RU2575066C2 - Bivalent bispecific antibodies - Google Patents
Bivalent bispecific antibodies Download PDFInfo
- Publication number
- RU2575066C2 RU2575066C2 RU2010129540/10A RU2010129540A RU2575066C2 RU 2575066 C2 RU2575066 C2 RU 2575066C2 RU 2010129540/10 A RU2010129540/10 A RU 2010129540/10A RU 2010129540 A RU2010129540 A RU 2010129540A RU 2575066 C2 RU2575066 C2 RU 2575066C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- heavy chain
- domain
- igf
- antibodies
- Prior art date
Links
- 108010071919 Bispecific Antibodies Proteins 0.000 title description 14
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 claims abstract description 409
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 claims abstract description 409
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 109
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 109
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 109
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 29
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 22
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 30
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 claims description 25
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 13
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 claims description 11
- 230000001131 transforming Effects 0.000 claims description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N D-serine Chemical compound OC[C@@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N D-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N 0.000 claims description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- 229960005190 Phenylalanine Drugs 0.000 claims description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract description 19
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 14
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 9
- 230000001965 increased Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 2
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 95
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 65
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 50
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 50
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 50
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 48
- 102100007747 ANGPT2 Human genes 0.000 description 38
- 101710043855 ANGPT2 Proteins 0.000 description 37
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 28
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 22
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 102100002977 CDR1 Human genes 0.000 description 16
- 101700073818 CDR1 Proteins 0.000 description 16
- 102000018358 Immunoglobulins Human genes 0.000 description 16
- 108060003951 Immunoglobulins Proteins 0.000 description 16
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 15
- 101710038213 AKR1C4 Proteins 0.000 description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 14
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 14
- 101710034060 RUNX1T1 Proteins 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 11
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 11
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 10
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 230000036462 Unbound Effects 0.000 description 9
- 108091006028 chimera Proteins 0.000 description 9
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 8
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 7
- 108010045030 monoclonal antibodies Proteins 0.000 description 7
- 102000005614 monoclonal antibodies Human genes 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 229940065638 Intron A Drugs 0.000 description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 6
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 5
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 5
- 102000015434 Humanized Monoclonal Antibodies Human genes 0.000 description 5
- 108010064750 Humanized Monoclonal Antibodies Proteins 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 229960000070 antineoplastic Monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 5
- 229960000060 monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 5
- 210000003719 B-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 4
- 230000035693 Fab Effects 0.000 description 4
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 4
- 229940072221 IMMUNOGLOBULINS Drugs 0.000 description 4
- AEMBWNDIEFEPTH-UHFFFAOYSA-N N-tert-butyl-N-ethylnitrous amide Chemical compound CCN(N=O)C(C)(C)C AEMBWNDIEFEPTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 4
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 230000001402 polyadenylating Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000003638 reducing agent Substances 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional Effects 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 description 4
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 3
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N Ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 210000002421 Cell Wall Anatomy 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 229920001320 Leader sequence (mRNA) Polymers 0.000 description 3
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 108091007229 NSP3 Papain-like protease domain Proteins 0.000 description 3
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 3
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 3
- 229920000401 Three prime untranslated region Polymers 0.000 description 3
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K Trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 102000006635 beta-Lactamases Human genes 0.000 description 3
- 108020004256 beta-Lactamases Proteins 0.000 description 3
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000023298 conjugation with cellular fusion Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037240 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory Effects 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 239000011778 trisodium citrate Substances 0.000 description 3
- ZTOJFFHGPLIVKC-CLFAGFIQSA-N ABTS Chemical compound S/1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N\N=C1/SC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N1CC ZTOJFFHGPLIVKC-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N Bis-tris methane Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M Coomassie Brilliant Blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 229960002743 Glutamine Drugs 0.000 description 2
- 210000004754 Hybrid Cells Anatomy 0.000 description 2
- 210000004408 Hybridomas Anatomy 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 231100000765 Toxin Toxicity 0.000 description 2
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Tris Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000003078 antioxidant Effects 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 102000024070 binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091007650 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 2
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 for example Proteins 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 2
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 2
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutic aid Substances 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 231100000773 point of departure Toxicity 0.000 description 2
- 229920000023 polynucleotide Polymers 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 101710044770 sll1951 Proteins 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000000392 somatic Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 108020003112 toxins Proteins 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000021037 unidirectional conjugation Effects 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2R,3R,4R,5R)-2-[(1S,2S,3R,4S,6R)-4,6-diamino-3-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1R)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- LBCZOTMMGHGTPH-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(OCCOCCO)C=C1 LBCZOTMMGHGTPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010048036 Angiopoietin-2 Proteins 0.000 description 1
- 210000000601 Blood Cells Anatomy 0.000 description 1
- SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L Brilliant Blue FCF Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 1
- 108009000280 Complement Activation Proteins 0.000 description 1
- 102000014447 Complement C1q Human genes 0.000 description 1
- 108010078043 Complement C1q Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000001161 Embryo, Mammalian Anatomy 0.000 description 1
- 102100015541 FCGR3A Human genes 0.000 description 1
- 101710044656 FCGR3A Proteins 0.000 description 1
- 101710044657 FCGR3B Proteins 0.000 description 1
- 210000003495 Flagella Anatomy 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N HEPES Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 1
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 229920002459 Intron Polymers 0.000 description 1
- 229920002521 Macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091005503 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229940055729 Papain Drugs 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000004268 Sodium erythorbin Substances 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091008153 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000000400 T-Lymphocytes, Cytotoxic Anatomy 0.000 description 1
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H Tricalcium phosphate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic Effects 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000005591 charge neutralization Effects 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- ANUSOIHIIPAHJV-UHFFFAOYSA-N fenticlor Chemical compound OC1=CC=C(Cl)C=C1SC1=CC(Cl)=CC=C1O ANUSOIHIIPAHJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 load Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 1
- 239000012516 mab select resin Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 media Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 1
- LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N oxophosphanyl Chemical group [P]=O LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplasts Anatomy 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000005700 syncytium formation by plasma membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к новым двухвалентным биспецифическим антителам, их получению и применению.The present invention relates to new bivalent bespecifically antibodies, their preparation and use.
Предпосылки создания изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION
В данной области известны сконструированные белки, такие как би- и мультиспецифические антитела, которые могут связываться с двумя или большим количеством антигенов. Указанные мультиспецифические связывающие белки можно создавать на основе методов клеточного слияния, химической конъюгации или рекомбинантной ДНК.Engineered proteins are known in the art, such as bi- and multispecific antibodies, which can bind to two or more antigens. These multispecific binding proteins can be created using cell fusion, chemical conjugation, or recombinant DNA methods.
В последние годы создано широкое разнообразие форматов рекомбинантных биспецифических антител, например, четырехвалентные биспецифические антитела, полученные путем слияния, например, антитела IgG-формата и одноцепочечных доменов (см., например, Coloma M.J. и др., Nature Biotech 15, 1997, сс.159-163; WO 2001/077342 и Morrison S.L., Nature Biotech 25, 2007, cc.1233-1234).In recent years, a wide variety of recombinant bispecific antibody formats have been created, for example, tetravalent bispecific antibodies obtained by fusion, for example, IgG format antibodies and single chain domains (see, for example, Coloma MJ et al., Nature Biotech 15, 1997, ss. 159-163; WO 2001/077342 and Morrison SL, Nature Biotech 25, 2007, cc. 1233-1234).
Разработано также несколько других новых форматов, в которых уже не сохранялась основная структура антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM), таких как диа-, триа- или тетратела, минитела, несколько одноцепочечных форматов (scFv, бис-scFv), которые могут связывать два или большее количество антигенов (Holliger Р. и др., Nature Biotech 23, 2005, сс.1126-1136; Fischer N., Leger O., Pathobiology 74, 2007, сс.3-14; Shen J и др., Journal of Immunological Methods 318, 2007, cc.65-74; Wu C. и др., Nature Biotech 25, 2007, cc.1290-1297)Several other new formats have also been developed in which the basic structure of the antibody (IgA, IgD, IgE, IgG or IgM), such as dia-, tri- or tetra-bodies, minuets, several single-chain formats (scFv, bis-scFv), has not been preserved which can bind two or more antigens (Holliger, R. et al., Nature Biotech 23, 2005, pp. 1126-1136; Fischer N., Leger O., Pathobiology 74, 2007, pp. 3-14; Shen J and et al., Journal of Immunological Methods 318, 2007, cc.65-74; Wu C. et al., Nature Biotech 25, 2007, cc. 1290-1297)
Во всех указанных форматах используют линкеры либо для слияния основной структуры антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM) с дополнительным связывающим белком (например, scFv), либо для слияния, например, двух Fab-фрагментов или scFv (Fischer N., Leger О., Pathobiology 74, 2007, cc.3-14). Хотя очевидно, что линкеры имеют преимущество при создании биспецифических антител, с ними могут быть связаны также проблемы терапевтического плана. Фактически эти чужеродные пептиды могут вызывать иммунный ответ против самого линкера или области стыка между белком и линкером. Кроме того, гибкая природа этих пептидов делает их более чувствительными к протеолитическому расщеплению, что может приводить к плохой стабильности, агрегации и повышению иммуногенности антитела. Кроме того, может существовать необходимость в поддержании эффекторных функций, таких как комплементзависимая цитотоксичность (CDC) или антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC), которые опосредуются связыванием с Fc-рецептором, путем сохранения высокой степени сходства с встречающимися в естественных условиях антителами.In all of these formats, linkers are used either to fuse the main structure of the antibody (IgA, IgD, IgE, IgG or IgM) with an additional binding protein (e.g. scFv), or to merge, for example, two Fab fragments or scFv (Fischer N., Leger, O., Pathobiology 74, 2007, cc. 3-14). Although it is obvious that linkers have an advantage in creating bispecific antibodies, problems of a therapeutic nature may also be associated with them. In fact, these foreign peptides can elicit an immune response against the linker itself or the interface between the protein and the linker. In addition, the flexible nature of these peptides makes them more sensitive to proteolytic cleavage, which can lead to poor stability, aggregation, and increased immunogenicity of the antibody. In addition, there may be a need to maintain effector functions such as complement dependent cytotoxicity (CDC) or antibody-dependent cell-dependent cytotoxicity (ADCC), which are mediated by binding to the Fc receptor, by maintaining a high degree of similarity with naturally occurring antibodies.
Таким образом, в идеальном варианте необходимо создавать биспецифические антитела, которые обладают очень сходной общей структурой с встречающимися в естественных условиях антителами (типа IgA, IgD, IgE, IgG или IgM), с минимальным отклонением от человеческих последовательностей.Thus, ideally, it is necessary to create bispecific antibodies that have a very similar overall structure to naturally occurring antibodies (such as IgA, IgD, IgE, IgG or IgM), with minimal deviation from human sequences.
В соответствии с одним из подходов биспецифические антитела с высокой степенью сходства с встречающимися в естественных условиях антителами создавали с помощью технологии квадром (квадрогибридом) (см. Milstein C. и A.C.Cuello, Nature, 305, 1983, сс.537-540) на основе соматического слияния двух различных клеточных линий гибридом, экспрессирующих мышиные моноклональные антитела с требуемыми специфичностями биспецифического антитела. В результате случайного спаривания тяжелых и легких цепей двух различных антител в образующейся линии клеток гибрида гибридомы (или квадромы) получают вплоть до 10 различных видов антител, из которых только одно представляет собой требуемое функциональное биспецифическое антитело. Из-за присутствия имеющих ошибочные спаривания побочных продуктов и в значительной степени сниженного выхода продукта, требуются более сложные процедуры очистки (см., например, Morrison S.L., Nature Biotech 25, 2007, сс.1233-1234). В целом, эта же проблема, связанная с имеющими ошибочные спаривания побочными продуктами, сохраняется при применении методов рекомбинантной экспрессии.In accordance with one approach, bispecific antibodies with a high degree of similarity with naturally occurring antibodies were created using quadra (quadrahybrid) technology (see Milstein C. and ACCuello, Nature, 305, 1983, pp. 537-540) based on somatic fusion of two different hybridoma cell lines expressing murine monoclonal antibodies with the required specificities of a bispecific antibody. As a result of random pairing of the heavy and light chains of two different antibodies in the resulting hybridoma (or quadroma) hybrid cell line, up to 10 different types of antibodies are obtained, of which only one is the desired functional bispecific antibody. Due to the presence of mismatched by-products and a significantly reduced product yield, more complex purification procedures are required (see, for example, Morrison S. L., Nature Biotech 25, 2007, pp. 1233-1234). In general, the same problem associated with erroneous mating by-products persists with the use of recombinant expression methods.
Подход, с помощью которого можно обойти проблему, связанную с имеющими ошибочные спаривания побочными продуктами, известный под названием «knobs-into-holes» (взаимодействие по типу «выступ-впадина»), направлен на усиление спаривания двух различных тяжелых цепей антитела путем интродукции мутаций в CH3-домены для модификации поверхности раздела в области контакта. На одной цепи имеющие большие размеры аминокислоты заменяли на аминокислоты с короткими боковыми цепями для создания «впадины». И, наоборот, аминокислоты с более крупными боковыми цепями интродуцировали в другой CH3-домен, создавая «выступ». Путем совместной экспрессии этих двух тяжелых цепей (и двух идентичных легких цепей, которые должны соответствовать обеим тяжелым цепям), получали высокий выход гетеродимерной формации («выступ-впадина») относительно гомодимерной формации («впадина-впадина» или «выступ-выступ») (Ridgway J.B., Presta L.G., Carter P. и WO 1996/027011). Процентное содержание гетеродимера можно дополнительно повышать путем ремоделирования поверхностей раздела двух CH3-доменов с помощью технологии фагового дисплея и интродукции дисульфидного мостика для стабилизации гетеродимеров (Merchant A.M, и др., Nature Biotech 16, 1998, сс.677-681; Atwell S., Ridgway J.В., Wells J.A., Carter P., J Mol Biol 270, 1997, cc.26-35). Новые подходы к технологии «knobs-into-holes» описаны, например, в EP 1870459 A1. Хотя указанный формат, вероятно, является очень привлекательным, в настоящее время отсутствуют данные о его развитии в направлении клинического применения. Одним из важных ограничений этой стратегии является то, что легкие цепи двух родительских антител должны быть идентичными для предупреждения ошибочных спариваний и формирования неактивных молекул. Таким образом, эта технология не пригодна для более легкого создания рекомбинантных двухвалентных биспецифических антител к двум антигенам с использованием в качестве исходных двух антител к первому и второму антигену, поскольку должны быть оптимизированы или тяжелые цепи этих антител, и/или идентичные легкие цепиAn approach by which to circumvent the problem associated with erroneous mating by-products, known as knobs-into-holes (protrusion-cavity interaction), is aimed at enhancing the pairing of two different antibody heavy chains by introducing mutations in CH3 domains to modify the interface in the contact area. On one chain, large amino acids were replaced by amino acids with short side chains to create a “hollow”. Conversely, amino acids with larger side chains were introduced into another CH3 domain, creating a “protrusion”. By co-expression of these two heavy chains (and two identical light chains that must correspond to both heavy chains), a high yield of the heterodimeric formation (“protrusion-trough”) relative to the homodimeric formation (“trough-trough” or “protrusion-protrusion”) was obtained (Ridgway JB, Presta LG, Carter P. and WO 1996/027011). The percentage of heterodimer can be further increased by remodeling the interface surfaces of two CH3 domains using phage display technology and the introduction of a disulfide bridge to stabilize heterodimers (Merchant AM et al., Nature Biotech 16, 1998, pp. 677-681; Atwell S., Ridgway J. B., Wells JA, Carter P., J Mol Biol 270, 1997, cc. 26-35). New approaches to knobs-into-holes technology are described, for example, in EP 1870459 A1. Although this format is probably very attractive, there is currently no data on its development in the direction of clinical use. One of the important limitations of this strategy is that the light chains of the two parent antibodies must be identical to prevent mismatches and the formation of inactive molecules. Thus, this technology is not suitable for easier creation of recombinant divalent bispecific bispecific antibodies to two antigens using two antibodies to the first and second antigens as initial two antibodies, since either the heavy chains of these antibodies and / or identical light chains should be optimized
У Simon T. и др., EMBO Journal, 9, 1990, сс.1051-1056 описаны мутанты доменов моноспецифических антител.Simon T. et al., EMBO Journal, 9, 1990, pp. 1051-1056 describe mutants of monospecific antibody domains.
Краткое изложение сущности изобретенияSummary of the invention
Настоящее изобретение относится к двухвалентному биспецифическому антителу, содержащему:The present invention relates to a divalent bispecific antibody, comprising:
а) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося с первым антигеном; иa) the light chain and heavy chain of an antibody that specifically binds to the first antigen; and
б) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося со вторым антигеном, в котором CL- и CH1-домены константных областей (константные CL- и CH1-домены) заменены друг на друга.b) the light chain and heavy chain of an antibody that specifically binds to a second antigen in which the CL and CH1 domains of the constant regions (constant CL and CH1 domains) are replaced by each other.
Следующим вариантом осуществления изобретения является способ получения двухвалентного биспецифического антитела, предлагаемого в изобретении, заключающийся в том, чтоThe next embodiment of the invention is a method for producing a divalent bispecific antibody of the invention, which consists in the fact that
а) трансформируют клетку-хозяинаa) transform the host cell
- векторами, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие легкую цепь и тяжелую цепь антитела, которое специфически связывается с первым антигеном,- vectors that contain nucleic acid molecules encoding the light chain and heavy chain of an antibody that specifically binds to the first antigen,
- векторами, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие легкую цепь и тяжелую цепь антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном, в котором CL- и CH1-домены константных областей заменены друг на друга;- vectors that contain nucleic acid molecules encoding the light chain and heavy chain of an antibody that specifically binds to a second antigen in which the CL and CH1 domains of the constant regions are replaced by each other;
б) культивируют клетку-хозяина в условиях, которые позволяют синтезировать указанную молекулу антитела; иb) cultivate the host cell under conditions that allow the synthesis of the indicated antibody molecule; and
в) выделяют молекулу антитела из культуры.c) isolate the antibody molecule from the culture.
Следующим вариантом осуществления изобретения является клетка-хозяин, содержащаяA further embodiment of the invention is a host cell comprising
- векторы, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие легкую цепь и тяжелую цепь антитела, которое специфически связывается с первым антигеном,- vectors that contain nucleic acid molecules encoding the light chain and heavy chain of an antibody that specifically binds to the first antigen,
- векторы, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие легкую цепь и тяжелую цепь антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном, в котором CL- и CH1-домены константных областей замены друг на друга.- vectors that contain nucleic acid molecules encoding the light chain and heavy chain of an antibody that specifically binds to a second antigen in which the CL and CH1 domains of the constant regions are replaced by each other.
Следующим вариантом осуществления изобретения является композиция, предпочтительно фармацевтическая или диагностическая композиция антитела, предлагаемого в изобретении.A further embodiment of the invention is a composition, preferably a pharmaceutical or diagnostic composition of an antibody of the invention.
Следующим вариантом осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, которая содержит антитело, предлагаемое в изобретении, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.A further embodiment of the invention is a pharmaceutical composition which comprises an antibody of the invention and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
Следующим вариантом осуществления изобретения является способ лечения пациента, который нуждается в терапии, отличающийся тем, что вводят пациенту в терапевтически эффективном количестве антитело, предлагаемое в изобретении.A further embodiment of the invention is a method of treating a patient who needs therapy, characterized in that the antibody of the invention is administered to the patient in a therapeutically effective amount.
Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Изобретение относится к двухвалентному биспецифическому антителу, содержащему:The invention relates to a divalent bispecific antibody containing:
а) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося с первым антигеном; иa) the light chain and heavy chain of an antibody that specifically binds to the first antigen; and
б) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося со вторым антигеном, в котором CL- и CH1-домены константных областей заменены друг на друга.b) the light chain and heavy chain of an antibody that specifically binds to a second antigen in which the CL and CH1 domains of the constant regions are replaced by each other.
Таким образом, двухвалентное биспецифическое антитело содержит:Thus, a divalent bispecific antibody contains:
а) первую легкую цепь и первую тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося с первым антигеном; иa) the first light chain and the first heavy chain of an antibody that specifically binds to the first antigen; and
б) вторую легкую цепь и вторую тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося со вторым антигеном, в котором CL- и CH1-домены константных областей второй легкой цепи и второй тяжелой цепи заменены друг на друга.b) a second light chain and a second heavy chain of an antibody specifically binding to the second antigen, in which the CL and CH1 domains of the constant regions of the second light chain and the second heavy chain are replaced by each other.
Таким образом, для создания антитела, специфически связывающегося со вторым антигеном, применяют следующие процессы: в легкой цепиThus, to create an antibody that specifically binds to the second antigen, the following processes are used: in the light chain
CL-домен константной области легкой цепи заменяют на CH1-домен константной области тяжелой цепи указанного антитела; и в тяжелой цепи The CL domain of the constant region of the light chain is replaced by the CH1 domain of the constant region of the heavy chain of the indicated antibody; and in the heavy chain
CH1-домен константной области тяжелой цепи заменяют на CL-домен константной области легкой цепи указанного антитела.The CH1 domain of the constant region of the heavy chain is replaced by the CL domain of the constant region of the light chain of the indicated antibody.
Понятие «антитело» к контексте настоящего описания относится к полным моноклональным антителам. Такие полные антитела состоят из двух пар, каждая из которых включает «легкую цепь» (LC) и «тяжелую цепь» (HC) (указанные пары легкая цепь (LC)/тяжелая цепь сокращенно обозначают в контексте настоящего описания как LC/HC). Легкие цепи и тяжелые цепи указанных антител представляют собой полипептиды, состоящие из нескольких доменов (областей). В полном антителе каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно обозначена в контексте настоящего описания как HCVR или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит константные CH1-, СН2- и CH3-домены тяжелой цепи (в антителе, которое относится к классам IgA, IgD и IgG) и необязательно константный CH4-домен тяжелой цепи (в антителе, которое относится к классам IgE и IgM). Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен легкой цепи VL и константный домен легкой цепи CL. Структура одного из классов встречающихся в естественных условиях антител, а именно антитела класса IgG, показана, например, на фиг.1. Вариабельные домены VH и VL можно дополнительно подразделять на области гипервариабельности, обозначенные как гипервариабельные участки (CDR), перемежающиеся более консервативными областями, которые называют каркасными участками (FR). Каждая VH- и VL-область состоит из трех CDR и четырех FR, которые расположены в направлении от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 ((Janeway C.A., Jr. и др., Immunobiology, 5-е изд., изд-во Garland Publishing, 2001; и Woof J., Burton D., Nat Rev Immunol 4, 2004, cc.89-99). Две пары, каждая из которых включает тяжелую цепь и легкую цепь (HC/LC), обладают способностью специфически связываться с одним и тем же антигеном. Таким образом, полное антитело представляет собой двухвалентное моноспецифическое антитело. Указанные «антитела» представляют собой, например, мышиные антитела, человеческие антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела и созданные с помощью генной инженерии антитела (варианты антител или мутантные антитела), если они сохраняют свои характерные свойства. Наиболее предпочтительными являются человеческие или гуманизированные антитела, прежде всего в виде рекомбинантных человеческих или гуманизированных антител.The term "antibody" as used herein refers to complete monoclonal antibodies. Such complete antibodies consist of two pairs, each of which includes a "light chain" (LC) and a "heavy chain" (HC) (these pairs of light chain (LC) / heavy chain are abbreviated in the context of the present description as LC / HC). Light chains and heavy chains of these antibodies are polypeptides consisting of several domains (regions). In a complete antibody, each heavy chain contains a variable region of the heavy chain (abbreviated as HCVR or VH in the context of the present description) and a constant region of the heavy chain. The constant region of the heavy chain contains constant CH1, CH2 and CH3 domains of the heavy chain (in the antibody, which belongs to the classes of IgA, IgD and IgG) and optionally constant CH4 domain of the heavy chain (in the antibody, which refers to the classes of IgE and IgM ) Each light chain contains the variable domain of the light chain VL and the constant domain of the light chain CL. The structure of one of the classes of naturally occurring antibodies, namely antibodies of the IgG class, is shown, for example, in FIG. The variable domains VH and VL can be further subdivided into regions of hypervariability, designated as hypervariable regions (CDR), interspersed with more conservative regions, which are called framework regions (FR). Each VH and VL region consists of three CDRs and four FRs, which are located in the direction from the amino terminus to the carboxy terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 ((Janeway CA, Jr. et al. , Immunobiology, 5th ed., Garland Publishing, 2001; and Woof J., Burton D., Nat Rev Immunol 4, 2004, cc.89-99). Two pairs, each of which includes a heavy chain and light chain (HC / LC), have the ability to specifically bind to the same antigen. Thus, the complete antibody is a bivalent monospecific antibody. These "antibodies" are, for example, mouse anti ate, human antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies and by using genetic engineering antibodies (antibody variants or mutant antibodies), if they retain their characteristic properties. Most preferred are human or humanized antibodies, especially as recombinant human or humanized antibodies.
Известно пять типов тяжелых цепей антител млекопитающих, которые обозначают греческими буквами: α, δ, ε, γ и µ. (Janeway C.A., Jr. и др., Immunobiology, 5-е изд., изд-во Garland Publishing, 2001). Присутствующий тип тяжелой цепи определяет класс антитела; указанные цепи обнаружены в антителах типа IgA, IgD, IgE, IgG и IgM соответственно (Rhoades R.A., Pflanzer R.G., Human Physiology, 4-е изд., изд-во Thomson Learning, 2002). Различные тяжелые цепи отличаются по размеру и составу; а и у содержат примерно 450 аминокислот, а µ и ε состоят примерно из 550 аминокислот.Five types of mammalian antibody heavy chains are known, which are denoted by Greek letters: α, δ, ε, γ, and μ. (Janeway C.A., Jr. et al., Immunobiology, 5th ed., Garland Publishing, 2001). The type of heavy chain present determines the class of antibody; these chains were found in antibodies of the type IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, respectively (Rhoades R.A., Pflanzer R.G., Human Physiology, 4th ed., Thomson Learning, 2002). Different heavy chains differ in size and composition; a and y contain approximately 450 amino acids, while µ and ε are composed of approximately 550 amino acids.
Каждая тяжелая цепь содержит две области, т.е. константную область и вариабельную область. Константная область является идентичной во всех антителах одного и того же изотипа, но отличается в антителах различного изотипа. Тяжелые цепи γ, α и δ содержат константную область, которая состоит из трех константных доменов CH1, СН2 и CH3 (выстроены в ряд) и шарнирной области, которая придает гибкость (Woof J., Burton D., Nat Rev Immunol 4, 2004, cc.89-99); тяжелые цепи µ и ε содержат константную область, которая состоит из четырех константных доменов CH1, СН2, CH3 и CH4 (Janeway C.A., Jr. и др., Immunobiology, 5-е изд., изд-во Garland Publishing, 2001). Вариабельная область тяжелой цепи отличается у антител, которые продуцируются различными B-клетками, но является одинаковой у всех антител, продуцируемых индивидуальной B-клеткой или B-клеточным клоном. Вариабельная область каждой тяжелой цепи антитела содержит примерно 110 аминокислот и состоит из одного домена.Each heavy chain contains two regions, i.e. constant region and variable region. The constant region is identical in all antibodies of the same isotype, but differs in antibodies of a different isotype. The heavy chains γ, α and δ contain a constant region, which consists of three constant domains CH1, CH2 and CH3 (aligned) and a hinge region, which gives flexibility (Woof J., Burton D.,
У млекопитающих известно только два типа легких цепей, которые обозначают как лямбда (λ) и каппа (κ). Легкая цепь состоит из двух последовательно расположенных доменов: один константный домен CL и один вариабельный домен VL. Примерная длина легкой цепи составляет 211-217 аминокислот. Предпочтительно легкая цепь представляет собой легкую каппа (κ)-цепь, а константный домен CL предпочтительно представляет собой С-каппа (κ).In mammals, only two types of light chains are known, which are designated as lambda (λ) and kappa (κ). The light chain consists of two consecutive domains: one constant domain CL and one variable domain VL. The approximate length of the light chain is 211-217 amino acids. Preferably, the light chain is a light kappa (κ) chain, and the constant domain CL is preferably a C-kappa (κ).
Понятия «моноклональное антитело» или «композиция моноклонального антитела» в контексте настоящего описания относится к препарату молекул антител одинакового аминокислотного состава.The term "monoclonal antibody" or "composition of a monoclonal antibody" in the context of the present description refers to the preparation of antibody molecules of the same amino acid composition.
«Антитела» согласно изобретению могут представлять собой антитела любого класса (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, предпочтительно IgG или IgE) или подкласса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2, предпочтительно IgG1), при этом оба антитела, из которых выводят двухвалентное биспецифическое антитело, предлагаемое в изобретение, имеют Fc-область одного и того же подкласса (например, IgG1, IgG4 и т.п., предпочтительно IgG1), предпочтительно одного и того же аллотипа (например, кавказского)."Antibodies" according to the invention can be antibodies of any class (eg, IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, preferably IgG or IgE) or a subclass (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2, preferably IgG1), however, both antibodies from which the divalent bispecific antibody of the invention are derived have the Fc region of the same subclass (e.g., IgG1, IgG4 and the like, preferably IgG1), preferably the same allotype (e.g. Caucasian).
Понятие «Fc-область (фрагмент) антитела» хорошо известно специалистам в данной области и ее определяют на основе расщепления антител папаином. Антитела, предлагаемые в изобретении, содержат в качестве Fc-области предпочтительно Fc-область, полученную из человеческого антитела, и предпочтительно все другие части человеческих константных областей. Fc-область антитела непосредственно участвует в активации комплемента, C1q-связывании, C3-активации и связывании Fc-рецептора. В то время как влияние антитела на систему комплемента зависит от определенных условий, связывание с C1q обусловлено определенными сайтами связывания в Fc-области. Указанные сайты связывания известны в данной области и описаны, например, у Lukas T.J. и др., J. Immunol. 127, 1981, сс.2555-2560; Brunhouse R. и Cebra J.J., Mol. Immunol. 16, 1979, сс.907-917; Burton D.R. и др., Nature 288, 1980, сс.338-344; Thommesen J.E. и др., Mol. Immunol. 37, 2000, cc.995-1004; Idusogie E.E. и др., J. Immunol. 164, 2000, cc.4178-4184; Hezareh M. и др., J. Virol. 75, 2001, cc.12161-12168; Morgan А. и др., Immunology 86, 1995, cc.319-324; и EP 0307434. Указанные сайты связывания представляют собой, например, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 и P329 (нумерация дана согласно нумерации EU Кэбота, см. ниже). Антитела подклассов IgG1, IgG2 и IgG3, как правило, характеризуются способностью к активации комплемента, C1q-связыванию и C3-активации, в то время как IgG4 не активируют систему комплемента, не связываются с C1q и не активируют C3. Предпочтительно Fc-область представляет собой человеческую Fc-область.The term “Fc region (fragment) of an antibody” is well known to those skilled in the art and is determined based on the breakdown of antibodies by papain. The antibodies of the invention comprise, as an Fc region, preferably an Fc region derived from a human antibody, and preferably all other parts of the human constant regions. The Fc region of the antibody is directly involved in complement activation, C1q binding, C3 activation and Fc receptor binding. While the effect of the antibody on the complement system depends on certain conditions, the binding to C1q is due to certain binding sites in the Fc region. These binding sites are known in the art and are described, for example, in Lukas T.J. et al., J. Immunol. 127, 1981, pp. 2555-2560; Brunhouse R. and Cebra J. J., Mol. Immunol. 16, 1979, pp. 907-917; Burton D.R. et al., Nature 288, 1980, pp. 338-344; Thommesen J.E. et al., Mol. Immunol. 37, 2000, cc.995-1004; Idusogie E.E. et al., J. Immunol. 164, 2000, cc. 4178-4184; Hezareh M. et al., J. Virol. 75, 2001, cc. 12161-12168; Morgan A. et al., Immunology 86, 1995, cc. 319-324; and EP 0307434. These binding sites are, for example, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 and P329 (numbering is given according to EU Cabot numbering, see below). Antibodies of subclasses IgG1, IgG2 and IgG3 are usually characterized by the ability to activate complement, C1q binding and C3 activation, while IgG4 do not activate the complement system, do not bind to C1q and do not activate C3. Preferably, the Fc region is a human Fc region.
Понятие «химерное антитело» относится к антителу, содержащему вариабельную область, т.е. связывающую область, полученную из одного источника или из одних и тех же видов, и по меньшей мере часть константной области, полученную из другого источника или других видов, и его, как правило, получают с использованием методов рекомбинантой ДНК. Предпочтительными являются химерные антитела, которые содержат мышиную вариабельную область и человеческую константную область. Другими предпочтительными формами «химерных антител», подпадающих под объем настоящего изобретения, являются антитела, константная область которых модифицирована или изменена по сравнению с исходным антителом с целью получения свойств, предлагаемых в изобретении, прежде всего касательно связывания C1q и/или связывания Fc-рецептора (FcR). Такие химерные антитела обозначают также как «антитела переключенного класса». Химерные антитела являются продуктом экспрессии генов иммуноглобулинов, содержащих сегменты ДНК, которые кодируют вариабельные области иммуноглобулинов, и сегменты ДНК, которые кодируют константные области иммуноглобулинов. Методы получения химерных антител включают обычные методы рекомбинантной ДНК и генной трансфекции, которые хорошо известны в данной области (см., например, Morrison S.L. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, cc.6851-6855; US 5202238 и US 5204244).The term "chimeric antibody" refers to an antibody containing a variable region, i.e. a binding region obtained from one source or from the same species, and at least part of a constant region obtained from another source or other species, and it is usually obtained using recombinant DNA methods. Preferred are chimeric antibodies that contain a murine variable region and a human constant region. Other preferred forms of "chimeric antibodies" falling within the scope of the present invention are antibodies, the constant region of which is modified or changed compared to the original antibody in order to obtain the properties proposed in the invention, especially with respect to C1q binding and / or Fc receptor binding ( FcR). Such chimeric antibodies are also referred to as “switched class antibodies”. Chimeric antibodies are the product of the expression of immunoglobulin genes containing DNA segments that encode the variable regions of immunoglobulins and DNA segments that encode the constant regions of immunoglobulins. Methods for producing chimeric antibodies include conventional recombinant DNA and gene transfection methods that are well known in the art (see, for example, Morrison SL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, cc.6851-6855; US 5202238 and US 5204244).
Понятие «гуманизированное антитело» относится к антителам, в которых каркасные или «гипервариабельные участки» (CDR) модифицированы так, что они содержат CDR иммуноглобулина другой специфичности по сравнению со специфичностью родительского иммуноглобулина. В предпочтительном варианте осуществления изобретения для получения «гуманизированного антитела» мышиный CDR трансплантируют в каркасный участок человеческого антитела (см., например, Riechmann L. и др., Nature 332, 1988, сс.323-327; и Neuberger M.S. и др., Nature 314, 1985, сс.268-270). Особенно предпочтительные CDR соответствуют CDR, которые представляют собой последовательности, распознающие антигены, указанные выше для химерных антител. Другими формами «гуманизированных антител», подпадающих под объем настоящего изобретения, являются антитела, константная область которых дополнительно модифицирована или изменена по сравнению с исходным антителом с целью получения свойств, предлагаемых в изобретении, прежде всего касательно связывания C1q и/или связывания Fc-рецептора (FcR).The term “humanized antibody” refers to antibodies in which the framework or “hypervariable regions” (CDRs) are modified to contain immunoglobulin CDRs of a different specificity compared to the specificity of the parental immunoglobulin. In a preferred embodiment of the invention, in order to obtain a “humanized antibody”, murine CDRs are transplanted into the framework region of a human antibody (see, for example, Riechmann L. et al., Nature 332, 1988, pp. 323-327; and Neuberger MS et al., Nature 314, 1985, pp. 268-270). Particularly preferred CDRs correspond to CDRs, which are sequences that recognize the antigens indicated above for chimeric antibodies. Other forms of “humanized antibodies” falling within the scope of the present invention are antibodies, the constant region of which is further modified or changed in comparison with the original antibody in order to obtain the properties proposed in the invention, especially with respect to C1q binding and / or Fc receptor binding ( FcR).
Понятие «человеческое антитело» в контексте настоящего описания относится к антителам, вариабельные и константные области которых выведены из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышей линии. Человеческие антитела хорошо известны в данной области (van Dijk М.А. и van de Winkel J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 2001, cc.368-374). Человеческие антитела можно получать также в трансгенных животных (например, мышах), которые в результате иммунизации могут продуцировать полный спектр или определенную часть человеческих антител при отсутствии производства эндогенного иммуноглобулина. Перенос набора генов иммуноглобулинов человеческой зародышевой линии в такую мутантную зародышевую линию мышей должен приводить к производству человеческих антител после антигенной стимуляции (см., например, Jakobovits А., и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, cc.2551-2555; Jakobovits А. и др., Nature 362, 1993, cc.255-258; Bruggemann M. и др., Year Immunol. 7, 1993, cc.33-40). Человеческие антитела можно получать также с помощью фаговых дисплейных библиотек (Hoogenboom H.R. и Winter, G., J. Mol. Biol. 227, 1992, cc.381-388; Marks J.D. и др., J. Mol. Biol. 222, 1991, cc.581-597). Для получения человеческих моноклональных антител можно использовать также методы Cole с соавторами и Boerner с соавторами (Cole и др., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, под ред. Alan R. Liss, 1985, c. 77; и Boerner P., и др., J. Immunol. 147, 1991, cc.86-95). Как уже было отмечено для химерных и гуманизированных антител, предлагаемых в изобретении, понятие «человеческое антитело» включает также такие антитела, константная область которых модифицирована с целью получения свойств, предлагаемых в изобретении, прежде всего касательно связывания C1q и/или связывания FcR, например, путем «переключения класса», т.е. замены или мутации Fc-областей (например, IgG1 на IgG4 и/или IgG1/IgG4-мутация).The term "human antibody" in the context of the present description refers to antibodies, the variable and constant regions of which are derived from immunoglobulin sequences of the human germ line. Human antibodies are well known in the art (van Dijk M.A. and van de Winkel J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 2001, cc. 368-374). Human antibodies can also be obtained in transgenic animals (for example, mice), which, as a result of immunization, can produce a full spectrum or a certain part of human antibodies in the absence of endogenous immunoglobulin production. Transferring a set of human germline immunoglobulin genes to such a mutant mouse germline should lead to the production of human antibodies after antigenic stimulation (see, for example, Jakobovits A., et al., Proc. Natl.
Понятие «рекомбинантное человеческое антитело» в контексте настоящего описания относится ко всем человеческим антителам, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с помощью методов рекомбинации, например, к антителам, выделенным из клетки-хозяина, такой как NS0- или CHO-клетка, или из животного (например, мыши), которое является трансгенным из-за присутствия человеческих генов иммуноглобулинов или антител, экспрессируемых с использованием рекомбинантного экспрессионного вектора, которым трансфектирована клетка-хозяин. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельную и константную области, которые находятся в преобразованной форме. Рекомбинантные человеческие антитела, предлагаемые в изобретении, подвергают соматической гипермутации in vivo. Таким образом, аминокислотные последовательности VH- и VL-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и выведены из последовательностей VH и VL человеческой зародышевой линии и родственных им линий, могут не существовать в естественных условиях в спектре зародышевой линии человеческих антител in vivo.The term "recombinant human antibody" in the context of the present description refers to all human antibodies that are obtained, expressed, created or isolated using recombination methods, for example, antibodies isolated from a host cell, such as an NS0 or CHO cell, or from an animal (eg, a mouse) that is transgenic due to the presence of human immunoglobulin genes or antibodies expressed using a recombinant expression vector by which the host cell is transfected. Such recombinant human antibodies have variable and constant regions that are in transformed form. Recombinant human antibodies of the invention are subjected to somatic hypermutation in vivo. Thus, the amino acid sequences of the VH and VL regions of recombinant antibodies are sequences that, although deduced from the VH and VL sequences of the human germline and their related lines, may not exist in vivo in the germline spectrum of human antibodies in vivo.
Понятие «вариабельная область (домен)» (вариабельный домен легкой цепи (VL), вариабельная область тяжелой цепи (VH)) в контексте настоящего описания относится к областям каждой из пары легких и тяжелой цепей, которые участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном. Домены вариабельных человеческих легких и тяжелых цепей имеют одинаковую общую структуру, и каждый домен содержит четыре каркасных участка (FR), последовательности которых являются весьма консервативными, связанных тремя «гипервариабельными участками» (или определяющими комплементарность участками, CDR). Каркасные участки адоптированы к β-складчатой конформации, a CDR могут образовывать петли, соединяющие β-складчатую структуру. CDR в каждой цепи сохраняют их трехмерную структуру с помощью каркасных участков и образуют вместе с CDR из других цепей антигенсвязывающий центр. CDR3-участки тяжелой и легкой цепей антитела играют особенно важную роль в специфичности связывания/аффинности антител, предлагаемых в изобретении, и поэтому являются дополнительным объектом изобретения.The term "variable region (domain)" (variable domain of the light chain (VL), variable region of the heavy chain (VH)) in the context of the present description refers to the regions of each of the pair of light and heavy chains that are directly involved in the binding of the antibody to the antigen. The domains of the variable human light and heavy chains have the same general structure, and each domain contains four frame sections (FR), the sequences of which are very conservative, linked by three "hypervariable regions" (or complementarity determining regions, CDR). Frame sections are adapted to the β-folded conformation, and CDRs can form loops connecting the β-folded structure. The CDRs in each chain retain their three-dimensional structure with the help of frame sections and form, together with the CDRs from other chains, an antigen-binding center. Antibody CDR3 regions of the heavy and light chains play a particularly important role in the specificity of binding / affinity of the antibodies of the invention, and therefore are an additional object of the invention.
Понятия «гипервариабельный участок» или «антигенсвязывающий центр антитела» в контексте настоящего описания относятся к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывания антигена. Гипервариабельный участок содержит аминокислотные остатки из «определяющих комплементарность участков» или «CDR». «Каркасные» или «FRw-участки представляют собой участки вариабельной области, отличные от указанных в настоящем описании остатков гипервариабельного участка. Таким образом, легкие и тяжелые цепи антитела содержат в направлении от N- к C-концу участки FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. CDR каждой цепи разделены аминокислотами указанного каркасного участка. В частности, CDR3 тяжелой цепи представляют собой участок, который вносит наибольший вклад в связывание с антигеном. CDR- и FR-участки определяют с помощью стандартной номенклатуры Кэбота (Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).The terms “hypervariable region” or “antigen binding site of an antibody” as used herein refer to the amino acid residues of an antibody that are responsible for antigen binding. The hypervariable region contains amino acid residues from the “complementarity determining regions” or “CDRs”. "Frame" or "FRw-sites are areas of the variable region, other than those specified in the present description of the remnants of the hypervariable region. Thus, the light and heavy chains of the antibody contain, from the N- to C-terminus, regions of FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 and FR4. The CDRs of each chain are separated by the amino acids of the indicated framework. In particular, heavy chain CDR3s are the site that contributes the most to antigen binding. CDR and FR plots are determined using standard Cabot nomenclature (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).
«Константные области (домены)» тяжелой цепи и легкой цепи не принимают непосредственного участия в связывании антитела с антигеном, но обладают различными эффекторными функциями. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области их тяжелых цепей антитела или иммуноглобулины подразделяют на указанные выше классы.The "constant regions (domains)" of the heavy chain and light chain do not directly participate in the binding of an antibody to an antigen, but they have different effector functions. Depending on the amino acid sequence of the constant region of their heavy chains, antibodies or immunoglobulins are divided into the above classes.
Понятие «двухвалентное биспецифическое антитело» в контексте настоящего описания относится к антителу, как оно описано выше, в котором каждая из двух пар, включающая тяжелую цепь и легкую цепь (HC/LC), специфически связывается с различным антигеном, т.е. первая тяжелая и первая легкая цепь (полученные из антитела к первому антигену) специфически связываются обе с первым антигеном, а вторая тяжелая и вторая легкая цепь (полученные из антитела ко второму антигену) специфически связываются обе со вторым антигеном (как показано на фиг.2); указанные двухвалентные биспецифические антитела обладают способностью специфически связываться одновременно с двумя различными антигенами и не более, чем с двумя антигенами, в отличие, во-первых, от моноспецифического антитела, которое обладает способностью связываться только с одним антигеном, и, во-вторых, от четырехвалентного тетраспецифического антитела, которое обладает способностью связываться одновременно с четырьмя молекулами антигенов.The term "bivalent bispecific antibody" in the context of the present description refers to an antibody as described above, in which each of the two pairs, including the heavy chain and light chain (HC / LC), specifically binds to a different antigen, i.e. the first heavy and first light chain (obtained from antibodies to the first antigen) both specifically bind to the first antigen, and the second heavy and second light chains (obtained from antibody to the second antigen) specifically bind both to the second antigen (as shown in FIG. 2) ; these bivalent bispecific antibodies have the ability to specifically bind simultaneously with two different antigens and no more than two antigens, in contrast, firstly, from a monospecific antibody, which has the ability to bind to only one antigen, and, secondly, from tetravalent tetraspecific antibodies that have the ability to bind simultaneously with four molecules of antigens.
Согласно изобретению соотношение между требуемым двухвалентным биспецифическим антителом и нежелательными побочными продуктами можно улучшать путем замены некоторых доменов только в одной паре, включающей тяжелую цепь и легкую цепь (HC/LC). Хотя первая из двух HC/LC-пар, полученная из антитела, которое специфически связывается с первым антигеном, остается практически не измененной, вторую из двух HC/LC-пар, полученную из антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном, изменяют с помощью следующей замены:According to the invention, the ratio between the desired bivalent bispecific antibody and undesirable by-products can be improved by replacing certain domains in only one pair, including the heavy chain and light chain (HC / LC). Although the first of the two HC / LC pairs derived from an antibody that specifically binds to the first antigen remains virtually unchanged, the second of the two HC / LC pairs derived from an antibody that specifically binds to the second antigen is modified using the following replacements:
легкая цепь: замена CL-домена константной области легкой цепи на CH1-домен константной области тяжелой цепи указанного антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном, иlight chain: replacing the CL domain of the constant region of the light chain with the CH1 domain of the constant region of the heavy chain of the indicated antibody, which specifically binds to the second antigen, and
тяжелая цепь: замена CH1-домена константной области тяжелой цепи на CL-домен константной области легкой цепи антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном.heavy chain: replacement of the CH1 domain of the constant region of the heavy chain with the CL domain of the constant region of the light chain of an antibody that specifically binds to the second antigen.
Таким образом, образовавшиеся двухвалентные биспецифические антитела представляют собой искусственные антитела, которые содержатThus, the resulting divalent bispecific antibodies are artificial antibodies that contain
а) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося с первым антигеном; иa) the light chain and heavy chain of an antibody that specifically binds to the first antigen; and
б) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося со вторым антигеном,b) the light chain and heavy chain of an antibody that specifically binds to the second antigen,
где указанная легкая цепь (антитела, специфически связывающегося со вторым антигеном) содержит константный домен CH1 вместо CL, и где указанная тяжелая цепь (антитела, специфически связывающегося со вторым антигеном) содержит константный домен CL вместо CH1.where said light chain (an antibody specifically binding to the second antigen) contains the constant domain of CH1 instead of CL, and where said heavy chain (an antibody specifically binding to the second antigen) contains the constant domain of CL instead of CH1.
Согласно еще одному объекту изобретения указанное улучшенное соотношение между требуемым двухвалентным биспецифическим антителом и нежелательными побочными продуктами можно дополнительно улучшать с помощью одного из указанных ниже двух альтернативных подходов:According to another aspect of the invention, said improved ratio between the desired bivalent bispecific antibody and undesired by-products can be further improved using one of the following two alternative approaches:
А) Первый альтернативный подход (см. фиг.3):A) The first alternative approach (see figure 3):
CH3-домены указанного двухвалентного биспецифического антитела, предлагаемого в изобретении, можно изменять с помощью технологии «knob-into-holes», которая описана подробно на нескольких примерах, например, в WO 96/027011, Ridgway J.В. и др., Protein Eng 9, 1996, сс.617-621; и у Merchant A.M. и др., Nat Biotechnol 16, 1998, сс.677-681. При использовании этого метода взаимодействующие поверхности двух CH3-доменов изменяют с целью повышения гетеродимеризации обеих тяжелых цепей, содержащих эти два CH3-домена. Каждый из двух CH3-доменов (двух тяжелых цепей) может представлять собой «выступ», а другой представлять собой «впадину». Введение дисульфидного мостика стабилизирует гетеродимеры (Merchant A.M, и др., Nature Biotech 16, 1998, сс.677-681; Atwell S., Ridgway J.В., Wells J.A, Carter P., J Mol Biol 270, 1997, cc.26-35) и повышает выход продукта.The CH3 domains of said bivalent bispecific antibody of the invention can be changed using the knob-into-holes technology, which is described in detail with a few examples, for example, in WO 96/027011, Ridgway J. B. et al.,
Таким образом, согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения CH3-домены двухвалентного биспецифического антитела, в котором первый CH3-домен и второй CH3-домен каждый соприкасается друг с другом на поверхности раздела, которая представляет собой исходную поверхность раздела между CH3-доменами антитела, изменяют с помощью технологии «knob-into-holes», включая дополнительную стабилизацию путем интродукции дисульфидного мостика в CH3-домены (как описано в WO 96/027011, Ridgway J.В. и др., Protein Eng 9, 1996, сс.617-621; Merchant A.M и др., Nature Biotech 16, 1998, сс.677-681; и Atwell S, Ridgway J.B., Wells J.А., Carter P., J Mol Biol 270, 1997, cc.26-35) для активации формирования двухвалентного биспецифического антитела.Thus, according to a preferred embodiment of the invention, the CH3 domains of a divalent bispecific antibody in which the first CH3 domain and the second CH3 domain are each in contact with each other at the interface, which is the initial interface between the CH3 domains of the antibody, is changed by knob-into-holes technologies, including additional stabilization by introducing a disulfide bridge into the CH3 domains (as described in WO 96/027011, Ridgway J. B. et al.,
Таким образом, согласно одному из объектов изобретения двухвалентное биспецифическое антитело отличается тем, чтоThus, according to one aspect of the invention, a divalent bispecific antibody is characterized in that
CH3-домен одной тяжелой цепи и CH3-домен другой тяжелой цепи каждый соприкасается друг с другом на поверхности раздела, которая представляет собой исходную поверхность раздела между CH3-доменами антитела; при этом поверхность раздела изменяют для активации формирования двухвалентного биспецифического антитела, где изменение отличается тем, что:The CH3 domain of one heavy chain and the CH3 domain of another heavy chain are each in contact with each other at the interface, which is the initial interface between the CH3 domains of the antibody; wherein the interface is changed to activate the formation of a divalent bispecific antibody, where the change is characterized in that:
а) изменяют CH3-домен одной тяжелой цепиa) change the CH3 domain of one heavy chain
так, что на исходной поверхности раздела CH3-домена одной тяжелой цепи, которая соприкасается с исходной поверхностью раздела CH3-домена второй тяжелой цепи в двухвалентном биспецифическом антителе, аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток, который имеет большую по объему боковую цепь, создавая тем самым выпуклость на поверхности раздела CH3-домена одной тяжелой цепи, которая может помещаться в полость на поверхности раздела CH3-домена другой тяжелой цепи, иso that on the initial interface of the CH3 domain of one heavy chain, which is in contact with the original interface of the CH3 domain of the second heavy chain in a divalent bispecific antibody, the amino acid residue is replaced by an amino acid residue that has a large side chain, thereby creating a bulge on the interface of the CH3 domain of one heavy chain, which can be placed in a cavity on the interface of the CH3 domain of another heavy chain, and
б) изменяют CH3-домен другой тяжелой цепи так, что на исходной поверхности раздела второго CH3-домена, которая соприкасается с исходной поверхностью раздела первого CH3-домена в двухвалентном биспецифическом антителе, аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток, который имеет меньшую по объему боковую цепь, создавая тем самым полость на поверхности раздела второго CH3-домена, в которую может помещаться выпуклость на поверхности раздела первого CH3-домена.b) change the CH3 domain of the other heavy chain so that on the initial interface of the second CH3 domain, which is in contact with the original interface of the first CH3 domain in a divalent bispecific antibody, the amino acid residue is replaced by an amino acid residue that has a smaller side chain thereby creating a cavity on the interface of the second CH3 domain, into which a bulge on the interface of the first CH3 domain can be placed.
Предпочтительно указанный аминокислотный остаток, который имеет большую по объему боковую цепь, выбирают из группы, включающей аргинин (R), фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W).Preferably, said amino acid residue that has a large side chain is selected from the group consisting of arginine (R), phenylalanine (F), tyrosine (Y), tryptophan (W).
Предпочтительно указанный аминокислотный остаток, который имеет меньшую по объему боковую цепь, выбирают из группы, включающей аланин (А), серин (S), треонин (Т), валин (V).Preferably, said amino acid residue that has a smaller side chain is selected from the group consisting of alanine (A), serine (S), threonine (T), valine (V).
Согласно одному из объектов изобретения оба CH3-домена дополнительно изменяют путем интродукции цистеина (С) в качестве аминокислоты в соответствующих положениях каждого CH3-домена так, чтобы мог образоваться дисульфидный мостик между обоими CH3-доменами.According to one aspect of the invention, both CH3 domains are further altered by introducing cysteine (C) as an amino acid at the corresponding positions of each CH3 domain so that a disulfide bridge between the two CH3 domains can form.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения оба CH3-домена изменяют, используя остатки R409D; K370E (K409D) в качестве образующих «выступ» остатков и D399K; E357K в качестве образующих «впадину» остатков, как описано, например, в EP 1870459 A1.In another preferred embodiment, both CH3 domains are modified using residues R409D; K370E (K409D) as “protrusion” residues and D399K; E357K as “trenching” residues, as described, for example, in
ИлиOr
Б) Второй альтернативный подход (см. фиг.4):B) The second alternative approach (see figure 4):
Этот подход предусматривает замену CH3-домена константной области одной тяжелой цепи на CH1-домен константной области тяжелой цепи; и замену CH3-домена константной области другой тяжелой цепи на CL-домен константной области легкой цепи.This approach involves replacing the CH3 domain of the constant region of one heavy chain with the CH1 domain of the constant region of the heavy chain; and replacing the CH3 domain of the constant region of the other heavy chain with the CL domain of the constant region of the light chain.
CHI-домен константной области тяжелой цепи, на который заменяют CH3-домен тяжелой цепи, может представлять собой домен любого Ig-класса (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM) или подкласса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2).The CHI domain of the constant region of the heavy chain, which is replaced by the CH3 domain of the heavy chain, can be a domain of any Ig class (e.g., IgA, IgD, IgE, IgG and IgM) or a subclass (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 , IgA1 and IgA2).
CL-домен константной области легкой цепи, на который заменяют CH3-домен тяжелой цепи, может быть лямбда- (λ) или каппа-(κ) типа, предпочтительно каппа - (κ) типа.The CL domain of the constant region of the light chain, to which the CH3 domain of the heavy chain is replaced, may be lambda- (λ) or kappa- (κ) type, preferably kappa- (κ) type.
Таким образом, одним из предпочтительных вариантов осуществления изобретения является двухвалентное биспецифическое антитело, которое содержит:Thus, one of the preferred embodiments of the invention is a divalent bispecific antibody, which contains:
а) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося с первым антигеном; иa) the light chain and heavy chain of an antibody that specifically binds to the first antigen; and
б) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося со вторым антигеном, в котором константные домены CL и CH1 заменены друг на друга,b) the light chain and heavy chain of an antibody that specifically binds to a second antigen in which the constant domains of CL and CH1 are replaced by each other,
и необязательноand optional
в) CH3-домен одной тяжелой цепи и CH3-домен другой тяжелой цепи, каждый из которых соприкасается друг с другом на поверхности раздела, которая представляет собой исходную поверхность раздела между CH3-доменами антитела;c) the CH3 domain of one heavy chain and the CH3 domain of another heavy chain, each of which is in contact with each other at the interface, which is the initial interface between the CH3 domains of the antibody;
при этом поверхность раздела изменяют для активации формирования двухвалентного биспецифического антитела, где изменение отличается тем, что:wherein the interface is changed to activate the formation of a divalent bispecific antibody, where the change is characterized in that:
ва) изменяют CH3-домен одной тяжелой цепиba) change the CH3 domain of one heavy chain
так, что на исходной поверхности раздела CH3-домена одной тяжелой цепи, которая соприкасается с исходной поверхностью раздела CH3-домена второй тяжелой цепи в двухвалентном биспецифическом антителе, аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток, который имеет большую по объему боковую цепь, создавая тем самым выпуклость на поверхности раздела CH3-домена одной тяжелой цепи, которая может помещаться в полость на поверхности раздела CH3-домена другой тяжелой цепи, иso that on the initial interface of the CH3 domain of one heavy chain, which is in contact with the original interface of the CH3 domain of the second heavy chain in a divalent bispecific antibody, the amino acid residue is replaced by an amino acid residue that has a large side chain, thereby creating a bulge on the interface of the CH3 domain of one heavy chain, which can be placed in a cavity on the interface of the CH3 domain of another heavy chain, and
вб) изменяют CH3-домен другой тяжелой цепиWB) change the CH3 domain of another heavy chain
так, что на исходной поверхности раздела второго CH3-домена, которая соприкасается с исходной поверхностью раздела первого CH3-домена в двухвалентном биспецифическом антителе, аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток, который имеет меньшую по объему боковую цепь, создавая тем самым полость на поверхности раздела второго CH3-домена, в которую может помещаться выпуклость на поверхности раздела первого CH3-домена;so that on the initial interface of the second CH3 domain, which is in contact with the original interface on the first CH3 domain in a divalent bispecific antibody, the amino acid residue is replaced by an amino acid residue that has a smaller side chain, thereby creating a cavity on the interface of the second A CH3 domain into which a bulge may be placed on the interface of the first CH3 domain;
илиor
г) CH3-домен константной области одной тяжелой цепи заменяют на CH1-домен константной области тяжелой цепи; и CH3-домен константной области другой тяжелой цепи заменяют на CL-домен константной области легкой цепи.d) the CH3 domain of the constant region of one heavy chain is replaced by the CH1 domain of the constant region of the heavy chain; and the CH3 domain of the constant region of another heavy chain is replaced by the CL domain of the constant region of the light chain.
Понятия «антиген» или «молекула антигена» в контексте настоящего описания применяют взаимозаменяемо, и они относятся ко всем молекулам, которые могут специфически связываться антителом. Двухвалентное биспецифическое антитело специфически связывается с первым антигеном и вторым отличным от первого антигеном. Понятие «антигены» в контексте настоящего описания включают, например, белки, различные эпитопы белков (в качестве различных антигенов согласно изобретению) и полисахариды. Они главным образом включают части (покрытия, капсулы, клеточные оболочки, жгутики, фимбрии и токсины) бактерий, вирусов и других микроорганизмов. Липиды и нуклеиновые кислоты являются антигенами только при их объединении с белками и полисахаридами. Не относящиеся к микробам экзогенные (чужеродные) антигены могут включать пыльцу, белок яиц и белки из трансплантированных тканей или органов или антигены, находящиеся на поверхности трансфузируемых кровяных клеток. Предпочтительно антиген выбирают из группы, включающей цитокины, белки клеточной поверхности, ферменты и рецепторы цитокинов, белков клеточной поверхности, ферментов и другие рецепторы.The terms “antigen” or “antigen molecule” are used interchangeably herein and refer to all molecules that can specifically bind to an antibody. A divalent bispecific antibody specifically binds to the first antigen and a second antigen different from the first. The term "antigens" in the context of the present description include, for example, proteins, various protein epitopes (as various antigens according to the invention) and polysaccharides. They mainly include parts (coatings, capsules, cell walls, flagella, fimbriae and toxins) of bacteria, viruses and other microorganisms. Lipids and nucleic acids are antigens only when combined with proteins and polysaccharides. Non-microbial exogenous (foreign) antigens may include pollen, egg protein and proteins from transplanted tissues or organs, or antigens located on the surface of transfused blood cells. Preferably, the antigen is selected from the group consisting of cytokines, cell surface proteins, enzymes and receptors of cytokines, cell surface proteins, enzymes and other receptors.
Опухолевые антигены представляют собой антигены, которые презентуются молекулами ГКГ I или ГКГ II на поверхности опухолевых клеток. Иногда эти антигены презентуются опухолевыми клетками и никогда здоровыми клетками. В этом случае их называют специфическими для опухоли антигенами (TSA), и они, как правило, являются результатом специфической для опухоли мутации. Более распространенными являются антигены, которые презентуются опухолевыми клетками и здоровыми клетками, и их называют ассоциированными с опухолью антигенами (TAA). Цитотоксические T-лимфоциты, которые распознают эти антигены, могут обладать способностью разрушать опухолевые клетки до их пролиферации или метастазирования. Опухолевые антигены могут находиться также на поверхности опухоли в форме, измененного в результате мутации рецептора, в этом случае они должны распознаваться B-клетками.Tumor antigens are antigens that are presented by MHC I or MHC II molecules on the surface of tumor cells. Sometimes these antigens are presented by tumor cells and never by healthy cells. In this case, they are called tumor-specific antigens (TSA), and they are usually the result of a tumor-specific mutation. More common are antigens that are presented by tumor cells and healthy cells, and they are called tumor associated antigens (TAA). Cytotoxic T lymphocytes that recognize these antigens may have the ability to destroy tumor cells before they proliferate or metastasize. Tumor antigens can also be located on the surface of the tumor in the form modified as a result of a receptor mutation, in which case they must be recognized by B cells.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения по меньшей мере один из двух различных антигенов (первый и второй антиген), с которым двухвалентное биспецифическое антитело специфически связывается, представляет собой опухолевый антиген.In one preferred embodiment of the invention, at least one of two different antigens (first and second antigen) with which the divalent bispecific antibody specifically binds is a tumor antigen.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения оба различных антигена (первый и второй антиген), с которыми двухвалентное биспецифическое антитело специфически связывается, представляют собой опухолевые антигены; в этом случае первый и второй антиген могут представлять собой также два различных эпитопа одного и того же специфического для опухоли белка.In another preferred embodiment of the invention, the two different antigens (first and second antigen) with which the divalent bispecific antibody specifically binds are tumor antigens; in this case, the first and second antigen can also be two different epitopes of the same tumor specific protein.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один из двух различных антигенов (первый и второй антиген), с которым двухвалентное биспецифическое антитело специфически связывается, представляет собой опухолевый антиген, а другой представляет собой антиген эффекторной клетки, такой, например, как T-клеточный рецептор, CD3, CD16 и т.п.In another preferred embodiment, at least one of two different antigens (first and second antigen) with which the divalent bispecific antibody specifically binds is a tumor antigen and the other is an effector cell antigen, such as, for example, T-cell receptor, CD3, CD16 and the like.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один из двух различных антигенов (первый и второй антиген), с которым двухвалентное биспецифическое антитело специфически связывается, представляет собой опухолевый антиген, а другой представляет собой противораковую субстанцию, такую как токсин или ингибитор киназы.In another preferred embodiment of the invention, at least one of two different antigens (the first and second antigen) with which the divalent bispecific antibody specifically binds is a tumor antigen and the other is an anticancer substance, such as a toxin or kinase inhibitor.
В контексте настоящего описания понятие «специфически связывается» или «связывается специфически с» относится к антителу, специфически связывающемуся с антигеном. Предпочтительно аффинность к связыванию антитела, специфически связывающегося с указанным антигеном, характеризуется значением KD 10-9 молей/л или ниже (например, 10-10 молей/л), предпочтительно значением KD 10-10 молей/л или ниже (например, 10-12 молей/л). Аффинность к связыванию определяют с помощью стандартного анализа связывания, такого как поверхностный плазмонный резонанс (Biacore®).In the context of the present description, the term "specifically binds" or "binds specifically to" refers to an antibody that specifically binds to an antigen. Preferably, the binding affinity of an antibody specifically binding to said antigen is characterized by a KD value of 10 −9 mol / L or lower (for example, 10 −10 mol / L), preferably a KD value of 10 −10 mol / L or lower (for example, 10 - 10 12 moles / l). Binding affinity is determined using standard binding analysis, such as surface plasmon resonance (Biacore®).
Понятие «эпитоп» включает любую полипептидную детерминанту, обладающую способностью специфически связываться с антителом. В некоторых вариантах осуществления изобретения эпитопная детермианта включает химически активные поверхностные группы молекул, такие как аминокислоты, боковые цепи Сахаров, фосфорил или сульфонил, и в некоторых вариантах осуществления изобретения могут иметь специфические трехмерные структурные характеристики и/или специфические характеристики заряда. Эпитоп представляет собой область антигена, которая связывается антителом. В некоторых вариантах осуществления изобретения считается, что антитело специфически связывается с антигеном, когда оно преимущественно распознает его антиген-мишень в сложной смеси белков и/или макромолекул.The term "epitope" includes any polypeptide determinant that has the ability to specifically bind to an antibody. In some embodiments, the epitope determinant includes chemically active surface groups of molecules such as amino acids, sugar chains, phosphoryl or sulfonyl, and in some embodiments, specific three-dimensional structural characteristics and / or specific charge characteristics. An epitope is a region of antigen that binds to an antibody. In some embodiments, the antibody is considered to specifically bind to an antigen when it primarily recognizes its target antigen in a complex mixture of proteins and / or macromolecules.
Еще одним вариантом осуществления изобретения является способ получения двухвалентного биспецифического антитела, предлагаемого в изобретении,Another embodiment of the invention is a method for producing a divalent bispecific antibody of the invention,
заключающийся в том, чтоconsisting in the fact that
а) трансформируют клетку-хозяинаa) transform the host cell
- векторами, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие легкую цепь и тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося с первым антигеном,- vectors that contain nucleic acid molecules encoding the light chain and heavy chain of an antibody that specifically binds to the first antigen,
- векторами, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие легкую цепь и тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося со вторым антигеном, в котором CL- и CH1-домены константных областей заменены друг на друга;- vectors that contain nucleic acid molecules encoding the light chain and heavy chain of an antibody that specifically binds to a second antigen in which the CL and CH1 domains of the constant regions are replaced by each other;
б) культивируют клетку-хозяина в условиях, которые позволяют синтезировать указанную молекулу антитела; иb) cultivate the host cell under conditions that allow the synthesis of the indicated antibody molecule; and
в) выделяют молекулу антитела из культуры.c) isolate the antibody molecule from the culture.
В целом, применяют два вектора, кодирующих легкую цепь и тяжелую цепь антитела, которое специфически связывается с первым антигеном, и еще два вектора, кодирующих легкую цепь и тяжелую цепь антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном. Один из двух векторов кодирует соответствующую легкую цепь, а другой из двух векторов кодирует соответствующую тяжелую цепь. Однако в альтернативном варианте способа получения двухвалентного биспецифического антитела, предлагаемого в изобретении, можно применять для трансформации клетки-хозяина только один первый вектор, кодирующий легкую цепь и тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося с первым антигеном, и только один второй вектор, кодирующий легкую цепь и тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося со вторым антигеном.In general, two vectors encoding the light chain and heavy chain of an antibody that specifically binds to the first antigen are used, and two more vectors encoding the light chain and heavy chain of an antibody that specifically binds to the second antigen. One of the two vectors encodes the corresponding light chain, and the other of the two vectors encodes the corresponding heavy chain. However, in an alternative embodiment of the method for producing the divalent bispecific antibody of the invention, only one first vector encoding the light chain and heavy chain of an antibody specifically binding to the first antigen and only one second vector encoding the light chain and can be used to transform the host cell the heavy chain of an antibody that specifically binds to a second antigen.
Изобретение относится также к способу получения антител, заключающемуся в том, что культивируют соответствующие клетки-хозяева в условиях, которые позволяют синтезировать молекулы антител, и выделяют антитела из культуры, например, предусматривающему экспрессиюThe invention also relates to a method for producing antibodies, which comprises culturing the appropriate host cells under conditions that allow the synthesis of antibody molecules, and isolating antibodies from the culture, for example, involving expression
- первой нуклеотидной последовательности, которая кодирует легкую цепь антитела, специфически связывающегося с первым антигеном,- the first nucleotide sequence that encodes the light chain of an antibody that specifically binds to the first antigen,
- второй нуклеотидной последовательности, которая кодирует тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося с первым антигеном,- a second nucleotide sequence that encodes the heavy chain of an antibody that specifically binds to the first antigen,
- третьей нуклеотидной последовательности, которая кодирует легкую цепь антитела, специфически связывающегося со вторым антигеном, в котором CL-домен константной области легкой цепи заменен на CH1-домен константной области тяжелой цепи, иa third nucleotide sequence that encodes a light chain of an antibody specifically binding to a second antigen in which the CL domain of the constant region of the light chain is replaced by the CH1 domain of the constant region of the heavy chain, and
- четвертой нуклеотидной последовательности, которая кодирует тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося со вторым антигеном, в котором CH1-домен константной области тяжелой цепи заменен на CL-домен константной области легкой цепи.- a fourth nucleotide sequence that encodes a heavy chain of an antibody that specifically binds to a second antigen, in which the CH1 domain of the constant region of the heavy chain is replaced by the CL domain of the constant region of the light chain.
Еще одним вариантом осуществления изобретения является клетка-хозяин, содержащаяAnother embodiment of the invention is a host cell containing
- векторы, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие легкую цепь и тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося с первым антигеном,- vectors that contain nucleic acid molecules encoding the light chain and heavy chain of an antibody that specifically binds to the first antigen,
- векторы, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие легкую цепь и тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося со вторым антигеном, в котором CL- и CH1-домены константных областей заменены друг на друга.- vectors that contain nucleic acid molecules encoding the light chain and heavy chain of an antibody that specifically binds to a second antigen in which the CL and CH1 domains of the constant regions are replaced by each other.
Еще одним вариантом осуществления изобретения является клетка-хозяин,Another embodiment of the invention is a host cell,
которая содержитwhich contains
а) вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует легкую цепь, и вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося с первым антигеном,a) a vector containing a nucleic acid molecule that encodes a light chain, and a vector containing a nucleic acid molecule that encodes a heavy chain of an antibody that specifically binds to the first antigen,
б) вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует легкую цепь, и вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует тяжелую цепь, антитела специфически связывающегося со вторым антигеном, в котором CL- и CH1-домены константных областей заменены друг на друга.b) a vector containing a nucleic acid molecule that encodes a light chain, and a vector containing a nucleic acid molecule that encodes a heavy chain, antibodies specifically binding to the second antigen, in which the CL and CH1 domains of the constant regions are replaced by each other.
Еще одним вариантом осуществления изобретения является композиция, предпочтительно фармацевтическая или диагностическая композиция двухвалентного биспецифического антитела, предлагаемого в изобретении.Another embodiment of the invention is a composition, preferably a pharmaceutical or diagnostic composition of a divalent bispecific antibody of the invention.
Еще одним вариантом осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая двухвалентное биспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.Another embodiment of the invention is a pharmaceutical composition comprising a divalent bispecific antibody of the invention and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
Еще одним вариантом осуществления изобретения является способ лечения пациента, который нуждается в терапии, отличающийся тем, что вводят пациенту в терапевтически эффективном количестве двухвалентное биспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении.Another embodiment of the invention is a method of treating a patient who needs therapy, characterized in that a divalent bispecific antibody of the invention is administered to the patient in a therapeutically effective amount.
Понятие «нуклеиновая кислота или молекула нуклеиновой кислоты» в контексте настоящего описания относится к молекулам ДНК и молекулам РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно представляет собой двухцепочечную ДНК.The term "nucleic acid or nucleic acid molecule" in the context of the present description refers to DNA molecules and RNA molecules. The nucleic acid molecule may be single-stranded or double-stranded, but preferably is double-stranded DNA.
В контексте настоящего описания понятия «клетка», «клеточная линия» и «клеточная культура» используются взаимозаменяемо, и все такие определения включают потомство. Так, понятия «трансформанты» и «трансформированные клетки» относятся к первичной рассматриваемой клетке и полученным из нее культурам безотносительно к количеству переносов. Следует понимать также, что все потомство может не быть полностью идентичным по составу ДНК из-за преднамеренных или случайных мутаций. Под объем изобретения подпадает вариант потомства, имеющего такую же функцию или биологическую активность, которая обнаружена у исходной трансформированной клетки. Если используются другие определения, то это будет очевидно из контекста.In the context of the present description, the terms “cell”, “cell line” and “cell culture” are used interchangeably, and all such definitions include offspring. Thus, the concepts of “transformants” and “transformed cells” refer to the primary cell under consideration and the cultures obtained from it, regardless of the number of transfers. It should also be understood that all offspring may not be completely identical in DNA composition due to intentional or accidental mutations. Variants of the offspring having the same function or biological activity as found in the original transformed cell fall within the scope of the invention. If other definitions are used, then this will be obvious from the context.
Понятие «трансформация» в контексте настоящего описания относится к процессу переноса вектора/нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Если в качестве клеток-хозяев применяют клетки без труднопреодолимых барьеров клеточных оболочек, то трансфекцию осуществляют, например, с помощью метода осаждения фосфатом кальция, который описан у Graham и Van der Eh, Virology 52, 1978, cc.546 и далее. Однако можно применять также другие методы интродукции ДНК в клетки, такие как инъекция ядер или слияние протопластов. Если применяют прокариотические клетки или клетки, которые содержат выраженные конструкции клеточных оболочек, можно применять, например, метод трансфекции, основанной на обработке кальцием, с использованием хлорида кальция, который описан у Cohen F.N, и др., PNAS. 69, 1972, сс.7110 и далее.The term "transformation" in the context of the present description refers to the process of transferring a vector / nucleic acid into a host cell. If cells without intractable cell wall barriers are used as host cells, transfection is carried out, for example, by the method of precipitation of calcium phosphate, which is described by Graham and Van der Eh, Virology 52, 1978, cc. 546 and further. However, other methods for introducing DNA into cells, such as injection of nuclei or fusion of protoplasts, can also be used. If prokaryotic cells or cells that contain pronounced cell wall constructs are used, for example, a calcium-based transfection method using calcium chloride as described by Cohen F.N. et al., PNAS can be used. 69, 1972, pp. 7110 ff.
Рекомбинантное получение антител с помощью трансформации хорошо известно в данной области и описано, например, в обзорных статьях Makrides S.C., Protein Expr. Purif. 17, 1999, cc.183-202; Geisse S. и др., Protein Expr. Purif. 8, 1996, cc.271-282; Kaufman R.J., Mol. Biotechnol. 16, 2000, cc.151-161; Werner R.G. и др., Arzneimittelforschung 48, 1998, cc.870-880, а также в US 6331415 и US 4816567.Recombinant production of antibodies by transformation is well known in the art and is described, for example, in review articles by Makrides S.C., Protein Expr. Purif. 17, 1999, cc. 183-202; Geisse S. et al., Protein Expr. Purif. 8, 1996, cc. 271-282; Kaufman R. J., Mol. Biotechnol. 16, 2000, cc. 151-161; Werner R.G. et al., Arzneimittelforschung 48, 1998, cc.870-880, as well as in US 6331415 and US 4816567.
В контексте настоящего описания понятие «экспрессия» относится к процессу, при котором нуклеиновая кислота транскрибируется в мРНК, и/или к процессу, при котором транскрибируемая мРНК (которую обозначают также как транскрипт) затем может транслироваться в пептиды, полипептиды или белки. И транскрипты, и кодируемые полипептиды обозначают в целом как генный продукт. Если полинуклеотид выводят из геномной ДНК, то экспрессия в эукариотической клетке может включать сплайсинг мРНК.As used herein, the term “expression” refers to a process in which a nucleic acid is transcribed into mRNA and / or to a process in which a transcribed mRNA (also referred to as a transcript) can then be translated into peptides, polypeptides or proteins. Both transcripts and encoded polypeptides are generally designated as a gene product. If the polynucleotide is derived from genomic DNA, expression in a eukaryotic cell may include mRNA splicing.
«Вектор» представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, в частности самореплицирующуюся, которая переносит встроенную молекулу нуклеиновой кислоты в клетки-хозяева и/или между клетками-хозяевами. Понятие включает векторы, функция которых состоит, прежде всего, во встраивании ДНК или РНК в клетку (например, хромосомная интеграция), в репликационные векторы, функция которых прежде всего состоит в репликации ДНК или РНК, и в экспрессионные векторы, функция которых прежде всего состоит в транскрипции и/или трансляции ДНК или РНК. Под понятие подпадают также векторы, которые обладают несколькими указанными функциями.A “vector” is a nucleic acid molecule, in particular a self-replicating one, that transfers the inserted nucleic acid molecule to the host cells and / or between the host cells. The concept includes vectors whose function is primarily to integrate DNA or RNA into a cell (for example, chromosome integration), to replication vectors, whose function is primarily to replicate DNA or RNA, and to expression vectors, whose function is primarily to in transcription and / or translation of DNA or RNA. The concept also includes vectors that have several of these functions.
«Экспрессионный вектор» представляет собой полинуклеотид, который при интродукции в соответствующую клетку-хозяина может транскрибироваться и транслироваться в полипептид. Понятие «экспрессионная система», как правило, относится к приемлемой клетке-хозяину, содержащей экспрессионный вектор, функцией которой может быть выход требуемого продукта экспрессии.An “expression vector” is a polynucleotide that, when introduced into an appropriate host cell, can be transcribed and translated into a polypeptide. The term "expression system", as a rule, refers to an acceptable host cell containing an expression vector, the function of which may be the yield of the desired expression product.
Двухвалентные биспецифические антитела, предлагаемые в изобретении, предпочтительно получают методами рекомбинации. Указанные методы хорошо известны в данной области и предусматривают экспрессию белка в прокариотических и эукариотических клетках с последующим выделением полипептида антитела и, как правило, очисткой до фармацевтически приемлемой чистоты. Для экспрессии белка нуклеиновые кислоты, кодирующие легкие и тяжелые цепи или их фрагменты, встраивают в экспрессионные векторы с помощью стандартных методов. Экспрессию осуществляют в приемлемых прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах типа CHO-клеток, NS0-клеток, SP2/0-клеток, HEK293-клеток, COS-клеток, дрожжей или клеток E.coli, и антитело выделяют из клеток (из супернатанта или клеток после лизиса). Двухвалентные биспецифические антитела могут присутствовать в целых клетках, в клеточном лизате или в частично очищенной или практически очищенной форме. Очистку осуществляют для удаления других клеточных компонентов или других загрязнителей, например, других клеточных нуклеиновых кислот или белков, стандартными методами, которые включают обработку щелочью/ДСН, хроматографию на колонках и другие методы, хорошо известные в данной области (см. в Current Protocols in Molecular Biology, под ред. Ausubel F., и др., изд-во Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987).The divalent bispecific antibodies of the invention are preferably prepared by recombination methods. These methods are well known in the art and involve protein expression in prokaryotic and eukaryotic cells, followed by isolation of the antibody polypeptide and, as a rule, purification to a pharmaceutically acceptable purity. For protein expression, nucleic acids encoding light and heavy chains or fragments thereof are inserted into expression vectors using standard methods. Expression is carried out in suitable prokaryotic or eukaryotic host cells such as CHO cells, NS0 cells, SP2 / 0 cells, HEK293 cells, COS cells, yeast or E. coli cells, and the antibody is isolated from cells (from supernatant or cells after lysis). Bivalent bispecific antibodies may be present in whole cells, in a cell lysate, or in a partially purified or substantially purified form. Purification is carried out to remove other cellular components or other contaminants, for example, other cellular nucleic acids or proteins, by standard methods, which include alkali / SDS treatment, column chromatography, and other methods well known in the art (see Current Protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel F., et al., Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987).
Экспрессия в NS0-клетках описана, например, у Barnes L.M. и др., Cytotechnology 32, 2000, сс.109-123; и Barnes L.M. и др., Biotech. Bioeng. 73, 2001, сс.261-270. Кратковременная экспрессия описана, например, у Durocher Y. и др., Nucl. Acids. Res. 30, 2002, с.E9. Клонирование вариабельных областей описано у Orlandi R. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, cc.3833-3837; Carter P. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, cc.4285-4289; и Norderhaug L. и др., J. Immunol. Methods 204, 1997, cc.77-87. Предпочтительная система кратковременной экспрессии (HEK 293) описана у Schlaeger E.-J. и Christensen K., в Cytotechnology 30, 1999, сс.71-83 и у Schlaeger E.-J. в J. Immunol. Methods 194, 1996, cc.191-199.Expression in NS0 cells is described, for example, in Barnes L.M. et al., Cytotechnology 32, 2000, pp. 109-123; and Barnes L.M. et al., Biotech. Bioeng. 73, 2001, pp. 261-270. Short-term expression is described, for example, in Durocher Y. et al., Nucl. Acids Res. 30, 2002, p. E9. Cloning of variable regions is described by Orlandi R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, cc. 3833-3837; Carter P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, cc. 4285-4289; and Norderhaug L. et al., J. Immunol. Methods 204, 1997, cc.77-87. A preferred short-term expression system (HEK 293) is described by Schlaeger E.-J. and Christensen K., in
Контролирующие последовательности, которые можно применять для прокариот, представляют собой, например, промотор, необязательно последовательность оператора и сайт связывания рибосом. Известно, что эукариотические клетки могут использовать промоторы, энхансеры и сигналы полиаденилирования.The control sequences that can be used for prokaryotes are, for example, a promoter, optionally an operator sequence and a ribosome binding site. It is known that eukaryotic cells can use promoters, enhancers and polyadenylation signals.
Нуклеиновая кислота «функционально связана», когда она помещена под функциональный контроль другой нуклеотидной последовательности. Например, ДНК предпоследовательности или лидера секреции функционально связана с ДНК, кодирующей полипептид, если она экспрессируется в виде предбелка, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он оказывает воздействие на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосом функционально связан с кодирующей последовательностью, если он помещен так, чтобы он облегчал трансляцию. Как правило, «функционально связаны» означает, что последовательности ДНК, будучи связаны, являются смежными, а в случае лидера секреции, смежными в рамке считывания. Однако не требуется, чтобы энхансеры были смежными. Связывание осуществляют путем лигирования в пригодных сайтах рестрикции. Если такие сайты не существуют, то согласно общепринятой практике используют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры.A nucleic acid is “operably linked” when it is placed under the functional control of another nucleotide sequence. For example, a presequence or secretion leader DNA is operably linked to a DNA encoding a polypeptide if it is expressed as a pre-protein that is involved in the secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription of the sequence; or a ribosome binding site is operably linked to a coding sequence if it is positioned to facilitate translation. Generally, “functionally linked” means that the DNA sequences, when linked, are contiguous, and in the case of a secretion leader, contiguous in the reading frame. However, enhancers are not required to be contiguous. Binding is carried out by ligation at suitable restriction sites. If such sites do not exist, then synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used in accordance with generally accepted practice.
Двухвалентные биспецифические антитела можно отделять от культуральной среды с помощью общепринятых методов очисти иммуноглобулинов, таких, например, как хроматография на протеин A-сефарозе, хроматография на гидроксилапатите, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография. ДНК или РНК, которые кодируют моноклональные антитела, легко выделять и секвенировать с помощью общепринятых методов. Источником таких ДНК и РНК могут служить клетки гибридом. После выделения ДНК можно встраивать в экспрессионные векторы, которыми затем трансфектируют клетки-хозяева, такие как клетки HEK 293, CHO-клетки или клетки миеломы, которые иначе не могут продуцировать белок иммуноглобулина, для синтеза рекомбинантных моноклинальных антител в клетках-хозяевах.Bivalent bispecific antibodies can be separated from the culture medium using conventional immunoglobulin purification methods, such as, for example, protein A-Sepharose chromatography, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis or affinity chromatography. DNA or RNA that encodes monoclonal antibodies is easily isolated and sequenced using conventional methods. Hybrid cells can serve as a source of such DNA and RNA. After isolation, DNA can be inserted into expression vectors, which are then transfected with host cells, such as HEK 293 cells, CHO cells or myeloma cells that otherwise cannot produce an immunoglobulin protein, for the synthesis of recombinant monoclinal antibodies in host cells.
Варианты аминокислотной последовательности (или мутанты) двухвалентного биспецифического антитела получают путем интродукции соответствующих нуклеотидных замен в ДНК антитела или путем синтеза нуклеотидов. Однако такие модификации можно осуществлять только в очень ограниченном диапазоне, например, как описано выше. Например, модификации не должны изменять вышеуказанные характеристики антитела, такие как изотип IgG и связывание с антигеном, но могут повышать выход продукта рекомбинации, стабильность белка или облегчать очистку.Variants of the amino acid sequence (or mutants) of a divalent bispecific antibody are obtained by introducing the corresponding nucleotide substitutions into the DNA of the antibody or by nucleotide synthesis. However, such modifications can be made only in a very limited range, for example, as described above. For example, modifications should not alter the above characteristics of an antibody, such as an IgG isotype and binding to an antigen, but may increase the yield of the recombination product, protein stability, or facilitate purification.
Следующие примеры, перечень последовательностей и чертежи даны с целью лучшего понимания настоящего изобретения, полный объем которого представлен в приведенной ниже формуле изобретения. Очевидно, что могут быть сделаны модификации в изложенных процедурах без отклонения от сути изобретения.The following examples, sequence listing, and drawings are given for the purpose of better understanding the present invention, the full scope of which is presented in the claims below. Obviously, modifications can be made to the procedures set forth without departing from the spirit of the invention.
Перечень последовательностейSequence listing
SEQ ID NO: 1 аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела <IGF-1R>дикого типа.SEQ ID NO: 1 amino acid sequence of the wild-type <IGF-1R> antibody heavy chain.
SEQ ID NO: 2 аминокислотная последовательность легкой цепи антитела <IGF-1R> дикого типа.SEQ ID NO: 2 amino acid sequence of the wild-type <IGF-1R> antibody light chain.
SEQ ID NO: 3 аминокислотная последовательность тяжелой цепи ∗∗ (HC∗∗) антитела <IGF-1R>, несущего замену CL-CH1, в котором CH1-домен тяжелой цепи заменен на CL-домен легкой цепи.SEQ ID NO: 3 amino acid sequence of the heavy chain ∗∗ (HC ∗∗) of the <IGF-1R> antibody bearing the substitution CL-CH1, in which the CH1 domain of the heavy chain is replaced by the CL domain of the light chain.
SEQ ID NO: 4 аминокислотная последовательность легкой цепи ∗∗ (LC∗∗) антитела <IGF-1R>, несущего замену CL-CH1, в котором CL-домен легкой цепи заменен на CH1-домен тяжелой цепи.SEQ ID NO: 4 amino acid sequence of the light chain ∗∗ (LC ∗∗) of the <IGF-1R> antibody bearing the substitution CL-CH1, in which the CL domain of the light chain is replaced by the CH1 domain of the heavy chain.
SEQ ID NO: 5 аминокислотная последовательность эктодомена (ECD) IGF-1R, несущего метку, которая представляет собой His-стрептавидин-связывающий пептид (ECD IGF-1R-His-SBP).SEQ ID NO: 5 amino acid sequence of the ectodomain (ECD) of IGF-1R carrying a label that is His-streptavidin-binding peptide (ECD IGF-1R-His-SBP).
SEP ID NO: 6 аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела к ANGPT2 (ангиопоэтин-2) <ANGPT2> дикого типа.SEP ID NO: 6 amino acid sequence of the wild-type anti-ANGPT2 (angiopoietin-2) <ANGPT2> heavy chain amino acid sequence.
SEP ID NO: 7 аминокислотная последовательность легкой цепи антитела к ANGPT2 <ANGPT2> дикого типа.SEP ID NO: 7 amino acid sequence of the wild-type anti-ANGPT2 <ANGPT2> antibody light chain.
SEQ ID NO: 8 аминокислотная последовательность CH3-домена («выступы») с заменой T366W для применения в технологии «knobs-into-holes».SEQ ID NO: 8 amino acid sequence of the CH3 domain (“protrusions”) with the replacement of T366W for use in knobs-into-holes technology.
SEQ ID NO: 9 аминокислотная последовательность CH3-домена («впадина») с заменой T366S, L368A, Y407V для применения в технологии «knobs-into-holes».SEQ ID NO: 9 amino acid sequence of the CH3 domain (“trough”) with replacement of T366S, L368A, Y407V for use in knobs-into-holes technology.
SEQ ID NO: 10 аминокислотная последовательность эктодомена IGF-1R, несущего метку, которая представляет собой His-стрептавидин-связывающий пептид (ECD IGF-1R-His-SBP).SEQ ID NO: 10 amino acid sequence of the IGF-1R ectodomain carrying a label that is His-streptavidin-binding peptide (ECD IGF-1R-His-SBP).
Описание чертежейDescription of drawings
На чертежах показано:The drawings show:
на фиг.1 - схематическое изображение встречающегося в естественных условиях полного антитела типа IgG, специфического в отношении одного антигена, с двумя парами тяжелых и легких цепей, каждая из которых содержит расположенные в общепринятом порядке вариабельные и константные домены;figure 1 is a schematic representation of a naturally occurring complete IgG type antibody specific for one antigen with two pairs of heavy and light chains, each of which contains variable and constant domains arranged in the generally accepted manner;
на фиг.2 - схематическое изображение двухвалентного биспецифического антитела, содержащего: а) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, которое специфически связывается с первым антигеном; и б) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном, в котором CL- и CH1-домены константных областей заменены друг на друга;figure 2 is a schematic representation of a divalent bispecific antibody containing: a) a light chain and a heavy chain of an antibody that specifically binds to the first antigen; and b) the light chain and heavy chain of an antibody that specifically binds to a second antigen in which the CL and CH1 domains of the constant regions are replaced by each other;
на фиг.3 - схематическое изображение двухвалентного биспецифического антитела, содержащего: а) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, которое специфически связывается с первым антигеном; и б) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном, в котором CL- и CH1-домены константных областей заменены друг на друга и в котором CH3-домены обеих тяжелых цепей изменены с помощью технологии «knobs-into-holes»;figure 3 is a schematic representation of a divalent bispecific antibody containing: a) a light chain and a heavy chain of an antibody that specifically binds to the first antigen; and b) an antibody light chain and heavy chain that specifically binds to a second antigen in which the CL and CH1 domains of the constant regions are replaced by one another and in which the CH3 domains of both heavy chains are changed using knobs-into-holes technology ";
на фиг.4 - схематическое изображение двухвалентного биспецифического антитела, содержащего: а) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, которое специфически связывается с первым антигеном; и б) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном, в котором CL- и CH1-домены константных областей заменены друг на друга и в котором один из CH3-доменов константной области обеих тяжелых цепей заменен на CH1-домен константной области тяжелой цепи; а другой CH3-домен константной области тяжелой цепи заменен на CL-домен константной области легкой цепи;figure 4 is a schematic representation of a divalent bispecific antibody containing: a) a light chain and a heavy chain of an antibody that specifically binds to the first antigen; and b) an antibody light chain and heavy chain that specifically binds to a second antigen in which the CL and CH1 domains of the constant regions are replaced by one another and in which one of the CH3 domains of the constant region of both heavy chains is replaced by the CH1 domain of the constant heavy chain areas; and the other CH3 domain of the constant region of the heavy chain is replaced by the CL domain of the constant region of the light chain;
на фиг.5 - схематическое изображение белковой последовательности тяжелой цепи ∗∗ <IGF-1R>HC∗∗ антитела <IGF-1R>, несущего замену CL-CH1 (с CL-доменом константной области легкой каппа-цепи);figure 5 is a schematic representation of the protein sequence of the heavy chain ∗∗ <IGF-1R> HC ∗∗ of the antibody <IGF-1R> bearing the substitution CL-CH1 (with CL domain constant region of the light Kappa chain);
на фиг.6 - схематическое изображение белковой последовательности легкой цепи ∗∗ <IGF-1R>LC∗∗∗ антитела <IGF-1R>, несущего замену CL-CH1;Fig.6 is a schematic representation of the protein sequence of the light chain ∗∗ <IGF-1R> LC ∗∗∗ of the antibody <IGF-1R> bearing the replacement of CL-CH1;
на фиг.7 - плазмидная карта экспрессионного вектора pUC-HC**-IGF-1R тяжелой цепи ∗∗ <IGF-1R>HC∗∗;Fig.7 is a plasmid map of the expression vector pUC-HC ** - IGF-1R heavy chain ∗∗ <IGF-1R> HC ∗∗;
на фиг.8 - плазмидная карта экспрессионного вектора pUC-LC∗∗-IGF-1R легкой цепи ∗∗ <IGF-1R>LC∗∗;on Fig is a plasmid map of the expression vector pUC-LC ∗∗ - IGF-1R light chain ∗∗ <IGF-1R> LC ∗∗;
на фиг.9 - плазмидная карта экспрессионного вектора 4700-Hyg-OriP;figure 9 is a plasmid map of the expression vector 4700-Hyg-OriP;
на фиг.10 - принцип осуществления клеточного FACS-анализа, позволяющего выявлять образование мостиковой связи типа IGF-1R-ANGPT2 с использованием клеток линии I24, экспрессирующих IGF-1R, с целью выявления, присутствия функционального биспецифического антитела <ANGPT2-IGF-1R>, несущего замену CL-CH1;figure 10 - the principle of the implementation of cellular FACS analysis, allowing to detect the formation of a bridging type IGF-1R-ANGPT2 using cells of the line I24 expressing IGF-1R, in order to detect the presence of functional bespecifically antibodies <ANGPT2-IGF-1R>, replacement bearing CL-CH1;
на фиг.11 - схематическое изображение принципа осуществления Biacore-анализа с использованием ECD IGF-1R;11 is a schematic representation of the principle of the implementation of Biacore analysis using ECD IGF-1R;
на фиг.12 - результаты, полученные с помощью ДСН-ПААГ и гель фильтрации, для очищенного моноспецифического двухвалентного антитела <IGF-1R>, несущего замену CL-CH1 (IgG1∗∗), у которого HC∗∗ и LC∗∗ выделены из супернатантов клеточных культур после кратковременной трансфекции клеток линии HEK293-F;on Fig - results obtained using SDS-PAGE and gel filtration, for purified monospecific divalent antibody <IGF-1R>, bearing the replacement of CL-CH1 (IgG1 ∗∗), in which HC ∗∗ and LC ∗∗ are isolated from cell culture supernatants after short-term transfection of HEK293-F cells;
на фиг.13 - данные о связывании моноспецифического антитела <IGF-1R>, несущего замену CL-CH1, и антитела дикого типа <IGF-1R> с ECD IGF-1R, полученные на основе оценки связывания с помощью ELISA;on Fig - data on the binding of monospecific antibodies <IGF-1R>, bearing the replacement of CL-CH1, and wild-type antibodies <IGF-1R> with ECD IGF-1R, obtained on the basis of evaluation of binding by ELISA;
на фиг.14 - результаты, полученные с помощью ДСН-ПААГ и гель-фильтрации, для смеси, которая содержит антитело<ANGPT2-IGF-1R>, несущее замену CL-CH1, очищенной из супернатантов клеточных культур после кратковременной трансфекции клеток линии HEK293-F;on Fig - results obtained using SDS-PAGE and gel filtration, for a mixture that contains the antibody <ANGPT2-IGF-1R>, carrying the replacement of CL-CH1 purified from supernatants of cell cultures after short-term transfection of cells of the line HEK293- F;
на фиг.15 - результаты, полученные для образцов A-E, с помощью FACS-анализа, позволяющего выявлять образование мостиковой связи типа IGF-1R-ANGPT2 с использованием клеток линии I24, экспрессирующих IGF-1R, с целью выявления присутствия функционального биспецифического антитела <ANGPT2-IGF-1R>, несущего замену CL-CH1, в очищенной смеси антител: очищенные белки образцов А-Е:on Fig - the results obtained for samples of AE, using FACS analysis, allowing to detect the formation of bridging type IGF-1R-ANGPT2 using I24 cells expressing IGF-1R, in order to detect the presence of functional bespecifically antibodies <ANGPT2- IGF-1R>, bearing the replacement of CL-CH1, in a purified mixture of antibodies: purified proteins of samples AE:
А=клетки линии I24, необработанные,A = I24 line cells, untreated,
Б=I24+2 мкг/мл hANGPT2+изотип hlgG,B = I24 + 2 μg / ml hANGPT2 + isotype hlgG,
В=I24+2 мкг/мл hANGPT2+смесь, полученная в результате совместной экспрессии антитела <IGF-1R>, несущего замену CL-CH1, и антитела <ANGPT2> дикого типа, содержащая биспецифическое антитело <ANGPT2-IGF-1R>, несущее замену CL-CH1,B = I24 + 2 μg / ml hANGPT2 + a mixture obtained by co-expression of an antibody <IGF-1R> bearing a CL-CH1 substitution and a wild-type antibody <ANGPT2> containing a bispecific antibody <ANGPT2-IGF-1R> carrying CL-CH1 replacement,
Г - отсутствует,G is absent
Д=I24+2 мкг/мл hANGPT2+антитело <ANGPT2> дикого типа,D = I24 + 2 μg / ml hANGPT2 + wild-type antibody <ANGPT2>,
Е=I24+2 мкг/мл hANGPT2+антитело <IGF-1R> дикого типа.E = I24 + 2 μg / ml hANGPT2 + wild-type <IGF-1R> antibody.
ПримерыExamples
Материалы и общие методыMaterials and general methods
Общая информация, касающаяся нуклеотидных последовательностей легких и тяжелых цепей человеческого иммуноглобулина, представлена у: Kabat E.A. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Аминокислоты цепей антител пронумерованы согласно нумерации EU (Edelman G.M. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63, 1969, cc.78-85; Kabat E.A. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-oe изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).General information regarding the nucleotide sequences of the light and heavy chains of human immunoglobulin is provided by: Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Antibody amino acids are numbered according to EU numbering (Edelman GM et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 63, 1969, cc.78-85; Kabat EA et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda , MD, 1991).
Методы рекомбинантной ДНКRecombinant DNA Methods
Для манипуляций с ДНК использовали стандартные методы, описанные у Sambrook J. и др., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Реагенты для молекулярной биологии использовали согласно инструкциям производителей.For DNA manipulations, standard methods described by Sambrook J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Molecular biology reagents were used according to manufacturers instructions.
Синтез геновGene synthesis
Требуемые сегменты генов получали из олигонуклеотидов, созданных путем химического синтеза. Генные сегменты длиной 600-1800 т.п.н., которые фланкированы уникальными сайтами рестрикции, собирали путем отжига и лигирования олигонуклеотидов, включая ПЦР-амплификацию и последующее клонирование через указанные сайты рестрикции, например, Kpnl/SacI или AscI/PacI в клонирующем векторе pGA4, основой которого является плазмида pPCRScript (фирма Stratagene). Последовательности ДНК субклонированных генных фрагментов подтверждали путем секвенирования ДНК. Синтез генных фрагментов осуществляли в порядке, представленном в спецификации фирмы Geneart (Регенсбург, Германия).The desired gene segments were obtained from oligonucleotides created by chemical synthesis. Gene segments 600-1800 kbp long, which are flanked by unique restriction sites, were collected by annealing and ligation of oligonucleotides, including PCR amplification and subsequent cloning through these restriction sites, for example, Kpnl / SacI or AscI / PacI in a cloning vector pGA4, which is based on the plasmid pPCRScript (Stratagene). The DNA sequences of the subcloned gene fragments were confirmed by DNA sequencing. The synthesis of gene fragments was carried out in the order presented in the specification of the company Geneart (Regensburg, Germany).
Определение последовательностей ДНКDNA sequencing
Последовательности ДНК определяли путем секвенирования двух цепей на фирме MediGenomix GmbH (Мартинсрид, Германия) или фирме Sequiserve GmbH (Фатерштеттен, Германия).DNA sequences were determined by sequencing two strands at MediGenomix GmbH (Martinsried, Germany) or Sequiserve GmbH (Vaterstetten, Germany).
Анализ последовательностей ДНК и белков и обработка данных о последовательностяхDNA and protein sequence analysis and sequence data processing
Применяли пакет программ фирмы GCG (Genetics Computer Group, Мэдисон, шт.Висконсин), версия 10.2 и Infomax's Vector NT1 Advance suite, версия 8.0 для создания, картирования, анализа, аннотирования и иллюстрации последовательностей.We used the GCG software package (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin), version 10.2, and Infomax's Vector NT1 Advance suite, version 8.0 to create, map, analyze, annotate, and illustrate sequences.
Экспрессионные векторыExpression vectors
Для экспрессии описанных антител применяли варианты экспрессионных плазмид, предназначенных для кратковременной экспрессии (например, в клетках HEK293 EBNA или HEK293-F), либо на основе кДНК-конструкции с использованием промотора CMV-интрона A, либо на основе геномной конструкции с использованием промотора CMV.Variants of expression plasmids intended for short-term expression (for example, in HEK293 EBNA or HEK293-F cells), either based on a cDNA construct using the CMV intron A promoter, or based on a genomic construct using the CMV promoter, were used to express the antibodies described.
Помимо кассеты экспрессии антитела векторы содержали:In addition to the antibody expression cassette, the vectors contained:
- сайт инициации репликации, обеспечивающий репликацию указанной плазмиды в E.coli, иa replication initiation site for replication of said plasmid in E. coli, and
- ген β-лактамазы, который придает устойчивость в E.coli к ампициллину.- β-lactamase gene, which confers resistance to ampicillin in E. coli.
Транскрипционная единица гена антитела состояла из следующих элементов:The transcriptional unit of the antibody gene consisted of the following elements:
- уникальный(ые) сайт(ы) рестрикции на 5'-конце,- unique restriction site (s) at the 5'-end,
- немедленно-ранний энхансер и промотор из человеческого цитомегаловируса,- immediate early enhancer and promoter from human cytomegalovirus,
- расположенная за ним последовательность интрона A в случае экспрессии на основе кДНК-конструкции,- the sequence of intron A located behind it in the case of expression based on a cDNA construct,
- 5'-нетранслируемая область гена человеческого антитела,- 5'-untranslated region of the gene for human antibodies,
- сигнальная последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина,- signal sequence of the heavy chain of immunoglobulin,
- цепь человеческого антитела (дикого типа или с заменой доменов) либо в виде кДНК-конструкции, либо в виде геномной конструкции с экзон-интронной конструкцией иммуноглобулина,- a chain of a human antibody (wild-type or with domain replacement) either in the form of a cDNA construct or in the form of a genomic construct with an exon-intron immunoglobulin construct,
- 3'-нетранслируемая область с сигнальной последовательностью полиаденилирования и- 3'-untranslated region with a polyadenylation signal sequence and
- уникальный(ые) сайт(ы) рестрикции на 3'-конце.- unique restriction site (s) at the 3'-end.
Слияние генов, содержащих описанные цепи антитела, как указано ниже, осуществляли с помощью ПЦР и/или синтеза и сборки генов с использованием известных методов и процедур рекомбинации путем соединения соответствующих сегментов нуклеиновых кислот, например, с использованием уникальных сайтов рестрикции в соответствующих векторах. Субклонированные нуклеотидные последовательности подтверждали секвенированием ДНК. Для кратковременных трансфекций создавали большие количества плазмид посредством получения плазмид из трансформированных культур E.coli (набор Nucleobond AX, фирма Macherey-Nagel).The fusion of genes containing the described antibody chains, as described below, was carried out by PCR and / or synthesis and gene assembly using known recombination methods and procedures by connecting the corresponding nucleic acid segments, for example, using unique restriction sites in the corresponding vectors. Subcloned nucleotide sequences were confirmed by DNA sequencing. For short-term transfections, large numbers of plasmids were created by obtaining plasmids from transformed E. coli cultures (Nucleobond AX kit, Macherey-Nagel).
Методики культивирования клетокCell Culture Techniques
Применяли стандартные методики культивирования клеток, описанные в Current Protocols in Cell Biology, под ред. Bonifacino J.S., Dasso M., Harford J.В., Lippincott-Schwartz J. и Yamada K.M., изд-во John Wiley & Sons, Inc., 2000. Биспецифические антитела экспрессировали путем кратковременной котрансфекции соответствующими экспрессионными плазмидами выращенных в виде прикрепленных культур клеток HEK293-EBNA или выращенных в виде суспензионных культур клеток HEK29-F, как будет описано ниже.Applied standard cell culture techniques described in Current Protocols in Cell Biology, ed. Bonifacino JS, Dasso M., Harford J. B., Lippincott-Schwartz J. and Yamada KM, John Wiley & Sons, Inc., 2000. Bispecific antibodies were expressed by short-term cotransfection with appropriate expression plasmids grown as attached cell cultures HEK293-EBNA or HEK29-F cell suspension cultures grown as described below.
Кратковременные трансфекций в системе HEK293-EBNAShort-term transfections in the HEK293-EBNA system
Биспецифические антитела экспрессировали путем кратковременной котрансфекции соответствующими экспрессионными плазмидами (например, кодирующими тяжелую цепь и модифицированную тяжелую цепь, а также соответствующую легкую цепь и модифицированную легкую цепь) выращенных в виде прикрепленных культур клеток HEK293-EBNA (линия клеток почки человеческого эмбриона 293, экспрессирующая ядерный антиген вируса Эпштейна-Барра; Американская коллекция типовых культур, депонирована под номером ATCC №CRL-10852, партия 959 218), которые культивировали в среде DMEM (модифицированная по методу Дульбекко среда Игла, фирма Gibco), дополненной 10% FCS (фетальная телячья сыворотка, фирма Gibco) с ультра низким содержанием IgG (Ultra Low IgG FCS), 2 мМ L-глутамином (фирма Gibco) и 250 мкг/мл генетицина (фирма Gibco). Для трансфекции применяли реагент для трансфекции типа FuGENE™ 6 (фирма Roche Molecular Biochemicals), используя соотношение реагента FuGENE™ (мкл) и ДНК (мкг) 4:1 (диапазон от 3:1 до 6:1). Белки экспрессировали, применяя соответствующие плазмиды, с использованием молярного соотношения плазмид, кодирующих (модифицированные и дикого типа) легкую цепь и тяжелую цепь, 1:1 (эквимолярное соотношение), в диапазоне от 1:2 до 2:1 соответственно. Клетки подпитывали в день 3 L-глутамином до концентрации 4 мМ, глюкозой (фирма Sigma) и NAA (амид никотиновой кислоты) (фирма Gibco). Собирали супернатанты клеточных культур, содержащие биспецифическое антитело, в дни с 5 по 11 после трансфекции путем центрифугирования и хранили при -20°C. Общую информацию, касающуюся рекомбинантной экспрессии человеческих иммуноглобулинов, например, в HEK293-клетках, см. у Meissner P. и др., Biotechnol. Bioeng. 75, 2001, сс.197-203.Bispecific antibodies were expressed by short-term cotransfection with appropriate expression plasmids (e.g., coding for the heavy chain and modified heavy chain, as well as the corresponding light chain and modified light chain) of HEK293-EBNA cell cultures grown in the form of adherent cultures (human embryo 293 kidney cell line expressing nuclear antigen Epstein-Barr virus; American Type Culture Collection, deposited under ATCC number CRL-10852, batch 959 218), which were cultured in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco) supplemented with 10% FCS (fetal calf serum, Gibco) with ultra low IgG (Ultra Low IgG FCS), 2 mM L-glutamine (Gibco) and 250 μg / ml Geneticin (Gibco company). For transfection, a
Кратковременные трансфекции в системе HEK293-FShort-term transfections in the HEK293-F system
Биспецифические антитела получали путем кратковременной трансфекции соответствующими плазмидами (например, кодирующими тяжелую цепь и модифицированную тяжелую цепь, а также соответствующую легкую цепь и модифицированную легкую цепь), используя систему HEK293-F (фирма Invitrogen) согласно инструкции производителя. В целом, метод состоял в следующем: HEK293-P-клетки (фирма Invitrogen), выращенные в виде суспензионной культуры либо во встряхиваемой колбе, либо в ферментере с мешалкой в бессывороточной среде для экспрессии типа FreeStyle 293 (фирма Invitrogen), трансфектировали смесью четырех экспрессионных плазмид и 293-фектином или фектином (фирма Invitrogen). В 2-литровую встряхиваемую колбу (фирма Corning) высевали клетки HEK293-F с плотностью 1,0×106 клеток/мл в 600 мл и инкубировали при 120 об/мин, 8% CO2. Через 1 день клетки трансфектировали при плотности клеток примерно 1,5×106 клеток/мл с помощью примерно 42 мл смеси A), содержащей 20 мл Opti-MEM (фирма Invitrogen) с 600 мкг общей плазмидной ДНК (1 мкг/мл), которая кодирует тяжелую цепь или модифицированную тяжелую цепь соответственно и соответствующую легкую цепь, в эквимолярном соотношении, и смеси Б), содержащей 20 мл Opti-MEM+1,2 мл 293-фектина или фектина (2 мкл/мл). В зависимости от поглощения глюкозы в процессе ферментации добавляли раствор глюкозы. Через 5-10 дней собирали супернатант, содержащий секретированное антитело, и либо из супернатанта непосредственно очищали антитела, либо супернатант замораживали и хранили.Bespecifically antibodies were obtained by short-term transfection with appropriate plasmids (e.g., coding for the heavy chain and modified heavy chain, as well as the corresponding light chain and modified light chain) using the HEK293-F system (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. In general, the method was as follows: HEK293-P cells (Invitrogen) grown in suspension culture either in a shake flask or in a fermenter with stirrer in serum-free expression medium such as FreeStyle 293 (Invitrogen), were transfected with a mixture of four expression plasmids and 293-fectin or fectin (Invitrogen). HEK293-F cells with a density of 1.0 × 10 6 cells / ml in 600 ml were seeded in a 2-liter shaken flask (Corning) and incubated at 120 rpm, 8% CO 2 . After 1 day, the cells were transfected at a cell density of about 1.5 × 10 6 cells / ml with about 42 ml of mixture A) containing 20 ml of Opti-MEM (Invitrogen) with 600 μg of total plasmid DNA (1 μg / ml), which encodes a heavy chain or a modified heavy chain, respectively, and the corresponding light chain, in an equimolar ratio, and mixture B) containing 20 ml of Opti-MEM + 1.2 ml of 293-pectin or pectin (2 μl / ml). Depending on the absorption of glucose, a glucose solution was added during the fermentation. After 5-10 days, the supernatant containing the secreted antibody was collected, and either antibodies were directly purified from the supernatant, or the supernatant was frozen and stored.
Определение белкаProtein Definition
Концентрацию белков очищенных антител и их производных определяли на основе оптической плотности (ОП) при 280 нм, используя коэффициент молярной экстинкции, рассчитанный на основе аминокислотной последовательности согласно методу, который описан у Расе и др., Protein Science, 1995, 4, сс.2411-1423.The protein concentration of purified antibodies and their derivatives was determined based on optical density (OD) at 280 nm using a molar extinction coefficient calculated based on the amino acid sequence according to the method described by Race et al., Protein Science, 1995, 4, pp. 2411 -1423.
Определение концентрации антител в супернатантахDetermination of antibody concentration in supernatants
Концентрацию антител и их производных в супернатантах клеточных культур определяли путем иммунопреципитации с белок A-агарозными гранулами (фирма Roche). 60 мкл белок A-агарозных гранул отмывали трижды в TBS-NP40 (50 мМ Трис, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 1% Nonidet-P40). Затем 1-15 мл супернатанта клеточной культуры наносили на белок А-агарозные гранулы, предварительно уравновешенные в TBS-NP40. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре гранулы отмывали на фильтрующей колонке типа Ultrafree-MC (фирма Amicon), используя однократно 0,5 мл TBS-NP40, дважды 0,5 мл двукратного (2×) забуференного фосфатом физиологического раствора (2×ЗФР, фирма Roche) и быстро четыре раза 0,5 мл 100 мМ Na-цитратным буфером, рН 5,0. Связанное антитело элюировали, добавляя 35 мкл буфера для образцов NuPAGE® LDS (фирма Invitrogen). Половину образца объединяли с восстановителем для образцов NuPAGE® или оставляли в невосстановленной форме соответственно и выдерживали в течение 10 мин при 70°C. Затем по 5-30 мкл применяли для осуществления ДСН-ПААГ с использованием 4-12% бис-Трис-гелей NuPAGE® (фирма Invitrogen) (применяя буфер MOPS для осуществлении ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях и буфер MES в виде подвижного буфера с антиоксидантной добавкой NuPAGE® (фирма Invitrogen) для осуществлении ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях) и окрашивали кумасси бриллиантовым голубым.The concentration of antibodies and their derivatives in cell culture supernatants was determined by immunoprecipitation with protein A-agarose granules (Roche). 60 μl of protein A-agarose granules were washed three times in TBS-NP40 (50 mm Tris, pH 7.5, 150 mm NaCl, 1% Nonidet-P40). Then, 1-15 ml of cell culture supernatant was applied to protein A-agarose granules previously equilibrated in TBS-NP40. After incubation for 1 h at room temperature, the granules were washed on an Ultrafree-MC filter column (Amicon) using once 0.5 ml of TBS-NP40, twice 0.5 ml of twice (2 ×) phosphate-buffered saline (2 × PBS, Roche) and quickly four times with 0.5 ml of 100 mM Na-citrate buffer, pH 5.0. The bound antibody was eluted by adding 35 μl of NuPAGE® LDS sample buffer (Invitrogen). Half of the sample was combined with a NuPAGE® sample reductant or left unreduced, respectively, and held for 10 minutes at 70 ° C. Then, 5-30 μl each was used for SDS-PAGE using 4-12% NuPAGE® bis-Tris gels (Invitrogen) (using MOPS buffer for SDS-PAGE under non-reducing conditions and MES buffer in the form of a moving buffer with antioxidant NuPAGE® (Invitrogen) for SDS-PAGE under reducing conditions) and Coomassie was stained with brilliant blue.
Концентрацию антител и их производных в супернатантах клеточных культур оценивали количественно с помощью аффинной ЖХВР-хроматографии. В целом, метод состоял в следующем: супернатанты, содержащие антитела и их производные, которые связывались с белком A, вносили на колонку Applied Biosystems Poros A/20 в 200 мМ KH2PO4, 100 мМ натрий-цитратный буфер, pH 7,4 и элюировали из матрикса с помощью 200 мМ NaCl, 100 мМ лимонной кислоты, pH 2,5 с использованием системы Agilent HPLC 1100. Элюированный белок оценивали количественно с помощью УФ-абсорбции и интегрирования площадей пиков. Очищенное стандартное антитело в виде IgG1 служило в качестве стандарта.The concentration of antibodies and their derivatives in the supernatants of cell cultures was quantified using affinity HPLC chromatography. In general, the method consisted of the following: supernatants containing antibodies and their derivatives that bind to protein A were added to an Applied Biosystems Poros A / 20 column in 200 mM KH 2 PO 4 , 100 mM sodium citrate buffer, pH 7.4 and was eluted from the matrix using 200 mM NaCl, 100 mM citric acid, pH 2.5 using the Agilent HPLC 1100 system. Eluted protein was quantified by UV absorption and integration of peak areas. Purified standard antibody as IgG1 served as a standard.
В альтернативном варианте концентрацию антител и их производных в супернатантах клеточных культур оценивали с помощью «сэндвич»-IgG-ELISA. В целом, метод состоял в следующем: 96-луночные титрационные микропланшеты, обладающие высокой способностью связывать стрептавидин A (планшеты типа StreptaWell High Bind Strepatavidin A (фирма Roche)), сенсибилизировали из расчета 100 мкл/лунку биотинилированным античеловеческим IgG F(ab')2<h-Fcγ>BI, применяемым в качестве иммобилизованной молекулы (фирма Dianova), в концентрации 0,1 мкг/мл в течение 1 ч при комнатной температуре или в другом варианте в течение ночи при 4°C и затем отмывали трижды, используя 200 мкл/лунку ЗФР, 0,05% Твин (ЗФРТ, фирма Sigma). Добавляли в лунки по 100 мкл/лунку серийных разведений в ЗФР (фирма Sigma), содержащих соответствующее антитело супернатантов клеточных культур, и инкубировали в течение 1-2 ч на шейкере для титрационных микропланшетов при комнатной температуре. Лунки отмывали трижды, используя 200 мкл/лунку ЗФРТ, и связанное антитело выявляли с помощью 100 мкл F(ab')2<hFcγ>POD (фирма Dianova) в концентрации 0,1 мкг/мл в качестве идентифицирующего антитела в течение 1-2 ч на шейкере для титрационных микропланшетов при комнатной температуре. Несвязанное идентифицирующее антитело отмывали трижды, используя 200 мкл/лунку ЗФРТ, и связанное идентифицирующее антитело выявляли, добавляя 100 мкл ABTS/лунку. Определение абсорбции осуществляли на спектрометре типа Tecan Fluor при длине волны 405 нм (длина референс волны 492 нм).Alternatively, the concentration of antibodies and their derivatives in cell culture supernatants was evaluated using a sandwich-IgG-ELISA. In general, the method consisted of the following: 96-well microtiter plates with high binding ability of streptavidin A (StreptaWell High Bind Strepatavidin A plates (Roche)) were sensitized at 100 μl / well with biotinylated anti-human IgG F (ab ') 2 <h-Fcγ> BI, used as an immobilized molecule (Dianova), at a concentration of 0.1 μg / ml for 1 h at room temperature or in another embodiment overnight at 4 ° C and then washed three times using 200 μl / well PBS, 0.05% Tween (PBS, Sigma). 100 μl / well of serial dilutions in PBS (Sigma) containing the corresponding antibody of cell culture supernatants were added to the wells and incubated for 1-2 hours on a microtiter plate shaker at room temperature. Wells were washed three times using 200 μl / well PBS, and the bound antibody was detected with 100 μl F (ab ') 2 <hFcγ> POD (Dianova) at a concentration of 0.1 μg / ml as an identifying antibody for 1-2 h on a shaker for microtiter plates at room temperature. Unbound identifying antibody was washed three times using 200 μl / well PBS, and the associated identifying antibody was detected by adding 100 μl ABTS / well. The absorption was determined on a Tecan Fluor spectrometer at a wavelength of 405 nm (reference wavelength of 492 nm).
Очистка белковProtein Purification
Белки очищали из профильтрованных супернатанов клеточных культур согласно стандартным протоколам. В целом, метод состоял в следующем: белки наносили на колонку, заполненную белок A-сефарозой (фирма GE Healthcare), и отмывали ЗФР. Элюцию антител осуществляли при pH 2,8 с последующей немедленной нейтрализацией образца. Агрегированный белок отделяли от мономерных антител гель-фильтрацией (Superdex 200, фирма GE Healthcare) в ЗФР или в 20 мМ гистидине, 150 мМ NaCl, pH 6,0. Фракции мономерных антител объединяли, при необходимости концентрировали, используя, например, центрифужный концентратор типа MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO (молекулярновесовой предел), замораживали и хранили при -20°C или -80°C. Часть образцов оставляли для последующего аналитического изучения белка и его аналитической характеризации, например, с помощью ДСН-ПААГ, гель-фильтрации или масс-спектрометрии.Proteins were purified from filtered supernatans of cell cultures according to standard protocols. In general, the method consisted of the following: proteins were applied to a column filled with A-Sepharose protein (GE Healthcare) and washed with PBS. The elution of antibodies was carried out at a pH of 2.8, followed by immediate neutralization of the sample. The aggregated protein was separated from monomeric antibodies by gel filtration (
ДСН-ПААГSDS-PAGE
Применяли систему геля NuPAGE® Pre-Cast (фирма Invitrogen) согласно инструкции производителя. В частности использовали 10% или 4-12% бис-Трис-гели NuPAGE®, Novex® (pH 6,4) и подвижные буферы, такие как NuPAGE® MES (гели, применяемые в восстанавливающих условиях, подвижный буфер с антиоксидантной добавкой NuPAGE®) или MOPS (гели, применяемые в невосстанавливающих условиях).The NuPAGE® Pre-Cast gel system (Invitrogen) was used according to the manufacturer's instructions. In particular, 10% or 4-12% NuPAGE® bis-Tris gels, Novex® (pH 6.4) and mobile buffers such as NuPAGE® MES (reducing gels, mobile buffer with antioxidant NuPAGE®) were used ) or MOPS (gels used in non-reducing conditions).
Аналитическая гель-фильтрацияAnalytical Gel Filtration
В качестве гель-фильтрации, предназначенной для определения агрегированного и олигомерного состояния антител, применяли ЖХВР-хроматографию. В целом, метод состоял в следующем: очищенные на белке A антитела вносили в колонку типа Tosoh TSKgel G3000SW в 300 мМ NaCl, 50 мМ KH2PO4/K2HPO4, pH 7,5 в системе Agilent HPLC 1100, или в колонку Superdex 200 (фирма GE Healthcare) в 2×ЗФР в ЖХВР-системе Dionex. Количество элюированного белка определяли на основе УФ-абсорбции и интегрирования площадей пиков. В качестве стандарта применяли стандарт для гель-фильтрации фирмы BioRad (Gel Filtration Standard 151-1901).As a gel filtration designed to determine the aggregated and oligomeric state of antibodies, HPLC was used. In general, the method consisted of the following: antibodies purified on protein A were added to a Tosoh TSKgel G3000SW column in 300 mM NaCl, 50 mM KH 2 PO 4 / K 2 HPO 4 , pH 7.5 in an Agilent HPLC 1100 system, or to a column Superdex 200 (GE Healthcare) in 2 × PBS in the Dionex HPLC system. The amount of eluted protein was determined based on UV absorption and integration of peak areas. As a standard, a BioRad gel filtration standard (Gel Filtration Standard 151-1901) was used.
Масс-спектрометрияMass spectrometry
Общую дегликозилированную массу антител, полученных в результате кроссинговера, определяли и подтверждали с помощью масс-спектрометрии с ионизацией электроспреем (ESI-MC). В целом, метод состоял в следующем: 100 мкг очищенных антител дегликозилировали с помощью 50 мед. N-гликозидазы F (PNGазаF, фирма ProZyme) в 100 мМ KH2PO4/K2HPO4, pH 7 при 37°C в течение 12-24 ч при концентрации белка вплоть до 2 мг/мл и затем обессоливали с помощью ЖХВР на колонке Sephadex G25 (фирма GE Healthcare). Массу соответствующих тяжелых и легких цепей определяли с помощью ESI-MC после дегликозилирования и восстановления. В целом, метод состоял в следующем: 50 мкг антитела в 115 мкл инкубировали с 60 мкл 1М TCEP и 50 мкл 8M гидрохлорида гуанидида после обессоливания. Общую массу и массу восстановленных тяжелых и легких цепей определяли с помощью ESI-MC с использованием МС-системы Q-Star Elite, снабженной источником NanoMate.The total deglycosylated mass of antibodies obtained by crossing over was determined and confirmed using electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MC). In general, the method was as follows: 100 μg of purified antibodies was deglycosylated with 50 honey. N-glycosidase F (PNGaseF, ProZyme) in 100 mM KH 2 PO 4 / K 2 HPO 4 ,
ELISA для оценки связывания ECD IGF-1RELISA for evaluating the binding of ECD IGF-1R
Особенности связывания созданных антител с внеклеточным доменом (ECD) IGF-1R анализировали с помощью ELISA. Для этой цели внеклеточный домен IGF-1R (остатки 1-462), содержащий встречающуюся в естественных условиях лидерную последовательность и 12 богатых LI-цистеином доменов эктодомена альфа-цепи человеческого IGF-IR (согласно МсКеrn и др., 1997; Ward и др., 2001), слитый с N-концевой меткой, представляющей собой His-стрептавидин-связывающий пептид (His-SBP), клонировали в производном вектора pcDNA3 и кратковременно экспрессировали в HEK293P-клетках. Белковая последовательность ECD IGF-1R-His-SBP представлена в SEQ ID NO: 10. 96-луночные титрационные микропланшеты, обладающие высокой способностью связывать стрептавидин A (планшеты типа StreptaWell High Bind Strepatavidin А (фирма Roche)), сенсибилизировали, используя 100 мкл/лунку супернатанта клеточной культуры, содержащего растворимый слитый белок IGF-1R-ECD-SBP, в течение ночи при 4°C и отмывали трижды, используя 200 мкл/лунку ЗФР, 0,05% Твин (ЗФРТ, фирма Sigma). Затем добавляли в лунки из расчета 100 мкл/лунку серийные разведения соответствующего антитела и в качестве референс-антитела антитело дикого типа<IGF-1R>в ЗФР (фирма Sigma), который включал 1% БСА (фракция V, фирма Roche), и инкубировали в течение 1-2 ч на шейкере для титрационных микропланшетов при комнатной температуре. При осуществлении серийных разведений в лунки вносили одинаковое количество очищенного антитела. Лунки отмывали трижды, используя 200 мкл/лунку ЗФРТ, и связанное антитело выявляли, используя 100 мкл/лунку F(ab')2<hFcγ>POD (фирма Dianova) в концентрации 0,1 мкг/мл (1:8000) в качестве идентифицирующего антитела, в течение 1-2 ч на шейкере для титрационных микропланшетов при комнатной температуре. Несвязанное идентифицирующее антитело отмывали трижды, используя 200 мкл/лунку ЗФРТ, и связанное идентифицирующее антитело выявляли, добавляя 100 мкл ABTS/лунку. Определение абсорбции осуществляли на спектрометре Tecan Fluor при длине волны 405 нм (длина референс волны 492 нм).The binding of the generated antibodies to the extracellular domain (ECD) of IGF-1R was analyzed by ELISA. For this purpose, the extracellular domain of IGF-1R (residues 1-462) containing a naturally occurring leader sequence and 12 LI-cysteine-rich ectodomain domains of the human IGF-IR alpha chain (according to McKern et al., 1997; Ward et al. , 2001), fused to the N-terminal tag of His-streptavidin-binding peptide (His-SBP), cloned in a derivative of the pcDNA3 vector and expressed briefly in HEK293P cells. The ECD protein sequence IGF-1R-His-SBP is shown in SEQ ID NO: 10. 96-well microtiter plates with high streptavidin A binding ability (StreptaWell High Bind Strepatavidin A plates (Roche)) were sensitized using 100 μl / a well of cell culture supernatant containing a soluble IGF-1R-ECD-SBP fusion protein overnight at 4 ° C. and washed three times using 200 μl / well PBS, 0.05% Tween (PBS, Sigma). Then, serial dilutions of the corresponding antibody were added to the wells at a rate of 100 μl / well and, as a reference antibody, a wild-type antibody <IGF-1R> in PBS (Sigma), which included 1% BSA (fraction V, Roche), and incubated for 1-2 hours on a shaker for microtiter plates at room temperature. During serial dilutions, the same amount of purified antibody was added to the wells. Wells were washed three times using 200 μl / well PBS, and the bound antibody was detected using 100 μl / well F (ab ') 2 <hFcγ> POD (Dianova) at a concentration of 0.1 μg / ml (1: 8000) as identifying antibodies, for 1-2 hours on a shaker for microtiter plates at room temperature. Unbound identifying antibody was washed three times using 200 μl / well PBS, and the associated identifying antibody was detected by adding 100 μl ABTS / well. The absorption was determined on a Tecan Fluor spectrometer at a wavelength of 405 nm (reference wavelength of 492 nm).
Biacore-анализ с использованием ECD IGF-1R (IGF-1R-ECD)Biacore Analysis Using ECD IGF-1R (IGF-1R-ECD)
Связывание созданных антител с человеческим IGF-1R-ECD исследовали также с помощью поверхностного плазмонного резонанса, используя устройство типа BIACORE Т100 (фирма GE Healthcare Biosciences AB, Упсала, Швеция). В целом, метод состоял в следующем: для оценки аффинности козьи античеловеческие антитела типа IgG JIR 109-005-098 иммобилизовывали на СМ5-чипе посредством аминового сочетания для презентации антител к человеческому IGF-1R-ECD, несущих Fc. Связывание оценивали в HBS-буфере (HBS-P (100 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 0,005% Твин 20, pH 7,4) при 25°C. IGF-1R-ECD (фирма R&D Systems или полученный при создании изобретения) добавляли в раствор в различных концентрациях. Ассоциацию оценивали путем инъекции IGF-1R-ECD в течение промежутка времени от 80 с до 3 мин; диссоциацию оценивали путем отмывки поверхности чипа HBS-буфером в течение 3-10 мин и значение KD определяли, используя модель связывания Ленгмюра при соотношении 1:1. Из-за низкой плотности загрузки и уровня захвата антител<IGF-1R>получали данные о связывании одновалентного IGF-1R-ECD. Данные, полученные для отрицательного контроля (например, кривые, полученные только для буфера) вычитали из кривых, полученных для образца, для коррекции присущего системе сдвига основного уровня и для снижения шумовых сигналов. Применяли программу Biacore Т100 Evaluation, версия 1.1.1 для анализа сенсограмм и для расчета данных, касающихся аффинности. На фиг.11 представлено схематическое изображение Biacore-анализа.The binding of the generated antibodies to human IGF-1R-ECD was also investigated using surface plasmon resonance using a device of the type BIACORE T100 (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Sweden). In general, the method was as follows: to assess the affinity of goat anti-human IgG type antibodies, JIR 109-005-098 was immobilized on a CM5 chip using an amine combination to present antibodies to human IGF-1R-ECD carrying Fc. Binding was evaluated in HBS buffer (HBS-P (100 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005
Примеры 1Examples 1
Получение, экспрессия, очистка и характеризация моноспецифического двухвалентного антитела <IGF-1R>, в котором CL- и CH1-домены константных областей заменены друг на друга (сокращенно обозначено в контексте настоящего описания как антитело<IGF-1R>, несущее замену CL-CH1)Obtaining, expression, purification and characterization of a monospecific divalent antibody <IGF-1R>, in which the CL and CH1 domains of the constant regions are replaced by each other (abbreviated in the context of the present description as the antibody <IGF-1R> bearing the replacement of CL-CH1 )
Пример 1АExample 1A
Создание экспрессионных плазмид для моноспецифического двухвалентного антитела <IGF-1R>, несущего замену CL-CH1The creation of expression plasmids for monospecific divalent antibodies <IGF-1R>, bearing the replacement of CL-CH1
Последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи моноспецифического двухвалентного антитела<IGF-1R>, несущего замену CL-CH1, включая соответствующие лидерные последовательности, описанные в данном примере, выводили из тяжелой цепи человеческого антитела <IGF-1R> (SEQ ID NO: 1, плазмида 4843-pUC-HC-IGF-1R) и его легкой цепи (SEQ ID NO: 2, плазмида 4842-pUC-LC-IGF-1R), которые описаны в WO 2005/005635, и константные домены тяжелой и легкой цепи выводили из человеческого антитела (C-каппа и IgG1).The heavy and light chain variable domain sequences of the monospecific divalent antibody <IGF-1R> bearing the CL-CH1 substitution, including the corresponding leader sequences described in this example, were derived from the heavy chain of the human antibody <IGF-1R> (SEQ ID NO: 1, plasmid 4843-pUC-HC-IGF-1R) and its light chain (SEQ ID NO: 2, plasmid 4842-pUC-LC-IGF-1R), which are described in WO 2005/005635, and the constant domains of the heavy and light chains were derived from a human antibody (C-kappa and IgG1).
Генные сегменты, кодирующие лидерную последовательность, вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и домен человеческой легкой каппа-цепи (CL) антитела<IGF-1R>сцепляли и сливали с 5'-концом Fc-доменов константных областей человеческой тяжелой γ1-цепи (шарнир-СН2-CH3). ДНК, кодирующую соответствующий слитый белок, полученный в результате замены CH1-домена на CL-домен (замена CH1-CL), создавали путем синтеза гена и обозначали далее как <IGF-1R>HC∗∗ (SEQ ID NO: 3).The gene segments encoding the leader sequence, the variable domain of the heavy chain (VH) and the domain of the human light Kappa chain (CL) of the <IGF-1R> antibody were linked and fused to the 5 ′ end of the Fc domains of the constant regions of the human heavy γ1 chain (hinge -CH2-CH3). DNA encoding the corresponding fusion protein obtained by replacing the CH1 domain with the CL domain (CH1-CL replacement) was created by gene synthesis and was designated below as <IGF-1R> HC ∗∗ (SEQ ID NO: 3).
Генные сегменты, кодирующие лидерную последовательность, вариабельный домен легкой цепи (VL) и константный домен (CH1) человеческой тяжелой γ1-цепи антитела <IGF-1R> сцепляли в виде независимой цепи. ДНК, кодирующую соответствующий слитый белок, полученный в результате замены CL-домена на CH1-домен (замена CL-CH1), создавали путем синтеза гена и обозначали далее как <IGF-1R>LC∗∗ (SEQ ID NO: 4).The gene segments encoding the leader sequence, the variable domain of the light chain (VL) and the constant domain (CH1) of the human heavy γ1 chain of the antibody <IGF-1R> were linked as an independent chain. DNA encoding the corresponding fusion protein obtained by replacing the CL domain with the CH1 domain (replacing CL-CH1) was created by gene synthesis and was designated below as <IGF-1R> LC ∗∗ (SEQ ID NO: 4).
На фиг.5 и фиг.6 представлено схематическое изображение белковой последовательности модифицированной тяжелой цепи <IGF-1R>HC∗∗ и модифицированной легкой цепи<IGF-1R>LC∗∗.5 and 6 are a schematic representation of the protein sequence of the modified heavy chain <IGF-1R> HC ∗∗ and the modified light chain <IGF-1R> LC ∗∗.
Ниже кратко описаны соответствующие экспрессионные векторы:The following expression vectors are briefly described below:
Вектор pUC-HC∗∗-IGF-1RVector pUC-HC ∗∗ - IGF-1R
Вектор pUC-HC∗∗-IGF-1R представляет собой экспрессионную плазмиду, например, предназначенную для кратковременной экспрессии несущей замену CL-CH1 тяжелой цепи<IGF-1R>HC∗∗ (кассета экспрессии на основе кДНК-конструкции; с CMV-интроном А), в клетках линии HEK293 (EBNA) или стабильной экспрессии в CHO-клетках.The vector pUC-HC ∗∗ - IGF-1R is an expression plasmid, for example, designed for short-term expression of the carrier chain <IGF-1R> HC ∗∗ heavy chain CL-CH1 (expression cassette based on cDNA construct; with CMV intron A ), in HEK293 (EBNA) cells, or stable expression in CHO cells.
Помимо экспрессионной кассеты <IGF-1R>HC∗ этот вектор содержал:In addition to the expression cassette <IGF-1R> HC ∗, this vector contained:
- сайт инициации репликации из pUC18, обеспечивающий репликацию указанной плазмиды в E.coli, иa replication initiation site from pUC18 providing replication of said plasmid in E. coli, and
- ген β-лактамазы, который придает устойчивость в E.coli к ампициллину.- β-lactamase gene, which confers resistance to ampicillin in E. coli.
Транскрипционная единица гена<IGF-1R>HC∗∗ содержала следующие элементы:The transcriptional unit of the <IGF-1R> HC ∗∗ gene contained the following elements:
- сайт рестрикции AscI на 5'-конце,- AscI restriction site at the 5'-end,
- немедленно-ранний энхансер и промотор из человеческого цитомегаловируса,- immediate early enhancer and promoter from human cytomegalovirus,
- расположенную за ним последовательность интрона A,- the sequence of intron A located behind it,
- 5'-нетранслируемую область гена человеческого антитела,- 5'-untranslated region of the gene for human antibodies,
- сигнальную последовательность легкой цепи иммуноглобулина,- signal sequence of the immunoglobulin light chain,
- ген человеческой зрелой HC∗∗-цепи <IGF-1R>, который кодирует слияние вариабельного домена человеческой тяжелой цепи (VH) и константного домена человеческой легкой каппа-цепи (CL), слитый на 5'-конце Fc-доменов константных доменов человеческой тяжелой γ1-цепи (шарнир-СН2-CH3),- a gene of human mature HC ∗∗ - <IGF-1R> chain, which encodes a fusion of the variable domain of the human heavy chain (VH) and the constant domain of the human light Kappa chain (CL), fused at the 5'-end of the Fc domains of constant domains of human heavy γ1 chain (hinge-CH2-CH3),
- 3'-нетранслируемую область с сигнальной последовательностью полиаденилирования и- 3'-untranslated region with a polyadenylation signal sequence and
- сайт рестрикции SgrAI на 3'-конце.- SgrAI restriction site at the 3'-end.
Плазмидная карта экспрессионного вектора pUC-HC∗∗-IGF-1R, предназначенного для несущей замену CL-CH1 тяжелой цепи ∗∗<IGF-1R>HC∗∗, представлена на фиг.7. Аминокислотная последовательность <IGF-1R>HC∗∗ (включая сигнальную последовательность) представлена в SEQ ID NO: 3.The plasmid map of the expression vector pUC-HC ∗∗ - IGF-1R, designed for carrying the replacement of CL-CH1 heavy chain ∗∗ <IGF-1R> HC ∗∗, is presented in Fig.7. The amino acid sequence <IGF-1R> HC ∗∗ (including the signal sequence) is presented in SEQ ID NO: 3.
Вектор pUC-LC∗∗-IGF-1RVector pUC-LC ∗∗ - IGF-1R
Вектор pUC-LC∗∗-IGF-1R представляет собой экспрессионную плазмиду, например, предназначенную для кратковременной экспрессии несущей замену CL-CH1 легкой цепи <IGF-1R>LC∗∗ ((кассета экспрессии на основе кДНК-конструкции; с CMV-интроном A), в клетках линии HEK293 (EBNA) или стабильной экспрессии в CHO-клетках.The vector pUC-LC ∗∗ - IGF-1R is an expression plasmid, for example, designed for short-term expression of the carrier chain <IGF-1R> LC ∗∗ light chain CL-CH1 ((expression cassette based on cDNA construct; with CMV intron A), in HEK293 (EBNA) cells, or stable expression in CHO cells.
Помимо экспрессионной кассеты<IGF-1R>LC∗∗ этот вектор содержал:In addition to the expression cassette <IGF-1R> LC ∗∗, this vector contained:
- сайт инициации репликации из pUC18, обеспечивающий репликацию указанной плазмиды в E.coli, иa replication initiation site from pUC18 providing replication of said plasmid in E. coli, and
- ген β-лактамазы, который придает устойчивость в E.coli к ампициллину.- β-lactamase gene, which confers resistance to ampicillin in E. coli.
Транскрипционная единица гена <IGF-1R>LC∗∗ содержала следующие элементы:The transcriptional unit of the <IGF-1R> LC ∗∗ gene contained the following elements:
- сайт рестрикции Sse8387I на 5'-конце,- restriction site Sse8387I at the 5'-end,
- немедленно-ранний энхансер и промотор из человеческого цитомегаловируса,- immediate early enhancer and promoter from human cytomegalovirus,
- расположенную за ним последовательность интрона A,- the sequence of intron A located behind it,
- 5'-нетранслируемую область гена человеческого антитела,- 5'-untranslated region of the gene for human antibodies,
- сигнальную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина,- the signal sequence of the heavy chain of immunoglobulin,
- ген человеческой зрелой LC∗∗-цепи<IGF-1R>, который кодирует слияние вариабельного домена человеческой легкой цепи (VL) и константных доменов человеческой тяжелой γ1-цепи (CH1),- a gene of human mature LC ∗∗ - <IGF-1R> chain, which encodes the fusion of the variable domain of the human light chain (VL) and constant domains of the human heavy γ1 chain (CH1),
- 3'-нетранслируемую область с сигнальной последовательностью полиаденилирования и- 3'-untranslated region with a polyadenylation signal sequence and
- сайты рестрикции SalI и FseI на 3'-конце.- restriction sites SalI and FseI at the 3'-end.
Плазмидная карта экспрессионного вектора pUC-LC∗∗-IGF-1R, предназначенного для несущей замену CL-CH1 легкой цепи ∗∗<IGF-1R>LC∗∗, представлена на фиг.8. Аминокислотная последовательность <IGF-1R>LC∗∗ (включая сигнальную последовательность) представлена в SEQ ID NO: 4.The plasmid map of the expression vector pUC-LC ∗∗ - IGF-1R, designed for bearing the replacement of CL-CH1 light chain ∗∗ <IGF-1R> LC ∗∗, is presented in Fig. 8. The amino acid sequence <IGF-1R> LC ∗∗ (including the signal sequence) is presented in SEQ ID NO: 4.
Плазмиды PUC-HC∗∗-IGF-1R и pUC-LC∗∗-IGF-1R можно применять для кратковременных или стабильных котрансфекций, например, клеток HEK293, HEK293 EBNA или СНО (2-векторная система). С целью сравнения осуществляли кратковременную экспрессию антитела <IGF-1R> дикого типа из плазмид 4842-pUC-LC-IGF-1R (SEQ ID NO: 2) и 4843-pUC-HC-IGF-1R (SEQ ID NO: 1), аналогично методу, описанному в этом примере.Plasmids PUC-HC ∗∗ - IGF-1R and pUC-LC ∗∗ - IGF-1R can be used for short-term or stable cotransfection, for example, HEK293 cells, HEK293 EBNA or CHO (2-vector system). For comparison, short-term expression of the wild-type <IGF-1R> antibody from plasmids 4842-pUC-LC-IGF-1R (SEQ ID NO: 2) and 4843-pUC-HC-IGF-1R (SEQ ID NO: 1) was carried out, similar to the method described in this example.
Для достижения более высоких уровней экспрессии при кратковременных экспрессиях в клетках HEK293 EBNA экспрессионную кассету <IGF-1R>HC∗∗ можно субклонировать с использованием сайтов AscI, SgrAI, а экспрессионную кассету <IGF-1R>LC∗∗ можно субклонировать с использованием сайтов Sse8387I и FseI в экспрессионном векторе 4700-pUC-Hyg_OriP, который содержалTo achieve higher levels of expression during short-term expressions in HEK293 EBNA cells, the <IGF-1R> HC ∗∗ expression cassette can be subcloned using AscI, SgrAI sites, and the <IGF-1R> LC ∗∗ expression cassette can be subcloned using Sse8387I and FseI in the expression vector 4700-pUC-Hyg_OriP, which contained
- элемент OriP и- element OriP and
- ген, обусловливающий устойчивость к гигромицину, в качестве селектируемого маркера.- a gene for resistance to hygromycin, as a selectable marker.
Транскрипционные единицы тяжелой и легкой цепи можно либо субклонировать в двух независимых векторах 4700-pUC-Hyg-OriP с целью котрансфекции (2-векторная система), либо их можно клонировать в одном общем векторе 4700-pUC-Hyg-OriP (1-векторная система) для последующих кратковременных или стабильных трансфекций с использованием образовавшихся векторов. На фиг.9 показана плазмидная карта основного вектора 4700-pUC-OriP.The heavy and light chain transcriptional units can either be subcloned in two independent 4700-pUC-Hyg-OriP vectors for cotransfection (2-vector system), or they can be cloned in one common 4700-pUC-Hyg-OriP vector (1-vector system ) for subsequent short-term or stable transfections using the resulting vectors. Figure 9 shows the plasmid map of the main vector 4700-pUC-OriP.
Пример 1БExample 1B
Создание экспрессионных плазмид для моноспецифического двухвалентного антитела <IGF-1R>, несущего замену CL-CH1The creation of expression plasmids for monospecific divalent antibodies <IGF-1R>, bearing the replacement of CL-CH1
Слитые гены <IGF-1R> (слитые гены НС∗∗ и LC∗∗), содержащие измененные Fab-последовательности относительно антитела <IGF-1R> дикого типа, собирали с помощью известных методов и процессов рекомбинации путем соединения соответствующих сегментов нуклеиновых кислот.The <IGF-1R> fusion genes (HC ∗∗ and LC ∗∗ fusion genes) containing altered Fab sequences relative to the wild-type <IGF-1R> antibody were assembled using known recombination methods and processes by combining the corresponding nucleic acid segments.
Каждую из нуклеотидных последовательностей, кодирующих НС∗∗ и LC∗∗ IGF-1R, синтезировали путем химического синтеза и затем клонировали в клонирующем векторе pGA4, основой которого является плазмида pPCRScript (фирма Stratagene), на фирме Geneart (Регенсбург, Германия). Кассету экспрессии, кодирующую IGF-1R HC∗∗, встраивали путем лигирования в пригодную для E.coli плазмиду, используя сайты рестрикции PvuII и BmgBI, с получением конечного вектора pUC-HC∗∗-IGF-1R; кассету экспрессии, кодирующую соответствующую IGF-1R LC∗∗, встраивали путем лигирования в пригодную для E.coli плазмиду, используя сайты рестрикции PvuII и SalI, с получением конечного вектора pUC-LC∗∗-IGF-1R. Субклонированные нуклеотидные последовательности подтверждали путем секвенирования ДНК. Для кратковременных и стабильных трансфекции использовали большие количества плазмид, которые получали из трансформированных культур E.coli (набор Nucleobond AX, фирма Macherey-Nagel).Each of the nucleotide sequences encoding HC ∗∗ and LC ∗∗ IGF-1R was synthesized by chemical synthesis and then cloned into the pGA4 cloning vector, which is based on the pPCRScript plasmid (Stratagene), at Geneart (Regensburg, Germany). An expression cassette encoding IGF-1R HC ∗∗ was inserted by ligation into an E. coli suitable plasmid using the PvuII and BmgBI restriction sites to give the final pUC-HC ∗∗ vector — IGF-1R; an expression cassette encoding the corresponding IGF-1R LC ∗∗ was inserted by ligation into a suitable E. coli plasmid using the PvuII and SalI restriction sites to obtain the final vector pUC-LC ∗∗ — IGF-1R. Subcloned nucleotide sequences were confirmed by DNA sequencing. For short-term and stable transfection, large quantities of plasmids were used, which were obtained from transformed E. coli cultures (Nucleobond AX kit, Macherey-Nagel).
Пример 1ВExample 1B
Кратковременная экспрессия моноспецифического двухвалентного антитела <IGF-1R>, несущего замену CL-CH1, его очистка и подтверждение идентичности с помощью масс-спектрометрииShort-term expression of a monospecific divalent antibody <IGF-1R> bearing the replacement of CL-CH1, its purification and confirmation of identity using mass spectrometry
Рекомбинантное антитело <IGF-1R>, несущее замену CL-CH1, экспрессировали путем кратковременной котрансфекции плазмидами pUC-HC∗∗-IGF-1R и pUC-LC∗∗-IGF-1R находящихся в суспензии клеток линии HEK293-F согласно описанному выше методу.Recombinant antibody <IGF-1R> bearing the substitution CL-CH1 was expressed by short-term cotransfection with the plasmids pUC-HC ∗∗ - IGF-1R and pUC-LC ∗∗ - IGF-1R of the suspension cells of the HEK293-F line according to the method described above .
Экспрессированное и секретированное моноспецифическое двухвалентное антитело <IGF-1R>, несущее замену CL-CH1, очищали из профильтрованных супернатантов клеточной культуры с помощью аффинной хроматографии на белке A согласно описанному выше методу. В целом, метод состоял в следующем: содержащие антитело <IGF-1R>, несущее замену CL-CH1, супернатанты клеточной культуры после кратковременных трансфекции осветляли центрифугированием и фильтрацией и вносили на содержащую белок A колонку HiTrap MabSelect Xtra (фирма GE Healthcare), уравновешенную ЗФР-буфером (100 мМ Na2HPO4, 1 мМ KH2PO4, 137 мМ NaCl и 2,7 мМ KCl, pH 7,4). Несвязанные белки отмывали уравновешивающим ЗФР-буфером, а затем 0,1 М натрий-цитратным буфером, pH 5,5 и отмывали ЗФР. Для элюции антитела применяли 100 мМ натрий-цитратый буфер, pH 2,8, после чего образцы немедленно нейтрализовали, добавляя 300 мкл 2М Трис, pH 9,0 на 2-миллилитровую фракцию. Агрегированный белок отделяли от мономерных антител с помощью гель-фильтрации на колонке HiLoad 26/60 Superdex 200 prep grade (фирма GE Healthcare) в 20 мМ гистидине, 150 мМ NaCl, pH 6,0, а фракцию мономерных антител затем концентрировали с помощью центрифужного концентратора MILLIPORE Amicon Ultra-15. Антитело <IGF-1R>, несущее замену CL-CH1, замораживали и хранили при -20°C или -80°C. Целостность антитела <IGF-1R>, несущего замену CL-CH1, анализировали с помощью ДСН-ПААГ в присутствии восстановителя или без него и затем окрашивали кумасси бриллиантовым голубым согласно описанному выше методу. Мономерное состояние антитела <IGF-1R>, несущего замену CL-CH1, подтверждали аналитической гель-фильтрацией (фиг.12). Охарактеризованные образцы использовали для дальнейшего аналитического исследования белка и изучения функциональных характеристик. С помощью ESI-масс-спектрометрии подтверждали теоретическую молекулярную массу полностью дегликолизированного антитела <IGF-1R>, несущего замену CL-CH1.Expressed and secreted monospecific bivalent <IGF-1R> antibody bearing the CL-CH1 substitution was purified from filtered cell culture supernatants using Protein A affinity chromatography as described above. In general, the method consisted of the following: containing an <IGF-1R> antibody bearing the CL-CH1 substitution, cell culture supernatants after short-term transfection were clarified by centrifugation and filtration and loaded onto a protein-containing HiTrap MabSelect Xtra column (GE Healthcare) balanced by PBS -buffer (100 mM Na 2 HPO 4 , 1 mM KH 2 PO 4 , 137 mM NaCl and 2.7 mM KCl, pH 7.4). Unbound proteins were washed with equilibrated PBS, followed by 0.1 M sodium citrate buffer, pH 5.5, and washed with PBS. To elute the antibody, 100 mM sodium citrate buffer, pH 2.8 was used, after which the samples were immediately neutralized by adding 300 μl of 2M Tris, pH 9.0 per 2 ml fraction. The aggregated protein was separated from monomeric antibodies by gel filtration on a HiLoad 26/60
Пример 1ГExample 1G
Анализ способности моноспецифического двухвалентного антитела <IGF-1R>, несущего замену CL-CH1, связывать IGF-1R с помощью применяемого для оценки связывания IGF-1R-ECD ELISA и Biacore-анализаAnalysis of the ability of a monospecific divalent antibody <IGF-1R>, bearing the replacement of CL-CH1, to bind IGF-1R using used to evaluate the binding of IGF-1R-ECD ELISA and Biacore analysis
Связывающие способности моноспецифического двухвалентного антитела <IGF-1R>, несущего замену CL-CH1, оценивали с помощью ELISA с использованием внеклеточного домена (ECD) IGF-1R согласно описанному выше методу. Для этой цели внеклеточный домен IGF-1R (остатки 1-462), содержащий встречающуюся в естественных условиях лидерную последовательность и 12 богатых LI-цистеином доменов эктодомена альфа-цепи человеческого IGF-IR (согласно McKern и др., 1997; Ward и др., 2001), слитый с N-концевой меткой, представляющей собой His-стрептавидин-связывающий пептид (His-SBP), клонировали в производном вектора pcDNA3 и кратковременно экспрессировали в HEK293F-клетках. Белковая последовательность ECD IGF-1R-His-SBP представлена выше. Из полученной титрационной кривой видно, что антитело <IGF-1R>, несущее замену CL-CH1, обладало функциональной активностью и для него выявлены характеристики связывания и кинетические характеристики, сопоставимые с характеристиками антитела <IGF-1R> дикого типа в пределах ошибки метода, и поэтому оно является полностью функциональным (фиг.13).The binding capacity of the monospecific divalent antibody <IGF-1R> bearing the substitution CL-CH1 was evaluated by ELISA using the extracellular domain (ECD) IGF-1R according to the method described above. For this purpose, the extracellular domain of IGF-1R (residues 1-462), containing a naturally occurring leader sequence and 12 LI-cysteine-rich ectodomain domains of the human IGF-IR alpha chain (according to McKern et al., 1997; Ward et al. , 2001), fused to an N-terminal tag representing His-streptavidin-binding peptide (His-SBP), cloned in a derivative of the pcDNA3 vector and expressed briefly in HEK293F cells. The protein sequence of ECD IGF-1R-His-SBP is presented above. It can be seen from the obtained titration curve that the <IGF-1R> antibody bearing the CL-CH1 substitution had functional activity and binding characteristics and kinetic characteristics were found for it that are comparable to the wild-type <IGF-1R> antibodies within the method error, and therefore, it is fully functional (FIG. 13).
Эти данные коррелируют с результатами, полученными с помощью Biacore-анализа, который продемонстрировал, что аффинность моноспецифического двухвалентного антитела <IGF-1R>, несущего замену CL-CH1, характеризуется значением KD, равным 3,7 пМ, и таким образом, оно имеет сопоставимые параметры аффинности и кинетические характеристики связывания с ECD IGF-1R с исходным антителом <IGF-1R> дикого типа, для которого значение KD составляет 3,2 нМ.These data correlate with the results obtained using Biacore analysis, which demonstrated that the affinity of the monospecific divalent antibody <IGF-1R> bearing the CL-CH1 substitution is characterized by a KD value of 3.7 pM, and thus it has comparable affinity parameters and kinetic characteristics of binding to ECD IGF-1R with the wild-type parent antibody <IGF-1R> for which the KD value is 3.2 nM.
Пример 1ДExample 1D
Анализ способности моноспецифического двухвалентного антитела <IGF-1R>, несущего замену CL-CH1, связывать IGF-1R с помощью FACS с использованием сверхэкспрессирующих IGF-1R I24-клетокAnalysis of the ability of a monospecific divalent antibody <IGF-1R>, bearing the replacement of CL-CH1, to bind IGF-1R using FACS using sverkhekspressiya IGF-1R I24 cells
Для подтверждения активности связывания антитела <IGF-1R>, несущего замену CL-CH1, с IGF-1R, сверхэкспрессируемым на поверхности I24-клеток (МНЗТ3-клетки, экспрессирующие рекомбинантный человеческий IGF-1R, фирма Roche), использовали FACS-анализ. В целом, метод состоял в следующем: 5×105 I24-клеток на каждую трубку, предназначенную для осуществления FACS, инкубировали с разведением очищенного антитела <IGF-1R>, несущего замену CL-CH1, и антитела <IGF-1R> дикого типа в качестве референс-антитела и инкубировали на льду в течение 1 ч. Несвязанный белок отмывали с помощью 4 мл охлажденного на льду ЗФР (фирма Gibco) + 2% FCS (фирма Gibco). Затем клетки центрифугировали (5 мин при 400 g), а связанное антитело выявляли с помощью конъюгата F(ab')2<hFcγ>PE (фирма Dianova) на льду в течение 1 ч, защищая от действия света. Выявленное несвязанное антитело отмывали с помощью 4 мл охлажденного на льду ЗФР+2% FCS. Затем клетки центрифугировали (5 мин при 400 g), ресуспендировали в 300-500 мкл ЗФР и выявленное связанное антитело оценивали количественно с помощью устройства FACSCalibur или FACS Canto (фирма BD (FL2-канал, 10000 клеток на процесс). В эксперимент включали в качестве контролей антитела соответствующего изотипа для исключения любых неспецифических случаев связывания. Связывание антитела<IGF-1R>, несущего замену CL-CH1, и антитела<IGF-1R>дикого типа с IGF-1R на поверхности I24-клеток характеризовалось сопоставимым зависящим от концентрации сдвигом средней интенсивности флуоресценции.FACS analysis was used to confirm the binding activity of the <IGF-1R> antibody bearing the replacement of CL-CH1 with IGF-1R overexpressed on the surface of I24 cells (MNZT3 cells expressing recombinant human IGF-1R, Roche). In general, the method was as follows: 5 × 10 5 I24 cells for each tube designed for FACS were incubated with dilution of purified <IGF-1R> antibody bearing the CL-CH1 substitution and wild-type <IGF-1R> antibody as a reference antibody and incubated on ice for 1 h. Unbound protein was washed with 4 ml of ice-cold PBS (Gibco) + 2% FCS (Gibco). Then, the cells were centrifuged (5 min at 400 g), and the bound antibody was detected using the F (ab ') 2 <hFcγ> PE conjugate (Dianova) on ice for 1 h, protecting from the action of light. The detected unbound antibody was washed with 4 ml ice-cold PBS + 2% FCS. The cells were then centrifuged (5 min at 400 g), resuspended in 300-500 μl PBS and the detected bound antibody was quantified using a FACSCalibur or FACS Canto device (BD firm (FL2 channel, 10,000 cells per process). The experiment was included as controls antibodies of the corresponding isotype to exclude any non-specific binding events. The binding of the <IGF-1R> antibody bearing the CL-CH1 substitution and the wild-type <IGF-1R> antibody with IGF-1R on the surface of I24 cells was characterized by a comparable concentration-dependent average shift intensity f uorestsentsii.
Примеры 2Examples 2
Описание моноспецифического двухвалентного антитела <ANGPT2> дикого типаDescription of the wild-type monospecific divalent antibody <ANGPT2>
Пример 2АExample 2A
Создание экспрессионных плазмид для моноспецифического двухвалентного антитела <ANGPT2> дикого типаThe creation of expression plasmids for monospecific divalent antibodies <ANGPT2> wild-type
Последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепи моноспецифического двухвалентного антитела к ANGPT2 (<ANGPT2>) дикого типа, включая соответствующие лидерные последовательности, описанные в данном примере, выводили из тяжелой цепи человеческого антитела <ANGPT2> (SEQ ID NO: 6) и его легкой цепи (SEQ ID NO: 7), которые описаны в WO 2006/045049, а константные домены тяжелой и легкой цепи выводили из человеческого антитела (C-каппа и IgG1).The sequences of the variable regions of the heavy and light chain of the monospecific divalent anti-ANGPT2 antibody (<ANGPT2>) of the wild type, including the corresponding leader sequences described in this example, were derived from the heavy chain of the human antibody <ANGPT2> (SEQ ID NO: 6) and its light chain (SEQ ID NO: 7), which are described in WO 2006/045049, and the constant domains of the heavy and light chains were derived from a human antibody (C-kappa and IgG1).
Антитело <ANGPT2> дикого типа клонировали в плазмидах SB04-pUC-HC-ANGPT2 (SEQ ID NO: 6) и SB06-pUC-LC-ANGPT2 (SEQ ID NO: 7), которые являются аналогами векторов, описанных выше в примере 1А.The wild-type <ANGPT2> antibody was cloned into plasmids SB04-pUC-HC-ANGPT2 (SEQ ID NO: 6) and SB06-pUC-LC-ANGPT2 (SEQ ID NO: 7), which are analogous to the vectors described above in Example 1A.
С целью сравнения и для осуществления экспериментов по совместной экспрессии (см. пример 3) антитело <ANGPT2> дикого типа кратковременно (ко-)экспрессировали с использованием плазмид SB04-pUC-HC-ANGPT2 и SB06-PUC-LC-ANGPT2.For the purpose of comparison and for performing co-expression experiments (see Example 3), wild-type <ANGPT2> antibody was briefly (co-) expressed using plasmids SB04-pUC-HC-ANGPT2 and SB06-PUC-LC-ANGPT2.
Пример 2БExample 2B
Создание экспрессионных плазмид для моноспецифического двухвалентного антитела <ANGPT2> дикого типаThe creation of expression plasmids for monospecific divalent antibodies <ANGPT2> wild-type
Каждую из нуклеотидных последовательностей, кодирующих HC и LC <ANGPT2>, синтезировали с помощью химического синтеза и затем клонировали в клонирующем векторе pGA4, основой которого является плазмида pPCRScript (фирма Stratagene), на фирме Geneart (Регенсбург, Германия). Экспрессионную кассету, кодирующую НС <ANGPT2>, клонировали в пригодной для E.coli плазмиде, получая конечный вектор SB04-pUC-HC-ANGPT2; экспрессионную плазмиду, кодирующую соответствующую LC <ANGPT2>, клонировали в пригодной для E.coli плазмиде, получая конечный вектор SB06-pUC-LC-ANGPT2. Субклонированные нуклеотидные последовательности подтверждали путем секвенирования ДНК. Для кратковременных и стабильных трансфекций использовали большие количества плазмид, которые получали из трансформированных культур E.coli (набор Nucleobond AX, фирма Macherey-Nagel).Each of the nucleotide sequences encoding HC and LC <ANGPT2> was synthesized by chemical synthesis and then cloned into the pGA4 cloning vector, which is based on the pPCRScript plasmid (Stratagene), from Geneart (Regensburg, Germany). The expression cassette encoding HC <ANGPT2> was cloned into a plasmid suitable for E. coli to give the final vector SB04-pUC-HC-ANGPT2; an expression plasmid encoding the corresponding LC <ANGPT2> was cloned into an E. coli suitable plasmid to obtain the final vector SB06-pUC-LC-ANGPT2. Subcloned nucleotide sequences were confirmed by DNA sequencing. For short-term and stable transfections, large quantities of plasmids were used which were obtained from transformed E. coli cultures (Nucleobond AX kit, Macherey-Nagel).
Примеры 3Examples 3
Экспрессия биспецифического двухвалентного антитела <ANGPT2-IGF-1R>, в котором тяжелая и легкая цепь специфически связывается с IGF-1R, константные домены CL и CH1 заменены друг на друга (сокращенно обозначено в контексте настоящего описания как антитело <ANGPT2-IGF-1R>, несущее замену CL-CH1)Expression of a bispecific divalent antibody <ANGPT2-IGF-1R>, in which the heavy and light chains specifically bind to IGF-1R, the constant domains CL and CH1 are replaced by each other (abbreviated in the context of the present description as the antibody <ANGPT2-IGF-1R> bearing replacement CL-CH1)
Пример 3AExample 3A
Кратковременная совместная экспрессия и очистка антитела<IGF-1R>, несущего замену CL-CH1, и антитела<ANGPT2>дикого типа в клетках линии HEK293 EBNA с получением биспецифического антитела <ANGPT2-IGF-1R>, несущего замену CL-CH1Short-term co-expression and purification of the <IGF-1R> antibody bearing the CL-CH1 substitution and the wild-type <ANGPT2> antibody in HEK293 EBNA cells to produce the bispecific antibody <ANGPT2-IGF-1R> bearing the CL-CH1 substitution
Для создания функционального биспецифического антитела, распознающего IGF-1R, на основе Fab-фрагмента антитела <IGF-1R>, несущего замену CL-CH1, с одной стороны, и распознающего ANGPT2 на основе Fab-фрагмента антитела <ANGPT2> дикого типа, с другой стороны, две экспрессионные плазмиды, кодирующие антитело <IGF-1R>, несущее замену CL-CH1 (пример 1А), совместно экспрессировали с двумя экспрессионными плазмидами, кодирующими антитело <ANGPT2> дикого типа (пример 2А). С учетом подтвержденной статистикой ассоциации тяжелых цепей (НС) дикого типа и несущих замену тяжелых цепей CL-CH1 НС∗∗ это приводило к получению биспецифического и двухвалентного антитела <IGF-1R-ANGPT2>, несущего замену CL-CH1. Учитывая, что оба антитела одинаково хорошо экспрессировались и при этом не образовывались побочные продукты в количестве, которое может повлиять на результат, следует ожидать, что этот процесс должен приводить к получению ниже указанных трех основных продуктов в соотношении 1:2:1: А) антитело <IGF-1R>, несущее замену CL-CH1, Б) биспецифическое антитело <IGF-1R-ANGPT2>, несущее замену CL-CH1, и В) антитело <ANGPT2> дикого типа. Можно было ожидать присутствия нескольких побочных продуктов. Однако из-за замены только CL-CH1-доменов частота встречаемости побочных продуктов должна быть снижена по сравнению с Fab, полученными в результате полного кроссинговера. Следует отметить, что для антитела <ANGPT2> дикого типа был обнаружен более высокий выход продукта кратковременной экспрессии по сравнению с антителом <IGF-1R> дикого типа и антителом <IGF-1R>, несущим замену CL-CH1, соотношение плазмид, кодирующих антитело <ANGPT2> дикого типа, и плазмид, кодирующих антитело <IGF-1R>, несущее замену CL-CH1, сдвигалось в сторону экспрессии антитела <ANGPT2> дикого типа.To create a functional bispecific antibody recognizing IGF-1R based on the Fab fragment of the antibody <IGF-1R> bearing the CL-CH1 substitution, on the one hand, and recognizing ANGPT2 based on the Fab fragment of the wild-type antibody <ANGPT2>, on the other on the other hand, two expression plasmids encoding the <IGF-1R> antibody bearing the CL-CH1 substitution (Example 1A) were co-expressed with two expression plasmids encoding the wild-type <ANGPT2> antibody (Example 2A). Taking into account the statistics confirmed by the association of wild-type heavy chains (HC) and bearing the heavy chain replacement CL-CH1, HC ∗∗ this led to the production of the bispecific and divalent antibody <IGF-1R-ANGPT2> bearing the CL-CH1 replacement. Considering that both antibodies were equally well expressed and that no by-products were formed in an amount that could affect the result, it should be expected that this process should lead to the production of the following three main products in a ratio of 1: 2: 1: A) antibody <IGF-1R> bearing the CL-CH1 substitution, B) a bispecific antibody <IGF-1R-ANGPT2> carrying the CL-CH1 substitution, and C) a wild-type <ANGPT2> antibody. One could expect the presence of several by-products. However, due to the replacement of only the CL-CH1 domains, the frequency of occurrence of by-products should be reduced in comparison with the Fab obtained as a result of full crossing over. It should be noted that for the wild-type antibody <ANGPT2>, a higher yield of the short-term expression product was found in comparison with the wild-type antibody <IGF-1R> and the <IGF-1R> antibody carrying the CL-CH1 substitution, the ratio of plasmids encoding the antibody < ANGPT2> wild-type, and plasmids encoding the <IGF-1R> antibody bearing the CL-CH1 substitution were shifted towards expression of the wild-type <ANGPT2> antibody.
Для создания смеси основных продуктов, таких как А) антитело <IGF-1R>, несущее замену CL-CH1, Б) биспецифическое антитело <IGF-1R-ANGPT2>, несущее замену CL-CH1, и В) антитело <ANGPT2> дикого типа, четырьмя плазмидами pUC-HC∗∗-IGF-1R и pUC-LC∗∗-IGF-1R и плазмидами SB04-pUC-HC-ANGPT2 и SB06-pUC-LC-ANGPT2 кратковременно котрансфектировали находящиеся в виде суспензионной культуры HEK293-F-клетки согласно описанному выше методу. Собранный супернатант, содержащий смесь основных продуктов: А) антитело <IGF-1R>, несущее замену CL-CH1, Б) биспецифическое антитело <IGF-1R-ANGPT2>, несущее замену CL-CH1, и В) антитело <ANGPT2> дикого типа, обозначили как «смесь, содержащая биспецифическое антитело, несущее замену CL-CH1». Супернатанты клеточной культуры, которые включали смесь, содержащую биспецифическое антитело, несущее замену CL-CH1, собирали центрифугированием и затем очищали согласно описанному выше методу (фиг.14).To create a mixture of basic products, such as A) an antibody <IGF-1R> carrying a CL-CH1 substitution, B) a bispecific antibody <IGF-1R-ANGPT2> carrying a CL-CH1 substitution, and C) a wild-type <ANGPT2> antibody , with four plasmids pUC-HC ∗∗ - IGF-1R and pUC-LC ∗∗ - IGF-1R and plasmids SB04-pUC-HC-ANGPT2 and SB06-pUC-LC-ANGPT2, HEK293-F- suspension culture was briefly transfected cells according to the method described above. The collected supernatant containing a mixture of the main products: A) an antibody <IGF-1R> carrying a CL-CH1 substitution, B) a bispecific antibody <IGF-1R-ANGPT2> carrying a CL-CH1 substitution, and C) a wild-type <ANGPT2> antibody , designated as "a mixture containing bespecifically antibody bearing the replacement of CL-CH1". Cell culture supernatants, which included a mixture containing a bispecific antibody bearing the CL-CH1 substitution, were collected by centrifugation and then purified according to the method described above (FIG. 14).
Целостность смеси антител анализировали с помощью ДСН-ПААГ в присутствии восстановителя или без него и затем окрашивали кумасси бриллиантовым голубым. Полученные с помощью ДСН-ПААГ результаты свидетельствуют о том, что, как и следовало ожидать, в препарате присутствовали 2 различные тяжелые и легкие цепи (гель в присутствии восстановителя). Мономерное состояние смеси антител подтверждали аналитической гель-фильтрацией, и было установлено, что очищенные виды антител находились в мономерном состоянии. Охарактеризованные образцы использовали для дальнейшего аналитического исследования белка и изучения функциональных характеристик.The integrity of the antibody mixture was analyzed using SDS-PAGE in the presence or absence of a reducing agent and then stained with Coomassie brilliant blue. The results obtained using SDS-PAGE results indicate that, as expected, 2 different heavy and light chains were present in the preparation (gel in the presence of a reducing agent). The monomeric state of the antibody mixture was confirmed by analytical gel filtration, and it was found that the purified types of antibodies were in the monomeric state. The characterized samples were used for further analytical study of the protein and the study of functional characteristics.
Пример 3БExample 3B
Выявление функционального биспецифического антитела <ANGPT2-IGF-1R>, несущего замену CL-CH1, с помощью клеточного FACS-анализа, позволяющего выявлять образование мостиковой связи, с использованием экспрессирующих IGF-1R клеток линии I24Detection of functional bispecific antibody <ANGPT2-IGF-1R>, carrying the substitution of CL-CH1, using cell FACS analysis, allowing to detect the formation of bridging, using expressing IGF-1R cell line I24
Для подтверждения присутствия функционального биспецифического антитела <ANGPT2-IGF-1R>, несущего замену CL-CH1, в очищенной смеси, которая содержала биспецифическое антитело, несущее замену CL-CH1, включающую следующие основные продукты: А) антитело <IGF-1R>, несущее замену CL-CH1, Б) биспецифическое антитело <ANGPT2-IGF-1R>, несущее замену CL-CH1, и В) антитело <ANGPT2> дикого типа, полученной после кратковременной совместной экспрессии согласно методу, описанному в примере ЗА, проводили клеточный FACS-анализ, позволяющий выявлять образование мостиковой связи такой как IGF-1R-ANGPT2, с использованием клеток линии I24 (ШНЗТ3-клетки, экспрессирующих рекомбинантный человеческий IGF-1R, фирма Roche). Принцип анализа показан на фиг.10. Биспецифическое антитело <ANGPT2-IGF-1R>, несущее замену CL-CH1, которое присутствовало в очищенной смеси антител, обладало способностью связываться с IGF-1R на поверхности I24-клеток и одновременно с ANGPT2; и таким образом обладало способностью соединять мостиковой связью два его антигена-мишени с двумя противоположными Fab-фрагментами.To confirm the presence of a functional bispecific antibody <ANGPT2-IGF-1R>, bearing the substitution CL-CH1, in a purified mixture that contained a bispecific antibody bearing the substitution CL-CH1, comprising the following main products: A) antibody <IGF-1R>, bearing substitution of CL-CH1, B) a bispecific antibody <ANGPT2-IGF-1R> carrying the substitution CL-CH1, and C) a wild-type antibody <ANGPT2> obtained after short-term co-expression according to the method described in Example 3A, FACS- analysis to detect bridging such as IGF-1R-ANGPT2, using cells of the I24 line (ShNZT3 cells expressing recombinant human IGF-1R, Roche). The principle of analysis is shown in FIG. 10. The bispecific antibody <ANGPT2-IGF-1R> bearing the CL-CH1 substitution that was present in the purified antibody mixture was able to bind to IGF-1R on the surface of I24 cells and simultaneously with ANGPT2; and thus had the ability to bridge two of its target antigens with two opposite Fab fragments.
В целом, метод состоял в следующем: 5×105 клеток линии I24 на трубку, предназначенную для осуществления FACS, инкубировали с общей смесью очищенных антител на льду в течение 1 ч (титрация 160 мкг/мл смеси). Соответствующие очищенные антитела дикого типа <IGF-1R> и <ANGPT2> наносили на I24-клетки в качестве контролей. Несвязанное антитело отмывали 4 мл охлажденного на льду ЗФР (фирма Gibco) + 2% FCS (фирма Gibco), клетки центрифугировали (5 мин при 400 g) и связанное биспецифическое антитело выявляли с помощью 50 мкл (2 мкг/мл) человеческого ANGPT2 (фирма R&D Systems) в течение 1 ч на льду. Затем несвязанный ANGPT2 отмывали один или два раза 4 мл охлажденного на льду ЗФР (фирма Gibco)+2% FCS (фирма Gibco), клетки центрифугировали (5 мин при 400 g) и связанный ANGPT2 выявляли с помощью 50 мкл (5 мкг/мл) антитела <ANGPT2> mIgG1-биотин (BAM0981, фирма R&D Systems) в течение 45 мин на льду; в альтернативном варианте клетки инкубировали с 50 мкл (5 мкг/мл) конъюгата mIgG1-биотин в качестве контроля изотипа (фирма R&D Systems). Несвязанное идентифицирующее антитело отмывали 4 мл охлажденного на льду ЗФР (фирма Gibco)+2% FCS (фирма Gibco), клетки центрифугировали (5 мин при 400 g) и связанное идентифицирующее антитело выявляли с помощью 50 мкл конъюгата 1:400 стрептавидин-РЕ (SA-PE) (фирма Invitrogen/Zymed) в течение 45 мин на льду, защищая от действия света. Несвязанный конъюгат стрептавидин-РЕ отмывали 4 мл охлажденного на льду ЗФР+2% FCS. Затем клетки центрифугировали (5 мин при 400 g), ресуспендировали в 300-500 мкл ЗФР и связанный конъюгат стрептавидин-РЕ оценивали количественно с помощью устройства FACSCalibur (фирма BD (FL2-канал, 10000 клеток на процесс). В эксперимент включали в качестве контролей антитела соответствующего изотипа для исключения любых неспецифических случаев связывания. Кроме того, в качестве контролей включали очищенные моноспецифические двухвалентные антитела типа IgG1, такие как <IGF-1R> и <ANGPT2>.In general, the method was as follows: 5 × 10 5 cells of the I24 line per tube designed for FACS were incubated with a general mixture of purified antibodies on ice for 1 h (titration of 160 μg / ml of the mixture). The corresponding purified wild-type antibodies <IGF-1R> and <ANGPT2> were applied to I24 cells as controls. Unbound antibody was washed with 4 ml of ice-cold PBS (Gibco) + 2% FCS (Gibco), the cells were centrifuged (5 min at 400 g) and the bound bispecific antibody was detected with 50 μl (2 μg / ml) of human ANGPT2 (company R&D Systems) for 1 h on ice. Then, unbound ANGPT2 was washed once or twice with 4 ml of ice-cold PBS (Gibco) + 2% FCS (Gibco), the cells were centrifuged (5 min at 400 g) and bound ANGPT2 was detected with 50 μl (5 μg / ml) antibodies <ANGPT2> mIgG1-biotin (BAM0981, R&D Systems) for 45 minutes on ice; alternatively, cells were incubated with 50 μl (5 μg / ml) of the mIgG1-biotin conjugate as an isotype control (R&D Systems). Unbound identification antibody was washed with 4 ml of ice-cold PBS (Gibco) + 2% FCS (Gibco), the cells were centrifuged (5 min at 400 g) and the associated identification antibody was detected with 50 μl of 1: 400 streptavidin-PE conjugate (SA -PE) (Invitrogen / Zymed) for 45 minutes on ice, protecting from light. The unbound conjugate streptavidin-PE was washed with 4 ml of ice-cold PBS + 2% FCS. The cells were then centrifuged (5 min at 400 g), resuspended in 300-500 μl of PBS and the coupled streptavidin-PE conjugate was quantified using a FACSCalibur device (BD (FL2 channel, 10,000 cells per process). The experiment was included as controls antibodies of the corresponding isotype to exclude any non-specific cases of binding In addition, purified monospecific divalent antibodies of the IgG1 type, such as <IGF-1R> and <ANGPT2>, were included as controls.
Результаты, представленные на фиг.15, демонстрируют, что инкубация со смесью, которая содержала очищенное возникшие в результате кроссинговера антитело (<ANGPT2-IGF-1R>, несущее замену CL-CH1), полученное после совместной экспрессии возникшего в результате кроссинговера антитела (<IGF-1R>, несущего замену CL-CH1) с антителом дикого типа (антитело <ANGPT2> дикого типа), приводила к существенному сдвигу флуоресценции, что свидетельствует о присутствии функционального биспецифического антитела <ANGPT2-IGF-1R>, несущего замену CL-CH1, которое обладает способностью связываться одновременно с IGF-1R на поверхности I24-клеток и с ANGPT2; и таким образом обладает способностью соединять мостиковой связью два его антигена-мишени с двумя противоположными Fab-фрагментами. В отличие от этого соответствующие контрольные антитела <IGF-1R> и <Ang-2> не приводили к сдвигу флуоресценции при осуществлении FACS-анализа, позволяющего выявлять образование мостиковой связи.The results presented in FIG. 15 demonstrate that incubation with a mixture that contained purified crossover antibody (<ANGPT2-IGF-1R> carrying the CL-CH1 substitution) obtained after co-expression of the resulting antibody crossover (< IGF-1R> carrying the CL-CH1 substitution) with a wild-type antibody (wild-type <ANGPT2> antibody) led to a significant fluorescence shift, indicating the presence of a functional bispecific antibody <ANGPT2-IGF-1R> carrying the CL-CH1 substitution that has the ability to bind atsya simultaneously with the IGF-1R on the surface I24-cells and ANGPT2; and thus has the ability to bridge two of its target antigens with two opposite Fab fragments. In contrast, the corresponding control antibodies <IGF-1R> and <Ang-2> did not lead to a fluorescence shift during FACS analysis, which allows the detection of the formation of a bridging link.
В сочетании эти данные свидетельствуют о том, что путем совместной экспрессии соответствующих плазмид дикого типа и полученных в результате кроссинговера плазмид можно создавать функциональные биспецифические антитела. Выход правильного биспецифического антитела можно повышать, увеличивая уровень правильной гетеродимеризации тяжелых цепей дикого типа и модифицированных полученных в результате кроссинговера тяжелый цепей, например, используя технологию «knobs-into-holes», а также стабилизацию с помощью дисульфидного мостика (см. пример 4).Combined, these data suggest that functional expression of bispecific antibodies can be achieved by co-expression of the corresponding wild-type plasmids and plasmids resulting from crossing-over. The yield of the correct bispecific antibody can be increased by increasing the level of correct heterodimerization of wild-type heavy chains and modified heavy chains resulting from crossing over, for example, using knobs-into-holes technology, as well as stabilization using a disulfide bridge (see example 4).
Пример 4Example 4
Экспрессия двухвалентного биспецифического антитела <ANGPT2-IGF-1R>, несущего замену CL-CH1, с модифицированными CH3-доменами (технология «knobs-into-holes»)Expression of a Bivalent Bispecific Antibody <ANGPT2-IGF-1R> Bearing CL-CH1 Substitution with Modified CH3 Domains (Knobs-into-holes Technology)
Для дополнительного повышения выхода биспецифического антитела <ANGPT2-IGF-1R>, несущего замену CL-CH1, применяли технологию «knobs-into-holes» для совместной экспрессии антитела <IGF-1R>, несущего замену CL-CH1, и антитела дикого типа <ANGPT2>, с целью получения препарата гомогенного и функционального биспецифического антитела. Для этой цели CH3-домен в тяжелой цепи ∗НС∗ антитела<IGF-1R>, несущего замену CL-CH1, заменяли на CH3-домен («выступы»), имеющий последовательность SEQ ID NO: 8 с заменой T366W, а CH3-домен в тяжелой цепи антитела дикого типа <ANGPT2> заменяли на CH3-домен («впадина»), имеющий последовательность SEQ ID NO: 9 с заменами T366S, L368A, Y407V, или наоборот. Кроме того, можно интродуцировать дисульфидный мостик для повышения стабильности и выхода, а также в качестве дополнительных остатков, формирующих ионные связи и повышающих выход продукта гетеродимеризации (EP 1870459 A1).To further increase the yield of the bispecific antibody <ANGPT2-IGF-1R> bearing the CL-CH1 substitution, the knobs-into-holes technology was used to co-express the antibody <IGF-1R> bearing the CL-CH1 substitution and the wild-type antibody < ANGPT2>, in order to obtain a preparation of a homogeneous and functional bispecific antibody. For this purpose, the CH3 domain in the heavy chain * HC * of the <IGF-1R> antibody bearing the substitution CL-CH1 was replaced by the CH3 domain ("protrusions") having the sequence SEQ ID NO: 8 with the substitution T366W, and CH3- the wild-type antibody heavy chain domain <ANGPT2> was replaced with a CH3 domain (“trough”) having the sequence of SEQ ID NO: 9 with substitutions T366S, L368A, Y407V, or vice versa. In addition, a disulfide bridge can be introduced to increase stability and yield, as well as additional residues that form ionic bonds and increase the yield of the heterodimerization product (EP 1870459 A1).
Кратковременную совместную экспрессию и очистку образовавшегося двухвалентного биспецифического антитела <ANGPT2-IGF-1R>, несущего замену CL-CH1, с модифицированными CH3-доменами (технология «knobs-into-holes») осуществляли согласно методу, описанному в примере 3.Short-term co-expression and purification of the resulting divalent bispecific bispecific antibody <ANGPT2-IGF-1R> bearing the CL-CH1 substitution with modified CH3 domains (knobs-into-holes technology) was carried out according to the method described in Example 3.
Следует отметить, что для оптимизации гетеродимеризации можно применять, например, различные технологии «knobs-in-holes», такие как интродукция дополнительного дисульфидного мостика в CH3-домен, например, Y349C в несущую «выступ» цепь» и D356C в несущую «впадину» цепь, и/или их объединение с применением остатков R409D; K370E (K409D) в качестве образующих «выступы» остатков и D399K; E357K в качестве образующих «впадину» остатков, которые описаны в EP 1870459 A1.It should be noted that for optimization of heterodimerization, for example, various knobs-in-holes technologies can be used, such as the introduction of an additional disulfide bridge into the CH3 domain, for example, Y349C into the carrier chain and D356C into the carrier cavity a chain and / or combination thereof using residues R409D; K370E (K409D) as protruding residues and D399K; E357K as “trenching” residues, which are described in EP 1870459 A1.
Аналогично методу, описанному в примере 4, можно получать другие двухвалентные биспецифические антитела, несущие замену CL-CH1, с модифицированными CH3-доменами (технология «knobs-into-holes»), мишенью которых является ANGPT2 и другой антиген-мишень (используя описанные выше тяжелую и легкую цепь антитела к ANGPT2 и тяжелую и легкую цепь∗∗ НС∗∗ и LC∗∗ антитела, несущего замену CL-CH1, к указанной другой мишени, посредством чего обе тяжелые цепи модифицировали с помощью технологии «knobs-into-holes», или мишенью которых является IGF-1R и другой антиген-мишень (используя тяжелую и легкую цепь антитела к указанной другой мишени и описанные выше тяжелую и легкую цепь∗∗ НС∗∗ и LC∗∗ антитела к IGF-1R, несущего замену CL-CH1, посредством чего обе тяжелые цепи модифицировали с помощью технологии «knobs-into-holes»).Similarly to the method described in example 4, you can get other bivalent bespecifically antibodies that carry the substitution of CL-CH1, with modified CH3 domains (technology "knobs-into-holes"), the target of which is ANGPT2 and another antigen target (using the above the heavy and light chain of the anti-ANGPT2 antibody and the heavy and light chain of the ∗ ∗ HC HC ∗∗ and LC ∗∗ of the antibody carrying the CL-CH1 substitution to the other target, whereby both heavy chains were modified using knobs-into-holes technology or whose target is IGF-1R and another target antigen (using the heavy and light chains of antibodies to the indicated other target and the heavy and light chains described above ** HC ∗∗ and LC ∗∗ antibodies to IGF-1R carrying the substitution CL-CH1, whereby both heavy chains were modified using knobs-into technology -holes ").
Claims (2)
а) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося с первым антигеном; и
б) легкую цепь и тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося со вторым антигеном, в котором CL- и СН1-домены константных областей заменены друг на друга, у которого
СН3-домен одной тяжелой цепи и СН3-домен другой тяжелой цепи каждый соприкасается друг с другом на поверхности раздела, которая представляет собой исходную поверхность раздела между СН3-доменами антитела; при этом поверхность раздела изменена для активации формирования двухвалентного биспецифического антитела, где изменение отличается тем, что:
а) изменен СН3-домен одной тяжелой цепи
так, что на исходной поверхности раздела СН3-домена одной тяжелой цепи, которая соприкасается с исходной поверхностью раздела СН3-домена второй тяжелой цепи в двухвалентном биспецифическом антителе, аминокислотный остаток заменен на аминокислотный остаток, который имеет большую по объему боковую цепь, что приводит к созданию выпуклости на поверхности раздела СН3-домена одной тяжелой цепи, которая может помещаться в полость на поверхности раздела СН3-домена другой тяжелой цепи,
и
б) изменен СН3-домен другой тяжелой цепи
так, что на исходной поверхности раздела второго СН3-домена, которая соприкасается с исходной поверхностью раздела первого СН3-домена в двухвалентном биспецифическом антителе, аминокислотный остаток заменен на аминокислотный остаток, который имеет меньшую по объему боковую цепь, что приводит к созданию полости на поверхности раздела второго СН3-домена, в которую может помещаться выпуклость на поверхности раздела первого СН3-домена, причем указанный аминокислотный остаток, который имеет большую по объему боковую цепь, выбран из группы, включающей аргинин (R), фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W),
а указанный аминокислотный остаток, который имеет меньшую по объему боковую цепь, выбран из группы, включающей аланин (А), серин (S), треонин (Т), валин (V),
а способ включает следующие этапы:
а) трансформации клетки-хозяина
- векторами, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие первую легкую цепь и первую тяжелую цепь указанного двухвалентного биспецифического антитела,
- векторами, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие вторую легкую цепь и вторую тяжелую цепь антитела указанного двухвалентного биспецифического антитела;
б) культивирование клетки-хозяина в условиях, которые позволяют синтезировать молекулу указанного двухвалентного биспецифического антитела, и
в) выделение молекулы указанного двухвалентного биспецифического антитела из культуры.1. A method of obtaining a divalent bispecific antibody, where the antibody contains:
a) the light chain and heavy chain of an antibody that specifically binds to the first antigen; and
b) the light chain and heavy chain of an antibody that specifically binds to a second antigen in which the CL and CH1 domains of the constant regions are replaced by one in which
The CH3 domain of one heavy chain and the CH3 domain of the other heavy chain are each in contact with each other at the interface, which is the initial interface between the CH3 domains of the antibody; wherein the interface is changed to activate the formation of a divalent bispecific antibody, where the change is characterized in that:
a) changed the CH3 domain of one heavy chain
so that on the initial interface of the CH3 domain of one heavy chain, which is in contact with the original interface of the CH3 domain of the second heavy chain in a divalent bispecific antibody, the amino acid residue is replaced by an amino acid residue that has a large side chain, which leads to bulges on the interface surface of the CH3 domain of one heavy chain, which can be placed in a cavity on the interface of the CH3 domain of another heavy chain,
and
b) the CH3 domain of another heavy chain is altered
so that on the initial interface of the second CH3 domain, which is in contact with the initial interface of the first CH3 domain in a divalent bispecific antibody, the amino acid residue is replaced by an amino acid residue that has a smaller side chain, which leads to the creation of a cavity on the interface a second CH3 domain into which a bulge may be placed on the interface of the first CH3 domain, wherein said amino acid residue, which has a large side chain, is selected from the group Luciano arginine (R), phenylalanine (F), tyrosine (Y), tryptophan (W),
and the specified amino acid residue, which has a smaller side chain, is selected from the group consisting of alanine (A), serine (S), threonine (T), valine (V),
and the method includes the following steps:
a) transformation of the host cell
- vectors that contain nucleic acid molecules encoding a first light chain and a first heavy chain of said divalent bispecific antibody,
- vectors that contain nucleic acid molecules encoding a second light chain and a second heavy chain of an antibody of said bivalent bispecific antibody;
b) culturing the host cell under conditions that allow you to synthesize a molecule of the specified divalent bespecifically antibodies, and
c) isolating a molecule of said divalent bispecific antibody from the culture.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP07024865.3 | 2007-12-21 | ||
| EP07024865 | 2007-12-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2010129540A RU2010129540A (en) | 2012-01-27 |
| RU2575066C2 true RU2575066C2 (en) | 2016-02-10 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU94028282A (en) * | 1993-08-02 | 1996-07-20 | Мерк Патент ГмбХ (DE) | Biospecific antibody, method of its preparing, monoclonal antibodies, pharmaceutical preparation, pharmaceutical sets, method of tumor cell removal, use of biospecific antibody fragment |
| WO1996027011A1 (en) * | 1995-03-01 | 1996-09-06 | Genentech, Inc. | A method for making heteromultimeric polypeptides |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU94028282A (en) * | 1993-08-02 | 1996-07-20 | Мерк Патент ГмбХ (DE) | Biospecific antibody, method of its preparing, monoclonal antibodies, pharmaceutical preparation, pharmaceutical sets, method of tumor cell removal, use of biospecific antibody fragment |
| WO1996027011A1 (en) * | 1995-03-01 | 1996-09-06 | Genentech, Inc. | A method for making heteromultimeric polypeptides |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MERCHANT AM. et al., An efficient route to human bispecific IgG, Nat Biotechnol, 1998, v.16(7), pp. 677-681. XIE Z. et al., A new format of bispecific antibody: highly efficient heterodimerization, expression and tumor cell lysis, J Immunol Methods, 2005, v. 296(1-2), pp. 95-101. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2587616C2 (en) | Bivalent bispecific antibodies | |
| RU2547615C2 (en) | Bivalent bispecific antibodies | |
| JP5281098B2 (en) | Bivalent bispecific antibody | |
| US8227577B2 (en) | Bivalent, bispecific antibodies | |
| RU2575066C2 (en) | Bivalent bispecific antibodies |