RU2575830C2 - Compositions and methods, including alkylglycosides, for stabilisation of protein-containing compositions - Google Patents

Compositions and methods, including alkylglycosides, for stabilisation of protein-containing compositions Download PDF

Info

Publication number
RU2575830C2
RU2575830C2 RU2013103025/15A RU2013103025A RU2575830C2 RU 2575830 C2 RU2575830 C2 RU 2575830C2 RU 2013103025/15 A RU2013103025/15 A RU 2013103025/15A RU 2013103025 A RU2013103025 A RU 2013103025A RU 2575830 C2 RU2575830 C2 RU 2575830C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
antibody
glucopyranoside
alkyl glycoside
protein
composition
Prior art date
Application number
RU2013103025/15A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2013103025A (en
Inventor
Осигве ЕСУЕ
Викас К. ШАРМА
Original Assignee
Дженентек, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дженентек, Инк. filed Critical Дженентек, Инк.
Priority claimed from PCT/US2011/041598 external-priority patent/WO2011163458A2/en
Publication of RU2013103025A publication Critical patent/RU2013103025A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2575830C2 publication Critical patent/RU2575830C2/en

Links

Images

Abstract

FIELD: medicine.
SUBSTANCE: group of inventions relates to field of pharmaceutics and deals with aqueous composition, containing antibody and alkylglycoside, which has CNC value about 1.0 mM or higher in water at 25°C, where alkylglycoside is present in concentration, which is lower than alkylglycoside CMC value in water at 25°C. Also claimed are method of antibody aggregation inhibition and method for prevention of antibody oxidation in aqueous solution with application of aqueous composition.
EFFECT: increased antibody stability in therapeutically suitable compositions.
33 cl, 16 dwg, 2 tbl, 3 ex

Description

Родственная заявкаRelated Application

По данной заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США 61/358105, поданной 24 июня 2010, которая полностью включена в настоящее описание посредством ссылки.This application claims the priority of provisional patent application US 61/358105, filed June 24, 2010, which is fully incorporated into this description by reference.

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Изобретение относится к применению определенных композиций алкилгликозидов для предотвращения агрегации и окисления антител и других белков в их терапевтически пригодных составах.The invention relates to the use of certain alkyl glycoside compositions to prevent the aggregation and oxidation of antibodies and other proteins in their therapeutically useful formulations.

Предпосылки создания изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION

В случае, когда в белковом составе требуется стабилизатор для защиты от денатурации при встряхивании, перемешивании, фрагментации и замерзании-оттаивании или в состоянии покоя на поверхности раздела, часто используется неионный детергент (то есть поверхностно-активное вещество) (патент США 5183746). Примерами этого является применение полисорбатов во многих содержащих белки продуктах. Например, полисорбаты 20 и 80 (Tween® 20 и Tween® 80) используются в составах биотерапевтических продуктов как для предотвращения поверхностной абсорбции, так и в качестве стабилизаторов, направленных против агрегации белков (Kerwin, J. Pharm. Sci. 97(8):2924-2936 (2008)). Полисорбаты представляют собой амфипатические неионные поверхностно-активные вещества, состоящие из эфиров жирных кислот полиоксиэтилен(POE)-сорбитана, таких как полиоксиэтиленсорбитанмонолаурат для полисорбата 20 и полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат для полисорбата 80.In the case where a stabilizer is required in the protein composition to protect against denaturation by shaking, stirring, fragmenting and freezing-thawing or at rest on the interface, a non-ionic detergent (i.e., a surfactant) is often used (US Pat. No. 5,183,746). Examples of this are the use of polysorbates in many protein-containing foods. For example, polysorbates 20 and 80 (Tween® 20 and Tween® 80) are used in biotherapeutic product formulations both to prevent surface absorption and as stabilizers against protein aggregation (Kerwin, J. Pharm. Sci. 97 (8): 2924-2936 (2008)). Polysorbates are amphipathic nonionic surfactants consisting of polyoxyethylene (POE) sorbitan fatty acid esters such as polyoxyethylene sorbitan monolaurate for polysorbate 20 and polyoxyethylene sorbitan monooleate for polysorbate 80.

Однако, к сожалению, полисорбаты могут подвергаться разложению посредством окисления или гидролиза. В случае, когда молекула полисорбата разлагается, она создает различные побочные продукты разложения, например жирные кислоты, POE-сорбитан, PEG, PEG-эфиры и алкиловые кислоты. Определенные из таких побочных продуктов разложения, включая свободные жирные кислоты, могут вызвать увеличение мутности и агрегации белков в содержащих белки составах. Следовательно, хотя полисорбаты обычно применяются в качестве стабилизаторов белков, жирные кислоты и другие побочные продукты разложения, высвобождающиеся при деградации полисорбатов с течением времени, могут неблагоприятно повлиять на защитный эффект, который полисорбаты демонстрируют в содержащих белки составах.However, unfortunately, polysorbates can be decomposed by oxidation or hydrolysis. When the polysorbate molecule decomposes, it creates various by-products of decomposition, for example, fatty acids, POE-sorbitan, PEG, PEG esters and alkyl acids. Certain of these by-products of decomposition, including free fatty acids, can cause an increase in turbidity and protein aggregation in protein-containing formulations. Therefore, although polysorbates are commonly used as protein stabilizers, fatty acids and other decomposition by-products released during the degradation of polysorbates over time can adversely affect the protective effect that polysorbates exhibit in protein-containing formulations.

Белки проходят через различные степени деградации в процессе очистки и хранения, где окисление (включая вызванное светом окисление) является одним из основных путей разложения, который оказывает разрушающее влияние на стабильность и активность белков. Окислительные реакции вызывают разрушение аминокислотных остатков, гидролиз пептидных связей и, следовательно, нестабильность белка вследствие изменения третичной структуры белка и агрегации белков (Davies, J. Biol. Chem. 262: 9895-901 (1987)). Обзор окисления белковых фармацевтических препаратов приведен в работах Nguyen (Chapter 4 in Formulation and Delivery of Protein and Peptides (1994)), Hovorka, (J. Pharm Sci. 90:25369 (2001)) и Li (Biotech Bioengineering 48:490-500 (1995)).Proteins go through various degrees of degradation during purification and storage, where oxidation (including light-induced oxidation) is one of the main degradation pathways that has a damaging effect on protein stability and activity. Oxidative reactions cause the destruction of amino acid residues, hydrolysis of peptide bonds and, consequently, protein instability due to changes in the tertiary structure of the protein and protein aggregation (Davies, J. Biol. Chem. 262: 9895-901 (1987)). A review of the oxidation of protein pharmaceutical preparations is provided by Nguyen (Chapter 4 in Formulation and Delivery of Protein and Peptides (1994)), Hovorka, (J. Pharm Sci. 90: 25369 (2001)) and Li (Biotech Bioengineering 48: 490-500 (1995)).

С учетом изложенного выше, очевидно, что существует потребность в идентификации композиций, которые могут быть использованы для повышения стабильности и предотвращения агрегации и/или окисления белков в содержащих белки составах.In view of the foregoing, it is obvious that there is a need to identify compositions that can be used to increase stability and prevent aggregation and / or oxidation of proteins in protein-containing formulations.

Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

Изобретение основано на обнаружении того, что определенные композиции алкилгликозидов эффективны для стабилизации и/или снижения агрегации или иммуногенности антител и других белков в терапевтически эффективных составах. Кроме того, изобретение также основано на обнаружении того, что определенные композиции алкилгликозидов эффективны для предотвращения окисления аминокислотных остатков, в частности остатков триптофана, в антителах или других белках в терапевтически эффективных составах. Более конкретно, один из аспектов изобретения направлен на способы применения алкилгликозидов, имеющих значение критической концентрации мицеллообразования (CMC), составляющее по меньшей мере 1,0 мМ, в качестве агентов, стабилизирующих белки или снижающих их агрегацию. В определенных вариантах осуществления изобретения композиция алкилгликозидов используется в составе, содержащем антитела или другие белки, в концентрации, которая ниже соответствующего значения CMC.The invention is based on the discovery that certain alkyl glycoside compositions are effective in stabilizing and / or reducing the aggregation or immunogenicity of antibodies and other proteins in therapeutically effective formulations. In addition, the invention is also based on the discovery that certain alkyl glycoside compositions are effective in preventing the oxidation of amino acid residues, in particular tryptophan residues, in antibodies or other proteins in therapeutically effective formulations. More specifically, one aspect of the invention is directed to methods of using alkyl glycosides having a critical micelle concentration (CMC) of at least 1.0 mM as protein stabilizing agents or reducing their aggregation. In certain embodiments, the alkyl glycoside composition is used in a composition containing antibodies or other proteins at a concentration that is lower than the corresponding CMC value.

Соответственно в одном из аспектов изобретение относится к композиции, содержащей белок и алкилгликозид, имеющий значение CMC около 1,0 мМ или более в воде при 25°C. В определенных вариантах осуществления белок, присутствующий в композиции, представляет собой антитело, которое необязательно может представлять собой моноклональное антитело. В других вариантах осуществления алкилгликозид выбран из группы, состоящей из н-гексил-β-D-глюкопиранозида, н-гептил-β-D-глюкопиранозида, н-октил-β-D-глюкопиранозида, н-нонил-β-D-глюкопиранозида, н-децил-β-D-глюкопиранозида, 3-циклогексил-1-пропил-β-D-глюкозида, 3-циклогексил-1-бутил-β-D-глюкозида, н-гексил-β-D-мальтопиранозида, н-октил-β-D-мальтопиранозида, н-нонил-β-D-мальтопиранозида, н-децил-β-D-мальтопиранозида, циклогексилметил-β-D-мальтозида, 2-циклогексилэтил-β-D-мальтозида, 3-циклогексилпропил-β-D-мальтозида, 4-циклогексилбутил-β-D-мальтозида и 5-циклогексилпентил-β-D-мальтозида. В других вариантах осуществления композиция содержит количество алкилгликозида, ингибирующее агрегацию, вызванную перемешиванием, или препятствующее окислению. В еще одном варианте осуществления алкилгликозид присутствует в композиции в концентрации, которая меньше значения CMC алкилгликозида в воде при 25°C. Композиция может быть водной, может быть стабильной при температуре около 2-8°C в течение по меньшей мере одного года и/или может быть стабильной при температуре около 30°C в течение по меньшей мере одного месяца. Необязательно вещество композиции является нелиофилизированным и не подвергнутым предшествующей лиофилизации, или может представлять собой ресуспендированный лиофилизированный состав.Accordingly, in one aspect, the invention provides a composition comprising a protein and an alkyl glycoside having a CMC value of about 1.0 mM or more in water at 25 ° C. In certain embodiments, the protein present in the composition is an antibody, which optionally may be a monoclonal antibody. In other embodiments, the implementation of the alkyl glycoside is selected from the group consisting of n-hexyl-β-D-glucopyranoside, n-heptyl-β-D-glucopyranoside, n-octyl-β-D-glucopyranoside, n-nonyl-β-D-glucopyranoside , n-decyl-β-D-glucopyranoside, 3-cyclohexyl-1-propyl-β-D-glucoside, 3-cyclohexyl-1-butyl-β-D-glucoside, n-hexyl-β-D-maltopyranoside, n -octyl-β-D-maltopyranoside, n-nonyl-β-D-maltopyranoside, n-decyl-β-D-maltopyranoside, cyclohexylmethyl-β-D-maltoside, 2-cyclohexylethyl-β-D-maltoside, 3-cyclohexylpropyl β-D-maltoside, 4-cyclohexylbutyl-β-D-maltoside and 5-cy clohexylpentyl-β-D-maltoside. In other embodiments, the composition comprises an amount of alkyl glycoside that inhibits agitation caused by stirring or inhibits oxidation. In yet another embodiment, the alkyl glycoside is present in the composition at a concentration that is less than the CMC of the alkyl glycoside in water at 25 ° C. The composition may be aqueous, may be stable at a temperature of about 2-8 ° C for at least one year, and / or may be stable at a temperature of about 30 ° C for at least one month. Optionally, the substance of the composition is non-lyophilized and not subjected to previous lyophilization, or may be a resuspended lyophilized composition.

В еще одном аспекте изобретение направлено на изделие, включающее контейнер, в котором находится описанная выше композиция.In another aspect, the invention is directed to an article comprising a container in which the composition described above is located.

В еще одном аспекте изобретение направлено на способ изготовления фармацевтического состава, включающий приготовление описанной выше композиции и оценку физической стабильности, химической стабильности или биологической активности белка в композиции.In yet another aspect, the invention is directed to a method for manufacturing a pharmaceutical composition, comprising preparing the composition described above and evaluating the physical stability, chemical stability, or biological activity of the protein in the composition.

В еще одном аспекте изобретение направлено на способ ингибирования агрегации белка, вызванной перемешиванием, присутствующего в первом водном растворе, включающий стадию добавления к первому водному раствору количества алкилгликозида, ингибирующего агрегацию, вызванную перемешиванием, при этом алкилгликозид имеет значение CMC около 1,0 мМ или более в воде при 25°C, обеспечивая, таким образом, второй водный раствор.In yet another aspect, the invention is directed to a method of inhibiting agitation-induced protein aggregation present in a first aqueous solution, comprising the step of adding to the first aqueous solution an amount of agglomeration-induced aggregation inhibiting alkyl glycoside, wherein the alkyl glycoside has a CMC value of about 1.0 mM or more in water at 25 ° C, thus providing a second aqueous solution.

В еще одном аспекте изобретение направлено на способ предотвращения окисления белка, присутствующего в первом водном растворе, включающий стадию добавления к первому водному раствору количества алкилгликозида, ингибирующего окисление, при этом алкилгликозид имеет значение CMC около 1,0 мМ или более в воде при 25°C, обеспечивая, таким образом, второй водный раствор.In yet another aspect, the invention is directed to a method of preventing oxidation of a protein present in a first aqueous solution, the method comprising the step of adding to the first aqueous solution an amount of an oxidation inhibiting alkyl glycoside, wherein the alkyl glycoside has a CMC value of about 1.0 mM or more in water at 25 ° C , thus providing a second aqueous solution.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

На фиг.1 показано влияние определенных поверхностно-активных веществ на агрегацию моноклонального антитела анти-MUC16 в водном растворе, вызванную перемешиванием.Figure 1 shows the effect of certain surfactants on the aggregation of an anti-MUC16 monoclonal antibody in an aqueous solution caused by stirring.

На фиг.2 показано влияние определенных поверхностно-активных веществ на агрегацию моноклонального антитела анти-MUC16 в водном растворе, вызванную перемешиванием.Figure 2 shows the effect of certain surfactants on the aggregation of an anti-MUC16 monoclonal antibody in an aqueous solution caused by stirring.

На фиг.3 показано влияние определенных поверхностно-активных веществ на агрегацию моноклонального антитела анти-MUC16 в водном растворе, вызванную перемешиванием.Figure 3 shows the effect of certain surfactants on the aggregation of an anti-MUC16 monoclonal antibody in an aqueous solution caused by stirring.

На фиг.4 показано влияние н-октил-β-D-глюкопиранозида на мутность водных растворов, содержащих моноклональное антитело анти-MUC16.Figure 4 shows the effect of n-octyl-β-D-glucopyranoside on the turbidity of aqueous solutions containing anti-MUC16 monoclonal antibody.

На фиг.5 показано влияние н-октил-β-D-глюкопиранозида на поддержание % мономеров моноклонального антитела анти-MUC16 в водном растворе.Figure 5 shows the effect of n-octyl-β-D-glucopyranoside on the maintenance of% monomers of the anti-MUC16 monoclonal antibody in aqueous solution.

На фиг.6 показано влияние н-октил-β-D-глюкопиранозида или полисорбата 20 на мутность водных растворов, содержащих моноклональное антитело анти-MUC16.Figure 6 shows the effect of n-octyl-β-D-glucopyranoside or polysorbate 20 on the turbidity of aqueous solutions containing anti-MUC16 monoclonal antibody.

На фиг.7 показано влияние н-октил-β-D-глюкопиранозида или полисорбата 20 на мутность водных растворов, содержащих моноклональное антитело анти-IgE.7 shows the effect of n-octyl-β-D-glucopyranoside or polysorbate 20 on the turbidity of aqueous solutions containing an anti-IgE monoclonal antibody.

На фиг.8 показано влияние н-октил-β-D-глюкопиранозида или полисорбата 20 на мутность водных растворов, содержащих моноклональное антитело анти-CD11a.Figure 8 shows the effect of n-octyl-β-D-glucopyranoside or polysorbate 20 on the turbidity of aqueous solutions containing the anti-CD11a monoclonal antibody.

На фиг.9 показано влияние н-октил-β-D-глюкопиранозида или полисорбата 20 на мутность водных растворов, содержащих моноклональное антитело анти-CD22.Figure 9 shows the effect of n-octyl-β-D-glucopyranoside or polysorbate 20 on the turbidity of aqueous solutions containing anti-CD22 monoclonal antibody.

На фиг.10 показано влияние н-октил-β-D-глюкопиранозида или полисорбата 20 на поддержание % мономеров моноклонального антитела анти-MUC16 в водном растворе.Figure 10 shows the effect of n-octyl-β-D-glucopyranoside or polysorbate 20 on the maintenance of% of the monomers of the anti-MUC16 monoclonal antibody in aqueous solution.

На фиг.11 показано влияние н-октил-β-D-глюкопиранозида или полисорбата 20 на поддержание % мономеров моноклонального антитела анти-IgE в водном растворе.11 shows the effect of n-octyl-β-D-glucopyranoside or polysorbate 20 on the maintenance of% of the monomers of the anti-IgE monoclonal antibody in aqueous solution.

На фиг.12 показано влияние н-октил-β-D-глюкопиранозида или полисорбата 20 на поддержание % мономеров моноклонального антитела анти-CD11a в водном растворе.12 shows the effect of n-octyl-β-D-glucopyranoside or polysorbate 20 on the maintenance of% of the monomers of the anti-CD11a monoclonal antibody in aqueous solution.

На фиг.13 показано влияние н-октил-β-D-глюкопиранозида или полисорбата 20 на поддержание % мономеров моноклонального антитела анти-CD22 в водном растворе.13 shows the effect of n-octyl-β-D-glucopyranoside or polysorbate 20 on the maintenance of% of monomers of the anti-CD22 monoclonal antibody in aqueous solution.

На фиг.14 показано количество пероксида водорода, генерированного различными алкилгликозидами или полисорбатом 20 в растворе с течением времени.On Fig shows the amount of hydrogen peroxide generated by various alkyl glycosides or polysorbate 20 in solution over time.

На фиг.15 показано влияние различных алкилгликозидов или полисорбата 20 на предотвращение окисления антитела анти-CD11a в водном растворе.FIG. 15 shows the effect of various alkyl glycosides or polysorbate 20 on preventing the oxidation of anti-CD11a antibodies in aqueous solution.

На фиг.16 показано влияние различных алкилгликозидов или полисорбата 20 на предотвращение окисления антитела анти-CD22 в водном растворе.Figure 16 shows the effect of various alkyl glycosides or polysorbate 20 on preventing the oxidation of anti-CD22 antibodies in aqueous solution.

Подробное описание предпочтительного варианта осуществленияDetailed Description of a Preferred Embodiment

Изобретение может быть понятно намного легче со ссылками на приведенное ниже подробное описание конкретных вариантов осуществления и примеры, приведенные в нем.The invention can be understood much more easily with reference to the following detailed description of specific embodiments and examples provided therein.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном описании, имеют то же самое значение, в котором они обычно понимаются специалистом в области техники, к которой относится изобретение. Хотя произвольные способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном описании, могут быть использованы при практическом применении или тестировании изобретения, ниже описаны предпочтительные способы и материалы. Все публикации, приведенные в данном описании, включены в него посредством ссылки во всей своей полноте.Unless otherwise specified, all technical and scientific terms used in this description have the same meaning in which they are usually understood by a specialist in the field of technology to which the invention relates. Although arbitrary methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the invention, preferred methods and materials are described below. All publications cited herein are incorporated by reference in their entirety.

В данном описании диапазоны или количества, перед которыми находится термин "около" явным образом включают точный диапазон или точное численное количество.In this specification, ranges or amounts in front of which the term “about” explicitly includes the exact range or exact numerical amount.

Агрегация антител и других белков преимущественно вызывается гидрофобными взаимодействиями, которые в результате приводят к денатурации. Если гидрофобная область частично или полностью развернутого белка подвергается воздействию воды, то это создает термодинамически неблагоприятную ситуацию из-за того факта, что обычно находящаяся внутри гидрофобная область теперь взаимодействует с гидрофильной водной средой. В результате этого снижение энтропии из-за структурирования водных молекул вокруг гидрофобной области вызывает агрегацию денатурированного белка, преимущественно через взаимодействующие гидрофобные области. Таким образом, растворимость белка также может быть нарушена. В некоторых случаях может в определенных условиях произойти самоассоциация белковых субъединиц, естественных или неправильно свернутых, что приведет к осаждению и потере активности.The aggregation of antibodies and other proteins is predominantly caused by hydrophobic interactions that result in denaturation. If the hydrophobic region of a partially or fully unfolded protein is exposed to water, this creates a thermodynamically unfavorable situation due to the fact that the usually hydrophobic region inside is now interacting with a hydrophilic aqueous medium. As a result of this, a decrease in entropy due to the structuring of aqueous molecules around the hydrophobic region causes aggregation of the denatured protein, mainly through interacting hydrophobic regions. Thus, the solubility of the protein can also be impaired. In some cases, under certain conditions, self-association of protein subunits, natural or improperly folded, can occur, which will lead to precipitation and loss of activity.

Факторы, которые влияют на агрегацию белков в растворе, обычно включают концентрацию белка, pH, температуру, другие эксципиенты и механическое напряжение. Некоторые факторы (например, температура) могут легче контролироваться во время очистки, составления смеси, производства, хранения и применения, чем другие (например, механическое напряжение). При исследовании составов будут выбраны соответствующие значения pH и эксципиенты, которые не вызовут агрегацию и/или фактически будут помогать в предотвращении агрегации. Концентрация белка определяется требуемой терапевтической дозой и в зависимости от значения данной концентрации будет определять, существует ли потенциал для более высоких состояний ассоциации (димеры, тетрамеры и т.д.), которые могут затем привести к агрегации в растворе. Тщательный анализ должен быть проведен в процессе разработки состава для определения того, какие факторы влияют на агрегацию белков и затем каким образом данные факторы могут быть исключены или каким образом они могут контролироваться.Factors that influence protein aggregation in solution typically include protein concentration, pH, temperature, other excipients, and mechanical stress. Some factors (e.g. temperature) can be more easily controlled during cleaning, mixing, production, storage and use than others (e.g. mechanical stress). In the study of formulations, appropriate pH values and excipients will be selected that will not cause aggregation and / or will actually help prevent aggregation. The protein concentration is determined by the required therapeutic dose and, depending on the value of this concentration, it will determine whether there is a potential for higher association states (dimers, tetramers, etc.), which can then lead to aggregation in solution. A thorough analysis should be carried out during the formulation development process to determine which factors influence protein aggregation and then how these factors can be excluded or how they can be controlled.

Желание идентифицировать стабильные составы растворов антител или другого белка для применения при парентеральном или другом введении может привести к разработке методологии тестирования для оценки влияния различных добавок на физическую стабильность. На основании известных факторов, влияющих на агрегацию белков, и требований таких применений, физическая стабильность может оцениваться с применением механических процедур, включая перемешивание или вращение растворов белков. Методология тестирования механической нагрузки с целью идентификации способности различных добавок предотвращать агрегацию может включать проведение встряхивания или взбалтывания в горизонтальной плоскости или вращение в x см от оси колеса, вращающегося на n об/мин в вертикальной плоскости. Мутность, возникающая вследствие агрегации, обычно определяется как функция от времени посредством визуального наблюдения или анализа рассеивания света. Альтернативно снижение содержания растворимого белка вследствие осаждения может быть количественно измерено с помощью анализа ВЭЖХ как функция от времени.The desire to identify stable formulations of antibody or other protein solutions for parenteral or other administration may lead to the development of a testing methodology to assess the effect of various additives on physical stability. Based on known factors affecting protein aggregation and the requirements of such applications, physical stability can be evaluated using mechanical procedures, including stirring or rotation of protein solutions. A methodology for testing mechanical stress to identify the ability of various additives to prevent aggregation may include shaking or shaking in the horizontal plane or rotating x cm from the axis of the wheel rotating n rpm in the vertical plane. Turbidity resulting from aggregation is usually defined as a function of time through visual observation or analysis of light scattering. Alternatively, the decrease in soluble protein content due to precipitation can be quantified by HPLC analysis as a function of time.

Изобретение основано на обнаружении того, что определенные композиции алкилгликозидов эффективны для стабилизации или снижения агрегации и иммуногенности антител или других белков в терапевтически эффективных составах. Кроме того, изобретение также основано на обнаружении того, что определенные композиции алкилгликозидов эффективны для предотвращения или снижения окисления антител или других белков в терапевтически эффективных составах.The invention is based on the discovery that certain alkyl glycoside compositions are effective in stabilizing or reducing the aggregation and immunogenicity of antibodies or other proteins in therapeutically effective compositions. In addition, the invention is also based on the discovery that certain alkyl glycoside compositions are effective in preventing or reducing the oxidation of antibodies or other proteins in therapeutically effective formulations.

"Поверхностно-активные вещества" представляют собой поверхностно-активные агенты, которые могут проявлять свое действие на поверхностях типа твердое-твердое, твердое-жидкое, жидкое-жидкое и жидкое-воздух вследствие своего химического состава, имеющего как гидрофильные, так и гидрофобные группы. Данные вещества снижают концентрацию белков в разбавленных растворах на поверхностях раздела воздух-вода и/или вода-твердое, где белки могут адсорбироваться и потенциально агрегироваться. Поверхностно-активные вещества могут связываться с гидрофобными поверхностями раздела в белковых композициях. Белки на поверхности воды будут агрегироваться, особенно при перемешивании, вследствие развертывания и последующей агрегации белкового монослоя."Surfactants" are surface active agents that can exert their effects on surfaces of the solid-solid, solid-liquid, liquid-liquid and liquid-air type due to their chemical composition having both hydrophilic and hydrophobic groups. These substances reduce the concentration of proteins in dilute solutions on the air-water and / or water-solid interfaces, where proteins can be adsorbed and potentially aggregated. Surfactants can bind to hydrophobic interfaces in protein compositions. Proteins on the surface of the water will aggregate, especially when mixed, due to the unfolding and subsequent aggregation of the protein monolayer.

"Поверхностно-активные вещества" могут денатурировать белки, но также могут стабилизировать их против поверхностной денатурации. Как правило, ионные поверхностно-активные вещества могут денатурировать белки. Однако неионные поверхностно-активные вещества обычно не денатурируют белки даже при относительно высоких концентрациях (1% масса/объем). Большинство парентерально приемлемых поверхностно-активных веществ происходят из групп полисорбатов или полиэфиров. Полисорбаты 20 и 80 представляют собой современные поверхностно-активные стабилизаторы в имеющихся на рынке белковых составах. Однако другие поверхностно-активные вещества, используемые в белковых составах, включают Pluronic F-68 и членов класса "Brij". Ни одно из этих веществ не является алкилгликозидом по изобретению."Surfactants" can denature proteins, but can also stabilize them against surface denaturation. As a rule, ionic surfactants can denature proteins. However, nonionic surfactants usually do not denature proteins even at relatively high concentrations (1% w / v). Most parenterally acceptable surfactants come from groups of polysorbates or polyesters. Polysorbates 20 and 80 are state-of-the-art surface-active stabilizers in commercially available protein formulations. However, other surfactants used in protein formulations include Pluronic F-68 and members of the class "Brij". None of these substances is the alkyl glycoside of the invention.

Физические события могут проявляться в подверженности химическим событиям. Химическая нестабильность белков может включать расщепление или образование ковалентных связей с первичной структурой белка. Было описано несколько реакций окисления в белках. В щелочной или нейтральной среде остатки аминокислот цистеина, гистидина, метионина, триптофана и тирозина особенно подвержены окислению. Однако в кислотных условиях чувствительным является метионин. Часто реакции окисления вызывают большую потерю биологической активности и даже иммуногенности. В данной области хорошо известно, что окисление аминокислотных остатков в белках, особенно остатков триптофана, может быть вызвано воздействием света.Physical events may manifest in exposure to chemical events. Chemical instability of proteins may include the cleavage or formation of covalent bonds with the primary structure of the protein. Several oxidation reactions in proteins have been described. In an alkaline or neutral environment, amino acid residues of cysteine, histidine, methionine, tryptophan and tyrosine are particularly susceptible to oxidation. However, in acidic conditions, methionine is sensitive. Often, oxidation reactions cause a large loss of biological activity and even immunogenicity. It is well known in the art that the oxidation of amino acid residues in proteins, especially tryptophan residues, can be caused by exposure to light.

Пероксиды представляют собой известные загрязняющие вещества для неионных поверхностно-активных веществ. Пероксиды в полисорбатах могут приводить к окислительному разложению белков. Составители композиций обычно изучают источники полисорбатов и других полимерных добавок в белковых составах на предмет загрязнения пероксидами и создают спецификации для использования пероксидов в качестве добавки. Альтернативно внесение антиоксиданта используют для того, чтобы способствовать снижению потенциальной опасности от неионных поверхностно-активных веществ, которые служат в качестве катализаторов окисления для чувствительных к окислению белков.Peroxides are known contaminants for nonionic surfactants. Peroxides in polysorbates can lead to oxidative degradation of proteins. Formulators typically study the sources of polysorbates and other polymer additives in protein formulations for contamination with peroxides and create specifications for the use of peroxides as an additive. Alternatively, the use of an antioxidant is used to help reduce potential hazards from non-ionic surfactants that serve as oxidation catalysts for oxidation-sensitive proteins.

"Поверхностно-активные вещества" являются молекулами с четко определенными полярными и неполярными областями, что позволяет им агрегировать в растворе с образованием мицелл. В зависимости от природы полярной области поверхностно-активные вещества могут быть неионными, анионными, катионными и цвиттер-ионными. Неионные поверхностно-активные вещества могут быть основаны на сахарах. Основанные на сахарах поверхностно-активные вещества могут представлять собой алкилгликозиды."Surfactants" are molecules with clearly defined polar and nonpolar regions, which allows them to aggregate in solution with the formation of micelles. Depending on the nature of the polar region, surfactants can be nonionic, anionic, cationic and zwitterionic. Nonionic surfactants can be sugar based. Sugar-based surfactants may be alkyl glycosides.

Как использовано в данном описании, "алкилгликозид" относится к произвольному сахару, соединенному связью с произвольным гидрофобным алкилом, как известно в данной области. Связь между гидрофобной алкильной цепью и гидрофильным сахаридом может включать, среди прочего, гликозидную, эфирную, тиогликозидную, тиоэфирную, сложноэфирную, амидную или уреидную связь или связывание, примеры которых описаны в данном описании. Термины "алкилгликозид" и "алкилсахарид" могут использоваться в данном описании взаимозаменяемо.As used herein, “alkyl glycoside” refers to an arbitrary sugar coupled to an arbitrary hydrophobic alkyl, as is known in the art. The bond between the hydrophobic alkyl chain and the hydrophilic saccharide may include, but is not limited to, glycosidic, ether, thioglycoside, thioether, ester, amide or ureide bonds or binding, examples of which are described herein. The terms “alkyl glycoside” and “alkyl saccharide” may be used interchangeably herein.

Общей структурой алкилгликозидов по изобретению является R1-O-(CH2)x-R, где R может представлять собой, например, CH3, циклогексил (C6H11) или другую алкильную цепь, включая их изомеры, и R1 представляет собой сахар, обычно глюкозу или мальтозу. Конкретные алкилгликозиды включают алкилы, в которых R1 представляет собой глюкозу, R представляет собой CH3, и x равен 5 (н-гексил-β-D-глюкопиранозид), x равен 6 (н-гептил-β-D-глюкопиранозид), x равен 7 (н-октил-β-D-глюкопиранозид), x равен 8 (н-нонил-β-D-глюкопиранозид), x равен 9 (н-децил-β-D-глюкопиранозид) и x равен 11 (н-додецил-β-D-глюкопиранозид). Иногда глюкопиранозиды называют глюкозидами.The general structure of the alkyl glycosides of the invention is R 1 -O- (CH 2 ) x -R, where R may be, for example, CH 3 , cyclohexyl (C 6 H 11 ) or other alkyl chain, including their isomers, and R 1 represents sugar, usually glucose or maltose. Particular alkyl glycosides include alkyls in which R 1 is glucose, R is CH 3 , and x is 5 (n-hexyl-β-D-glucopyranoside), x is 6 (n-heptyl-β-D-glucopyranoside) x is 7 (n-octyl-β-D-glucopyranoside), x is 8 (n-nonyl-β-D-glucopyranoside), x is 9 (n-decyl-β-D-glucopyranoside) and x is 11 (n dodecyl-β-D-glucopyranoside). Sometimes glucopyranosides are called glucosides.

Иллюстративные алкилгликозиды дополнительно включают алкилы, в которых R1 представляет собой мальтозу, R представляет собой CH3, и x равен 5 (н-гексил-β-D-мальтопиранозид), x равен 7 (н-октил-β-D-мальтопиранозид), x равен 8 (н-нонил-β-D-мальтопиранозид), x равен 9 (н-децил-β-D-мальтопиранозид), x равен 10 (н-ундецил-β-D-мальтопиранозид), x равен 11 (н-додецил-β-D-мальтопиранозид), x равен 12 (н-тридецил-β-D-мальтопиранозид), x равен 13 (н-тетрадецил-β-D-мальтопиранозид) и x равен 15 (н-гексадецил-β-D-мальтопиранозид). Иногда мальтопиранозиды называют мальтозидами.Illustrative alkyl glycosides further include alkyls in which R 1 is maltose, R is CH 3 , and x is 5 (n-hexyl-β-D-maltopyranoside), x is 7 (n-octyl-β-D-maltopyranoside) , x is 8 (n-nonyl-β-D-maltopyranoside), x is 9 (n-decyl-β-D-maltopyranoside), x is 10 (n-undecyl-β-D-maltopyranoside), x is 11 ( n-dodecyl-β-D-maltopyranoside), x is 12 (n-tridecyl-β-D-maltopyranoside), x is 13 (n-tetradecyl-β-D-maltopyranoside) and x is 15 (n-hexadecyl-β D-maltopyranoside). Maltopyranosides are sometimes called maltosides.

Иллюстративные алкилгликозиды также включают алкилы, в которых R1 представляет собой глюкозу, x равен 3, и R представляет собой циклогексил (3-циклогексил-1-пропил-β-D-глюкозид); и в которых R1 представляет собой мальтозу, x равен 4, и R представляет собой циклогексил (4-циклогексил-1-бутил-β-D-мальтозид).Illustrative alkyl glycosides also include alkyls in which R 1 is glucose, x is 3, and R is cyclohexyl (3-cyclohexyl-1-propyl-β-D-glucoside); and in which R 1 is maltose, x is 4, and R is cyclohexyl (4-cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltoside).

В одном конкретном аспекте изобретения алкилгликозиды, используемые в изобретении, представляют собой алкилы, демонстрирующие критическую концентрацию мицеллообразования (CMC), составляющую 1,0 мМ или более в воде при температуре в диапазоне 20-25°C, предпочтительно, при 25°C. Иллюстративные алкилгликозиды, имеющие такие значения CMC, показаны в табл. 1, при этом другие алкилы хорошо известны в данной области.In one specific aspect of the invention, the alkyl glycosides used in the invention are alkyls exhibiting a critical micelle concentration (CMC) of 1.0 mM or more in water at a temperature in the range of 20-25 ° C., preferably at 25 ° C. Illustrative alkyl glycosides having such CMC values are shown in table. 1, while other alkyls are well known in the art.

Таблица 1Table 1 АлкилгликозидAlkylglycoside Значение CMC (мМ)CMC value (mm) Значение CMC (масса/объем)CMC value (mass / volume) н-гексил-β-D-глюкопиранозидn-hexyl-β-D-glucopyranoside 250 мМ250 mm 6,6% масса/объем6.6% mass / volume н-гептил-β-D-глюкопиранозидn-heptyl-β-D-glucopyranoside 70 мМ70 mm 1,9% масса/объем1.9% mass / volume н-октил-β-D-глюкопиранозидn-octyl-β-D-glucopyranoside 18 мМ18 mm 0,53% масса/объем0.53% mass / volume н-нонил-β-D-глюкопиранозидn-nonyl-β-D-glucopyranoside 6,5 мМ6.5 mm 0,2% масса/объем0.2% mass / volume н-децил-β-D-глюкопиранозидn-decyl-β-D-glucopyranoside 2,2 мМ2.2 mm 0,07% масса/объем0.07% mass / volume 3-циклогексил-1-пропил-β-D-глюкозид3-cyclohexyl-1-propyl-β-D-glucoside 28 мМ28 mm 0,86% масса/объем0.86% mass / volume 3-циклогексил-1-бутил-β-D-глюкозид3-cyclohexyl-1-butyl-β-D-glucoside 1,8 мМ1.8 mm 0,058% масса/объем0.058% mass / volume н-гексил-β-D-мальтопиранозидn-hexyl-β-D-maltopyranoside 210 мМ210 mm 8,9% масса/объем8.9% mass / volume н-октил-β-D-мальтопиранозидn-octyl-β-D-maltopyranoside 19,5 мМ19.5 mm 0,89% масса/объем0.89% mass / volume н-нонил-β-D-мальтопиранозидn-nonyl-β-D-maltopyranoside 6 мМ6 mm 0,28% масса/объем0.28% mass / volume н-децил-β-D-мальтопиранозидn-decyl-β-D-maltopyranoside 1,8 мМ1.8 mm 0,087% масса/объем0.087% mass / volume циклогексилметил-β-D-мальтозидcyclohexylmethyl-β-D-maltoside 340 мМ340 mm 15% масса/объем15% mass / volume 2-циклогексилэтил-β-D-мальтозид2-cyclohexylethyl-β-D-maltoside 120 мМ120 mm 5,4% масса/объем5.4% mass / volume 3-циклогексилпропил-β-D-мальтозид3-cyclohexylpropyl-β-D-maltoside 34,5 мМ34.5 mm 1,6% масса/объем1.6% mass / volume 4-циклогексилбутил-β-D-мальтозид4-cyclohexylbutyl-β-D-maltoside 7,6 мМ7.6 mm 0,37% масса/объем0.37% mass / volume 5-циклогексилпентил-β-D-мальтозид5-cyclohexylpentyl-β-D-maltoside 2,4 мМ2.4 mm 0,12% масса/объем0.12% mass / volume

н-додецил-β-D-мальтопиранозидn-dodecyl-β-D-maltopyranoside 0,17 мМ0.17 mm 0,0087 масса/объем0.0087 mass / volume н-додецил-β-D-глюкопиранозидn-dodecyl-β-D-glucopyranoside 0,19 мМ0.19 mm 0,0066 масса/объем0.0066 mass / volume

В частности, алкилгликозид может быть использован отдельно в качестве агента, стабилизирующего антитело или другой белок (или снижающего агрегацию или окисление), или может быть использован совместно с другими алкилгликозидами. Алкилгликозиды находят применение в качестве агентов, стабилизирующих антитело или другой белок (или снижающих агрегацию или окисление) в широком диапазоне концентраций в водном растворе. В конкретных вариантах осуществления изобретения алкилгликозид (при использовании в качестве отдельного агента) или алкилгликозиды (при совместном использовании) могут присутствовать в водном содержащем антитело или белок составе в концентрации от около 0,001 мМ до около 500 мМ, предпочтительно от около 0,005 мМ до около 400 мМ, более предпочтительно от около 0,01 мМ до около 300 мМ, более предпочтительно от около 0,02 мМ до около 250 мМ, более предпочтительно от около 0,03 мМ до около 200 мМ, более предпочтительно от около 0,05 мМ до около 100 мМ, предпочтительнее от около 0,1 мМ до около 100 мМ, более предпочтительно от около 0,1 мМ до около 50 мМ.In particular, an alkyl glycoside can be used alone as an agent that stabilizes an antibody or other protein (or reduces aggregation or oxidation), or can be used in conjunction with other alkyl glycosides. Alkyl glycosides are used as agents that stabilize an antibody or other protein (or reduce aggregation or oxidation) in a wide range of concentrations in aqueous solution. In specific embodiments, an alkyl glycoside (when used as a separate agent) or alkyl glycosides (when used together) may be present in an aqueous antibody or protein composition in a concentration of from about 0.001 mm to about 500 mm, preferably from about 0.005 mm to about 400 mm more preferably from about 0.01 mm to about 300 mm, more preferably from about 0.02 mm to about 250 mm, more preferably from about 0.03 mm to about 200 mm, more preferably from about 0.05 mm to about 100 mm, preferably f from about 0.1 mM to about 100 mM, more preferably from about 0.1 mM to about 50 mM.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения конкретный алкилгликозид может быть применен в качестве агента, стабилизирующего антитело или другой белок (или снижающего агрегацию или окисление), в концентрации ниже, чем его соответствующее значение CMC.In a particularly preferred embodiment, the particular alkyl glycoside can be used as an agent that stabilizes an antibody or other protein (or reduces aggregation or oxidation) at a concentration lower than its corresponding CMC value.

В отношении описанного выше, в данной области понимается, что химический синтез соединений, таких как алкилгликозиды, описанные в данном описании, приводит к образованию некоторой гетерогенной смеси соединений, отличной от полностью гомогенного состава. Поэтому, если в данном описании указывается, что используется конкретный алкилгликозид, следует понимать, что определение относится к большей части компонентов гетерогенной смеси, которая образуется в результате их химического синтеза.In relation to the above, it is understood in the art that chemical synthesis of compounds, such as the alkyl glycosides described herein, leads to the formation of some heterogeneous mixture of compounds other than a completely homogeneous composition. Therefore, if in this description it is indicated that a specific alkyl glycoside is used, it should be understood that the definition refers to most of the components of a heterogeneous mixture, which is formed as a result of their chemical synthesis.

Под "полипептидом" или "белком" понимают последовательность аминокислот, для которой длина цепи является достаточной для получения более высоких уровней третичной и/или четвертичной структуры. Таким образом, белки отличаются от "пептидов", которые также представляют собой основанные на аминокислотах молекулы, которые не имеют подобной структуры. Обычно белок, используемый для целей изобретения, будет иметь молекулярную массу по меньшей мере около 5-20 кДа, альтернативно по меньшей мере около 15-20 кДа, предпочтительно по меньшей мере около 20 кДа. Под "пептидом" понимается последовательность аминокислот, которая обычно не демонстрирует более высокий уровень третичной и/или четвертичной структуры. Пептиды обычно имеют молекулярную массу менее чем около 5 кДа.By "polypeptide" or "protein" is meant an amino acid sequence for which the chain length is sufficient to obtain higher levels of the tertiary and / or quaternary structure. Thus, proteins differ from “peptides”, which are also amino acid-based molecules that do not have a similar structure. Typically, the protein used for the purposes of the invention will have a molecular weight of at least about 5-20 kDa, alternatively at least about 15-20 kDa, preferably at least about 20 kDa. By "peptide" is meant an amino acid sequence that usually does not exhibit a higher level of tertiary and / or quaternary structure. Peptides typically have a molecular weight of less than about 5 kDa.

Примеры полипептидов, охватываемых приведенным в настоящем описании определением, включают белки млекопитающих, такие как, например, ренин; гормон роста, включая человеческий гормон роста и гормон роста крупного рогатого скота; фактор, стимулирующий выделение гормона роста; паратиреоидный гормон; тиреостимулирующий гормон; липопротеины; альфа-1-антитрипсин; A-цепь инсулина; B-цепь инсулина; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания крови, такие как фактор VIIIC, фактор IX, тканевый фактор и фактор фон Виллебранда; факторы противосвертывания, такие как протеин С; предсердный натрийуретический фактор; сурфактант легких; активатор плазминогена, такой как урокиназа или активатор плазминогена человеческой мочи или тканевый активатор плазминогена (t-PA); бомбезин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; факторы некроза опухолей альфа и бета; энкефалиназа; RANTES (хемокин, выделяемый T-клетками при активации); человеческий макрофаговый белок воспаления (MIP-1-альфа); сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин; мюллеров ингибирующий фактор; A-цепь релаксина; B-цепь релаксина; прорелаксин; мышиный ассоциированный с гонадотропином пептид; микробный белок, такой как бета-лактамаза; ДНКаза; IgE; антиген цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA), такой как CTLA-4; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов (VEGF); рецепторы для гормонов или факторов роста; белок A или D; ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, такой как выделенный из кости нейротрофический фактор (BDNF), нейротрофин-3, -4, -5 или -6 (NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6), или фактор роста нервной ткани, такой как NGF-β; фактор роста тромбоцитов (PDGF); фактор роста фибробластов, такой как aFGF и bFGF; эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF), такой как TGF-альфа и TGF-бета, включая TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 или TGF-β5; инсулиноподобный фактор роста-I и -II (IGF-I и IGF-II); des(1-3)-IGF-I (мозговой IGF-I), белки связывания инсулиноподобных факторов роста (IGFBP); CD-белки, такие как CD3, CD4, CD8, CD19 и CD20; эритропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; костный морфогенетический белок (BMP); интерферон, такой как интерферон-альфа, -бета и -гамма; колониестимулирующие факторы (CSF), например, M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (IL), например, IL-1-IL-10; супероксид-дисмутаза; рецепторы T-клетки; поверхностные мембранные белки; фактор стимулятора гемолиза; вирусный антиген, такой как, например, часть оболочки СПИД; транспортные белки; "хоминг"-рецептор; адресины; регуляторные белки; интегрины, такие как CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 и VCAM; опухолевый специфический антиген, такой как CA125 (антиген рака яичников) или рецептор HER2, HER3 или HER4; иммуноадгезины; и фрагменты и/или варианты любых приведенных выше белков, а также антитела, включая фрагменты антител, связывающиеся с любыми приведенными выше белками.Examples of polypeptides covered by the definition herein include mammalian proteins, such as, for example, renin; growth hormone, including human growth hormone and growth hormone of cattle; growth hormone stimulating factor; parathyroid hormone; thyroid-stimulating hormone; lipoproteins; alpha-1-antitrypsin; Insulin A chain; Insulin B chain; proinsulin; follicle-stimulating hormone; calcitonin; luteinizing hormone; glucagon; coagulation factors such as factor VIIIC, factor IX, tissue factor and von Willebrand factor; anticoagulation factors such as protein C; atrial natriuretic factor; lung surfactant; plasminogen activator, such as urokinase or human urine plasminogen activator or tissue plasminogen activator (t-PA); bombesin; thrombin; hematopoietic growth factor; tumor necrosis factors alpha and beta; enkephalinase; RANTES (chemokine secreted by T cells upon activation); human macrophage inflammation protein (MIP-1 alpha); serum albumin, such as human serum albumin; Mueller inhibitory factor; Relaxin A chain; Relaxin B chain; prorelaxin; murine gonadotropin-associated peptide; microbial protein, such as beta-lactamase; DNase; IgE; cytotoxic T lymphocyte antigen (CTLA), such as CTLA-4; inhibin; activin; vascular endothelial growth factor (VEGF); receptors for hormones or growth factors; protein A or D; rheumatoid factors; a neurotrophic factor, such as bone derived neurotrophic factor (BDNF), neurotrophin-3, -4, -5 or -6 (NT-3, NT-4, NT-5 or NT-6), or nerve tissue growth factor, such as NGF-β; platelet growth factor (PDGF); fibroblast growth factor such as aFGF and bFGF; epidermal growth factor (EGF); transforming growth factor (TGF), such as TGF-alpha and TGF-beta, including TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 or TGF-β5; insulin-like growth factor-I and -II (IGF-I and IGF-II); des (1-3) -IGF-I (cerebral IGF-I), insulin-like growth factor binding proteins (IGFBP); CD proteins such as CD3, CD4, CD8, CD19 and CD20; erythropoietin; osteoinductive factors; immunotoxins; bone morphogenetic protein (BMP); interferon, such as interferon alpha, beta and gamma; colony stimulating factors (CSF), for example, M-CSF, GM-CSF and G-CSF; interleukins (IL), for example, IL-1-IL-10; superoxide dismutase; T cell receptors; surface membrane proteins; hemolysis stimulant factor; viral antigen, such as, for example, part of the envelope of AIDS; transport proteins; homing receptor; addressees; regulatory proteins; integrins such as CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 and VCAM; a tumor specific antigen such as CA125 (ovarian cancer antigen) or a HER2, HER3 or HER4 receptor; immunoadhesins; and fragments and / or variants of any of the above proteins, as well as antibodies, including antibody fragments that bind to any of the above proteins.

Белок, включаемый в композицию, предпочтительно является, по существу, чистым и желательно, по существу, гомогенным (то есть свободным от загрязняющих белков). "По существу, чистый" белок означает композицию, содержащую по меньшей мере около 90% белка по массе относительно общей массы композиции, предпочтительно по меньшей мере около 95% по массе. "По существу, гомогенный" белок означает композицию, содержащую по меньшей мере около 99% белка по массе относительно общей массы композиции.The protein to be included in the composition is preferably substantially pure and preferably substantially homogeneous (i.e., free of contaminating proteins). “Essentially pure” protein means a composition comprising at least about 90% by weight relative to the total weight of the composition, preferably at least about 95% by weight. "Essentially homogeneous" protein means a composition containing at least about 99% protein by weight relative to the total weight of the composition.

В определенных вариантах осуществления белок представляет собой антитело. В данном описании антитело направлено на представляющий интерес "антиген". Предпочтительно антиген представляет собой биологически важный белок, и введение антитела млекопитающему, страдающему заболеванием или нарушением, может иметь терапевтический эффект для этого млекопитающего. Однако также предполагаются антитела, направленные на небелковые антигены (такие как ассоциированные с опухолью гликолипидные антигены; см. патент США 5091178). Если антиген является белком, он может представлять собой трансмембранную молекулу (например, рецептор) или лиганд, такой как фактор роста. Конкретные антигены включают белки, обсуждаемые выше. Предпочтительные молекулы-мишени для антител, охватываемые изобретением, включают CD-полипептиды, такие как CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 и CD34; члены семейства рецепторов HER, такие как EGF-рецептор (HER1), рецептор HER2, HER3 или HER4; молекулы клеточной адгезии, такие как LFA-1, Mac1, pl50,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM и интегрин av/b3, включая его субъединицы a или b (например, антитела анти-CD11a, анти-CD18 или анти-CD 11b); факторы роста, такие как VEGF; IgE; антигены группы крови; рецептор flk2/flt3; рецептор ожирения (OB); рецептор mpl; CTLA-4; полипептид C и т.д. Растворимые антигены или их фрагменты необязательно сопряженные с другими молекулами, могут быть использованы в качестве иммуногенов для получения антител. В случае трансмембранных молекул, таких как рецепторы, их фрагменты (например, внеклеточный домен рецепторы) могут быть использованы в качестве иммуногена. Альтернативно, клетки, экспрессирующие трансмембранную молекулу, могут быть использованы в качестве иммуногена. Такие клетки могут быть получены из природного источника (например, раковых клеточных линий) или могут представлять собой клетки, которые были трансформированы посредством рекомбинантных технологий для экспрессии трансмембранной молекулы.In certain embodiments, the protein is an antibody. As used herein, an antibody is directed to an “antigen” of interest. Preferably, the antigen is a biologically important protein, and administration of the antibody to a mammal suffering from a disease or disorder may have a therapeutic effect for that mammal. However, antibodies directed at non-protein antigens (such as tumor-associated glycolipid antigens; see US Pat. No. 5,091,178) are also contemplated. If the antigen is a protein, it can be a transmembrane molecule (e.g., a receptor) or a ligand, such as a growth factor. Specific antigens include the proteins discussed above. Preferred antibody target molecules of the invention include CD polypeptides such as CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 and CD34; members of the HER receptor family, such as the EGF receptor (HER1), the HER2, HER3 or HER4 receptor; cell adhesion molecules such as LFA-1, Mac1, pl50.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM and av / b3 integrin, including its subunits a or b (e.g., anti-CD11a, anti-CD18 or anti -CD 11b); growth factors such as VEGF; IgE; blood type antigens; flk2 / flt3 receptor; obesity receptor (OB); mpl receptor; CTLA-4; polypeptide C, etc. Soluble antigens or fragments thereof, optionally conjugated to other molecules, can be used as immunogens to produce antibodies. In the case of transmembrane molecules, such as receptors, fragments thereof (for example, the extracellular domain of receptors) can be used as an immunogen. Alternatively, cells expressing a transmembrane molecule can be used as an immunogen. Such cells can be obtained from a natural source (for example, cancer cell lines) or can be cells that have been transformed by recombinant technology to express a transmembrane molecule.

Примеры антител, предназначенных для очистки в соответствии с изобретением, включают, но не ограничиваются ими, антитела HER2, включая трастузумаб (HERCEPTIN®) (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992), патент США 5725856) и пертузумаб (OMNITARG™) (WO01/00245); антитела CD20 (см. ниже); антитела IL-8 (St John et al., Chest, 103:932 (1993) и международная публикация No. WO 95/23865); антитела рецептора VEGF или VEGF, включая гуманизированные антитела VEGF и/или антитела VEGF с созреванием аффинности, такие как гуманизированное антитело VEGF huA4.6.1 бевацизумаб (AVASTIN®) и ранибизумаб (LUCENTIS®) (Kim et al., Growth Factors, 7:53-64 (1992), международная публикация No. WO96/30046 и WO 98/45331, опубликованная 15 октября 1998); антитела PSCA (WO01/40309); антитела CD11a, включая эфализумаб (RAPTIVA®) (патент США 6037454, патент США 5622700, WO 98/23761, Stoppa et al., Transplant Intl. 4:3-7 (1991), и Hourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994)); антитела, которые связывают IgE, включая омализумаб (XOLAIR®) (Presta et al., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993) и международная публикация No. WO 95/19181; патент США 5714338, выданный 3 февраля 1998, или патент США 5091313, выданный 25 февраля 1992, WO 93/04173, опубликованная 4 марта 1993, или международная заявка No. PCT/US98/13410, поданная 30 июня 1998, патент США 5714338); антитела CD18 (патент США 5622700, выданный 22 апреля 1997, или как в WO 97/26912, опубликованной 31 июля 1997); антитела рецепторного антитела Apo-2 (WO 98/51793, опубликованная 19 ноября 1998); антитела тканевого фактора (TF) (европейский патент 0420937 B1, выданный 9 ноября 1994); антитела интегринов α4-α7 (WO 98/06248, опубликованная 19 февраля 1998); антитела EGFR (например, химерного или гуманизированного антитела 225, цетуксимаб, ERBUTIX®, как в WO 96/40210, опубликованной 19 декабря 1996); антитела CD3, такие как OKT3 (патент США 4515893, выданный 7 мая 1985); антитела CD25 или Tac, такие как CHI-621 (SIMULECT®) и ZENAPAX® (патент США 5693762, выданный 2 декабря 1997); антитела CD4, такие как антитело cM-7412 (Choy et al., Arthritis Rheum 39(l):52-56 (1996)); антитела CD52, такие как CAMPATH-1H (ILEX/Berlex) (Riechmann et al., Nature 332:323-337 (1988)); антитела рецептора Fc, такие как антитело M22 против FcyRI, как в работе Graziano et al., J. Immunol. 155(10):4996-5002 (1995)); антитела карциноэмбрионального антигена (CEA), такие как hMN-14 (Sharkey et al., Cancer Res. 55(23Suppl): 5935s-5945s (1995)); антитела, направленные против эпителиальных клеток груди, включая huBrE-3, hu-Mc 3 и CHL6 (Ceriani et al., Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995); и Richman et al., Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s (1995)); антитела, которые связываются с клетками карциномы толстой кишки, такие как C242 (Litton et al., Eur J. Immunol. 26(1): 1-9 (1996)); антитела CD38, например, AT 13/5 (Ellis et al., J. Immunol. 155(2):925-937 (1995)); антитела CD33, такие как Hu M195 (Jurcic et al., Cancer Res 55(23 Suppl):5908s-5910s (1995)) и CMA-676 или CDP771; антитела EpCAM, такие как 17-1A (PANOREX®); антитела GpIIb/IIIa, такие как абциксимаб или c7E3 Fab (REOPRO®); антитела RSV, такие как MEDI-493 (SYNAGIS®); антитела CMV, такие как PROTOVIR®; антитела ВИЧ, такие как PR0542; антитела гепатита, такие как антитело Hep B OSTAVIR®; антитело CA125, включая анти-MUC16 (WO2007/001851; Yin, BWT и Lloyd, KO, J. Biol. Chem. 276:27371-27375 (2001)) и OvaRex; антитело идиотипического эпитопа GD3 BEC2; антитело ανβ3 {например, VITAXIN®; Medimmune); антитело почечно-клеточной карциномы, такое как ch-G250; ING-1; антитело против человеческого 17-1An (3622W94); антитело против человеческой колоректальной опухоли (A33); антитело против человеческой меланомы R24, направленное против ганглиозида GD3; против человеческой плоскоклеточной карциномы (SF-25); антитело антигена лейкоцитов человека (HLA), такое как Smart ID 10 и антитело анти-HLA DR Oncolym (Lym-1); антитело CD37, такое как TRU 016 (Trubion); антитело IL-21 (Zymogenetics/Novo Nordisk); антитело анти-B-клетки (Impheron); направленное на B-клетки MAb (Immunogen/Aventis); 1D09C3 (Morphosys/GPC); LymphoRad 131 (HGS); антитело Lym-1, такое как Lym-1Y-90 (USC) или анти-Lym-1 Oncolym (USC/Peregrine); LIF 226 (Enhanced Lifesci.); антитело BAFF (например, WO 03/33658); антитело рецептора BAFF (например, WO 02/24909); антитело BR3; антитело Blys, такое как белимумаб; LYMPHOSTAT-B™; ISF 154 (UCSD/Roche/Tragen); гомиликсима (Idee 152; Biogen Idee); антитело к рецептору IL-6, такое как атлизумаб (ACTEMRATM; Chugai/Roche); антитело к IL-15, такое как HuMax-I1-15 (Genmab/Amgen); антитело к рецептору хемокинов, такое как антитело к CCR2 (например, MLN1202; Millieneum); антитело к комплементу, такое как антитело к C5 (например, экулизумаб, 5G1.1; Alexion); пероральный препарат иммуноглобулина человека (например, IgPO; Protein Therapeutics); антитело к IL-12, такое как ABT-874 (CAT/Abbott); тенеликсимаб (BMS-224818); антитела CD40, включая S2C6 и его гуманизированные варианты (WO00/75348) и TNX 100 (Chiron/Tanox); антитела TNF-α, включая cA2 или инфликсимаб (REMICADE®), CDP571, MAK-195, адалимумаб (HUMIRA™), пегилированный фрагмент антитела к TNF-α, такой как CDP-870 (Celltech), D2E7 (Knoll), поликлональное антитело к анти-TNF-α (например, PassTNF; Verigen); антитела CD22, такие как LL2 или эпратузумаб (LYMPHOCIDE®; Immunomedics), включая эпратузумаб Y-90 и эпратузумаб I-131, антитело Abiogen CD22 (Abiogen, Italy), CMC 544 (Wyeth/Celltech), комботокс (UT Soutwestern), BL22 (NIH) и LympoScan Tc99 (Immunomedics).Examples of antibodies intended for purification in accordance with the invention include, but are not limited to, HER2 antibodies, including trastuzumab (HERCEPTIN®) (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285-4289 (1992 ), U.S. Patent 5,725,856) and Pertuzumab (OMNITARG ™) (WO01 / 00245); CD20 antibodies (see below); IL-8 antibodies (St John et al., Chest, 103: 932 (1993) and international publication No. WO 95/23865); VEGF or VEGF receptor antibodies, including humanized VEGF antibodies and / or affinity maturing VEGF antibodies, such as the humanized VEGF huA4.6.1 antibody bevacizumab (AVASTIN®) and ranibizumab (LUCENTIS®) (Kim et al., Growth Factors, 7:53 -64 (1992), international publication No. WO96 / 30046 and WO 98/45331, published October 15, 1998); PSCA antibodies (WO01 / 40309); CD11a antibodies, including efalizumab (RAPTIVA®) (US patent 6037454, US patent 5622700, WO 98/23761, Stoppa et al., Transplant Intl. 4: 3-7 (1991), and Hourmant et al., Transplantation 58: 377 -380 (1994)); antibodies that bind IgE, including omalizumab (XOLAIR®) (Presta et al., J. Immunol. 151: 2623-2632 (1993) and international publication No. WO 95/19181; US patent 5714338, issued February 3, 1998, or US patent 5091313, issued February 25, 1992, WO 93/04173, published March 4, 1993, or international application No. PCT / US98 / 13410, filed June 30, 1998, US patent 5714338); antibodies CD18 (US patent 5622700, issued April 22, 1997, or as in WO 97/26912, published July 31, 1997); Apo-2 receptor antibody antibodies (WO 98/51793 published November 19, 1998); tissue factor (TF) antibodies (European Patent 0420937 B1, issued November 9, 1994); α4-α7 integrin antibodies (WO 98/06248, published February 19, 1998); EGFR antibodies (e.g., chimeric or humanized antibodies 225, cetuximab, ERBUTIX®, as in WO 96/40210, published December 19, 1996); CD3 antibodies such as OKT3 (US Patent 4,515,893, issued May 7, 1985); CD25 or Tac antibodies such as CHI-621 (SIMULECT®) and ZENAPAX® (US Pat. No. 5,693,762, issued December 2, 1997); CD4 antibodies, such as antibody cM-7412 (Choy et al., Arthritis Rheum 39 (l): 52-56 (1996)); CD52 antibodies such as CAMPATH-1H (ILEX / Berlex) (Riechmann et al., Nature 332: 323-337 (1988)); Fc receptor antibodies, such as anti-FcyRI M22 antibody, as reported by Graziano et al., J. Immunol. 155 (10): 4996-5002 (1995)); carcinoembryonic antigen (CEA) antibodies such as hMN-14 (Sharkey et al., Cancer Res. 55 (23Suppl): 5935s-5945s (1995)); antibodies directed against breast epithelial cells, including huBrE-3, hu-Mc 3 and CHL6 (Ceriani et al., Cancer Res. 55 (23): 5852s-5856s (1995); and Richman et al., Cancer Res. 55 (23 Supp): 5916s-5920s (1995)); antibodies that bind to colon carcinoma cells, such as C242 (Litton et al., Eur J. Immunol. 26 (1): 1-9 (1996)); CD38 antibodies, for example, AT 13/5 (Ellis et al., J. Immunol. 155 (2): 925-937 (1995)); CD33 antibodies such as Hu M195 (Jurcic et al., Cancer Res 55 (23 Suppl): 5908s-5910s (1995)) and CMA-676 or CDP771; EpCAM antibodies such as 17-1A (PANOREX®); GpIIb / IIIa antibodies such as abciximab or c7E3 Fab (REOPRO®); RSV antibodies such as MEDI-493 (SYNAGIS®); CMV antibodies such as PROTOVIR®; HIV antibodies such as PR0542; hepatitis antibodies, such as the Hep B OSTAVIR® antibody; CA125 antibody, including anti-MUC16 (WO2007 / 001851; Yin, BWT and Lloyd, KO, J. Biol. Chem. 276: 27371-27375 (2001)) and OvaRex; antibody idiotypic epitope GD3 BEC2; ανβ3 antibody {e.g., VITAXIN®; Medimmune); renal cell carcinoma antibody such as ch-G250; ING-1; anti-human antibody 17-1An (3622W94); anti-human colorectal tumor antibody (A33); anti-human melanoma R24 antibody directed against ganglioside GD3; against human squamous cell carcinoma (SF-25); human leukocyte antigen (HLA) antibody such as Smart ID 10 and Oncolym anti-HLA DR antibody (Lym-1); CD37 antibody such as TRU 016 (Trubion); IL-21 antibody (Zymogenetics / Novo Nordisk); anti-B cell antibody (Impheron); directed to B-cells MAb (Immunogen / Aventis); 1D09C3 (Morphosys / GPC); LymphoRad 131 (HGS); Lym-1 antibody, such as Lym-1Y-90 (USC) or Oncolym anti-Lym-1 (USC / Peregrine); LIF 226 (Enhanced Lifesci.); BAFF antibody (e.g., WO 03/33658); BAFF receptor antibody (e.g., WO 02/24909); BR3 antibody; Blys antibody such as belimumab; LYMPHOSTAT-B ™; ISF 154 (UCSD / Roche / Tragen); homilixime (Idee 152; Biogen Idee); an IL-6 receptor antibody such as atlizumab (ACTEMRA ™ ; Chugai / Roche); an anti-IL-15 antibody such as HuMax-I1-15 (Genmab / Amgen); a chemokine receptor antibody, such as an anti-CCR2 antibody (e.g., MLN1202; Millieneum); complement antibody, such as an anti-C5 antibody (e.g., eculizumab, 5G1.1; Alexion); human oral immunoglobulin preparation (e.g., IgPO; Protein Therapeutics); an anti-IL-12 antibody such as ABT-874 (CAT / Abbott); teneliximab (BMS-224818); CD40 antibodies, including S2C6 and its humanized variants (WO00 / 75348) and TNX 100 (Chiron / Tanox); TNF-α antibodies, including cA2 or infliximab (REMICADE®), CDP571, MAK-195, adalimumab (HUMIRA ™), a pegylated fragment of an anti-TNF-α antibody such as CDP-870 (Celltech), D2E7 (Knoll), a polyclonal antibody anti-TNF-α (e.g. PassTNF; Verigen); CD22 antibodies such as LL2 or epratuzumab (LYMPHOCIDE®; Immunomedics), including epratuzumab Y-90 and epratuzumab I-131, Abiogen CD22 antibody (Abiogen, Italy), CMC 544 (Wyeth / Celltech), combotox (UT Soutwestern), BL22 (NIH) and LympoScan Tc99 (Immunomedics).

Примеры антител CD20 включают "C2B8", которое в настоящее время называется "ритуксимаб" ("RITUXAN®") (патент США 5736137); помеченное иттрием-[90] мышиное антитело 2B8, обозначенное как "Y2B8" или "ибритутомаб тиуксетан" (ZEVALIN®), коммерчески доступное от IDEC Pharmaceuticals, Inc. (патент США 5736137; 2B8, зарегистрированное в ATCC под кодом доступа № HB11388 22 июня 1993); мышиное IgG2a "B1", также называемое "тозитумомаб", необязательно помеченное I с целью создания антитела "131I-B1" или "йод I131 - тозитумомаб" (BEXXAR™), коммерчески доступное от Corixa (патент США 5595721); мышиное моноклональное антитело "1F5" (Press et al., Blood 69(2):584-591 (1987)) и его варианты, включая 1F5 "со склеенным остовом" или гуманизированное 1F5 (WO 2003/002607, Leung, S.; регистрация в ATCC под номером HB-96450); мышиное антитело 2H7 и химерное антитело 2H7 (патент США 5677180); гуманизированное 2H7 (WO 2004/056312, Lowman et al.,); 2F2 (HuMax-CD20), полностью человеческое высокоаффинное антитело, нацеленное на молекулу CD20 в клеточной мембране B-клеток (Genmab, Denmark; например, Glennie and van de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003) и Cragg et al., Blood 101: 1045-1052 (2003); WO 2004/035607; US2004/0167319); человеческие моноклональные антитела, описанные в WO 2004/035607 и US2004/0167319 (Teeling et al.); антитела, имеющие сложные соединенные N-гликозидом сахарные цепи, связанные с Fc-областью, описанной в US 2004/0093621 (Shitara et al.,); моноклональные антитела и связывающие антиген фрагменты, связывающиеся с CD20 (WO 2005/000901, Tedder et al.), такие как HB20-3, HB20-4, HB20-25, и MB20-11; связывающие CD20 молекулы, такие как серия антител AME, например, антитела AME 33, описанные в WO 2004/103404 и US2005/0025764 (Watkins et al., Eli Lilly/Applied Molecular Evolution, AME); связывающие CD20 молекулы, такие как описано в US 2005/0025764 (Watkins et al.); антитело A20 или его варианты, такие как химерное или гуманизированное антитело A20 (cA20, bA20, соответственно) или IMMU-106 (US 2003/0219433, Immunomedics); связывающие CD20 антитела, включая Leu-16, 1H4, или 2B8 с обедненным эпитопом, необязательно конъюгированные с IL-2, как в US 2005/0069545A1 и WO 2005/16969 (Carr et al.,); биспецифичное антитело, которое связывает CD22 и CD20, например, hLL2xhA20 (WO2005/14618, Chang et al.,); моноклональные антитела L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 или NU-B2, доступные в трудах международного семинара по типированию лейкоцитарных антигенов (Valentine et al., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987)); 1H4 (Haisma et al., Blood 92: 184 (1998)); анти-CD20 конъюгат ауристатина E (Seattle Genetics); анти-CD20-IL2 (EMD/Biovation/City of Hope); терапевтическое средство анти-CD20 MAb (EpiCyte); антитело анти-CD20 TRU 015 (Trubion).Examples of CD20 antibodies include “C2B8,” which is currently called “rituximab” (“RITUXAN®”) (US Pat. No. 5,736,137); yttrium-labeled [90] mouse antibody 2B8, designated “Y2B8” or “ibritutomab tiuksetan” (ZEVALIN®), commercially available from IDEC Pharmaceuticals, Inc. (US patent 5736137; 2B8, registered in ATCC under access code No. HB11388 June 22, 1993); murine IgG2a "B1", also called "tositumomab", optionally labeled I to create an antibody "131I-B1" or "i131 iodine-tositumomab" (BEXXAR ™), commercially available from Corixa (US Pat. No. 5,595,721); murine monoclonal antibody "1F5" (Press et al., Blood 69 (2): 584-591 (1987)) and variants thereof, including 1F5 "glued backbone" or humanized 1F5 (WO 2003/002607, Leung, S .; ATCC registration under HB-96450); murine antibody 2H7 and chimeric antibody 2H7 (US patent 5677180); humanized 2H7 (WO 2004/056312, Lowman et al.,); 2F2 (HuMax-CD20), a fully human high-affinity antibody targeting a CD20 molecule in a B cell cell membrane (Genmab, Denmark; e.g. Glennie and van de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003) and Cragg et al ., Blood 101: 1045-1052 (2003); WO 2004/035607; US2004 / 0167319); human monoclonal antibodies described in WO 2004/035607 and US2004 / 0167319 (Teeling et al.); antibodies having complex N-glycoside-linked sugar chains linked to the Fc region described in US 2004/0093621 (Shitara et al.,); monoclonal antibodies and antigen binding fragments binding to CD20 (WO 2005/000901, Tedder et al.), such as HB20-3, HB20-4, HB20-25, and MB20-11; CD20-binding molecules, such as an AME antibody series, for example, AME 33 antibodies described in WO 2004/103404 and US2005 / 0025764 (Watkins et al., Eli Lilly / Applied Molecular Evolution, AME); CD20 binding molecules, such as described in US 2005/0025764 (Watkins et al.); A20 antibody or variants thereof, such as a chimeric or humanized antibody A20 (cA20, bA20, respectively) or IMMU-106 (US 2003/0219433, Immunomedics); CD20-binding antibodies, including Leu-16, 1H4, or 2B8 with a depleted epitope, optionally conjugated to IL-2, as in US 2005/0069545A1 and WO 2005/16969 (Carr et al.,); a bispecific antibody that binds CD22 and CD20, for example, hLL2xhA20 (WO2005 / 14618, Chang et al.,); monoclonal antibodies L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 or NU-B2, available in the proceedings of the international seminar on typing leukocyte antigens (Valentine et al., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987)); 1H4 (Haisma et al., Blood 92: 184 (1998)); anti-CD20 auristatin E conjugate (Seattle Genetics); anti-CD20-IL2 (EMD / Biovation / City of Hope); anti-CD20 MAb therapeutic agent (EpiCyte); anti-CD20 antibody TRU 015 (Trubion).

Термин "антитело", как использовано в данном описании, включает моноклональные антитела (включая полноразмерные антитела, имеющие Fc-область иммуноглобулина), композиции антител со специфичностью ко многим эпитопам, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела, диатела и одноцепочечные молекулы, а также фрагменты антител (например, Fab, F(ab')2 и Fv). Термин "иммуноглобулин" (Ig) в данном описании используется взаимозаменяемо с термином "антитело".The term “antibody”, as used herein, includes monoclonal antibodies (including full-length antibodies having the immunoglobulin Fc region), multi-epitope specific antibody compositions, multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies, diabodies and single chain molecules, as well as fragments antibodies (eg, Fab, F (ab ') 2 and Fv). The term “immunoglobulin” (Ig) is used interchangeably herein with the term “antibody”.

Базовый элемент 4-цепочечного антитела представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин, состоящий из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Антитело IgM состоит из 5 базовых гетеротетрамерных единиц и дополнительного полипептида, называемого J-цепью, и содержит 10 сайтов связывания антигена, тогда как антитела IgA содержат от 2 до 5 базовых 4-цепочечных элементов, которые могут полимеризироваться с образованием поливалентных соединений в комбинации с J-цепью. В случае IgG, 4-цепочечный элемент обычно имеет массу около 150000 Да. Каждая L-цепь соединена с H-цепью одной ковалентной дисульфидной связью, тогда как две H-цепи соединены друг с другом одной или более дисульфидными связями в зависимости от изотипа H-цепи. Каждая H- и L-цепь также имеет расположенные с равными интервалами внутрицепные дисульфидные мостики. Каждая H-цепь имеет на N-конце вариабельный домен (VH), после которого следуют три константных домена (CH) для каждой из α- и γ-цепей и четыре CH-домена для изотипов µ и ε. Каждая L-цепь имеет на N-конце вариабельный домен (VL), после которого следует константный домен на другом ее конце. VL выровнен с VH, и CL выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи (CH1). Считается, что конкретные аминокислотные остатки формируют границу раздела между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи. В результате объединения VH и VL образуется один сайт связывания антигена. Структуры и свойства различных классов антител см., например, в работе Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr и Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71 and Chapter 6.The base element of a 4-chain antibody is a heterotetrameric glycoprotein consisting of two identical light (L) chains and two identical heavy (H) chains. An IgM antibody consists of 5 basic heterotetrameric units and an additional polypeptide called the J chain and contains 10 antigen binding sites, while IgA antibodies contain from 2 to 5 basic 4-chain elements that can polymerize to form polyvalent compounds in combination with J -chain. In the case of IgG, the 4-chain element usually has a mass of about 150,000 Da. Each L chain is connected to the H chain by one covalent disulfide bond, while two H chains are connected to each other by one or more disulfide bonds, depending on the isotype of the H chain. Each H and L chain also has intrachain disulfide bridges spaced at equal intervals. Each H chain has a variable domain (V H ) at the N-terminus, followed by three constant domains (C H ) for each of the α and γ chains and four C H domains for μ and ε isotypes. Each L-chain has a variable domain (V L ) at the N-terminus, followed by a constant domain at its other end. V L is aligned with V H , and C L is aligned with the first constant domain of the heavy chain (C H 1). It is believed that specific amino acid residues form the interface between the variable domains of the light chain and heavy chain. By combining V H and V L , one antigen binding site is formed. For the structures and properties of different classes of antibodies, see, for example, Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr and Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71 and Chapter 6.

L-цепь из произвольного вида позвоночных может быть отнесена к одному из двух ясно различимых типов, называемых каппа и лямбда, на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей (CH) иммуноглобулины могут быть отнесены к различным классам или изотипам. Существует пять классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, имеющих тяжелые цепи, обозначаемые α, δ, ε, γ и µ соответственно. Классы γ и α дополнительно подразделяются на подклассы на основании сравнительно небольших различий в последовательности и функции их CH, например, у человека экспрессируются следующие подклассы: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2.An L-chain from an arbitrary vertebrate species can be assigned to one of two clearly distinguishable types, called kappa and lambda, based on the amino acid sequences of their constant domains. Depending on the amino acid sequence of the constant domain of their heavy chains (C H ), immunoglobulins can be assigned to different classes or isotypes. There are five classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM having heavy chains designated α, δ, ε, γ and μ, respectively. The classes γ and α are further subdivided on the basis of relatively small differences in the sequence and function of their C H , for example, the following subclasses are expressed in humans: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2.

Термин "вариабельный" относится к тому факту, что определенные части вариабельных доменов сильно отличаются по последовательности между антителами. V-домен опосредует связывание антигена и определяет специфичность конкретного антитела для его конкретного антигена. Однако вариабельность распределена на всем протяжении вариабельных доменов антител неравномерно. Напротив, V-домен состоит из сравнительно неизменных участков, называемых каркасными областями (FR), из 15-30 аминокислотных остатков, разделенных более короткими чрезвычайно вариабельными областями, называемыми "гипервариабельными областями", или иногда "определяющими комплементарность областями" (CDR), каждая из которых имеет длину около 9-12 аминокислотных остатков. Вариабельные домены природных тяжелых и легких цепей содержат по четыре области FR, в основном принимающие конфигурацию бета-слоя, связанные тремя гипервариабельными областями, которые формируют петли, соединяющие и в некоторых случаях формирующие часть структуры бета-слоев. Гипервариабельные области в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости областями FR и вместе с гипервариабельными областями из другой цепи участвуют в формировании связывающего антиген участка антител (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Константные домены напрямую не участвуют в связывании антитела с антигеном, но обладают различными эффекторными функциями, такими как участие в антителозависимой клеточной токсичности (ADCC).The term "variable" refers to the fact that certain parts of the variable domains are very different in sequence between antibodies. The V domain mediates antigen binding and determines the specificity of a particular antibody for its specific antigen. However, variability is not uniformly distributed throughout the variable domains of antibodies. In contrast, the V domain consists of relatively constant regions called framework regions (FRs) of 15-30 amino acid residues separated by shorter extremely variable regions called “hypervariable regions” or sometimes “complementarity determining regions” (CDRs), each of which has a length of about 9-12 amino acid residues. The variable domains of natural heavy and light chains contain four FR regions, mainly taking the beta layer configuration, connected by three hypervariable regions, which form loops that connect and, in some cases, form part of the beta layer structure. The hypervariable regions in each chain are held together in close proximity to the FR regions and, together with the hypervariable regions of the other chain, are involved in the formation of an antigen-binding antibody site (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition Public Health Service, National Institute of Health Bethesda, MD (1991)). The constant domains are not directly involved in the binding of an antibody to an antigen, but they have various effector functions, such as participation in antibody-dependent cellular toxicity (ADCC).

Термин "гипервариабельная область" (также известный как "определяющие комплементарность области" или CDR), как использовано в данном описании, относится к аминокислотным остаткам антитела (обычно к трем или четырем коротким областям чрезвычайной вариабельности), которые находятся в пределах домена V-области иммуноглобулина, и которые формируют связывающую антиген область и являются основными детерминантами специфичности антигена. Существует по меньшей мере два способа идентификации CDR-остатков: (1) способ, основанный на межвидовой вариабельности последовательности (то есть, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, MS (1991)); и (2) подход, основанный на кристаллографических исследованиях комплексов антиген-антитело (Chothia, C. et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Однако в той мере, в которой две методики идентификации остатков определяют перекрывающиеся области, но не идентичные области, они могут быть объединены для определения гибридной CDR.The term “hypervariable region” (also known as “complementarity determining regions” or CDRs), as used herein, refers to the amino acid residues of an antibody (usually three or four short regions of extreme variability) that are within the domain of the immunoglobulin V region , and which form the antigen-binding region and are the main determinants of antigen specificity. There are at least two methods for identifying CDR residues: (1) a method based on interspecific sequence variability (i.e., Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, MS (1991)); and (2) an approach based on crystallographic studies of antigen-antibody complexes (Chothia, C. et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). However, to the extent that there are two methods for identifying residues overlapping regions are determined, but not identical, they can be combined to define a hybrid CDR.

Термин "моноклональное антитело", как использовано в данном описании, относится к антителу, полученному из группы, по существу, гомогенных антител, то есть отдельные антитела, составляющие группу, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций и/или пострансляционных модификаций (например, изомеризации, амидации), которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, будучи направленными на единственный антигенный участок. Кроме того, в отличие от обычных (поликлональных) препаратов антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое из моноклональных антител направлено против единственной детерминанты на антигене. Помимо их специфичности, преимущество моноклональных антител состоит в том, что они синтезируются с помощью гибридомной культуры, не загрязненной другими иммуноглобулинами. Модификатор "моноклональный" указывает на характеристику антитела как полученного, по существу, из гомогенной группы антител, и его не следует рассматривать как требующий получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, предназначенные для использования в соответствии с изобретением, могут быть получены гибридомным способом, первоначально описанным Kohler et al., в Nature, 256: 495 (1975), или могут быть получены рекомбинантными способами ДНК (патент США 4816567). "Моноклональные антитела" также могут быть выделены из фаговых библиотек антител с применением методик, описанных, например, Clackson et al., в Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991).The term "monoclonal antibody", as used herein, refers to an antibody derived from a group of substantially homogeneous antibodies, that is, the individual antibodies that make up the group are identical, except for possible naturally occurring mutations and / or post-translational modifications ( for example, isomerization, amidation), which may be present in small amounts. Monoclonal antibodies are highly specific, being directed to a single antigenic site. In addition, unlike conventional (polyclonal) antibody preparations, which usually include different antibodies directed against different determinants (epitopes), each of the monoclonal antibodies is directed against a single determinant on the antigen. In addition to their specificity, the advantage of monoclonal antibodies is that they are synthesized using a hybridoma culture that is not contaminated with other immunoglobulins. The monoclonal modifier indicates the characterization of the antibody as being obtained essentially from a homogeneous group of antibodies, and should not be construed as requiring the antibody to be obtained in any particular way. For example, monoclonal antibodies intended for use in accordance with the invention can be obtained by the hybridoma method originally described by Kohler et al., In Nature, 256: 495 (1975), or can be obtained by recombinant DNA methods (US patent 4816567). "Monoclonal antibodies" can also be isolated from phage antibody libraries using techniques described, for example, by Clackson et al., In Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991).

Моноклональные антитела в данном описании, в частности, включают "химерные" антитела (иммуноглобулины), у которых часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям антител, полученных у конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, тогда как оставшаяся часть цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, полученным у другого вида или принадлежащих другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность (патент США 4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Химерные антитела, представляющие интерес по изобретению, включают "приматированные" антитела, содержащие связывающие антиген последовательности вариабельного домена примата, не являющегося человеком (например, мартышки, гориллы и т.д.) и человеческие последовательности содержательной области.Monoclonal antibodies in this description, in particular, include "chimeric" antibodies (immunoglobulins), in which part of the heavy and / or light chain is identical or homologous to the corresponding sequences of antibodies obtained from a particular species or belonging to a particular class or subclass of antibodies, while the remaining part of the chain (s) is identical or homologous to the corresponding antibody sequences obtained from another species or belonging to another class or subclass of antibodies, as well as fragments of such antibodies L, provided that they exhibit the desired biological activity (US Patent No. 4,816,567; Morrison et al, Proc Natl Acad Sci USA, 81:..... 6851-6855 (1984)). Chimeric antibodies of interest according to the invention include “primated” antibodies containing antigen binding sequences of the non-human primate variable domain (eg, monkeys, gorillas, etc.) and human sequences of the content region.

"Интактное" антитело представляет собой антитело, которое содержит антигенсвязывающий участок, а также CL и по меньшей мере домены тяжелой цепи СН1, СН2 и СН3. Константные домены могут представлять собой константные домены с природной последовательностью (например, константные домены с человеческой природной последовательностью) или вариант их аминокислотной последовательности. Предпочтительно интактное антитело обладает одной или более эффекторными функциями.An "intact" antibody is an antibody that contains an antigen binding site, as well as C L and at least heavy chain domains C H 1, C H 2 and C H 3. Constant domains can be constant domains with a natural sequence (for example, constant domains with human natural sequence) or a variant of their amino acid sequence. Preferably, the intact antibody has one or more effector functions.

"Фрагмент антитела" содержит часть интактного антитела, предпочтительно содержащий антигенсвязывающую или вариабельную область интактного антитела. Примеры фрагментов антитела включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диатела; линейные антитела (патент США 5641870, Example 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); молекулы одноцепочечных антител и мультиспецифические антитела, полученные из фрагментов антител.An “antibody fragment” comprises a portion of an intact antibody, preferably comprising an antigen binding or variable region of an intact antibody. Examples of antibody fragments include Fab, Fab ', F (ab') 2, and Fv fragments; diabodies; linear antibodies (US Patent 5641870, Example 2; Zapata et al., Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 [1995]); single-chain antibody molecules and multispecific antibodies derived from antibody fragments.

Расщепление антител папаином приводит к образованию двух идентичных антигенсвязывающих фрагментов, называемых "Fab"-фрагменты, и остаточного "Fc"-фрагмента, название которого отражает его способность к легкой кристаллизации. Fab-фрагмент состоит из целой L-цепи и домена вариабельной области H-цепи (VH), а также первого константного домена тяжелой цепи (СН1). Каждый Fab-фрагмент является моновалентным в отношении связывания антигена, то есть он имеет единственный сайт связывания антигена. Обработка пепсином приводит к образованию фрагмента (Fab')2, который грубо соответствует двум дисульфидно соединенным Fab-фрагментам, обладающим различной антигенсвязывающей активностью и все еще способным к перекрестному связыванию антигена. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов тем, что они имеют несколько дополнительных остатков на карбоксильном конце домена СН1, включая один или более цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH в данном описании обозначает Fab', в котором остаток(ки) цистеина константных доменов несет(ут) свободную тиольную группу. F(ab')2-фрагменты антител исходно получали в виде пары фрагментов Fab', которые содержали между собой шарнирные цистеины. Также известны другие химические сочетания фрагментов антител.The cleavage of antibodies by papain leads to the formation of two identical antigen-binding fragments, called "Fab" fragments, and a residual "Fc" fragment, the name of which reflects its ability to easily crystallize. The Fab fragment consists of the whole L chain and the domain of the variable region of the H chain (V H ), as well as the first constant domain of the heavy chain (C H 1). Each Fab fragment is monovalent with respect to antigen binding, i.e., it has a single antigen binding site. Pepsin treatment leads to the formation of a (Fab ') 2 fragment, which roughly corresponds to two disulfide-linked Fab fragments with different antigen-binding activity and still capable of cross-linking the antigen. Fab'-fragments differ from Fab-fragments in that they have several additional residues at the carboxyl end of the C H 1 domain, including one or more cysteines from the hinge region of the antibody. Fab'-SH in this description means Fab ', in which the cysteine residue (s) of the constant domains carries (ut) a free thiol group. F (ab ') 2 antibody fragments were initially prepared as a pair of Fab' fragments that contained articulated cysteines. Other chemical combinations of antibody fragments are also known.

Fc-фрагмент содержит области карбоксильных концов обеих H-цепей, соединенные дисульфидами. Эффекторные функции антител определяются последовательностями в Fc-области, которая также распознается Fc-рецепторами (FcR), обнаруженными на клетках определенных типов.The Fc fragment contains regions of the carboxyl ends of both H chains connected by disulfides. The effector functions of antibodies are determined by sequences in the Fc region, which is also recognized by Fc receptors (FcRs) found on certain types of cells.

"Fv" представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный антигенраспознающий и антигенсвязывающий сайт. Данный фрагмент состоит из димера вариабельного домена одной тяжелой цепи и одной легкой цепи в жесткой нековалентной связи. В результате укладки этих двух доменов возникает шесть гипервариабельных петель (3 петли для каждой из H- и L-цепей), которые дают аминокислотные остатки для связывания антигена и придают антителу антигенсвязывающую специфичность. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичных для антигена) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя и с более низкой аффинностью по сравнению с полным сайтом связывания."Fv" is a minimal antibody fragment that contains a complete antigen-recognizing and antigen-binding site. This fragment consists of a dimer of the variable domain of one heavy chain and one light chain in a hard non-covalent bond. As a result of folding of these two domains, six hypervariable loops arise (3 loops for each of the H and L chains), which give amino acid residues for antigen binding and give the antibody antigen-binding specificity. However, even one variable domain (or half of an Fv containing only three CDRs specific for an antigen) has the ability to recognize and bind antigen, albeit with a lower affinity compared to the full binding site.

"Одноцепочечные Fv", также обозначаемые как "sFv" или "scFv", представляют собой фрагменты антител, которые содержат домены антитела VH и VL, соединенные в одну полипептидную цепь. Предпочтительно полипептид sFv между VH- и VL-доменами дополнительно содержит полипептидный линкер, который позволяет sFv формировать необходимую для связывания антигена структуру. Обзор sFv см. в Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).“Single chain Fvs”, also referred to as “sFvs” or “scFvs,” are antibody fragments that contain the VH and VL antibody domains linked into a single polypeptide chain. Preferably, the sFv polypeptide between the VH and VL domains further comprises a polypeptide linker that allows sFv to form the structure necessary for antigen binding. For an overview of sFv, see Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

Термин "диатела" относится к небольшим фрагментам антител, полученным путем конструирования sFv-фрагментов (см. предыдущий абзац) с короткими линкерами (около 5-10 остатков) между доменами VH и VL таким образом, чтобы достигалось спаривание V-доменов между цепями, но не внутри цепи, в результате чего формируется бивалентный фрагмент, то есть фрагмент, имеющий два сайта связывания антигена. Биспецифичные антитела являются гетеродимерами двух "пересекающихся" sFv-фрагментов, в которых домены VH и VL двух антител находятся на различных полипептидных цепях. Диатела более подробно описаны, например, в EP 404097; WO 93/11161; Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).The term “diabodies” refers to small antibody fragments obtained by constructing sFv fragments (see previous paragraph) with short linkers (about 5-10 residues) between the VH and VL domains so that pairing of V domains between chains is achieved, but not inside the chain, resulting in the formation of a bivalent fragment, that is, a fragment having two antigen binding sites. Bispecific antibodies are heterodimers of two “intersecting” sFv fragments in which the VH and VL domains of two antibodies are on different polypeptide chains. Diabodies are described in more detail, for example, in EP 404097; WO 93/11161; Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).

Антителом, которое "специфично связывается с" или является "специфичным для" конкретного полипептида или эпитопа на конкретном полипептиде, является антитело, которое связывается с конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде, при этом, по существу, не связываясь с любым другим полипептидом или эпитопом полипептида.An antibody that "specifically binds to" or is "specific" to a particular polypeptide or epitope on a particular polypeptide is an antibody that binds to a specific polypeptide or epitope on a particular polypeptide, without substantially binding to any other polypeptide or epitope polypeptide.

Термин "твердая фаза" описывает неводный матрикс, к которому может прикрепляться антитело по изобретению. Примеры твердых фаз, охватываемые изобретением, включают твердые фазы, сформированные частично или полностью из стекла (например, стекла с контролируемым размером пор), полисахаридов (например, агарозы), полиакриламидов, полистирола, поливинилового спирта и силиконов. В определенных вариантах осуществления, в зависимости от контекста, твердая фаза может содержать лунку аналитического планшета; в других она представляет собой колонку очистки (например, колонку для аффинной хроматографии). Данный термин также включает прерывистую твердую фазу из дискретных частиц, таких, как описано в патенте США 4275149.The term "solid phase" describes a non-aqueous matrix to which an antibody of the invention can attach. Examples of solid phases covered by the invention include solid phases formed partially or completely from glass (e.g., glass with controlled pore size), polysaccharides (e.g., agarose), polyacrylamides, polystyrene, polyvinyl alcohol and silicones. In certain embodiments, depending on context, the solid phase may comprise a well of an assay plate; in others, it is a purification column (for example, an affinity chromatography column). The term also includes discontinuous solids from discrete particles, such as those described in US Pat. No. 4,275,149.

"Гуманизированные" формы не принадлежащих человеку (например, мышиных) антител представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие связывающие антиген подпоследовательности антител), по существу, из человеческих последовательностей, которые содержат минимальную последовательность, полученную из не принадлежащего человеку иммуноглобулина. В большинстве случаев гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (реципиентное антитело), в которых остатки гипервариабельной области (также, CDR) реципиента заменены на остатки из гипервариабельной области вида, не являющегося человеком (донорское антитело), такого как мышь, крыса или кролик, обладающие желаемой специфичностью, аффинностью и активностью. В некоторых случаях остатки каркасной области Fv (FR) человеческого иммуноглобулина заменены на соответствующие не относящиеся к человеку остатки. Кроме того, гуманизированные антитела при использовании в изобретении могут содержать остатки, которые отсутствуют как в реципиентном антителе, так и в донорском антителе. Подобные модификации проводят для дополнительного повышения и оптимизации функциональной способности антитела. В оптимальном случае гуманизированное антитело также будет содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно человеческого иммуноглобулина. Более подробно см. в Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al, Nature, 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol, 2:593-596 (1992)."Humanized" forms of non-human (eg, murine) antibodies are chimeric immunoglobulins, immunoglobulin chains or fragments thereof (such as Fv, Fab, Fab ', F (ab') 2 or other antigen-binding antibody subsequences), essentially from human sequences that contain a minimal sequence derived from a non-human immunoglobulin. In most cases, humanized antibodies are human immunoglobulins (recipient antibodies) in which residues of the reciprocal region (also CDR) of the recipient are replaced by residues from the hypervariable region of a non-human species (donor antibody), such as a mouse, rat or rabbit, having desired specificity, affinity and activity. In some cases, residues of the Fv framework region (FR) of a human immunoglobulin are replaced with corresponding non-human residues. In addition, humanized antibodies when used in the invention may contain residues that are absent in both the recipient antibody and the donor antibody. Such modifications are performed to further enhance and optimize the functional ability of the antibody. Optionally, a humanized antibody will also contain at least a portion of the constant region of an immunoglobulin (Fc), typically a human immunoglobulin. For more details see Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al, Nature, 332: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol, 2: 593-596 (1992).

«Зависимое от вида антитело», например антитело млекопитающего против человеческого IgE, представляет собой антитело, которое имеет более высокую аффинность связывания в отношении антигена из млекопитающего первого вида, чем в отношении гомолога этого антигена из млекопитающего второго вида. Обычно зависимое от вида антитела "связывается специфически" с антигеном человека (т.е. имеет величину аффинности связывания (Kd) не более чем приблизительно 1·10-7М, альтернативно не более чем приблизительно 1·10-8М, альтернативно не более чем 1·10-9М), но имеет аффинность связывания в отношении гомолога этого антигена из млекопитающего второго вида, не являющегося человеком, которая по меньшей мере приблизительно в 50 раз, по меньшей мере приблизительно в 500 раз, или по меньшей мере приблизительно в 1000 раз является более слабой, чем его аффинность связывания в отношении антигена, не относящегося к человеку. Зависимое от вида антитело может быть любым относящимся к разнообразным типам антител, определенным выше, но предпочтительно оно является гуманизированным или человеческим антителом.A “species-dependent antibody”, for example, a mammalian anti-human IgE antibody, is an antibody that has a higher binding affinity for an antigen from a mammal of the first kind than for a homologue of this antigen from a mammal of the second kind. Typically, the type-specific antibody "binds specifically" to the human antigen (i.e., has a binding affinity (Kd) of not more than about 1 · 10 -7 M, alternatively not more than about 1 · 10 -8 M, alternatively not more than 1 · 10 -9 M), but has a binding affinity for the homolog of this antigen from a second non-human mammal that is at least about 50 times, at least about 500 times, or at least about 1000 times weaker than its affinity binding to a non-human antigen. The species-dependent antibody may be any of the various types of antibodies defined above, but preferably it is a humanized or human antibody.

"Эффекторные функции" антитела означают биологические функции, относимые к Fc-области (Fc-области природной последовательности или Fc-области аминокислотной последовательности варианта) антитела и варьируются в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антител включают связывание C1q и комплементзависимую цитотоксичность; связывание рецептора Fc; антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающую регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, рецепторов В-клеток) и активацию В-клеток."Effector functions" of an antibody mean biological functions attributable to the Fc region (Fc region of the natural sequence or Fc region of the amino acid sequence of the variant) of the antibody and vary depending on the isotype of the antibody. Examples of antibody effector functions include C1q binding and complement dependent cytotoxicity; Fc receptor binding; antibody dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC); phagocytosis; downregulation of cell surface receptors (e.g., B-cell receptors) and activation of B-cells.

"Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность", или ADCC, является формой цитотоксичности, в которой секретируемые Ig, связанные на рецепторах Fc (FcR), представленные на некоторых цитотоксических клетках (например, естественные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги), позволяют данным цитотоксическим клеткам связываться с несущей антиген клеткой-мишенью и затем убивать клетку-мишень цитотоксинами. Эти антитела "вооружают" цитотоксические клетки и являются необходимыми для уничтожения клетки-мишени по этому механизму. Первичные клетки для опосредования ADCC, NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, в то время как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия Fc на гемопоэтических клетках суммирована в табл. 3 на странице 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Для оценки ADCC-активности представляющей интерес молекулы может быть выполнен анализ ADCC in vitro, как описано в патентах США 5500362 или 5821337. Целесообразные эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и природные клетки-киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно активность ADCC представляющей интерес молекулы может быть оценена in vivo, например, на модели животного, как описано в Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998).“Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,” or ADCC, is a form of cytotoxicity in which secreted Igs bound to Fc receptors (FcRs) present on certain cytotoxic cells (eg, natural killer cells (NKs), neutrophils, and macrophages) allow these cytotoxic the cells bind to the antigen-carrying target cell and then kill the target cell with cytotoxins. These antibodies "arm" cytotoxic cells and are necessary for the destruction of target cells by this mechanism. Primary cells to mediate ADCC, NK cells, express FcγRIII only, while monocytes express FcγRI, FcγRII and FcγRIII. Expression of Fc on hematopoietic cells is summarized in table. 3 on page 464 of Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). In vitro ADCC analysis can be performed to evaluate the ADCC activity of the molecule of interest, as described in US Pat. Nos. 5,500,362 or 5,821,337. Suitable effector cells for such assays include peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and natural killer cells (NKs). Alternatively or additionally, the ADCC activity of the molecule of interest can be evaluated in vivo, for example, in an animal model, as described in Clynes et al., PNAS USA 95: 652-656 (1998).

"Рецептор Fc", или "FcR", обозначает рецептор, который связывается с Fc-областью антитела. Предпочтительным FcR является природная последовательность FcR человека. Кроме того, предпочтительным FcR является FcR, который связывается с IgG-антителом (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, в том числе аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы этих рецепторов. FcγRII-рецепторы включают FcγRIIA ("активирующий рецептор") и FcγRIIB ("ингибирующий рецептор"), которые имеют сходные аминокислотные последовательности, различающиеся в основном в их цитоплазматических доменах. Активирующий рецептор FcγRIIA содержит иммунорецепторный мотив активации (ITAM) на основе тирозина в своем цитоплазматическом домене. Ингибирующий рецептор FcγRIIB содержит иммунорецепторный мотив ингибирования (ITIM) на основе тирозина в своем цитоплазматическом домене (M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997). FcR рассмотрены в обзоре Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Другие FcR, в том числе FcR, которые будут идентифицированы в будущем, также включены в термин "FcR" в данном описании. Этот термин включает также неонатальный рецептор, FcRn, который является ответственным за перенос материнских IgG в плод (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994))."Fc receptor", or "FcR", means a receptor that binds to the Fc region of an antibody. A preferred FcR is the native human FcR sequence. In addition, a preferred FcR is FcR, which binds to an IgG antibody (gamma receptor) and includes receptors of the subclasses FcγRI, FcγRII and FcγRIII, including allelic variants and alternatively spliced forms of these receptors. FcγRII receptors include FcγRIIA ("activating receptor") and FcγRIIB ("inhibitory receptor"), which have similar amino acid sequences that differ mainly in their cytoplasmic domains. The activating receptor FcγRIIA contains a tyrosine-based immunoreceptor activation motif (ITAM) in its cytoplasmic domain. The inhibitory receptor FcγRIIB contains a tyrosine-based immunoreceptor inhibition motif (ITIM) in its cytoplasmic domain (M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997). FcRs are reviewed by Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). FcRs, including FcRs that will be identified in the future, are also included in the term “FcRs.” This term also includes the neonatal receptor, FcRn, which is responsible for the transfer of maternal IgG to the fetus (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24: 24 9 (1994)).

"Эффекторные клетки человека" представляют собой лейкоциты, которые экспрессируют один или несколько FcR и выполняют эффекторные функции. Предпочтительно эти клетки экспрессируют по меньшей мере FcγRIII и выполняют эффекторную функцию ADCC. Примеры лейкоцитов человека, которые опосредуют ADCC, включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), природные клетки-киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы, причем предпочтительными являются PBMC и MNK-клетки. Эти эффекторные клетки могут быть выделены из природного источника, например крови."Human effector cells" are white blood cells that express one or more FcRs and perform effector functions. Preferably, these cells express at least FcγRIII and perform the ADCC effector function. Examples of human leukocytes that mediate ADCC include peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), natural killer cells (NKs), monocytes, cytotoxic T cells, and neutrophils, with PBMC and MNK cells being preferred. These effector cells can be isolated from a natural source, such as blood.

"Комплементзависимая цитотоксичность" (CDC) означает лизис клетки-мишени в присутствии комплемента. Активация классического пути комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с антителами (подходящего подкласса), которые связываются с соответствующим им антигеном. Для оценки активации комплемента может быть выполнен CDC-анализ, например, описанный Gazzano-Santoro et al., в J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)."Complement dependent cytotoxicity" (CDC) means lysis of a target cell in the presence of complement. Activation of the classical complement pathway is initiated by binding of the first component of the complement system (C1q) to antibodies (of a suitable subclass) that bind to their corresponding antigen. To assess complement activation, a CDC assay can be performed, for example, as described by Gazzano-Santoro et al., In J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).

Термин "фармацевтический состав" относится к препарату, который находится в такой форме, чтобы биологическая активность активного ингредиента была эффективной, и который не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому состав будет вводиться.The term "pharmaceutical composition" refers to a preparation that is in such a form that the biological activity of the active ingredient is effective, and which does not contain additional components that are unacceptably toxic to the subject to whom the composition will be administered.

Антитело обладает "биологической активностью" в фармацевтической составе, если биологическая активность антитела в заданный момент времени находится в пределах около 10% (в пределах ошибок анализа) от биологической активности, демонстрируемой в момент времени, когда фармацевтический состав был приготовлен, в соответствии с определенным по способности антитела связывать антиген in vitro или in vivo, и приводит к измеряемой биологической реакции.An antibody has “biological activity” in a pharmaceutical composition if the biological activity of the antibody at a given point in time is within about 10% (within the limits of analysis errors) of the biological activity exhibited at the point in time when the pharmaceutical composition was prepared, as determined by the ability of an antibody to bind an antigen in vitro or in vivo, and results in a measurable biological response.

"Стабильный" состав представляет собой композицию, в которой белок, по существу, сохраняет свою физическую и/или химическую стабильность при хранении. Стабильность может быть измерена при выбранной температуре в течение выбранного периода времени. Предпочтительно состав стабилен при комнатной температуре (~30°C) или при 40°C в течение по меньшей мере 1 месяца и/или стабилен при 2-8°C в течение по меньшей мере 1 года и предпочтительно в течение по меньшей мере 2 лет. Например, степень агрегации во время хранения может быть использована в качестве индикатора стабильности белка. Таким образом, "стабильным составом" может быть композиция, в которой менее чем около 10% и предпочтительно менее чем около 5% белка присутствуют в виде агрегата в композиции. Различные аналитические методики для измерения стабильности белка известны в данной области и приведены, например, в обзоре Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) и Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993).A “stable” formulation is one in which the protein substantially retains its physical and / or chemical storage stability. Stability can be measured at a selected temperature for a selected period of time. Preferably, the composition is stable at room temperature (~ 30 ° C) or at 40 ° C for at least 1 month and / or stable at 2-8 ° C for at least 1 year and preferably for at least 2 years . For example, the degree of aggregation during storage can be used as an indicator of protein stability. Thus, a “stable composition” can be a composition in which less than about 10% and preferably less than about 5% of the protein is present as an aggregate in the composition. Various analytical techniques for measuring protein stability are known in the art and are provided, for example, in Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993).

Повышение "стабильности" содержащего белок состава относится к сокращению (по сравнению с необработанным содержащим белок составом) или предотвращению образования агрегатов в этом составе.Increasing the “stability” of a protein-containing composition refers to reducing (compared to the untreated protein-containing composition) or preventing the formation of aggregates in that composition.

Термин "водный раствор" относится к раствору, в котором вода является растворяющей средой или растворителем. В случае, когда вещество растворяется в жидкости, смесь называется раствором. Растворенным веществом является вещество, которое было растворено, и жидкость, в которой выполняется растворение (в данном случае, вода), представляет собой растворитель.The term "aqueous solution" refers to a solution in which water is a solvent medium or solvent. In the case when a substance dissolves in a liquid, the mixture is called a solution. A dissolved substance is a substance that has been dissolved, and the liquid in which the dissolution is performed (in this case, water) is a solvent.

Термин "стабилизирующий агент" или "стабилизатор" при использовании в данном описании означает химическое соединение или компонент, который добавляется в раствор, или смесь, или суспензию, или композицию, или терапевтическую композицию для ее поддержания в стабильном или неизменном состоянии; или который используется, поскольку он приводит к реакции, влекущей к изменениям в атомах или молекулах, приводящим к более стабильному или неизменяемому состоянию.The term “stabilizing agent” or “stabilizer” as used herein means a chemical compound or component that is added to a solution, or mixture, or suspension, or composition, or therapeutic composition to maintain it in a stable or unchanged state; or which is used because it leads to a reaction leading to changes in atoms or molecules, leading to a more stable or unchanging state.

Термин "агрегат" или "агрегация" при использовании в данном описании означает соединение или сбор в вещество или целое, например, как при агрегации пептидов, полипептидов, антител или их вариантов. Агрегаты могут быть самоагрегирующимися или могут агрегировать благодаря другим факторам, например, вызывающим агрегацию агентам, осадителям, вследствие перемешивания или посредством других средств и способов, посредством которых пептиды, полипептиды, антитела и их варианты могут быть объединены.The term "aggregate" or "aggregation" as used in this description means a compound or collection into a substance or whole, for example, as in the aggregation of peptides, polypeptides, antibodies or their variants. Aggregates may be self-aggregating or may aggregate due to other factors, for example, aggregating agents, precipitants, due to mixing, or by other means and methods by which peptides, polypeptides, antibodies and their variants can be combined.

Вызываемая перемешиванием агрегация представляет собой образование агрегатов в содержащем белок растворе, вызываемое перемешиванием, при этом перемешивание запускается посредством встряхивания или взбалтывания.Agitation-induced aggregation is the formation of aggregates in a protein-containing solution caused by agitation, wherein agitation is triggered by shaking or agitation.

Антитело, "подверженное агрегации" представляет собой антитело, для которого наблюдалась агрегация с другими молекулами антител, особенно после перемешивания.An “aggregation prone” antibody is an antibody for which aggregation with other antibody molecules has been observed, especially after mixing.

Под "ингибированием" агрегации, вызываемой перемешиванием, подразумевается предотвращение, сокращение или снижение количества агрегации, вызываемой перемешиванием, измеренного путем сравнения количества агрегата, присутствующего в содержащем белок растворе, который содержит по меньшей мере один ингибитор агрегации, вызываемой перемешиванием, с количеством агрегата, присутствующего в содержащем белок растворе, который не содержит по меньшей мере одного ингибитора агрегации, вызываемой перемешиванием.By "inhibition" of aggregation caused by stirring is meant the prevention, reduction or reduction of the amount of aggregation caused by stirring, measured by comparing the amount of aggregate present in the protein-containing solution that contains at least one inhibitor of aggregation caused by stirring with the amount of aggregate present in a protein-containing solution that does not contain at least one stirring-induced aggregation inhibitor.

"Ингибирующим агрегацию, вызываемую перемешиванием", количеством алкилгликозида является количество, которое ингибирует выявляемым образом агрегацию белка, вызываемую перемешиванием, по сравнению с идентично обработанным белком в отсутствие алкилгликозида.“Inhibitory aggregation-induced aggregation”, the amount of alkyl glycoside is an amount that inhibits the detectable aggregation of agitation-induced protein in comparison with an identically treated protein in the absence of an alkyl glycoside.

"Окисленным" белком в данном описании является белок, в котором один или более его аминокислотных остатков были окислены. В определенных вариантах осуществления окисленной аминокислотой является триптофан. Окисление аминокислот в белках может быть вызвано воздействием света и в этом случае в данном описании оно называется "вызванным светом окислением".An “oxidized” protein as used herein is a protein in which one or more of its amino acid residues has been oxidized. In certain embodiments, the oxidized amino acid is tryptophan. The oxidation of amino acids in proteins can be caused by exposure to light, and in this case it is called “light-induced oxidation” in this description.

Белок, "чувствительный окислению" представляет собой белок, содержащий один или более остатков, для которых была обнаружена склонность к окислению.An “oxidation sensitive” protein is a protein containing one or more residues for which an oxidation tendency has been detected.

Под "ингибированием" или "предотвращением" окисления предполагается сокращение или снижение количества окисления, измеренное посредством сравнения количества окисления, имеющегося в содержащем белок растворе, который содержит по меньшей мере один ингибитор окисления, с количеством окисления, имеющегося в содержащем белок растворе, который не содержит по меньшей мере одного ингибитора окисления.By "inhibiting" or "preventing" oxidation is meant a reduction or decrease in the amount of oxidation measured by comparing the amount of oxidation present in a protein-containing solution that contains at least one oxidation inhibitor with the amount of oxidation available in a protein-containing solution that does not contain at least one oxidation inhibitor.

"Предотвращающим окисление" количеством алкилгликозида является такое количество алкилгликозида, которое ингибирует или сокращает окисление выявляемым образом по сравнению с идентично обработанным белком в отсутствие алкилгликозида.An “anti-oxidation” amount of an alkyl glycoside is that amount of an alkyl glycoside that inhibits or reduces oxidation in a detectable manner compared to an identically treated protein in the absence of an alkyl glycoside.

Способы, которые могут быть применены в изобретении для измерения агрегации, вызываемой перемешиванием, и/или окисления белка включают гель-электрофорез, изоэлектрическое фокусирование, капиллярный электрофорез, хроматографию, такую как эксклюзионная хроматография размеров, ионообменная хроматография и высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенными фазами, пептидное картирование, олигосахаридное картирование, масс-спектрометрию, спектроскопию ультрафиолетового поглощения, флуоресцентную спектроскопию, спектроскопию кругового дихроизма, изотермическую титрационную калориметрию, дифференциальную сканирующую калориметрию, аналитическое ультрацентрифугирование, динамическое рассеяние света, протеолиз и перекрестное сшивание, измерение мутности, исследования задержки в фильтрах, иммунологические анализы, анализы связывания флуоресцентного красителя, анализа окрашивания белков, микроскопию и обнаружение агрегатов с помощью ELISA или других анализов связывания.Methods that can be used in the invention to measure agitation caused by stirring and / or oxidation of a protein include gel electrophoresis, isoelectric focusing, capillary electrophoresis, chromatography such as size exclusion chromatography, ion exchange chromatography, and reverse phase high performance liquid chromatography, peptide mapping, oligosaccharide mapping, mass spectrometry, ultraviolet absorption spectroscopy, fluorescence spectroscopy, spectroscopy circular dichroism, isothermal titration calorimetry, differential scanning calorimetry, analytical ultracentrifugation, dynamic light scattering, proteolysis and crosslinking, measurement of turbidity, filter delay studies, immunological analyzes, fluorescence dye binding assays, protein staining analysis, microscopy and detection of aggregates or other binding assays.

"Критическая концентрация мицеллообразования" (CMC) представляет собой пороговую концентрацию, при которой поверхностно-активное вещество агрегирует в растворе с образованием скоплений, называемых мицеллами. При использовании в данном описании значения CMC для любого конкретного поверхностно-активного вещества измеряются при 20-25°C в воде, предпочтительно при 25°C в воде, и могут быть выражены в единицах мМ или масса/объем. Поскольку образование мицелл из мономерных компонентов требует равновесия, было установлено наличие узкого диапазона концентраций для мицелл, ниже которого раствор содержит пренебрежимо малое количество мицелл и выше которого практически все дополнительное поверхностно-активное вещество обнаруживается в форме дополнительных мицелл. Набор значений CMC для сотен веществ в водном растворе был подготовлен Mukerjee, P. and Mysels, K.J. (1971) в Critical Micelle Concentrations of Aqueous Surfactant Systems, NSRDS-NBS 36. Superintendent of Documents, U.S. Government Printing Office, Washington, DC. Также см. http://www.anatrace.com/docs/detergent_data.pdf.A “critical micelle concentration” (CMC) is a threshold concentration at which a surfactant aggregates in solution to form clusters called micelles. As used herein, the CMC values for any particular surfactant are measured at 20-25 ° C in water, preferably at 25 ° C in water, and can be expressed in units of mM or mass / volume. Since the formation of micelles from monomer components requires equilibrium, it was found that a narrow range of concentrations for micelles was found, below which the solution contains a negligible amount of micelles and above which almost all additional surfactant is found in the form of additional micelles. A set of CMC values for hundreds of substances in aqueous solution was prepared by Mukerjee, P. and Mysels, K.J. (1971) in Critical Micelle Concentrations of Aqueous Surfactant Systems, NSRDS-NBS 36. Superintendent of Documents, U.S. Government Printing Office, Washington, DC. Also see http://www.anatrace.com/docs/detergent_data.pdf.

Одной из общепринятых методик, используемых для определения CMC, является непосредственное измерение равновесного поверхностного натяжения как функции концентрации поверхностно-активного вещества с использованием поверхностного тензиометра. Другие способы включают измерение интенсивности рассеянного света, растворимости флуоресцентных красителей и т.д. как функции концентрации поверхностно-активного вещества. Эти и другие подобные методики хорошо известны и регулярно применяются в данной области.One common technique used to determine CMC is to directly measure the equilibrium surface tension as a function of surfactant concentration using a surface tensiometer. Other methods include measuring the intensity of scattered light, the solubility of fluorescent dyes, etc. as a function of surfactant concentration. These and other similar techniques are well known and regularly used in the art.

"Выделенный" при использовании для описания различных полипептидов и антител, изложенных в данном описании, означает полипептид или антитело, которое было идентифицировано отделено и/или восстановлено из компонента среды его получения. Предпочтительно выделенный полипептид не имеет связей с другими компонентами из среды его получения. Загрязняющие компоненты из среды его получения, такие как возникающие из рекомбинантных трансфецированных клеток, являются компонентами, которые обычно будут создавать помехи диагностическому и терапевтическому применению полипептидов, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые и небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления полипептид будет очищен (1) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности путем использования секвенатора с вращающейся чашкой, или (2) до гомогенности по SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием красителя синего кумасси или предпочтительно содержащего серебро красителя. Однако обычно выделенный полипептид или антитело получают с использованием по меньшей мере одной стадии очистки."Isolated" when used to describe the various polypeptides and antibodies set forth herein, means a polypeptide or antibody that has been identified is separated and / or restored from a component of its production environment. Preferably, the isolated polypeptide has no bonds with other components from its production environment. Contaminants from the production environment, such as those arising from recombinant transfected cells, are components that will typically interfere with the diagnostic and therapeutic use of polypeptides, and may include enzymes, hormones, and other protein and non-protein solutes. In preferred embodiments, the polypeptide will be purified (1) to a degree sufficient to produce at least 15 residues of the N-terminal or internal amino acid sequence by using a rotary cup sequencer, or (2) until SDS-PAGE homogeneity under reducing or non-reducing conditions using Coomassie blue dye or preferably silver-containing dye. However, usually an isolated polypeptide or antibody is prepared using at least one purification step.

"Выделенной" молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды и антитела, описанные в данном описании, является молекула нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена по меньшей мере от одной загрязняющей молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно связана в среде, в которой она была получена. Предпочтительно эта выделенная нуклеиновая кислота свободна от связи со всеми компонентами, связанными со средой получения. Выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды и антитела, описанные в данном описании, находится в форме, отличной от формы или окружения, в которой они находятся в природе. Таким образом, выделенные молекулы нуклеиновых кислот отличаются от нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды и антитела, описанные в данном описании, и существующей в природных условиях в клетке.An "isolated" nucleic acid molecule encoding the polypeptides and antibodies described herein is a nucleic acid molecule that is identified and separated from at least one contaminating nucleic acid molecule with which it is usually bound in the medium in which it was obtained. Preferably, this isolated nucleic acid is free from binding to all components associated with the production environment. Isolated nucleic acid molecules encoding the polypeptides and antibodies described herein are in a form different from the form or environment in which they are found in nature. Thus, the isolated nucleic acid molecules are different from the nucleic acid encoding the polypeptides and antibodies described in this description, and existing in natural conditions in the cell.

Термин "регуляторные последовательности" относится к ДНК-последовательностям, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Регуляторные последовательности, которые пригодны, например, для прокариот, включают промотор, необязательно операторную последовательность и сайт связывания рибосом. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.The term "regulatory sequences" refers to DNA sequences necessary for the expression of a functionally linked coding sequence in a particular host organism. Regulatory sequences that are suitable, for example, for prokaryotes, include a promoter, optionally an operator sequence and a ribosome binding site. Eukaryotic cells are known to use promoters, polyadenylation signals, and enhancers.

Нуклеиновая кислота является "функционально связанной", когда она помещена в функциональную взаимосвязь с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК для препоследовательности или секреторного лидера функционально связана с ДНК для полипептида, если она экспрессируется в виде пребелка, который участвует в секреции этого полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию этой последовательности; или сайт связывания рибосом функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен таким образом, что он облегчает трансляцию. Обычно термин "функционально связанные" означает, что связываемые ДНК-последовательности являются смежными и в случае секреторного лидера смежными и находящимися в одной рамке считывания. Однако энхансеры необязательно должны быть смежными. Связывание выполняется лигированием в удобных сайтах рестрикции. Если такие сайты не существуют, используют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры в соответствии с общепринятой практикой.A nucleic acid is "functionally linked" when it is placed in a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, DNA for a presequence or secretory leader is operably linked to DNA for a polypeptide if it is expressed as a preprotein that is involved in the secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription of this sequence; or a ribosome binding site is operably linked to a coding sequence if it is positioned in such a way that it facilitates translation. Typically, the term "functionally linked" means that the DNA sequences to be linked are contiguous and, in the case of a secretory leader, contiguous and in the same reading frame. However, enhancers need not be contiguous. Binding is performed by ligation at convenient restriction sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used in accordance with generally accepted practice.

Термин "эпитоп-меченый" при использовании в данном описании относится к химерному полипептиду, содержащему описанные в данном описании полипептид или антитело, слитые с "полипептидом-меткой". Полипептид-метка имеет достаточно остатков для создания эпитопа, против которого может быть получено антитело, но все еще является достаточно коротким, чтобы не мешать активности полипептида, с которым он слит. Полипептид-метка предпочтительно является достаточно уникальным, так что антитело, по существу, не реагирует перекрестно с другими эпитопами. Подходящие полипептиды-метки обычно имеют по меньшей мере шесть аминокислотных остатков и обычно имеют приблизительно 8-50 аминокислотных остатков (предпочтительно около 10-20 аминокислотных остатков).The term “epitope-labeled” as used herein refers to a chimeric polypeptide comprising the polypeptide or antibody fused to the “label polypeptide” described herein. The tag polypeptide has enough residues to create an epitope against which the antibody can be made, but is still short enough to not interfere with the activity of the polypeptide with which it is fused. The label polypeptide is preferably quite unique so that the antibody does not substantially cross-react with other epitopes. Suitable label polypeptides typically have at least six amino acid residues and usually have about 8-50 amino acid residues (preferably about 10-20 amino acid residues).

Как использовано в данном описании, термин «иммуноадгезин» означает подобные антителу молекулы, которые объединяют в себе специфичность связывания гетерологичного белка ("адгезина") с эффекторными функциями константных доменов иммуноглобулина. Структурно иммуноадгезины представляют собой слияние аминокислотной последовательности с желаемой специфичностью связывания, отличной от участка распознавания антигена и связывания антитела (т.е. "гетерологичной"), и последовательности константного домена иммуноглобулина. Адгезиновая часть молекулы иммуноадгезина обычно представляет собой последовательность смежных аминокислот, содержащую по меньшей мере сайт связывания рецептора или лиганда. Последовательность константного домена иммуноглобулина в иммуноадгезине может быть получена из любого иммуноглобулина, такого как подтипы IgG-1, IgG2, IgG-3 или IgG-4, IgA (в том числе IgA-1 и IgA-2), IgE, IgD или IgM. Такие Ig-слияния предпочтительно включают замену по меньшей мере одного вариабельного района в молекуле Ig на домен описанного в данном описании полипептида или антитела. В особенно предпочтительном варианте осуществления слияние иммуноглобулина включает шарнирную область, области СН2 и СН3 или шарнирную область, области СН1, СН2 и СН3 молекулы IgG1. В отношении получения слияний иммуноглобулинов см. также патент США 5428130, выданный 27 июня 1995 года.As used herein, the term “immunoadhesin” means antibody-like molecules that combine the binding specificity of a heterologous protein (“adhesin”) with the effector functions of the constant domains of immunoglobulin. Structurally, immunoadhesins are a fusion of an amino acid sequence with a desired binding specificity different from the site of antigen recognition and antibody binding (ie, “heterologous”) and the sequence of the immunoglobulin constant domain. The adhesion portion of the immunoadhesin molecule is typically a sequence of adjacent amino acids containing at least a receptor or ligand binding site. The sequence of the immunoglobulin constant domain in the immunoadhesin can be obtained from any immunoglobulin, such as subtypes of IgG-1, IgG2, IgG-3 or IgG-4, IgA (including IgA-1 and IgA-2), IgE, IgD or IgM. Such Ig fusions preferably include replacing at least one variable region in the Ig molecule with a domain of a polypeptide or antibody described herein. In a particularly preferred embodiment, the fusion of the immunoglobulin comprises a hinge region, regions of CH2 and CH3 or a hinge region, regions of CH1, CH2 and CH3 of an IgG1 molecule. For immunoglobulin fusions, see also U.S. Patent 5,428,130, issued June 27, 1995.

"Изотонической" является композиция, которая имеет, по существу, такое же осмотическое давление, что и кровь человека. Изотонические композиции обычно будут иметь осмотическое давление от около 250 до 300 мОсм. Термин "гипотоническая" описывает композицию с осмотическим давлением ниже осмотического давления крови человека. Соответственно термин "гипертоническая" используется для описания композиции с осмотическим давлением выше осмотического давления крови человека. Изотоничность может быть измерена, например, с использованием парофазного осмометра или криоскопического осмометра. Композиции по изобретению являются гипертоническими в результате добавления соли и/или буфера.“Isotonic” is a composition that has substantially the same osmotic pressure as human blood. Isotonic compositions will typically have an osmotic pressure of about 250 to 300 mOsm. The term "hypotonic" describes a composition with an osmotic pressure below the osmotic pressure of human blood. Accordingly, the term "hypertonic" is used to describe a composition with an osmotic pressure higher than the osmotic pressure of human blood. Isotonicity can be measured, for example, using a vapor-phase osmometer or a cryoscopic osmometer. The compositions of the invention are hypertonic as a result of the addition of salt and / or buffer.

"Восстановленной" композицией является композиция, которая была получена растворением лиофилизированной композиции белка или антитела в разбавителе таким образом, чтобы этот белок был диспергирован в восстановленной композиции. Такая восстановленная композиция может быть использована для введения (например, парентерального введения) пациенту, для которого проводят лечение представляющим интерес белком, и в некоторых вариантах осуществления она может представлять собой композицию, подходящую для подкожного введения.A “reconstituted” composition is a composition that has been prepared by dissolving a lyophilized composition of a protein or antibody in a diluent so that the protein is dispersed in the reconstituted composition. Such a reconstituted composition may be used to administer (eg, parenteral administration) to a patient for whom the protein of interest is being treated, and in some embodiments, it may be a composition suitable for subcutaneous administration.

"Фармацевтически приемлемая кислота" включает неорганические и органические кислоты, которые не являются токсичными в концентрации и при использовании способов, с помощью которых их получают. Например, подходящие неорганические кислоты включают хлористоводородную, перхлорную, бромистоводородную, иодистоводородную, азотную, серную, сульфоновую, сульфиновую, сульфаниловую, фосфорную, угольную кислоту и т.д. Подходящие органические кислоты включают содержащие алкил с прямой или разветвленной цепью, ароматические, циклические, циклоалифатические, арилалифатические, гетероциклические, насыщенные, ненасыщенные, моно-, ди- и трикарбоновые кислоты, в том числе, например, муравьиную, уксусную, 2-гидроксиуксусную, трифторуксусную, фенилуксусную, триметилуксусную, трет-бутилуксусную, антраниловую, пропановую, 2-гидроксипропановую, 2-оксопропановую, пропандиовую, циклопентанпропионовую, циклопентанпропионовую, 3-фенилпропионовую, бутановую, бутандиовую, бензойную, 3-(4-гидроксибензоил)бензойную, 2-ацетоксибензойную, аскорбиновую, коричную, лаурилсерную, стеариновую, муконовую, миндальную, янтарную, эмбоновую, фумаровую, яблочную, малеиновую, гидроксималеиновую, малоновую, молочную, лимонную, винную, гликолевую, гликоновую, глюконовую, пировиноградную, глиоксалевую, щавелевую, метилсульфониловую, янтарную, салициловую, фталевую, пальмовую, пальмеиновую, тиоциановую, метансульфоновую, этансульфоновую, 1,2-этандисульфоновую, 2-гидроксиэтансульфоновую, бензолсульфоновую, 4-хлорбензолсульфоновую, нафталин-2-сульфоновую, п-толуолсульфоновую, камфорсульфоновую, 4-метилбицикло[2.2.2]окт-2-ен-1-карбоновую, глюкогептоновую, 4,4'-метиленбис-3-(гидрокси-2-ен-1-карбоновую кислоту), гидроксинафтойную кислоты.A "pharmaceutically acceptable acid" includes inorganic and organic acids that are not toxic in concentration and using the methods by which they are prepared. For example, suitable inorganic acids include hydrochloric, perchloric, hydrobromic, hydroiodic, nitric, sulfuric, sulfonic, sulfinic, sulfanilic, phosphoric, carbonic acids, etc. Suitable organic acids include straight or branched chain alkyl, aromatic, cyclic, cycloaliphatic, arylaliphatic, heterocyclic, saturated, unsaturated, mono-, di- and tricarboxylic acids, including, for example, formic, acetic, 2-hydroxyacetic, trifluoroacetic , phenylacetic, trimethylacetic, tert-butylacetic, anthranyl, propane, 2-hydroxypropane, 2-oxopropane, propanedioic, cyclopentanepropionic, cyclopentanepropionic, 3-phenylpropionic, butane, butanedi ovoy, benzoic, 3- (4-hydroxybenzoyl) benzoic, 2-acetoxybenzoic, ascorbic, cinnamon, laurylseric, stearic, muconic, almond, amber, embonic, fumaric, apple, maleic, hydroxymaleic, malonic, lemon, milk , glyconic, gluconic, pyruvic, glyoxalic, oxalic, methylsulfonyl, succinic, salicylic, phthalic, palm, palmeic, thiocyanic, methanesulfonic, ethanesulfonic, 1,2-ethanedisulfonic, 2-hydroxyethanesulfonesulfonic, 4-benzene background, naphthalene-2-sulfonic, p-toluenesulfonic, camphorsulfonic, 4-methylbicyclo [2.2.2] oct-2-en-1-carboxylic, glucohepton, 4,4'-methylenebis-3- (hydroxy-2-en- 1-carboxylic acid), hydroxy naphtha.

"Фармацевтически приемлемые основания" включают неорганические и органические основания, которые не являются токсичными в концентрации и при использовании способов, с помощью которых их получают. Например, подходящие основания включают основания, образованные из образующих неорганическое основание металлов, таких как литий, натрий, калий, магний, кальций, аммоний, железо, цинк, медь, марганец, алюминий, N-метилглюкамин, морфолин, пиперидин и органические нетоксичные основания, включающие первичный, вторичный и третичный амин, замещенные амины, циклические амины и основные ионообменные смолы [например, N(R')4 + (где R' означает независимо Н или С1-4алкил, например, аммоний, Трис)], например изопропиламин, триметиламин, диэтиламин, триэтиламин, трипропиламин, этаноламин, 2-диэтиламиноэтанол, триметамин, дициклогексиламин, лизин, аргинин, гистидин, кофеин, прокаин, гидрабамин, холин, бетаин, этилендиамин, глюкозамин, метилглюкамин, теобромин, пурины, пиперазин, пиперидин, N-этилпиперидин, полиаминные смолы и т.п. Особенно предпочтительными органическими нетоксичными основаниями являются изопропиламин, диэтиламин, этаноламин, триметамин, дициклогексиламин, холин и кофеин."Pharmaceutically acceptable bases" include inorganic and organic bases that are not toxic in concentration and using the methods by which they are prepared. For example, suitable bases include bases formed from inorganic base metals, such as lithium, sodium, potassium, magnesium, calcium, ammonium, iron, zinc, copper, manganese, aluminum, N-methylglucamine, morpholine, piperidine and organic non-toxic bases, including primary, secondary and tertiary amines, substituted amines, cyclic amines and basic ion-exchange resins [for example, N (R ' ) 4 + (where R' is independently H or C 1-4 alkyl, for example, ammonium, Tris)], for example isopropylamine, trimethylamine, diethylamine, triethyl min, tripropylamine, ethanolamine, 2-diethylaminoethanol, trimethamine, dicyclohexylamine, lysine, arginine, histidine, caffeine, procaine, hydrabamine, choline, betaine, ethylenediamine, glucosamine, methylglucamine, theobromine, purines, piperazine, ethylene piperidine, piperidine, piperidine etc. Particularly preferred organic non-toxic bases are isopropylamine, diethylamine, ethanolamine, trimethamine, dicyclohexylamine, choline and caffeine.

Дополнительные фармацевтически приемлемые кислоты и основания, используемые в изобретении, включают кислоты и основания, полученные из аминокислот, например гистидина, глицина, фенилаланина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, лизина и аспарагина.Additional pharmaceutically acceptable acids and bases used in the invention include acids and bases derived from amino acids, for example, histidine, glycine, phenylalanine, aspartic acid, glutamic acid, lysine and asparagine.

"Фармацевтически приемлемые" буферы и соли включают буферы и соли, полученные как из кислотно-аддитивных, так и основно-аддитивных солей вышеуказанных кислот и оснований. Конкретные буферы и/или соли включают гистидин, сукцинат и ацетат."Pharmaceutically acceptable" buffers and salts include buffers and salts derived from both the acid addition and base addition salts of the above acids and bases. Specific buffers and / or salts include histidine, succinate and acetate.

"Лиопротектор" представляет собой молекулу, которая при объединении с представляющим интерес белком значимо предотвращает или уменьшает физико-химическую нестабильность белка при лиофилизации и последующем хранении. Примеры лиопротекторов включают сахара и соответствующие им сахароспирты; аминокислоту, такую как мононатрийглутамат или гистидин; метиламин, такой как бетаин; лиотропную соль, такую как сульфат магния; полиол, такой как трехатомные или более высокомолекулярные сахароспирты, например глицерин, декстран, эритрит, глицерол, арабит, ксилит, сорбит и маннит; пропиленгликоль; полиэтиленгликоль; Pluronics®; и их комбинации. Дополнительные примеры лиопротекторов включают глицерин и желатин, и сахара меллибиозу, мелецитозу, рафинозу, маннотриозу и стахиозу. Примеры редуцирующих сахаров включают глюкозу, мальтозу, лактозу, мальтулозу, изомальтулозу и лактулозу. Примеры нередуцирующих сахаров включают нередуцирующие гликозиды полигидроксисоединений, выбранные из сахароспиртов и других полиспиртов с прямой цепью. Предпочтительными сахароспиртами являются моногликозиды, в частности соединения, полученные восстановлением дисахаридов, таких как лактоза, мальтоза, лактулоза и мальтулоза. Гликозидная боковая группа может быть либо глюкозидной, либо галактозидной. Дополнительными примерами сахароспиртов являются глюцит, мальтит, лактит и изомальтоза. Предпочтительными лиопротекторами являются нередуцирующие сахара трегалоза или сахароза.A “lyoprotector” is a molecule that, when combined with a protein of interest, significantly prevents or reduces the physicochemical instability of the protein during lyophilization and subsequent storage. Examples of lyoprotectants include sugars and their corresponding sugar alcohols; an amino acid such as monosodium glutamate or histidine; methylamine such as betaine; a lyotropic salt such as magnesium sulfate; a polyol such as triatomic or higher molecular weight sugar alcohols, for example glycerol, dextran, erythritol, glycerol, arabitol, xylitol, sorbitol and mannitol; propylene glycol; polyethylene glycol; Pluronics® and their combinations. Additional examples of lyoprotectants include glycerin and gelatin, and sugars, mellibiosis, melecitosis, raffinose, mannotriosis, and stachiosis. Examples of reducing sugars include glucose, maltose, lactose, maltulose, isomaltulose and lactulose. Examples of non-reducing sugars include non-reducing glycosides of polyhydroxy compounds selected from sugar alcohols and other straight chain polyalcohols. Preferred sugar alcohols are monoglycosides, in particular compounds obtained by the reduction of disaccharides such as lactose, maltose, lactulose and maltulose. The glycoside side group can be either glucoside or galactoside. Further examples of sugar alcohols are glucite, maltitol, lactitol and isomaltose. Preferred lyoprotectors are non-reducing sugars trehalose or sucrose.

Лиопротектор добавляют к предварительно лиофилизированной композиции в "лиопротективном количестве", что означает, что после лиофилизации белка в присутствии лиопротективного количества лиопротектора белок, по существу, сохраняет свою физико-химическую стабильность при лиофилизации и хранении.The lyoprotectant is added to the pre-lyophilized composition in a “lyoprotective amount”, which means that after lyophilization of the protein in the presence of a lyoprotective amount of the lyoprotectant, the protein essentially retains its physicochemical stability during lyophilization and storage.

"Фармацевтически приемлемым сахаром" является молекула, которая при объединении с представляющим интерес белком предотвращает или уменьшает физико-химическую нестабильность этого белка при хранении. В случае, когда композиция должна быть лиофилизирована и затем восстановлена, "фармацевтически приемлемые сахара" могут также называться "лиопротектором". Примеры сахаров и соответствующих им сахароспиртов включают аминокислоту, такую как мононатрийглутамат или гистидин; метиламин, такой как бетаин; лиотропную соль, такую как сульфат магния; полиол, такой как трехатомные или более высокомолекулярные сахароспирты, например глицерин, декстран, эритрит, глицерол, арабит, ксилит, сорбит и маннит; пропиленгликоль; полиэтиленгликоль; Pluronics®; и их комбинации. Дополнительные примеры лиопротекторов включают глицерин и желатин, и сахара меллибиозу, мелецитозу, рафинозу, маннотриозу и стахиозу. Пример редуцирующих сахаров включают глюкозу, мальтозу, лактозу, мальтулозу, изомальтулозу и лактулозу. Примеры нередуцирующих сахаров включают нередуцирующие гликозиды полигидроксисоединений, выбранных из сахароспиртов и других полиспиртов с прямой цепью. Предпочтительными сахароспиртами являются моногликозиды, в частности соединения, полученные восстановлением дисахаридов, таких как лактоза, мальтоза, лактулоза и мальтулоза. Гликозидная боковая группа может быть либо глюкозидной, либо галактозидной. Дополнительными примерами сахароспиртов являются глюцит, мальтит, лактит и изомальтоза. Предпочтительными фармацевтически приемлемыми сахарами являются нередуцирующие сахара трегалоза или сахароза."Pharmaceutically acceptable sugar" is a molecule that, when combined with a protein of interest, prevents or reduces the physicochemical instability of the protein during storage. In the case where the composition is to be lyophilized and then reconstituted, “pharmaceutically acceptable sugars” may also be referred to as “lyoprotectant”. Examples of sugars and their corresponding sugar alcohols include an amino acid such as monosodium glutamate or histidine; methylamine such as betaine; a lyotropic salt such as magnesium sulfate; a polyol such as triatomic or higher molecular weight sugar alcohols, for example glycerol, dextran, erythritol, glycerol, arabitol, xylitol, sorbitol and mannitol; propylene glycol; polyethylene glycol; Pluronics® and their combinations. Additional examples of lyoprotectants include glycerin and gelatin, and sugars, mellibiosis, melecitosis, raffinose, mannotriosis, and stachiosis. Examples of reducing sugars include glucose, maltose, lactose, maltulose, isomaltulose and lactulose. Examples of non-reducing sugars include non-reducing glycosides of polyhydroxy compounds selected from sugar alcohols and other straight chain polyalcohols. Preferred sugar alcohols are monoglycosides, in particular compounds obtained by the reduction of disaccharides such as lactose, maltose, lactulose and maltulose. The glycoside side group can be either glucoside or galactoside. Further examples of sugar alcohols are glucite, maltitol, lactitol and isomaltose. Preferred pharmaceutically acceptable sugars are non-reducing sugars trehalose or sucrose.

Фармацевтически приемлемые сахара добавляют к композиции в "защитном количестве" (например, перед лиофилизацией), что означает, что белок, по существу, сохраняет свою физико-химическую стабильность во время хранения (например, после восстановления и хранения).Pharmaceutically acceptable sugars are added to the composition in a “protective amount” (for example, before lyophilization), which means that the protein essentially retains its physicochemical stability during storage (for example, after reconstitution and storage).

Представляющим интерес "разбавителем" в данном описании является разбавитель, который является фармацевтически приемлемым (безопасным и нетоксичным при введении человеку) и который может использоваться для получения жидкой композиции, такой как композиция, восстановленная после лиофилизации. Примеры разбавителей включают стерильную воду, бактериостатическую воду для инъекции (BWFI), раствор с забуференным рН (например, забуференный фосфатом солевой раствор), стерильный физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы. В альтернативном варианте осуществления разбавители могут включать водные растворы солей и/или буферов.The “diluent” of interest in this specification is a diluent that is pharmaceutically acceptable (safe and non-toxic when administered to humans) and which can be used to prepare a liquid composition, such as a composition reconstituted after lyophilization. Examples of diluents include sterile water, bacteriostatic water for injection (BWFI), pH buffered saline (e.g., phosphate buffered saline), sterile saline, Ringer's solution, or dextrose solution. In an alternative embodiment, diluents may include aqueous solutions of salts and / or buffers.

«Консервант» представляет собой соединение, которое может быть добавлено к композициям по изобретению для снижения бактериальной активности. Например, добавление консерванта может облегчать получение композиции для многоразового применения (многодозовой композиции). Примеры возможных консервантов включают октадецилдиметилбензиламмонийхлорид, гексаметонийхлорид, бензалконийхлорид (смесь алкилбензилдиметиламмонийхлоридов, в которых алкильные группы являются длинноцепочечными), и бензетонийхлорид. Другие типы консервантов включают ароматические спирты, такие как фенол, бутиловый и бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен, катехин, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол и м-крезол. Наиболее предпочтительным консервантом в данном описании является бензиловый спирт.A “preservative” is a compound that can be added to the compositions of the invention to reduce bacterial activity. For example, the addition of a preservative may facilitate the preparation of a reusable composition (multi-dose composition). Examples of possible preservatives include octadecyldimethylbenzylammonium chloride, hexamethonium chloride, benzalkonium chloride (a mixture of alkylbenzyl dimethylammonium chlorides in which the alkyl groups are long chain), and benzethonium chloride. Other types of preservatives include aromatic alcohols such as phenol, butyl and benzyl alcohol, alkyl parabens such as methyl or propyl paraben, catechin, resorcinol, cyclohexanol, 3-pentanol and m-cresol. The most preferred preservative in this description is benzyl alcohol.

Термин "лечение" относится как к терапевтическому лечению, так и профилактическим или превентивным мерам. Индивиды, нуждающиеся в лечении, включают как индивидов, уже имеющих нарушение, так и индивидов, у которых должно быть предотвращено нарушение.The term “treatment” refers to both therapeutic treatment and prophylactic or preventative measures. Individuals in need of treatment include both individuals already having a disorder and individuals for whom the disorder should be prevented.

"Млекопитающим" для целей лечения является любое животное, классифицируемое как млекопитающее, включая людей, домашних и сельскохозяйственных животных и животных зоопарков, используемых в спорте животных или домашних животных, таких как собаки, лошади, кролики, крупный рогатый скот, свиньи, хомяки, песчанки, мыши, хорьки, крысы, кошки и т.д. Предпочтительно млекопитающим является человек.A “mammal” for treatment purposes is any animal classified as a mammal, including humans, domestic and farm animals, and zoo animals used in the sport of animals or domestic animals such as dogs, horses, rabbits, cattle, pigs, hamsters, gerbils , mice, ferrets, rats, cats, etc. Preferably, the mammal is a human.

"Нарушение" представляет собой любое состояние, лечение которого белком может быть целесообразным. Оно включает хронические и острые нарушения или заболевания, включая патологические состояния, которые предрасполагают к возникновению у млекопитающего рассматриваемого нарушения. Неограничивающие примеры нарушений, на которые может быть направлено лечение, включают карциномы и воспаления."Violation" is any condition whose treatment with protein may be appropriate. It includes chronic and acute disorders or diseases, including pathological conditions that predispose to the occurrence of the violation in a mammal. Non-limiting examples of disorders that can be targeted for treatment include carcinomas and inflammations.

"Терапевтически эффективное количество" представляет собой по меньшей мере минимальную концентрацию, требуемую для осуществления измеримого улучшения или предупреждения конкретного нарушения. Терапевтически эффективное количество известных белков хорошо известно в данной области, в то время как эффективные количества белков, которые будут обнаружены ниже, могут быть определены стандартными методиками, которые находятся в компетенции специалиста в данной области техники, например врача общей практики.A “therapeutically effective amount” is at least the minimum concentration required to achieve a measurable improvement or prevention of a particular disorder. A therapeutically effective amount of known proteins is well known in the art, while effective amounts of proteins to be found below can be determined by standard techniques that are within the competence of a person skilled in the art, for example, a general practitioner.

Способы получения антител (включая антител, конъюгированных с токсином) и других белков, которые могут быть включены в описанные в данном описании композиции, хорошо известны в данной области и подробно описаны, например, в WO2007/001851.Methods for producing antibodies (including toxin conjugated antibodies) and other proteins that may be included in the compositions described herein are well known in the art and are described in detail, for example, in WO2007 / 001851.

Антитела и другие белки могут быть включены в композиции по изобретению в водной или лиофилизированной форме, при этом в последнем случае они могут быть восстановлены до водной формы.Antibodies and other proteins can be included in the compositions of the invention in aqueous or lyophilized form, in which case, in the latter case, they can be reduced to an aqueous form.

Описанные в данном описании композиции могут быть также получены в виде восстановленных лиофилизированных композиций. Описанные в данном описании белки или антитела лиофилизируют и затем восстанавливают для получения стабильных жидких композиций по изобретению. В этом конкретном варианте осуществления после получения представляющего интерес белка, как описано выше, получают «предварительно лиофилизированную композицию». Количество белка, присутствующего в «предварительно лиофилизированной композиции», определяют с учетом желаемого количества дозы, способа(ов) введения и т.д. Например, исходная концентрация интактного антитела может составлять от около 2 мг/мл до около 50 мг/мл, предпочтительно от около 5 мг/мл до около 40 мг/мл и наиболее предпочтительно около 20-30 мг/мл.The compositions described herein can also be prepared as reconstituted lyophilized compositions. The proteins or antibodies described herein are lyophilized and then reduced to produce stable liquid compositions of the invention. In this particular embodiment, after obtaining the protein of interest as described above, a “pre-lyophilized composition” is obtained. The amount of protein present in the “pre-lyophilized composition” is determined taking into account the desired amount of dose, method (s) of administration, etc. For example, the initial concentration of the intact antibody may be from about 2 mg / ml to about 50 mg / ml, preferably from about 5 mg / ml to about 40 mg / ml, and most preferably about 20-30 mg / ml.

Белок, который может использоваться в виде композиции, обычно присутствует в растворе. Например, в композициях по изобретения белок может присутствовать в растворе с забуференным рН при рН около 4-8 и предпочтительно около 5-7. Концентрация буфера может составлять от около 1 мМ до около 20 мМ, альтернативно от около 3 мМ до около 15 мМ, в зависимости, например, от буфера и желаемой тоничности данной композиции (например, восстановленной композиции). Примерами буферов и/или солей являются буферы и соли, которые являются фармацевтически приемлемыми и могут быть образованы из подходящих кислот, оснований и их солей, таких как кислоты, основания и соли, которые определяются термином "фармацевтически приемлемые" кислоты, основания и соли.A protein that can be used as a composition is typically present in solution. For example, in the compositions of the invention, the protein may be present in a pH buffered solution at a pH of about 4-8 and preferably about 5-7. The concentration of the buffer may be from about 1 mm to about 20 mm, alternatively from about 3 mm to about 15 mm, depending, for example, on the buffer and the desired tonicity of the composition (eg, reconstituted composition). Examples of buffers and / or salts are buffers and salts that are pharmaceutically acceptable and can be formed from suitable acids, bases and their salts, such as acids, bases and salts, which are defined by the term "pharmaceutically acceptable" acids, bases and salts.

В одном из вариантов осуществления к предварительно лиофилизированной композиции добавляют лиопротектор. Количество лиопротектора в предварительно лиофилизированной композиции обычно является таким, чтобы при восстановлении полученная предварительно лиофилизированная композиция была изотонической. Однако также могут использоваться гипертонические восстановленные композиции. Кроме того, количество лиопротектора не должно быть слишком низким, таким, чтобы при лиофилизации имело место неприемлемое количество разложения/агрегации данного белка. Однако иллюстративными концентрациями лиопротектора в предварительно лиофилизированной композиции являются концентрации от около 10 мМ до около 400 мМ, альтернативно от около 30 мМ до около 300 мМ, альтернативно от около 50 мМ до около 100 мМ. Примеры лиопротекторов включают сахара и сахароспирты, такие как сахароза, манноза, трегалоза, глюкоза, сорбит, маннит. Однако при конкретных обстоятельствах некоторые лиопротекторы могут также способствовать увеличению вязкости композиции. Поэтому следует обращать внимание на то, чтобы были выбраны конкретные лиопротекторы, которые минимизируют или нейтрализуют этот эффект. Дополнительными лиопротекторами являются лиопротекторы, описанные выше под определением "лиопротекторы", также называемые в данном описании "фармацевтически приемлемыми сахарами".In one embodiment, a lyoprotector is added to the pre-lyophilized composition. The amount of lyoprotectant in the pre-lyophilized composition is usually such that upon reconstitution, the resulting pre-lyophilized composition is isotonic. However, hypertonic reconstituted compositions may also be used. In addition, the amount of lyoprotectant should not be too low, such that during lyophilization an unacceptable amount of degradation / aggregation of the protein takes place. However, exemplary lyoprotectant concentrations in the pre-lyophilized composition are from about 10 mM to about 400 mM, alternatively from about 30 mM to about 300 mM, alternatively from about 50 mM to about 100 mM. Examples of lyoprotectants include sugars and sugar alcohols, such as sucrose, mannose, trehalose, glucose, sorbitol, mannitol. However, in specific circumstances, some lyoprotectants may also increase the viscosity of the composition. Therefore, care should be taken to select specific lyoprotectants that minimize or neutralize this effect. Additional lyoprotectants are the lyoprotectants described above under the definition of “lyoprotectants”, also referred to herein as “pharmaceutically acceptable sugars”.

Отношение белка к лиопротектору может изменяться для каждого конкретного белка или антитела и комбинации лиопротекторов. В случае, когда в качестве выбранного белка выступает антитело, и в качестве лиопротектора выступает сахар (например, сахароза или трегалоза), для создания изотонической восстановленной композиции с высокой концентрацией белка молярное отношение лиопротектора к антителу может составлять от около 100 до около 1500 моль лиопротектора на 1 моль антитела и предпочтительно от около 200 до около 1000 моль лиопротектора на 1 моль антитела, например от около 200 до около 600 моль лиопротектора на 1 моль антитела.The ratio of protein to lyoprotector can vary for each specific protein or antibody and combination of lyoprotectors. In the case where the antibody acts as the selected protein and sugar acts as the lyoprotector (e.g. sucrose or trehalose), to create an isotonic reconstituted composition with a high protein concentration, the molar ratio of the lyoprotector to the antibody can be from about 100 to about 1500 mol of the lyoprotector per 1 mol of antibody and preferably from about 200 to about 1000 mol of a lyoprotectant per 1 mol of antibody, for example from about 200 to about 600 mol of a lyoprotector per 1 mol of antibody.

Смесь лиопротектора (такого как сахароза или трегалоза) и наполнителя (например, маннита или глицина) может быть использована при получении предварительно лиофилизированной композиции. Наполнитель может дать возможность получения однородного лиофилизированного остатка без избыточных полостей в нем и т.д. В предварительно лиофилизированную композицию (и/или лиофилизированную композицию, и/или восстановленную композицию) могут быть включены другие фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы, такие как описано в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980), при условии, что они не действуют неблагоприятным образом на желаемые характеристики композиции. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными в отношении реципиентов при используемых дозах и концентрациях и включают дополнительные буферные агенты; консерванты; сорастворители; антиоксиданты, в том числе аскорбиновую кислоту и метионин; хелатообразующие агенты, такие как EDTA; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); биоразлагаемые полимеры, такие как полиэфиры; и/или солеобразующие противоионы, такие как натрий.A mixture of a lyoprotectant (such as sucrose or trehalose) and an excipient (e.g. mannitol or glycine) can be used to prepare a pre-lyophilized composition. The filler can make it possible to obtain a homogeneous lyophilized residue without excess cavities in it, etc. The pre-lyophilized formulation (and / or the lyophilized formulation and / or the reconstituted formulation) may be incorporated other pharmaceutically acceptable carriers, excipients or stabilizers such as described in Remington's Pharmaceutical Sciences 16 th edition, Osol, A. Ed. (1980), provided that they do not adversely affect the desired characteristics of the composition. Acceptable carriers, excipients or stabilizers are non-toxic to recipients at the dosages and concentrations used and include additional buffering agents; preservatives; cosolvents; antioxidants, including ascorbic acid and methionine; chelating agents such as EDTA; metal complexes (e.g. Zn protein complexes); biodegradable polymers such as polyesters; and / or salt forming counterions, such as sodium.

Композиция изобретения может также содержать более чем один белок, если это необходимо для конкретного подлежащего лечению показания, предпочтительно, белки с дополняющими активностями, которые не влияют неблагоприятным образом на другой белок. Например, может быть желательным предоставление двух или более антител, которые связываются с желаемой мишенью (например, рецептором или антигеном), в единой композиции. Такие белки предпочтительно присутствуют в этой комбинации в количествах, которые являются эффективными для предполагаемой цели.The composition of the invention may also contain more than one protein, if necessary for the particular indication to be treated, preferably proteins with complementary activities that do not adversely affect another protein. For example, it may be desirable to provide two or more antibodies that bind to a desired target (eg, a receptor or antigen) in a single composition. Such proteins are preferably present in this combination in amounts that are effective for the intended purpose.

Композиции, которые предназначены для введения in vivo, должны быть стерильными. Это легко достигается фильтрованием через стерильные фильтрующие мембраны до или после лиофилизации и восстановления. Альтернативно стерильность полной смеси может достигаться автоклавированием ингредиентов, за исключением белка, при около 120°С, например, в течение около 30 мин.Compositions that are intended for in vivo administration must be sterile. This is easily achieved by filtering through sterile filter membranes before or after lyophilization and reconstitution. Alternatively, sterility of the complete mixture can be achieved by autoclaving the ingredients, with the exception of protein, at about 120 ° C, for example, for about 30 minutes.

После смешивания вместе белка, необязательного лиопротектора и других необязательных компонентов полученную композицию лиофилизируют. Для этой цели могут быть использованы многочисленные сушилки с вымораживанием, такие как сушилки с вымораживанием Hull50TM (Hull, США) или GT20TM (Leybold-Heraeus, Германия). Лиофилизацию выполняют посредством вымораживания композиции и последующей сублимации льда из замороженного содержимого при температуре, подходящей для первичной сушки. В этих условиях температура продукта находится ниже точки эвтектики или температуры разрушения этой композиции. Обычно температура выдерживания для первичной сушки будет находиться в диапазоне от около -30 до 25°С (при условии, что этот продукт остается замороженным во время первичной сушки) при подходящем давлении, обычно в диапазоне приблизительно 50-250 мТорр. Состав, размер и тип контейнера для образца (например, стеклянного флакона) и объем жидкости будут в основном определять время, необходимое для сушки, которое может находиться в диапазоне от нескольких часов до нескольких дней (например, 40-60 ч). Необязательно может также выполняться стадия вторичной сушки в зависимости от желаемого остаточного уровня влажности в данном продукте. Температура, при которой проводят вторичную сушку, находится в диапазоне около 0-40°С в зависимости прежде всего от типа и размера контейнера и типа используемого белка. Например, температура выдерживания на протяжении фазы лиофилизации полного удаления воды может составлять около 15-30°С (например, около 20°С). Время и давление, требуемые для вторичной сушки, будут такими, которые дают подходящий лиофилизированный остаток в зависимости, например, от температуры и других параметров. Время вторичной сушки определяется желаемым остаточным уровнем влажности в данном продукте и обычно составляет около 5 ч (например, 10-15 ч). Давление может быть таким же, какое использовали во время стадии первичной сушки. Условия лиофилизации могут варьироваться в зависимости от конкретной композиции и размера флакона.After mixing together the protein, optional lyoprotectant and other optional components, the resulting composition is lyophilized. Numerous freeze dryers can be used for this purpose, such as Hull50 TM freezers (Hull, USA) or GT20 TM (Leybold-Heraeus, Germany). Lyophilization is performed by freezing the composition and subsequent sublimation of ice from the frozen contents at a temperature suitable for primary drying. Under these conditions, the product temperature is below the eutectic point or the fracture temperature of this composition. Typically, the aging temperature for the primary drying will be in the range of about −30 to 25 ° C. (assuming that this product remains frozen during the primary drying) at a suitable pressure, typically in the range of about 50-250 mTorr. The composition, size and type of sample container (e.g., glass bottle) and liquid volume will mainly determine the time required for drying, which can range from a few hours to several days (e.g., 40-60 hours). Optionally, a secondary drying step may also be performed depending on the desired residual moisture level in the product. The temperature at which the secondary drying is carried out is in the range of about 0-40 ° C, depending primarily on the type and size of the container and the type of protein used. For example, the holding temperature during the lyophilization phase of the complete removal of water may be about 15-30 ° C (for example, about 20 ° C). The time and pressure required for the secondary drying will be such as to give a suitable lyophilized residue depending, for example, on temperature and other parameters. The secondary drying time is determined by the desired residual moisture level in the product and is usually about 5 hours (for example, 10-15 hours). The pressure may be the same as that used during the primary drying step. Lyophilization conditions may vary depending on the particular composition and size of the vial.

Перед введением пациенту лиофилизированную композицию восстанавливают фармацевтически приемлемым разбавителем таким образом, чтобы концентрация белка в этой восстановленной композиции составляла по меньшей мере около 50 мг/мл, например, от около 50 мг/мл до около 400 мг/мл, альтернативно от около 80 мг/мл до около 300 мг/мл, альтернативно от около 90 мг/мл до около 150 мг/мл. Такие высокие концентрации белка в восстановленной композиции считаются особенно выгодными, когда предполагается подкожная доставка восстановленной композиции. Однако для других способов введения, таких как внутривенное введение, могут быть желательными более низкие концентрации белка в восстановленной композиции (например, около 5-50 мг/мл или около 10-40 мг/мл белка в восстановленной композиции). В некоторых вариантах осуществления концентрация белка в восстановленной композиции является значительно более высокой, чем концентрация белка в предварительно лиофилизированной композиции. Например, концентрация белка в восстановленной композиции может превышать концентрацию предварительно лиофилизированной композиции приблизительно в 2-40 раз, альтернативно в 3-10 раз, альтернативно в 3-6 раз (например по меньшей мере в три раза или по меньшей мере в четыре раза).Before administration to a patient, the lyophilized composition is reconstituted with a pharmaceutically acceptable diluent so that the protein concentration in this reconstituted composition is at least about 50 mg / ml, for example, from about 50 mg / ml to about 400 mg / ml, alternatively from about 80 mg / ml to about 300 mg / ml, alternatively from about 90 mg / ml to about 150 mg / ml. Such high protein concentrations in the reconstituted composition are considered particularly advantageous when subcutaneous delivery of the reconstituted composition is contemplated. However, for other modes of administration, such as intravenous administration, lower protein concentrations in the reconstituted composition (for example, about 5-50 mg / ml or about 10-40 mg / ml protein in the reconstituted composition) may be desirable. In some embodiments, the protein concentration in the reconstituted composition is significantly higher than the protein concentration in the pre-lyophilized composition. For example, the protein concentration in the reconstituted composition may exceed the concentration of the pre-lyophilized composition by about 2-40 times, alternatively 3-10 times, alternatively 3-6 times (for example, at least three times or at least four times).

Восстановление обычно выполняют при температуре около 25°С для обеспечения полной гидратации, хотя, если это необходимо, могут быть использованы другие температуры. Время, необходимое для восстановления, будет зависеть, например, от типа разбавителя, количества вспомогательного(ых) вещества(в) и белка. Примеры разбавителей включают стерильную воду, бактериостатическую воду для инъекции (BWF), раствор с забуференным рН (например, забуференный фосфатом солевой раствор), стерильный солевой раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы. Разбавитель необязательно содержит консервант. Примеры консервантов описаны выше, причем предпочтительными консервантами являются ароматические спирты, такие как бензиловый спирт или фенолоспирт. Количество используемого консерванта определяют посредством оценочного тестирования различных концентраций консерванта на совместимость с белком и испытанием эффективности консерванта. Например, если консервант является ароматическим спиртом (таким как бензиловый спирт), он может присутствовать в количестве около 0,1-2,0% и предпочтительно около 0,5-1,5%, но наиболее предпочтительно около 1,0-1,2%.Recovery is usually carried out at a temperature of about 25 ° C. to ensure complete hydration, although other temperatures may be used if necessary. The time required for recovery will depend, for example, on the type of diluent, the amount of excipient (s) of the substance (s) and protein. Examples of diluents include sterile water, bacteriostatic water for injection (BWF), a pH buffered solution (e.g., phosphate buffered saline), sterile saline, Ringer's solution, or dextrose solution. The diluent optionally contains a preservative. Examples of preservatives are described above, with preferred preservatives being aromatic alcohols, such as benzyl alcohol or phenol alcohol. The amount of preservative used is determined by evaluating testing various concentrations of the preservative for protein compatibility and testing the effectiveness of the preservative. For example, if the preservative is an aromatic alcohol (such as benzyl alcohol), it may be present in an amount of about 0.1-2.0% and preferably about 0.5-1.5%, but most preferably about 1.0-1. 2%

Предпочтительно восстановленная композиция имеет менее 6000 частиц на флакон, которые имеют размер ≥10 мкм.Preferably, the reconstituted composition has less than 6,000 particles per vial that are ≥10 μm in size.

Терапевтические композиции подготавливают для хранения посредством смешивания активного ингредиента, имеющего желаемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042 [1990]). Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными в отношении реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают буферы, антиоксиданты, в том числе аскорбиновую кислоту, метионин, витамин Е, метабисульфит натрия, консерванты, агенты изотоничности, стабилизаторы, комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок) и/или хелатообразующие агенты, такие как EDTA.Therapeutic formulations are prepared for storage by mixing the active ingredient having the desired degree of purity with optional pharmaceutically acceptable carriers, excipients or stabilizers (Remington's Pharmaceutical Sciences 18 th edition, Mack Publishing Co., Easton , Pa. 18042 [1990]). Acceptable carriers, excipients or stabilizers are non-toxic to recipients in the dosages and concentrations used and include buffers, antioxidants, including ascorbic acid, methionine, vitamin E, sodium metabisulfite, preservatives, isotonicity agents, stabilizers, metal complexes (e.g. Zn complexes protein) and / or chelating agents such as EDTA.

В случае, когда терапевтическим агентом является фрагмент антитела, предпочтительным является наименьший фрагмент, который специфически связывается со связывающим доменом белка-мишени. Например, на основе последовательностей вариабельных областей антител могут быть сконструированы фрагменты антител или даже пептидные молекулы, которые сохраняют способность связывания с последовательностью белка-мишени. Такие пептиды могут быть синтезированы химически и/или получены технологией рекомбинантных ДНК (Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 [1993]).In the case where the antibody fragment is the therapeutic agent, the smallest fragment that specifically binds to the binding domain of the target protein is preferred. For example, antibody fragments or even peptide molecules that retain the ability to bind to the target protein sequence can be constructed based on the variable region sequences of antibodies. Such peptides can be synthesized chemically and / or obtained by recombinant DNA technology (Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 [1993]).

Для контроля рН в диапазоне, который оптимизирует терапевтическую эффективность, используют буферы, особенно в том случае, когда стабильность зависит от рН. Буферы присутствуют предпочтительно в концентрациях в диапазоне от около 50 мМ до около 250 мМ. Подходящие буферные агенты для использования в изобретении включают как органические, так и неорганические кислоты и их соли. Например, цитрат, фосфат, сукцинат, тартрат, фумарат, глюконат, оксалат, лактат, ацетат. Кроме того, буферы могут состоять из солей гистидина и триметиламина, таких как Трис.To control pH in a range that optimizes therapeutic efficacy, buffers are used, especially when stability is pH dependent. Buffers are preferably present in concentrations ranging from about 50 mM to about 250 mM. Suitable buffering agents for use in the invention include both organic and inorganic acids and their salts. For example, citrate, phosphate, succinate, tartrate, fumarate, gluconate, oxalate, lactate, acetate. In addition, buffers may consist of histidine and trimethylamine salts such as Tris.

Для замедления роста микробов добавляют консерванты, и они обычно присутствуют в диапазоне 0,2-1,0% (масса/объем). Подходящие консерванты для использования по изобретению включают октадецилдиметилбензиламмонийхлорид; гексаметонийхлорид; бензалконийгалогениды (например, хлорид, бромид, иодид), бензетонийхлорид; тимерозал, фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехин; резорцин; циклогексанол, 3-пентанол и м-крезол.Preservatives are added to slow the growth of microbes, and they are usually present in the range of 0.2-1.0% (mass / volume). Suitable preservatives for use in the invention include octadecyldimethylbenzylammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium halides (e.g. chloride, bromide, iodide), benzethonium chloride; thimerosal, phenol, butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propyl paraben; catechin; resorcinol; cyclohexanol, 3-pentanol and m-cresol.

Агенты тоничности, иногда называемые "стабилизаторами", присутствуют для коррекции или поддержания тоничности жидкой композиции. При применении с большими заряженными биомолекулами, такими как белки и антитела, их часто называют "стабилизаторами", так как они могут взаимодействовать с заряженными группами боковых цепей аминокислот, ослабляя, тем самым, потенциал в отношении меж- и внутриклеточных взаимодействий. Агенты тоничности могут присутствовать в произвольном количестве от 0,1 до 25% по массе, предпочтительно 1-5% по массе с учетом относительных количеств других ингредиентов. Агенты тоничности включают многоатомные сахароспирты, предпочтительно трехатомные или более высокоатомные сахароспирты, такие как глицерин, эритрит, арабит, ксилит, сорбит и маннит.Tonicity agents, sometimes called "stabilizers," are present to correct or maintain the tonicity of a liquid composition. When used with large charged biomolecules, such as proteins and antibodies, they are often called “stabilizers,” since they can interact with charged groups of amino acid side chains, thereby weakening the potential for inter- and intracellular interactions. Tonicity agents may be present in an arbitrary amount from 0.1 to 25% by weight, preferably 1-5% by weight, taking into account the relative amounts of other ingredients. Tonicity agents include polyhydric sugar alcohols, preferably triatomic or higher atomic sugar alcohols, such as glycerol, erythritol, arabitol, xylitol, sorbitol and mannitol.

Дополнительные эксципиенты включают агенты, которые могут служить в качестве одного или нескольких из следующих компонентов: (1) наполнителей, (2) усилителей растворимости, (3) стабилизаторов и (4) агентов, предотвращающих денатурацию или прикрепление к стенке контейнера. Такие эксципиенты включают многоатомные сахароспирты (перечисленные выше); аминокислоты, такие как аланин, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин, лизин, орнитин, лейцин, 2-фенилаланин, глутаминовая кислота, треонин и т.д.; органические сахара или сахароспирты, такие как сахароза, лактоза, лактит, трегалоза, стахиоза, манноза, сорбоза, ксилоза, рибоза, рибит, миоинозитоза, миоинозит, галактоза, галактит, глицерин, циклит (например, инозит), полиэтиленгликоль; содержащие серу восстанавливающие агенты, такие как мочевина, глутатион, тиоктовая кислота, тиогликолат натрия, тиоглицерин, α-монотиоглицерин и тиосульфат натрия; низкомолекулярные белки, такие как сывороточный альбумин человека, бычий сывороточный альбумин, желатин или другие иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; моносахариды (например, ксилозу, маннозу, фруктозу, глюкозу); дисахариды (например, лактозу, мальтозу, сахарозу); трисахариды, такие как рафиноза; и полисахариды, такие как декстрин или декстран.Additional excipients include agents that can serve as one or more of the following components: (1) fillers, (2) solubility enhancers, (3) stabilizers, and (4) agents that prevent denaturation or attachment to the container wall. Such excipients include polyhydric sugar alcohols (listed above); amino acids such as alanine, glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine, lysine, ornithine, leucine, 2-phenylalanine, glutamic acid, threonine, etc .; organic sugars or sugar alcohols, such as sucrose, lactose, lactitol, trehalose, stachyose, mannose, sorbose, xylose, ribose, ribite, myoinositol, myoinositol, galactose, galactite, glycerin, cyclite (for example, inositol), polyethylene glycol; sulfur-containing reducing agents such as urea, glutathione, thioctic acid, sodium thioglycolate, thioglycerol, α-monothioglycerin and sodium thiosulfate; low molecular weight proteins such as human serum albumin, bovine serum albumin, gelatin or other immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; monosaccharides (e.g. xylose, mannose, fructose, glucose); disaccharides (e.g. lactose, maltose, sucrose); trisaccharides such as raffinose; and polysaccharides such as dextrin or dextran.

Для того чтобы композиции могли быть использованы для введения in vivo, они должны быть стерильными. Композиция может быть стерилизована посредством фильтрования через стерильные фильтрующие мембраны. Терапевтические композиции, описанные в данном описании, обычно помещают в контейнер, имеющий стерильный входной канал, например мешочек для внутривенного раствора, или сосуд, имеющий пробку, протыкаемую иглой для гиподермальной инъекции.In order for the compositions to be used for in vivo administration, they must be sterile. The composition can be sterilized by filtration through sterile filter membranes. The therapeutic compositions described herein are usually placed in a container having a sterile inlet channel, for example, an intravenous solution bag, or a vessel having a plug pierced by a hypodermal injection needle.

Путь введения соответствует известным и общепризнанным способам, таким как единственное или множественное болюсное введение или инфузия в течение продолжительного периода времени подходящим способом, например инъекция или инфузия подкожным, внутривенным, внутрибрюшинным, внутримышечным, внутриартериальным путем, введение в повреждение или внутрь сустава, местное введение, ингаляция или способ поддерживаемого или пролонгированного высвобождения.The route of administration corresponds to known and generally recognized methods, such as single or multiple bolus administration or infusion over an extended period of time with a suitable method, for example, injection or infusion by subcutaneous, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intra-arterial route, introduction to damage or inside the joint, local administration, inhalation or sustained or sustained release method.

Описанная в данном описании композиция может также содержать более одного активного соединения, если это необходимо для конкретного подлежащего лечению показания, предпочтительно она может содержать соединения с дополняющими активностями, которые не действуют неблагоприятным образом друг на друга. Альтернативно или дополнительно композиция может содержать цитотоксический агент, цитокин или ингибирующий рост агент. Такие молекулы предпочтительно присутствуют в комбинации в количествах, которые являются эффективными для предполагаемых целей.The composition described herein may also contain more than one active compound, if necessary for the particular indication to be treated, preferably it may contain compounds with complementary activities that do not adversely affect each other. Alternatively or additionally, the composition may comprise a cytotoxic agent, a cytokine, or a growth inhibitory agent. Such molecules are preferably present in combination in amounts that are effective for the intended purposes.

Активные ингредиенты могут быть также заключены в микрокапсулы, полученные, например, посредством методик коацервации или посредством межфазной полимеризации, например микрокапсулы гидроксиметилцеллюлозы или желатиновые микрокапсулы, и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы или нанокапсулы) или в макроэмульсиях. Такие методики изложены в Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition, см. выше.The active ingredients can also be enclosed in microcapsules obtained, for example, by coacervation techniques or by interfacial polymerization, for example, hydroxymethyl cellulose microcapsules or gelatin microcapsules, and poly (methyl methacrylate) microcapsules, respectively, in colloidal drug delivery systems (e.g., liposomes, alba microemulsions, nanoparticles or nanocapsules) or in macroemulsions. Such techniques are described in Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition, see above.

Могут быть получены препараты пролонгированного высвобождения. Подходящие примеры препаратов пролонгированного высвобождения включают полупроницаемые матриксы твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, причем эти матриксы находятся в виде формованных изделий, например пленок или микрокапсул. Примеры матриксов пролонгированного высвобождения включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт)), полилактиды (патент США 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, неразлагаемый этилен-винилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и ацетата лейпролида) и поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота. Микроинкапсулирование рекомбинантных белков для пролонгированного высвобождения было успешно выполнено с гормоном роста человека (rhGH), интерфероном человека (rhIFN-), интерлейкином-2 и MN rpg 120. Johnson et al., Nat. Med. 2: 795-799 (1996); Yasuda et al., Biomed. Ther. 27: 1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology 8: 755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems", in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds., (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462; WO 97/03692; WO 96/40072; WO 96/07399 и патент США 5654010.Sustained release preparations may be prepared. Suitable examples of sustained release formulations include semi-permeable matrices of solid hydrophobic polymers containing the antibody, which matrices are in the form of molded articles, such as films or microcapsules. Examples of sustained release matrices include polyesters, hydrogels (e.g., poly (2-hydroxyethyl methacrylate) or poly (vinyl alcohol)), polylactides (US Pat. No. 3,773,919), copolymers of L-glutamic acid and γ-ethyl-L-glutamate, non-degradable ethylene-vinyl acetate degradable copolymers of lactic acid and glycolic acid, such as LUPRON DEPOT ™ (injectable microspheres consisting of a copolymer of lactic acid and glycolic acid and leuprolide acetate) and poly-D - (-) - 3-hydroxybutyric acid. Microencapsulation of recombinant proteins for sustained release has been successfully performed with human growth hormone (rhGH), human interferon (rhIFN-), interleukin-2 and MN rpg 120. Johnson et al., Nat. Med. 2: 795-799 (1996); Yasuda et al., Biomed. Ther. 27: 1221-1223 (1993); Hora et al., Bio / Technology 8: 755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems", in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds., (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462; WO 97/03692; WO 96/40072; WO 96/07399 and U.S. Patent 5,654,010.

Композиции пролонгированного высвобождения из таких белков могут быть разработаны с использованием сополимера полимолочной и гликолевой кислот (PLGA) вследствие его биосовместимости и широкого диапазона биодеградируемых свойств. Продукты разложения PLGA, молочная и гликолевая кислоты, могут быстро выводиться из организма человека. Кроме того, расщепляемость этого полимера может быть доведена с месяцев до лет в зависимости от его молекулярной массы и состава. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer", in Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker; New York, 1990), M. Chasin and R. Langer (Eds.) pp. 1-41.Sustained release compositions from such proteins can be developed using a polylactic and glycolic acid copolymer (PLGA) due to its biocompatibility and a wide range of biodegradable properties. The decomposition products of PLGA, lactic and glycolic acids, can be rapidly excreted from the human body. In addition, the degradability of this polymer can be brought up from months to years depending on its molecular weight and composition. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide / glycolide polymer", in Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker; New York, 1990), M. Chasin and R. Langer (Eds.) Pp. 1-41.

В то время как такие полимеры, как этилен - винилацетат и молочная кислота - гликолевая кислота, позволяют высвобождать молекулы в течение более 100 дней, определенные гидрогели высвобождают белки в течение более коротких периодов времени. Когда инкапсулированные антитела остаются в организме в течение продолжительного времени, они могут денатурироваться или агрегировать в результате воздействия влаги при 37°С, что приводит к потере биологической активности и возможным изменениям в иммуногенности. Могут быть разработаны рациональные стратегии для стабилизации в зависимости от участвующего в этом механизма. Например, если обнаружено, что механизмом агрегации является образование межмолекулярной S-S-связи посредством взаимообмена тиол-дисульфид, стабилизация может быть достигнута модификацией сульфгидрильных остатков, лиофилизацией из кислотного раствора, регуляцией содержания влаги, использованием подходящих добавок и разработкой специфических композиций с использованием полимерного матрикса.While polymers such as ethylene - vinyl acetate and lactic acid - glycolic acid allow molecules to be released for more than 100 days, certain hydrogels release proteins for shorter periods of time. When the encapsulated antibodies remain in the body for a long time, they can denature or aggregate as a result of exposure to moisture at 37 ° C, which leads to a loss of biological activity and possible changes in immunogenicity. Rational strategies for stabilization may be developed depending on the mechanism involved. For example, if it is found that the aggregation mechanism is the formation of an intermolecular S-S bond through the exchange of thiol disulfide, stabilization can be achieved by modification of sulfhydryl residues, lyophilization from an acid solution, regulation of moisture content, the use of suitable additives and the development of specific compositions using a polymer matrix.

Для получения композиций белков или антител, описанных в данном описании, также могут быть использованы липосомные или протеиноидные композиции (патенты США 4925673 и 5013556).Liposome or proteinoid compositions (US Pat. Nos. 4,925,673 and 5,013,556) can also be used to prepare the protein or antibody compositions described herein.

Стабильность описанных в данном описании белков и антител может быть повышена посредством использования нетоксичных "водорастворимых солей поливалентных металлов". Примеры включают Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Sn2+, Sn3+, Al2+ и Al3+. Примеры анионов, которые могут образовывать водорастворимые соли с вышеуказанными катионами поливалентных металлов, включают анионы, образованные из неорганических кислот и/или органических кислот. Такие водорастворимые соли имеют растворимость в воде (при 20°C), составляющую по меньшей мере около 20 мг/мл, альтернативно по меньшей мере около 100 мг/мл, альтернативно по меньшей мере около 200 мг/мл.The stability of the proteins and antibodies described herein can be enhanced by the use of non-toxic “water-soluble polyvalent metal salts”. Examples include Ca 2+ , Mg 2+ , Zn 2+ , Fe 2+ , Fe 3+ , Cu 2+ , Sn 2+ , Sn 3+ , Al 2+ and Al 3+ . Examples of anions that can form water soluble salts with the above polyvalent metal cations include anions formed from inorganic acids and / or organic acids. Such water soluble salts have a solubility in water (at 20 ° C.) of at least about 20 mg / ml, alternatively at least about 100 mg / ml, alternatively at least about 200 mg / ml.

Подходящие неорганические кислоты, которые могут быть использованы для образования "водорастворимых солей поливалентных металлов", включают хлористоводородную, уксусную, серную, азотную, тиоциановую и фосфорную кислоту. Подходящие органические кислоты, которые могут быть использованы, включают алифатические карбоновые кислоты и ароматические кислоты. Алифатические кислоты в пределах данного определения могут быть определены как насыщенные или ненасыщенные С2-9-карбоновые кислоты (например, алифатические моно-, ди- и трикарбоновые кислоты). Например, примеры монокарбоновых кислот в данном определении включают насыщенные С2-9-монокарбоновые кислоты: уксусную, пропионовую, масляную, валериановую, капроновую, энантовую, каприловую, пеларгоновую и каприоновую кислоты, и ненасыщенные С2-9-монокарбоновые кислоты: акриловую, пропиоловую, метакриловую, кротоновую и изокротоновую кислоты. Примеры дикарбоновых кислот включают насыщенные С2-9-дикарбоновые кислоты: малоновую, янтарную, глутаровую, адипиновую и пимелиновую кислоты, тогда как ненасыщенные С2-9-дикарбоновые кислоты включают малеиновую, фумаровую, цитраконовую и мезаконовую кислоты. Примеры трикарбоновых кислот включают насыщенные С2-9-трикарбоновые кислоты: трикарбаллиловую и 1,2,3-бутантрикарбоновую кислоту. Кроме того, карбоновые кислоты этого определения могут также содержать одну или две гидроксильные группы для образования гидроксикарбоновых кислот. Примеры гидроксикарбоновых кислот включают гликолевую, молочную, глицериновую, тартроновую, яблочную, винную и лимонную кислоты. Ароматические кислоты в данном определении включают бензойную и салициловую кислоту.Suitable inorganic acids that can be used to form “water-soluble polyvalent metal salts” include hydrochloric, acetic, sulfuric, nitric, thiocyanic and phosphoric acid. Suitable organic acids that may be used include aliphatic carboxylic acids and aromatic acids. Aliphatic acids within this definition can be defined as saturated or unsaturated C 2-9 carboxylic acids (for example, aliphatic mono-, di - and tricarboxylic acids). For example, examples of monocarboxylic acids in this definition include saturated C 2-9 monocarboxylic acids: acetic, propionic, butyric, valerianic, caproic, enanthic, caprylic, pelargonic and capric acids, and unsaturated C 2-9 monocarboxylic acids: acrylic, propiol , methacrylic, crotonic and isocrotonic acids. Examples of dicarboxylic acids include saturated C 2-9 dicarboxylic acids: malonic, succinic, glutaric, adipic and pimelic acids, while unsaturated C 2-9 dicarboxylic acids include maleic, fumaric, citraconic and mesaconic acids. Examples of tricarboxylic acids include saturated C 2-9 tricarboxylic acids: tricarboxylic acid and 1,2,3-butanetricarboxylic acid. In addition, carboxylic acids of this definition may also contain one or two hydroxyl groups to form hydroxycarboxylic acids. Examples of hydroxycarboxylic acids include glycolic, lactic, glyceric, tartronic, malic, tartaric and citric acids. Aromatic acids in this definition include benzoic and salicylic acid.

Обычно используемые водорастворимые соли поливалентных металлов, которые могут быть использованы для улучшения стабилизации инкапсулированных полипептидов по изобретению, включают, например: (1) соли металлов и неорганических кислот, выбранные из галогенидов (например, хлорид цинка, хлорид кальция), сульфатов, нитратов, фосфатов и тиоцианатов; (2) соли металлов и алифатических карбоновых кислот (например, ацетат кальция, ацетат цинка, пропионат кальция, гликолат цинка, лактат кальция, лактат цинка и тартрат цинка); и (3) соли металлов и ароматических карбоновых кислот, выбранные из бензоатов (например, бензоат цинка) и салицилатов.Commonly used water-soluble salts of polyvalent metals that can be used to improve the stabilization of the encapsulated polypeptides of the invention include, for example: (1) metal and inorganic acid salts selected from halides (e.g. zinc chloride, calcium chloride), sulfates, nitrates, phosphates and thiocyanates; (2) metal salts of aliphatic carboxylic acids (e.g., calcium acetate, zinc acetate, calcium propionate, zinc glycolate, calcium lactate, zinc lactate and zinc tartrate); and (3) metal salts and aromatic carboxylic acids selected from benzoates (e.g., zinc benzoate) and salicylates.

Для профилактики или лечения заболевания подходящая доза активного агента будет зависеть от типа заболевания, на которое направлено лечение, как определенно выше, тяжести и протекания этого заболевания, от того, вводится ли этот агент для профилактических или терапевтических целей, от предыдущей терапии, клинической истории пациента и реакции на данный агент, а также от мнения лечащего врача. Этот агент вводят пациенту подходящим способом единовременно или на протяжении ряда введений.For the prevention or treatment of a disease, a suitable dose of the active agent will depend on the type of disease to which treatment is directed, as defined above, the severity and course of the disease, on whether this agent is administered for prophylactic or therapeutic purposes, on previous therapy, the patient’s clinical history and reactions to this agent, as well as the opinion of the attending physician. This agent is administered to the patient in an appropriate manner at a time or over a series of administrations.

Способ по изобретению может комбинироваться с известными способами лечения нарушения в виде комбинированных или дополнительных стадий лечения, либо в виде дополнительных компонентов терапевтической композиции.The method according to the invention can be combined with known methods of treating a disorder in the form of combined or additional stages of treatment, or in the form of additional components of a therapeutic composition.

Дозы и желаемая концентрация лекарственного средства в фармацевтической композиции по изобретению могут изменяться в зависимости от конкретного предполагаемого применения. Определение подходящей дозы или способа введения находится в компетенции специалиста в данной области техники. Эксперименты на животных обеспечивают надежную рекомендацию для определения эффективных доз для терапии человека. Межвидовое масштабирование эффективных доз может выполняться в соответствии с принципами, установленными Mordenti, J. and Chappell, W. в "The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics", In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-46.Dosages and the desired concentration of the drug in the pharmaceutical composition of the invention may vary depending on the particular intended use. Determining the appropriate dose or route of administration is within the competence of a person skilled in the art. Animal experiments provide a reliable recommendation for determining effective doses for human therapy. Interspecific scaling of effective doses can be performed in accordance with the principles established by Mordenti, J. and Chappell, W. in "The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics", In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-46.

При введении in vivo описанных в данном описании полипептидов или антител нормальные количества доз могут варьироваться от около 10 нг/кг до около 100 мг/кг массы тела млекопитающего или большего количества на день, предпочтительно, от около 1 мг/кг/день до 10 мг/кг/день в зависимости от способа введения. Руководство в отношении конкретных доз и способов доставки приведено в литературе (патенты США 4657760; 5206344 или 5225212). В объем изобретения входят различные композиции, которые будут эффективными для различных способов лечения и различных нарушений, и введение, предназначенное для лечения конкретного органа или ткани, может потребовать доставки способом, отличающимся от способа доставки для другого органа или ткани. Кроме того, дозы могут вводиться посредством одного введения или нескольких отдельных введений или посредством непрерывной инфузии. Для повторяемых введений на протяжении нескольких дней или более длительного периода времени в зависимости от состояния, лечение поддерживают до тех пор, пока не происходит желаемое подавление симптомов заболевания. Однако могут быть целесообразными и другие схемы введения доз. Ход такой терапии можно легко подвергнуть мониторингу с использованием общепринятых способов и анализов.When administered in vivo to the polypeptides or antibodies described herein, normal dose amounts can range from about 10 ng / kg to about 100 mg / kg of mammalian body weight or more per day, preferably from about 1 mg / kg / day to 10 mg / kg / day depending on the route of administration. Guidance on specific dosages and delivery methods is provided in the literature (US Pat. Nos. 4,657,760; 5,206,344 or 5,225,212). Various compositions are included in the scope of the invention that will be effective for various treatment methods and various disorders, and administration intended to treat a particular organ or tissue may require delivery in a manner different from the delivery method for another organ or tissue. In addition, doses may be administered by a single administration or several separate administrations or by continuous infusion. For repeated administrations over several days or a longer period of time depending on the condition, treatment is maintained until the desired suppression of disease symptoms occurs. However, other dosage regimens may be appropriate. The progress of such therapy can be easily monitored using conventional methods and assays.

Композиции по изобретениию, включая, но, не ограничиваясь ими, восстановленные композиции, вводят животному, нуждающемуся в лечении данным белком, предпочтительно человеку, согласно известным способам, таким как внутривенное введение в виде болюса или непрерывной инфузии в течение некоторого периода времени, внутримышечным, внутрибрюшинным, интрацереброспинальным, подкожным, внутрисуставным, интрасиновиальным, подоболочечным, пероральным, местным или ингаляционным способом.The compositions of the invention, including, but not limited to, reconstituted compositions, are administered to an animal in need of treatment with this protein, preferably to a human, according to known methods, such as intravenous administration as a bolus or continuous infusion over a period of time, intramuscular, intraperitoneal , intracerebrospinal, subcutaneous, intraarticular, intrasinovial, subshell, oral, local or inhaled.

В предпочтительных вариантах осуществления композиции вводят млекопитающему подкожным (то есть под кожу) введением. Для таких целей композиция может бить инъецирована с использованием шприца. Однако имеются другие устройства для введения композиции, такие как инъекционные устройства (например, устройства Inject-ease™ и Genject™); ручки для инъекции (такие как GenPen™); автоинъекторные устройства, безыгольные устройства (например, MediJector™ и BioJector™) и подкожные системы доставки в виде пластырей.In preferred embodiments, the compositions are administered to the mammal by subcutaneous (i.e., subcutaneous) administration. For such purposes, the composition may be injected using a syringe. However, there are other devices for administering the composition, such as injection devices (for example, Inject-ease ™ and Genject ™ devices); injection pens (such as GenPen ™); autoinjector devices, needleless devices (such as MediJector ™ and BioJector ™), and subcutaneous patch delivery systems.

В конкретном варианте осуществления изобретение относится к наборам для элемента введения отдельных доз. Такие наборы содержат контейнер водной композиции терапевтического белка или антитела, включающий либо однокамерные, либо многокамерные предварительно наполненные шприцы. Примеры заранее наполненных шприцов доступны от Vetter GmbH, Ravensburg, Германия.In a specific embodiment, the invention relates to kits for a single dose unit. Such kits comprise a container of an aqueous composition of a therapeutic protein or antibody, including either single chamber or multi chamber prefilled syringes. Examples of prefilled syringes are available from Vetter GmbH, Ravensburg, Germany.

Подходящая доза ("терапевтически эффективное количество") белка будет зависеть, например, от подлежащего лечению состояния, тяжести и протекания состояния, от того, вводят ли этот белок для профилактических или терапевтических целей, предыдущей терапии, клинической истории пациента и реакции на белок, типа используемого белка, а также от мнения лечащего врача. Белок подходящим способом вводят пациенту единовременно или на протяжении ряда введений, и он может вводиться пациенту в любое время после установления диагноза. Белок вводят как единственное терапевтическое средство или вместе с другими лекарственными средствами или способами терапии, применимыми в лечении рассматриваемого состояния.A suitable dose (“therapeutically effective amount”) of the protein will depend, for example, on the condition to be treated, the severity and course of the condition, whether the protein is administered for prophylactic or therapeutic purposes, previous therapy, the patient’s clinical history and response to the protein, such as the protein used, as well as the opinion of the attending physician. The protein is suitably administered to the patient at a time or over a series of administrations, and it can be administered to the patient at any time after diagnosis. The protein is administered as the only therapeutic agent or together with other drugs or therapies useful in the treatment of the condition in question.

В случае, когда выбранным белком является антитело, начальной кандидатной дозой является доза около 0,1-20 мг/кг для введения пациенту, например, посредством одного или более отдельных введений. Однако могут быть использованы и другие схемы введения доз. Ход такой терапии легко подвергается мониторингу с помощью общепринятых методик.In the case where the selected protein is an antibody, the initial candidate dose is a dose of about 0.1-20 mg / kg for administration to a patient, for example, through one or more separate administrations. However, other dosage regimens may also be used. The progress of such therapy is easily monitored using conventional techniques.

В еще одном варианте осуществления изобретения представлено изделие, которое содержит данную композицию и предпочтительно содержит инструкцию для ее применения. Это изделие содержит контейнер. Подходящие контейнеры включают, например, сосуды, флаконы (например, двухкамерные флаконы), шприцы (например, однокамерные или двухкамерные шприцы) и тест-пробирки. Контейнер может быть сделан из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию и имеет этикетку или прилагаемую к нему аннотацию с указаниями по восстановлению и/или использованию композиции. На этикетке может быть дополнительно указано, что данная композиция применима или предназначена для подкожного введения. Контейнер, содержащий данную композицию, может быть флаконом многоразового использования, который позволяет выполнять повторные введения (например, от 2 до 6 введений) восстановленной композиции. Изделие может дополнительно включать второй контейнер, содержащий подходящий разбавитель (например, BWFI). При смешивании разбавителя и лиофилизированной композиции конечная концентрация белка в восстановленной композиции будет обычно составлять по меньшей мере 50 мг/мл. Изделие может дополнительно включать другие материалы, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения пользователя, в том числе другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши упаковки с инструкциями по применению.In yet another embodiment of the invention, an article is provided that contains the composition and preferably contains instructions for its use. This product contains a container. Suitable containers include, for example, vessels, vials (e.g., dual-chamber vials), syringes (e.g., single-chamber or dual-chamber syringes), and test tubes. The container can be made of various materials, such as glass or plastic. The container contains the composition and has a label or annotation attached thereto with instructions for restoring and / or using the composition. The label may further indicate that the composition is applicable or intended for subcutaneous administration. The container containing the composition may be a refillable bottle that allows repeated administrations (e.g., 2 to 6 administrations) of the reconstituted composition. The product may further include a second container containing a suitable diluent (e.g., BWFI). When mixing the diluent and the lyophilized composition, the final protein concentration in the reconstituted composition will typically be at least 50 mg / ml. The product may further include other materials necessary from a commercial point of view and from the point of view of the user, including other buffers, diluents, filters, needles, syringes and package inserts with instructions for use.

Изобретение будет более понятно со ссылкой на нижеследующие примеры. Однако примеры не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. Все ссылки в описании настоящим включены посредством ссылки.The invention will be better understood with reference to the following examples. However, the examples should not be construed as limiting the scope of the invention. All references in the description are hereby incorporated by reference.

Пример 1: Изучение алкилгликозидов в качестве неионных поверхностно-активных веществ для предотвращения агрегации белков/антителExample 1: Study of alkyl glycosides as nonionic surfactants to prevent protein / antibody aggregation

В данном примере иллюстрируется применение алкилгликозидов в качестве неионных поверхностно-активных веществ для предотвращения агрегации антител в водном растворе. Защитное действие различных алкилгликозидов и полисорбата 20 против агрегации различных моноклональных антител, вызываемой перемешиванием, в растворе оценивали для двух разных форм перемешивания: встряхивания и взбалтывания.This example illustrates the use of alkyl glycosides as nonionic surfactants to prevent the aggregation of antibodies in an aqueous solution. The protective effect of various alkyl glycosides and polysorbate 20 against the aggregation of various monoclonal antibodies caused by stirring in a solution was evaluated for two different forms of stirring: shaking and shaking.

Вызываемая встряхиванием агрегацияShake-induced aggregation

В данном наборе исследований забуференный раствор (20 мМ буфера из фосфата натрия, pH 7,4) моноклонального антитела подвергали встряхиванию на орбитальном встряхивателе на 150 об/мин при контролируемой температуре 37°C. Данные исследования проводили с использованием 3 мл раствора антител, помещенного в стеклянный флакон объемом 6 см3. Образцы извлекали через регулярные интервалы и анализировали относительно процента мономеров с применением эксклюзионной хроматографии размеров. Различные поверхностно-активные вещества из класса алкилгликозидов оценивали на их эффективность по предотвращению агрегации белков во время встряхивания. Поверхностно-активные вещества использовали в концентрациях ниже соответствующих им критических концентраций мицеллообразования (CMC) или выше соответствующих им CMC.In this test kit, a buffered solution (20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4) of the monoclonal antibody was shaken on an orbital shaker at 150 rpm at a controlled temperature of 37 ° C. These studies were carried out using 3 ml of a solution of antibodies placed in a glass vial with a volume of 6 cm 3 . Samples were taken at regular intervals and analyzed relative to the percentage of monomers using size exclusion chromatography. Various surfactants from the class of alkyl glycosides were evaluated for their effectiveness in preventing protein aggregation during shaking. Surfactants were used at concentrations below their respective critical micelle concentrations (CMC) or above their corresponding CMC.

Вызываемая взбалтыванием агрегацияAgitated agitation

В данном наборе исследований использовали покрытую тефлоном магнитную мешалку для перемешивания забуференного раствора (20 мМ гистидин-ацетата, pH 5,5) моноклонального антитела. 3 мл раствора антител помещали в стеклянный флакон объемом 6 см3 и раствор взбалтывали на 500 об/мин с использованием покрытой тефлоном мешалки. Раствор взбалтывали в течение 90 мин, образцы извлекали через регулярные интервалы и анализировали относительно мутности как указания на образование нерастворимых агрегатов. Различные поверхностно-активные вещества из класса алкилгликозидов оценивали на их эффективность по предотвращению агрегации белков во время взбалтывания. Поверхностно-активные вещества использовали в концентрациях ниже соответствующих им критических концентраций мицеллообразования (CMC) или выше соответствующих им CMC.In this set of studies, a Teflon-coated magnetic stirrer was used to mix a buffered solution (20 mM histidine acetate, pH 5.5) of a monoclonal antibody. 3 ml of antibody solution was placed in a 6 cm 3 glass vial and the solution was shaken at 500 rpm using a Teflon-coated stirrer. The solution was shaken for 90 minutes, samples were removed at regular intervals and analyzed relative to the turbidity as indications of the formation of insoluble aggregates. Various surfactants from the class of alkyl glycosides were evaluated for their effectiveness in preventing protein aggregation during agitation. Surfactants were used at concentrations below their respective critical micelle concentrations (CMC) or above their corresponding CMC.

Результатыresults

На фиг.1 показана временная зависимость процента мономеров моноклонального антитела анти-MUC16 в растворе после встряхивания на 150 об/мин при 37°C в течение 64 ч в отсутствие поверхностно-активного вещества и в присутствии различных поверхностно-активных веществ, включая н-децил-β-D-глюкопиранозид, н-октил-β-D-глюкопиранозид или полисорбат 20. Поверхностно-активные вещества использовали в концентрации, равной половине соответствующих им значений CMC, то есть 1,1 мМ (0,035% масса/объем) для н-децил-β-D-глюкопиранозида, 9 мМ (0,24%) для н-октил-β-D-глюкопиранозида и 0,04 мМ (0,0035%) для полисорбата 20.Figure 1 shows the time dependence of the percentage of monomers of the anti-MUC16 monoclonal antibody in solution after shaking at 150 rpm at 37 ° C for 64 hours in the absence of a surfactant and in the presence of various surfactants, including n-decyl -β-D-glucopyranoside, n-octyl-β-D-glucopyranoside or polysorbate 20. Surfactants were used at a concentration equal to half of their corresponding CMC values, i.e. 1.1 mM (0.035% mass / volume) for n -decyl-β-D-glucopyranoside, 9 mM (0.24%) for n-octyl-β-D-glucopyranose yes and 0.04 mM (0.0035%) of polysorbate 20.

Как показано на фиг.1, при отсутствии какого-либо поверхностно-активного вещества наблюдалось снижение процента мономеров антитела после встряхивания в течение 64 ч. Полисорбат 20 не был эффективным в предотвращении вызываемой встряхиванием потери мономеров в данных условиях, тогда как два протестированных поверхностно-активных вещества из класса алкилгликозидов, то есть н-децил-β-D-глюкопиранозид и н-октил-β-D-глюкопиранозид, были эффективными в предотвращении потери мономеров моноклонального антитела анти-MUC16 после встряхивания. Следовательно, как н-децил-β-D-глюкопиранозид, так и н-октил-β-D-глюкопиранозид (то есть алкилгликозиды, имеющие значения CMC более чем 1,0 мМ) эффективно предотвращают агрегацию моноклонального антитела анти-MUC16 в растворе, вызываемую перемешиванием.As shown in FIG. 1, in the absence of any surfactant, a decrease in the percentage of antibody monomers was observed after shaking for 64 hours. Polysorbate 20 was not effective in preventing shaking caused by loss of monomers under these conditions, while the two surfactants tested substances from the class of alkyl glycosides, i.e. n-decyl-β-D-glucopyranoside and n-octyl-β-D-glucopyranoside, were effective in preventing the loss of monomers of the anti-MUC16 monoclonal antibody after shaking. Therefore, both n-decyl-β-D-glucopyranoside and n-octyl-β-D-glucopyranoside (i.e., alkyl glycosides having CMC values of more than 1.0 mM) effectively prevent the aggregation of the anti-MUC16 monoclonal antibody in solution, caused by mixing.

На фиг.2 и 3 показана временная динамика формирования замутнения в растворе моноклонального антитела анти-MUC16 после взбалтывания на 500 об/мин с использованием покрытой тефлоном магнитной мешалки при температуре окружающей среды в течение 90 мин. Мутность оценивали в растворах, не содержащих поверхностно-активных веществ, а также в растворах, содержащих различные поверхностно-активные вещества из класса алкилгликозидов или полисорбат 20. На фиг.2 используемая концентрация поверхностно-активных веществ составляла одну десятую соответствующих им значений CMC, то есть 1,8 мМ (0,053%) для н-октил-β-D-глюкопиранозида, 0,18 мМ (0,008%) для н-децил-β-D-мальтопиранозида, 0,22 мМ (0,007%) для н-децил-β-D-глюкопиранозида, 25 мМ (0,66%) для н-гексил-β-D-глюкопиранозида и 0,008 мМ (0,0007%) для полисорбата 20. На фиг.3 используемая концентрация поверхностно-активных веществ была в два раза выше соответствующих им значений CMC, то есть 36 мМ (1,0%) для н-октил-β-D-глюкопиранозида, 3,6 мМ (0,16%) для н-децил-β-D-мальтопиранозида, 4,4 мМ (0,14%) для н-децил-β-D-глюкопиранозида, 500 мМ (12%) для н-гексил-β-D-глюкопиранозида и 0,16 мМ (0,014%) для полисорбата 20.Figures 2 and 3 show the temporal dynamics of the formation of turbidity in the solution of the anti-MUC16 monoclonal antibody after shaking at 500 rpm using a Teflon-coated magnetic stirrer at ambient temperature for 90 minutes. Turbidity was evaluated in solutions containing no surfactants, as well as in solutions containing various surfactants from the class of alkyl glycosides or polysorbate 20. In FIG. 2, the concentration of surfactants used was one tenth of their corresponding CMC values, i.e. 1.8 mM (0.053%) for n-octyl-β-D-glucopyranoside, 0.18 mM (0.008%) for n-decyl-β-D-maltopyranoside, 0.22 mM (0.007%) for n-decyl β-D-glucopyranoside, 25 mM (0.66%) for n-hexyl-β-D-glucopyranoside and 0.008 mm (0.0007%) for polysorbate 20. In FIG. 3, used the concentration of surfactants was two times higher than the corresponding CMC values, i.e. 36 mM (1.0%) for n-octyl-β-D-glucopyranoside, 3.6 mM (0.16%) for n-decyl β-D-maltopyranoside, 4.4 mM (0.14%) for n-decyl-β-D-glucopyranoside, 500 mM (12%) for n-hexyl-β-D-glucopyranoside and 0.16 mm ( 0.014%) for polysorbate 20.

Как видно на фиг.2, при концентрации, составляющей одну десятую соответствующих им значений CMC, н-октил-β-D-глюкопиранозид и полисорбат 20 были эффективны в предотвращении формирования замутненности по сравнению с раствором антитела, не содержащего поверхностно-активных веществ. Формирование замутненности обычно объясняют формированием больших нерастворимых агрегатов антитела.As can be seen in FIG. 2, at a concentration of one tenth of their respective CMC values, n-octyl-β-D-glucopyranoside and polysorbate 20 were effective in preventing turbidity from forming compared to a solution of a surfactant-free antibody. The formation of turbidity is usually explained by the formation of large insoluble aggregates of the antibody.

Как также можно видеть на фиг.3, при концентрации в два раза больше соответствующих им значений CMC все поверхностно-активные вещества из класса алкилгликозидов были эффективны в предотвращении агрегации антитела в растворе в соответствии с измерениями формирования замутненности.As can also be seen in FIG. 3, at a concentration twice that of their respective CMCs, all surfactants from the class of alkyl glycosides were effective in preventing the aggregation of antibodies in solution in accordance with turbidity formation measurements.

На фиг.4 приведено исследование влияния изменения концентрации н-октил-β-D-глюкопиранозида на мутность композиций моноклонального антитела анти-MUC16 во время встряхивания на 300 об/мин в течение 72 ч при 37°C. Как показано на фиг.4, при всех протестированных концентрациях, то есть 0,72 мМ (0,02 масса/объем), 1,8 мМ (0,05 масса/объем), 3,6 мМ (0,1 масса/объем), 9 мМ (0,25 масса/объем), 18 мМ (0,5 масса/объем) н-октил-β-D-глюкопиранозид эффективно подавлял образование видимых агрегатов антител после встряхивания, в соответствии с измерениями формирования замутненности.Figure 4 shows a study of the effect of changes in the concentration of n-octyl-β-D-glucopyranoside on the turbidity of the compositions of the anti-MUC16 monoclonal antibody during shaking at 300 rpm for 72 hours at 37 ° C. As shown in figure 4, at all tested concentrations, that is, 0.72 mm (0.02 mass / volume), 1.8 mm (0.05 mass / volume), 3.6 mm (0.1 mass / volume), 9 mM (0.25 mass / volume), 18 mM (0.5 mass / volume) n-octyl-β-D-glucopyranoside effectively suppressed the formation of visible antibody aggregates after shaking, in accordance with measurements of turbidity formation.

На фиг.5 приведено исследование влияния изменения концентрации н-октил-β-D-глюкопиранозида на процент мономеров моноклонального антитела анти-MUC16 после встряхивания на 300 об/мин при 37°C в течение 72 ч. Как показано на фиг.5, при всех протестированных концентрациях н-октил-β-D-глюкопиранозид эффективно поддерживал процент мономеров антитела анти-MUC16 после встряхивания по сравнению с образцом, не подвергавшимся встряхиванию, который хранился в аналогичных условиях.Figure 5 shows a study of the effect of changes in the concentration of n-octyl-β-D-glucopyranoside on the percentage of monomers of the anti-MUC16 monoclonal antibody after shaking at 300 rpm at 37 ° C for 72 hours. As shown in figure 5, when of all tested concentrations of n-octyl-β-D-glucopyranoside effectively maintained the percentage of anti-MUC16 antibody monomers after shaking compared to a non-shaken sample that was stored under similar conditions.

На фиг.6-9 приведено исследование влияния 0,23 мМ (0,02% масса/объем) полисорбата 20 и 3,6 мМ (0,1% масса/объем) н-октил-β-D-глюкопиранозида на мутность водных композиций моноклонального антитела анти-MUC16 (фиг.6), моноклонального антитела анти-IgE (фиг.7), моноклонального антитела анти-CD11a (фиг.8) и моноклонального антитела анти-CD22 (фиг.9) во время встряхивания на 300 об/мин в течение 72 ч при 37°C. Как показано на фиг.6-9, как полисорбат 20, так и н-октил-β-D-глюкопиранозид эффективно подавляли образование видимых агрегатов антител для всех протестированных антител после встряхивания в соответствии с измерениями формирования замутненности.Figure 6-9 shows a study of the effect of 0.23 mm (0.02% mass / volume) of polysorbate 20 and 3.6 mm (0.1% mass / volume) of n-octyl-β-D-glucopyranoside on aqueous turbidity compositions of the anti-MUC16 monoclonal antibody (FIG. 6), the anti-IgE monoclonal antibody (FIG. 7), the anti-CD11a monoclonal antibody (FIG. 8) and the anti-CD22 monoclonal antibody (FIG. 9) while shaking at 300 rpm / min for 72 hours at 37 ° C. As shown in FIGS. 6-9, both polysorbate 20 and n-octyl-β-D-glucopyranoside effectively suppressed the formation of visible antibody aggregates for all tested antibodies after shaking in accordance with turbidity formation measurements.

На фиг.10-13 приведено исследование влияния 0,23 мМ (0,02% масса/объем) полисорбата 20 и 3,6 мМ (0,1% масса/объем) н-октил-β-D-глюкопиранозида на процент мономеров в водных композициях моноклонального антитела анти-MUC16 (фиг.10), моноклонального антитела анти-IgE (фиг.11), моноклонального антитела анти-CD11a (фиг.12) и моноклонального антитела анти-CD22 (фиг.13) во время встряхивания на 300 об/мин в течение 72 ч при 37°C. Как показано на фиг.10-13, н-октил-β-D-глюкопиранозид эффективно поддерживал процент мономеров для различных протестированных антител после встряхивания по сравнению с образцом, не подвергавшимся встряхиванию, который хранился в аналогичных условиях.Figure 10-13 shows a study of the effect of 0.23 mm (0.02% mass / volume) of polysorbate 20 and 3.6 mm (0.1% mass / volume) of n-octyl-β-D-glucopyranoside on the percentage of monomers in aqueous compositions of the anti-MUC16 monoclonal antibody (FIG. 10), the anti-IgE monoclonal antibody (FIG. 11), the anti-CD11a monoclonal antibody (FIG. 12) and the anti-CD22 monoclonal antibody (FIG. 13) while shaking on 300 rpm for 72 hours at 37 ° C. As shown in FIGS. 10-13, n-octyl-β-D-glucopyranoside effectively maintained the percentage of monomers for the various antibodies tested after shaking compared to a non-shaken sample that was stored under similar conditions.

Пример 2: Изучение алкилгликозидов в качестве неионных поверхностно-активных веществ для предотвращения окисления белков/антителExample 2: Study of alkyl glycosides as nonionic surfactants to prevent oxidation of proteins / antibodies

В данном примере проиллюстрировано применение алкилгликозидов в качестве неионных поверхностно-активных веществ для предотвращения окисления антител в водном растворе.This example illustrates the use of alkyl glycosides as nonionic surfactants to prevent oxidation of antibodies in aqueous solution.

В первом эксперименте растворы поверхностно-активных веществ из класса алкилгликозидов, то есть н-децил-β-D-глюкопиранозида, н-октил-β-D-глюкопиранозида и н-децил-β-D-мальтопиранозида, а также полисорбата 20 при концентрации 0,1% масса/объем в воде хранили при 40°C в течение одного месяца. Затем образцы извлекали и анализировали на предмет наличия пероксида водорода с использованием анализа на пероксид водорода Amplex Red; результаты этих анализов показаны на фиг.14.In the first experiment, solutions of surfactants from the class of alkyl glycosides, i.e., n-decyl-β-D-glucopyranoside, n-octyl-β-D-glucopyranoside and n-decyl-β-D-maltopyranoside, as well as polysorbate 20 at a concentration 0.1% weight / volume in water was stored at 40 ° C for one month. Samples were then removed and analyzed for the presence of hydrogen peroxide using an Amplex Red hydrogen peroxide assay; the results of these analyzes are shown in FIG.

Как показано на фиг.14, в растворах, содержащих в качестве поверхностно-активных веществ алкилгликозиды, образовывалось незначительное количество пероксида водорода после хранения данных растворов при 40°C в течение одного месяца. Напротив, около 10 мкΜ пероксида водорода образовалось в содержащем полисорбат 20 растворе в тех же условиях хранения. Эти данные показывают, что применение алкилгликозидов в качестве стабилизирующих белок агентов в водных композициях может являться предпочтительным по сравнению с полисорбатом 20 по причине относительно низкой предрасположенности алкилгликозидов к образованию окисляющего пероксида водорода в растворе с течением времени.As shown in FIG. 14, in solutions containing alkyl glycosides as surfactants, a small amount of hydrogen peroxide was formed after storing these solutions at 40 ° C for one month. On the contrary, about 10 μΜ of hydrogen peroxide was formed in a solution containing polysorbate 20 under the same storage conditions. These data show that the use of alkyl glycosides as protein stabilizing agents in aqueous compositions may be preferred over polysorbate 20 because of the relatively low predisposition of alkyl glycosides to the formation of oxidizing hydrogen peroxide in solution over time.

Во втором эксперименте оценивали окисление аминокислотного остатка Met256 в моноклональном антителе анти-CD11a в растворах, содержащих н-децил-β-D-глюкопиранозид, н-октил-β-D-глюкопиранозид или полисорбат 20. Для этой цели 3 мл забуференного раствора антител (pH 6,0), содержащего 0,1% масса/объем поверхностно-активного вещества, хранили во флаконах объемом 6 см3 при 5°C или 40°C в течение 2 или 4 недель. Затем образцы извлекали и анализировали на предмет окисления остатка Met256, аминокислоты в первичной последовательности анти-CD11a, относительно которой ранее было показано, что она является чувствительной к окислению; результаты этих анализов показаны на фиг.15.In a second experiment, the oxidation of the amino acid residue Met256 in the anti-CD11a monoclonal antibody in solutions containing n-decyl-β-D-glucopyranoside, n-octyl-β-D-glucopyranoside or polysorbate 20 was evaluated. For this purpose, 3 ml of buffered antibody solution ( pH 6.0) containing 0.1% weight / volume surfactant was stored in 6 cm 3 vials at 5 ° C or 40 ° C for 2 or 4 weeks. Samples were then removed and analyzed for oxidation of the Met256 residue, an amino acid in the primary anti-CD11a sequence, which was previously shown to be oxidatively sensitive; the results of these analyzes are shown in FIG.

Как показано на фиг.15, в растворах, содержащих н-децил-β-D-глюкопиранозид или н-октил-β-D-глюкопиранозид, не наблюдалось значимого увеличения процента окисленного Met256 в анти-CD11a после хранения, как описано выше, по сравнению с первоначальным образцом. Однако в растворах анти-CD11a, содержащих полисорбат 20, было обнаружено окисление приблизительно 16% остатков Met256 после хранения при 40°C в течение 4 недель по сравнению с приблизительно 2% окислением того же аминокислотного остатка в нулевой момент времени. Таким образом, эти данные показывают, что применение алкилгликозидов в качестве стабилизирующих белок агентов в водных композициях может являться предпочтительным по сравнению с полисорбатом 20 по причине относительно низкой предрасположенности алкилгликозидов к окислению белка в композиции с течением времени.As shown in FIG. 15, in solutions containing n-decyl-β-D-glucopyranoside or n-octyl-β-D-glucopyranoside, there was no significant increase in the percentage of oxidized Met256 in anti-CD11a after storage, as described above, by Compared to the original sample. However, in solutions of anti-CD11a containing polysorbate 20, oxidation of approximately 16% of Met256 residues after storage at 40 ° C for 4 weeks was detected, compared with approximately 2% oxidation of the same amino acid residue at time zero. Thus, these data show that the use of alkyl glycosides as protein stabilizing agents in aqueous compositions may be preferred over polysorbate 20 due to the relatively low susceptibility of alkyl glycosides to protein oxidation in the composition over time.

В третьем эксперименте анализировали вызываемое реактивом Фентона окисление аминокислотных остатков Met и Trp (то есть аминокислот, известных как чувствительные к окислению) в моноклональном антителе анти-CD22. В частности, получали забуференные (20 мМ гистидин-ацетата, pH 5,5) растворы моноклонального антитела анти-CD22, содержащие 0,1 ч/млн Fe и 1 ч/млн пероксида водорода, и хранили в течение 2 или 4 недель при 40°C в отсутствие поверхностно-активных веществ или в присутствии 0,23 мМ (0,02% масса/объем) полисорбата 20 или 3,6 мМ (0,1% масса/объем) н-октил-β-D-глюкопиранозида. Затем образцы извлекали и определяли процент окисления остатков Met и Trp по процентным пикам перед основным компонентом при элюировании антитела через фенильную колонку ОФ-ВЭЖХ. Результаты данных анализов показаны на фиг.16.In a third experiment, Fenton's reagent-induced oxidation of the amino acid residues Met and Trp (i.e., amino acids known as oxidation sensitive) in the anti-CD22 monoclonal antibody was analyzed. In particular, buffered (20 mM histidine acetate, pH 5.5) monoclonal anti-CD22 monoclonal antibody solutions containing 0.1 ppm Fe and 1 ppm hydrogen peroxide were prepared and stored for 2 or 4 weeks at 40 ° C in the absence of surfactants or in the presence of 0.23 mM (0.02% w / v) polysorbate 20 or 3.6 mM (0.1% w / v) n-octyl-β-D-glucopyranoside. Then, the samples were removed and the percentage of oxidation of Met and Trp residues was determined by percentage peaks in front of the main component when the antibody was eluted through a phenyl RP-HPLC column. The results of these analyzes are shown in Fig.16.

Как показано на фиг.16, вызываемое реактивом Фентона окисление чувствительных аминокислот (Trp, Met) в моноклональном анти-CD22 подавляется в растворах, содержащих н-октил-β-D-глюкопиранозид, по сравнению с растворами, содержащими полисорбат 20, и сравнимо с растворами, не содержащими поверхностно-активных веществ. Таким образом, эти данные показывают, что применение алкилгликозидов в качестве стабилизирующих белок агентов в водных композициях может являться предпочтительным по сравнению с полисорбатом 20 по причине относительно низкой предрасположенности алкилгликозидов к окислению белка в композиции с течением времени.As shown in FIG. 16, the oxidation of sensitive amino acids (Trp, Met) induced by Fenton’s reagent in monoclonal anti-CD22 is inhibited in solutions containing n-octyl-β-D-glucopyranoside compared to solutions containing polysorbate 20 and is comparable to solutions that do not contain surfactants. Thus, these data show that the use of alkyl glycosides as protein stabilizing agents in aqueous compositions may be preferred over polysorbate 20 due to the relatively low susceptibility of alkyl glycosides to protein oxidation in the composition over time.

Пример 3: Изучение алкилгликозидов в качестве неионных поверхностно-активных веществ для предотвращения вызываемого светом окисления остатков триптофана в белках/антителахExample 3: Study of alkyl glycosides as nonionic surfactants to prevent light-induced oxidation of tryptophan residues in proteins / antibodies

В данном примере проиллюстрировано применение алкилгликозидов в качестве неионных поверхностно-активных веществ для предотвращения вызываемого светом окисления остатков триптофана в белках/антителах в водном растворе.This example illustrates the use of alkyl glycosides as nonionic surfactants to prevent light-induced oxidation of tryptophan residues in proteins / antibodies in an aqueous solution.

Все приведенные ниже эксперименты проводили следующим образом.All of the experiments below were performed as follows.

Образцы моноклональных антител и обработка светом: гуманизированное противоокислительное моноклональное антитело LDL получали от Genentech, Inc. из клеточной линии CHO. Было подготовлено три независимых образца для изучения светоустойчивости: 1) контрольный образец, флакон, обернутый алюминиевой фольгой; 2) тестовый образец, подверженный воздействию света флакон (необернутый); 3) тестовый образец, подверженный воздействию света флакон (необернутый), содержащий заданное неионное поверхностно-активное вещество. Контрольный и подверженные воздействию света образцы хранили на световой панели в течение 24 ч. Воздействие света соответствовало руководству ICH со следующими настройками для световой панели Atlas SUNTEST CPS+: уровень освещенности=250 Вт/м2; настройка времени 24 ч; суммарная УФ-доза=538 Вт·ч/м2; суммарная видимая доза=1320000 лк·ч.Monoclonal Antibody Samples and Light Treatment: Humanized Antioxidant Monoclonal Antibody LDL Received from Genentech, Inc. from the CHO cell line. Three independent samples were prepared for studying light fastness: 1) a control sample, a bottle wrapped in aluminum foil; 2) test sample exposed to light vial (non-wrapped); 3) a test sample exposed to light a vial (non-wrapped) containing a predetermined non-ionic surfactant. The control and light-exposed samples were stored on the light panel for 24 hours. The light exposure was in accordance with ICH guidelines with the following settings for the Atlas SUNTEST CPS + light panel: light level = 250 W / m 2 ; time setting 24 hours; total UV dose = 538 W · h / m 2 ; total apparent dose = 1320000 lux · h.

ЖХ/МС/МС трипсиновой пептидной карты моноклонального антитела: образцы расщепляли трипсином после восстановления и алкилирования. Полученные в результате пептиды анализировали на масс-спектрометре Thermo LTQ-Orbitrap, соединенном с капиллярной ВЭЖХ-системой Agilent 1200. ВЭЖХ-колонка: Jupiter 5мкм C18 250×1,0 мм, скорость потока: 70 мкл/мин, температура термостата колонки: 55°C. Растворитель A: 0,1% TFA в воде, B: 0,09% TFA в 90% ACN. Настройки Orbitrap: разрешение MS 60000, MS/MS собирали в режиме зависимости от данных с использованием LTQ.LC / MS / MS trypsin peptide map of the monoclonal antibody: samples were digested with trypsin after reduction and alkylation. The resulting peptides were analyzed on a Thermo LTQ-Orbitrap mass spectrometer coupled to an Agilent 1200 capillary HPLC system. HPLC column: Jupiter 5 μm C18 250 × 1.0 mm, flow rate: 70 μl / min, column thermostat temperature: 55 ° C. Solvent A: 0.1% TFA in water, B: 0.09% TFA in 90% ACN. Orbitrap settings: resolution MS 60000, MS / MS was collected in data dependent mode using LTQ.

Измерения флуоресценции: присущий триптофану спектр флуоресцентного излучения растворов получали с использованием спектрофлуориметра Horiba Jobin Yvon Fluoromax-4 (Edison, NJ), оборудованного водяной баней с регулируемой температурой. Спектр излучения триптофана получали в диапазоне от 300 до 450 нм после возбуждения при 295 нм.Fluorescence measurements: the tryptophan-specific fluorescence emission spectrum of solutions was obtained using a Horiba Jobin Yvon Fluoromax-4 spectrofluorimeter (Edison, NJ) equipped with a temperature-controlled water bath. The emission spectrum of tryptophan was obtained in the range from 300 to 450 nm after excitation at 295 nm.

Определяли влияние света и защитный эффект неионных поверхностно-активных веществ относительно окисления остатков триптофана в противоокислительном антителе LDL. Протестированное антитело содержало остатки триптофана в положениях 33 (то есть Trp33) и 92 (то есть Trp92), и процент вызываемого светом окисления в этих местах определяли, как описано выше; результаты этих анализов показаны в табл. 2.The influence of light and the protective effect of nonionic surfactants with respect to the oxidation of tryptophan residues in the antioxidant antibody LDL were determined. The tested antibody contained tryptophan residues at positions 33 (i.e., Trp33) and 92 (i.e., Trp92), and the percentage of light-induced oxidation at these sites was determined as described above; the results of these analyzes are shown in table. 2.

Таблица 2table 2 Условия/поверхностно-активное веществоConditions / Surfactant % окисленного Trp33% oxidized Trp33 % окисленного Trp92% oxidized Trp92 Нет света/отсутствует поверхностно-активное веществоNo light / no surfactant 0,0%0,0% 0,6%0.6% Свет/отсутствует поверхностно-активное веществоLight / no surfactant 0,3%0.3% 6,0%6.0% Свет/0,39 мМ н-гексил-β-D-глюкопиранозидаLight / 0.39 mM n-hexyl-β-D-glucopyranoside 0,3%0.3% 4,9%4.9%

Свет/300 мМ н-гексил-β-D-глюкопиранозидаLight / 300 mM n-hexyl-β-D-glucopyranoside 0,0%0,0% 1,6%1.6% Свет/0,39 мМ н-гексил-β-D-мальтопиранозидаLight / 0.39 mM n-hexyl-β-D-maltopyranoside 0,3%0.3% 5,7%5.7% Свет/300 мМ н-гексил-β-D-мальтопиранозидаLight / 300 mM n-hexyl-β-D-maltopyranoside 0,0%0,0% 2,2%2.2% Свет/0,03 мМ н-додецил-β-D-мальтопиранозидаLight / 0.03 mM n-dodecyl-β-D-maltopyranoside 0,0%0,0% 10,6%10.6% Свет/0,39 мМ н-додецил-β-D-мальтопиранозидаLight / 0.39 mM n-dodecyl-β-D-maltopyranoside 0,1%0.1% 2,7%2.7% Свет/0,03 мМ н-додецил-β-D-глюкопиранозидаLight / 0.03 mM n-dodecyl-β-D-glucopyranoside 0,4%0.4% 8,9%8.9% Свет/0,02% полисорбат 20Light / 0.02% Polysorbate 20 0,6%0.6% 8,9%8.9%

Выводыfindings

Алкилгликозиды, имеющие значения CMC около 1 мМ или более, придают стабильность против вызванной перемешиванием агрегации белков, включая моноклональные антитела.Alkyl glycosides having CMC values of about 1 mM or more confer stability against agitation-induced protein aggregation, including monoclonal antibodies.

Стабильность против вызванной перемешиванием агрегации, придаваемая алкилгликозидами, имеющими значения CMC около 1 мМ или более, не зависит от антитела в том отношении, что благоприятный эффект наблюдается с различным антителами различных аминокислотных последовательностей.Stability against agitation-induced aggregation imparted by alkyl glycosides having a CMC value of about 1 mM or more is independent of the antibody in that a beneficial effect is observed with different antibodies of different amino acid sequences.

Как ни странно, стабильность относительно вызванной перемешиванием агрегации, придаваемая алкилгликозидами, имеющими значения CMC около 1 мМ или более, наблюдается, когда алкилгликозид используется в концентрации, которая меньше его соответствующего значения CMC.Oddly enough, stability with respect to stirring-induced aggregation imparted by alkyl glycosides having a CMC value of about 1 mM or more is observed when the alkyl glycoside is used at a concentration that is less than its corresponding CMC value.

В отличие от полисорбата 20, алкилгликозиды, имеющие значения CMC около 1 мМ или более, не образуют пероксид водорода после хранения в течение длительного периода времени.Unlike polysorbate 20, alkyl glycosides having CMC values of about 1 mM or more do not form hydrogen peroxide after storage for a long period of time.

В отличие от полисорбата 20, алкилгликозиды, имеющие значения CMC около 1 мМ или более, не вызывают значительного окисления подверженных окислению аминокислот в различных моноклональных антителах.Unlike polysorbate 20, alkyl glycosides having CMC values of about 1 mM or more do not significantly oxidize the oxidized amino acids in various monoclonal antibodies.

В отличие от полисорбата 20, алкилгликозиды, имеющие значения CMC около 1 мМ или более, способны подавлять или снижать количество вызываемого светом окисления остатков триптофана в антителах и других белках, особенно при использовании в концентрации, которая выше соответствующих им значений CMC.Unlike polysorbate 20, alkyl glycosides having CMC values of about 1 mM or more are able to suppress or reduce the amount of light-induced oxidation of tryptophan residues in antibodies and other proteins, especially when used at a concentration that is higher than their corresponding CMC values.

Claims (33)

1. Водная композиция, содержащая антитело и алкилгликозид, имеющий значение CMC около 1,0 мМ или более в воде при 25°C, где алкилгликозид присутствует в концентрации, которая меньше значения CMC алкилгликозида в воде при 25°C. 1. An aqueous composition comprising an antibody and an alkyl glycoside having a CMC value of about 1.0 mM or more in water at 25 ° C, where the alkyl glycoside is present in a concentration that is less than the CMC value of the alkyl glycoside in water at 25 ° C. 2. Композиция по п. 1, в которой антитело представляет собой моноклональное антитело.2. The composition of claim 1, wherein the antibody is a monoclonal antibody. 3. Композиция по п. 1 или 2, в которой алкилгликозид выбран из группы, состоящей из н-гексил-β-D-глюкопиранозида, н-гептил-β-D-глюкопиранозида, н-октил-β-D-глюкопиранозида, н-нонил-β-D-глюкопиранозида, н-децил-β-D-глюкопиранозида, 3-циклогексил-1-пропил-β-D-глюкозида, 3-циклогексил-1-бутил-β-D-глюкозида, н-гексил-β-D-мальтопиранозида, н-октил-β-D-мальтопиранозида, н-нонил-β-D-мальтопиранозида, н-децил-β-D-мальтопиранозида, циклогексилметил-β-D-мальтозида, 2-циклогексилэтил-β-D-мальтозида, 3-циклогексилпропил-β-D-мальтозида, 4-циклогексилбутил-β-D-мальтозида и 5-циклогексилпентил-β-D-мальтозида. 3. The composition of claim 1 or 2, wherein the alkyl glycoside is selected from the group consisting of n-hexyl-β-D-glucopyranoside, n-heptyl-β-D-glucopyranoside, n-octyl-β-D-glucopyranoside, n nonyl-β-D-glucopyranoside, n-decyl-β-D-glucopyranoside, 3-cyclohexyl-1-propyl-β-D-glucoside, 3-cyclohexyl-1-butyl-β-D-glucoside, n-hexyl β-D-maltopyranoside, n-octyl-β-D-maltopyranoside, n-nonyl-β-D-maltopyranoside, n-decyl-β-D-maltopyranoside, cyclohexylmethyl-β-D-maltoside, 2-cyclohexylethyl-β -D-maltoside, 3-cyclohexylpropyl-β-D-maltoside, 4-cyclohexylbutyl-β-D-maltoside and 5-c klogeksilpentil-β-D-maltoside. 4. Композиция по п. 3, в которой алкилгликозид представляет собой н-октил-β-D-глюкопиранозид.4. The composition of claim 3, wherein the alkyl glycoside is n-octyl-β-D-glucopyranoside. 5. Композиция по п. 3, в которой алкилгликозид представляет собой н-децил-β-D-глюкопиранозид.5. The composition of claim 3, wherein the alkyl glycoside is n-decyl-β-D-glucopyranoside. 6. Композиция по п. 3, в которой алкилгликозид представляет собой н-децил-β-D-мальтопиранозид.6. The composition of claim 3, wherein the alkyl glycoside is n-decyl-β-D-maltopyranoside. 7. Композиция по п. 3, в которой алкилгликозид представляет собой н-гексил-β-D-глюкопиранозид.7. The composition of claim 3, wherein the alkyl glycoside is n-hexyl-β-D-glucopyranoside. 8. Композиция по п. 1 или 2, содержащая количество указанного алкилгликозида, ингибирующее агрегацию, вызванную перемешиванием.8. The composition according to p. 1 or 2, containing an amount of the specified alkyl glycoside, inhibiting aggregation caused by stirring. 9. Композиция по п. 1 или 2, содержащая количество указанного алкилгликозида, предотвращающее окисление.9. The composition according to p. 1 or 2, containing an amount of the specified alkyl glycoside, preventing oxidation. 10. Композиция по п. 1 или 2, которая является стабильной при температуре около 2-8°C в течение по меньшей мере одного года.10. The composition according to p. 1 or 2, which is stable at a temperature of about 2-8 ° C for at least one year. 11. Композиция по п. 1 или 2, которая является стабильной при температуре около 30°C в течение по меньшей мере одного месяца.11. The composition according to p. 1 or 2, which is stable at a temperature of about 30 ° C for at least one month. 12. Композиция по п. 1 или 2, которая является нелиофилизированной и не подвергалась предшествующей лиофилизации.12. The composition according to p. 1 or 2, which is non-lyophilized and has not undergone previous lyophilization. 13. Композиция по п. 1 или 2, которая представляет собой ресуспендированный лиофилизированный состав.13. The composition according to p. 1 or 2, which is a resuspended lyophilized composition. 14. Композиция по п. 1 или 2, в которой антитело подвержено агрегации.14. The composition according to p. 1 or 2, in which the antibody is subject to aggregation. 15. Композиция по п. 1 или 2, в которой антитело подвержено окислению.15. The composition according to p. 1 or 2, in which the antibody is susceptible to oxidation. 16. Способ ингибирования агрегации антитела,, присутствующего в первом водном растворе, где агрегация вызвана перемешиванием, включающий стадию добавления к указанному первому водному раствору количества алкилгликозида, ингибирующего агрегацию, вызванную перемешиванием, при этом алкилгликозид имеет значение CMC около 1,0 мМ или более в воде при 25°C, где алкилгликозид добавляют до конечной концентрации, которая меньше значения CMC алкилгликозида в воде при 25°C, обеспечивая, таким образом, второй водный раствор.16. A method of inhibiting the aggregation of antibodies present in the first aqueous solution, where the aggregation is caused by stirring, comprising the step of adding to the specified first aqueous solution an amount of an alkyl glycoside inhibiting aggregation caused by stirring, wherein the alkyl glycoside has a CMC value of about 1.0 mM or more in water at 25 ° C, where the alkyl glycoside is added to a final concentration that is less than the CMC value of the alkyl glycoside in water at 25 ° C, thus providing a second aqueous solution. 17. Способ по п. 16, в котором антитело представляет собой моноклональное антитело.17. The method of claim 16, wherein the antibody is a monoclonal antibody. 18. Способ по п. 16 или 17, в котором алкилгликозид выбран из группы, состоящей из н-гексил-β-D-глюкопиранозида, н-гептил-β-D-глюкопиранозида, н-октил-β-D-глюкопиранозида, н-нонил-β-D-глюкопиранозида, н-децил-β-D-глюкопиранозида, 3-циклогексил-1-пропил-β-D-глюкозида, 3-циклогексил-1-бутил-β-D-глюкозида, н-гексил-β-D-мальтопиранозида, н-октил-β-D-мальтопиранозида, н-нонил-β-D-мальтопиранозида, н-децил-β-D-мальтопиранозида, циклогексилметил-β-D-мальтозида, 2-циклогексилэтил-β-D-мальтозида, 3-циклогексилпропил-β-D-мальтозида, 4-циклогексилбутил-β-D-мальтозида и 5-циклогексилпентил-β-D-мальтозида.18. The method of claim 16 or 17, wherein the alkyl glycoside is selected from the group consisting of n-hexyl-β-D-glucopyranoside, n-heptyl-β-D-glucopyranoside, n-octyl-β-D-glucopyranoside, n nonyl-β-D-glucopyranoside, n-decyl-β-D-glucopyranoside, 3-cyclohexyl-1-propyl-β-D-glucoside, 3-cyclohexyl-1-butyl-β-D-glucoside, n-hexyl β-D-maltopyranoside, n-octyl-β-D-maltopyranoside, n-nonyl-β-D-maltopyranoside, n-decyl-β-D-maltopyranoside, cyclohexylmethyl-β-D-maltoside, 2-cyclohexylethyl-β -D-maltoside, 3-cyclohexylpropyl-β-D-maltoside, 4-cyclohexylbutyl-β-D-maltoside and 5-cycle ohexylpentyl-β-D-maltoside. 19. Способ по п. 18, в котором алкилгликозид представляет собой н-октил-β-D-глюкопиранозид.19. The method of claim 18, wherein the alkyl glycoside is n-octyl-β-D-glucopyranoside. 20. Способ по п. 18, в котором алкилгликозид представляет собой н-децил-β-D-глюкопиранозид.20. The method of claim 18, wherein the alkyl glycoside is n-decyl-β-D-glucopyranoside. 21. Способ по п. 18, в котором алкилгликозид представляет собой н-децил-β-D-мальтопиранозид.21. The method of claim 18, wherein the alkyl glycoside is n-decyl-β-D-maltopyranoside. 22. Способ по п. 18, в котором алкилгликозид представляет собой н-гексил-β-D-глюкопиранозид.22. The method of claim 18, wherein the alkyl glycoside is n-hexyl-β-D-glucopyranoside. 23. Способ по п. 16 или 17, включающий дополнительную стадию лиофилизации указанного второго водного раствора.23. The method according to p. 16 or 17, comprising an additional stage of lyophilization of the specified second aqueous solution. 24. Способ предотвращения окисления антитела, присутствующего в первом водном растворе, включающий стадию добавления к указанному первому водному раствору количества алкилгликозида, предотвращающего окисление, при этом алкилгликозид имеет значение CMC около 1,0 мМ или более в воде при 25°C, где алкилгликозид добавляют до конечной концентрации, которая меньше значения CMC алкилгликозида в воде при 25°C, обеспечивая, таким образом, второй водный раствор.24. A method for preventing oxidation of an antibody present in a first aqueous solution, comprising the step of adding to the first aqueous solution an amount of an anti-oxidation alkyl glycoside, wherein the alkyl glycoside has a CMC value of about 1.0 mM or more in water at 25 ° C., where the alkyl glycoside is added to a final concentration that is less than the CMC value of the alkyl glycoside in water at 25 ° C, thus providing a second aqueous solution. 25. Способ по п. 24, в котором антитело представляет собой моноклональное антитело.25. The method of claim 24, wherein the antibody is a monoclonal antibody. 26. Способ по п. 24 или 25, в котором алкилгликозид выбран из группы, состоящей из н-гексил-β-D-глюкопиранозида, н-гептил-β-D-глюкопиранозида, н-октил-β-D-глюкопиранозида, н-нонил-β-D-глюкопиранозида, н-децил-β-D-глюкопиранозида, 3-циклогексил-1-пропил-β-D-глюкозида, 3-циклогексил-1-бутил-β-D-глюкозида, н-гексил-β-D-мальтопиранозида, н-октил-β-D-мальтопиранозида, н-нонил-β-D-мальтопиранозида, н-децил-β-D-мальтопиранозида, циклогексилметил-β-D-мальтозида, 2-циклогексилэтил-β-D-мальтозида, 3-циклогексилпропил-β-D-мальтозида, 4-циклогексилбутил-β-D-мальтозида и 5-циклогексилпентил-β-D-мальтозида.26. The method according to p. 24 or 25, in which the alkyl glycoside is selected from the group consisting of n-hexyl-β-D-glucopyranoside, n-heptyl-β-D-glucopyranoside, n-octyl-β-D-glucopyranoside, n nonyl-β-D-glucopyranoside, n-decyl-β-D-glucopyranoside, 3-cyclohexyl-1-propyl-β-D-glucoside, 3-cyclohexyl-1-butyl-β-D-glucoside, n-hexyl β-D-maltopyranoside, n-octyl-β-D-maltopyranoside, n-nonyl-β-D-maltopyranoside, n-decyl-β-D-maltopyranoside, cyclohexylmethyl-β-D-maltoside, 2-cyclohexylethyl-β -D-maltoside, 3-cyclohexylpropyl-β-D-maltoside, 4-cyclohexylbutyl-β-D-maltoside and 5-cycle ohexylpentyl-β-D-maltoside. 27. Способ по п. 26, в котором алкилгликозид представляет собой н-октил-β-D-глюкопиранозид.27. The method of claim 26, wherein the alkyl glycoside is n-octyl-β-D-glucopyranoside. 28. Способ по п. 26, в котором алкилгликозид представляет собой н-децил-β-D-глюкопиранозид.28. The method of claim 26, wherein the alkyl glycoside is n-decyl-β-D-glucopyranoside. 29. Способ по п. 26, в котором алкилгликозид представляет собой н-децил-β-D-мальтопиранозид.29. The method of claim 26, wherein the alkyl glycoside is n-decyl-β-D-maltopyranoside. 30. Способ по п. 26, в котором алкилгликозид представляет собой н-гексил-β-D-глюкопиранозид.30. The method of claim 26, wherein the alkyl glycoside is n-hexyl-β-D-glucopyranoside. 31. Способ по п. 24 или 25, включающий дополнительную стадию лиофилизации указанного второго водного раствора.31. The method according to p. 24 or 25, comprising an additional stage of lyophilization of the specified second aqueous solution. 32. Способ по п. 24 или 25, в котором указанное окисление представляет собой вызываемое светом окисление.32. The method of claim 24 or 25, wherein said oxidation is light-induced oxidation. 33. Способ по п. 32, в котором вызываемое светом окисление имеет место для остатков триптофана в указанном антителе. 33. The method of claim 32, wherein the light-induced oxidation occurs for tryptophan residues in said antibody.
RU2013103025/15A 2010-06-24 2011-06-23 Compositions and methods, including alkylglycosides, for stabilisation of protein-containing compositions RU2575830C2 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35810510P 2010-06-24 2010-06-24
US61/358,105 2010-06-24
PCT/US2011/041598 WO2011163458A2 (en) 2010-06-24 2011-06-23 Compositions and methods for stabilizing protein-containing formulations

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2013103025A RU2013103025A (en) 2014-07-27
RU2575830C2 true RU2575830C2 (en) 2016-02-20

Family

ID=

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007149096A1 (en) * 2006-06-23 2007-12-27 Aegis Therapeutics, Inc. Stabilizing alkylglycoside compositions and methods thereof
WO2008012062A1 (en) * 2006-07-24 2008-01-31 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Antigenic proteoliposomes and method of manufacture

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007149096A1 (en) * 2006-06-23 2007-12-27 Aegis Therapeutics, Inc. Stabilizing alkylglycoside compositions and methods thereof
WO2008012062A1 (en) * 2006-07-24 2008-01-31 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Antigenic proteoliposomes and method of manufacture

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GRUNE T et al, Degradation of oxidized proteins in mammalian cells. The FASEB Journal, 1997 June, vol.11, pp.526-534. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11938189B2 (en) Compositions and methods for stabilizing protein-containing formulations
JP6791929B2 (en) Compositions and Methods Useful for Stabilizing Protein-Containing Formulations
KR20210145152A (en) Compositions and methods for stabilization of protein-containing formulations
RU2575830C2 (en) Compositions and methods, including alkylglycosides, for stabilisation of protein-containing compositions