RU2575616C2 - Enzymic hydrolysis of cellulose - Google Patents

Abstract

FIELD: bioengineering.

SUBSTANCE: cellulose biomass containing at least 10 wt % of solid products is added to the reactor operating in steady-state condition. Enzymes specifically hydrolysing the cellulose are added to the said reactor. During the enzymic hydrolysis the steady-state condition is ensured, during it the cellulose biomass is continuously added to the reactor, and partially hydrolysed biomass with maximum viscosity 25 Pa·s is continuously removed from the reactor. Under the preferable option the method is executed in cascade containing at least two reactors. Besides the method of production of monosaccharides, chemicals based on sugar, biologic fuels or materials with sulphonated ligninis suggested. Preliminary the lignocellulosic biomass is treated at stage of the sulphite pulping. The produced biomass is divided to the liquid phase containing 50 wt % or over of the sulphonated ligninis, and to pulp containing 70 wt % or over of cellulose. By the method of continuous hydrolysis the pulp is hydrolysed to at least partially hydrolysed biomass containing monosaccharides. The monosaccharide and the sulphonated ligninis are processed with production of the useful chemicals, biologic fuels and/or proteins.

EFFECT: inventions ensure hydrolysis of the cellulosic biomass at high loads of solid substances in steady-state condition with high yield of glucose and xylose with use of only common mixing.

13 cl, 6 dwg, 3 ex

Description

Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к непрерывному способу ферментативного гидролиза целлюлозной биомассы. Улучшенный гидролиз в соответствии с настоящим изобретением, в частности пригоден для использования, в преобразовании биомассы для целлюлозы, в целом, то есть в способе преобразования целлюлозной биомассы в полезные химические вещества или продукты, например, в биологические топлива.The present invention relates to a continuous process for the enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass. The improved hydrolysis in accordance with the present invention is particularly suitable for use in converting biomass to cellulose, in general, that is, to a method for converting cellulosic biomass to useful chemicals or products, for example, to biofuels.

В одном из вариантов осуществления, настоящее изобретение относится к способу непрерывного гидролиза целлюлозной биомассы, включающему, по меньшей мере, следующие стадии:In one of the embodiments, the present invention relates to a method for the continuous hydrolysis of cellulosic biomass, comprising at least the following stages:

(P) обеспечения, по меньшей мере, одного реактора, который может быть работать в стационарном состоянии;(P) providing at least one reactor that can be stationary;

(A) добавления заданного количества целлюлозной биомассы в указанный реактор, при этом указанная целлюлозная биомасса имеет содержание твердых веществ, по меньшей мере, 10%, предпочтительно, по меньшей мере, 15%, предпочтительно, по меньшей мере, 20%, предпочтительно, по меньшей мере, 25%, более предпочтительно, по меньшей мере, 30%; более предпочтительно, 10%-45%, более предпочтительно, 15%-45%, более предпочтительно, 20%-40% или от 15% до 30%;(A) adding a predetermined amount of cellulosic biomass to said reactor, said cellulosic biomass having a solids content of at least 10%, preferably at least 15%, preferably at least 20%, preferably according to at least 25%, more preferably at least 30%; more preferably 10% -45%, more preferably 15% -45%, more preferably 20% -40%, or 15% to 30%;

(Α') добавления заданного количества ферментов в указанный реактор;(Α ') adding a predetermined amount of enzymes to said reactor;

(E) осуществления, по меньшей мере, частичного ферментативного гидролиза целлюлозной биомассы в указанном реакторе.(E) the implementation of at least partial enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass in the specified reactor.

В указанном способе достигается стационарное состояние, при котором целлюлозная биомасса непрерывно добавляется в указанный реактор, в то время как, по меньшей мере, частично гидролизованная целлюлозная биомасса непрерывно удаляется из указанного реактора, при этом указанная, по меньшей мере, частично гидролизованная целлюлозная биомасса, которую непрерывно удаляют, имеет вязкость, как измерено на реометре Physica MCR 101 в чашке с мешалкой (FL 100/6W), не больше чем 25 Па·с (паскаль-секунда), предпочтительно, не более чем 10 Па·с, предпочтительно, не более чем 5 Па·с, более предпочтительно, не более чем 3 Па·с, более предпочтительно, не более чем 1 Па·с.In this method, a stationary state is achieved in which the cellulosic biomass is continuously added to said reactor, while at least partially hydrolyzed cellulosic biomass is continuously removed from said reactor, wherein said at least partially hydrolyzed cellulosic biomass, which continuously removed, has a viscosity, as measured on a Physica MCR 101 rheometer in a cup with stirrer (FL 100 / 6W), not more than 25 Pa · s (pascal second), preferably not more than 10 Pa · s, preferably not b more than 5 Pa · s, more preferably not more than 3 Pa · s, more preferably not more than 1 Pa · s.

Вязкость измеряют при стандартных условиях (20°C, 1 бар). Специалист в данной области найдет дополнительную информацию относительно того, как измерять указанную вязкость, в Примере, приведенном в настоящей заявке.Viscosity is measured under standard conditions (20 ° C, 1 bar). The person skilled in the art will find further information on how to measure the indicated viscosity in the Example given in this application.

Предпочтительно, в указанном стационарном состоянии, указанная вязкость остается в основном постоянной или остается в основном ниже любого из описанных выше значений для вязкости в течение продолжительного периода времени, например, в течение 2 часов, 4 часов, 6 часов, 12 часов или более.Preferably, in said stationary state, said viscosity remains substantially constant or remains substantially below any of the above values for viscosity for an extended period of time, for example, for 2 hours, 4 hours, 6 hours, 12 hours or more.

Целью установления стационарного состояния в указанном реакторе является предоставление возможности для гидролиза целлюлозной биомассы, имеющей сравнительно высокое содержание твердых веществ. Желательно осуществлять ферментативный гидролиз при высоких нагрузках твердых веществ, предпочтительно, при общем содержании твердых веществ ("TS") 10% или выше, в частности, с точки зрения окружающей среды и экономики, поскольку это уменьшает потребление воды и энергии, а также стоимость капиталовложений в оборудование. Однако одной из проблем при гидролизе целлюлозной биомассы с высоким содержанием твердых веществ является достижение достаточного перемешивания при условиях высокой вязкости суспензии с высоким содержанием твердых веществ. Обычно, в частности, в загрузочных способах, известных в данной области, перемешивание возможно только при использовании энергоемкого и конструктивно сложного оборудования.The purpose of establishing a stationary state in the specified reactor is to provide opportunities for the hydrolysis of cellulosic biomass having a relatively high solids content. It is desirable to carry out enzymatic hydrolysis at high solids loads, preferably with a total solids content ("TS") of 10% or higher, in particular from the point of view of the environment and the economy, as this reduces the consumption of water and energy, as well as the cost of investment into equipment. However, one of the problems in the hydrolysis of cellulosic biomass with a high solids content is to achieve sufficient mixing under conditions of high viscosity of a suspension with a high solids content. Usually, in particular, in the boot methods known in this field, mixing is possible only when using energy-intensive and structurally complex equipment.

В соответствии с настоящим изобретением, в указанном реакторе достигается реакция гидролиза в стационарном состоянии. При этом, целлюлозную биомассу с высоким содержанием твердых веществ в целом (предпочтительно, 10% или выше, более предпочтительно, в пределах между 15 и 40%) непрерывно добавляют в указанный реактор, в то время как, по меньшей мере, частично гидролизованную целлюлозную биомассу непрерывно удаляют из указанного реактора. Устанавливают стационарное состояние, то есть регулируют количество добавляемой целлюлозной биомассы и регулируют количество, по меньшей мере, частично гидролизованной удаляемой целлюлозной биомассы, так что среднее время удерживания целлюлозной биомассы в реакторе больше, чем соответствующее среднее "время ожижения", то есть период времени, необходимый для преобразования суспензии твердых веществ в прокачиваемую жидкость в течение гидролиза, то есть время, необходимое для понижения вязкости суспензии до значения, которое является приемлемым для дальнейшей переработки.In accordance with the present invention, a hydrolysis reaction in a stationary state is achieved in said reactor. In this case, cellulosic biomass with a high solids content in general (preferably 10% or higher, more preferably between 15 and 40%) is continuously added to said reactor, while at least partially hydrolyzed cellulosic biomass continuously removed from the specified reactor. The steady state is established, that is, the amount of added cellulosic biomass is added and the amount of at least partially hydrolyzed removed cellulosic biomass is adjusted, so that the average retention time of the cellulosic biomass in the reactor is longer than the corresponding average “liquefaction time”, i.e. to convert a suspension of solids into a pumped liquid during hydrolysis, that is, the time required to lower the viscosity of the suspension to a value that is acceptable for further processing.

В соответствии с настоящим изобретением, это "время ожижения" соответствующим образом описывается с помощью вязкости, по меньшей мере, частично гидролизованной целлюлозной биомассы, которую непрерывно удаляют из реактора. Указанная вязкость, как измерено на реометре Physica MCR 101 в чашке с мешалкой (FL 100/6W), составляет не более чем 25 Па·с (паскаль-секунда), предпочтительно, не более чем 10 Па·с, предпочтительно, не более чем 5 Па·с, более предпочтительно, не более чем 3 Па·с, более предпочтительно, не более чем 1 Па·с.In accordance with the present invention, this “liquefaction time" is appropriately described using the viscosity of at least partially hydrolyzed cellulosic biomass, which is continuously removed from the reactor. The specified viscosity, as measured on a Physica MCR 101 rheometer in a cup with stirrer (FL 100 / 6W), is not more than 25 Pa · s (pascal-second), preferably not more than 10 Pa · s, preferably not more than 5 Pa · s, more preferably not more than 3 Pa · s, more preferably not more than 1 Pa · s.

В предпочтительном варианте осуществления, в соответствии с которым увеличивается выход глюкозы для способа в целом, способ непрерывного гидролиза целлюлозной биомассы осуществляют в каскаде, по меньшей мере, из двух реакторов, то есть стадия (P) представляет собой:In a preferred embodiment, in which the glucose yield is increased for the process as a whole, the process for the continuous hydrolysis of cellulosic biomass is carried out in a cascade of at least two reactors, i.e., step (P) is:

(P) обеспечение каскада, по меньшей мере, из двух реакторов, которые могут работать в стационарном состоянии.(P) providing a cascade of at least two reactors that can operate in a stationary state.

В предпочтительном варианте осуществления, указанный способ непрерывного гидролиза целлюлозной биомассы включает, по меньшей мере, следующие стадии:In a preferred embodiment, said method for the continuous hydrolysis of cellulosic biomass comprises at least the following steps:

(P) обеспечения каскада по меньшей мере из двух реакторов, которые могут работать в стационарном состоянии;(P) providing a cascade of at least two reactors that can operate in a stationary state;

(A) добавления заданного количества целлюлозной биомассы в первый реактор, при этом указанная целлюлозная биомасса имеет содержание твердых веществ, по меньшей мере, 10%, предпочтительно, по меньшей мере, 15%, предпочтительно, по меньшей мере, 20%, предпочтительно, по меньшей мере, 25%, более предпочтительно, по меньшей мере, 30%, более предпочтительно, 10%-45%, более предпочтительно, 15%-45%, более предпочтительно, 20%-40% или от 15% до 30%;(A) adding a predetermined amount of cellulosic biomass to the first reactor, said cellulosic biomass having a solids content of at least 10%, preferably at least 15%, preferably at least 20%, preferably at least 25%, more preferably at least 30%, more preferably 10% -45%, more preferably 15% -45%, more preferably 20% -40% or 15% to 30%;

(Α') добавления заданного количества ферментов в указанный первый реактор(Α ') adding a predetermined amount of enzymes to said first reactor

(E) осуществления частичного ферментативного гидролиза целлюлозной биомассы в указанном первом реакторе,(E) performing partial enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass in said first reactor,

(T) непрерывного удаления частично гидролизованной целлюлозной биомассы со стадии (E1), которая имеет вязкость, как измерено на реометре Physica MCR 101 в чашке с мешалкой (FL 100/6W), не более чем 25 Па·с (паскаль-секунда), предпочтительно, не более чем 10 Па·с, предпочтительно, не более чем 5 Па·с, более предпочтительно, не более чем 3 Па·с, более предпочтительно, не более чем 1 Па·с, и переноса ее во второй реактор, который может работать в стационарном состоянии;(T) continuously removing partially hydrolyzed cellulosic biomass from step (E1), which has a viscosity, as measured on a Physica MCR 101 rheometer in a stirrer plate (FL 100 / 6W), of not more than 25 Pa · s (pascal second), preferably not more than 10 Pa · s, preferably not more than 5 Pa · s, more preferably not more than 3 Pa · s, more preferably not more than 1 Pa · s, and transferring it to a second reactor, which can work in a stationary state;

(Ε') осуществления дополнительного ферментативного гидролиза на частично гидролизованной целлюлозной биомассе со стадии (E) в указанном втором реакторе.(Ε ') the implementation of additional enzymatic hydrolysis on partially hydrolyzed cellulosic biomass from stage (E) in the specified second reactor.

Предыдущий уровень техникиPrior art

Как принято считать повсеместно, ресурсы химических веществ на основе нефти и самой нефти, используемой как (ископаемое) топливо, ограничены. Один из используемых в настоящее время альтернативных ресурсов представляет собой "биологическое топливо", как получают из биомассы. Можно использовать различные источники биомассы.It is generally accepted that the resources of chemicals based on oil and the oil itself used as (fossil) fuel are limited. One of the currently used alternative resources is “biofuel”, as obtained from biomass. You can use various sources of biomass.

"Биологические топлива первого поколения" представляют собой биологические топлива, полученные из сахара, крахмала, растительного масла или животных жиров с использованием обычной технологии. Иллюстративный основной исходный материал для получения биологических топлив первого поколения представляет собой семена или зерна, такие как пшеница, которая дает крахмал, который гидролизуют и ферментируют в биоэтанол, или семена подсолнечника, которые отжимают с получением растительного масла, которое может быть преобразовано в биодизельное топливо. Однако эти исходные материалы могут, вместо этого, поступать в пищевую цепочку животных или людей. По этой причине, биологические топлива первого поколения критикуют за изъятие пищевых продуктов из пищевой цепочки человека, что приводит к недостатку продовольствия и росту цен.“First generation biofuels” are biofuels derived from sugar, starch, vegetable oil or animal fats using conventional technology. An illustrative primary source material for producing first generation biological fuels is seeds or grains, such as wheat, which produces starch, which is hydrolyzed and fermented into bioethanol, or sunflower seeds, which are squeezed to produce vegetable oil, which can be converted to biodiesel. However, these starting materials may, instead, enter the food chain of animals or humans. For this reason, first-generation biofuels are criticized for removing food from the human food chain, resulting in food shortages and rising prices.

В противоположность этому, "биологическое топливо второго поколения" может производиться постоянно с использованием биомассы, состоящей из остатков, не употребляемых в пищу (то есть не перевариваемых) частей современных сельскохозяйственных культур, таких как стволы, листья, багасса (волокнистые остатки сахарного тростника), шелуха, и тому подобное, которые остаются после извлечения частей растений, пригодных в пищу, а также другие исходные материалы, которые не используют для пищевых целей (непищевые сельскохозяйственные культуры), такие как древесина, однолетние растения, и зерновые культуры, которые содержат мало зерна, а также промышленные отходы, такие как древесные опилки, кожура и отжимки от отжима фруктов, приготовления вина, и тому подобное.In contrast, “second generation biofuels” can be produced continuously using biomass consisting of leftovers (i.e., non-digestible) parts of modern crops, such as trunks, leaves, bagasse (sugarcane fibrous residues), husks, and the like, which remain after the extraction of parts of plants suitable for food, as well as other starting materials that are not used for food purposes (non-food crops), e as wood, annual plants and cereals that are low in grains, and industrial waste, such as sawdust, paring and scrap obtained from the extraction of fruit, cooking wine, and the like.

Важной стадией в преобразовании биомассы в целом для этого биологического топлива второго поколения представляет собой гидролиз необработанной или предварительно обработанной целлюлозной биомассы до единиц меньших размеров. На указанной стадии гидролиза, цепи целлюлозы разрушают с помощью разрушения, по меньшей мере, одной β-1-4-глюкозидной связи.An important step in the conversion of biomass as a whole for this second-generation biofuel is the hydrolysis of untreated or pre-treated cellulosic biomass to smaller units. In this hydrolysis step, the cellulose chains are broken by breaking at least one β-1-4-glucosidic bond.

Более конкретно, целлюлоза представляет собой нерастворимый линейный полимер из повторяющихся глюкановых единиц, связанных с помощью β-1-4-глюкозидных связей. В воде целлюлоза, обычно, гидролизуется под воздействием электрофильного водорода молекулы воды на гликозидную связь. В цепях целлюлозы каждая единица глюкозы может, в принципе, образовывать три водородных связи с мономерами в соседних цепях, с получением стабильной кристаллической структуры, которую нелегко гидролизовать. Скорость реакции гидролиза может быть повышена при использовании повышенных температур и давлений или может катализироваться с помощью разбавленной или концентрированной кислоты или с помощью ферментов (как в случае настоящего изобретения).More specifically, cellulose is an insoluble linear polymer of repeating glucan units linked via β-1-4-glucosidic bonds. In water, cellulose is usually hydrolyzed under the influence of electrophilic hydrogen of a water molecule on a glycosidic bond. In cellulose chains, each glucose unit can, in principle, form three hydrogen bonds with monomers in adjacent chains, to obtain a stable crystalline structure that is not easily hydrolyzed. The rate of the hydrolysis reaction can be increased by using elevated temperatures and pressures, or it can be catalyzed by dilute or concentrated acid or by enzymes (as in the case of the present invention).

В промышленном масштабе особый интерес представляет гидролиз целлюлозной биомассы с высоким содержанием твердых веществ. Обычно, целлюлозную биомассу, имеющую высокое содержание твердых веществ, гидролизуют с использованием избыточных времен гидролиза, часто достигающих 5-7 дней, иногда используя объединенные установки, где гидролиз и ферментирование осуществляют одновременно.On an industrial scale, hydrolysis of cellulosic biomass with a high solids content is of particular interest. Typically, cellulosic biomass having a high solids content is hydrolyzed using excess hydrolysis times, often reaching 5-7 days, sometimes using combined plants where hydrolysis and fermentation are carried out simultaneously.

US 2009/0209009 относится к ферментативному гидролизу целлюлозы и описывает, что стоимость ферментов может быть уменьшена посредством введения домена связывания с целлюлозой в один из компонентов фермента, необходимого для деградации целлюлозы, а именно бета-глюкозидазы. Для достижения этого, необходимы специфичные агенты для связывания. Этот агент для связывания позволяет ферменту связываться с целлюлозой для обычного рециклирования. Кроме того, реакцию гидролиза осуществляют в специальных реакторах для удерживания твердых веществ, где твердые вещества имеют время удерживания, которое больше чем время удерживания для жидкости.US 2009/0209009 relates to enzymatic hydrolysis of cellulose and describes that the cost of enzymes can be reduced by introducing a binding domain of cellulose into one of the components of the enzyme necessary for cellulose degradation, namely beta-glucosidase. To achieve this, specific binding agents are needed. This binding agent allows the enzyme to bind to cellulose for routine recycling. In addition, the hydrolysis reaction is carried out in special reactors for retaining solids, where the solids have a retention time that is longer than the retention time for the liquid.

WO 2009/14067 описывает загрузочный способ с отделением твердых веществ и разбавлением субстрата, чтобы можно было манипулировать с высокими содержаниями суспендированных твердых веществ в реакторе в целом (TSS).WO 2009/14067 describes a loading process with separation of solids and dilution of the substrate, so that high levels of suspended solids in the reactor as a whole (TSS) can be manipulated.

Статья Brethauer, S.; Wyman, C.E. "Review: Continuous hydrolysis and fermentation for cellulosic ethanol production" Biores. Technol. 2010, 4862 сравнивает загрузочный и непрерывный способы гидролиза и ферментирования в общих терминах, но с ударением на ферментирование. Упоминаемые преимущества включают уменьшение нерабочего времени реактора для очистки и заполнения, что соответствует увеличению объемной производительности, уменьшению размеров реакторов, меньшим капитальным вложениям и упрощению контроля в стационарном состоянии. Данные, представленные в статье, взяты из экспериментов с непрерывным ферментированием.Article Brethauer, S .; Wyman, C.E. "Review: Continuous hydrolysis and fermentation for cellulosic ethanol production" Biores. Technol. 2010, 4862 compares loading and continuous methods of hydrolysis and fermentation in general terms, but with emphasis on fermentation. Mentioned advantages include reducing the reactor’s idle time for cleaning and filling, which corresponds to an increase in volumetric productivity, a reduction in the size of the reactors, lower capital investment and simplified monitoring in a stationary state. The data presented in the article are taken from experiments with continuous fermentation.

Статья Fan, Z.L.; South, C; Lyford, K.; Munsie, J.; van Walsum, P.; Lynd, L. R. "Conversion of paper sludge to ethanol in a semi-continuous solids-fed reactor" Bioprocess Biosyst. Eng. 2003, 93, описывает полунепрерывный реактор, где бумажную пульпу вводят через определенные интервалы в реактор, осуществляющий SSF (= одновременное осахаривание и ферментирование). Авторы наблюдают, что посредством уменьшения частоты введения исходных материалов (добавления исходных материалов за время пребывания), нагрузка целлюлозы может быть уменьшена.Article Fan, Z.L .; South, C; Lyford, K .; Munsie, J .; van Walsum, P .; Lynd, L. R. "Conversion of paper sludge to ethanol in a semi-continuous solids-fed reactor" Bioprocess Biosyst. Eng. 2003, 93, describes a semi-continuous reactor, where paper pulp is introduced at regular intervals into an SSF reactor (= simultaneous saccharification and fermentation). The authors observe that by reducing the frequency of introduction of the starting materials (adding raw materials during the residence time), the load of the pulp can be reduced.

В свете предыдущего уровня техники, как обсуждается выше, одной из целей настоящего изобретения является обеспечение способа ферментативного гидролиза целлюлозной биомассы, в котором целлюлозная биомасса со сравнительно высоким содержанием твердых веществ может гидролизоваться в условиях промышленного масштаба, в то же время, сводя к минимуму затраты (капитальные и на работу).In light of the prior art, as discussed above, one of the objectives of the present invention is to provide a method for the enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass, in which a cellulosic biomass with a relatively high solids content can be hydrolyzed on an industrial scale, while at the same time minimizing costs ( capital and work).

Эта цель (и другие) достигается (достигаются) с помощью следующего способа непрерывного гидролиза целлюлозной биомассы, включающего, по меньшей мере, следующие стадии:This goal (and others) is achieved (achieved) using the following method of continuous hydrolysis of cellulosic biomass, comprising at least the following stages:

(P) обеспечения, по меньшей мере, одного реактора, который может работать в стационарном состоянии;(P) providing at least one reactor that can operate in a stationary state;

(A) добавления заданного количества целлюлозной биомассы в указанный реактор, при этом указанная целлюлозная биомасса имеет содержание твердых веществ, по меньшей мере, 10%, предпочтительно, по меньшей мере, 15%, предпочтительно, по меньшей мере, 20%, предпочтительно, по меньшей мере, 25%, более предпочтительно, по меньшей мере, 30%; более предпочтительно, 10%-45%, более предпочтительно, 15%-45%, более предпочтительно, 20%-40% или от 15% до 30%;(A) adding a predetermined amount of cellulosic biomass to said reactor, said cellulosic biomass having a solids content of at least 10%, preferably at least 15%, preferably at least 20%, preferably according to at least 25%, more preferably at least 30%; more preferably 10% -45%, more preferably 15% -45%, more preferably 20% -40%, or 15% to 30%;

(Α') добавления заданного количества ферментов в указанный реактор;(Α ') adding a predetermined amount of enzymes to said reactor;

(E) осуществления, по меньшей мере, частичного ферментативного гидролиза целлюлозной биомассы в указанном реакторе,(E) the implementation of at least partial enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass in the specified reactor,

где достигается стационарное состояние, при котором целлюлозную биомассу непрерывно добавляют в указанный реактор, в то время как, по меньшей мере, частично гидролизованную целлюлозную биомассу непрерывно удаляют из указанного реактора, при этом указанная, по меньшей мере, частично гидролизованная целлюлозная биомасса, которую непрерывно удаляют, имеет вязкость, как измерено на реометре Physica MCR 101 в чашке с мешалкой (FL 100/6W), не более чем 25 Па·с(паскаль-секунда), предпочтительно, не более чем 10 Па·с, предпочтительно, не более чем 5 Па·с, более предпочтительно, не более чем 3 Па·с, более предпочтительно, не более чем 1 Па·с.where a stationary state is achieved in which the cellulosic biomass is continuously added to said reactor, while at least partially hydrolyzed cellulosic biomass is continuously removed from said reactor, wherein said at least partially hydrolyzed cellulosic biomass is continuously removed has a viscosity, as measured on a Physica MCR 101 rheometer in a cup with a stirrer (FL 100 / 6W), not more than 25 Pa · s (pascal second), preferably not more than 10 Pa · s, preferably not more than 5 Pa · s, more than p preferably not more than 3 Pa · s, more preferably not more than 1 Pa · s.

В настоящем документе и в описании настоящего изобретения, в целом, термин "содержание твердых веществ" (известный также специалистам в данной области как "TS" или "твердые вещества в целом") обозначает отношение между массой образца после сушки при 105°C в течение 16 часов и массой этого же образца перед указанной сушкой.In this document and in the description of the present invention, in General, the term "solids content" (also known to specialists in this field as "TS" or "solids in General") refers to the ratio between the mass of the sample after drying at 105 ° C for 16 hours and the mass of the same sample before the specified drying.

Соответственно, термин "TDS" или "растворенные твердые вещества в целом", как используется в настоящей заявке, обозначает отношение между массой высушенного (105°C в течение 16 часов) фильтрата, полученного из образца после его фильтрования, и массой этого же образца перед указанным фильтрованием и сушкой.Accordingly, the term “TDS” or “dissolved solids in general,” as used herein, refers to the ratio between the mass of dried (105 ° C for 16 hours) filtrate obtained from the sample after filtering and the mass of the same sample before specified filtering and drying.

Термин TSS" или "суспендированные твердые вещества в целом" обозначает отношение между массой высушенной (при 105°C в течение 16 часов) лепешки на фильтре, получаемой из образца после его фильтрования, и массой этого же образца перед указанным фильтрованием и сушкой. Следовательно, соотношение между этими показателями представляет собой TS=TDS+TSS.The term TSS "or" suspended solids in general "refers to the relationship between the mass of dried (at 105 ° C for 16 hours) filter cake obtained from the sample after filtering and the mass of the same sample before the specified filtering and drying. Therefore, the ratio between these indicators is TS = TDS + TSS.

Посредством осуществления непрерывного способа в соответствии с настоящим изобретением, то есть посредством установления стационарного состояния и определенного режима вязкости, решаются проблемы, связанные с высокой начальной вязкостью и сложностью конструкции реактора. В частности, настоящее изобретение решает проблему осуществления коммерчески жизнеспособного ферментативного гидролиза при высоких нагрузках твердых веществ, в то же время, поддерживая вязкость в реакторе низкой. Настоящее изобретение позволяет осуществлять ферментативный гидролиз при высоком содержании твердых веществ в целом и при низком содержании суспендированных твердых веществ в целом ("TSS") в виде непрерывного способа с рециклированием ферментов или без него.By implementing the continuous method in accordance with the present invention, that is, by establishing a steady state and a certain viscosity regime, problems associated with high initial viscosity and reactor design complexity are solved. In particular, the present invention solves the problem of commercially viable enzymatic hydrolysis at high loads of solids, while at the same time keeping the viscosity in the reactor low. The present invention allows enzymatic hydrolysis at a high solids content in general and at a low content of suspended solids in general ("TSS") as a continuous process with or without enzyme recycling.

Не требуется никакого специального перемешивания реактора, поскольку нет проблем с высоким TSS. Как следствие, в способе по настоящему изобретению можно использовать обычные CSTR (реакционные емкости с непрерывным перемешиванием). По этой причине, предпочтительно (по меньшей мере, один), реактор, используемый в способе в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой реактор с непрерывным перемешиванием, более предпочтительно, проточный реактор с мешалкой.No special mixing of the reactor is required since there is no problem with high TSS. As a result, conventional CSTRs (continuous stirring reaction vessels) can be used in the method of the present invention. For this reason, preferably (at least one), the reactor used in the method in accordance with the present invention, is a reactor with continuous stirring, more preferably, a flow reactor with a stirrer.

Другой вариант осуществления, который достигает указанной выше цели (целей), также повышает выход глюкозы способа в целом. При этом способ непрерывного гидролиза целлюлозной биомассы в соответствии с настоящим изобретением, в частности, стадию (P), осуществляют в каскаде, по меньшей мере, из двух реакторов.Another embodiment that achieves the above goal (s) also increases the glucose yield of the process as a whole. Moreover, the method of continuous hydrolysis of cellulosic biomass in accordance with the present invention, in particular stage (P), is carried out in a cascade of at least two reactors.

Нет никаких ограничений относительно максимального количества реакторов. Количество реакторов, работающих в каскаде (то есть работающих последовательно), зависит в основном от желаемого выхода глюкозы.There are no restrictions on the maximum number of reactors. The number of reactors operating in a cascade (i.e., operating sequentially) depends mainly on the desired glucose output.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения, количество ферментов, необходимое в способе в целом, уменьшается, по меньшей мере, на 30%, предпочтительно, по меньшей мере, на 40% с помощью включения контура рециклирования, в котором рециклируются ферменты. При этом гидролизат, то есть жидкая фаза, содержащая гидролизованную целлюлозу и ферменты, из (последнего) реактора подвергается воздействию стадии разделения, где негидролизованные твердые вещества отделяют от гидролизата, по-прежнему содержащего ферменты. Затем указанный жидкий гидролизат смешивают с негидролизованной ("свежей") целлюлозной биомассой, которую затем вводят в (первый) реактор гидролиза.In a preferred aspect of the present invention, the amount of enzymes required in the process as a whole is reduced by at least 30%, preferably at least 40%, by including a recycling loop in which the enzymes are recycled. In this case, the hydrolyzate, that is, the liquid phase containing hydrolyzed cellulose and enzymes, from the (last) reactor is subjected to a separation step, where non-hydrolyzed solids are separated from the hydrolyzate, which still contains enzymes. Then, said liquid hydrolyzate is mixed with non-hydrolyzed ("fresh") cellulosic biomass, which is then introduced into the (first) hydrolysis reactor.

Краткое описание фигурBrief Description of the Figures

Фигура 1 показывает непрерывный реактор, работающий в соответствии со способом по настоящему изобретению, вместе с необязательным следующим далее каскадом дополнительных реакторов.Figure 1 shows a continuous reactor operating in accordance with the method of the present invention, together with the optional following cascade of additional reactors.

Фигура 2 показывает блок-схему непрерывного ферментативного гидролиза целлюлозной биомассы в каскаде, по меньшей мере, из двух реакторов, при этом, по меньшей мере, часть ферментов, добавляемых в реактор, рециклируется.Figure 2 shows a block diagram of the continuous enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass in a cascade of at least two reactors, with at least a portion of the enzymes added to the reactor being recycled.

Фигура 3 показывает блок-схему непрерывного ферментативного гидролиза целлюлозной биомассы в каскаде, по меньшей мере, из двух реакторов, при этом ингибирование гидролиза под действием высокой нагрузки сахара сводится к минимуму в каскаде реакторов, которые последовательно уменьшаются по объему.Figure 3 shows a block diagram of the continuous enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass in a cascade of at least two reactors, while the inhibition of hydrolysis under the influence of a high sugar load is minimized in a cascade of reactors that are successively decreasing in volume.

Фигура 4 изображает изменение вязкости целлюлозной биомассы, подвергаемой воздействию ферментативного гидролиза, со временем, давая информацию об ожидаемом минимальном времени удерживания в стационарном состоянии.Figure 4 depicts the change in viscosity of cellulosic biomass subjected to enzymatic hydrolysis over time, giving information about the expected minimum retention time in a stationary state.

Фигура 5 представляет собой общую концепцию биорафинирования в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения.5 is a general biodegradation concept in accordance with one embodiment of the present invention.

Фигура 6 показывает блок-схему непрерывного ферментативного гидролиза целлюлозной биомассы в каскаде из трех реакторов в соответствии с Примерами 2 и 3.Figure 6 shows a block diagram of a continuous enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass in a cascade of three reactors in accordance with Examples 2 and 3.

Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к гидролизу целлюлозной биомассы. Нет никаких ограничений относительно типа или композиции целлюлозной биомассы, кроме того, что указанная биомасса содержит целлюлозу. В соответствии с одним из пригодных для использования определений, "биомасса" представляет собой общую массу (ранее) живой материи, в частности органической материи, в заданной единице области окружающей среды, предпочтительно, растительный материал, растения или сельскохозяйственные отходы, используемые в качестве топлива или источника энергии. Тот факт, что "ранее" живая биомасса включается также как "целлюлозная биомасса" принимает во внимание то, что рециклированные целлюлозные материалы, в частности, рециклированные хлопковые материалы и/или рециклированные продукты на основе бумаги или другие возможные рециклированные материалы на основе целлюлозы, также включаются. Любая смесь рециклированных целлюлозных материалов, таких как рециклированные бумажные продукты, с любым другим типом целлюлозной биомассы также включается.The present invention relates to the hydrolysis of cellulosic biomass. There is no restriction on the type or composition of cellulosic biomass, except that said biomass contains cellulose. According to one suitable definition, “biomass” is the total mass of (formerly) living matter, in particular organic matter, in a given unit of the environment, preferably plant material, plants or agricultural waste used as fuel or source of energy. The fact that “previously” living biomass is also included as “cellulosic biomass” takes into account that recycled cellulosic materials, in particular recycled cotton materials and / or recycled paper-based products or other possible recycled cellulose-based materials, also are included. Any mixture of recycled cellulosic materials, such as recycled paper products, with any other type of cellulosic biomass is also included.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, указанная целлюлозная биомасса содержит более 30% целлюлозы (% массы по отношению к массе в целом), предпочтительно, более 50% целлюлозы, предпочтительно, более 70% целлюлозы. При этом термин "целлюлоза" также включает термин "гемицеллюлоза". Предпочтительная целлюлозная биомасса в соответствии с настоящим изобретением содержит хлопок, хлопковые линтеры и лигноцеллюлозную биомассу, то есть биомассу, содержащую как лигниновые компоненты, так и целлюлозные и/или гемицеллюлозные компоненты.According to a preferred embodiment, said cellulosic biomass contains more than 30% cellulose (% mass relative to the mass as a whole), preferably more than 50% cellulose, preferably more than 70% cellulose. The term "cellulose" also includes the term "hemicellulose". A preferred cellulosic biomass in accordance with the present invention comprises cotton, cotton linters and lignocellulosic biomass, that is, biomass containing both lignin components and cellulosic and / or hemicellulose components.

Предпочтительная целлюлозная биомасса, которая является особенно пригодной для способа по настоящему изобретению, основывается на энергетических сельскохозяйственных культурах, однолетних растениях, сельскохозяйственных остатках и древесине.A preferred cellulosic biomass, which is particularly suitable for the method of the present invention, is based on energy crops, annual plants, crop residues and wood.

Промышленные энергетические сельскохозяйственные культуры, как правило, представляют собой плотно высаживаемые, дающие высокие урожаи виды, которые предпочтительно имеют ограниченную ценность как пищевые продукты или вообще ее не имеют. Например, древесные сельскохозяйственные культуры, такие как ива, китайский тростник, верба или тополь, являются предпочтительными энергетическими сельскохозяйственными культурами.Industrial energy crops are typically densely planted, high yielding species that preferably have limited value as food products or not at all. For example, woody crops such as willow, Chinese cane, willow or poplar are preferred energy crops.

Предпочтительные примеры однолетних растений представляют собой солому, сахарный тростник и маниоку.Preferred examples of annual plants are straw, sugarcane and cassava.

Сельскохозяйственные остатки включают те части пахотных культур, которые не используются для первичной цели получения пищевых продуктов, кормов или волокон, например использованные подстилки для животных и листья.Agricultural residues include those parts of arable crops that are not used for the primary purpose of obtaining food, feed, or fiber, such as used animal bedding and leaves.

Эти остатки иллюстрируются багассой от сахарного тростника и стеблями кукурузы.These leftovers are illustrated with sugarcane bagasse and corn stalks.

Особенно предпочтительный исходный материал сахарного тростника может быть разделен на багассу, сахар и солому. Багасса представляет собой волокнистый материал, состоящий из целлюлозы, гемицеллюлозы, лигнинов, экстрактивных веществ, неорганических солей и других органических веществ, таких как белки и органические кислоты.A particularly preferred sugarcane starting material can be divided into bagasse, sugar and straw. Bagasse is a fibrous material consisting of cellulose, hemicellulose, lignins, extractives, inorganic salts and other organic substances such as proteins and organic acids.

Багасса и древесина твердых пород имеют множество сходных особенностей, то есть высокое содержание ксилана, более короткие волокна и более низкое содержание лигнина и целлюлозы по сравнению с древесиной мягких пород. Однако багасса имеет чуть более высокое содержание золы. Содержание золы может объясняться различиями в морфологии растений и способе сбора урожая. Более короткие волокна в багассе связаны в основном с ее высоким содержанием сердцевины (~30%).Bagasse and hardwood have many similar features, i.e. high xylan, shorter fibers and lower lignin and cellulose compared to softwood. However, bagasse has a slightly higher ash content. The ash content can be explained by differences in plant morphology and method of harvesting. Shorter fibers in bagasse are mainly associated with its high core content (~ 30%).

В целом, на основании того факта, что никакого механического уменьшения размеров может не потребоваться и что получают более высокий выход гидролиза, является особенно предпочтительным осуществление способа в соответствии с настоящим изобретением с помощью не древесных сельскохозяйственных остатков, в частности, багассы, в качестве целлюлозной биомассы.In general, on the basis of the fact that no mechanical downsizing may be required and that a higher hydrolysis yield is obtained, it is particularly preferred to carry out the process of the present invention using non-wood agricultural residues, in particular bagasse, as cellulosic biomass .

Древесина также является материалом, пригодным для настоящего способа. При этом пригодными для использования являются все типы древесины.Wood is also a material suitable for the present method. All types of wood are suitable for use.

В соответствии с настоящим способом пульпу из целлюлозной биомассы ферментативно гидролизуют. Целлюлоза представляет собой нерастворимый линейный полимер из повторяющихся глюкановых единиц, связанных β-1-4-глюкозидными связями. В воде целлюлоза гидролизуется под воздействием электрофильного водорода молекулы воды на гликозидную связь. В целлюлозных цепях каждая единица глюкозы может образовывать три водородных связи с мономерами соседних цепей, с получением стабильной кристаллической структуры, которую сложно гидролизовать. Скорость реакции гидролиза можно повысить, используя повышенные температуры и давления, или ее можно катализировать с помощью разбавленной или концентрированной кислоты или с помощью ферментов, предпочтительно, как в случае настоящего изобретения, с помощью ферментов.In accordance with the present method, pulp from cellulosic biomass is enzymatically hydrolyzed. Cellulose is an insoluble linear polymer of repeating glucan units linked by β-1-4-glucosidic bonds. In water, cellulose is hydrolyzed under the influence of electrophilic hydrogen of a water molecule on a glycosidic bond. In cellulose chains, each glucose unit can form three hydrogen bonds with the monomers of adjacent chains, to obtain a stable crystalline structure that is difficult to hydrolyze. The rate of the hydrolysis reaction can be increased using elevated temperatures and pressures, or it can be catalyzed using dilute or concentrated acid or using enzymes, preferably, as in the case of the present invention, using enzymes.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, на стадии гидролиза используют комплексы внеклеточных или ассоциированных с клеточными мембранами ферментов (целлюлаз), которые могут специфично гидролизовать полимер целлюлозы в виде растворимых мономеров глюкозы. Целлюлазы представляет собой комплексы из множества белков, состоящие из синергических ферментов с различными специфичными активностями, которые можно разделить на экзо- и эндоцеллюлазу (глюканазу) и β-глюкозидазу (целлобиазу). В дополнение к этому, имеются ферменты (гемицеллюлазы, лакказы, лигнолитические пероксидазы, и тому подобное), которые могут разрушать остальные главные компоненты целлюлозной биомассы. Все эти ферменты и любое их сочетание представляют собой предпочтительные ферменты, которые можно использовать при ферментативном гидролизе по настоящему изобретению.According to a preferred embodiment of the present invention, complexes of extracellular or cell membrane associated enzymes (cellulases) are used in the hydrolysis step, which can specifically hydrolyze the cellulose polymer as soluble glucose monomers. Cellulase is a complex of many proteins, consisting of synergistic enzymes with various specific activities that can be divided into exo- and endocellulase (glucanase) and β-glucosidase (cellobiase). In addition to this, there are enzymes (hemicellulase, laccase, lignolytic peroxidase, and the like) that can destroy the remaining main components of cellulosic biomass. All of these enzymes and any combination thereof are preferred enzymes that can be used in the enzymatic hydrolysis of the present invention.

Целлобиоза представляет собой известный ингибитор конечного продукта глюканаз, и β-глюкозидаза, как известно, ослабляет это ингибирование посредством преобразования целлобиозы в глюкозу (стадия, ограничивающая скорость). В промышленных процессах, например, при этанольном ферментировании с помощью дрожжей, эффективность осахаривания целлюлазы может быть улучшена посредством одновременного осахаривания и ферментирования (SSF). Самая большая проблема при SSF относится к различию оптимальных температур для обычных гидролитических ферментов и ферментирующих организмов. В дополнение к ингибированию конечного продукта, лигнин, как известно, ухудшает рабочие характеристики ферментов посредством неспецифичного связывания с целлюлазами.Cellobiose is a known glucanase end product inhibitor, and β-glucosidase is known to reduce this inhibition by converting cellobiose to glucose (rate limiting step). In industrial processes, for example, in ethanol fermentation using yeast, the saccharification efficiency of cellulase can be improved by simultaneous saccharification and fermentation (SSF). The biggest problem with SSF is the difference in optimal temperatures for conventional hydrolytic enzymes and fermenting organisms. In addition to inhibiting the final product, lignin is known to degrade the performance of enzymes through non-specific binding to cellulases.

Является предпочтительным, чтобы целлюлозная биомасса перед гидролизом подвергалась воздействию, по меньшей мере, одного типа предварительной обработки, которая превращает, по меньшей мере, часть лигнина целлюлозной биомассы в водорастворимую форму, тем самым делая их особенно хорошо пригодными для стадии гидролиза настоящего изобретения.It is preferred that the cellulosic biomass is subjected to at least one type of pretreatment prior to hydrolysis, which converts at least a portion of the lignin of the cellulosic biomass into a water-soluble form, thereby making them particularly well suited for the hydrolysis step of the present invention.

По этой причине, в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, осуществляют предварительную обработку целлюлозы для увеличения удельной площади поверхности целлюлозы. Правильная предварительная обработка имеет преимущества увеличения скорости ферментативного гидролиза благодаря большему количеству доступного субстрата, а также посредством удаления потенциально ингибиторных веществ.For this reason, in accordance with a preferred embodiment, the pulp is pretreated to increase the specific surface area of the pulp. Proper pretreatment has the advantage of increasing the rate of enzymatic hydrolysis due to the greater amount of substrate available, as well as by the removal of potentially inhibitory substances.

Хотя способ в соответствии с настоящим изобретением применим ко всем видам целлюлозных материалов, является предпочтительным, чтобы материал предварительно обрабатывался на отдельной стадии, предшествующей стадии гидролиза. Обнаружено, что указанная стадия предварительной обработки повышает эффективность ферментативного гидролиза.Although the method of the present invention is applicable to all types of cellulosic materials, it is preferred that the material is pretreated in a separate step preceding the hydrolysis step. It was found that this pretreatment step increases the efficiency of enzymatic hydrolysis.

Указанная предварительная обработка является механической или химической, предпочтительно, химической.Said pretreatment is mechanical or chemical, preferably chemical.

При механической (предварительной) обработке, импульс или энергия переносится в целлюлозную биомассу, например, посредством измельчения или резки, или разбивания биомассы на более мелкие частицы. При этом химических реагентов не добавляют, и химическая структура компонентов материала остается в основном неизменной.During mechanical (preliminary) processing, momentum or energy is transferred to the cellulosic biomass, for example, by grinding or cutting, or breaking the biomass into smaller particles. At the same time, no chemical reagents are added, and the chemical structure of the components of the material remains basically unchanged.

При химической (предварительной) обработке, добавляют, по меньшей мере, один химический реагент, и химическая структура, по меньшей мере, одного компонента из компонентов биомассы изменяется. Как будет обсуждаться более подробно ниже, "сульфитная варка" представляет собой химическую предварительную обработку, и является, фактически, предпочтительным типом предварительной обработки.During chemical (preliminary) processing, at least one chemical reagent is added, and the chemical structure of at least one component of the biomass components changes. As will be discussed in more detail below, "sulfite cooking" is a chemical pre-treatment, and is, in fact, the preferred type of pre-treatment.

В предпочтительном варианте осуществления, в настоящем способе используют целлюлозную биомассу, в частности лигноцеллюлозную биомассу, которая не требует механической (предварительной) обработки, и при этом сульфитная варка представляет собой единственную (предварительную) обработку. Сульфитная варка может быть разделена на четыре главных группы: кислотная, кислотная бисульфитная, слабощелочная и щелочная сульфитная варка.In a preferred embodiment, the present method uses cellulosic biomass, in particular lignocellulosic biomass, which does not require mechanical (pre) treatment, and sulphite cooking is the only (pre) treatment. Sulphite cooking can be divided into four main groups: acid, acid bisulfite, slightly alkaline and alkaline sulphite cooking.

При предпочтительной предварительной обработке в соответствии с настоящим изобретением целлюлозную биомассу варят с помощью сульфита, предпочтительно сульфита натрия, кальция, аммония или магния, при кислотных, нейтральных или основных условиях. Эта стадия предварительной обработки растворяет большую часть лигнина как сульфонированный лигнин (лигносульфонаты) вместе с частями гемицеллюлозы.In a preferred pretreatment according to the present invention, the cellulosic biomass is cooked using sulfite, preferably sodium, calcium, ammonium or magnesium sulfite, under acidic, neutral or basic conditions. This pretreatment step dissolves most of the lignin as sulfonated lignin (lignosulfonates) along with parts of hemicellulose.

Неожиданно в настоящем способе обнаружено, что использование сульфитной варки в качестве стадии предварительной обработки при получении топлив или химических веществ из ферментируемых сахаров является очень эффективным, поскольку оно приводит к повышению выхода химических веществ в целом. По существу достигается более высокий выход (>80%) полезных химических веществ, чем в любой другой известной технологии биорафинирования на платформе сахаров.Unexpectedly, in the present method it was found that the use of sulphite cooking as a pretreatment step in the production of fuels or chemicals from fermentable sugars is very effective because it leads to an increase in the yield of chemicals in general. Essentially, a higher yield (> 80%) of beneficial chemicals is achieved than in any other known sugar platform bio-refining technology.

Тот факт, что целлюлозная пульпа, получаемая в результате одностадийной предварительной обработки, имеет особенно мало примесей, в частности лигнина, делает более простой разработку или адаптирование ферментов для гидролиза.The fact that the cellulosic pulp resulting from the one-step pretreatment has especially few impurities, in particular lignin, makes it easier to develop or adapt enzymes for hydrolysis.

Сульфитную предварительную обработку предпочтительно осуществляют в соответствии с одним из следующих вариантов осуществления. В настоящем документе и по всему настоящему описанию "сульфитная предварительная обработка" упоминается также как "варка":Sulphite pretreatment is preferably carried out in accordance with one of the following embodiments. Throughout this document and throughout this specification, “sulfite pretreatment” is also referred to as “cooking”:

• кислотная варка (предпочтительно SO₂ с гидроксидом, более предпочтительно, с Ca(OH)₂, NaOH, NH₄OH или Mg(OH)₂),• acid cooking (preferably SO ₂ with hydroxide, more preferably Ca (OH) ₂ , NaOH, NH ₄ OH or Mg (OH) ₂ ),

• бисульфитная варка (предпочтительно SO₂ с гидроксидом, более предпочтительно с NaOH, NH₄OH или Mg(OH)₂),• bisulfite cooking (preferably SO ₂ with hydroxide, more preferably with NaOH, NH ₄ OH or Mg (OH) ₂ ),

• слабощелочная варка (предпочтительно Na₂SO₃, более предпочтительно, с Na₂CO₃) и• slightly alkaline cooking (preferably Na ₂ SO ₃ , more preferably Na ₂ CO ₃ ) and

• щелочная варка (предпочтительно Na₂SO₃ с гидроксидом, более предпочтительно с NaOH).• alkaline cooking (preferably Na ₂ SO ₃ with hydroxide, more preferably with NaOH).

Относительно стадии сульфитной предварительной обработки (сульфитной варки), которая представляет собой предпочтительную предварительную обработку, которая должна осуществляться перед ферментативным гидролизом в соответствии с настоящим изобретением, соответствующее описание WO 2010/078930 с заглавием "Lignocellulosic Biomass Conversion", как подано 16 декабря 2009 года, включается в качестве ссылки в настоящее описание.Regarding the sulphite pretreatment (sulphite cooking) step, which is the preferred pretreatment to be carried out before enzymatic hydrolysis in accordance with the present invention, the corresponding description of WO 2010/078930 with the title "Lignocellulosic Biomass Conversion", as filed December 16, 2009, included by reference in the present description.

Настоящее изобретение также относится к объединенному способу получения моносахаридов, химических веществ на основе сахаров, биологических топлив или материалов вместе с сульфонированным лигнином из лигноцеллюлозной биомассы, включающему, по меньшей мере, следующие стадии:The present invention also relates to a combined process for producing monosaccharides, sugar-based chemicals, biofuels or materials together with sulfonated lignin from lignocellulosic biomass, comprising at least the following steps:

(i) предварительной обработки лигноцеллюлозной биомассы, предпочтительно, на стадии сульфитной варки;(i) pretreatment of lignocellulosic biomass, preferably in a sulphite cooking step;

(ii) разделения предварительно обработанной лигноцеллюлозной биомассы со стадии (i) на(ii) separating the pre-treated lignocellulosic biomass from step (i) into

(a) жидкую фазу "отработанного сульфитного щелока", предпочтительно содержащую 50% или более лигнина из лигноцеллюлозной биомассы в форме сульфонированного лигнина, и на(a) a "spent sulfite liquor" liquid phase, preferably containing 50% or more of lignin from lignocellulosic biomass in the form of a sulfonated lignin, and

(b) пульпу, предпочтительно содержащую 70% или более целлюлозы из лигноцеллюлозной биомассы;(b) pulp, preferably containing 70% or more of lignocellulosic biomass cellulose;

(iii) гидролиза пульпы (b) со стадии (ii) до платформы химии сахаров, содержащей моносахариды; при этом указанная стадия гидролиза представляет собой способ непрерывного гидролиза лигноцеллюлозной биомассы, как описано выше;(iii) hydrolysis of the pulp (b) from step (ii) to a sugar chemistry platform containing monosaccharides; wherein said hydrolysis step is a process for continuously hydrolyzing lignocellulosic biomass as described above;

(iv) необязательной дополнительной переработки моносахаридов со стадии (iii), с получением полезных химических веществ, биологических топлив и/или белков; и(iv) optional further processing of the monosaccharides from step (iii) to produce useful chemicals, biofuels and / or proteins; and

(v) прямого преобразования или дополнительной переработки сульфонированного лигнина из жидкой фазы (a) со стадии (ii) в полезные химические вещества, биологические топлива и/или материалы.(v) direct conversion or further processing of the sulfonated lignin from the liquid phase (a) from step (ii) into useful chemicals, biofuels and / or materials.

Этот способ в целом схематически изображен на Фигуре 5.This method is generally schematically depicted in Figure 5.

Стадия (iv) указанного способа относится к ферментированию моносахаридов, в частности, гексоз и пентоз, в этанол или другие химические вещества на основе сахаров или с получением белков биомассы.Stage (iv) of this method relates to the fermentation of monosaccharides, in particular hexoses and pentoses, into ethanol or other sugar-based chemicals or to produce biomass proteins.

Ферментирование включает микроорганизмы, которые разрушают сахара, высвобождая энергию, при этом способ приводит к получению продуктов подобных спирту или кислоте. Saccharomyces cerevisiae (хлебопекарные дрожжи) используют чаще всего для ферментирования гексоз до этанола. Один моль глюкозы стехиометрически будет давать 2 моля этанола плюс 2 моля диоксида углерода. Пульпа из багассы содержит относительно большие количества пентоз. Эти сахара также могут быть либо ферментированы, либо метаболизированы с получением белков биомассы.Fermentation involves microorganisms that break down sugars, releasing energy, and the process results in products like alcohol or acid. Saccharomyces cerevisiae (baker's yeast) is most often used to ferment hexoses to ethanol. One mole of glucose will stoichiometrically produce 2 moles of ethanol plus 2 moles of carbon dioxide. Bagasse pulp contains relatively large amounts of pentoses. These sugars can also be either fermented or metabolized to produce biomass proteins.

Со ссылкой на описанный выше объединенный способ получения моносахаридов или без нее настоящее изобретение относится к гидролизу целлюлозной биомассы, как описано выше. По отношению к указанному гидролизу, предпочтительными являются следующие варианты осуществления.With reference to the combined process described above for producing monosaccharides or without it, the present invention relates to the hydrolysis of cellulosic biomass as described above. With respect to said hydrolysis, the following embodiments are preferred.

В предпочтительном варианте осуществления, в непрерывном способе по настоящему изобретению, вся суспензия из жидких и твердых компонентов перемещается через реакторы с одинаковой скоростью, то есть твердые вещества негидролизованных волокон и водная фаза суспензии удерживаются в течение одинакового интервала времени в указанном реакторе.In a preferred embodiment, in the continuous process of the present invention, the entire suspension of liquid and solid components travels through the reactors at the same speed, that is, the solids of the non-hydrolyzed fibers and the aqueous phase of the suspension are held for the same amount of time in said reactor.

В соответствии с первым вариантом осуществления, как иллюстрируется на Фигуре 1, субстрат, то есть целлюлозная биомасса, вводится в реактор, и добавляются ферменты. Способ осуществляют непрерывно, то есть в стационарном состоянии. В указанном реакторе субстрат, то есть целлюлозная биомасса, гидролизуется. Вязкость частично гидролизованной целлюлозной биомассы в реакторе, работающем в соответствии с настоящим изобретением, с TS 25% (состоит из TSS 10% и TDS 15%) может аппроксимироваться вязкостью в соответствующем загрузочном эксперименте после времени реакции 16 часов.According to a first embodiment, as illustrated in FIG. 1, a substrate, that is, cellulosic biomass, is introduced into the reactor and enzymes are added. The method is carried out continuously, that is, in a stationary state. In the specified reactor, the substrate, i.e. cellulosic biomass, is hydrolyzed. The viscosity of the partially hydrolyzed cellulosic biomass in a reactor operating in accordance with the present invention with a TS of 25% (consisting of TSS 10% and TDS 15%) can be approximated by the viscosity in the corresponding loading experiment after a reaction time of 16 hours.

Не существует никаких ограничений относительно реактора, необходимого для осуществления способа, хотя CSTR (проточный реактор с мешалкой) является предпочтительным.There are no restrictions on the reactor required to carry out the process, although a CSTR (stirred tank reactor) is preferred.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, также показанным на Фигуре 1, предусматривают каскад реакторов для улучшения выхода глюкозы. В дополнительных реакторах (следующих за первым реактором, описанным выше), субстрат дополнительно гидролизуется с получением гидролизата с высокой концентрацией сахаров (= высокому содержанию растворенных твердых веществ в целом, "TDS") и твердого остатка, состоящего из материала, который не может быть гидролизован (лигнина, неорганических материалов, и тому подобное).In accordance with a preferred embodiment, also shown in Figure 1, a cascade of reactors is provided to improve glucose output. In additional reactors (following the first reactor described above), the substrate is further hydrolyzed to give a hydrolyzate with a high sugar concentration (= high dissolved solids in general, “TDS”) and a solid residue consisting of material that cannot be hydrolyzed (lignin, inorganic materials, and the like).

Даже если реактор запитывают субстратом, имеющим высокое содержание твердых веществ, например, TS 25%, содержание суспендированных продуктов в целом ("TSS") в реакторе составляет только примерно 10% в стационарном состоянии (предполагая 3 реактора последовательно при общем времени реакции 48 часов, по 16 час в каждом реакторе). Вязкость раствора с TS 25% (состоит из TSS 10% и TDS 15%) в стационарном реакторе по настоящему изобретению соответствует вязкости в загрузочном реакторе после времени реакции 16 часов или меньше.Even if the reactor is fed with a substrate having a high solids content, for example, TS 25%, the total suspended product (“TSS”) content in the reactor is only about 10% in steady state (assuming 3 reactors in series with a total reaction time of 48 hours, 16 hours in each reactor). The viscosity of the solution with TS 25% (consists of TSS 10% and TDS 15%) in the stationary reactor of the present invention corresponds to the viscosity in the loading reactor after a reaction time of 16 hours or less.

Среднее время удерживания в реакторе для целлюлозной биомассы, добавленной в реактор для гидролиза, должно быть примерно равным времени, необходимому для ожижения в загрузочном реакторе с хорошим перемешиванием, предпочтительно, чуть больше, чем это время. По этой причине среднее время удерживания первого реактора должно быть выбрано так, чтобы достигалось достаточное ожижение для суспензии, чтобы суспензию можно было прокачивать.The average retention time in the reactor for cellulosic biomass added to the hydrolysis reactor should be approximately equal to the time required for liquefaction in a loading reactor with good mixing, preferably slightly more than this time. For this reason, the average retention time of the first reactor should be chosen so that sufficient fluidization for the slurry is achieved so that the slurry can be pumped.

В соответствии со вторым вариантом осуществления затраты на фермент понижаются при использовании рециклирования фермента. Способ схематически описан на Фигуре 2.According to a second embodiment, the cost of the enzyme is reduced by using recycling of the enzyme. The method is schematically described in Figure 2.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения количество фермента, необходимое для способа в целом, понижается, по меньшей мере, на 30%, предпочтительно, по меньшей мере, на 40% посредством включения контура рециклирования, в котором рециклируются ферменты.In a preferred aspect of the present invention, the amount of enzyme required for the process as a whole is reduced by at least 30%, preferably at least 40% by activating a recycling loop in which the enzymes are recycled.

В соответствии с этим предпочтительным вариантом осуществления гидролизат, то есть жидкая фаза, содержащая гидролизованную целлюлозу и ферменты, из (последнего) реактора подвергается воздействию стадии разделения, где негидролизованные твердые вещества, по меньшей мере, частично отделяют от гидролизата, по-прежнему содержащего ферменты. Затем указанный жидкий гидролизат смешивают с негидролизованной ("свежей") целлюлозной биомассой, которую затем вводят в реактор для гидролиза.According to this preferred embodiment, the hydrolyzate, i.e. the liquid phase containing hydrolyzed cellulose and enzymes, from the (last) reactor is subjected to a separation step where non-hydrolyzed solids are at least partially separated from the hydrolyzate still containing enzymes. Then, said liquid hydrolyzate is mixed with non-hydrolyzed ("fresh") cellulosic biomass, which is then introduced into the hydrolysis reactor.

Это иллюстрируется на Фигуре 2. Здесь, после реактора гидрола 3 каскада из трех гидролизных реакторов, гидролизат (включая ферменты) отделяют от негидролизованных твердых остатков. Указанный гидролизат рециклируют в систему через резервуар для смешивания (крайний слева резервуар на Фигуре 2). В указанном резервуаре для смешивания может иметь место некоторый (остаточный) гидролиз, но указанный реактор, прежде всего, предназначен для смешивания рециклированного гидролизата, содержащего ферменты, с добавленной целлюлозной биомассой ("субстратом"). На необязательной стадии разделения после указанного специального резервуара для смешивания некоторое количество гидролизата, в частности некоторая часть конечного продукта сахаров, может быть отделено для дальнейшей переработки.This is illustrated in Figure 2. Here, after a hydrolysis reactor 3 of a cascade of three hydrolysis reactors, the hydrolyzate (including enzymes) is separated from non-hydrolyzed solid residues. The specified hydrolyzate is recycled to the system through a mixing tank (leftmost tank in Figure 2). Some (residual) hydrolysis may take place in said mixing tank, but said reactor is primarily intended to mix recycled hydrolyzate containing enzymes with added cellulosic biomass (“substrate”). In an optional separation step, after said special mixing tank, a certain amount of hydrolyzate, in particular a portion of the final sugar product, can be separated for further processing.

По этой причине, в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, по меньшей мере, часть, по меньшей мере, частично гидролизованной целлюлозной биомассы, которую непрерывно удаляют из реактора, предпочтительно, из последнего реактора каскада из двух или более реакторов, подвергается воздействию стадии разделения, при этом негидролизованные твердые вещества, по меньшей мере, частично отделяются от гидролизата, то есть от жидкой фазы, содержащей гидролизованную целлюлозную биомассу и ферменты, где указанный жидкий гидролизат смешивают затем с целлюлозной биомассой, предпочтительно, в специальном реакторе или резервуаре, затем эту смесь вводят в способ в соответствии с настоящим изобретением.For this reason, in accordance with a preferred embodiment, at least a portion of at least partially hydrolyzed cellulosic biomass that is continuously removed from the reactor, preferably from the last reactor of the cascade of two or more reactors, is subjected to a separation step, when this non-hydrolyzed solids, at least partially separated from the hydrolyzate, that is, from the liquid phase containing hydrolyzed cellulosic biomass and enzymes, where the specified liquid hydrolyzate with eshivayut then with cellulosic biomass, preferably in a special reactor or tank, then the mixture is introduced into the method according to the present invention.

Дополнительное преимущество этого технологического решения заключается в том, что гидролизат/раствор сахаров (после отделения негидролизованного материала) смешивают с субстратом до (первой) реакционной емкости. Это сильно уменьшит необходимые количества ферментов, по меньшей мере, на 40% (благодаря замещению жидкой фазы в пульпе).An additional advantage of this technological solution is that the hydrolyzate / sugar solution (after separation of the non-hydrolyzed material) is mixed with the substrate to the (first) reaction vessel. This will greatly reduce the required amount of enzymes by at least 40% (due to the replacement of the liquid phase in the pulp).

Посредством смешивания гидролизата (после отделения негидролизованных твердых веществ) со свежим субстратом (то есть с целлюлозной биомассой), ферменты с остатком, связывающим углеводы, могут связываться с субстратом (целлюлозой) перед тем, как ее вводят в первый гидролизный реактор. Это позволит дополнительно уменьшить потребление фермента, в дополнение к 40% уменьшению, рассмотренному выше.By mixing the hydrolyzate (after separation of the non-hydrolyzed solids) with a fresh substrate (i.e., cellulosic biomass), enzymes with a carbohydrate-binding residue can bind to the substrate (cellulose) before being introduced into the first hydrolysis reactor. This will further reduce enzyme intake, in addition to the 40% reduction discussed above.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления, останавливается ингибирование гидролиза на основе содержания сахаров, которое является слишком высоким (высокие TDS).According to another preferred embodiment, the inhibition of hydrolysis based on sugar content that is too high (high TDS) is stopped.

Здесь любое потенциальное ингибирование гидролиза, индуцируемое сахарами, предпочтительно преодолевается с помощью последовательного отделения сахаров.Here, any potential inhibition of hydrolysis induced by sugars is preferably overcome by successive separation of sugars.

В соответствии с этим предпочтительным вариантом осуществления, как иллюстрируется на Фигуре 3, суспендированные твердые вещества отделяют от жидкости после первого реактора, в котором имеет место реакция гидролиза.According to this preferred embodiment, as illustrated in FIG. 3, suspended solids are separated from the liquid after the first reactor in which the hydrolysis reaction takes place.

Как правило, приблизительно 60% преобразование целлюлозы/гемицеллюлозы в моносахара может быть достигнуто в гидролизном реакторе, работающем в стационарном состоянии, в соответствии с настоящим изобретением. Остальные 40% негидролизованных волокон переносят затем во второй реактор. Ожидается, что ферменты с остатком, связывающим углеводы, будут связываться с негидролизованными волокнами. Кроме того, ферменты, растворенные в жидкости, захваченной в волокнах, будут также переноситься во второй реактор. В дополнение к ферментам, которые извлекают из первого реактора, во второй реактор предпочтительно добавляют малое количество ферментов.Typically, approximately 60% conversion of cellulose / hemicellulose to monosugar can be achieved in a stationary state hydrolysis reactor in accordance with the present invention. The remaining 40% of the non-hydrolyzed fibers are then transferred to a second reactor. Enzymes with a carbohydrate binding moiety are expected to bind to non-hydrolyzed fibers. In addition, enzymes dissolved in a liquid trapped in the fibers will also be transferred to the second reactor. In addition to the enzymes that are recovered from the first reactor, a small amount of enzymes is preferably added to the second reactor.

Предпочтительно, размер второго гидролизного реактора уменьшают для приведения в соответствие с количеством негидролизованных волокон, для достижения такого же TSS, как в первом реакторе, или, по меньшей мере, сходного с ним.Preferably, the size of the second hydrolysis reactor is reduced to match the number of non-hydrolyzed fibers, to achieve the same TSS as in the first reactor, or at least similar to it.

Весь способ может быть повторен таким же образом для следующего гидролизного реактора, который затем пропорционально уменьшают.The whole process can be repeated in the same way for the next hydrolysis reactor, which is then proportionally reduced.

В целом, в соответствии с этим предпочтительным вариантом осуществления, в способе в соответствии с настоящим изобретением, используют для гидролиза каскад из двух или более реакторов, при этом, по меньшей мере, некоторая часть гидролизата, то есть жидкой фазы, содержащей гидролизованную целлюлозную биомассу и ферменты из первого реактора, отделяют от твердой фазы и подвергают дальнейшей переработке в любом из последующих реакторов, и при этом указанную твердую фазу добавляют в следующий реактор, который предпочтительно является меньшим по размеру и/или по объему, чем первый реактор, где дополнительное заданное количество фермента может быть добавлено в указанный следующий реактор.In General, in accordance with this preferred embodiment, in the method in accordance with the present invention, a cascade of two or more reactors is used for hydrolysis, with at least some of the hydrolyzate, i.e. the liquid phase, containing hydrolyzed cellulosic biomass and enzymes from the first reactor are separated from the solid phase and further processed in any of the subsequent reactors, and wherein said solid phase is added to the next reactor, which is preferably smaller in size and / or volume than the first reactor where an additional predetermined quantity of enzyme can be added to said next reactor.

Примеры:Examples:

Следующие далее условия, как приведено, используют для примеров по всему описанию:The following conditions, as shown, are used for examples throughout the description:

Температура приведена в °C.Temperature is given in ° C.

% означает мас.%, если не указано иного.% means wt.%, unless otherwise indicated.

Эквивалент глюкозы - количество глюкозы, получаемое из целлюлозы в субстрате.Glucose Equivalent - The amount of glucose obtained from cellulose in a substrate.

Эквивалент ксилозы - количество ксилозы, получаемое из ксилана в субстрате.Xylose Equivalent - The amount of xylose obtained from xylan in a substrate.

Пример 1Example 1

Для определения примерного среднего времени удерживания в первом реакторе, один образец щелочного субстрата багассы, полученной с помощью щелочной сульфитной варки в условиях, подобных тем, что описаны в Примере 1 WO 2010/078930, гидролизуют. Гидролиз осуществляют на реометре Physica MCR 101 в чашке с мешалкой (FL 100/6W). Скорость вращения составляет 30 об/мин, а температура - 50°C. Концентрация целлюлозной биомассы составляет 10%, а добавление фермента представляет собой 40% объем/масс Accellerase Duet (Genencor, CA, USA). Вязкость непрерывно отслеживают, и вязкость как функция времени показана на Фигуре 4.To determine the approximate average retention time in the first reactor, one sample of an alkaline bagasse substrate obtained by alkaline sulphite cooking under conditions similar to those described in Example 1 of WO 2010/078930 is hydrolyzed. Hydrolysis is carried out on a Physica MCR 101 rheometer in a cup with stirrer (FL 100 / 6W). The rotation speed is 30 rpm and the temperature is 50 ° C. The cellulosic biomass concentration is 10%, and the addition of the enzyme is 40% vol / wt Accellerase Duet (Genencor, CA, USA). Viscosity is continuously monitored, and viscosity as a function of time is shown in Figure 4.

Гидролиз дает начальное быстрое уменьшение вязкости и, после короткого периода времени, кривая вязкости начинает становиться более плоской и достигает уровня, при этом образец может выглядеть как жидкий или сходный с жидкостью. Эта вязкость зависит от субстрата (здесь: целлюлозной биомассы) и экспериментальных условий, но гидролизованный материал может считаться ожиженным, когда вязкость ниже чем 3 Па·с (паскаль-секунда), то есть ниже чем 3000 сантипуаз.Hydrolysis gives an initial rapid decrease in viscosity and, after a short period of time, the viscosity curve begins to become flatter and reaches a level, while the sample may look like a liquid or similar to a liquid. This viscosity depends on the substrate (here: cellulosic biomass) and experimental conditions, but hydrolyzed material can be considered liquefied when the viscosity is lower than 3 Pa · s (Pascal second), i.e. lower than 3000 centipoise.

Минимальное среднее время удерживания (первого) реактора определяется временем ожижения, которое, в свою очередь, зависит от нескольких параметров, таких как субстрат, концентрация субстрата и количество, и тип ферментов.The minimum average retention time of the (first) reactor is determined by the liquefaction time, which, in turn, depends on several parameters, such as substrate, substrate concentration and amount, and type of enzymes.

Пример 2Example 2

Образец субстрата багассы (пульпы из багассы), полученной с помощью кислотной сульфитной варки, при условиях, сходных с теми, что описаны в Примере 2, из WO 2010/078930, подвергают воздействию непрерывного гидролиза в экспериментальной установке с 3 последовательными реакторами, как показано на Фигуре 6. Общий объем системы, согласно измерениям, составляет приблизительно 6,6 литра. Реакторы снабжены кожухами и соединены с водяной баней для контроля температуры, и охлаждающая вода циркулирует в крышках для сведения к минимуму испарения из реакторов.A sample of bagasse substrate (bagasse pulp) obtained by acid sulphite cooking, under conditions similar to those described in Example 2, from WO 2010/078930, is subjected to continuous hydrolysis in an experimental unit with 3 serial reactors, as shown in 6. The total volume of the system, as measured, is approximately 6.6 liters. The reactors are shrouded and connected to a water bath to control the temperature, and cooling water circulates in the covers to minimize evaporation from the reactors.

Ферменты (Accellerase DUET от Genencor, CA, USA), буфер (натрий ацетатный буфер, концентрация в реакторах в стационарном состоянии 50 мМ) и пульпу из багассы непрерывно добавляют в реактор 1. Реакционную смесь поддерживают при 50°C в реакторах 1-3. Гидролизат собирают в резервуаре для продукта, который охлаждают водой примерно до 5°C.Enzymes (Accellerase DUET from Genencor, CA, USA), buffer (sodium acetate buffer, stationary concentration of 50 mM in reactors) and bagasse pulp are continuously added to reactor 1. The reaction mixture is maintained at 50 ° C in reactors 1-3. The hydrolyzate is collected in a product reservoir, which is cooled with water to about 5 ° C.

Среднее общее поступление в систему составляет 144,2 г/час. Средняя концентрация сухого субстрата на входе составляет 17,1%, и средняя нагрузка фермента составляет 0,273 г Accellerase DUET/г сухого субстрата. Среднее время гидролиза (удерживания), согласно вычислениям, составляет 46 час, считая, что плотность реакционной смеси составляет 1,0 г/мл.The average total intake of the system is 144.2 g / hour. The average concentration of dry substrate at the inlet is 17.1%, and the average enzyme load is 0.273 g Accellerase DUET / g dry substrate. The average hydrolysis (retention) time, according to calculations, is 46 hours, assuming that the density of the reaction mixture is 1.0 g / ml.

Выход из системы в резервуар для продукта взвешивают регулярно. Выход в среднем на 5,1% ниже, чем поступление в систему. Главной причиной потерь считается испарение воды из трех реакторов и/или аккумулирование материала в реакторах. Образцы отбирают изо всех трех реакторов дважды в день для измерения выхода глюкозы и ксилозы. Через 4-5 дней количества глюкозы и ксилозы во всех трех реакторах стабилизируются, показывая тем самым, что достигнуты условия стационарного состояния. Выход глюкозы вычисляют как (г выхода глюкозы/час)/(г поступления эквивалентов глюкозы/час). Выходы глюкозы в трех реакторах, вычисленные как средние значения по трем дням, при стационарном состоянии составляют 24,6% (реактор 1), 40,2% (реактор 2) и 49,6% (реактор 3). Выход ксилозы вычисляют как (г выхода ксилозы/час)/(г поступления эквивалентов ксилозы/час). Выходы ксилозы во всех трех реакторах, вычисленные как средние значения по трем дням, в стационарном состоянии, составляют 33,7% (реактор 1), 56,0% (реактор 2) и 66,0% (реактор 3). Вязкость измеряют с использованием реометра Physica MCR 101, снабженного чашкой с мешалкой (FL 100/6W), скорость вращения составляет 1 об/мин и температура равна 50°C. Среднее значение вязкости в реакторе 1 в стационарном состоянии составляет 1,7 Па·с (паскаль-секунда) по сравнению с вязкостью поступления (17,1% суспензия субстрата), которая, как измерено, составляет 82,2 Па·с.The exit from the system to the product tank is weighed regularly. The output is on average 5.1% lower than the entry into the system. The main cause of losses is the evaporation of water from three reactors and / or the accumulation of material in the reactors. Samples were taken from all three reactors twice a day to measure the yield of glucose and xylose. After 4-5 days, the amounts of glucose and xylose in all three reactors are stabilized, thereby showing that the conditions of the stationary state are achieved. Glucose yield is calculated as (g glucose output / hour) / (g glucose equivalents / hour). The glucose yields in the three reactors, calculated as the average of three days, at steady state are 24.6% (reactor 1), 40.2% (reactor 2), and 49.6% (reactor 3). The xylose yield is calculated as (g xylose yield / hour) / (g xylose equivalents / hour). The xylose yields in all three reactors, calculated as the average of three days, in steady state, are 33.7% (reactor 1), 56.0% (reactor 2) and 66.0% (reactor 3). Viscosity is measured using a Physica MCR 101 rheometer equipped with a stirrer cup (FL 100 / 6W), a rotation speed of 1 rpm and a temperature of 50 ° C. The average value of the viscosity in the reactor 1 in the stationary state is 1.7 Pa · s (pascal-second) compared with the viscosity of the input (17.1% suspension of the substrate), which, as measured, is 82.2 Pa · s.

Этот пример показывает, что непрерывный способ гидролиза при высоких нагрузках твердых веществ в стационарном состоянии дает гидролизат с очень высоким выходом глюкозы и ксилозы с использованием только обычного перемешивания. Вязкость в первом реакторе значительно ниже, чем для исходных материалов в стационарном состоянии.This example shows that a continuous process of hydrolysis at high loads of solids in a stationary state gives a hydrolyzate with a very high yield of glucose and xylose using only conventional mixing. The viscosity in the first reactor is much lower than for the starting materials in a stationary state.

Пример 3Example 3

Образец субстрата багассы (пульпы из багассы), полученной с помощью щелочной сульфитной варки, при условиях, сходных с теми, что описаны в Примере 1 из WO 2010/078930, подвергают воздействию гидролиза в экспериментальной установке с 3 последовательными реакторами, как изображено на Фигуре 6. Общий объем системы, согласно измерениям, составляет приблизительно 6,6 литра. Реакторы снабжены кожухами, и соединены с водяной баней для контроля температуры, и охлаждающая вода циркулирует в крышках для сведения к минимуму испарения из реакторов.A sample of bagasse substrate (bagasse pulp) obtained by alkaline sulphite cooking, under conditions similar to those described in Example 1 of WO 2010/078930, is subjected to hydrolysis in an experimental unit with 3 serial reactors, as shown in Figure 6 The total volume of the system, as measured, is approximately 6.6 liters. The reactors are jacketed and connected to a water bath for temperature control, and cooling water circulates in the covers to minimize evaporation from the reactors.

Ферменты (Accellerase DUET от Genencor, CA, USA), буфер (натрий ацетатный буфер, концентрация в реакторах в стационарном состоянии 50 мМ) и пульпу из багассы непрерывно добавляют в реактор 1. Реакционную смесь поддерживают при 50°C в реакторах 1-3. Гидролизат собирают в резервуаре для продукта, который охлаждают водой примерно до 5°C.Enzymes (Accellerase DUET from Genencor, CA, USA), buffer (sodium acetate buffer, stationary concentration of 50 mM in reactors) and bagasse pulp are continuously added to reactor 1. The reaction mixture is maintained at 50 ° C in reactors 1-3. The hydrolyzate is collected in a product reservoir, which is cooled with water to about 5 ° C.

Среднее общее поступление в систему составляет 144,1 г/час. Средняя концентрация сухого субстрата на входе составляет 18,8%, и средняя нагрузка фермента составляет 0,173 г Accelerase DUET/г сухого субстрата. Среднее время гидролиза (удерживания), согласно вычислениям, составляет 46 час, считая, что плотность реакционной смеси составляет 1,0 г/мл.The average total intake of the system is 144.1 g / hour. The average concentration of dry substrate inlet is 18.8%, and the average enzyme load is 0.173 g Accelerase DUET / g dry substrate. The average hydrolysis (retention) time, according to calculations, is 46 hours, assuming that the density of the reaction mixture is 1.0 g / ml.

Выход из системы в резервуар для продукта взвешивают регулярно. Выход в среднем на 1% ниже, чем поступление в систему. Главной причиной потерь считается испарение воды из трех реакторов и/или аккумулирование материала в реакторах. Образцы отбирают изо всех трех реакторов дважды в день для измерения выхода глюкозы и ксилозы. Через 4-5 дней количества глюкозы и ксилозы во всех трех реакторах стабилизируются, показывая тем самым, что достигнуты условия стационарного состояния. Выход глюкозы вычисляют как (г выхода глюкозы/час)/(г поступления эквивалентов глюкозы/час). Выходы глюкозы в трех реакторах, вычисленные как средние значения по трем дням, при стационарном состоянии составляют 39,8% (реактор 1), 55,0% (реактор 2) и 58,8% (реактор 3). Выходы ксилозы вычисляют как (г выхода ксилозы /час)/(г поступления эквивалентов ксилозы/час). Выходы ксилозы в трех реакторах, вычисленные как средние значения по трем дням, в стационарном состоянии составляют 75,0% (реактор 1), 93,2% (реактор 2) и 89,6% (реактор 3). Вязкость измеряют с использованием реометра Physica MCR 101, снабженного чашкой с мешалкой (FL 100/6W), скорость вращения составляет 30 об/мин, и температура равна 50°C. Среднее значение вязкости в реакторе 1 в стационарном состоянии составляет 1,5 Па·с (паскаль-секунда), по сравнению с вязкостью моделируемого поступления (10% суспензия субстрата должна использоваться вместо 18,8% суспензии субстрата из-за очень высокой вязкости), которая, как измерено, составляет 249 Па·с.The exit from the system to the product tank is weighed regularly. The output is on average 1% lower than the entry into the system. The main cause of losses is the evaporation of water from three reactors and / or the accumulation of material in the reactors. Samples were taken from all three reactors twice a day to measure the yield of glucose and xylose. After 4-5 days, the amounts of glucose and xylose in all three reactors are stabilized, thereby showing that the conditions of the stationary state are achieved. Glucose yield is calculated as (g glucose output / hour) / (g glucose equivalents / hour). The glucose yields in the three reactors, calculated as the average of three days, at steady state are 39.8% (reactor 1), 55.0% (reactor 2), and 58.8% (reactor 3). The xylose yields are calculated as (g xylose yields / hour) / (g xylose equivalents / hr). The xylose yields in the three reactors, calculated as the average of three days, in the stationary state are 75.0% (reactor 1), 93.2% (reactor 2), and 89.6% (reactor 3). Viscosity is measured using a Physica MCR 101 rheometer equipped with a stirrer cup (FL 100 / 6W), a rotation speed of 30 rpm and a temperature of 50 ° C. The average viscosity in reactor 1 in stationary state is 1.5 Pa · s (pascal-second), compared with the viscosity of the simulated input (10% suspension of the substrate should be used instead of 18.8% suspension of the substrate due to its very high viscosity), which, as measured, is 249 Pa · s.

Этот пример показывает, что непрерывный способ гидролиза на основе другого субстрата при высоких нагрузках твердых веществ в стационарном состоянии дает гидролизат с очень высоким выходом глюкозы и ксилозы с использованием только обычного перемешивания. Вязкость в первом реакторе значительно ниже, чем для исходных материалов в стационарном состоянии.This example shows that a continuous hydrolysis process based on another substrate at high loads of solids in a stationary state produces a hydrolyzate with a very high yield of glucose and xylose using only normal mixing. The viscosity in the first reactor is much lower than for the starting materials in a stationary state.

Claims (13)

1. Способ непрерывного гидролиза целлюлозной биологической массы, включающий по меньшей мере следующие стадии:
(Р) обеспечения по меньшей мере одного реактора, который может работать в стационарном состоянии;
(А) добавления заданного количества целлюлозной биологической массы в указанный реактор, при этом указанная целлюлозная биологическая масса имеет содержание твердых продуктов по меньшей мере 10 мас.%;
(А') добавления ферментов в указанный по меньшей мере один реактор, при этом указанные ферменты содержат комплексы внеклеточных или ассоциированных с клеточными мембранами ферментов, в частности смесь целлюлаз и β-глюкозидаз, которые могут специфично гидролизовать полимер целлюлозы до растворимых мономеров глюкозы;
(Е) осуществления по меньшей мере частичного ферментативного гидролиза целлюлозной биологической массы в указанном реакторе,
при этом достигается стационарное состояние, при котором целлюлозную биологическую массу непрерывно добавляют в указанный по меньшей мере один реактор, в то время как по меньшей мере частично гидролизованную целлюлозную биологическую массу непрерывно удаляют из указанного по меньшей мере одного реактора, при этом указанная по меньшей мере частично гидролизованная целлюлозная биологическая масса, которую непрерывно удаляют, имеет вязкость, как измерено на реометре Physica MCR 101 в чашке с мешалкой (FL 100/6W), не более чем 25 Па·с (Паскаль-секунда).1. The method of continuous hydrolysis of cellulosic biological mass, comprising at least the following stages:
(P) providing at least one reactor that can operate in a stationary state;
(A) adding a predetermined amount of cellulosic biological mass to said reactor, wherein said cellulosic biological mass has a solids content of at least 10 wt.%;
(A ′) adding enzymes to said at least one reactor, said enzymes containing complexes of extracellular or cell membrane associated enzymes, in particular a mixture of cellulases and β-glucosidases that can specifically hydrolyze the cellulose polymer to soluble glucose monomers;
(E) the implementation of at least partial enzymatic hydrolysis of the cellulosic biological mass in the specified reactor,
this achieves a stationary state in which the cellulosic biological mass is continuously added to the specified at least one reactor, while at least partially hydrolyzed cellulosic biological mass is continuously removed from the specified at least one reactor, while at least partially the hydrolyzed cellulosic biological mass, which is continuously removed, has a viscosity of not more than 25 Pa · s (Pascal second), as measured on a Physica MCR 101 rheometer in a cup with stirrer (FL 100 / 6W). 2. Способ по п.1, в котором на стадии (Р) создается каскад по меньшей мере из двух реакторов, и который предпочтительно дополнительно включает следующие стадии
(Т) непрерывного удаления частично гидролизованной целлюлозной биологической массы со стадии (Е), которая имеет вязкость, как измерено на реометре Physica MCR 101 в чашке с мешалкой (FL 100/6W), не более чем 25 Па·с, и переноса ее в последующий реактор, который может работать в стационарном состоянии;
(Е') осуществления дополнительного ферментативного гидролиза частично гидролизованной целлюлозной биологической массы со стадии (Е) в указанном последующем реакторе.2. The method according to claim 1, in which at the stage (P) creates a cascade of at least two reactors, and which preferably further includes the following stages
(T) continuously removing the partially hydrolyzed cellulosic biological mass from step (E), which has a viscosity, as measured on a Physica MCR 101 rheometer in a stirrer cup (FL 100 / 6W), of not more than 25 Pa · s, and transferring it to a subsequent reactor that can operate in a stationary state;
(E ') the implementation of additional enzymatic hydrolysis of partially hydrolyzed cellulosic biological mass from stage (E) in the specified subsequent reactor. 3. Способ по п.1 или 2, в котором содержание твердых продуктов целлюлозной биологической массы, которую добавляют в указанный реактор, составляет по меньшей мере 15 мас.%, предпочтительно по меньшей мере 20 мас.%, предпочтительно по меньшей мере 25 мас.%, более предпочтительно по меньшей мере 30 мас.%; более предпочтительно 10 мас.% - 45 мас.%, более предпочтительно 15 мас.% - 45 мас.%, более предпочтительно 20 мас.% - 40 мас.% или от 15 мас.% до 30 мас.%.3. The method according to claim 1 or 2, in which the solids content of the cellulosic biological mass, which is added to the specified reactor, is at least 15 wt.%, Preferably at least 20 wt.%, Preferably at least 25 wt. %, more preferably at least 30 wt.%; more preferably 10 wt.% - 45 wt.%, more preferably 15 wt.% - 45 wt.%, more preferably 20 wt.% - 40 wt.% or from 15 wt.% to 30 wt.%. 4. Способ по п. 1 или 2, в котором вязкость непрерывно удаляемой частично гидролизованной целлюлозной биологической массы, как измерено на реометре Physica MCR 101 в чашке с мешалкой (FL 100/6W), составляет не более чем 10 Па·с, предпочтительно не более чем 5 Па·с, более предпочтительно не более чем 3 Па·с, более предпочтительно не более чем 1 Па·с.4. The method according to claim 1 or 2, in which the viscosity of the continuously removed partially hydrolyzed cellulosic biological mass, as measured on a Physica MCR 101 rheometer in a cup with stirrer (FL 100 / 6W), is not more than 10 Pa · s, preferably not more than 5 Pa · s, more preferably not more than 3 Pa · s, more preferably not more than 1 Pa · s. 5. Способ по п.1 или 2, в котором целлюлозная биологическая масса представляет собой лигноцеллюлозную биологическую массу и предпочтительно содержит древесину, однолетние растения, сельскохозяйственные остатки или отходы, в частности багассу или энергетические культуры.5. The method according to claim 1 or 2, in which the cellulosic biological mass is a lignocellulosic biological mass and preferably contains wood, annual plants, agricultural residues or waste, in particular bagasse or energy crops. 6. Способ по п.1 или 2, в котором целлюлозная биологическая масса содержит более 70 мас.% целлюлозы.6. The method according to claim 1 or 2, in which the cellulosic biological mass contains more than 70 wt.% Cellulose. 7. Способ по п.1 или 2, в котором целлюлозную биологическую массу подвергают воздействию предварительной обработки перед указанным гидролизом, где указанная предварительная обработка предпочтительно представляет собой сульфитную варку и целлюлозная биологическая масса предпочтительно представляет собой лигноцеллюлозную биологическую массу.7. The method according to claim 1 or 2, in which the cellulosic biological mass is subjected to pretreatment before said hydrolysis, wherein said pretreatment is preferably sulphite cooking and the cellulosic biological mass is preferably lignocellulosic biological mass. 8. Способ по п. 1 или 2, в котором реактор представляет собой CSTR, то есть проточный реактор с мешалкой.8. The method according to p. 1 or 2, in which the reactor is a CSTR, that is, a flow reactor with a stirrer. 9. Способ по п. 1, в котором ферменты включают целлюлазы, гемицеллюлазы и/или β-глюкозидазы.9. The method of claim 1, wherein the enzymes include cellulase, hemicellulase and / or β-glucosidase. 10. Способ по п.1 или 2, в котором по меньшей мере некоторую часть по меньшей мере частично гидролизованной целлюлозной биологической массы, которую непрерывно удаляют из реактора, подвергают воздействию стадии разделения, при этом негидролизованные твердые продукты по меньшей мере частично отделяют по меньшей мере от части гидролизата, то есть жидкой фазы, содержащей гидролизованную целлюлозную биологическую массу и ферменты, при этом указанный гидролизат смешивают затем с целлюлозной биологической массой, которую затем вводят в стадию (А) способа.10. The method according to claim 1 or 2, in which at least some of the at least partially hydrolyzed cellulosic pulp, which is continuously removed from the reactor, is subjected to a separation step, wherein the non-hydrolyzed solids are at least partially separated at least partially from a portion of the hydrolyzate, i.e. the liquid phase, containing the hydrolyzed cellulosic biological mass and enzymes, wherein said hydrolyzate is then mixed with the cellulosic biological mass, which is then introduced into the stage (A) method. 11. Способ по п.2, в котором используют каскад из двух или более реакторов для гидролиза,
и в котором по меньшей мере некоторую часть гидролизата, то есть жидкой фазы, содержащей гидролизованную целлюлозную биологическую массу и ферменты, из первого реактора отделяют от твердой фазы и подвергают дальнейшей переработке,
и в котором указанную твердую фазу от указанного разделения добавляют в следующий далее реактор, предпочтительно имеющий меньший размер и/или объем, чем первый реактор, более предпочтительно, где дополнительное заданное количество фермента добавляют в указанный следующий далее реактор.11. The method according to claim 2, in which a cascade of two or more reactors is used for hydrolysis,
and in which at least some of the hydrolyzate, that is, the liquid phase containing the hydrolyzed cellulosic biological mass and enzymes from the first reactor is separated from the solid phase and subjected to further processing,
and wherein said solid phase from said separation is added to the next further reactor, preferably having a smaller size and / or volume than the first reactor, more preferably, where an additional predetermined amount of enzyme is added to the next following reactor. 12. Способ по п.11, который повторяют для любой последующей пары соседних реакторов в каскаде из трех или более реакторов для гидролиза, при этом, предпочтительно, каждый следующий реактор меньше по размеру и/или объему, чем каждый предшествующий реактор, соответственно.12. The method according to claim 11, which is repeated for any subsequent pair of adjacent reactors in a cascade of three or more hydrolysis reactors, preferably, each subsequent reactor is smaller in size and / or volume than each previous reactor, respectively. 13. Способ получения моносахаридов, химических веществ на основе сахаров, биологических топлив или материалов вместе с сульфонированным лигнином из лигноцеллюлозной биологической массы, включающий по меньшей мере следующие стадии:
(i) предварительной обработки лигноцеллюлозной биологической массы, предпочтительно, на стадии сульфитной варки;
(ii) разделения предварительно обработанной лигноцеллюлозной биологической массы со стадии (i) на
(а) жидкую фазу "отработанного сульфитного щелока", предпочтительно содержащую 50 мас.% или более лигнина из лигноцеллюлозной биологической массы в форме сульфонированного лигнина, и на
(b) пульпу, предпочтительно содержащую 70 мас.% или более целлюлозы из лигноцеллюлозной биологической массы;
(iii) гидролиза пульпы (b) со стадии (ii) до по меньшей мере частично гидролизованной целлюлозной биологической массы, содержащей моносахариды; при этом указанная стадия гидролиза представляет собой способ непрерывного гидролиза целлюлозной биологической массы по любому из пп.1-12;
(iv) необязательной дополнительной переработки моносахаридов со стадии (iii) с получением полезных химических веществ, биологических топлив и/или белков; и
(v) прямого преобразования или дополнительной переработки сульфонированного лигнина из жидкой фазы (а) со стадии (ii) в полезные химические вещества, биологические топлива и/или материалы. 13. A method for producing monosaccharides, sugar-based chemicals, biological fuels or materials together with sulfonated lignin from lignocellulosic biological mass, comprising at least the following steps:
(i) pretreatment of the lignocellulosic biological mass, preferably in a sulphite cooking step;
(ii) separating the pre-treated lignocellulosic biological mass from step (i) into
(a) a "spent sulfite liquor" liquid phase, preferably containing 50 wt.% or more of lignin from a lignocellulosic biological mass in the form of a sulfonated lignin, and
(b) pulp, preferably containing 70 wt.% or more of lignocellulosic pulp;
(iii) hydrolysis of the pulp (b) from step (ii) to at least partially hydrolyzed cellulosic pulp containing monosaccharides; wherein said hydrolysis step is a process for the continuous hydrolysis of cellulosic biological mass according to any one of claims 1 to 12;
(iv) optional further processing of the monosaccharides from step (iii) to produce useful chemicals, biofuels and / or proteins; and
(v) direct conversion or further processing of the sulfonated lignin from the liquid phase (a) from step (ii) into useful chemicals, biofuels and / or materials.

Images