RU2582569C2 - Dna coding full-size human interleukin-receptor antagonist 36, dna coding full-size human interleukin-receptor antagonist 36 with c-end poligistidine tag, plasmid expression vector (versions), escherichia coli bl21 [de3] star (pet-il36raf),-producer of full-size receptor antagonist 36 and strain of bacteria escherichia coli bl21 [de3] star (pet-il36raf-his),-producer of full-size receptor antagonist 36 with c-end poligistidine tag - Google Patents
Dna coding full-size human interleukin-receptor antagonist 36, dna coding full-size human interleukin-receptor antagonist 36 with c-end poligistidine tag, plasmid expression vector (versions), escherichia coli bl21 [de3] star (pet-il36raf),-producer of full-size receptor antagonist 36 and strain of bacteria escherichia coli bl21 [de3] star (pet-il36raf-his),-producer of full-size receptor antagonist 36 with c-end poligistidine tag Download PDFInfo
- Publication number
- RU2582569C2 RU2582569C2 RU2014130529/10A RU2014130529A RU2582569C2 RU 2582569 C2 RU2582569 C2 RU 2582569C2 RU 2014130529/10 A RU2014130529/10 A RU 2014130529/10A RU 2014130529 A RU2014130529 A RU 2014130529A RU 2582569 C2 RU2582569 C2 RU 2582569C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- receptor antagonist
- full
- il36raf
- pet
- escherichia coli
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к генно-инженерным препаратам медицинского назначения и технологии их получения, точнее к технологии получения рецепторного антагониста интерлейкина-36.The invention relates to the field of biotechnology, in particular to genetic engineering drugs for medical purposes and the technology for their preparation, more precisely, to the technology for producing the receptor antagonist of interleukin-36.
Альфа-, бета- и гамма-нтерлейкины-36 (IL-36α, IL-36β, IL-36γ), а также рецепторный антагонист нтерлейкинов-36 (IL-36Ra) представляют собой отдельную группу в семействе интерлейкина-1 [Gresnigt MS, van de Veerdonk FL. Biology of IL-36 cytokines and their role in disease. Semin Immunol. 2013 25(6):458-65; Van de Veerdonk FL., Netea MG. New Insights in the Immunobiology of IL-1 Family Members. Front Immunol. 2013 Jul 8; 4:167].Alpha, beta, and gamma-interleukins-36 (IL-36α, IL-36β, IL-36γ), as well as the receptor antagonist of interleukins-36 (IL-36Ra) are a separate group in the interleukin-1 family [Gresnigt MS, van de Veerdonk FL. Biology of IL-36 cytokines and their role in disease. Semin Immunol. 2013 25 (6): 458-65; Van de Veerdonk FL., Netea MG. New Insights in the Immunobiology of IL-1 Family Members. Front Immunol. 2013 Jul 8; 4: 167].
IL-36(α,β,γ) играют важную роль в активации воспалительного процесса в коже и в легких. В частности, ряд экспериментальных данных свидетельствует о возможном участии IL-36 в развитии псориаза и воспалительных заболеваний дыхательных путей и суставов [Ramadas RA, Ewart SL, Iwakura Y, Medoff BD, LeVine AM. IL-36α exerts pro-inflammatory effects in the lungs of mice. PLoS One. 2012; 7(9): e45784; Vigne S, Palmer G, Lamacchia C, Martin P, Talabot-Ayer D, Rodriguez E, Ronchi F, Sallusto F, Dinh H, Sims JE, Gabay C. IL-36R ligands are potent regulators of dendritic and T cells. Blood. 2011 Nov 24; 118(22):5813-23; Foster AM, Baliwag J, Chen CS, Guzman AM, Stoll SW, Gudjonsson JE, Ward NL, Johnston A. IL-36 Promotes Myeloid Cell Infiltration, Activation, and Inflammatory Activity in Skin. J. Immunol. 2014 Jun 15; 192(12):6053-6061; Tortola L1, Rosenwald E, Abel B, Blumberg H, 
IL-36α, IL-36β, IL-36γ связываются с клеточным рецептором IL-1Rrp2 и используют корецептор IL-1RAcP, запуская систему сигналинга, похожую на сигналинг, индуцируемый IL-1, а рецепторный антагонист IL-36Ra ингибирует их активность. Кроме того, IL-36Ra способен активировать противовоспалительный каскад, взаимодействуя с рецептором SIGIRR [Van de Veerdonk FL., Netea MG. New Insights in the Immunobiology of IL-1 Family Members. Front Immunol. 2013 Jul 8; 4:167].IL-36α, IL-36β, IL-36γ bind to the IL-1Rrp2 cell receptor and use the IL-1RAcP coreceptor, launching a signaling system similar to signaling induced by IL-1, and the IL-36Ra receptor antagonist inhibits their activity. In addition, IL-36Ra is able to activate the anti-inflammatory cascade by interacting with the SIGIRR receptor [Van de Veerdonk FL., Netea MG. New Insights in the Immunobiology of IL-1 Family Members. Front Immunol. 2013 Jul 8; 4: 167].
В научной и патентной литературе IL36-Ra известен также под другими наименованиями:In the scientific and patent literature, IL36-Ra is also known by other names:
FIL1 delta, IL-1-related protein 3 (IL-1RP3), Interleukin-1 HY1 (IL-1HY1), Interleukin-1 delta (IL-1 delta), Interleukin-1 family member 5 (IL-1F5), Interleukin-1 receptor antagonist homolog 1 (IL-1ra homolog 1), Interleukin-1-like protein 1 (IL-1L1).FIL1 delta, IL-1-related protein 3 (IL-1RP3), Interleukin-1 HY1 (IL-1HY1), Interleukin-1 delta (IL-1 delta), Interleukin-1 family member 5 (IL-1F5), Interleukin -1 receptor antagonist homolog 1 (IL-1ra homolog 1), Interleukin-1-like protein 1 (IL-1L1).
Все интерлейкины группы IL-36 синтезируются в основном в эпителиальных тканях и в коже, не имеют сигнальных пептидов и поэтому не могут секретироваться по обычному секреционному пути [Vigne S, Palmer G, Lamacchia С, Martin P, Talabot-Ayer D, Rodriguez E, Ronchi F, Sallusto F, Dinh H, Sims JE, Gabay C. IL-36R ligands are potent regulators of dendritic and T cells. Blood. 2011 Nov 24; 118(22):5813-23].All interleukins of the IL-36 group are synthesized mainly in epithelial tissues and in the skin, do not have signal peptides and therefore cannot be secreted by the usual secretory pathway [Vigne S, Palmer G, Lamacchia C, Martin P, Talabot-Ayer D, Rodriguez E, Ronchi F, Sallusto F, Dinh H, Sims JE, Gabay C. IL-36R ligands are potent regulators of dendritic and T cells. Blood 2011 Nov 24; 118 (22): 5813-23].
Наиболее близким к настоящему изобретению является группа изобретений по международной заявке WO 2008033333, в которой раскрывается, что биологическая активность IL-36Ra, измеренная по экспрессии люциферазы клетками Jurkat Е6.1, транзитарно экспрессирующими рецептор IL-1Rrp2 и люциферазу под контролем репортерного промотора, значительно возрастает после удаления N-концевого метионина. Однако полученные результаты оказались недостаточно корректны, в связи с тем, что результаты определения активности с использованием данной искусственной модели существенно отличаются от результатов, полученных с использованием природных, то есть нетрансфецированных клеток. В частности, измерения, выполненные на модели фибробластов человека и приведенные в примере 3 настоящего изобретения, показывают, что удаление N-концевого метионина практически не влияет на биологическую активность IL-36Ra в данной модели, более приближенной к природным условиям по сравнению с моделью, использованной в WO 2008033333.Closest to the present invention is the group of inventions according to international application WO2008033333, which discloses that the biological activity of IL-36Ra, measured by luciferase expression by Jurkat E6.1 cells transiently expressing IL-1Rrp2 receptor and luciferase under the control of a reporter promoter, increases significantly after removal of the N-terminal methionine. However, the results obtained were not correct enough, due to the fact that the results of determining activity using this artificial model differ significantly from the results obtained using natural, that is, non-transfected cells. In particular, the measurements performed on the model of human fibroblasts and shown in Example 3 of the present invention show that the removal of the N-terminal methionine has practically no effect on the biological activity of IL-36Ra in this model, which is closer to natural conditions compared to the model used in WO2008033333.
В заявке WO 2008033333 вектор для экспрессии IL-36Ra содержит кДНК человека, кодирующую IL-36Ra, лишенный N-концевого метионина (Seq ID No 69 кодирует IL-36Ra с N-концевым валином и Seq ID No 70 кодирует его искусственный вариант, в котором данный валин заменен на метионин, кроме того, Seq ID No 70 кодирует также полигистидиновый таг на С-конце IL-36Ra). Однако обе последовательности были получены амплификацией кДНК из клеток человека и не являются оптимальными для экспрессии IL-36Ra в клетках Escherichia coli, поскольку частота использования кодонов в геноме E.coli существенно отличается от частоты использования кодонов в клетках человека.In WO2008033333, a vector for the expression of IL-36Ra contains human cDNA encoding IL-36Ra lacking an N-terminal methionine (Seq ID No. 69 encodes IL-36Ra with an N-terminal valine and Seq ID No. 70 encodes an artificial version thereof, in which this valine has been replaced by methionine, in addition, Seq ID No. 70 also encodes a polyhistidine tag at the C-terminus of IL-36Ra). However, both sequences were obtained by amplification of cDNA from human cells and are not optimal for the expression of IL-36Ra in Escherichia coli cells, since the frequency of codon use in the E. coli genome is significantly different from the frequency of codon use in human cells.
Техническая задача, решаемая авторами - разработка технологии получения рекомбинантного биологически активного IL-36Ra человека с высокой производительностью.The technical problem solved by the authors is the development of a technology for producing recombinant biologically active human IL-36Ra with high productivity.
Технический результат достигался созданием последовательности ДНК (Seq ID No 1), кодирующей полноразмерный IL-36Ra; последовательности ДНК (Seq ID No 2), кодирующей полноразмерный IL-36Ra-His с С-концевым полигистидиновым тагом; плазмидных экспрессионного вектора рЕТ-IL36Raf и pET-IL36Raf-His, а также штаммов бактерий Escherichia coli BL21Star[DE3](pET-IL36Raf), содержащего вектор pET-IL36Raf - продуцента полноразмерного IL-36Ra человека и BL21 Star[DE3](pET-IL36Raf-His), содержащего вектор pET-IL36Raf-His - продуцента полноразмерного IL-36Ra человека с С-концевым полигистидиновым тагом.The technical result was achieved by creating a DNA sequence (Seq ID No. 1) encoding a full-sized IL-36Ra; a DNA sequence (Seq ID No. 2) encoding a full-length IL-36Ra-His with a C-terminal polyhistidine tag; plasmid expression vector pET-IL36Raf and pET-IL36Raf-His, as well as bacterial strains of Escherichia coli BL21Star [DE3] (pET-IL36Raf) containing the vector pET-IL36Raf - producer of full-length human IL-36Ra and BL21 Star [DE3] (pET- IL36Raf-His) containing the vector pET-IL36Raf-His, a producer of full-length human IL-36Ra with a C-terminal polyhistidine tag.
Последовательность искусственного гена, кодирующего IL36Ra человека, была составлена с учетом частоты использования кодонов в геноме Escherichia coli (Seq ID No 1). По концам к гену были добавлены олигонуклеотиды, формирующие сайты рестрикции NdeI и XhoI. Ген был получен путем химического синтеза, обработан вышеуказанными рестриктазами и клонирован в подготовленный аналогичным образом вектор pET22b+ с получением экспрессионной плазмиды pET-IL36Raf.The sequence of the artificial gene encoding human IL36Ra was compiled taking into account the frequency of codon use in the Escherichia coli genome (Seq ID No. 1). At the ends, oligonucleotides that form the restriction sites NdeI and XhoI were added to the gene. The gene was obtained by chemical synthesis, processed with the above restriction enzymes and cloned into the pET22b + vector prepared in a similar manner to obtain the expression plasmid pET-IL36Raf.
Вариантом указанной последовательности является последовательность ДНК, кодирующая полноразмерный IL-36Ra слитый с С-концевым полигистидиновым тагом LEHHHHHH (Seq ID No 2). Наличие такой последовательности значительно упрощает очистку рекомбинантного белка посредством металлохелатной хроматографии.A variant of this sequence is a DNA sequence encoding a full-sized IL-36Ra fused to the LEHHHHHH C-terminal polyhistidine tag (Seq ID No. 2). The presence of such a sequence greatly simplifies the purification of the recombinant protein by metal chelate chromatography.
Структуры полученных объектов показаны в приложении.The structures of the resulting objects are shown in the appendix.
Список полученных последовательностей:List of obtained sequences:
Seq ID No 1 - Последовательность ДНК, кодирующая полноразмерный IL-36Ra, оптимизированная для синтеза белка в клетках Escherichia coli Seq ID No 2 - Последовательность ДНК, кодирующая полноразмерный IL-36Ra и оптимизированная для синтеза белка в клетках Escherichia coli и содержащая С-концевой полигистидиновый таг.Seq ID No. 1 - DNA sequence encoding a full-length IL-36Ra optimized for protein synthesis in Escherichia coli cells Seq ID No 1 - DNA sequence encoding a full-length IL-36Ra optimized for protein synthesis in Escherichia coli cells and containing a C-terminal polyhistidine tag
Плазмидный экспрессионный вектор pET-IL36Raf содержит ген Lac-репрессора, промотор Lac-оперона, промотор Т7, ген IL-36Raf, терминатор транскрипции Т7, ген бета-лактамазы, репликатор плазмиды pBR322, сайты рестрикции, ограничивающие ген IL-36Raf. Карта плазмиды приведена на фиг 1.The plasmid expression vector pET-IL36Raf contains the Lac repressor gene, Lac operon promoter, T7 promoter, IL-36Raf gene, T7 transcription terminator, beta-lactamase gene, pBR322 plasmid replicator, and restriction sites limiting the IL-36Raf gene. The plasmid map is shown in FIG. 1.
Плазмидный экспрессионный вектор pET-IL36Raf-His содержит ген Lac-репрессора, промотор Lac-оперона, промотор Т7, ген IL-36Raf, терминатор транскрипции Т7, ген бета-лактамазы, репликатор плазмиды pBR322, сайты рестрикции, ограничивающие ген IL-36Raf-His. Карта плазмиды приведена на фиг 2.The plasmid expression vector pET-IL36Raf-His contains the Lac repressor gene, Lac operon promoter, T7 promoter, IL-36Raf gene, T7 transcription terminator, beta-lactamase gene, pBR322 plasmid replicator, restriction sites restricting IL-36Raf-His gene . The plasmid map is shown in FIG. 2.
Полученный штамм бактерий Escherichia coli BL21Star[DE3](pET-IL36f) - продуцент IL-36Ra, трансформированный экспрессионной плазмидой, содержащей последовательность ДНК, кодирующую IL-36Ra, состав кодонов которой оптимизирован для экспрессии IL-36Ra в клетках Escherichia coli (Seq ID No 1).The resulting bacterial strain Escherichia coli BL21Star [DE3] (pET-IL36f) is an IL-36Ra producer transformed with an expression plasmid containing a DNA sequence encoding IL-36Ra, the codon composition of which is optimized for IL-36Ra expression in Escherichia coli cells (Seq ID No one).
Штаммы Escherichia coli BL21Star[DE3](pET-IL36f) и Escherichia coli BL21Star[DE3](pET-IL36f-His) характеризуются следующими культурально-морфологическими и физико-биохимическими свойствами:The strains of Escherichia coli BL21Star [DE3] (pET-IL36f) and Escherichia coli BL21Star [DE3] (pET-IL36f-His) are characterized by the following cultural-morphological and physico-biochemical properties:
Культурально-морфологические особенности штаммов:Cultural and morphological features of the strains:
Грамотрицательные прямые палочки, размером 1,1-1,5×2,0-3,0 мкм, одиночные, спор и капсул не образуют. Каталазоположительные. Оксидазо-отрицательные. Факультативные анаэробы. Клетки хорошо растут на простых питательных средах, содержащих и не содержащих ампициллин, например, на среде LB. На агаризованной среде - колонии гладкие, круглые, слабо выпуклые, с ровным краем. В жидких средах образуют равномерную свето-рассеивающую суспензию, при хранении без перемешивания оседают на дно. Клетки растут в интервале температур от 8°C до 43°C, интервал для культивирования - 28-38°C, оптимум роста при 37°C. Интервал pH 5-7. Катализируют D-глюкозу и некоторые другие углеводы с образованием кислоты и газа, не сбраживают галактозу. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная, не образуют H2S, гидролизуют мочевину.Gram-negative straight rods, 1.1-1.5 × 2.0-3.0 microns in size, single, do not form spores and capsules. Catalopositive. Oxidase negative. Optional anaerobes. Cells grow well on simple nutrient media containing and not containing ampicillin, for example, on LB medium. On an agar medium, colonies are smooth, round, slightly convex, with a smooth edge. In liquid media, a uniform light-scattering suspension is formed; when stored without stirring, they settle to the bottom. Cells grow in the temperature range from 8 ° C to 43 ° C, the interval for cultivation is 28-38 ° C, the optimum growth at 37 ° C. PH range 5-7. Catalyze D-glucose and some other carbohydrates with the formation of acid and gas, do not ferment galactose. Voges-Proskauer reaction is negative, do not form H 2 S, hydrolyze urea.
Характеристики полезного вещества, синтезируемого штаммами: Рекомбинантный белок - антагонист рецептора интерлейкинов-36 человека и рекомбинантный белок - антагонист рецептора интерлейкинов-36 человека с С-концевым полигистидиновым тагом соответственно.Characteristics of the useful substance synthesized by the strains: Recombinant protein is an antagonist of the human interleukin-36 receptor and recombinant protein is an antagonist of the human interleukin-36 receptor with a C-terminal polyhistidine tag, respectively.
Активность штамма:Strain activity:
Продуктивность штаммов - рекомбинантный IL-36Ra составляет не менее 17% массы белков клеточного лизата при культивировании в условиях индукции, а рекомбинантный IL-36Ra-His составляет не менее 13% массы белков клеточного лизата при культивировании в условиях индукции.The productivity of the strains - recombinant IL-36Ra is at least 17% of the mass of cell lysate proteins when cultured under induction conditions, and recombinant IL-36Ra-His is at least 13% of the mass of cell lysate proteins when cultured under induction.
Криоконсервация. В запаянных ампулах штаммы, лиофильно-высушенные в среде, содержащей 1% сахарозы и 1% маннитола, хранятся при комнатной температуре в течении 20 лет.Cryopreservation. In sealed ampoules, strains freeze-dried in a medium containing 1% sucrose and 1% mannitol are stored at room temperature for 20 years.
Культивирование штаммов: Культивирование при температуре 28-38°C в термостате или качалке, в агаризованной (2% агара) или жидкой LB-среде, соответственно. Селективные условия - добавление 100 мкг/мл ампициллина.Cultivation of strains: Cultivation at a temperature of 28-38 ° C in a thermostat or rocking chair, in agarized (2% agar) or liquid LB medium, respectively. Selective conditions - the addition of 100 μg / ml ampicillin.
Ферментация: Ферментацию ведут в жидкой среде PYP-5052, содержащей 0,2% лактозы [Studier FW. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Prot. Expr. Purif. 2005; 41910:207-234], с добавлением 100 мкг/мл ампициллина, при перемешивании и аэрировании, при температуре 28-38°C в течение 18 часов.Fermentation: Fermentation is carried out in PYP-5052 liquid medium containing 0.2% lactose [Studier FW. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Prot. Expr. Purif. 2005; 41910: 207-234], with the addition of 100 μg / ml ampicillin, with stirring and aeration, at a temperature of 28-38 ° C for 18 hours.
Перечень чертежей и рисунковList of drawings and drawings
На фиг. 1 приведена карта плазмиды pET-IL36Raf. Используются следующие обозначения:In FIG. 1 shows a map of plasmid pET-IL36Raf. The following notation is used:
NdeI и XhoI - сайты рестрикции, ограничивающие ген IL-36RafNdeI and XhoI — Restriction Sites Restricting IL-36Raf Gene
На фиг. 2 приведена карта плазмиды pET-IL36Raf-His. Используются следующие обозначения:In FIG. 2 shows a map of the plasmid pET-IL36Raf-His. The following notation is used:
NdeI и XhoI - сайты рестрикции, ограничивающие ген IL-36Raf-His.NdeI and XhoI are restriction sites limiting the IL-36Raf-His gene.
На фиг. 3. показана индукция синтеза рекомбинантных IL-36Ra штаммамиIn FIG. 3. shows the induction of the synthesis of recombinant IL-36Ra strains
Escherichia coli, где цифрами обозначены следующие дорожки:Escherichia coli, where the numbers indicate the following tracks:
1 - маркеры молекулярной массы1 - molecular weight markers
2 - Escherichia coli BL21Star[DE3] - отрицательный контроль2 - Escherichia coli BL21Star [DE3] - negative control
3 - Escherichia coli BL21Star[DE3](pET-IL36Rafn-His), IPTG 0.2 mM, 3 часа3 - Escherichia coli BL21Star [DE3] (pET-IL36Rafn-His), IPTG 0.2 mM, 3 hours
4 - Escherichia coli BL21Star[DE3](pET-IL36Rafn-His), IPTG 0.2 mM, 5 часов4 - Escherichia coli BL21Star [DE3] (pET-IL36Rafn-His), IPTG 0.2 mM, 5 hours
5 - Escherichia coli BL21 Star[DE3](pET-IL36Raf-His), IPTG 0.2 mM, 3 часа5 - Escherichia coli BL21 Star [DE3] (pET-IL36Raf-His), IPTG 0.2 mM, 3 hours
6 - Escherichia coli BL21Star[DE3](pET-IL36Raf), IPTG 0.2 mM, 3 часа.6 - Escherichia coli BL21Star [DE3] (pET-IL36Raf), IPTG 0.2 mM, 3 hours.
На фиг. 4 продемонстрировано подавление продукции ИЛ-8 фибробластами кожи человека, стимулированными ИЛ-36γ различными вариантами рекомбинантного IL-3Ra-HisIn FIG. 4 shows the suppression of the production of IL-8 by human skin fibroblasts stimulated by IL-36γ by various variants of recombinant IL-3Ra-His
№1 - Полноразмерный IL-36Ra-HisNo. 1 - Full-sized IL-36Ra-His
№2 - Укороченный IL-36Ra-His.No. 2 - Shortened IL-36Ra-His.
Изобретение поясняется следующими примерами:The invention is illustrated by the following examples:
Пример 1. Создание генетических конструкций, обеспечивающих синтез рекомбинантного IL36Ra в клетках Е.coliExample 1. The creation of genetic constructs that ensure the synthesis of recombinant IL36Ra in E. coli cells
Последовательность искусственного гена, кодирующего IL36Ra человека, была составлена с учетом частоты использования кодонов в геноме Escherichia coli (Seq ID No 1). По концам к гену были добавлены олигонуклеотиды, формирующие сайты рестрикции NdeI и XhoI. Ген был получен путем химического синтеза, обработан вышеуказанными рестриктазами и клонирован в подготовленный аналогичным образом вектор pET22b+ с получением экспрессионной плазмиды pET-IL36Raf. Кольцевая карта плазмиды pET-IL36 представлена на фиг. 1.The sequence of the artificial gene encoding human IL36Ra was compiled taking into account the frequency of codon use in the Escherichia coli genome (Seq ID No. 1). At the ends, oligonucleotides that form the restriction sites NdeI and XhoI were added to the gene. The gene was obtained by chemical synthesis, processed with the above restriction enzymes and cloned into the pET22b + vector prepared in a similar manner to obtain the expression plasmid pET-IL36Raf. A ring map of the plasmid pET-IL36 is shown in FIG. one.
Также был получен оптимизированный ген IL36Ra, отличающийся от Seq ID No 1 наличием с 3′-конца последовательности, кодирующей С-концевой полигистидиновый таг LEHHHHHH (Seq ID No 2).An optimized IL36Ra gene was also obtained, which differs from Seq ID No. 1 by the presence at the 3′-end of the sequence encoding the C-terminal polyhistidine tag LEHHHHHH (Seq ID No. 2).
Дополнительно методом обратной транскрипции мРНК мононуклеарных клеток периферической крови человека со специфическими праймерами была получена последовательность кДНК IL-36Ra человека, которую методом ПЦР удлинили с 3′-конца добавлением последовательности, кодирующей полигистидиновый таг. К данным последовательностям генов также добавили с 5′- и 3′-концов нуклеотиды, формирующие вышеуказанные сайты рестрикции. Полученные последовательности были вставлены в вектор pET22b+ по сайтам рестрикции NdeI и XhoI с получением экспрессионных плазмид pET-IL36Raf-His, pET-IL36Rafn и pET-IL36Rafn-His, соответственно (Табл. 1).Additionally, a human IL-36Ra cDNA sequence was obtained by reverse transcription of mRNA of human peripheral blood mononuclear cells with specific primers, which was extended by PCR from the 3′-end by adding a sequence encoding a polyhistidine tag. Nucleotides forming the above restriction sites were also added to these gene sequences from the 5′- and 3′-ends. The obtained sequences were inserted into the pET22b + vector at the NdeI and XhoI restriction sites to obtain expression plasmids pET-IL36Raf-His, pET-IL36Rafn and pET-IL36Rafn-His, respectively (Table 1).
Пример 2. Получение штаммов-продуцентов IL36RaExample 2. Obtaining producer strains of IL36Ra
Полученными плазмидами pET-IL36Raf, pET-IL36Raf-His, pET-IL36Rafn и pET-IL36Rafn-His были трансформированы клетки Escherichia coli штамма BL21Star[DE3], содержащие в своем геноме ген, кодирующий полимеразу фага Т7 под контролем бактериального промотора, индуцируемого лактозой. Кроме того, они не содержат протеазу lon и несут мутацию в гене, кодирующем протеазу OmpT. Отсутствие этих двух протеаз уменьшает деградацию гетерологичных белков. Данный штамм содержит также мутацию в гене rne, кодирующем рибонуклеазу Е, что приводит к увеличению стабильности мРНК в клетке, и, как следствие, к повышению продукции клетками данного штамма рекомбинантного белка.The obtained plasmids pET-IL36Raf, pET-IL36Raf-His, pET-IL36Rafn and pET-IL36Rafn-His transformed Escherichia coli cells of strain BL21Star [DE3] containing the gene encoding the phage T7 polymerase under the control of the bacterial promoter induced by lactose in its genome. In addition, they do not contain the lon protease and carry a mutation in the gene encoding the OmpT protease. The absence of these two proteases reduces the degradation of heterologous proteins. This strain also contains a mutation in the rne gene encoding ribonuclease E, which leads to an increase in the stability of mRNA in the cell, and, as a result, to an increase in the production of recombinant protein by the cells of this strain.
В результате был получены штаммы Escherichia coli BL21Star[DE3](pET-IL36Raf) и Escherichia coli BL21Star[DE3](pET-IL36Raf-His) - продуценты полноразмерного IL36Ra и IL36Ra, содержащего С-концевой полигистидиновый таг, в которых использована оптимизированная по составу кодонов последовательность ДНК, а также штаммы Escherichia coli BL21Star[DE3](pET-IL36Rafn) и BL21 Star[DE3](pET-IL36Rafn-His), в которых содержится неоптимизированная кДНК IL-36Ra человека.As a result, strains of Escherichia coli BL21Star [DE3] (pET-IL36Raf) and Escherichia coli BL21Star [DE3] (pET-IL36Raf-His) were obtained, which are producers of full-sized IL36Ra and IL36Ra containing a C-terminal polyhistidine tag using optimized composition codons of the DNA sequence, as well as Escherichia coli strains BL21Star [DE3] (pET-IL36Rafn) and BL21 Star [DE3] (pET-IL36Rafn-His), which contain non-optimized human IL-36Ra cDNA.
Для поддержания полученных штаммов-продуцентов использовали плотную агаризованную LB-среду, содержащую 100 мкг/мл ампициллина и 1% глюкозы.To maintain the obtained producer strains, a dense agarized LB medium containing 100 μg / ml ampicillin and 1% glucose was used.
Продуктивность штаммов Escherichia coli BL21Star[DE3](pET-IL36Raf) и Escherichia coli BL21Star[DE3](pET-IL36Raf-His) в сравнении со штаммом Escherichia coli BL21Star[DE3](pET-IL36Rafn-His) изучали путем культивирования клеток в среде LB, в термостатированной качалке роторного типа при температуре 37°C, скорости вращения платформы 250 об/мин в течение 18 часов. После достижения клетками плотности, соответствующей А600=0,2 добавляли индуктор - изопропилтиогалактопираннозид (ИПТГ) до конечной концентрации 0,2 мМ. После 3 и 5 часов культивирования в присутствии индуктора клетки осаждали центрифугированием, лизировали и белки клеточных лизатов разделяли электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Содержание белка в полосе, соответствующей рекомбинантному IL-36Ra, определяли денситометриированием геля с последующим анализом программой Image J. В качестве контроля использовали клетки штамма Escherichia coli BL21Star[DE3], не содержавшие экспрессионных плазмид.The productivity of Escherichia coli BL21Star [DE3] (pET-IL36Raf) and Escherichia coli BL21Star [DE3] (pET-IL36Raf-His) strains in comparison with the Escherichia coli BL21Star [DE3] (pET-IL36Rafn-His) strain was studied by culturing cells in medium LB, in a thermostatic rocker-type rocking chair at a temperature of 37 ° C, platform rotation speed of 250 rpm for 18 hours. After the cells reached a density corresponding to A600 = 0.2, an inducer, isopropylthiogalactopyranoside (IPTG) was added to a final concentration of 0.2 mM. After 3 and 5 hours of cultivation in the presence of an inducer, the cells were precipitated by centrifugation, lysed, and the proteins of the cell lysates were separated by polyacrylamide gel electrophoresis under denaturing conditions. The protein content in the band corresponding to recombinant IL-36Ra was determined by gel densitometry followed by Image J analysis. As a control, Escherichia coli strain BL21Star [DE3] was used that did not contain expression plasmids.
Результат представлен на фиг. 3.The result is shown in FIG. 3.
Как видно из фиг. 3, индукция культур клеток штаммов Escherichia coli BL21Star[DE3](pET-IL36Raf), Escherichia coli BL21 Star[DE3](pET-IL36Raf-His), Escherichia coli BL21Star[DE3](pET-IL36Rafn-His) приводит к синтезу белка с молекулярным весом от 17 до 18 килодальтон, что соответствует ожидаемым молекулярным весам для экспрессируемых вариантов IL-36Ra, представленным в таблице 1. Денситометрия полиакриламидного геля, представленного на фиг. 3, показала, что штамм Escherichia coli BL21[DE3]Star(pET-IL36Raf) в условиях индукции за 3 часа продуцирует рекомбинантный IL36Ra, количество которого составляет 17,6% общего белка клеточного лизата. Культивирование штамма Escherichia coli BL21[DE3]Star(pET-IL36Raf-His) в аналогичных условиях показало содержание IL36Ra в клеточном лизате 13,7%. Культивирование клеток штамма Escherichia coli BL21Star[DE3](pET-IL36Rafn-His), содержащих неоптимизированную последовательность гена IL-36Ra, показало накопление значительно меньших количеств рекомбинантного IL-36Ra-His, составивших 8,0% и 8,6% белков клеточных лизатов за 3 и 5 часов культивирования после внесения индуктора. Таким образом, оптимизированная по частоте использования кодонов последовательность, кодирующая IL-36Ra (Seq ID No1), обеспечивает более высокую продуктивность штамма-продуцента, чем природная (неоптимизированная) последовательность кДНК IL-36Ra.As can be seen from FIG. 3, the induction of cell cultures of Escherichia coli BL21Star [DE3] strains (pET-IL36Raf), Escherichia coli BL21 Star [DE3] (pET-IL36Raf-His), Escherichia coli BL21Star [DE3] (pET-IL36Rafn-His) leads to protein synthesis with a molecular weight of 17 to 18 kilodaltons, which corresponds to the expected molecular weights for the expressed variants of IL-36Ra, are presented in table 1. Densitometry of the polyacrylamide gel shown in Fig. 3, showed that the strain Escherichia coli BL21 [DE3] Star (pET-IL36Raf) under the conditions of induction in 3 hours produces recombinant IL36Ra, the amount of which is 17.6% of the total protein of the cell lysate. Cultivation of the Escherichia coli strain BL21 [DE3] Star (pET-IL36Raf-His) under similar conditions showed an IL36Ra content of 13.7% in the cell lysate. The cultivation of Escherichia coli BL21Star [DE3] strain cells (pET-IL36Rafn-His) containing the non-optimized IL-36Ra gene sequence showed the accumulation of significantly smaller amounts of recombinant IL-36Ra-His, which comprised 8.0% and 8.6% of cell lysate proteins for 3 and 5 hours of cultivation after making the inductor. Thus, the codon-optimized sequence encoding IL-36Ra (Seq ID No1) provides higher productivity of the producer strain than the natural (non-optimized) IL-36Ra cDNA sequence.
Пример 3. Исследование биологической активности рекомбинантного IL-36RaExample 3. The study of the biological activity of recombinant IL-36Ra
Биологическую активность вариантов рекомбинантного IL-36Ra определяли по их способности подавлять продукцию IL-8 фибробластами кожи человека, индуцированными ИЛ-36γ. Для этой цели фибробласты кожи человека культивировали в среде DMEM/F12 с 10% фетальной сыворотки. За сутки до постановки теста клетки снимали с пластика раствором Версена с трипсином и рассевали в 96-луночную плату по 2×104 клеток на лунку в 100 мкл среды DMEM/F12 с 10% FCS. Через 24 часа среду заменяли на свежую и вносили в параллелях рекомбинантный человеческий ИЛ-36γ (R&D Systems) в концентрации 10 нг/мл и различные концентрации полноразмерного IL-36Ra-His и укороченного варианта IL-36Ra-His (R&D Systems). Через 24 часа выделяли супернатанты, в которых анализировали содержание ИЛ-8 человека с помощью иммуноферментного анализа, используя тест-систему производства ООО «Цитокин» по инструкции изготовителя.The biological activity of recombinant IL-36Ra variants was determined by their ability to suppress IL-8 production by human skin fibroblasts induced by IL-36γ. For this purpose, human skin fibroblasts were cultured in DMEM / F12 medium with 10% fetal serum. The day before the test, the cells were removed from plastic with a Versen solution with trypsin and scattered into a 96-well plate at 2 × 10 4 cells per well in 100 μl of DMEM / F12 medium with 10% FCS. After 24 hours, the medium was replaced with fresh and in parallel, recombinant human IL-36γ (R&D Systems) was added at a concentration of 10 ng / ml and various concentrations of full-length IL-36Ra-His and a shortened version of IL-36Ra-His (R&D Systems). After 24 hours, supernatants were isolated, in which the content of human IL-8 was analyzed using an enzyme-linked immunosorbent assay using a test system manufactured by Cytokine LLC according to the manufacturer's instructions.
Результаты, представленные на фиг. 4, показывают, что внесение возрастающих доз полноразмерного и укороченного вариантов IL-36Ra-His приводит к дозозависимому подавлению продукции фибробластами кожи человека IL-8 до фонового уровня 440±17 пг/мл (спонтанная продукция ИЛ-8 фибробластами составила 407±37 пг/мл. При добавлении 10 нг/мл ИЛ-36γ концентрация ИЛ-8 в супернатантах увеличивалась до 1123±130 пг/мл).The results presented in FIG. 4 show that the introduction of increasing doses of the full-sized and shortened IL-36Ra-His variants leads to a dose-dependent suppression of human skin fibroblast production of IL-8 to a background level of 440 ± 17 pg / ml (spontaneous production of IL-8 by fibroblasts was 407 ± 37 pg / ml With the addition of 10 ng / ml IL-36γ, the concentration of IL-8 in supernatants increased to 1123 ± 130 pg / ml).
Полное подавление стимуляции клеток ИЛ-36γ было достигнуто при внесении 3 мкг/мл полноразмерного ИЛ-36Ra-His. При этом укороченный на 1 N-концевую аминокислоту белок снижал продукцию ИЛ-8, стимулированную ИЛ-36γ, лишь на 50%: при концентрации укороченного IL-36Ra-His 3 мкг/мл концентрация ИЛ-8 в супернатанте составляла 746±59 пг/мл.Complete suppression of IL-36γ cell stimulation was achieved with 3 μg / ml full-length IL-36Ra-His. At the same time, a protein shortened by 1 N-terminal amino acid reduced IL-8 production stimulated by IL-36γ by only 50%: at a concentration of truncated IL-36Ra-His of 3 μg / ml, the concentration of IL-8 in the supernatant was 746 ± 59 pg / ml
Таким образом, использование настоящей группы изобретений позволило получить штамм-продуцент биологически активного рекомбинантного IL-36Ra Escherichia coli BL21[DE3](pET-IL36Raf) с повышенной биологической активностью.Thus, the use of the present group of inventions made it possible to obtain a producer strain of biologically active recombinant IL-36Ra Escherichia coli BL21 [DE3] (pET-IL36Raf) with increased biological activity.
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014130529/10A RU2582569C2 (en) | 2014-07-24 | 2014-07-24 | Dna coding full-size human interleukin-receptor antagonist 36, dna coding full-size human interleukin-receptor antagonist 36 with c-end poligistidine tag, plasmid expression vector (versions), escherichia coli bl21 [de3] star (pet-il36raf),-producer of full-size receptor antagonist 36 and strain of bacteria escherichia coli bl21 [de3] star (pet-il36raf-his),-producer of full-size receptor antagonist 36 with c-end poligistidine tag |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014130529/10A RU2582569C2 (en) | 2014-07-24 | 2014-07-24 | Dna coding full-size human interleukin-receptor antagonist 36, dna coding full-size human interleukin-receptor antagonist 36 with c-end poligistidine tag, plasmid expression vector (versions), escherichia coli bl21 [de3] star (pet-il36raf),-producer of full-size receptor antagonist 36 and strain of bacteria escherichia coli bl21 [de3] star (pet-il36raf-his),-producer of full-size receptor antagonist 36 with c-end poligistidine tag |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2014130529A RU2014130529A (en) | 2016-02-10 |
| RU2582569C2 true RU2582569C2 (en) | 2016-04-27 |
Family
ID=55313216
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014130529/10A RU2582569C2 (en) | 2014-07-24 | 2014-07-24 | Dna coding full-size human interleukin-receptor antagonist 36, dna coding full-size human interleukin-receptor antagonist 36 with c-end poligistidine tag, plasmid expression vector (versions), escherichia coli bl21 [de3] star (pet-il36raf),-producer of full-size receptor antagonist 36 and strain of bacteria escherichia coli bl21 [de3] star (pet-il36raf-his),-producer of full-size receptor antagonist 36 with c-end poligistidine tag |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2582569C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2672816C2 (en) * | 2017-02-06 | 2018-11-19 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства | METHOD OF PRODUCING NON-METHIONINE RECEPTOR ANTAGONIST INTERLEUKIN-36 STRAIN BACTERIA ESCHERICHIA COLI BL21 [DE3] - PRODUCER NON-METHIONINE RECEPTOR ANTAGONIST INTERLEUKIN-36 (VARIANTS), METHOD OF THEIR PREPARATION, AND PLASMID VECTOR pBAD15A pET15A AND DNA SEQUENCE FOR THEIR PREPARATION |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2326947C2 (en) * | 2004-11-23 | 2008-06-20 | Общество с ограниченной ответственностью "ЦИТОКИН" | Method of preparation of recombinant antagonist of human interleukine-1 receptor "aril" |
| WO2012103240A2 (en) * | 2011-01-25 | 2012-08-02 | Eleven Biotherapeutics, Inc. | Receptor binding agents |
| US20130236471A1 (en) * | 2011-11-16 | 2013-09-12 | Boehringer Ingelheim Gmbh | Anti il-36r antibodies |
-
2014
- 2014-07-24 RU RU2014130529/10A patent/RU2582569C2/en active IP Right Revival
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2326947C2 (en) * | 2004-11-23 | 2008-06-20 | Общество с ограниченной ответственностью "ЦИТОКИН" | Method of preparation of recombinant antagonist of human interleukine-1 receptor "aril" |
| WO2012103240A2 (en) * | 2011-01-25 | 2012-08-02 | Eleven Biotherapeutics, Inc. | Receptor binding agents |
| US20130236471A1 (en) * | 2011-11-16 | 2013-09-12 | Boehringer Ingelheim Gmbh | Anti il-36r antibodies |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| VIGNE S. et al., IL-36R ligands are potent regulators of dendritic and T cells, Blood, 2011, v.118, n.22, p.5813-5823. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2672816C2 (en) * | 2017-02-06 | 2018-11-19 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства | METHOD OF PRODUCING NON-METHIONINE RECEPTOR ANTAGONIST INTERLEUKIN-36 STRAIN BACTERIA ESCHERICHIA COLI BL21 [DE3] - PRODUCER NON-METHIONINE RECEPTOR ANTAGONIST INTERLEUKIN-36 (VARIANTS), METHOD OF THEIR PREPARATION, AND PLASMID VECTOR pBAD15A pET15A AND DNA SEQUENCE FOR THEIR PREPARATION |
| RU2672816C9 (en) * | 2017-02-06 | 2019-01-11 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства | THE METHOD OF PRODUCTION OF INTERLEUKIN-36 RECEPTOR ANTAGONIST WITH CLEAVED N-TERMINAL METHIONINE, ESCHERICHIA COLI BL21[DE3] STRAIN PRODUCING INTERLEUKIN-36 RECEPTOR ANTAGONIST WITH CLEAVED N-TERMINAL METHIONINE (VARIANTS), METHOD OF THEIR CONSTRUCTION, PLASMID VECTORS pBAD15A AND pET15A AND DNA SEQUENCE FOR THEIR CONSTRUCTION |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2014130529A (en) | 2016-02-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6941664B2 (en) | Modified IL-2 mutant that selectively activates regulatory T cells for the treatment of autoimmune diseases | |
| Rodríguez et al. | Enzyme replacement therapy for Morquio A: an active recombinant N-acetylgalactosamine-6-sulfate sulfatase produced in Escherichia coli BL21 | |
| WO2020082950A1 (en) | Sphingosine kinase 1, fusion protein comprising same, and use thereof | |
| KR20210032972A (en) | Means and methods for increasing protein expression using transcription factors | |
| Ayed et al. | High level production and purification of human interferon α2b in high cell density culture of Pichia pastoris | |
| Guo et al. | Production of soluble bioactive mouse leukemia inhibitory factor from Escherichia coli using MBP tag | |
| CN103193887B (en) | Recombinant porcine IL2-Fc (interteukin-2-Fc) fusion protein as well as encoding gene and expressing method of fusion protein | |
| WO2017181920A1 (en) | Method for preparing recombinant human granulocyte colony-stimulating factor | |
| RU2582569C2 (en) | Dna coding full-size human interleukin-receptor antagonist 36, dna coding full-size human interleukin-receptor antagonist 36 with c-end poligistidine tag, plasmid expression vector (versions), escherichia coli bl21 [de3] star (pet-il36raf),-producer of full-size receptor antagonist 36 and strain of bacteria escherichia coli bl21 [de3] star (pet-il36raf-his),-producer of full-size receptor antagonist 36 with c-end poligistidine tag | |
| CN107937408B (en) | Epinephelus coioidesinsulinGene, encoded protein and application thereof | |
| RU2524133C2 (en) | Escherichia coli BACTERIA STRAIN - PRODUCER OF RECOMBINANT FLAGELLIN | |
| CN116925240A (en) | Recombinant collagen and expression method and application thereof | |
| Devi et al. | A combinatorial approach of N-terminus blocking and codon optimization strategies to enhance the soluble expression of recombinant hIL-7 in E. coli fed-batch culture | |
| CN104119445A (en) | Fusion protein containing leucine-rich repetitive sequence, and preparation method and application thereof | |
| Luo et al. | Expression, purification, and functional characterization of recombinant human interleukin-7 | |
| US20200377873A1 (en) | Variants of porcine trypsin | |
| Kim et al. | Expression and efficient one-step chromatographic purification of a soluble antagonist for human leukemia inhibitory factor receptor in Escherichia coli | |
| CN103012578B (en) | Recombinant porcine interleukin 2, and encoding gene and expression method thereof | |
| JP2012147772A (en) | Recombinant plasmid vector and method for producing protein by using the same | |
| RU2610173C1 (en) | Recombinant plasmid pfm-ifn-17 providing expression of interferon alpha-2b of human, recombinant plasmid pfm-ap, providing expression of enzyme methionine-aminopeptidase e coli, biplasmid strain escherichia coli fm-ifn-ap (pfm-ifn-17, pfm-ap) - producer (met-) of recombinant interferon alpha -2b of human | |
| KR101634078B1 (en) | Process for producing protein capable of forming inclusion body | |
| CN101962654B (en) | Overexpression of thymidylate synthase in colon bacillus | |
| CN104119448A (en) | Fusion protein containing leucine-rich repetitive sequence, and preparation method and application thereof | |
| CN104119447A (en) | Fusion protein containing leucine-rich repetitive sequence, and preparation method and application thereof | |
| RU2804544C2 (en) | RECOMBINANT PLASMIN DNA pFGF2, ENCODING A POLYPEPTIDE WITH THE PROPERTIES OF THE MAIN HUMAN FIBROBLAST GROWTH FACTOR AND RECOMBINANT STRAIN OF METHYLOTROPHIC YEAST PICHIA PASTORIS WHICH IS PRODUCER OF POLYPEPTIDE WITH THE PROPERTIES OF THE MAIN FIBROBLAST GROWTH FACTOR |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160725 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20170510 |