RU2574935C2 - Способ разделения органической и минеральной составляющей костной ткани - Google Patents
Способ разделения органической и минеральной составляющей костной ткани Download PDFInfo
- Publication number
- RU2574935C2 RU2574935C2 RU2014114089/15A RU2014114089A RU2574935C2 RU 2574935 C2 RU2574935 C2 RU 2574935C2 RU 2014114089/15 A RU2014114089/15 A RU 2014114089/15A RU 2014114089 A RU2014114089 A RU 2014114089A RU 2574935 C2 RU2574935 C2 RU 2574935C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bone
- bone tissue
- extraction
- dry residue
- filtrate
- Prior art date
Links
- 210000000988 Bone and Bones Anatomy 0.000 title claims abstract description 70
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 19
- 239000011707 mineral Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 42
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 24
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 17
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 23
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 11
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 claims description 4
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 4
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 210000002391 Femur Head Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000004876 x-ray fluorescence Methods 0.000 claims description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 abstract description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 7
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 abstract description 7
- 210000002805 Bone Matrix Anatomy 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 abstract description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 abstract 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 abstract 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 abstract 1
- 238000005020 pharmaceutical industry Methods 0.000 abstract 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 23
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 23
- 229960005188 collagen Drugs 0.000 description 18
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 208000007353 Hip Osteoarthritis Diseases 0.000 description 6
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 6
- 208000003432 Bone Disease Diseases 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 229910052586 apatite Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 210000000845 Cartilage Anatomy 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000002808 Connective Tissue Anatomy 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 108010050808 Procollagen Proteins 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H Tricalcium phosphate Chemical class [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 125000005587 carbonate group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 2
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 2
- 102100001249 ALB Human genes 0.000 description 1
- 101710027066 ALB Proteins 0.000 description 1
- 210000001909 Alveolar Process Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 Body Fluids Anatomy 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- 210000004544 DC2 Anatomy 0.000 description 1
- 210000003298 Dental Enamel Anatomy 0.000 description 1
- WQABCVAJNWAXTE-UHFFFAOYSA-N Dimercaprol Chemical compound OCC(S)CS WQABCVAJNWAXTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940110715 ENZYMES FOR TREATMENT OF WOUNDS AND ULCERS Drugs 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 210000001723 Extracellular Space Anatomy 0.000 description 1
- 210000003035 Hyaline Cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 208000009883 Joint Disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001503 Joints Anatomy 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 206010053643 Neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 229910003873 O—P—O Inorganic materials 0.000 description 1
- 101700003795 PDZD2 Proteins 0.000 description 1
- 229940055729 Papain Drugs 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 210000004261 Periodontium Anatomy 0.000 description 1
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000016202 Proteolipids Human genes 0.000 description 1
- 108010010974 Proteolipids Proteins 0.000 description 1
- 210000002356 Skeleton Anatomy 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K [O-]P([O-])([O-])=O Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004164 analytical calibration Methods 0.000 description 1
- XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N atorvastatin Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N 0.000 description 1
- 239000003462 bioceramic Substances 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 230000010072 bone remodeling Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000024881 catalytic activity Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940020899 hematological Enzymes Drugs 0.000 description 1
- 210000004394 hip joint Anatomy 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 200000000018 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000002530 ischemic preconditioning Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesions Effects 0.000 description 1
- 230000004301 light adaptation Effects 0.000 description 1
- 101700081388 map Proteins 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 239000012454 non-polar solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 1
- 125000000962 organic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005416 organic matter Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged Effects 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000003595 spectral Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002277 temperature effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу разделения органической и минеральной составляющей костной ткани. Способ разделения органической и минеральной составляющей костной ткани, в котором подготавливают пластины губчатой костной ткани, из них получают костный порошок, полученный костный порошок подвергают двукратному экстракционному концентрированию, на первом этапе отбирают среднюю пробу полученного костного порошка и добавляют смесь хлороформ:этиловый спирт, испаряют растворитель и дважды добавляют дистиллированной воды, перемешивают, отфильтровывают, получают сухой остаток 1 и фильтрат 1, на втором этапе к сухому остатку 1 добавляют хлорид натрия, испаряют растворитель и дважды добавляют дистиллированной воды, перемешивают, отфильтровывают, получают сухой остаток 2 и фильтрат 2, высушивают и анализируют, при определенных условиях. Вышеописанный способ позволяет отделить водо- и солерастворимые белковые составляющие костного матрикса от минеральной компоненты для их изучения при различных функциональных состояниях костной ткани, а также позволяет повысить степень извлечения белковых соединений костной ткани, что в свою очередь позволяет проводить количественное определение белковых составляющих костной ткани. 2 з.п. ф-лы, 2 табл., 4 ил.
Description
Изобретение относится к медицине и неорганической химии, а конкретно к технологии выделения биологических веществ для изучения межклеточного вещества (матрикса) костной ткани человека при различных функциональных состояниях, в том числе при костно-суставных заболеваниях (например, при коксартрозе и остеопорозе).
Более глубокие представления о протекании заболеваний костной системы человека могут быть получены при изучении структурной организации костной ткани на ультра- и микроуровнях, а именно, минеральной и органической составляющих костного матрикса, интенсивности процессов их формирования и резорбции (ремоделирования или реконструкции) (Карякина Е.В., Персова Е.А. Особенности ремоделирования костной ткани при воспалительных и дегенеративных заболеваниях тазобедренного сустава // Саратовский научно-медицинский журнал, 2009, Т.5, №2, С.227-230; Зацепин С.Г. Костная патология взрослых, М.: Медицина, 2001, 640 с.; Некачалов В.В. Патология костей и суставов, СПб.: Сотис, 2000, 288 с., Корнилов А.С., Аврунин А.С. Адаптационные процессы в органах скелета, СПб.: МОРСАР АВ, 2001, 269 с.). Однако проведение таких исследований сопряжено с рядом проблем, которые в первую очередь связаны с многокомпонентным составом и трудностью разделения каждой из указанных компонент. Известно, что минеральная основа костной ткани представлена гидроксилапатитом, другими фосфатами кальция, водой и т.д. Органический матрикс кости на 90% образует полифазный коллаген 1 типа, включающий две фракции, отличающиеся наличием поперечных связей: проколлагена - растворимой в воде, кислотах, солях и колластромина - нерастворимой («нативной» или «зрелой»). Считается, что проколлаген, выделяемый в межклеточное пространство - легкоэкстрагируемый нейтральносолерастворимый («молодой»). В дальнейшем он превращается в нерастворимый коллаген непосредственно или через кислоторастворимую фракцию. Считается, что кислоторастворимый коллаген является побочным продуктом деградации нерастворимого коллагена. В состав органической компоненты межклеточного вещества входят также неколлагеновые белки, липиды, углеводы, кислоты и их комплексы (Слуцкий Л.И. Биохимия нормальной и патологически измененной соединительной ткани, М.: Медицина, 1969, 375 с.; Мухамеджанова Л.Р., Галеев И.М. Изучение фракционного состава коллагена костной ткани альвеолярного отростка у больных генерализованным пародонтом // Успехи современного естествознания, 2003, №8, С.63-64; Касавина Б.С. Торбенко В.П. Жизнь костной ткани, М.: Издательство «Наука», 1979, 176 с.; Ньюман У., Ньюман М. Минеральный обмен кости, М.: Издательство иностранной литературы, 1961, 262 с.).
В настоящее время существующие изобретения, направленные на извлечение органической компонентов из кости при сохранении ее исходной минеральной основы, используют для получения биосовместимых материалов. Известны способы удаления органики путем термического отжига в интервалах температур 250-395°C в течение 3-18 часов (патент РФ №2326680) и 600-1200°C в течение 3-5 мин (патент РФ №2189823). Известно, что длительное температурное воздействие приводит к изменению кристалличности минеральной компоненты за счет преобразования состава адсорбционного слоя. При отжиге при температурах выше 600°C происходят процессы десорбции продуктов разложения карбонатных групп из кристаллической решетки костного апатита (Zyman Z.Z., Rokhmistrov D.V., Glushko V.I., Ivanov I.G. Thermal impurity reactions and structural changes in slightly carbonated hydroxyapatite // Journal of Materials Science-materials in Medicine, 2009, V.20, P.1389-1399, Баринов С.М., Комлев B.C. Биокерамика на основе фосфатов кальция, М.: Наука, 2005, с.204).
В другой группе изобретений проводят очистку кости от фибриллярного белка коллагена, гликопротеинов и гликолипидов с помощью ферментов папаина или смеси папина:триписина с последующей обработкой растворами перекисью водорода и этанола различной концентрации. Полученные образцы стерилизуют облучением 2,5 Мград (патент РФ №2136298, патент РФ №2136297). Несомненно, применение ферментов для выделения органических веществ с меньшей, чем у коллагена молекулярной массой (неколлагеновых белков, протеогликанов, гликопротеинов) является достоинством данных способов. Однако в указанных изобретениях не учитывается фракционный состав коллагена, а именно, наличие его солерастворимой части. Кроме того, для получения максимальной активности ферментов целесообразно использовать активаторы, ускоряющие их действие. Так, папаин действует более активно в присутствии 2,3-меркаптопропанола или смеси цистеина (0,005 М) с этилентетрауксусной кислотой (0,002 М) или с версеном (0,001 М) (Валуева Т.А. Карта белка папина // http://humbio.ru/humbio/proteins/000a47b8.htm). Существует информация о том, что коллаген медленно переваривается пепсином и почти не переваривается трипсином (Перкель Т.П. Физико-химические и биохимические основы производства мяса и мясных продуктов учебное пособие, Кемерово: Издательство: КемТИПП, 2004, 100 с).
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому является способ получения и консервации минерализованного матрикса (патент РФ №2495567), заключающийся в том, что предварительно очищенную от остатков хрящевой ткани губчатую кость перфорируют спицей диаметром 1,5 мм и последовательно обрабатывают при постоянном перемешивании на магнитной мешалке раствором смеси 0,8%-ого хлорида натрия и 0,1%-ого твина-100 в течение 6 ч, меняя его 3 раза через каждые 2 ч, далее помещают на 24 часа в раствор 6%-ой перекиси водорода, заменяя его через 6 ч, центрифугируют при 3000 об/мин, после чего на 12 ч погружают в смесь этанола и хлороформа в соотношении 1:1, меняя 3 раза через каждые 4 ч, затем в течение 6 ч обрабатывают спирт-эфирную смесь (1:2), проветривают губчатую кость в токе воздуха в течение 12 ч, замораживают при -70°C и лиофильно высушивают. Высушенную губчатую кость помещают в герметичный пластиковый контейнер и стерилизуют потоком быстрых электронов дозой 18+5 кГр на линейном ускорителе электронов У003 MB.
Основное преимущество данного способа заключается в экстракции полярных липидов, гликолипидов протеолипидов, углеводов и аминокислот, а также время его реализации 48 часов. Однако в нем также не учитывается фракционный состав коллагена. В рамках метода не проводится физико-химический анализ полученных после разделения минеральной и органической составляющих костного матрикса.
Экстракционное разделение минеральной и органической составляющих костной ткани // Экстракция органических соединений (ЭОС 2010): материалы IV Междунар. конф. Воронеж, 2010, С. 263-264), включающий последовательную экстракцию органического вещества 1 масс. % раствором хлорида натрия и смесью хлорофом-спирт в объемном соотношении 2:1, экстракционное концентрирование проводили при комнатной температуре в течение 3 суток. Сохранность структуры апатита костной ткани при извлечении белковых фракций подтверждена путем анализа рентгенограмм сухого костного порошка с помощью рентгенофазового анализа.
В данном способе извлечение липидов и белков производится экстрагенами, не оказывающими разрушающего воздействия на минеральную кристаллическую фазу костной ткани. Однако не проводится анализ состава и количества извлекаемых органических соединений, а только используется рентгенофазовый анализ, позволяющий охарактеризовать лишь минеральную составляющую межклеточного костного матрикса. Также не учитывается фракционный состав коллагена костных тканей, а именно проведение экстракции первоначально 1%-ым хлоридом натрия, а далее органической смесью хлороформ-спирт не позволяет извлекать поэтапно соле- и водорастворимые фракции коллагена, следовательно, оценить их изменение при костных заболеваниях. Кроме того, не обоснован выбор времени экстракционного концентрирования каждым растворителем.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа разделения минеральной и органической составляющих межклеточного костного матрикса с сохранением структуры минеральной компоненты для их изучения при различных функциональных состояниях костной ткани, в том числе при костных заболеваниях.
Указанный технический результат достигается тем, что предложен способ разделения органической и минеральной составляющей костной ткани, в котором подготавливают пластины губчатой костной ткани толщиной 0,2-0,5 мм, получают из них костный порошок, полученный костный порошок подвергают двухкратному экстракционному концентрированию, на первом этапе отбирают среднюю пробу, полученного костного порошка массой 200 мг и добавляют 10 мл смеси хлороформ:этиловый спирт в объемном отношении 2:1, помещают на трое суток в темное место при температуре не выше 25°C, испаряют растворитель и дважды добавляют по 5 мл дистиллированной воды, перемешивают, отфильтровывают, получают сухой остаток 1 и фильтрат 1, на втором этапе к сухому остатку 1 добавляют 10 мл 0,9 масс. % хлорида натрия и помещают на трое суток в темное место при температуре не выше 25°C, испаряют растворитель и дважды добавляют по 5 мл дистиллированной воды, перемешивают, отфильтровывают, получают сухой остаток 2 и фильтрат 2, высушивают при 105°C в течение 60 мин и анализируют его с помощью ИК-спектроскопии и рентгенофлуоресцентного анализа. При этом в качестве биологического материала используют губчатую костную ткань головок бедренных костей человека, из которых получают пластины от 0,2 до 0,5 мм, а в фильтратах определяют степень извлечения: водорастворимых белковых фракций и солерастворимых белковых фракций в процессе экстракционного концентрирования средней пробы костного порошка.
В данном способе пластины губчатой костной ткани толщиной 0,2-0,5 см обрабатывают раствором 3%-ого пероксида водорода, промывают пятикратно дистиллированной водой, измельчают в агатовой ступке (размеры частиц 3-300 микрон), сушат при 105°C в течение 60 мин, отбирают среднюю пробу и подвергают последовательному экстракционному концентрированию в смеси состава хлороформ:этиловый спирт в объемном отношении 2:1 в течение 3 суток, экстрагент-смесь испаряют, сухой остаток растворяют в определенном объеме воды для получения оптимальной концентрации белка, отфильтровывают и костную ткань подвергают дальнейшему концентрированию в 0,2 М растворе хлорида натрия в течение 3 суток в однократной повторности, испаряют экстрагент, а сухой остаток растворяют в определенном объеме воды, отфильтровывают костный порошок и высушивают его при 105°C в течение 60 мин и анализируют его с помощью РФА и ИК-спектроскопии. В фильтратах определяют содержание белка спектрофотометрическим методом.
Материалом исследования являлась губчатая костная ткань коллекции головок бедренных костей, которые удалены у жителей Омского региона в ходе тотального эндопротезирования с заболеванием деформирующий коксартроз и у лиц, у которых отсутствуют костные патологии («норма»). Последние образцы извлекались в соответствии с нормативными документами №694 от 21.07.1978 г. п. 2.24, №8-ФЗ от 12.01.1996 г. п. 3. №73-ФЗ от 31.05.2001 г. п. 14, 16.
В данном способе подготовка пластин костной ткани для анализа осуществляется следующим образом: с головки бедренной кости удаляют остатки мягких тканей, промывают проточной водой и делят ее на три равные части, из середины которых выпиливают три костных среза толщиной от 0,2 до 0,5 см (верхний, средний, нижний - порядок чередования приведен в направлении гиалиновый хрящ - бедренная кость). Подбор толщины образцов осуществлялся экспериментально. Данные размеры срезов являются оптимальными для получения средней пробы массой 200 мг методом квартования и экстрагирования органических веществ с помощью указанных выше растворов. После чего удаляют со срезов хрящевую ткань, пятикратно промывают их от костной пыли проточной водой и выдерживают для удаления клеточных элементов в 3%-ом растворе пероксида водорода в течение 30 мин, заменяя раствор однократно через 15 мин. Более длительный интервал обработки перекисью водорода может привести к денатурации неколлагеновых белков, которую следует избегать на этапе механической подготовки образцов для анализа. Полученные срезы высушивают на воздухе в эксикаторе в течение 24 часов, измельчают до размеров частиц 3-300 микрон, отбирают средние пробы массой по 200 мг методом квартования.
Полученный костный порошок подвергают экстракционному концентрированию. На начальном этапе подобраны условия проведения экстрагирования. С этой целью исследована экстракция этих органических веществ рядом растворителей: хлороформом, этиловым спиртом, смесью хлороформ:этиловый спирт в объемных соотношениях 1:1, 1:2 и 2:1, диэтиловым эфиром и хлоридом натрия. Так как концентрация хлорида натрия в плазме крови и тканевых жидкостях организма составляет 0,9 масс.%, изучена экстракция белковых соединений, данных электролитом в интервале концентраций от 0,1 до 10 масс.%. Кроме того, определены оптимальное время экстрагирования каждым растворителем (от 12 ч до 7 суток), кратность (от одного до трех раз) и последовательность их применения.
Установлено, что наиболее эффективное экстрагирование органических веществ происходит при двукратной экстракции (по 3 суток) следующими растворителями смесью хлороформ-спирт (2:1) и 0,2 масс.% раствором хлорида натрия при соблюдении следующих условий (фиг.1). На первом этапе проводят экстракцию липидов, их соединений с белками и углеводами, а также неколлагеновых белков и водорастворимой фракции коллагена. Для этого 200 мг полученного костного порошка помещают в колбу с притертой пробкой и добавляют 10 мл раствора смеси хлороформ:этиловый спирт в объемном отношении 2:1, оставляют на трое суток в темном месте при температуре не выше 25°C. По истечении указанного времени испаряют растворитель и дважды добавляют по 5 мл дистиллированной воды, перемешивают и отфильтровывают (фильтрат 1 или анализируемый раствор 1 и сухой остаток 1). На втором этапе выделяют оставшуюся часть липидов, неколлагеновых белков и солерастворимую фракцию коллагена. В колбу с притертой пробкой переносят сухой остаток 1 и добавляют 10 мл 0,9 масс.% раствора, закрывают пробкой, хранят в течение 3 суток в темном месте. После чего аналогичным образом проводят процедуры по испарению экстрагента и получению сухого остатка 2 и фильтрата 2 (анализируемый раствор 2). В фильтратах определяют содержание белка реактивом Бенедикта спектрофотометрическим методом (патент RU 2239195, C1 МПК7 01N 33/68, 27.10.2014). Фоновые растворы готовят аналогично на основе испаренных растворителей без внесения пробы костной ткани. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре СФ-46 λэфф=330 нм, 1=10 мм. Количественное определение белковых составляющих определяют методом градуировочного графика с применением стандартного раствора альбумина (КлиниТест-ОБ, «Эко-Сервис», коэффициент корреляции 0,9998, P=0,95). Предел обнаружения при определении водорастворимых белковых соединений составляет 30 мкг/мл, относительное стандартное отклонение - 0,03-0,04.
Эффективность экстрагирования оценивается величиной степени извлечения (R). За общее значение количеств белковых соединений в костной ткани принято содержание общего азота, полученное по методике ГОСТ 13496.4-93 на автоматизированной линии «КОНТИФЛО» (ГОСТ 13496.4-93. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения содержания азота и сырого протеина, М.: ИПК Изд. стандартов, 1995, С.11-17). Проводится анализ ИК-спектров и рентгенограмм до и после экстракции.
Главное отличие предлагаемого способа от прототипа заключается в последовательности выделения органических веществ, а именно проводится поэтапное извлечение и селективное определение водорастворимых и солерастворимых белков, включая соответственно данные фракции коллагена. Возможно, применение именно такого порядка проведения процедур связано с наибольшей растворимостью органических веществ в неполярных растворителях.
Результаты применения способа.
Полученные результаты статистически обработаны с помощью программного пакета программного пакета статистической обработки данных StatSoft Statistica 6.0.
В таблице 1 приведены содержание и степень экстракционного извлечения (R) белкового азота в костной ткани лиц, у которых отсутствуют костные заболевания, и лиц, больных коксартрозом при (n=3; P=0,95) по данному способу.
| Таблица 1 | ||||
| Костные срезы | Белковый азот, % | R, % | ||
| Хлороформ-спирт (2:1) | NaCl, 1% раствор | |||
| Коксартроз | Верхний | 0,908±0,270 | 1,028±0,030 | 43,30 |
| Средний | 1,300±0,300 | 1,116±0,154 | 55,70 | |
| Нижний | 0,796±0,452 | 0,769±0,220 | 54,80 | |
| «Норма» | 1,920±0,920 | 0,623±0,123 | 69,30 | |
На фиг.2 представлены дифрактограммы костной ткани до экстракции (1); после экстракции двукратной экстракции (2). На данных дифрактограммах отмечается заметное снижение фоновых сигналов, особенно в области от 10.8 до 16.8 29, принадлежащей аморфной компоненте, прежде всего органической. Рефлексы гидроксилапатита более разрешенные.
На фиг.3 представлены ИК-спектры костной ткани до экстракции (1); после экстракции смесью хлороформ:спирт (2:1) (2); после экстракции 1% раствором NaCl. При этом на ИК-спектрах после поэтапного воздействия растворителей отмечается уменьшение полос поглощения колебаний связей органических групп следующих частот: 2950-2800 см-1, 1790-1700 см-1, 1242-1260 см-1, принадлежащих соответственно ν(C-Hn), ν(C=O), ν(NH). Кроме того, на всех спектрограммах присутствуют более четкие полосы поглощения колебаний связей, основной вклад в интенсивности которых принадлежит молекулам и ионам неорганической фазы костной ткани, см-1: 3600-3200 - νOH- в молекулах воды; 1680-1610 - H-O-H в H2O; 1590-1500 - C-O в 
, указывающие на замещение ими в структуре апатита фосфатных тетраэдров по A-механизму; 1480-1410 - C-O в 
B-типа; 1090-1030 - υ3 P-O в 
; 962-968 - υ1 P-O в 
; 872-879 - ν2 ; 574-605 - υ4 O-P-O в .
На фиг.4 представлено разложение ИК-спектра в области 400-650 см-1 колебаний ν4 O-P-O связей PO43 - на три элементарные полосы поглощения (PeakFit_v 4.11.)
Для характеристики степени кристалличности костных образцов проводится математическая обработка спектров с помощью программного пакета PeakFit_v 4.11, заключающаяся в разложении спектральной области 400-650 см-1 на три элементарных полосы поглощения (распределение по Лоренцу, P=0,99). По результатам разложения рассчитывается параметр инфракрасного расщепления антисимметричного деформационного колебания ν4 связи O-P-O, полученный как отношение интенсивностей двух пиков к интенсивности «впадины» между ними (фиг.4): IRSF=I(564 см-1)+I(604 см-1)/I(584 см-1) (Shi J., Klocke A., Zhang М., Bismayer U. Thermally-induced structural modification of dental enamel apatite: Decomposition and transformation of carbonate groups // European Journal of Mineralogy, 2005, V.17, P.769-775).
В таблице 2 представлены значения параметра IRSF до- и после экстракции костной ткани мужчин и женщин (46-56 лет). Показано, что процедуры экстрагирования не оказывают влияние на степень кристалличности минеральной основы костной ткани, следовательно, применение способа позволяет ее исследовать более детально с помощью методов, таких как РФА и ИК-спектроскопия (табл.2).
| Таблица 2 | ||
| Костная ткань | IRSF | |
| До экстракции | После экстракции | |
| Мужчин | 2,31-2,93 | 2,31-2,99 |
| Женщин | 2,11-2,22 | 2,12-2,73 |
Анализ полученных данных позволяет также оценить изменения, которые происходят на ультра- и микроструктурных уровнях организации костной ткани человека при костных заболеваниях (на примере коксартроза). Установлено, что для проб поврежденных срезов характерна наименьшая суммарная степень извлечения белковых компонент (R (водорастворимой и солерастворимой фракций), %). Возможно, это связано с переходом данных растворимых белковых компонент в нерастворимые за счет деформации меж- и внутримолекулярных связей коллагеновых волокон (Copenhaver W.M., Kelly D.E., Wood R.L. The connective tissues: cartilage and bone, Baltimore: Williams & Wilkins, 1978, P.170-205). Следовательно, для коллагеновых молекул костных тканей при коксартрозе характерна большая степень агрегации. При этом в отличие от «нормы» при более глубоком поражении костной ткани (в верхнем срезе) увеличивается содержание извлекаемой солерастворимой белковой составляющей, из которой формируется «зрелый», что может указывать на снижение интенсивности процессов формирования коллагеновых волокон и усиление резорбции органического матрикса.
Таким образом, заявляемый способ позволяет отделить водо- и солерастворимые белковые составляющие костного матрикса от минеральной компоненты, а также проводить их исследование при различных костно-суставных патологиях и разрабатывать эффективные методы профилактики, диагностики и лечения данных функциональных нарушений.
Claims (3)
1. Способ разделения органической и минеральной составляющей костной ткани, в котором подготавливают пластины губчатой костной ткани толщиной 0,2-0,5 мм, получают из них костный порошок, полученный костный порошок подвергают двухкратному экстракционному концентрированию, на первом этапе отбирают среднюю пробу полученного костного порошка массой 200 мг и добавляют 10 мл смеси хлороформ:этиловый спирт в объемном отношении 2:1, помещают на трое суток в темное место при температуре не выше 25°C, испаряют растворитель и дважды добавляют по 5 мл дистиллированной воды, перемешивают, отфильтровывают, получают сухой остаток 1 и фильтрат 1, на втором этапе к сухому остатку 1 добавляют 10 мл 0,9 мас.% хлорида натрия и помещают на трое суток в темное место при температуре не выше 25°C, испаряют растворитель и дважды добавляют по 5 мл дистиллированной воды, перемешивают, отфильтровывают, получают сухой остаток 2 и фильтрат 2, высушивают при 105°C в течение 60 мин и анализируют его с помощью ИК-спектроскопии и рентгенофлуоресцентного анализа.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве билогического материала используют губчатую костную ткань головок бедренных костей человека, из которых получают пластины от 0,2 до 0,5 мм.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно в фильтратах определяют степень извлечения: водорастворимых белковых фракций и солерастворимых белковых фракций в процессе экстрационного концентрирования средней пробы костного порошка.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014114089/15A RU2574935C2 (ru) | 2014-04-09 | Способ разделения органической и минеральной составляющей костной ткани |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014114089/15A RU2574935C2 (ru) | 2014-04-09 | Способ разделения органической и минеральной составляющей костной ткани |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2014114089A RU2014114089A (ru) | 2015-10-27 |
| RU2574935C2 true RU2574935C2 (ru) | 2016-02-10 |
Family
ID=
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2104703C1 (ru) * | 1989-11-22 | 1998-02-20 | Ост-Девелоппман | Способ получения материала для остеопластики и полученный этим способом материал |
| RU2172104C1 (ru) * | 2000-06-15 | 2001-08-20 | ГУН Центральный научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова | Способ изготовления имплантатов из губчатой костной ткани |
| WO2008032928A1 (en) * | 2006-09-12 | 2008-03-20 | Seoul National University Industry Foundation | Method for preparing bone grafting substitute from horse bone |
| RU2478394C1 (ru) * | 2011-11-23 | 2013-04-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Биоматериал для возмещения дефектов костей и способ его получения |
| RU2495567C1 (ru) * | 2012-03-29 | 2013-10-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ получения и консервации минерализованного костного матрикса |
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2104703C1 (ru) * | 1989-11-22 | 1998-02-20 | Ост-Девелоппман | Способ получения материала для остеопластики и полученный этим способом материал |
| RU2172104C1 (ru) * | 2000-06-15 | 2001-08-20 | ГУН Центральный научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова | Способ изготовления имплантатов из губчатой костной ткани |
| WO2008032928A1 (en) * | 2006-09-12 | 2008-03-20 | Seoul National University Industry Foundation | Method for preparing bone grafting substitute from horse bone |
| RU2478394C1 (ru) * | 2011-11-23 | 2013-04-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Биоматериал для возмещения дефектов костей и способ его получения |
| RU2495567C1 (ru) * | 2012-03-29 | 2013-10-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ получения и консервации минерализованного костного матрикса |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Голованова О.А., Лемешева С. А. Экстракционное разделение минеральной и органической составляющих костной ткани // Экстракция органических соединений (ЭОС 2010) : материалы IV Междунар. конф. - Воронеж, 2010. - С. 263-264. Перечень данных [он-лайн] 2010 [найдено 2015.04.27] -найдено в Интернете:URL: http://www.rusanalytchem.org/events/Lists/List/Attachments/9/Voronezh_2010.pdf. * |
| Системы. Методы. Технологии. Головашина О.А. и др. Корреляционные зависимости между фазовым, элементарным и аминокислотным составом физиогенных патогенных ОМА и их синтетических аналогов. 2012. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mendelsohn et al. | IR microscopic imaging of pathological states and fracture healing of bone | |
| Boskey et al. | Infrared analysis of bone in health and disease | |
| DE69024970T2 (de) | Verfahren zur herstellung eines werkstoffes für osteoplastik aus natürlichem knochengewebe sowie aus solchem verfahren gewonnenes material | |
| US20100151040A1 (en) | Putamen ovi | |
| Ouyang et al. | Fourier transform infrared microscopic imaging: effects of estrogen and estrogen deficiency on fracture healing in rat femurs | |
| Timchenko et al. | Optical analysis of implants from the dura mater | |
| CN114848920B (zh) | 一种多孔块状异种骨修复材料的极短流程免煅烧制备方法 | |
| FI91877C (fi) | Menetelmä osseiini-hydroksiapatiittiyhdisteen valmistamiseksi | |
| AU2012316026B2 (en) | Method of preparing porous carbonate apatite from natural bone | |
| RU2574935C2 (ru) | Способ разделения органической и минеральной составляющей костной ткани | |
| Boskey | Variations in bone mineral properties with age and disease | |
| US7758895B2 (en) | Methods for purifying insoluble bone gelatin | |
| Ahmed et al. | Collagen formation observed from healing calvarial defects with principal component analysis of Raman scattering | |
| Weidman et al. | Studies on the skeletal tissues. 1. The degree of calcification of selected mammalian bones | |
| Boyar et al. | FTIR spectroscopic investigation of mineral structure of streptozotocin induced diabetic rat femur and tibia | |
| Mubarokah et al. | Phytochemical Screening of Noni (Morinda citrifolia L) Leaf Ethanol Extract in Pejagan Village, Bangkalan Regency | |
| Anastassopoulou et al. | The role of β-antagonists on the structure of human bone-a spectroscopic study | |
| Hernández-Urbiola et al. | Mineral content and physicochemical properties in female rats bone during growing stage | |
| Timchenko et al. | Raman Spectroscopy for Analysis of Implants from the Dura Mater | |
| RU2456003C1 (ru) | Способ получения деминерализованного костного матрикса в виде крошки | |
| Oetama et al. | The impact of dietary hydrolyzed collagen on bone’s calcium deficiency of Rattus norvegicus | |
| RU2664148C1 (ru) | Способ производства сухих экстрактов из сырья растительного происхождения | |
| KR20040035336A (ko) | 사슴육과 뼈를 이용한 농축액 제조방법 및 이를 이용한 식품 | |
| Gromov et al. | Development of a method for obtaining of dimineralized bone matrix with high residual content of native bone tissue growth factors | |
| Al Sekhaneh et al. | CHARACTERIZATION AND DATING OF ARCHAEOLOGICAL EXCAVATED HUMAN BONE FROM JORDAN BY HIGH-RESOLUTION 31 P AND 14 C NMR AND FOURIER TRANSFORMATION INFRARED. |