрессирующие белок WT1 вследствие введения гена WT1 (фиг.3). Это выявило, что пептид WT135, пептид WT186 и пептид WT1294 продуцировались внутриклеточным процессом эндогенного белка WT1 и экспонировались (представлялись) на молекуле МНС класса II. На основании вышеуказанных фактов, было показано, что эти три пептида WT1 являются рестриктированными относительно МНС класса II пептидами WT1.
Измерение IFN-γ-продуцирующей активности
Как описано выше, клетки селезенки стимулировали in vitro 3 раза с интервалами 10 дней с использованием клеток селезенки неиммунизированных мышей, которые обрабатывали в импульсном режиме каждым пептидом WT1 и облучали. Затем измеряли концентрацию IFN-γ и IL-4 в культуральном супернатанте с использованием набора ELISA (BIOSOURCE Immunoassay Kit, Invitrogen). В результате, клетки селезенки двух отдельных мышей отвечали на клетки селезенки неиммунизированных мышей, которые обрабатывали в импульсном режиме каждым пептидом WT1 и облучали, и продуцировали интерферон-γ, но мало интерлейкина-4 (фиг.4). Это выявило, что эти три типа пептидов WT1 индуцируют Th1-тип WT1-специфических хелперных Т-клеток.
Пример 2
Измерение WT1-специфических цитотоксических Т-клеток (CTL)
Мышей иммунизировали 3 раза одним пептидом WT1126 (MHC класса I), пептидом WT1126 (MHC класса I) + пептидом WT135 (MHC класса II), пептидом WT1126 (MHC класса I) + пептидом WTl86 (MHC класса II) или пептидом WT1126 MHC класса I) + пептидом WT1294 (MHC класса II) и получали клетки селезенки этих мышей. Затем эти клетки селезенки стимулировали один раз in vitro с использованием пептида WT1126 (MHC класса I) и на 6-ой день измеряли цитотоксическую активность с использованием клеток RMAS, обработанных в импульсном режиме пептидом WT1126 (MHC класса I), в качестве клетки-мишени. Клетки RMAS, не обработанные в импульсном режиме пептидом WT1126 (MHC класса I), использовали в качестве контрольной клетки-мишени. В результате, клетки селезенки мыши, иммунизированные пептидом WT1126 (MHC класса I) + хелперным пептидом WT1 (MHC класса II), индуцировали WT1-специфические цитотоксические Т-клетки более сильно в сравнении с клетками селезенки мыши, иммунизированными только WT1126 (MHC класса I) (фиг. 5). Это демонстрировало, что эти три пептида (MHC класса II) являются WT1-специфическими хелперными пептидами.
Пример 3
Эксперимент с имплантацией опухоли
WT1-экспрессирующие лейкозные клетки С1498 подкожно имплантировали в мышей в соотношении 2,5×105 клеток на мышь и 50 мкг/мышь хелперного пептида WT135 вводили внутрикожно вместе с неполным адъювантом Фрейнда один раз в неделю, всего 3 раза, контроля, вместо хелперного пептида WT135 вводили внутрикожно физиологический раствор вместе с неполным адъювантом Фрейнда. Размер подкожной опухоли измеряли во времени и коэффициент выживаемости с отсутствием заболевания рассчитывали до дня 29 после подкожной имплантации. В результате, эта опухоль разрасталась во всех мышах контрольной группы, тогда как пролиферация этой опухоли полностью подавлялась в 4 из 10 мышей иммунизированной хелперным пептидом WT135 (МНС класса II) группы (фиг.7). Наблюдали также значимое различие (р<0,05) между иммунизированной хелперным пептидом WT135 группой и контрольной группой (фиг.8). Это демонстрировало, что хелперный пептид WT135 (МНС класса II) является пептидом WT1, имеющим способность индуцировать иммунизацию опухоли in vivo.
Затем мышей вскрывали на 29-ый день после начала вышеописанного эксперимента, селезенку вырезали и WT1-специфическую иммунную реакцию анализировали с использованием клеток селезенки. Вкратце, селезенку иссекали при вскрытии мышей иммунизированной хелперным пептидом WT135 (МНС класса II) группы и контрольной группы и получали клетки селезенки. Эти клетки селезенки стимулировали один раз пептидом WT1126 (МНС класса I) и на 6-ой день после стимуляции измеряли цитотоксическую активность клеток селезенки с использованием клеток RMAS, обработанных в импульсном режиме пептидом WT1126 (МНС класса I), в качестве клетки-мишени. В качестве контроля, цитотоксическую активность клеток селезенки измеряли с использованием клеток RMAS в качестве клетки-мишени. В результате, WT1-специфические цитотоксические Т-клетки индуцировались во всех 4 мышах иммунизированной хелперным пептидом WT135 (МНС класса II) группы (фиг.9). С другой стороны, WT1-специфические цитотоксические Т-клетки очень слабо индуцировались в 3 мышах контрольной группы (фиг.10). WT1-специфические цитотоксические Т-клетки не индуцировались в одной мыши. Было также ясно, что индукция WT1-специфических цитотоксических Т-клеток была более низкой в сравнении с иммунизированной хелперным пептидом WT135 (МНС класса II) группой (фиг.9 и 10). Это показывает, что WT1-специфические хелперные Т-клетки индуцировались введением хелперного пептида WT135 класса II, и посредством действия WT1-специфических хелперных Т-клеток WT1-специфические цитотоксические Т-клетки индуцированные иммунным ответом на белок WT1, экспрессируемый имплантированными опухолевыми клетками, в сильной степени амплифицировались in vivo. Таким образом, эти результаты продемонстрировали применимость хелперного пептида WT135.
Затем анализировали специфический цитолиз в мышах вышеуказанной иммунизированной хелперным пептидом WT135 (МНС класса II) группы и контрольной группы. Вкратце, степень цитолиза (%), полученную вычитанием степени цитолиза (%), когда клетками-мишенями были клетки RMAS, из степени цитолиза (%), когда клетками-мишенями были клетки RMAS, обработанные в импульсном режиме пептидом WT1126 (МНС класса I), в вышеуказанных экспериментах использовали в качестве специфического цитолиза (%) (фиг.11, слева). Полученные, как описано выше, клетки селезенки и флуоресцентно-меченый тетрамер WT1 (Н-2Db WT1 Tetramer-REMPNAPYL-PE) инкубировали при 4°С в течение 20 минут, промывали, затем окрашивали флуоресцентно-мечеными CD3- и CD8-антителами, опять промывали и анализировали при помощи FACS. CD3-положительные, CD8-положительные и WT1-тетрамер-положительные клетки служили в качестве WT1-специфических цитотоксических Т-клеток (фиг.11, справа). В результате, значимо более высокие WT1-специфические цитотоксические Т-клетки (р<0,05) индуцировались в клетках селезенки мышей иммунизированной хелперным пептидом WT135 (МНС класса II) группы в сравнении с клетками селезенки мышей контрольной группы (фиг.11).
Пример 4
Измерение способности пролиферации WT1-специфических цитотоксических Т-клеток (CTL) в человеке
Мононуклеарные клетки периферической крови получали из 6 здоровых субъектов, имеющих подкласс молекул DRB1, DPB1, DQB1 или DRB5, показанный на фиг.12. К мононуклеарным клеткам периферической крови добавляли хелперный пептид WT135 и эти клетки культивировали в течение одной недели. Затем, мононуклеарные клетки периферической крови стимулировали 4 раза в целом при интервалах периода одной недели с использованием идентичных полученных из субъекта мононуклеарных клеток периферической крови, которые обрабатывали в импульсном режиме хелперным пептидом WT135 и облучали, в качестве стимулятора, и 3Н-включение измеряли на 6-ой день. Во всех 6 субъектах, мононуклеарные клетки периферической крови отвечали на хелперный пептид WT135 и пролиферировали (фиг.12). Это показало, что хелперный пептид WT135 имеет функцию связывания с вышеупомянутыми молекулами HLA класса II и вызывания реакции пролиферации. В этой связи, пептид WT186 и пептид WT1294 мыши отличаются от пептида WT186 (SEQ ID NO:4) и пептида WT1294 (SEQ ID NO:5) человека в одной аминокислоте в положениях, заключенных в квадратах, как показано в таблице 8.
Таблица 8 | |||
Различия в последовательностях между пептидами WT135, WT186 и WT1294 мыши и человека | |||
mWT135 | Мышь | WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:3) | 18-мер |
hWT135 | Человек | WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:3) | |
mWT186 | Мышь | EQCLSAFTLHFGQFTG (SEQ ID NO:6) | 17-мер |
hWT186 | Человек | EQCLSAFTVHFGQFTG (SEQ ID NO:4) | |
mWT1294 | Мышь | FRGIQDVRRVSGVAPTLVR (SEQ ID NO:7) | 19-мер |
hWT1294 | Человек | FRGIQDVRRVPGVAPTLVR (SEQ ID NO:5) |
Пример 5
Рестриктированность по молекулам HLA класса II пептида WT1
35
Для определения рестриктированности по молекулам HLA класса II пептида WT135, проводили дополнительный эксперимент при помощи способа, хорошо известного квалифицированным в данной области специалистам, вкратце описанный здесь. Сначала, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), полученные из здорового субъекта [DRB1* 0101/0405-, DPB1* 0201/0402- и DQB1* 0401/0501-положительного субъекта (далее называемого здесь здоровым субъектом А)], стимулировали 5 раз пептидом WT135 с получением Респондера. Затем мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), полученные из другого здорового субъекта, отличающиеся в типе HLA класса II [DRB1* 0405/0901-, DPB1* 0201/0501- и DQB1* 0303/0401-положительного здорового субъекта (далее называемого здесь здоровым субъектом В)], обрабатывали в импульсном режиме пептидом WT135 с получением Стимулятора и измеряли пролиферацию клеток [количество включенного 3Н-тимидина (имп/мин)]. Это измерение проводили при условиях без добавления антитела, с добавлением анти-HLA-DR-антитела (+а-DR), с добавлением анти-HLA-DQ-антитела (+а-DQ). Обычный тип HLA класса II, который является положительным как в Респондере, так и в Стимуляторе, показывает рестриктированность пептида WT135. Как результат этих экспериментов, было показано, что пептид WT135 является DRB1* 0405-рестриктированным, так как пролиферация была подавлена при условии добавления анти-DR-антитела, и DRB1* 0405 был общим в здоровых субъектах А и В, как показано на фиг.13.
Затем, эксперимент проводили при тех же самых условиях, что и условия вышеуказанного эксперимента, за исключением того, что в качестве PBMC, полученные из здорового субъекта, отличающегося от здорового субъекта А [DRB1* 0405/0803-, DPB1* 0202/0501- и DQB1* 0401/0601-положительного субъекта, называемого здоровым субъектом G)] использовали в качестве Стимулятора. В результате было показано, что пептид WT135 является DRB1* 0405-, DPB1* 0201- и DPB1* 0202-рестриктированным, так как пролиферация подавлялась при условии добавления анти-HLA-DR-антитела или анти-HLA-DP-антитела и DRB1* 0405, DPB1* 0201 и DPB1* 0202 были общими в здоровом субъекте А и здоровом субъекте G (DPB1* 0201 и DPB1* 0202 имеют высокую аналогию и являются перекрестно реактивными и, следовательно, они считаются общей молекулой), как показано на фиг.14.
Затем проводили эксперимент при тех же самых условиях, что и условия в вышеописанном эксперименте, за исключением того, что PBMC, полученные из здорового субъекта, отличающегося от здорового субъекта А [DRB1* 0101/0803-, DPB1* 0501/- и DQB1* 0501/0601-положительного субъекта (называемого здоровым субъектом Н)] использовали в качестве Стимулятора. В результате было показано, что пептид WT135 является DRB1* 0101-рестриктированным, так как пролиферация подавлялась при условии добавления анти-HLA-DR-антитела и DRB1* 0101 был общим в здоровом субъекте А и здоровом субъекте Н, как показано на фиг.15.
Кроме того, PBMC, полученные из здорового субъекта G использовали в качестве Респондера и L-клетки, имеющие введенный ген DQB1* 0601, использовали в качестве Стимулятора для определения рестриктированности пептида WT135. Измеряли различие в количестве IFN-γ, продуцируемом в присутствии или в отсутствие импульса с пептидом WT135 L-клеток. Долю внутриклеточного продуцирования IFN-γ измеряли с использованием способа FACS, который является способом, хорошо известным квалифицированным в данной области специалистам. В результате, было показано, что пептид WT135 является DQB1* 0601-рестриктированным, так как этот Респондер активировался импульсом с пептидом WT135 на L-клетках, как показано на фиг.16.
Затем, проводили эксперимент, как описано выше, с использованием PBMC, полученных из того же самого здорового субъекта, что и Респондер и Стимулятор. Типы молекул HLA класса II, которыми обладали здоровые субъекты, используемые в этом эксперименте, суммированы в таблице 9 ниже.
Таблица 9 | |||
Типы молекул HLA класса II, которыми обладали здоровые субъекты, использованные в этом эксперименте | |||
№ здорового субъекта | DRB1 | DPB1 | DQB1 |
А | *0101/0405 | *0201/0402 | *0401/0501 |
В | *0405/0901 | *0201/0501 | *0303/0401 |
С | *0802/1201 | *0201/0501 | *0301/0302 |
D | *1502/1502 | *0201/0901 | *0601/0601 |
E | *0405/0901 | *0202/0501 | *0303/0401 |
F | *1403/1502 | *0201/0901 | *0301/0601 |
G | *0405/0803 | *0202/0501 | *0401/0601 |
H | *0101/0803 | *0501/- | *0501/0601 |
I | *0101/1501 | *0201/0402 | *0501/0602 |
В результате было обнаружено, что добавление анти-DR-антитела или анти-DP-антитела при проведении этого эксперимента с использованием PBMC, полученных из здоровых субъектов А-Е, приводило к уменьшению количества включенного 3Н-тимидина (имп/мин) и, следовательно, к супрессии пролиферации. Добавление только анти-DR-антитела при использовании PBMC, полученных из здорового субъекта F, также приводило к супрессии пролиферации. Кроме того, добавление только анти-HLA-DP-антитела при использовании PBMC, полученных из здорового субъекта G, приводило к супрессии пролиферации. Посредством эксперимента с использованием здорового субъекта А было показано, что пептид WT135 является DRB1* 0101- или 0405-рестриктированным и DPB1* 0201- или 0402-рестриктированным. Посредством эксперимента с использованием здорового субъекта С было показано, что пептид WT135 является DRB1* 0802- или 1201-рестриктированным и DPB1* 0201- или 0501-рестриктированным. Посредством эксперимента с использованием здорового субъекта D было показано, что пептид WT135 является DRB1* 1502-рестриктированным, так как DRB1* 1502 является гомозиготой (фиг.17). Кроме того, было показано, что пептид WT135 является DPB1* 0201- или 0901-рестриктированным. Посредством эксперимента с использованием здорового субъекта Е было показано, что пептид WT135 является DRB1* 0405- или 0901-рестриктированным и DPB1* 0202- или 0501-рестрикимрованным. Посредством эксперимента с использованием здорового субъекта F было показано, что пептид WT135 является DRB1* 1403- или 1502-рестриктированным. Посредством эксперимента с использованием здорового субъекта G было показано, что пептид WT135 является DRB1* 0202- или 0501-рестриктированным.
Различие в количестве IFN-γ, продуцируемом в присутствии или в отсутствие импульса с пептидом WT135, также измеряли с использованием PBMC, полученных из здорового субъекта I в качестве Респондера и Стимулятора. Долю внутриклеточного продуцирования IFN-γ измеряли при помощи FACS, способа, хорошо известного квалифицированным в данной области специалистам. В результате, доля количества IFN-γ заметно увеличивалась импульсом пептида WT135 (фиг.18). Это показывает, что пептид WT135 является рестриктированным по любому из DRB1* 0101, DRB1* 1501, DPB1* 0201, DPB1* 0402, DQB1* 0501 и DQB1* 0602.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
Данное изобретение обеспечивает пептид WT1, который является рестриктированным по многим типам молекул МНС класса II, полинуклеотид, кодирующий этот пептид, фармацевтическую композицию, содержащую их, и т.п. Таким образом, они могут быть использованы в области фармацевтических веществ, например, в области развития и получения профилактических или терапевтических лекарственных средств для различных опухолей гемопоэтических органов и солидных опухолей, которые в высокой степени экспрессируют ген WT1.
Claims (17)
1. Пептид, который имеет аминокислотную последовательность, состоящую из смежных аминокислот, полученных из белка WT1, и индуцирует WT1-специфические хелперные Т-клетки связыванием с молекулой МНС класса II, где эта аминокислотная последовательность выбрана из группы, состоящей из:
(a) аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO: 3;
(b) аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO: 4;
(c) аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO: 5, и
(d) аминокислотной последовательности, в которой одна аминокислота является замещенной в аминокислотных последовательностях, изображенных в (а)-(с).
(a) аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO: 3;
(b) аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO: 4;
(c) аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO: 5, и
(d) аминокислотной последовательности, в которой одна аминокислота является замещенной в аминокислотных последовательностях, изображенных в (а)-(с).
2. Пептид по п. 1, где этой аминокислотной последовательностью является аминокислотная последовательность, изображенная в SEQ ID NO: 3.
3. Пептид по п. 1 или 2, где эта молекула МНС класса II выбрана из группы, состоящей из DRB1* 0101, DRB1* 0405, DRB1* 0802, DRB1* 0803, DRB1* 0901, DRB1* 1201, DRB1* 1403, DRB1* 1501, DRB1* 1502, DPB1* 0201, DPB1* 0202, DPB1* 0402, DPB1* 0501, DPB1* 0901, DQB1* 0301, DQB1* 0302, DQB1* 0401, DQB1* 0501, DQB1* 0601, DQB1* 0602 и DRB5* 0102.
4. Пептид по п. 1 или 2, где эта молекула МНС класса II выбрана из группы, состоящей из DRB1* 0101, DRB1* 0405, DRB1* 1502, DPB1* 0201, DPB1* 0202 и DQB1* 0601.
5. Полинуклеотид, кодирующий пептид по п. 1 или 2, где пептид индуцирует WT1-специфические хелперные Т-клетки связыванием с молекулой МНС класса II.
6. Экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид по п. 5.
7. Антитело против пептида по любому из пп. 1-4, где антитело получают иммунизацией животного пептидом по любому из пп. 1-4, и где антитело специфично связывается с пептидом по любому из пп. 1-4.
8. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая эффективное количество пептида по любому из пп. 1-4 и подходящий адъювант.
9. Способ лечения рака, который предусматривает введение эффективного количества пептида по любому из пп. 1-4 субъекту, имеющему молекулу МНС класса II по п. 3 или 4.
10. Применение пептида по любому из пп. 1-4 для лечения рака.
11. Выделенная антигенпрезентирующая клетка, которая экспонирует (представляют) пептид по любому из пп. 1-4 посредством молекулы МНС класса II по п. 3 или 4.
12. Способ индукции антигенпрезентирующих клеток, который предусматривает культивирование незрелых антигенпрезентирующих клеток в присутствии пептида по любому из пп. 1-4 и индукцию антигенпрезентирующих клеток, которые экспонируют (представляют) этот пептид посредством молекулы МНС класса II по п. 3 или 4, из незрелых антигенпрезентирующих клеток.
13. WT1-специфическая хелперная Т-клетка, которая индуцирована in vitro пептидом по любому из пп. 1-4 с молекулой МНС класса II, где указанная клетка специфически распознает комплекс пептида по любому из пп. 1-4 и молекулы МНС класса II.
14. Способ индукции WT1-специфических хелперных Т-клеток, который предусматривает культивирование мононуклеарных клеток периферической крови в присутствии пептида по любому из пп. 1-4 и индукцию WT1-специфических хелперных Т-клеток из этих мононуклеарных клеток периферической крови.
15. Набор для индукции WT1-специфических хелперных Т-клеток, содержащий в качестве существенного ингредиента пептид по любому из пп. 1-4 и подходящий адъювант.
16. Применение фармацевтической композиции для лечения рака, экспрессирующего ген WT1, содержащей, в качестве существенного ингредиента, пептид по любому из пп. 1-4 и подходящий адъювант, где рак выбран из группы, состоящей из опухолей гемопоэтических органов, таких как лейкоз, миелодиспластический синдром, множественная миелома и злокачественная лимфома, и солидных раковых заболеваний, таких как рак желудка, рак кишечника, рак легкого, рак молочной железы, рак половых клеток, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак шейки матки и рак яичника.
17. Способ определения присутствия или количества WT1-специфических хелперных Т-клеток в субъекте, имеющем молекулу МНС класса II по п. 3 или 4, причем указанный способ предусматривает стадии:
(а) реакции пептида по любому из пп. 1-4 с пробой, полученной из этого субъекта;
(b) определения присутствия или количества цитокина, содержащегося в этой пробе; и затем
(c) использования присутствия или количества цитокина в качестве индикатора.
(а) реакции пептида по любому из пп. 1-4 с пробой, полученной из этого субъекта;
(b) определения присутствия или количества цитокина, содержащегося в этой пробе; и затем
(c) использования присутствия или количества цитокина в качестве индикатора.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009105286 | 2009-04-23 | ||
JP2009-105286 | 2009-04-23 | ||
PCT/JP2010/057149 WO2010123065A1 (ja) | 2009-04-23 | 2010-04-22 | 癌抗原ヘルパーペプチド |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2011147479A RU2011147479A (ru) | 2013-05-27 |
RU2588442C2 true RU2588442C2 (ru) | 2016-06-27 |
Family
ID=
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001025273A2 (en) * | 1999-10-04 | 2001-04-12 | Corixa Corporation | Compositions and methods for wt1 specific immunotherapy |
WO2003037060A2 (en) * | 2001-10-30 | 2003-05-08 | Corixa Corporation | Compositions and methods for wt1 specific immunotherapy |
US20050002951A1 (en) * | 2001-09-28 | 2005-01-06 | Haruo Sugiyama | Novel method of inducing antigen-specific t cells |
EP1696027A1 (en) * | 2003-11-05 | 2006-08-30 | International Institute of Cancer Immunology, Inc. | Hla-dr-binding antigen peptide derived from wt1 |
RU2343486C2 (ru) * | 2003-12-08 | 2009-01-10 | Цзюнь ХУ | Способ детектирования специфичности активированных лимфоцитов и среда для его осуществления |
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001025273A2 (en) * | 1999-10-04 | 2001-04-12 | Corixa Corporation | Compositions and methods for wt1 specific immunotherapy |
US20050002951A1 (en) * | 2001-09-28 | 2005-01-06 | Haruo Sugiyama | Novel method of inducing antigen-specific t cells |
WO2003037060A2 (en) * | 2001-10-30 | 2003-05-08 | Corixa Corporation | Compositions and methods for wt1 specific immunotherapy |
EP1696027A1 (en) * | 2003-11-05 | 2006-08-30 | International Institute of Cancer Immunology, Inc. | Hla-dr-binding antigen peptide derived from wt1 |
RU2343486C2 (ru) * | 2003-12-08 | 2009-01-10 | Цзюнь ХУ | Способ детектирования специфичности активированных лимфоцитов и среда для его осуществления |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
FUJIKI F. ET AL., WT1 protein-derived, naturally processed 16-mer peptide, WT1(332), is a promiscuous helper peptide for induction of WT1-specific Th1-type CD4(+) T cells, MICROBIOL.IMMUNOL, v. 52, no. 12, 2008, p. 591-600, реферат. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11732018B2 (en) | Cancer antigen helper peptide | |
US11548924B2 (en) | WT1 HLA class II-binding peptides and compositions and methods comprising same | |
JP4422903B2 (ja) | 癌抑制遺伝子wt1の産物に基づく癌抗原 | |
RU2435782C2 (ru) | Hla-a*3303-рестриктированный пептид wt1 и содержащая его фармацевтическая композиция | |
JP2019122377A (ja) | 免疫原性wt−1ペプチドおよびその使用法 | |
WO2005095598A1 (ja) | Wt1由来の癌抗原ペプチド | |
US7601801B2 (en) | HLA-A24 binding cancer antigen peptide derived from livin | |
RU2588442C2 (ru) | Хелперный пептид ракового антигена | |
JPWO2017150698A1 (ja) | がん免疫療法に利用可能な抗原性ポリペプチド及び当該ポリペプチドを含む抗腫瘍剤 |