RU2574667C2 - Prodrugs containing insulin linker conjugate - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine, pharmaceutics.

SUBSTANCE: group of inventions refers to insulin linker conjugate D-L or its pharmaceutically acceptable salt, wherein D represents an insulin fragment and -L is a biologically inactive linker fragment -L¹ presented by formula (I), wherein a dash line indicates an attachment point to one of insulin amino groups by forming an amide bond. The invention also refers to pharmaceutical compositions containing the above conjugates, methods for producing, as well as using them as a medicinal product for treating or preventing diseases or disorders which may be treated by insulin.

EFFECT: group of inventions provides reducing a rate of injections and making it possible to provide optimum control of blood insulin and glucose.

65 cl, 21 ex, 9 dwg

Description

Настоящее изобретение относится к пролекарствам, фармацевтическим композициям, содержащим указанные пролекарства, а также к их применению в качестве лекарственного средства для лечения или предотвращения заболеваний или нарушений, которые можно лечить инсулином.The present invention relates to prodrugs, pharmaceutical compositions containing said prodrugs, and also to their use as a medicament for treating or preventing diseases or disorders that can be treated with insulin.

Инсулинотерапия диктуется высокой необходимостью поддержать высвобождение инсулинового лекарственного средства на очень строгом уровне, поскольку терапевтическое окно является узким, и вредные эффекты гиперинсулинемии потенциально могут представлять угрозу для жизни. Многочисленные инсулиновые препараты запущены в серийное производство с различными профилями действия, чтобы удовлетворить отдельным требованиям популяции, страдающей диабетом. Быстродействующие инсулиновые аналоги вводят непосредственно перед едой, чтобы контролировать максимальный уровень глюкозы в плазме после переваривания пищи, в то время как аналоги инсулина длительного действия обычно дают один или два раза в день для достижения постоянного базального уровня инсулина.Insulin therapy is dictated by the high need to maintain the release of the insulin drug at a very strict level, since the therapeutic window is narrow and the harmful effects of hyperinsulinemia can potentially be life threatening. Numerous insulin preparations have been put into serial production with various action profiles in order to satisfy the individual requirements of the diabetes population. Fast-acting insulin analogues are administered immediately before meals to control the maximum plasma glucose level after food digestion, while long-acting insulin analogues are usually given once or twice a day to achieve a constant basal level of insulin.

В связи с этим существует очевидная потребность в новых препаратах инсулина длительного действия, которые постоянно высвобождают инсулин за весь период между введениями.In this regard, there is an obvious need for new long-acting insulin preparations that constantly release insulin over the entire period between administrations.

WO-A 2006/003014 описывает гидрогель, способный высвобождать инсулин с возможностью уменьшения частоты дозирования по сравнению со стандартными ежедневными инъекциями базального инсулина. Однако инсулин высвобождается со скоростью, слишком быстрой для обеспечения строгого контроля инсулинотропного действия в течение периодов продолжительностью в 2 дня. В действительности, инсулин высвобождается с периодом полужизни, составляющим приблизительно 30 часов, что означает, что пролекарство должно вводиться по меньшей мере каждые 30 часов для того, чтобы отношение максимума к самой низшей точке кривой составляло ниже 2 при состоянии равновесия.WO-A 2006/003014 describes a hydrogel capable of releasing insulin with the possibility of decreasing the dosage frequency compared to standard daily injections of basal insulin. However, insulin is released at a rate too fast to ensure strict control of the insulinotropic effect over periods of 2 days. In fact, insulin is released with a half-life of approximately 30 hours, which means that the prodrug must be administered at least every 30 hours so that the ratio of the maximum to the lowest point of the curve is below 2 at equilibrium.

Концепция приготовления обратимого конъюгата полимера и пролекарства инсулина была представлена Shechter et al. и описана в научных статьях и патентных заявках (например, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2008(70), 19-28 и WO-A 2004/089280). Инсулин конъюгирован с ПЭГ-полимером 40 кДа посредством линкера флуоренила. Гидролиз молекулы указанного линкера высвобождает инсулин с периодом полужизни, составляющим приблизительно 30 часов, что означает, что пролекарство должно вводиться по меньшей мере каждые 30 часов, чтобы отношение максимума к низшей точке кривой составляло менее 2 при состоянии равновесия.The concept of preparing a reversible polymer conjugate and an insulin prodrug was presented by Shechter et al. and is described in scientific articles and patent applications (e.g., European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2008 (70), 19-28 and WO-A 2004/089280). Insulin is conjugated to a 40 kDa PEG polymer via a fluorenyl linker. Hydrolysis of the molecule of said linker releases insulin with a half-life of approximately 30 hours, which means that the prodrug must be administered at least every 30 hours so that the ratio of the maximum to the lowest point of the curve is less than 2 at equilibrium.

Были предприняты и другие попытки снизить частоту дозирования инсулина. Исследователь Hinds et al., Journal of Controlled Release, 2005 (104), 447-460, описал способ продуцирования инсулина один раз в неделю вначале путем осуществления прочного ПЭГилирования молекулы инсулина и затем микрокапсулирования ПЭГилированного инсулина в микрочастицы PLGA. В данном случае инсулин был подвергнут существенной структурной модификации посредством устойчивой модификации высокомолекулярным полимерным продуктом. Такие модифицированные высокомолекулярными соединениями инсулины могут обладать пониженной эффективностью вследствие снижения связывания с рецептором и также могут проявлять реакции в месте введения, такие как липоатрофия, в результате длительного присутствия высоких концентраций инсулина, модифицированного высокомолекулярным полимером, в подкожной ткани. Кроме того, такие ПЭГилированные инсулины будут иметь более низкий объем распределения, который представляет особый недостаток в лечении диабета.Other attempts have been made to reduce the frequency of insulin dosing. A researcher of Hinds et al., Journal of Controlled Release, 2005 (104), 447-460, described a method of producing insulin once a week, first by performing strong PEGylation of the insulin molecule and then microencapsulating PEGylated insulin in PLGA microparticles. In this case, insulin was subjected to significant structural modification through stable modification with a high molecular weight polymer product. Such insulin-modified high molecular weight compounds may have reduced efficacy due to decreased receptor binding and may also exhibit reactions at the injection site, such as lipoatrophy, as a result of the prolonged presence of high concentrations of high molecular weight polymer-modified insulin in the subcutaneous tissue. In addition, such PEGylated insulins will have a lower volume of distribution, which is a particular disadvantage in the treatment of diabetes.

Однако ПЭГилирование инсулина, очевидно, служит для того, чтобы защитить пептид от деградации в PLGA-полимерной композиции. Эффект ПЭГилирования для защиты пептидов от ацилирования при деградации PLGA-композиции был продемонстрирован для октреотида D. H. Na et al., AAPS PharmSciTech 2003, 4 (4) Article 72.However, PEGylation of insulin obviously serves to protect the peptide from degradation in the PLGA polymer composition. The effect of PEGylation to protect peptides from acylation during degradation of the PLGA composition was demonstrated for octreotide D. H. Na et al., AAPS PharmSciTech 2003, 4 (4) Article 72.

Было показано, что PLGA-капсулирование белков вызывает побочные реакции сложных эфиров полимеров с аминогруппами пептида или белка. Продукты ацилирования молочной кислоты наблюдали после воздействия на композиции буферными растворами при нейтральном рН (G. Zhu et al., Nature Biotechnology 18 (2000) 52-57; A.J. Domb et al., Pharm. Res. 11 (1994) 865-868; A. Lucke et al., Pharm. Res. 19 (2002) 175-181).It has been shown that PLGA-encapsulation of proteins causes side reactions of polymer esters with the amino groups of the peptide or protein. Lactic acid acylation products were observed after exposure to the composition with buffer solutions at neutral pH (G. Zhu et al., Nature Biotechnology 18 (2000) 52-57; AJ Domb et al., Pharm. Res. 11 (1994) 865-868; A. Lucke et al., Pharm. Res. 19 (2002) 175-181).

Специально для инсулина были продемонстрированы вредные действия полимерных препаратов P.G. Shao et al., Pharm. Dev. Technol. 4 (1999) 633-642 (см. также P.G. Shao et al., Pharm. Dev. Technol. 5 (2000) 1-9).Especially for insulin, the harmful effects of P.G. Shao et al., Pharm. Dev. Technol. 4 (1999) 633-642 (see also P.G. Shao et al., Pharm. Dev. Technol. 5 (2000) 1-9).

Кроме того, известно, что инсулин легко претерпевает побочные реакции, которые связаны с присутствием трех дисульфидных мостиков в молекуле. Например, А- и В-цепи инсулина могут быть расщеплены путем разрыва дисульфидной связи, или димеры или олигомеры могут быть образованы в результате реакций дисульфидного обмена. Такая дисульфидная перегруппировка является особенно вероятной, если молекулы инсулина вынуждены вступать в близкий контакт хаотически. Такая характерная лабильность молекулы инсулина существенно тормозит прогресс развития препарата-депо длительного действия и препятствует использованию других полимерных препаратов, где инсулин капсулирован в некотором смысле подобно аморфному преципитату, который, как хорошо известно, приводит к образованию различных продуктов разложения, возникающих в результате обширного дисульфидного обмена.In addition, it is known that insulin easily undergoes side reactions that are associated with the presence of three disulfide bridges in the molecule. For example, insulin A and B chains can be cleaved by breaking a disulfide bond, or dimers or oligomers can be formed from disulfide exchange reactions. Such a disulfide rearrangement is especially likely if insulin molecules are forced to come into close contact randomly. This characteristic lability of the insulin molecule significantly inhibits the development of a long-acting depot drug and prevents the use of other polymer preparations, where insulin is encapsulated in a sense like an amorphous precipitate, which, as is well known, leads to the formation of various decomposition products resulting from extensive disulfide metabolism .

Из представленных выше данных следует, что сохраняется проблема разработки препарата инсулина длительного действия без нарушения фармакодинамики инсулина путем прочного присоединения высокомолекулярной структуры или путем создания повреждения структуры молекулы в течение ее присутствия в депо.From the above data it follows that there remains the problem of developing a long-acting insulin preparation without disturbing the pharmacodynamics of insulin by firmly attaching a high molecular weight structure or by creating damage to the structure of the molecule during its presence in the depot.

Таким образом, задача настоящего изобретения состоит в предоставлении пролекарства, содержащего инсулин, которое соответствует, по меньшей мере частично, описанным выше требованиям.Thus, it is an object of the present invention to provide a prodrug containing insulin that meets, at least in part, the requirements described above.

Задача изобретения решается за счет получения пролекарства или его фармацевтически приемлемой соли, содержащих конъюгат инсулина и линкера D-L, гдеThe objective of the invention is solved by obtaining a prodrug or its pharmaceutically acceptable salt containing the conjugate of insulin and linker D-L, where

D представляет собой фрагмент инсулина; иD represents a fragment of insulin; and

-L является биологически неактивным линкерным фрагментом -L¹, представленным формулой (I)-L is a biologically inactive linker moiety -L ¹ represented by formula (I)

где пунктирная линия указывает на присоединение к одной из аминогрупп инсулина с образованием амидной связи;where the dashed line indicates the attachment to one of the amino groups of insulin with the formation of an amide bond;

X является C(R³R^3a) или N(R³);X is C (R ³ R ^3a ) or N (R ³ );

R^1a, R^3a независимо выбирают из группы, содержащей H, NH(R^2b), N(R^2b)C(O)R⁴ и C_1-4алкил;R ^1a , R ^{3a are} independently selected from the group consisting of H, NH (R ^2b ), N (R ^2b ) C (O) R ^4, and C _1-4 alkyl;

R¹, R², R^2a, R^2b, R³, R⁴ независимо выбирают из группы, содержащей H и C_1-4алкил,R ¹ , R ² , R ^2a , R ^2b , R ³ , R ^{4 are} independently selected from the group consisting of H and C _1-4 alkyl,

где фрагмент L¹ замещен одним элементом L²-Z и необязательно дополнительно замещен при условии, что водород, помеченный звездочкой в формуле (I), не заменен заместителем, и гдеwhere the fragment L ^{1 is} substituted by one element L ² -Z and optionally further substituted, provided that the hydrogen marked with an asterisk in formula (I) is not replaced by a substituent, and where

L² является простой химической связью или спейсером; иL ² is a simple chemical bond or spacer; and

Z является гидрогелем.Z is a hydrogel.

В ходе данной работы неожиданно было обнаружено, что пролекарство согласно настоящему изобретению может достичь высвобождения инсулина из подкожного депо в структурно интактной форме в течение периодов времени, составляющих по меньшей мере 2 дня между введениями. Поскольку дальнейшее преимущество структурной целостности высвобожденного инсулина может быть достигнуто с помощью хорошо гидратированного полимерного матрикса, сведение до минимума межмолекулярного контакта молекул инсулина и замедленное высвобождение могут быть возможны благодаря внутреннему расщеплению линкера пролекарства между инсулином и полимерным матриксом.In the course of this work, it was unexpectedly discovered that the prodrug of the present invention can achieve insulin release from the subcutaneous depot in a structurally intact form for periods of at least 2 days between administrations. Since a further advantage of the structural integrity of the released insulin can be achieved using a well-hydrated polymer matrix, minimizing the intermolecular contact of the insulin molecules and delayed release may be possible due to the internal cleavage of the prodrug linker between the insulin and the polymer matrix.

Таким образом, должно стать возможным вводить инсулин в виде пролекарства согласно настоящему изобретению менее часто, чем обычные инсулины длительного действия. Другими преимуществами должны стать малые величины отношения максимальной к минимальной концентрации, которые в значительной степени снижают риск гипогликемических эпизодов. Такое введение поможет больным снизить частоту инъекций, в то же время сохранить возможность оптимального контроля уровней инсулина в плазме и следовательно глюкозы в крови.Thus, it should be possible to administer insulin as a prodrug according to the present invention less frequently than conventional long acting insulins. Other advantages should be small values of the ratio of maximum to minimum concentration, which significantly reduce the risk of hypoglycemic episodes. Such an introduction will help patients reduce the frequency of injections, while at the same time maintaining the ability to optimally control plasma insulin levels and therefore blood glucose.

“Инсулин” согласно настоящему изобретению означает рекомбинантный человеческий инсулин, лантус, инсулин гларгин, инсулин детемир, инсулин глулизин, инсулин аспарт, лизпро-инсулин, инсулин, конъюгированный с низкомолекулярным ПЭГ. Низкомолекулярный ПЭГ имеет молекулярную массу менее 10 кДа.“Insulin” according to the present invention means recombinant human insulin, lantus, insulin glargine, insulin detemir, insulin glulisin, insulin aspart, lyspro-insulin, insulin conjugated to low molecular weight PEG. A low molecular weight PEG has a molecular weight of less than 10 kDa.

Инсулин, связанный с биологически неактивным линкером, имеет название “фрагмент инсулина”.Insulin bound to a biologically inactive linker is called the “insulin fragment”.

Под “аналогом инсулина”, как используют в описании, подразумевают полипептид, имеющий молекулярную структуру, которая формально может быть произведена из структуры природного инсулина, например структуры человеческого инсулина, путем делеции и/или обмена по меньшей мере одного аминокислотного остатка, встречающегося в природном инсулине, и/или добавления по меньшей мере одного аминокислотного остатка. Добавленные и/или обмененные аминокислотные остатки либо могут быть кодируемыми аминокислотными остатками, либо другими природными остатками или чисто синтетическими аминокислотными остатками.By “insulin analogue,” as used herein, is meant a polypeptide having a molecular structure that can formally be produced from the structure of natural insulin, for example, the structure of human insulin, by deletion and / or exchange of at least one amino acid residue found in natural insulin and / or adding at least one amino acid residue. The added and / or exchanged amino acid residues can either be encoded amino acid residues, or other natural residues, or purely synthetic amino acid residues.

Аналоги инсулина могут быть такими, у которых положение 28 В-цепи может быть модифицировано от природного остатка Pro до одного из Asp, Lys или Ile. В другом аспекте, Lys в положении B29 модифицирован до Pro. Также, Asn в положении A21 может быть модифицирован до Ala, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val, в частности до Gly, Ala, Ser, или Thr и предпочтительно до Gly. Кроме того, Asn в положении B3 может быть модифицирован до Lys или Asp. Другими примерами аналогов инсулина являются дес(B30) человеческий инсулин; аналоги дес(B30) человеческого инсулина; инсулиновые аналоги, у которых PheB1 был исключен; инсулиновые аналоги, у которых A-цепь и/или B-цепь имеет N-концевое удлинение, и инсулиновые аналоги, у которых A-цепь и/или В-цепь имеет C-концевое удлинение. Таким образом, один или два остатка Arg могут быть добавлены в положение B1.Insulin analogs may be those in which the position of the 28 B chain can be modified from the natural Pro residue to one of Asp, Lys or Ile. In another aspect, Lys at position B29 is modified to Pro. Also, Asn at position A21 can be modified to Ala, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val, in particular to Gly, Ala, Ser, or Thr, and preferably up to Gly. In addition, Asn at position B3 can be modified to Lys or Asp. Other examples of insulin analogs are des (B30) human insulin; analogues of des (B30) human insulin; insulin analogues in which PheB1 was excluded; insulin analogues in which the A chain and / or B chain has an N-terminal extension, and insulin analogs in which the A chain and / or B chain has a C-terminal extension. Thus, one or two Arg residues can be added to position B1.

Относительно “десВ30 инсулина”, “десВ30 человеческий инсулин” означает природный инсулин или его аналог с отсутствующим В30 аминокислотным остатком. Аналогично, “десВ29десВ30 инсулин” или “десВ29десВ30 человеческий инсулин” означает природный инсулин или его аналог с отсутствующими В29 и В30 аминокислотными остатками.Regarding “desB30 insulin”, “desB30 human insulin” means natural insulin or its analogue with the missing B30 amino acid residue. Similarly, “desB29desB30 insulin” or “desB29desB30 human insulin” means naturally occurring insulin or an analogue thereof with missing B29 and B30 amino acid residues.

Под “В1”, “А1” и т.д. подразумевают аминокислотный остаток в положении 1 в В-цепи инсулина (считая от N-концевой области) и аминокислотный остаток в положении 1 в А-цепи инсулина (считая от N-концевой области), соответственно. Аминокислотный остаток в специфическом положении также может быть обозначен как, например, PheB1, который означает, что аминокислотный остаток в положении В1 является остатком фенилаланина.Under “B1”, “A1”, etc. mean the amino acid residue at position 1 in the insulin B chain (counting from the N-terminal region) and the amino acid residue at position 1 in the insulin A chain (counting from the N-terminal region), respectively. An amino acid residue at a specific position can also be designated as, for example, PheB1, which means that the amino acid residue at position B1 is a phenylalanine residue.

“Биологически неактивный линкер” означает линкер, который не проявляет фармакологические эффекты лекарственного средства, произведенного из биологически активного агента.“Biologically inactive linker” means a linker that does not exhibit the pharmacological effects of a drug derived from a biologically active agent.

Термин “защитные группы” относится к фрагменту, который временно защищает химическую функциональную группу молекулы в процессе синтеза для достижения хемоселективности в последующих химических реакциях. Защитными группами для спиртов являются, например, бензил и тритил, защитными группами для аминов являются, например, трет-бутилоксикарбонил, 9-флуоренилметилоксикарбонил и бензил, и для тиолов примерами защитных групп являются 2,4,6-триметоксибензил, фенилтиометил, ацетамидометил, пара-метоксибензилоксикарбонил, трет-бутилтио, трифенилметил, 3-нитро-2-пиридилтио, 4-метилтритил.The term “protecting groups” refers to a moiety that temporarily protects a chemical functional group of a molecule during synthesis to achieve chemoselectivity in subsequent chemical reactions. Protective groups for alcohols are, for example, benzyl and trityl, protective groups for amines are, for example, tert-butyloxycarbonyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl and benzyl, and for thiols, examples of protective groups are 2,4,6-trimethoxybenzyl, phenylthiomethyl, acetamidomethyl, steam -methoxybenzyloxycarbonyl, tert-butylthio, triphenylmethyl, 3-nitro-2-pyridylthio, 4-methyltrityl.

Термин “защищенные функциональные группы” означает функциональную группу с определенными химическими свойствами, защищенную защитной группой.The term “protected functional groups” means a functional group with certain chemical properties protected by a protective group.

“Ацилирующее средство” означает фрагмент структуры R-(C=O)-, предоставляющий ацильную группу в реакции ацилирования, необязательно соединенный с уходящей группой, такой как хлорангидрид, N-гидроксисукцинимид, пентафторфенол и пара-нитрофенол.“Acylating agent” means a fragment of the structure R- (C = O) -, providing an acyl group in an acylation reaction, optionally connected to a leaving group such as acid chloride, N-hydroxysuccinimide, pentafluorophenol and para-nitrophenol.

“Алкил” означает прямую или разветвленную углеродную цепь. Любой водород у углерода алкила может быть заменен заместителем.“Alkyl” means a straight or branched carbon chain. Any hydrogen on alkyl carbon may be substituted with a substituent.

“Арил” относится к любому заместителю, произведенному от моноциклического или полициклического или конденсированного ароматического кольца, включая гетероциклические кольца, например, фенил, тиофен, индолил, нафтил, пиридил, которое необязательно может быть также замещенным.“Aryl” refers to any substituent derived from a monocyclic or polycyclic or fused aromatic ring, including heterocyclic rings, for example phenyl, thiophene, indolyl, naphthyl, pyridyl, which optionally may also be substituted.

“Ацил” означает функциональную группу с определенными химическими свойствами структуры R-(C=O)-, где R является алкилом или арилом.“Acyl” means a functional group with certain chemical properties of the structure R- (C = O) -, where R is alkyl or aryl.

“C_1-4алкил” означает алкильную цепь, содержащую 1-4 атома углерода, например, если присутствует на конце молекулы: метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, или, например, -CH₂-, -CH₂-CH₂-, -CH(CH₃)-, -CH₂-CH₂-CH₂-, -CH(C₂H₅)-, -C(CH₃)₂-, когда два фрагмента молекулы связаны алкильной группой. Любой водород у углерода C_1-4алкила может быть заменен заместителем.“C _1-4 alkyl” means an alkyl chain containing 1-4 carbon atoms, for example, if present at the end of the molecule: methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, or, for example, -CH ₂ -, -CH ₂ -CH ₂ -, -CH (CH ₃ ) -, -CH ₂ -CH ₂ -CH ₂ -, -CH (C ₂ H ₅ ) -, -C (CH ₃ ) ₂ - when two fragments of a molecule are linked by an alkyl group. Any hydrogen on C _1-4 alkyl carbon may be substituted with a substituent.

“C_1-6алкил” означает алкильную цепь, содержащую 1-6 атомов углерода, например, если присутствует на конце молекулы: C_1-4алкил, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил; трет-бутил, н-пентил, н-гексил, или, например, -CH₂-, -CH₂-CH₂-, -CH(CH₃)-, -CH₂-CH₂-CH₂-, -CH(C₂H₅)-, -C(CH₃)₂-, когда два фрагмента молекулы связаны алкильной группой. Любой водород у углерода C_1-6алкила может быть заменен заместителем.“C _1-6 alkyl” means an alkyl chain containing 1-6 carbon atoms, for example, if present at the end of the molecule: C _1-4 alkyl, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec- butyl; tert-butyl, n-pentyl, n-hexyl, or, for example, -CH ₂ -, -CH ₂ -CH ₂ -, -CH (CH ₃ ) -, -CH ₂ -CH ₂ -CH ₂ -, -CH (C ₂ H ₅ ) -, -C (CH ₃ ) ₂ - when two fragments of the molecule are linked by an alkyl group. Any hydrogen on carbon of C _1-6 alkyl may be substituted with a substituent.

Соответственно, “C_1-18алкил” означает алкильную цепь, содержащую от 1 до 18 атомов углерода, и “C_8-18алкил” означает алкильную цепь, содержащую от 8 до 18 атомов углерода. Соответственно, “C_1-50алкил” означает алкильную цепь, содержащую от 1 до 50 атомов углерода.Accordingly, “C _1-18 alkyl” means an alkyl chain containing from 1 to 18 carbon atoms, and “C _8-18 alkyl” means an alkyl chain containing from 8 to 18 carbon atoms. Accordingly, “C _1-50 alkyl” means an alkyl chain containing from 1 to 50 carbon atoms.

“C_2-50алкенил” означает разветвленную или неразветвленную алкенильную цепь, содержащую от 2 до 50 атомов углерода, например, если присутствует на конце молекулы: -CH=CH₂, -CH=CH-CH₃, -CH₂-CH=CH₂, -CH=CH-CH₂-CH₃, -CH=CH-CH=CH₂, или, например, -CH=CH-, когда два фрагмента молекулы соединены алкенильной группой. Любой водород у углерода C_2-50алкенила может быть заменен заместителем, как указано далее. Соответственно, термин “алкенил” относится к углеродной цепи по меньшей мере с одной углерод-углеродной двойной связью. Необязательно, одна или более тройные связи могут присутствовать.“C _2-50 alkenyl” means a branched or unbranched alkenyl chain containing from 2 to 50 carbon atoms, for example, if present at the end of the molecule: -CH = CH ₂ , -CH = CH-CH ₃ , -CH ₂ -CH = CH ₂ , —CH = CH — CH ₂ —CH ₃ , —CH = CH — CH = CH ₂ , or, for example, —CH = CH— when two fragments of the molecule are joined by an alkenyl group. Any hydrogen on C _2-50 alkenyl carbon may be substituted with a substituent, as indicated below. Accordingly, the term “alkenyl” refers to a carbon chain with at least one carbon-carbon double bond. Optionally, one or more triple bonds may be present.

“C_2-50алкинил” означает разветвленную или неразветвленную алкинильную цепь, содержащую от 2 до 50 атомов углерода, например, если присутствует на конце молекулы: -C≡CH, -CH₂-C≡CH, CH₂-CH₂-C≡CH, CH₂-C≡C-CH₃, или, например, -C≡C-, когда два фрагмента молекулы соединены алкинильной группой. Любой водород у углерода C_2-50алкинила может быть заменен заместителем, как указано далее. Соответственно, термин алкинил” относится к углеродной цепи по меньшей мере с одной углерод-углеродной тройной связью. Необязательно, одна или более двойные связи могут присутствовать.“C _2-50 alkynyl” means a branched or unbranched alkynyl chain containing from 2 to 50 carbon atoms, for example, if present at the end of the molecule: -C≡CH, -CH ₂ -C≡CH, CH ₂ -CH ₂ -C ≡CH, CH ₂ -C≡C-CH ₃ , or, for example, -C≡C-, when two fragments of the molecule are joined by an alkynyl group. Any hydrogen in carbon of C _2-50 alkynyl may be substituted with a substituent, as indicated below. Accordingly, the term “alkynyl” refers to a carbon chain with at least one carbon-carbon triple bond. Optionally, one or more double bonds may be present.

“C_3-7циклоалкил” или “C_3-7циклоалкильное кольцо” означает циклическую алкильную цепь, содержащую от 3 до 7 атомов углерода, которая может включать углерод-углеродные двойные связи, будучи по меньшей мере частично насыщенными, например, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогексенил, циклогептил. Любой водород у углерода циклоалкила может быть заменен заместителем. Термин “C_3-7циклоалкил” или “C_3-7циклоалкильное кольцо” также включает бициклы, соединенные мостиковой связью подобно норбонану или норбонену. Соответственно, “C_3-5циклоалкил” означает циклоалкил, содержащий от 3 до 5 атомов углерода.“C _3-7 cycloalkyl” or “C _3-7 cycloalkyl ring” means a cyclic alkyl chain containing from 3 to 7 carbon atoms, which may include carbon-carbon double bonds, being at least partially saturated, for example cyclopropyl, cyclobutyl , cyclopentyl, cyclohexyl, cyclohexenyl, cycloheptyl. Any hydrogen on carbon cycloalkyl can be replaced by a substituent. The term “C _3-7 cycloalkyl” or “C _3-7 cycloalkyl ring” also includes bicycles bridged like norbonane or norbonene. Accordingly, “C _3-5 cycloalkyl” means cycloalkyl containing from 3 to 5 carbon atoms.

Соответственно, “C_3-10циклалкил” означает циклический алкил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, например, C_3-7циклоалкил; циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогексенил, циклогептил, циклооктил, циклононил, циклодецил. Термин “C_3-10циклоалкил” также включает по меньшей мере частично насыщенные карбомоно- и бициклы.Accordingly, “C _3-10 cycloalkyl” means cyclic alkyl containing from 3 to 10 carbon atoms, for example, C _3-7 cycloalkyl; cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cyclohexenyl, cycloheptyl, cyclooctyl, cyclononyl, cyclodecyl. The term “C _3-10 cycloalkyl” also includes at least partially saturated carbomono and bicycles.

“Галоген” означает фтор, хлор, бром или йод. В большинстве случаев предпочтительно, когда галогеном является фтор или хлор.“Halogen” means fluoro, chloro, bromo or iodo. In most cases, it is preferable when the halogen is fluorine or chlorine.

“4-7-членный гетероциклил” или “4-7-членный гетероцикл” означает кольцо с 4, 5, 6 или 7 атомами в кольце, которое может содержать вплоть до максимального числа двойные связи (ароматическое или неароматическое кольцо, которое полностью насыщено, частично насыщено или не насыщено), где по меньшей мере от одного кольцевого атома до 4 атомов в кольце заменены гетероатомом, выбранным из группы, состоящей из серы (включая -S(O)-, -S(O)₂-), кислорода и азота (включая =N(O)-), и где кольцо связано с остальной частью молекулы через атом углерода или азота. Примерами 4-7-членных гетероциклов являются азетидин, оксетан, тиетан, фуран, тиофен, пиррол, пирролин, имидазол, имидазолин, пиразол, пиразолин, оксазол, оксазолин, изоксазол, изоксазолин, тиазол, тиазолин, изотиазол, изотиазолин, тиадиазол, тиадиазолин, тетрагидрофуран, тетрагидротиофен, пирролидин, имидазолидин, пиразолидин, оксазолидин, изоксазолидин, тиазолидин, изотиазолидин, тиадиазолидин, сульфолан, пиран, дигидропиран, тетрагидропиран, имидазолидин, пиридин, пиридазин, пиразин, пиримидин, пиперазин, пиперидин, морфолин, тетразол, триазол, триазолидин, тетразолидин, диазепан, азепин или гомопиперазин.“4-7 membered heterocyclyl” or “4-7 membered heterocycle” means a ring with 4, 5, 6 or 7 atoms in a ring, which may contain up to a maximum number of double bonds (aromatic or non-aromatic ring, which is fully saturated, partially saturated or not saturated), where at least one ring atom to 4 atoms in the ring are replaced by a heteroatom selected from the group consisting of sulfur (including —S (O) -, —S (O) ₂ -), oxygen, and nitrogen (including = N (O) -), and where the ring is connected to the rest of the molecule through a carbon or nitrogen atom. Examples of 4-7 membered heterocycles are azetidine, oxetane, thietane, furan, thiophene, pyrrole, pyrroline, imidazole, imidazoline, pyrazole, pyrazoline, oxazole, oxazoline, isoxazole, isoxazoline, thiaziazole, isothiaziol, thiaziazole, thiaziazole, tetrahydrofuran, tetrahydrothiophene, pyrrolidine, imidazolidine, pyrazolidine, oxazolidine, isoxiazolidine, thiazolidine, sulfolane, pyran, dihydropyran, tetrahydropyran, imidazolidine pyridine pyridine pyridine pyridine pyridine pyridine pyridine pyridine pyridine pyridine pyridine pyridine azole, triazolidine, tetrazolidine, diazepan, azepine or homopiperazine.

“9-11-членный гетеробициклил” или “9-11-членный гетеробицикл” означает гетероциклическую систему из двух колец, содержащую 9-11 кольцевых атомов где по меньшей мере один атом в кольце является общим для обоих колец, и которые могут содержать вплоть до максимального числа двойных связей (ароматическое или неароматическое кольцо, которое является полностью насыщенным, частично насыщенным или ненасыщенным), где по меньшей мере от одного кольцевого атома до 6 кольцевых атомов заменены гетероатомом, выбранным из группы, состоящей из серы (включая -S(O)-, -S(O)₂-), кислорода и азота (включая =N(О)-), и где кольцо связано с остальной частью молекулы через атом углерода или азота. Примерами 9-11-членного гетеробицикла являются индол, индолин, бензофуран, бензотиофен, бензоксазол, бензизоксазол, бензотиазол, бензизотиазол, бензимидазол, бензимидазолин, хинолин, хиназолин, дигидрохиназолин, хинолин, дигидрохинолин, тетрагидрохинолин, декагидрохинолин, изохинолин, декагидроизохинолин, тетрагидроизохинолин, дигидроизохинолин, бензазепин, пурин или птеридин. Термин «9-11-членный гетеробицикл» также включает спиро-структуры из двух колец, подобные 1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]декану или гетероциклам, соединенным мостиковой связью подобно 8-азабицикло[3.2.1]октану.“9-11 membered heterobicyclyl” or “9-11 membered heterobicycle” means a two-ring heterocyclic system containing 9-11 ring atoms where at least one atom in the ring is common to both rings and which may contain up to the maximum number of double bonds (aromatic or non-aromatic ring, which is fully saturated, partially saturated or unsaturated), where at least one ring atom to 6 ring atoms are replaced by a heteroatom selected from the group consisting of sulfur (including I -S (O) -, -S ( O) ₂ -), oxygen and nitrogen (including = N (O) -) and wherein the ring is bonded to the remainder of the molecule via a carbon or nitrogen atom. Examples 9-11 membered heterobicycle are indole, indoline, benzofuran, benzothiophene, benzoxazole, benzisoxazole, benzothiazole, benzisothiazole, benzimidazole, benzimidazolinyl, quinoline, quinazoline, dihydroquinazoline, quinoline, dihydroquinoline, tetrahydroquinoline, decahydroquinoline, isoquinoline, decahydroisoquinoline, tetrahydroisoquinoline, dihydroisoquinoline, benzazepine, purine or pteridine. The term “9-11 membered heterobicycle” also includes two-ring spiro structures like 1,4-dioxa-8-azaspiro [4.5] decane or heterocycles connected by a bridging like 8-azabicyclo [3.2.1] octane.

В случае инсулиновых пролекарств, включающих соединения согласно формуле (I), которые содержат одну или более кислотных или основных групп, изобретение также включает их соответствующие фармацевтически или токсикологически приемлемые соли, в частности, их фармацевтически пригодные соли. Таким образом, инсулиновые пролекарства, включающие соединения формулы (I), которые содержат кислотные группы, могут быть использованы согласно изобретению, например, в виде солей щелочных металлов, солей щелочноземельных металлов или аммониевых солей. Более определенные примеры таких солей включают натриевые соли, калиевые соли, кальциевые соли, магниевые соли и соли с аммиаком или органическими аминами, такими как, например, этиламин, этаноламин, триэтаноламин или аминокислоты. Инсулиновые пролекарства, включающие соединения формулы (I), которые содержат одну или более основных групп, т.е. группы, которые могут быть протонированы, могут присутствовать и могут быть использованы согласно изобретению в виде их аддитивных солей с неорганическими или органическими кислотами. Примеры таких кислот включают хлористоводородную кислоту, бромистоводородную кислоту, фосфорную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, метансульфокислоту, пара-толуолсульфокислоту, нафталиндисульфокислоту, щавелевую кислоту, уксусную кислоту, винную кислоту, молочную кислоту, салициловую кислоту, бензойную кислоту, муравьиную кислоту, пропионовую кислоту, триметилуксусную кислоту, диэтилуксусную кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, пимелиновую кислоту, фумаровую кислоту, малеиновую кислоту, яблочную кислоту, сульфаминовую кислоту, фенилпропионовую кислоту, глюконовую кислоту, аскорбиновую кислоту, изоникотиновую кислоту, лимонную кислоту, адипиновую кислоту и другие кислоты, известные специалисту в данной области. Если инсулиновые пролекарства, включающие соединения формулы (I), одновременно содержат кислотные и основные группы в молекуле, изобретение также включает, кроме указанных выше солевых форм, внутренние соли или бетаины (цвиттерионы). Соответствующие соли сообразно с инсулиновыми пролекарствами, включающими соединения формулы (I), могут быть получены общепринятыми способами, известными специалисту в данной области, подобными, например, способу, включающему взаимодействие их с органической или неорганической кислотой или основанием в растворителе или диспергирующем средстве или анионный обмен или катионный обмен с другими солями. Настоящее изобретение также включает все соли инсулиновых пролекарств, содержащих соединения формулы (I), которые из-за их низкой физиологической совместимости не используются прямо в качестве фармацевтических препаратов, но которые могут быть использованы, например, в качестве промежуточных соединений для химических реакций или для приготовления фармацевтически приемлемых солей.In the case of insulin prodrugs, including compounds according to formula (I), which contain one or more acidic or basic groups, the invention also includes their corresponding pharmaceutically or toxicologically acceptable salts, in particular their pharmaceutically acceptable salts. Thus, insulin prodrugs including compounds of formula (I) that contain acid groups can be used according to the invention, for example, in the form of alkali metal salts, alkaline earth metal salts or ammonium salts. More specific examples of such salts include sodium salts, potassium salts, calcium salts, magnesium salts, and salts with ammonia or organic amines, such as, for example, ethylamine, ethanolamine, triethanolamine or amino acids. Insulin prodrugs comprising compounds of formula (I) that contain one or more basic groups, i.e. groups that can be protonated can be present and can be used according to the invention in the form of their addition salts with inorganic or organic acids. Examples of such acids include hydrochloric acid, hydrobromic acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, methanesulfonic acid, para-toluenesulfonic acid, naphthalene disulfonic acid, oxalic acid, acetic acid, tartaric acid, lactic acid, salicylic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid , trimethylacetic acid, diethylacetic acid, malonic acid, succinic acid, pimelic acid, fumaric acid, maleic acid, malic acid, sulfamines acid, phenylpropionic acid, gluconic acid, ascorbic acid, isonicotinic acid, citric acid, adipic acid and other acids known to the person skilled in the art. If insulin prodrugs comprising compounds of formula (I) simultaneously contain acidic and basic groups in the molecule, the invention also includes, in addition to the salt forms indicated above, internal salts or betaines (zwitterions). The corresponding salts in accordance with insulin prodrugs, including compounds of formula (I), can be obtained by conventional methods known to the person skilled in the art, similar, for example, to a method comprising reacting them with an organic or inorganic acid or base in a solvent or dispersant or anion exchange or cation exchange with other salts. The present invention also includes all salts of insulin prodrugs containing compounds of formula (I), which, because of their low physiological compatibility, are not directly used as pharmaceuticals, but which can be used, for example, as intermediates for chemical reactions or for the preparation of pharmaceutically acceptable salts.

Для того чтобы усилить физико-химические или фармакокинетические свойства лекарственного средства, такого как инсулин, in vivo, такое лекарственное средство может быть конъюгировано с носителем. Если лекарственное средство временно связано с носителем и/или линкером, такие системы обычно обозначают как связанные с носителем пролекарства. Согласно определениям, предоставленным IUPAC (как дано согласно http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac.medchem, доступного с 22 июля 2009), связанное с носителем пролекарство является пролекарством, которое содержит временную связь данного активного вещества с неустойчивой группой носителя, образование которой способствует улучшению физико-химических и фармакокинетических свойств и которая может быть легко удалена in vivo, обычно путем гидролитического расщепления.In order to enhance the physicochemical or pharmacokinetic properties of a drug, such as insulin, in vivo , such a drug can be conjugated to a carrier. If the drug is temporarily associated with the carrier and / or linker, such systems are usually referred to as carrier-related prodrugs. According to the definitions provided by IUPAC (as given according to http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac.medchem, available from July 22, 2009), a carrier-associated prodrug is a prodrug that contains a temporary association of this active substance with an unstable a carrier group, the formation of which improves the physicochemical and pharmacokinetic properties and which can be easily removed in vivo , usually by hydrolytic cleavage.

Линкеры, используемые в таких пролекарствах, связанных с носителем, являются временными, что означает, что они гидролитически разрушаются (расщепляются) неферментативным путем при физиологических условиях (водный буфер при рН 7,4, 37°C) с периодами полужизни, колеблющимися, например, от одного часа до трех месяцев.The linkers used in such carrier-related prodrugs are temporary, which means that they are hydrolytically destroyed (cleaved) non-enzymatically under physiological conditions (aqueous buffer at pH 7.4, 37 ° C) with half-lives fluctuating, for example, from one hour to three months.

Подходящими носителями являются полимеры, и они могут быть либо непосредственно конъюгированы с линкером, либо через нерасщепляемый спейсер. Термин “пролекарство инсулина с гидрогелем” относится к связанным с носителем пролекарствам инсулина, где носителем является гидрогель. Термины “пролекарство с гидрогелем” и “гидрогельсвязанное пролекарство” относятся к пролекарствам биологически активных средств, временно связанных с гидрогелем, и используются как синонимы. “Гидрогель” может быть определен как трехмерная, гидрофильная или амфифильная полимерная сетка, проявляющая способность поглощать большие количества воды. Сетки состоят из гомополимеров или сополимеров, являются нерастворимыми вследствие присутствия ковалентных химических или физических (ионных, гидрофобных взаимодействий, переплетений) поперечных связей. Поперечные связи обеспечивают сетчатую структуру и физическую целостность. Гидрогели имеют термодинамическую совместимость с водой, что позволяет им набухать в водных средах. Цепи сетки соединены таким образом, что образуются поры и что существенная часть данных пор имеет размеры между 1 нм и 1000 нм.Suitable carriers are polymers, and they can either be directly conjugated to the linker or via a non-cleavable spacer. The term “hydrogel insulin prodrug” refers to a carrier-related insulin prodrug, where the carrier is a hydrogel. The terms “prodrug with hydrogel” and “hydrogel bound prodrug” refer to prodrugs of biologically active agents temporarily associated with a hydrogel and are used synonymously. A “hydrogel” can be defined as a three-dimensional, hydrophilic or amphiphilic polymer network exhibiting the ability to absorb large amounts of water. Nets consist of homopolymers or copolymers, are insoluble due to the presence of covalent chemical or physical (ionic, hydrophobic interactions, weaves) cross-links. Cross links provide a mesh structure and physical integrity. Hydrogels have thermodynamic compatibility with water, which allows them to swell in aqueous media. The grid chains are connected in such a way that pores are formed and that a substantial part of these pores have sizes between 1 nm and 1000 nm.

“Свободная форма” лекарственного средства относится к лекарственному средству в его немодифицированной, фармакологически активной форме, такой как форма после высвобождения средства из полимерного конъюгата.A “free form" of a drug refers to a drug in its unmodified, pharmacologically active form, such as after release of the drug from the polymer conjugate.

Термины “лекарственное средство”, “биологически активная молекула”, “биологически активный фрагмент”, “биологически активное средство”, “активное средство” и тому подобные означают любое вещество, которое может воздействовать на любые физические или биохимические свойства биологического организма, включающего, но не ограничивающегося ими, вирусы, бактерии, грибы, растения, животные и людей. В частности, как используют в описании, биологически активные молекулы включают любое вещество, предназначенное для диагностики, устранения, ослабления, лечения или предотвращения заболевания у людей или других животных, или иначе повысить физическое или психическое здоровье людей или животных. Точнее, термины “лекарственное средство”, “биологически активная молекула”, “биологически активный фрагмент”, “биологически активное средство”, “активное средство” и тому подобные относятся к инсулину.The terms “drug”, “biologically active molecule”, “biologically active fragment”, “biologically active agent”, “active agent” and the like mean any substance that can affect any physical or biochemical properties of a biological organism, including, but not limited to viruses, bacteria, fungi, plants, animals and people. In particular, as used herein, biologically active molecules include any substance intended to diagnose, eliminate, attenuate, treat or prevent disease in humans or other animals, or otherwise enhance the physical or mental health of humans or animals. More specifically, the terms “drug”, “biologically active molecule”, “biologically active fragment”, “biologically active agent”, “active agent” and the like refer to insulin.

“Терапевтически активное количество” инсулина, как используют в описании, означает количество, достаточное для устранения, ослабления или частичного подавления клинических проявлений данного заболевания и его осложнений. Количество, достаточное для достижения указанных целей, определяют как “терапевтически эффективное количество”. Эффективные количества для каждой цели будут зависеть от тяжести заболевания или повреждения, а также массы тела и общего состояния субъекта. Понятно, что определение соответствующей дозировки может быть достигнуто посредством обычного эксперимента, путем построения матрицы величин и тестирования различных точек в матрице, которые находятся в компетенции квалифицированного врача.A “therapeutically active amount” of insulin, as used herein, means an amount sufficient to eliminate, attenuate, or partially suppress the clinical manifestations of the disease and its complications. An amount sufficient to achieve these goals is defined as a “therapeutically effective amount”. Effective amounts for each goal will depend on the severity of the disease or damage, as well as body weight and general condition of the subject. It is understood that the determination of the appropriate dosage can be achieved through a routine experiment, by constructing a matrix of values and testing various points in the matrix that are within the competence of a qualified physician.

“Стабильные” и “стабильность” означает, что в течение указанного времени хранения конъюгаты гидрогеля остаются конъюгированными и не гидролизуются в значительной степени и имеют приемлемый состав примесей относительно инсулина. Для того чтобы считаться стабильной, композиция должна содержать менее чем 5% лекарственного средства в его свободной форме.“Stable” and “stability” means that during the indicated storage time, the hydrogel conjugates remain conjugated and do not hydrolyze to a large extent and have an acceptable composition of impurities relative to insulin. In order to be considered stable, the composition must contain less than 5% of the drug in its free form.

Термин “фармацевтически приемлемый” означает, что он утвержден надзорным органом, таким как EMEA (Европа), и/или FDA (США), и/или любым другим национальным надзорным органом для использования у животных, предпочтительно у людей.The term “pharmaceutically acceptable” means that it is approved by a regulatory authority such as EMEA (Europe) and / or FDA (USA) and / or any other national regulatory authority for use in animals, preferably humans.

“Фармацевтическая композиция” или “композиция” означает один или более активных ингредиентов, а также любой продукт, который произведен, прямо или непрямо, в результате комбинирования, комплексообразования или агрегирования любых двух или более ингредиентов, или диссоциации одного или более ингредиентов, или в результате других типов реакций или взаимодействий одного или более ингредиентов. Соответственно, фармацевтические композиции настоящего изобретения охватывают любую композицию, приготовленную путем смешивания соединения согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемого наполнителя (фармацевтически приемлемого носителя).“Pharmaceutical composition” or “composition” means one or more active ingredients, as well as any product that is produced, directly or indirectly, by combining, complexing or aggregating any two or more ingredients, or dissociating one or more ingredients, or as a result other types of reactions or interactions of one or more ingredients. Accordingly, the pharmaceutical compositions of the present invention encompass any composition made by admixing a compound of the present invention and a pharmaceutically acceptable excipient (pharmaceutically acceptable carrier).

“Сухая композиция” означает, что композиция пролекарства инсулина с гидрогелем предоставлена в сухом виде в контейнере. Подходящими способами сушки являются сушка распылением и лиофилизация (сушка вымораживанием). Такая сухая композиция пролекарства инсулина с гидрогелем имеет остаточное содержание воды, составляющее максимум 10%, предпочтительно менее 5% и более предпочтительно менее 2% (определено согласно методу Карла Фишера). Предпочтительным способом сушки является лиофилизация. “Лиофилизированная композиция” означает, что композиция пролекарства инсулина с гидрогелевым полимером вначале была заморожена и затем подвергнута обработке путем снижения давления для уменьшения количества воды. Указанная терминология не исключает дополнительные стадии сушки, которые имеют место в процессе производства до заполнения композицией конечного контейнера.“Dry composition” means that the hydrogel insulin prodrug composition is provided dry in a container. Suitable drying methods are spray drying and lyophilization (freeze drying). Such a dry hydrogel insulin prodrug composition has a residual water content of at most 10%, preferably less than 5% and more preferably less than 2% (determined according to Karl Fischer method). A preferred drying method is lyophilization. “Lyophilized composition” means that the composition of the prodrug of insulin with a hydrogel polymer was first frozen and then processed by reducing pressure to reduce the amount of water. The indicated terminology does not exclude additional drying steps that take place during the production process before the composition is filled with the final container.

“Лиофилизация” (сушка вымораживанием) представляет собой процесс дегидратации, характеризующийся замораживанием композиции и затем снижением окружающего давления и, необязательно, подведением тепла, чтобы позволить замороженной в композиции воде сублимировать прямо из твердой фазы в газообразную. Обычно сублимированную воду собирают десублимацией.“Lyophilization” (freeze-drying) is a dehydration process characterized by freezing the composition and then lowering the ambient pressure and, optionally, adding heat to allow the water frozen in the composition to sublimate directly from the solid phase to the gaseous one. Usually freeze-dried water is collected by desublimation.

“Восстановление” означает добавление жидкости для восстановления первоначальной формы композиции.“Recovery” means adding liquid to restore the original form of the composition.

“Раствор для восстановления” относится к жидкости, используемой для восстановления сухой композиции пролекарства инсулина с гидрогелем для введения больному по необходимости.“Recovery solution" refers to a liquid used to reconstitute a dry hydrogel insulin prodrug composition for administration to a patient as needed.

“Контейнер” означает любой контейнер, в котором композиция пролекарства инсулина с гидрогелем содержится и может храниться до реконструкции.“Container” means any container in which a hydrogel insulin prodrug composition is contained and can be stored until reconstitution.

“Буфер” или “буферное средство” относится к химическим соединениям, которые поддерживают рН в желаемой области. Физиологически допустимыми буферами являются, например, фосфат натрия, сукцинат, гистидин, бикарбонат, цитрат и ацетат, сульфат, нитрат, хлорид, пируват. Антациды, такие как Mg(OH)₂ или ZnCO₃, также могут быть использованы. Буферную способность можно регулировать, чтобы подобрать условия, наиболее чувствительные к рН-стабильности.“Buffer” or “buffering agent” refers to chemical compounds that maintain pH in the desired region. Physiologically acceptable buffers are, for example, sodium phosphate, succinate, histidine, bicarbonate, citrate and acetate, sulfate, nitrate, chloride, pyruvate. Antacids such as Mg (OH) ₂ or ZnCO ₃ can also be used. The buffering ability can be adjusted to select the conditions most sensitive to pH stability.

Термин “наполнители” относится к соединениям, вводимым вместе с терапевтическим средством, например, буферные средства, модифицирующие изотоничность вещества, консерванты, стабилизирующие вещества, противопоглощающие средства, средства, защищающие от окисления, или другие дополнительные средства. Однако в некоторых случаях один наполнитель может иметь двойную или тройную функции.The term “excipients” refers to compounds administered together with a therapeutic agent, for example, buffering agents, isotonicity modifying agents, preservatives, stabilizing agents, anti-absorbing agents, anti-oxidation agents, or other additional agents. However, in some cases, one filler may have double or triple functions.

“Лиопротектант” является молекулой, которая при комбинировании с интересующим белком существенно предотвращает или снижает химическую и/или физическую нестабильность белка при сушке вообще и, особенно, в течение лиофилизации и последующего хранения. Примеры средств, защищающих при сушке, включают сахара, такие как сахароза или трегалоза; аминокислоты, такие как аргинин, глицин, глутамат или гистидин; метиламины, такие как бетаин; соли с лиотропным действием, такие как сульфат магния; полиолы, такие как трехатомные или высшие сахарные спирты, например, глицерин, эритрит, глицерол, арабит, ксилит, сорбит и маннит; этиленгликоль; пропиленгликоль; полиэтиленгликоль; плюроник; гидроксиалкиловые крахмалы, например, гидроксиэтилкрахмал (HES), и их комбинации.A “lyoprotectant” is a molecule which, when combined with a protein of interest, substantially prevents or reduces the chemical and / or physical instability of the protein during drying in general and, especially, during lyophilization and subsequent storage. Examples of drying preservatives include sugars such as sucrose or trehalose; amino acids such as arginine, glycine, glutamate or histidine; methylamines such as betaine; salts with lyotropic action, such as magnesium sulfate; polyols, such as trihydric or higher sugar alcohols, for example, glycerol, erythritol, glycerol, arabitol, xylitol, sorbitol and mannitol; ethylene glycol; propylene glycol; polyethylene glycol; pluronic; hydroxyalkyl starches, for example, hydroxyethyl starch (HES), and combinations thereof.

“Поверхностно-активное вещество” относится к смачивающим средствам, которые снижают поверхностное натяжение жидкости.“Surfactant” refers to wetting agents that reduce the surface tension of a liquid.

“Изменяющие изотоничность средства” относятся к соединениям, снижающим до минимума боль, которая может возникать в результате повреждения клетки из-за разницы в осмотическом давлении при инъекции депо-препарата.“Isotonicity modifying agents” refers to compounds that minimize pain that may occur as a result of cell damage due to the difference in osmotic pressure during injection of the depot preparation.

Термин “стабилизирующие средства” относится к соединениям, используемым для стабилизации полимерного пролекарства. Стабилизация достигается путем упрочнения сил, стабилизирующих белок, путем дестабилизации состояния денатурации или путем прямого связывания наполнителей с белком.The term “stabilizing agents” refers to compounds used to stabilize a polymer prodrug. Stabilization is achieved by strengthening the forces stabilizing the protein, by destabilizing the state of denaturation, or by directly binding the excipients to the protein.

“Противопоглощающие средства” относится, главным образом, к ионным или неионным поверхностно-активным веществам или другим белкам или растворимым полимерам, используемым, чтобы покрыть или адсорбироваться конкурентно на внутренней поверхности контейнера с композицией. Выбранная концентрация и тип наполнителя зависят от эффекта, которого следует избегать, но обычно монослой поверхностно-активного вещества образуется у поверхности раздела как раз выше величины CMC.“Anti-absorbing agents” refers primarily to ionic or non-ionic surfactants or other proteins or soluble polymers used to coat or adsorb competitively on the inner surface of the composition container. The concentration and type of filler chosen depends on the effect to be avoided, but usually a surfactant monolayer forms at the interface just above the CMC.

“Средства, защищающие от окисления” относится к антиоксидантам, таким как аскорбиновая кислота, эктоин, глутатион, метионин, тиоглицерин, морин, полиэтиленимин (PEI), пропилгаллат, витамин E, хелатирующим средствам, таким как лимонная кислота, ЭДТА, гексафосфат, меркаптоуксусная кислота.“Anti-oxidation agents” refers to antioxidants such as ascorbic acid, ectoin, glutathione, methionine, thioglycerol, morin, polyethyleneimine (PEI), propyl gallate, vitamin E, chelating agents such as citric acid, EDTA, hexaphosphate, mercaptoacetic acid .

“Противомикробные средства” относится к химическому веществу, которое убивает или ингибирует рост микроорганизмов, таких как бактерии, грибы, дрожжи, простейшие и/или разрушает вирусы.“Antimicrobial agents” refers to a chemical that kills or inhibits the growth of microorganisms, such as bacteria, fungi, yeast, protozoa, and / or destroys viruses.

“Герметизация контейнера” означает, что контейнер закрывают таким образом, что он становится воздухонепроницаемым, не допуская обмен газа между наружной и внутренней частью и оставляя содержимое стерильным.“Container sealing” means that the container is closed in such a way that it becomes airtight, preventing the exchange of gas between the outer and inner parts and leaving the contents sterile.

Термин “реагент” или “предшественник” относится к промежуточному соединению или исходному материалу, используемому в способе комбинирования, приводящему к пролекарству согласно настоящему изобретению.The term “reagent” or “precursor” refers to an intermediate or starting material used in a combination method leading to a prodrug of the present invention.

Термин “химическая функциональная группа” относится к карбоновой кислоте и активированным производным, амино, малеимиду, тиолу и производным, сульфоновой кислоте и производным, карбонату и производным, карбамату и производным, гидроксилу, альдегиду, кетону, гидразину, изоцианату, изотиоцианату, фосфорной кислоте и производным, фосфоновой кислоте и производным, галогенацетилу, галогеналкилам, акрилоилу и другим альфа-бета ненасыщенным акцепторам Михаэля, арилирующим средствам, подобным арилфторидам, гидроксиламину, дисульфидам, подобным пиридилдисульфиду, винилсульфону, винилкетону, диазоалканам, диазоацетильным соединениям, оксирану и азиридину.The term “chemical functional group” refers to a carboxylic acid and an activated derivative, amino, maleimide, thiol and derivatives, sulfonic acid and derivatives, carbonate and derivatives, carbamate and derivatives, hydroxyl, aldehyde, ketone, hydrazine, isocyanate, isothiocyanate, phosphoric acid and derivatives, phosphonic acid and derivatives, haloacetyl, haloalkyls, acryloyl and other alpha-beta unsaturated Michael acceptors, arylating agents like aryl fluorides, hydroxylamine, disulfides, like pyridyl disulfide, vinyl sulfone, vinyl ketone, diazoalkanes, diazoacetyl compounds, oxirane and aziridine.

Если химическая функциональная группа соединена с другой химической функциональной группой, образовавшаяся химическая структура названа “связью”. Например, реакция аминогруппы с карбоксильной группой приводит к образованию амидной связи.If a chemical functional group is connected to another chemical functional group, the resulting chemical structure is called a “bond”. For example, the reaction of an amino group with a carboxyl group leads to the formation of an amide bond.

“Реакционноспособные функциональные группы” являются химическими функциональными группами фрагмента каркаса, которые соединены с гиперразветвленным фрагментом.“Reactive functional groups” are chemical functional groups of a backbone fragment that are linked to a hyperbranched fragment.

“Функциональная группа” представляет собой собирательное понятие, используемое для “реакционноспособной функциональной группы”, “разрушаемой взаимосвязанной функциональной группы”, или “функциональной группы конъюгата”.A “functional group” is a collective term used for a “reactive functional group”, a “destructible interconnected functional group”, or a “conjugate functional group”.

“Разрушаемая взаимосвязанная функциональная группа” является связью, включающей биоразрушаемую связь, которая с одной стороны связана с фрагментом спейсера, соединенным с фрагментом каркаса, и с другой стороны соединена с фрагментом сшивающего реагента. Термины “разрушаемая взаимосвязанная функциональная группа”, “биоразрушаемая взаимосвязанная функциональная группа”, “взаимосвязанная биоразрушаемая функциональная группа” и “взаимосвязанная функциональная группа” используют как синонимы.A “destructible interconnected functional group” is a bond comprising a biodegradable bond which, on the one hand, is connected to a spacer moiety connected to a carcass fragment, and on the other hand, is connected to a cross-linking reagent fragment. The terms “destructible interconnected functional group”, “biodegradable interconnected functional group”, “interconnected biodegradable functional group” and “interconnected functional group” are used synonymously.

Термины “блокирующая группа” или “закрывающая группа” используются как синонимы и относятся к фрагментам, которые необратимо связаны с реакционноспособными функциональными группами, чтобы сделать их неспособными взаимодействовать, например, с химическими функциональными группами.The terms “blocking group” or “closing group” are used synonymously and refer to fragments that are irreversibly linked to reactive functional groups to render them unable to interact, for example, with chemical functional groups.

Термины “защищающая группа” или “защитная группа” относятся к фрагменту, который необратимо соединен с реакционноспособными функциональными группами, чтобы сделать их неспособными взаимодействовать, например, с другими химическими функциональными группами.The terms “protecting group” or “protecting group” refer to a moiety that is irreversibly linked to reactive functional groups to render them unable to interact, for example, with other chemical functional groups.

Термин “взаимосоединяемая функциональная группа” относится к химическим функциональным группам, которые принимают участие в реакции радикальной полимеризации и являются частью сшивающего средства или каркасного реагента.The term “interconnected functional group” refers to chemical functional groups that participate in a radical polymerization reaction and are part of a crosslinking agent or framework reagent.

Термин “полимеризуемая функциональная группа” относится к химическим функциональным группам, которые принимают участие в реакции типа лигирования и являются частью сшивающего реагента и каркасного реагента.The term “polymerizable functional group” refers to chemical functional groups that take part in a ligation type reaction and are part of a crosslinking reagent and a frame reagent.

Фрагмент каркаса может включать фрагмент спейсера, который с одного конца соединен с фрагментом каркаса и с другой стороны со сшивающим фрагментом.A fragment of the frame may include a fragment of a spacer, which is connected at one end to a fragment of the frame and, on the other hand, to a crosslinking fragment.

Термин “производные” относится к химическим функциональным группам, подходяще замещенным защитными и/или активирующими группами, или к активированным формам соответствующей химической функциональной группы, которые известны специалисту в данной области. Например, активированные формы карбоксильных групп включают, но не ограничиваются ими, активированные сложные эфиры, такие как сукцинимидильный эфир, бензотриазильный эфир, нитрофенильный эфир, пентафторфенильный эфир, азабензотриазильный эфир, ацилгалогениды, смешанные или симметричные ангидриды, ацилимидазол.The term “derivatives” refers to chemical functional groups suitably substituted with protecting and / or activating groups, or to activated forms of the corresponding chemical functional group that are known to one skilled in the art. For example, activated forms of carboxyl groups include, but are not limited to, activated esters such as succinimidyl ether, benzotriazyl ether, nitrophenyl ether, pentafluorophenyl ether, azabenzotriazyl ether, acyl halides, mixed or symmetric anhydrides, acylimidazole.

Термин “линкер, расщепляемый неферментативным путем”, относится к линкерам, которые гидролитически разрушаются при физиологических условиях без ферментативной активности. “Биологически неактивный линкер” означает линкер, который не проявляет фармакологические эффекты лекарственного средства (D-H), произведенного из биологически активного фрагмента.The term “non-enzymatically cleavable linker” refers to linkers that are hydrolytically destroyed under physiological conditions without enzymatic activity. “Biologically inactive linker” means a linker that does not exhibit the pharmacological effects of a drug (D-H) derived from a biologically active fragment.

Термины “спейсер”, “спейсерная группа”, “молекула спейсера” и “спейсерный фрагмент” используют взаимозаменяемо, и если используют для описания фрагмента, присутствующего в гидрогельном носителе согласно изобретению, относятся к любому фрагменту, подходящему для соединения двух фрагментов, такому как C_1-50алкил, C_2-50алкенил или C_2-50алкинил, который фрагмент необязательно прерывается одной или более группами, выбранными из -NH-, -N(C_1-4алкил)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)NH-, -C(O)N(C_1-4алкил)-, -O-C(O)-, -S(O)-, -S(O)₂-, 4-7-членного гетероциклила, фенила или нафтила.The terms “spacer”, “spacer group”, “spacer molecule” and “spacer fragment” are used interchangeably, and if used to describe a fragment present in a hydrogel carrier according to the invention, refers to any fragment suitable for joining two fragments, such as C _1-50 alkyl, C _2-50 alkenyl or C _2-50 alkynyl, which moiety is optionally interrupted by one or more groups selected from -NH-, -N (C _1-4 alkyl) -, -O-, -S- , -C (O) -, -C (O) NH-, -C (O) N (C _1-4 alkyl) -, -OC (O) -, -S (O) -, -S (O) _2- , 4-7 membered heterocyclyl, phenyl or naphthyl.

Термины “концевой”, “конец” или “дальний конец” относятся к положению функциональной группы или связи в молекуле или фрагменте, тем самым такая функциональная группа может быть химической функциональной группой, и связь может быть разрушаемой или устойчивой связью, характеризующейся тем, что она локализована рядом со структурой связи или в структуре связи между двумя фрагментами или на конце олигомерной или полимерной цепи.The terms “terminal”, “end” or “far end” refer to the position of a functional group or bond in a molecule or fragment, thereby such a functional group may be a chemical functional group, and the bond may be a destructible or stable bond, characterized in that it localized next to the bond structure or in the bond structure between two fragments or at the end of an oligomeric or polymer chain.

Фразы “в связанном виде” или “фрагмент” относятся к субструктурам, которые являются частью большей молекулы. Фразу “в связанном виде” используют, чтобы упростить ссылку на фрагменты при именовании или перечислении реагентов, исходных материалов или гипотетических исходных материалов, хорошо известных в данной области, и тем самым, “в связанном виде” означает, что, например, один или более радикалов водорода (-H), или одна или более активирующих или защитных групп, имеющихся в реагентах или исходных материалах, не присутствуют во фрагменте.The phrases “bound” or “fragment” refer to substructures that are part of a larger molecule. The phrase “bound” is used to simplify the reference to fragments when naming or listing reagents, starting materials or hypothetical starting materials well known in the art, and thereby, “bound” means that, for example, one or more hydrogen radicals (—H), or one or more activating or protecting groups present in the reactants or starting materials are not present in the fragment.

Понятно, что все реагенты и фрагменты, содержащие полимерные фрагменты, относятся к макромолекулярным структурам, которые, как известно, проявляют вариабельности в отношении молекулярной массы, длины цепи или степени полимеризации или числа функциональных групп. Структуры, показанные для каркасных реагентов, каркасных фрагментов, сшивающих реагентов и сшивающих фрагментов, являются только характерными примерами.It is understood that all reagents and fragments containing polymer fragments are macromolecular structures that are known to exhibit variability with respect to molecular weight, chain length or degree of polymerization or number of functional groups. The structures shown for frame reagents, frame fragments, crosslinking reagents and crosslinking fragments are only representative examples.

Реагент или фрагмент может быть линейным или разветвленным. Если реагент или фрагмент имеет две концевые группы, его называют линейным реагентом или фрагментом. Если реагент или фрагмент имеет более двух концевых групп, его рассматривают как разветвленный или многофункциональный реагент или фрагмент.The reagent or fragment may be linear or branched. If the reagent or fragment has two end groups, it is called a linear reagent or fragment. If the reagent or fragment has more than two end groups, it is considered as a branched or multifunctional reagent or fragment.

Термин “полимерная цепь, основанная на поли(этиленгликоле)” или “ПЭГ-основанная цепь” относится к олиго- или полимерной молекулярной цепи.The term “poly (ethylene glycol) based polymer chain” or “PEG based chain” refers to an oligo or polymer molecular chain.

Предпочтительно, такая полимерная цепь, основанная на поли(этиленгликоле), связана с разветвленной сердцевиной, она является линейной поли(этиленгликолевой) цепью, у которой один конец соединен с разветвленной сердцевиной и другой конец соединен с гиперразветвленным дендритным фрагментом. Понятно, что ПЭГ-основанная цепь может заканчиваться или прерываться алкильными или арильными группами, необязательно замещенными гетероатомами и химическими функциональными группами.Preferably, such a poly (ethylene glycol) based polymer chain is bonded to a branched core, it is a linear poly (ethylene glycol) chain in which one end is connected to a branched core and the other end is connected to a hyperbranched dendritic moiety. It is understood that the PEG-based chain may terminate or be interrupted by alkyl or aryl groups optionally substituted with heteroatoms and chemical functional groups.

Если термин “полимерная цепь, основанная на поли(этиленгликоле)” используется при ссылке на сшивающий реагент, он относится к сшивающему фрагменту или цепи, содержащим по меньшей мере 20% масс. этиленгликолевых фрагментов.If the term “polymer chain based on poly (ethylene glycol)” is used when referring to a crosslinking reagent, it refers to a crosslinking fragment or chain containing at least 20% of the mass. ethylene glycol fragments.

Предпочтительно в формуле (I) группа R² заменена L²-Z.Preferably in formula (I), the group R ^{2 is} replaced by L ² -Z.

Предпочтительно в формуле (I) группа R¹ заменена L²-Z.Preferably in formula (I), the group R ^{1 is} replaced by L ² -Z.

Предпочтительно в формуле (I) Х является N(R³).Preferably in the formula (I) X is N (R ³ ).

Предпочтительно в формуле (I) Х является C(R³R^3a) и R^3a является N(R^2b)C(O)R⁴.Preferably in formula (I) X is C (R ³ R ^3a ) and R ^3a is N (R ^2b ) C (O) R ⁴ .

Предпочтительно в формуле (I) Х является C(R³R^3a) и группа R^3a заменена L²-Z.Preferably in formula (I) X is C (R ³ R ^3a ) and the group R ^{3a is} replaced by L ² -Z.

Предпочтительно X является C(R³R^3a), R^3a является N(R^2b)-L²-Z.Preferably X is C (R ³ R ^3a ), R ^3a is N (R ^2b ) -L ² -Z.

Предпочтительные пролекарства согласно настоящему изобретению содержат конъюгат инсулина с линкером D-L, где группа L¹ формулы (I) представлена формулами (Ia), (Ib), (Ic) или (Id):Preferred prodrugs of the present invention comprise an insulin conjugate DL linker, wherein the L ¹ group ^of formula (I) is represented by formulas (Ia), (Ib), (Ic) or (Id):

где R¹, R^1a, R², R^2a, R^2b, R³, R⁴, L², Z имеют значение, как указано в описании, и где группа L¹ необязательно также замещена, при условии, что водород, отмеченный звездочкой в формуле от (Ia) до (Id), не заменен заместителем.where R ¹ , R ^1a , R ² , R ^2a , R ^2b , R ³ , R ⁴ , L ² , Z are as defined herein, and where the group L ^{1 is} optionally also substituted, provided that the hydrogen marked an asterisk in the formula (Ia) to (Id) is not substituted with a substituent.

Предпочтительно группа L¹ также не замещена (за исключением обязательного заместителя L²-Z).Preferably, the group L ^{1 is} also not substituted (except for the optional substituent L ² -Z).

Предпочтительно фрагмент инсулина соединен с L¹ через азот N^αА1 или через азот боковой цепи лизина фрагмента инсулина.Preferably, the insulin fragment is coupled to L ¹ via nitrogen N ^αA1 or through the nitrogen of the lysine side chain of the insulin fragment.

Предпочтительно фрагмент инсулина является рекомбинантным человеческим инсулином.Preferably, the insulin fragment is recombinant human insulin.

Как показано, например, в формулах от (Ia) до (Id) один атом водорода заменен группой L²-Z.As shown, for example, in formulas (Ia) to (Id), one hydrogen atom is replaced by a group L ² -Z.

В общем, группа L² может быть соединена с L¹ у любого положения, за исключением замены водорода, отмеченного звездочкой в формуле (I). Предпочтительно, один из атомов водорода, представленных R¹, R^1a, R², R^2a, R^2b, R³, R^3a, R⁴, непосредственно или как атом водорода C_1-4алкила или других групп заменен L²-Z.In general, the L ² group can be connected to L ¹ at any position, with the exception of the hydrogen substitution indicated by an asterisk in formula (I). Preferably, one of the hydrogen atoms represented by R ¹ , R ^1a , R ² , R ^2a , R ^2b , R ³ , R ^3a , R ⁴ directly or as a hydrogen atom of C _1-4 alkyl or other groups is replaced by L ² -Z .

Кроме того, группа L¹ может быть необязательно также замещена. Вообще, любой заместитель может быть использован, поскольку принцип расщепления не действует. Однако предпочтительно, что группа L¹ также не замещена.In addition, the group L ¹ may optionally also be substituted. In general, any substituent may be used since the principle of cleavage does not apply. However, it is preferable that the group L ^{1 is} also not substituted.

Предпочтительно, один или более другие необязательные заместители независимо выбирают из группы, состоящей из галогена; CN; COOR⁹; OR⁹; C(O)R⁹; C(O)N(R⁹R^9a); S(O)₂N(R⁹R^9a); S(O)N(R⁹R^9a); S(O)₂R⁹; S(O)R⁹; N(R⁹)S(O)₂N(R^9aR^9b); SR⁹; N(R⁹R^9a); NO₂; OC(O)R⁹; N(R⁹)C(O)R^9a; N(R⁹)S(O)₂R^9a; N(R⁹)S(O)R^9a; N(R⁹)C(O)OR^9a; N(R⁹)C(O)N(R^9aR^9b); OC(O)N(R⁹R^9a); T; C_1-50алкила; C_2-50алкенила; или C_2-50алкинила, где T, C_1-50алкил, C_2-50алкенил и C_2-50алкинил необязательно замещены одной или более группами R¹⁰, которые являются одинаковыми или различными, и где C_1-50алкил, C_2-50алкенил и C_2-50алкинил необязательно прерваны одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из T, -C(O)O-; -О-; -C(O)-; -C(O)N(R¹¹)-; - S(O)₂N(R¹¹)-; -S(O)N(R¹¹)-; -S(O)₂-; -S(O)-; -N(R¹¹)S(O)₂N(R^11a); -S-; -N(R¹¹)-; -OC(O)R¹¹; -N(R¹¹)C(O)-; -N(R¹¹)S(O)₂-; -N(R¹¹)S(O)-; -N(R¹¹)C(O)O-; -N(R¹¹)C(O)N(R^11a)- и -OC(O)N(R¹¹R^11a);Preferably, one or more other optional substituents are independently selected from the group consisting of halogen; CN; COOR ⁹ ; OR ⁹ ; C (O) R ⁹ ; C (O) N (R ⁹ R ^9a ); S (O) ₂ N (R ⁹ R ^9a ); S (O) N (R ⁹ R ^9a ); S (O) ₂ R ⁹ ; S (O) R ⁹ ; N (R ⁹ ) S (O) ₂ N (R ^9a R ^9b ); SR ⁹ ; N (R ⁹ R ^9a ); NO ₂ ; OC (O) R ⁹ ; N (R ⁹ ) C (O) R ^9a ; N (R ⁹ ) S (O) ₂ R ^9a ; N (R ⁹⁾ S (O) R ^9a; N (R ⁹ ) C (O) OR ^9a ; N (R ⁹ ) C (O) N (R ^9a R ^9b ); OC (O) N (R ⁹ R ^9a ); T; C _1-50 alkyl; C _2-50 alkenyl; or C _2-50 alkynyl, where T, C _1-50 alkyl, C _2-50 alkenyl and C _2-50 alkynyl are optionally substituted with one or more R ¹⁰ groups that are the same or different, and where C _1-50 alkyl, C _2-50 alkenyl and C _2-50 alkynyl are optionally interrupted by one or more groups selected from the group consisting of T, -C (O) O-; -ABOUT-; -C (O) -; -C (O) N (R ¹¹ ) -; - S (O) ₂ N (R ¹¹ ) -; -S (O) N (R ¹¹ ) -; -S (O) ₂ -; -S (O) -; -N (R ¹¹ ) S (O) ₂ N (R ^11a ); -S-; -N (R ¹¹ ) -; -OC (O) R ¹¹ ; -N (R ¹¹ ) C (O) -; -N (R ¹¹ ) S (O) ₂ -; -N (R ¹¹ ) S (O) -; -N (R ¹¹ ) C (O) O-; -N (R ¹¹ ) C (O) N (R ^11a ) - and -OC (O) N (R ¹¹ R ^11a );

R⁹, R^9a, R^9b независимо выбирают из группы, состоящей из H, T и C_1-50алкила, C_2-50алкенила или C_2-50алкинила, где T, C_1-50алкил, C_2-50алкенил и C_2-50алкинил необязательно замещены одной или более группами R¹⁰, которые являются одинаковыми или различными, и где C_1-50алкил, C_2-50алкенил и C_2-50алкинил необязательно прерваны одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из T, -C(O)O-; -О-; -C(O)-; -C(O)N(R¹¹)-; - S(O)₂N(R¹¹)-; -S(O)N(R¹¹)-; -S(O)₂-; -S(O)-; -N(R¹¹)S(O)₂N(R^11a); -S-; -N(R¹¹)-; -OC(O)R¹¹; -N(R¹¹)C(O)-; - N(R¹¹)S(O)₂-; -N(R¹¹)S(O)-; -N(R¹¹)C(O)O-; -N(R¹¹)C(O)N(R^11a)- и -OC(O)N(R¹¹R^11a);R ⁹ , R ^9a , R ^{9b are} independently selected from the group consisting of H, T and C _1-50 alkyl, C _2-50 alkenyl or C _2-50 alkynyl, where T, C _1-50 alkyl, C _2-50 alkenyl and C _2-50 alkynyl are optionally substituted with one or more R ¹⁰ groups that are the same or different, and where C _1-50 alkyl, C _2-50 alkenyl and C _2-50 alkynyl are optionally interrupted by one or more groups selected from a group consisting of T, —C (O) O—; -ABOUT-; -C (O) -; -C (O) N (R ¹¹ ) -; - S (O) ₂ N (R ¹¹ ) -; -S (O) N (R ¹¹ ) -; -S (O) ₂ -; -S (O) -; -N (R ¹¹ ) S (O) ₂ N (R ^11a ); -S-; -N (R ¹¹ ) -; -OC (O) R ¹¹ ; -N (R ¹¹ ) C (O) -; - N (R ¹¹ ) S (O) ₂ -; -N (R ¹¹ ) S (O) -; -N (R ¹¹ ) C (O) O-; -N (R ¹¹ ) C (O) N (R ^11a ) - and -OC (O) N (R ¹¹ R ^11a );

Т выбирают из группы, состоящей из фенила; нафтила; инденила; инданила; тетралинила; C_3-10циклоалкила; 4-7-членного гетероциклила или 9-11-членного гетеробициклила, где группа T необязательно замещена одной или более группами R¹⁰, которые являются одинаковыми или различными;T is selected from the group consisting of phenyl; naphthyl; indenyl; indanil; tetralinyl; C _3-10 cycloalkyl; 4-7 membered heterocyclyl or 9-11 membered heterobicyclyl, wherein the T group is optionally substituted with one or more R ¹⁰ groups that are the same or different;

R¹⁰ означает галоген; CN; оксо (=О); COOR¹²; OR¹²; C(O)R¹²; C(O)N(R¹²R^12a); S(O)₂N(R¹²R^12a); S(O)N(R¹²R^12a); S(O)₂R¹²; S(O)R¹²; N(R¹²)S(O)₂N(R^12aR^12b); SR¹²; N(R¹²R^12a); NO₂; OC(O)R¹²; N(R¹²)C(O)R^12a; N(R¹²)S(O)₂R^12a; N(R¹²)S(O)R^12a; N(R¹²)C(O)OR^12a; N(R¹²)C(O)N(R^12aR^12b); OC(O)N(R¹²R^12a); или C_1-6алкил, где C_1-6алкил необязательно замещен одним или более галогенами, которые являются одинаковыми или различными;R ¹⁰ means halogen; CN; oxo (= O); COOR ¹² ; OR ¹² ; C (O) R ¹² ; C (O) N (R ¹² R ^12a ); S (O) ₂ N (R ¹² R ^12a ); S (O) N (R ¹² R ^12a ); S (O) ₂ R ¹² ; S (O) R ¹² ; N (R ¹² ) S (O) ₂ N (R ^12a R ^12b ); SR ¹² ; N (R ¹² R ^12a ); NO ₂ ; OC (O) R ^12; N (R ¹² ) C (O) R ^12a ; N (R ¹² ) S (O) ₂ R ^12a ; N (R ¹² ) S (O) R ^12a ; N (R ¹² ) C (O) OR ^12a ; N (R ¹² ) C (O) N (R ^12a R ^12b ); OC (O) N (R ¹² R ^12a ); or C _1-6 alkyl, wherein C _1-6 alkyl is optionally substituted with one or more halogens that are the same or different;

R¹¹, R^11a, R¹², R^12a, R^12b независимо выбирают из группы, состоящей из H или C_1-6алкила, где C_1-6алкил необязательно замещен одним или более галогенами, которые являются одинаковыми или различными.R ¹¹ , R ^11a , R ¹² , R ^12a , R ^{12b are} independently selected from the group consisting of H or C _1-6 alkyl, where C _1-6 alkyl is optionally substituted with one or more halogens that are the same or different.

Термин “прерванная цепь” означает, что между двумя углеродами или на конце углеродной цепи между углеродом и водородом вставлена группа.The term “broken chain” means that a group is inserted between two carbons or at the end of a carbon chain between carbon and hydrogen.

L² является простой химической связью или спейсером. В случае когда L² является спейсером, предпочтительно определение как один или более заместители, указанные выше, при условии, что группа L² замещена Z.L ² is a simple chemical bond or spacer. In the case where L ² is a spacer, it is preferable to define as one or more of the substituents indicated above, provided that the group L ^{2 is} substituted by Z.

Соответственно, когда L² является группой, отличной от простой химической связи, L²-Z означает COOR⁹; OR⁹; C(O)R⁹; C(O)N(R⁹R^9a); S(O)₂N(R⁹R^9a); S(O)N(R⁹R^9a); S(O)₂R⁹; S(O)R⁹; N(R⁹)S(O)₂N(R^9aR^9b); SR⁹; N(R⁹R^9a); OC(O)R⁹; N(R⁹)C(O)R^9a; N(R⁹)S(O)₂R^9a; N(R⁹)S(O)R^9a; N(R⁹)C(O)OR^9a; N(R⁹)C(O)N(R^9aR^9b); OC(O)N(R⁹R^9a); T; C_1-50алкил; C_2-50алкенил или C_2-50алкинил, где T, C_1-50алкил, C_2-50алкенил и C_2-50алкинил необязательно замещены одной или более группами R¹⁰, которые являются одинаковыми или различными, и где C_1-50алкил, C_2-50алкенил и C_2-50алкинил необязательно прерваны одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из -T-; -C(O)O-; -О-; -C(O)-; -C(O)N(R¹¹)-; - S(O)₂N(R¹¹)-; -S(O)N(R¹¹)-; -S(O)₂-; -S(O)-; -N(R¹¹)S(O)₂N(R^11a); -S-; -N(R¹¹)-; -OC(O)R¹¹; -N(R¹¹)C(O)-; -N(R¹¹)S(O)₂-; -N(R¹¹)S(O)-; -N(R¹¹)C(O)O-; -N(R¹¹)C(O)N(R^11a)- и -OC(O)N(R¹¹R^11a);Accordingly, when L ² is a group other than a simple chemical bond, L ² -Z is COOR ⁹ ; OR ⁹ ; C (O) R ⁹ ; C (O) N (R ⁹ R ^9a ); S (O) ₂ N (R ⁹ R ^9a ); S (O) N (R ⁹ R ^9a ); S (O) ₂ R ⁹ ; S (O) R ⁹ ; N (R ⁹ ) S (O) ₂ N (R ^9a R ^9b ); SR ⁹ ; N (R ⁹ R ^9a ); OC (O) R ⁹ ; N (R ⁹ ) C (O) R ^9a ; N (R ⁹ ) S (O) ₂ R ^9a ; N (R ⁹⁾ S (O) R ^9a; N (R ⁹ ) C (O) OR ^9a ; N (R ⁹ ) C (O) N (R ^9a R ^9b ); OC (O) N (R ⁹ R ^9a ); T; C _1-50 alkyl; C _2-50 alkenyl or C _2-50 alkynyl, where T, C _1-50 alkyl, C _2-50 alkenyl and C _2-50 alkynyl are optionally substituted with one or more R ¹⁰ groups that are the same or different, and where C _1-50 alkyl, C _2-50 alkenyl and C _2-50 alkynyl are optionally interrupted by one or more groups selected from the group consisting of -T-; -C (O) O-; -ABOUT-; -C (O) -; -C (O) N (R ¹¹ ) -; - S (O) ₂ N (R ¹¹ ) -; -S (O) N (R ¹¹ ) -; -S (O) ₂ -; -S (O) -; -N (R ¹¹ ) S (O) ₂ N (R ^11a ); -S-; -N (R ¹¹ ) -; -OC (O) R ¹¹ ; -N (R ¹¹ ) C (O) -; -N (R ¹¹ ) S (O) ₂ -; -N (R ¹¹ ) S (O) -; -N (R ¹¹ ) C (O) O-; -N (R ¹¹ ) C (O) N (R ^11a ) - and -OC (O) N (R ¹¹ R ^11a );

R⁹, R^9a, R^9b независимо выбирают из группы, состоящей из H; Z; T; и C_1-50алкила, C_2-50алкенила или C_2-50алкинила, где T; C_1-50алкил, C_2-50алкенил и C_2-50алкинил необязательно замещены одной или более группами R¹⁰, которые являются одинаковыми или различными, и где C_1-50алкил, C_2-50алкенил и C_2-50алкинил необязательно прерваны одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из T; -C(O)O-; -О-; -C(O)-; -C(O)N(R¹¹)-; - S(O)₂N(R¹¹)-; -S(O)N(R¹¹)-; -S(O)₂-; -S(O)-; -N(R¹¹)S(O)₂N(R^11a); -S-; -N(R¹¹)-; -OC(O)R¹¹; -N(R¹¹)C(O)-; - N(R¹¹)S(O)₂-; -N(R¹¹)S(O)-; -N(R¹¹)C(O)O-; -N(R¹¹)C(O)N(R^11a)- и -OC(O)N(R¹¹R^11a);R ⁹ , R ^9a , R ^{9b are} independently selected from the group consisting of H; Z; T; and C _1-50 alkyl, C _2-50 alkenyl or C _2-50 alkynyl, where T; C _1-50 alkyl, C _2-50 alkenyl and C _2-50 alkynyl are optionally substituted with one or more R ¹⁰ groups that are the same or different, and where C _1-50 alkyl, C _2-50 alkenyl and C _2-50 alkynyl is optionally interrupted by one or more groups selected from the group consisting of T; -C (O) O-; -ABOUT-; -C (O) -; -C (O) N (R ¹¹ ) -; - S (O) ₂ N (R ¹¹ ) -; -S (O) N (R ¹¹ ) -; -S (O) ₂ -; -S (O) -; -N (R ¹¹ ) S (O) ₂ N (R ^11a ); -S-; -N (R ¹¹ ) -; -OC (O) R ¹¹ ; -N (R ¹¹ ) C (O) -; - N (R ¹¹ ) S (O) ₂ -; -N (R ¹¹ ) S (O) -; -N (R ¹¹ ) C (O) O-; -N (R ¹¹ ) C (O) N (R ^11a ) - and -OC (O) N (R ¹¹ R ^11a );

Т выбирают из группы, состоящей из фенила; нафтила; инденила; инданила; тетралинила; C_3-10циклоалкила; 4-7-членного гетероциклила; или 9-11-членного гетеробициклила, где группа T необязательно замещена одной или более группами R¹⁰, которые являются одинаковыми или различными;T is selected from the group consisting of phenyl; naphthyl; indenyl; indanil; tetralinyl; C _3-10 cycloalkyl; 4-7 membered heterocyclyl; or a 9-11 membered heterobicyclyl, wherein the T group is optionally substituted with one or more R ¹⁰ groups that are the same or different;

R¹⁰ означает Z; галоген; CN; оксо (=О); COOR¹²; OR¹²; C(O)R¹²; C(O)N(R¹²R^12a); S(O)₂N(R¹²R^12a); S(O)N(R¹²R^12a); S(O)₂R¹²; S(O)R¹²; N(R¹²)S(O)₂N(R^12aR^12b); SR¹²; N(R¹²R^12a); NO₂; OC(O)R¹²; N(R¹²)C(O)R^12a; N(R¹²)S(O)₂R^12a; N(R¹²)S(O)R^12a; N(R¹²)C(O)OR^12a; N(R¹²)C(O)N(R^12aR^12b); OC(O)N(R¹²R^12a); или C_1-6алкил, где C_1-6алкил необязательно замещен одним или более галогенами, которые являются одинаковыми или различными;R ¹⁰ means Z; halogen; CN; oxo (= O); COOR ¹² ; OR ¹² ; C (O) R ¹² ; C (O) N (R ¹² R ^12a ); S (O) ₂ N (R ¹² R ^12a ); S (O) N (R ¹² R ^12a ); S (O) ₂ R ¹² ; S (O) R ¹² ; N (R ¹² ) S (O) ₂ N (R ^12a R ^12b ); SR ¹² ; N (R ¹² R ^12a ); NO ₂ ; OC (O) R ^12; N (R ¹² ) C (O) R ^12a ; N (R ¹² ) S (O) ₂ R ^12a ; N (R ¹² ) S (O) R ^12a ; N (R ¹² ) C (O) OR ^12a ; N (R ¹² ) C (O) N (R ^12a R ^12b ); OC (O) N (R ¹² R ^12a ); or C _1-6 alkyl, wherein C _1-6 alkyl is optionally substituted with one or more halogens that are the same or different;

R¹¹, R^11a, R¹², R^12a, R^12b независимо выбирают из группы, состоящей из H; Z; или C_1-6алкила, где C_1-6алкил необязательно замещен одним или более галогенами, которые являются одинаковыми или различными;R ¹¹ , R ^11a , R ¹² , R ^12a , R ^{12b are} independently selected from the group consisting of H; Z; or C _1-6 alkyl, wherein C _1-6 alkyl is optionally substituted with one or more halogens that are the same or different;

при условии, что только одна группа из R⁹, R^9a, R^9b, R¹⁰, R¹¹, R^11a, R¹², R^12a, R^12b означает Z.provided that only one group of R ⁹ , R ^9a , R ^9b , R ¹⁰ , R ¹¹ , R ^11a , R ¹² , R ^12a , R ^12b means Z.

Более предпочтительно, L² означает C_1-20алкильную цепь, которая необязательно прерывается одной или более группами, независимо выбранными из -O- и C(O)N(R^3aa); необязательно замещена одной или более группами, независимо выбранными из OH и C(O)N(R^3aaR^3aaa); и где R^3aa, R^3aaa независимо выбраны из группы, состоящей из H и C_1-4алкила.More preferably, L ² is a C _1-20 alkyl chain that is optionally interrupted by one or more groups independently selected from —O— and C (O) N (R ^3aa ); optionally substituted with one or more groups independently selected from OH and C (O) N (R ^3aa R ^3aaa ); and where R ^3aa , R ^{3aaa are} independently selected from the group consisting of H and C _1-4 alkyl.

Предпочтительно, L² имеет молекулярную массу в диапазоне от 14 г/моль до 750 г/моль.Preferably, L ² has a molecular weight in the range of 14 g / mol to 750 g / mol.

Предпочтительно, группа L² соединена с Z через концевую группу, выбранную изPreferably, the group L ^{2 is} connected to Z via an end group selected from

и

and

В случае, когда L² имеет такую концевую группу, также предпочтительно, что L² имеет молекулярную массу в диапазоне от 14 г/моль до 500 г/моль, рассчитанную без такой концевой группы.In the case where L ² has such an end group, it is also preferable that L ² has a molecular weight in the range of 14 g / mol to 500 g / mol calculated without such an end group.

Предпочтительно, когда ковалентное соединение, образованное между линкером и гидрогелем Z, имеет прочную связь.Preferably, the covalent compound formed between the linker and the hydrogel Z has a strong bond.

Предпочтительно, гидрогель Z представляет собой биоразрушаемый, не растворимый в воде гидрогель, основанный на полиэтиленгликоле (PEG). Термин “ПЭГ-основанный”, как установлено в описании, означает, что массовая доля цепей ПЭГ в гидрогеле составляет по меньшей мере 10% масс., предпочтительно по меньшей мере 25% на основании общей массы гидрогеля. Остальная часть может быть составлена из других спейсеров и/или олигомеров или полимеров, таких как олиго- или полилизины.Preferably, hydrogel Z is a biodegradable, water insoluble hydrogel based on polyethylene glycol (PEG). The term “PEG-based” as defined herein means that the mass fraction of PEG chains in the hydrogel is at least 10% by weight, preferably at least 25% based on the total weight of the hydrogel. The rest may be composed of other spacers and / or oligomers or polymers, such as oligo- or polylysines.

Кроме того, термин “нерастворимый в воде” относится к набухаемой, пространственно сшитой молекулярной сетке, образующей гидрогель. Гидрогель, если суспендирован в большом избытке воды или водном буфере физиологической осмоляльности, может впитать значительное количество воды, например, вплоть до 10-кратного превышения массы гидрогеля, и поэтому является набухаемым, однако после удаления избытка воды физическая стабильность и форма все еще сохраняются. Такая форма может иметь любую геометрию, и понятно, что такой индивидуальный гидрогелевый материал следует рассматривать как единую молекулу, состоящую из компонентов, где каждый компонент связан с любым другим компонентом химическими связями.In addition, the term “water insoluble” refers to a swellable, spatially crosslinked molecular network forming a hydrogel. A hydrogel, if suspended in a large excess of water or an aqueous physiological osmolality buffer, can absorb a significant amount of water, for example, up to a 10-fold excess of the mass of the hydrogel, and therefore is swellable, but after removal of the excess water, physical stability and shape are still preserved. This form can have any geometry, and it is clear that such an individual hydrogel material should be considered as a single molecule consisting of components, where each component is connected to any other component by chemical bonds.

Согласно настоящему изобретению гидрогель может состоять из каркасных фрагментов, связанных между собой гидролитически разрушаемыми связями.According to the present invention, the hydrogel may consist of frame fragments linked together by hydrolytically destructible bonds.

Предпочтительно группа L² связана с фрагментом каркаса.Preferably, the L ² group is linked to a carcass fragment.

Предпочтительно фрагмент каркаса имеет молекулярную массу в диапазоне от 1 кДа до 20 кДа, более предпочтительно от 1 кДа до 15 кДа и даже более предпочтительно от 1 кДа до 10 кДа. Фрагменты каркаса предпочтительно являются ПЭГ-основанными, содержащими одну или более цепи ПЭГ.Preferably, the carcass fragment has a molecular weight in the range of 1 kDa to 20 kDa, more preferably 1 kDa to 15 kDa, and even more preferably 1 kDa to 10 kDa. Fragment fragments are preferably PEG-based containing one or more PEG chains.

В гидрогеле, несущем конъюгаты лекарственного средства и линкера согласно изобретению, каркасный фрагмент характеризуется числом функциональных групп, включающих взаимосвязанные биоразрушаемые функциональные группы и гидрогельсвязанные конъюгаты лекарственное средство-линкер и необязательно блокирующие группы. Это означает, что каркасный фрагмент характеризуется числом гидрогельсвязанных конъюгатов лекарственное средство-линкер; функциональных групп, включающих биоразрушаемые взаимосвязанные функциональные группы; и необязательно блокирующих групп. Предпочтительно, сумма взаимосвязанных биоразрушаемых функциональных групп и конъюгатов лекарственное средство-линкер и блокирующих групп составляет 16-128, предпочтительно 20-100, более предпочтительно 24-80 и наиболее предпочтительно 30-60.In a hydrogel carrying drug and linker conjugates according to the invention, the frame fragment is characterized by a number of functional groups, including interconnected biodegradable functional groups and hydrogel-linked drug-linker conjugates and optionally blocking groups. This means that the frame fragment is characterized by the number of hydrogel-linked drug-linker conjugates; functional groups, including biodegradable interconnected functional groups; and optionally blocking groups. Preferably, the sum of the interconnected biodegradable functional groups and drug-linker conjugates and blocking groups is 16-128, preferably 20-100, more preferably 24-80, and most preferably 30-60.

Предпочтительно сумма взаимосвязанных функциональных групп и гидрогельсвязанных конъюгатов лекарственное средство-линкер и блокирующих групп фрагмента каркаса поровну разделена на число ПЭГ-основанных полимерных цепей, исходящих от ветвящейся сердцевины. Например, если существует 32 взаимосвязанные функциональные группы и гидрогельсвязанные конъюгаты лекарственное средство-линкер и блокирующие группы, восемь групп может быть предоставлено каждой их четырех ПЭГ-основанных полимерных цепей, исходящих от сердцевины, предпочтительно посредством дендритных фрагментов, присоединенных к концу каждой ПЭГ-основанной полимерной цепи. Альтернативно, четыре группы могут быть предоставлены каждой из восьми ПЭГ-основанных полимерных цепей, исходящих от сердцевины, или две группы каждой из шестнадцати ПЭГ-основанных полимерных цепей. Если число ПЭГ-основанных полимерных цепей, исходящих от ветвящейся сердцевины, не допускает ровное распределение, предпочтительно, когда отклонение от среднего числа суммы взаимосвязанных функциональных групп и гидрогельсвязанных конъюгатов лекарственное средство-линкер и блокирующих групп на ПЭГ-основанную полимерную цепь сводится до минимума.Preferably, the sum of the interconnected functional groups and the hydrogel-linked drug-linker conjugates and the blocking groups of the scaffold fragment is evenly divided by the number of PEG-based polymer chains emanating from the branching core. For example, if there are 32 interconnected functional groups and hydrogel-linked drug-linker conjugates and blocking groups, eight groups can be provided to each of the four PEG-based polymer chains emanating from the core, preferably via dendritic moieties attached to the end of each PEG-based polymer chains. Alternatively, four groups may be provided for each of the eight PEG-based polymer chains emanating from the core, or two groups of each of sixteen PEG-based polymer chains. If the number of PEG-based polymer chains emanating from the branching core does not allow an even distribution, it is preferable that the deviation from the average number of the sum of interrelated functional groups and hydrogel-linked drug-linker conjugates and blocking groups on the PEG-based polymer chain is minimized.

В таких связанных с носителем пролекарствах согласно изобретению желательно, чтобы почти все лекарственное средство высвободилось (>90%) до высвобождения значительного количества каркасных фрагментов (<10%). Это может быть достигнуто путем регулирования времени полужизни связанного с носителем пролекарства в сравнении с кинетикой деградации гидрогеля согласно изобретению.In such carrier-related prodrugs of the invention, it is desirable that almost all of the drug is released (> 90%) prior to the release of a significant amount of scaffold fragments (<10%). This can be achieved by adjusting the half-life of the carrier-associated prodrug in comparison with the kinetics of degradation of the hydrogel according to the invention.

Предпочтительно каркасный фрагмент характеризуется наличием ветвящейся сердцевины, из которой вытягиваются по меньшей мере три ПЭГ-основанные полимерные цепи. Соответственно, в предпочтительном аспекте настоящего изобретения каркасный реагент включает ветвящуюся сердцевину, от которой по меньшей мере три ПЭГ-основанные полимерные цепи исходят. Такие ветвящиеся сердцевины могут состоять из поли- или олигоспиртов в связанном виде, предпочтительно пентаэритрита, трипентаэритрита, гексаглицерина, сахарозы, сорбита, фруктозы, маннита, глюкозы, целлюлозы, амилоз, крахмалов, гидроксиалкилкрахмалов, поливиниловых спиртов, декстранов, гиалуронанов, или ветвящиеся сердцевины могут состоять из поли- или олигоаминов, таких как орнитин, диаминомасляная кислота, трилизин, тетрализин, пентализин, гексализин, гептализин, октализин, нонализин, декализин, ундекализин, додекализин, тридекализин, тетрадекализин, пентадекализин или олиголизины, полиэтиленимины, поливиниламины в связанном виде.Preferably, the scaffold fragment is characterized by the presence of a branching core from which at least three PEG-based polymer chains are stretched. Accordingly, in a preferred aspect of the present invention, the scaffold reagent comprises a branching core from which at least three PEG-based polymer chains extend. Such branched cores may consist of bound poly- or oligosalcohols, preferably pentaerythritol, tripentaerythritol, hexaglycerol, sucrose, sorbitol, fructose, mannitol, glucose, cellulose, amylose, starches, hydroxyalkyl starch, polyvinyl alcohols, polyvinyl alcohols, vetranov, dextravon consist of poly- or oligoamines such as ornithine, diaminobutyric acid, trilizine, tetralizine, pentalysine, hexalysine, heptalysine, octalizine, nonalizine, decalysine, undecalizine, dodecalizine, tridecalizine , tetradecalizine, pentadecalizine or oligolizines, polyethyleneimines, bound polyvinylamines.

Предпочтительно от ветвящейся сердцевины исходит от трех до шестнадцати ПЭГ-основанных полимерных цепей, более предпочтительно от четырех до восьми. Предпочтительные ветвящиеся сердцевины могут состоять из пентаэритрита, орнитина, диаминомасляной кислоты, трилизина, тетрализина, пентализина, гексализина, гептализина или олиголизина, низкомолекулярного PEI, гексаглицерина, трипентаэритрита в связанном виде. Предпочтительно, от ветвящейся сердцевины исходит от трех до шестнадцати ПЭГ-основанных полимерных цепей, более предпочтительно от четырех до восьми. Предпочтительно, ПЭГ-основанная полимерная цепь является линейной поли(этиленгликолевой) цепью, у которой один конец связан с ветвящейся сердцевиной и другой конец связан с гиперразветвленным дендритным фрагментом. Понятно, что полимерная ПЭГ-основанная цепь может быть окончена или прервана алкильными или арильными группами, необязательно замещенными гетероатомами и химическими функциональными группами.Preferably, three to sixteen PEG-based polymer chains are provided from the branching core, more preferably four to eight. Preferred branching cores may consist of pentaerythritol, ornithine, diaminobutyric acid, trilizine, tetralizine, pentalysin, hexalysine, heptalysin or oligolysin, low molecular weight PEI, hexaglycerol, tripentaerythritol in bound form. Preferably, three to sixteen PEG-based polymer chains, more preferably four to eight, come from the branching core. Preferably, the PEG-based polymer chain is a linear poly (ethylene glycol) chain in which one end is bonded to a branching core and the other end is bonded to a hyperbranched dendritic moiety. It is understood that the polymeric PEG-based chain may be terminated or interrupted by alkyl or aryl groups optionally substituted with heteroatoms and chemical functional groups.

Предпочтительно, ПЭГ-основанная полимерная цепь подходяще замещена производным полиэтиленгликоля (ПЭГ-основанным).Preferably, the PEG-based polymer chain is suitably substituted with a polyethylene glycol derivative (PEG-based).

Предпочтительные структуры соответствующих ПЭГ-основанных полимерных цепей, исходящих от ветвящейся сердцевины, содержащейся в каркасном фрагменте, представляют собой множество ветвей ПЭГ-производных, как например, подробно описано в перечне продуктов JenKem Technology, USA (доступно из www.jenkemusa.com, загружено 28 июля, 2009), 4ARM-ПЭГ-производные (сердцевина из пентаэритрита), 8ARM-ПЭГ-производные (сердцевина из гексаглицерина) и 8ARM-ПЭГ-производные (сердцевина из трипентаэритрита). Наиболее предпочтительными являются производные из 4 ветвей ПЭГамина (сердцевина из пентаэритрита) и из 4 ветвей ПЭГкарбоксила (сердцевина из пентаэритрита), из 8 ветвей ПЭГамина (сердцевина из гексаглицерина), из 8 ветвей ПЭГкарбоксила (сердцевина из гексаглицерина), из 8 ветвей ПЭГамина (сердцевина из трипентаэритрита) и из 8 ветвей ПЭГкарбоксила (сердцевина из трипентаэритрита). Предпочтительные молекулярные массы таких ПЭГ-производных, представленных в виде множества ветвей, в каркасном фрагменте составляют от 1 кДа до 20 кДа, более предпочтительно от 1 кДа до 15 кДа и даже более предпочтительно от 1 кДа до 10 кДа.Preferred structures for the corresponding PEG-based polymer chains emanating from the branching core contained in the framework fragment are many branches of PEG derivatives, such as described in detail in the product list of JenKem Technology, USA (available from www.jenkemusa.com, downloaded 28 July, 2009), 4ARM-PEG derivatives (pentaerythritol core), 8ARM-PEG derivatives (hexaglycerol core) and 8ARM-PEG derivatives (tripentaerythritol core). Most preferred are derivatives of 4 branches of PEGamine (pentaerythritol core) and of 4 branches of PEG carboxyl (core of pentaerythritol), of 8 branches of PEGamine (core of hexaglycerol), of 8 branches of PEGcarboxyl (core of hexaglycerin), of 8 branches of PEG from tripentaerythritol) and from 8 branches of PEG carboxyl (core from tripentaerythritol). Preferred molecular weights of such PEG derivatives represented as multiple branches in the scaffold are from 1 kDa to 20 kDa, more preferably from 1 kDa to 15 kDa, and even more preferably from 1 kDa to 10 kDa.

Понятно, что концевые аминогруппы упомянутых выше молекул, представленных в виде множества ветвей, присутствуют в связанном виде в каркасном фрагменте, чтобы предоставить также взаимосвязанные функциональные группы и реакционноспособные функциональные группы фрагмента каркаса.It is understood that the terminal amino groups of the aforementioned molecules, represented as multiple branches, are bound in a framework fragment to provide interconnected functional groups and reactive functional groups of the framework fragment.

Предпочтительно, когда сумма взаимосвязанных функциональных групп и реакционноспособных функциональных групп фрагмента каркаса поровну разделена на число ПЭГ-основанных полимерных цепей, исходящих от ветвящейся сердцевины. Если число ПЭГ-основанных полимерных цепей, исходящих от ветвящейся сердцевины, не допускает равное распределение, предпочтительно, чтобы отклонение от среднего числа суммы взаимосвязанных функциональных групп и реактивных функциональных групп на ПЭГ-основанную полимерную цепь сводилось до минимума.Preferably, when the sum of the interconnected functional groups and the reactive functional groups of the carcass fragment is equally divided by the number of PEG-based polymer chains emanating from the branching core. If the number of PEG-based polymer chains emanating from the branching core does not allow an equal distribution, it is preferable that the deviation from the average number of the sum of interconnected functional groups and reactive functional groups per PEG-based polymer chain is minimized.

Более предпочтительно сумма взаимосвязанных и реакционноспособных функциональных групп каркасного фрагмента поровну разделена на число ПЭГ-основанных полимерных цепей, исходящих от ветвящейся сердцевины. Например, если существует 32 взаимосвязанные функциональные группы и реакционноспособные функциональные группы, восемь групп может быть предоставлено каждой из четырех ПЭГ-основанных полимерных цепей, исходящих от сердцевины, предпочтительно посредством дендритных фрагментов, присоединенных к концу каждой ПЭГ-основанной полимерной цепи. Альтернативно, четыре группы могут быть предоставлены каждой из восьми ПЭГ-основанных полимерных цепей, исходящих от сердцевины, или две группы каждой из шестнадцати ПЭГ-основанных полимерных цепей.More preferably, the sum of the interconnected and reactive functional groups of the scaffold fragment is evenly divided by the number of PEG-based polymer chains emanating from the branching core. For example, if there are 32 interconnected functional groups and reactive functional groups, eight groups can be provided for each of the four PEG-based polymer chains emanating from the core, preferably by dendritic moieties attached to the end of each PEG-based polymer chain. Alternatively, four groups may be provided for each of the eight PEG-based polymer chains emanating from the core, or two groups of each of sixteen PEG-based polymer chains.

Такие дополнительные функциональные группы могут быть предоставлены дендритными фрагментами. Предпочтительно, каждый дендритный фрагмент имеет молекулярную массу в диапазоне от 0,4 кДа до 4 кДа, более предпочтительно от 0,4 кДа до 2 кДа. Предпочтительно, каждый дендритный фрагмент имеет по меньшей мере 3 разветвления и по меньшей мере 4 реакционноспособные функциональные группы, и по большей мере 63 разветвления и 64 реакционноспособные функциональные группы, предпочтительно по меньшей мере 7 разветвлений и по меньшей мере 8 реакционноспособных функциональных групп и по большей мере 31 разветвление и 32 реакционноспособные функциональные группы.Such additional functional groups may be provided by dendritic moieties. Preferably, each dendritic moiety has a molecular weight in the range of 0.4 kDa to 4 kDa, more preferably 0.4 kDa to 2 kDa. Preferably, each dendritic moiety has at least 3 branches and at least 4 reactive functional groups, and at least 63 branches and 64 reactive functional groups, preferably at least 7 branches and at least 8 reactive functional groups and at least 31 branching and 32 reactive functional groups.

Примеры таких дендритных фрагментов включают трилизин, тетрализин, пентализин, гексализин, гептализин, октализин, нонализин, декализин, ундекализин, додекализин, тридекализин, тетрадекализин, пентадекализин, гексадекализин, гептадекализин, октадекализин, нонадекализин в связанном виде. Примеры таких предпочтительных дендритных фрагментов включают трилизин, тетрализин, пентализин, гексализин, гептализин в связанном виде, наиболее предпочтительны трилизин, пентализин или гептализин, орнитин, диаминомасляная кислота в связанном виде.Examples of such dendritic fragments include trilizine, tetralizine, pentalizine, hexalysine, heptalysine, octalizine, nonalizine, decalysine, undekalizine, dodekalizin, tridekalizin, tetradekalizin, pentadecalizine, hexadecalizine, heptadecalizine, nectadecalizine, octadecalizine, nectadecalizine, octadecalizine, octadecalizine, octadecalizine, octadecalizine, nectadecalizine, octadecalizine, octadecalizine, octadecalizine, octadecalizine, octadecalizine, octadecalizine, octadecalizine, octadecalizine, octadecalizine, octadecalizine, octadecalizine, octadecalizine, octadecalizine, octadecalizine, nectadecalizine, octadecalizine, nectadecalizine, octadecalizine, nectadecalizine, octadecalizine, nectadecalizine Examples of such preferred dendritic fragments include trilizine, tetralizine, pentalizine, hexalysine, heptalysine in bound form, most preferred trilizin, pentalizin or heptalizin, ornithine, diaminobutyric acid in bound form.

Наиболее предпочтительно, гидрогелевый носитель согласно настоящему изобретению отличается тем, что каркасный фрагмент имеет четвертичный атом углерода C(A-Hyp)₄, где каждая группа А является независимо поли(этиленгликоль)-основанной полимерной цепью, своим концом соединенной с четвертичным атомом углерода прочной ковалентной связью, и дальний конец ПЭГ-основанной полимерной цепи ковалентно связан с дендритным фрагментом Hyp, каждый дендритный фрагмент Hyp имеет по меньшей мере четыре функциональные группы, представляющие собой взаимосвязанные функциональные группы и реакционноспособные функциональные группы.Most preferably, the hydrogel support according to the present invention is characterized in that the framework fragment has a C (A-Hyp) ₄ quaternary carbon atom, where each group A is an independently poly (ethylene glycol) -based polymer chain, with its end connected to the quaternary carbon atom, is a strong covalent bond, and the far end of the PEG-based polymer chain is covalently linked to the Hyp dendritic fragment, each Hyp dendritic fragment has at least four functional groups that are interconnected associated functional groups and reactive functional groups.

Предпочтительно каждая группа А независимо выбрана из формулы -(CH₂)_n1(OCH₂CH₂)_nX-, где n1 равно 1 или 2; n является целым числом в диапазоне от 5 до 50; и X является химической функциональной группой, ковалентно связывающей A и Hyp.Preferably, each group A is independently selected from the formula - (CH ₂ ) _n1 (OCH ₂ CH ₂ ) _n X-, where n1 is 1 or 2; n is an integer in the range from 5 to 50; and X is a chemical functional group covalently linking A and Hyp.

Предпочтительно A и Hyp ковалентно связаны амидной связью.Preferably, A and Hyp are covalently linked by an amide bond.

Предпочтительно дендритный фрагмент Hyp представляет собой гиперразветвленный полипептид. Предпочтительно гиперразветвленный полипептид содержит лизин в связанном виде. Предпочтительно каждый дендритный фрагмент Hyp имеет молекулярную массу в диапазоне от 0,4 кДа до 4 кДа. Понятно, что каркасный фрагмент C(A-Hyp)₄ может состоять из одинаковых или различных дендритных фрагментов Hyp и что каждый Hyp может быть выбран независимо. Каждый фрагмент Hyp содержит 5-32 лизина, предпочтительно по меньшей мере 7 лизинов, т.е. каждый фрагмент содержит 5-32 лизина в связанном виде, предпочтительно по меньшей мере 7 лизинов в связанном виде. Наиболее предпочтительно, Hyp включает гептализинил.Preferably, the Hyp dendritic fragment is a hyperbranched polypeptide. Preferably, the hyperbranched polypeptide contains lysine in bound form. Preferably, each dendritic Hyp moiety has a molecular weight in the range of 0.4 kDa to 4 kDa. It is understood that the framework fragment C (A-Hyp) ₄ may consist of the same or different dendritic Hyp fragments and that each Hyp can be independently selected. Each Hyp fragment contains 5-32 lysines, preferably at least 7 lysines, i.e. each fragment contains 5-32 lysines in bound form, preferably at least 7 lysines in bound form. Most preferably, Hyp includes heptalysinyl.

Реакция полимеризуемых функциональных групп каркасного реагента, точнее Hyp с полимеризуемыми функциональными группами полиэтиленгликоль-основанных сшивающих реагентов, приводит к образованию прочной амидной связи.The reaction of the polymerizable functional groups of the carcass reagent, more precisely Hyp, with the polymerizable functional groups of polyethylene glycol-based crosslinking reagents leads to the formation of a strong amide bond.

Предпочтительно C(A-Hyp)₄ имеет молекулярную массу в диапазоне от 1 кДа до 20 кДа, более предпочтительно от 1 кДа до 15 кДа и даже более предпочтительно от 1 кДа до 10 кДа.Preferably, C (A-Hyp) ₄ has a molecular weight in the range of 1 kDa to 20 kDa, more preferably 1 kDa to 15 kDa, and even more preferably 1 kDa to 10 kDa.

Один предпочтительный каркасный фрагмент представлен ниже, пунктирные линии указывают на взаимосвязывающиеся биоразрушаемые связи со сшивающими фрагментами, и n равно целому числу от 5 до 50:One preferred wireframe fragment is shown below, dashed lines indicate mutually binding biodegradable bonds with crosslinking fragments, and n is an integer from 5 to 50:

Биоразрушаемость гидрогелей согласно настоящему изобретению достигается введением связей, расщепляемых гидролизом.The biodegradability of hydrogels according to the present invention is achieved by the introduction of bonds cleaved by hydrolysis.

Термины “гидролитически разрушаемые”, “биоразрушаемые” или “расщепляемые гидролизом”, “ауторасщепляемые”, или “саморасщепление”, “саморасщепляющиеся”, “неустойчивые” или “временные” относятся в контексте настоящего изобретения к связям и сшивкам, которые разрушаются или расщепляются посредством неферментативного гидролиза при физиологических условиях (водный буфер при pH 7,4, 37°C) с временем полужизни, колеблющимся от одного часа до трех месяцев, включающим, но не ограничивающимся ими, аконитилы, ацетали, амиды, ангидриды карбоновых кислот, сложные эфиры, имины, гидразоны, амиды малеиновой кислоты, сложные орто-эфиры, фосфамиды, фосфоэфиры, силиловые эфиры кислот фосфора, силиловые сложные эфиры, сложные эфиры сульфоновых кислот, ароматические карбаматы, их комбинации и тому подобное.The terms “hydrolytically degradable”, “biodegradable” or “cleavable by hydrolysis”, “auto-cleavable”, or “self-cleavage”, “self-cleavable”, “unstable” or “temporary” refer in the context of the present invention to bonds and cross-links that are broken or cleaved by non-enzymatic hydrolysis under physiological conditions (aqueous buffer at pH 7.4, 37 ° C) with a half-life ranging from one hour to three months, including, but not limited to, aconityls, acetals, amides, carb anhydrides acids, esters, imines, hydrazones, maleic acid amides, ortho esters, phosphamides, phosphoesters, silyl esters of phosphorus acids, silyl esters, sulphonic acid esters, aromatic carbamates, combinations thereof and the like.

Если в гидрогеле согласно изобретению имеется разрушаемая взаимосвязанная функциональная группа, предпочтительными биоразрушаемыми сшивками являются сложные эфиры карбоновых кислот, карбонаты, фосфоэфиры и сложные эфиры сульфокислот, и наиболее предпочтительными являются сложные эфиры карбоновых кислот или карбонаты.If the hydrogel according to the invention has a destructible interconnected functional group, carboxylic acid esters, carbonates, phosphoesters and sulfonic acid esters are preferred biodegradable cross-links, and carboxylic acid esters or carbonates are most preferred.

Устойчивые сшивки не разрушаются путем ферментативного гидролиза при физиологических условиях (водный буфер при pH 7,4, 37°C) со временем полужизни, составляющим шесть месяцев или дольше, такие как амиды.Stable crosslinking is not destroyed by enzymatic hydrolysis under physiological conditions (aqueous buffer at pH 7.4, 37 ° C) with a half-life of six months or longer, such as amides.

Для того чтобы ввести расщепляемые путем гидролиза связи в гидрогелевый носитель согласно изобретению, каркасные фрагменты могут быть непосредственно связаны друг с другом с помощью биоразрушаемых связей.In order to introduce cleavable bonds by hydrolysis into a hydrogel carrier according to the invention, framework fragments can be directly linked to each other using biodegradable bonds.

В одном варианте осуществления изобретения каркасные фрагменты биоразрушаемого гидрогелевого носителя могут быть прямо связаны вместе, т.е. без сшивающих фрагментов. Гиперразветвленные дендритные фрагменты двух каркасных фрагментов такого биоразрушаемого гидрогеля могут быть, каждый, прямо связаны посредством взаимосвязанной функциональной группы, которая соединяет два гиперразветвленных дендритных фрагмента. Альтернативно, два гиперразветвленных дендритных фрагмента двух разных каркасных фрагментов могут быть связаны друг с другом посредством двух спейсерных фрагментов, соединенных с каркасным фрагментом, и с другой стороны соединенных со сшивающим фрагментом, разделенными взаимосвязанными функциональными группами.In one embodiment of the invention, fragments of a biodegradable hydrogel support can be directly linked together, i.e. without crosslinking fragments. The hyperbranched dendritic fragments of two framework fragments of such a biodegradable hydrogel can each be directly linked through an interconnected functional group that connects two hyperbranched dendritic fragments. Alternatively, two hyperbranched dendritic fragments of two different framework fragments can be linked to each other by two spacer fragments connected to the framework fragment, and on the other hand connected to a crosslinking fragment separated by interconnected functional groups.

Альтернативно, каркасные фрагменты могут быть соединены вместе посредством сшивающих фрагментов, каждый сшивающий фрагмент оканчивается по меньшей мере двумя гидролитически разрушаемыми связями. Кроме концевых разрушаемых связей, сшивающие фрагменты могут также содержать биоразрушаемые связи. Таким образом, каждый конец сшивающего фрагмента, связанного с каркасным фрагментом, включает гидролитически разрушаемую связь, и дополнительные биоразрушаемые связи необязательно могут присутствовать в сшивающем фрагменте.Alternatively, the framework fragments can be joined together by crosslinking fragments, each crosslinking fragment terminates in at least two hydrolytically degradable bonds. In addition to the terminal breakable bonds, crosslinking fragments may also contain biodegradable bonds. Thus, each end of the crosslinking fragment associated with the frame fragment includes a hydrolytically degradable bond, and additional biodegradable bonds may optionally be present in the crosslinker fragment.

Предпочтительно биоразрушаемый гидрогелевый носитель состоит из каркасных фрагментов, взаимосвязанных гидролитически разрушаемыми связями, и каркасные фрагменты соединены вместе через сшивающие фрагменты.Preferably, the biodegradable hydrogel carrier consists of framework fragments interconnected by hydrolytically degradable bonds, and the framework fragments are joined together via crosslinking fragments.

Биоразрушаемый гидрогелевый носитель может содержать один или более различных типов сшивающих фрагментов, предпочтительно один. Сшивающий фрагмент может представлять собой линейную или разветвленную молекулу, и предпочтительно является линейной молекулой. В предпочтительном варианте осуществления изобретения сшивающий фрагмент соединен с каркасными фрагментами по меньшей мере двумя биоразрушаемыми связями.A biodegradable hydrogel carrier may contain one or more different types of crosslinking moieties, preferably one. The crosslinker moiety may be a linear or branched molecule, and is preferably a linear molecule. In a preferred embodiment, the crosslinking moiety is coupled to the carcass fragments by at least two biodegradable bonds.

Предпочтительно сшивающие фрагменты имеют молекулярную массу в диапазоне от 60 Да до 5 кДа, более предпочтительно от 0,5 кДа до 4 кДа, даже более предпочтительно от 1 кДа до 4 кДа, даже более предпочтительно от 1 кДа до 3 кДа. В одном варианте осуществления изобретения сшивающий фрагмент состоит из полимера.Preferably, the crosslinking moieties have a molecular weight in the range of 60 Da to 5 kDa, more preferably from 0.5 kDa to 4 kDa, even more preferably from 1 kDa to 4 kDa, even more preferably from 1 kDa to 3 kDa. In one embodiment, the crosslinker moiety is comprised of a polymer.

Кроме олигомерных или полимерных сшивающих фрагментов, низкомолекулярные сшивающие фрагменты могут быть использованы, особенно когда гидрофильные высокомолекулярные каркасные фрагменты используют для формирования биоразрушаемого гидрогеля согласно изобретению.In addition to oligomeric or polymeric crosslinking moieties, low molecular weight crosslinking moieties can be used, especially when hydrophilic high molecular weight framework moieties are used to form a biodegradable hydrogel according to the invention.

Предпочтительно поли(этиленгликоль)-основанные сшивающие фрагменты представляют собой углеводородные цепи, содержащие этиленгликолевые единицы, необязательно включающие также функциональные группы, где поли(этиленгликоль)-основанные сшивающие фрагменты содержат, каждый, по меньшей мере m этиленгликолевых единиц, где m является целым числом в диапазоне от 3 до 100, предпочтительно от 10 до 70. Предпочтительно поли(этиленгликоль)-основанные сшивающие фрагменты имеют молекулярную массу в диапазоне от 0,5 кДа до 5 кДа.Preferably, the poly (ethylene glycol) based crosslinking moieties are hydrocarbon chains containing ethylene glycol units, optionally also including functional groups, where the poly (ethylene glycol) based crosslinking moieties contain at least m ethylene glycol units, where m is an integer in in the range of 3 to 100, preferably 10 to 70. Preferably, the poly (ethylene glycol) -based crosslinking moieties have a molecular weight in the range of 0.5 kDa to 5 kDa.

При использовании в ссылке на сшивающий фрагмент или ПЭГ-основанную полимерную цепь, связанную с ветвящейся сердцевиной, термин “ПЭГ-основанный” относится к сшивающему фрагменту или ПЭГ-основанной полимерной цепи, содержащей по меньшей мере 20% масс. этиленгликолевых фрагментов.When used in reference to a crosslinking fragment or PEG-based polymer chain linked to a branching core, the term “PEG-based” refers to a crosslinking fragment or PEG-based polymer chain containing at least 20% by weight. ethylene glycol fragments.

В одном варианте осуществления изобретения мономеры, составляющие полимерные сшивающие фрагменты, соединены биоразрушаемыми связями. Такие полимерные сшивающие фрагменты могут содержать вплоть до 100 биоразрушаемых связей или более, в зависимости от молекулярной массы сшивающего фрагмента и молекулярной массы мономерных единиц. Примерами таких сшивающих фрагментов являются полимеры, основанные на поли(молочной кислоте) или поли(гликолевой кислоте). Понятно, что такая цепь поли(молочной кислоты) или поли(гликолевой кислоты) может быть окончена или прервана алкильными или арильными группами, и что они необязательно могут быть замещены гетероатомами и химическими функциональными группами.In one embodiment, the monomers constituting the polymer crosslinking moieties are linked by biodegradable bonds. Such polymeric crosslinking moieties can contain up to 100 biodegradable bonds or more, depending on the molecular weight of the crosslinking moiety and the molecular weight of the monomer units. Examples of such crosslinking moieties are polymers based on poly (lactic acid) or poly (glycolic acid). It is understood that such a chain of poly (lactic acid) or poly (glycolic acid) may be terminated or interrupted by alkyl or aryl groups, and that they may optionally be substituted with heteroatoms and chemical functional groups.

Предпочтительно сшивающие фрагменты представляют собой ПЭГ-основанные, предпочтительно представленные только одной ПЭГ-основанной молекулярной цепью. Предпочтительно, поли(этиленгликоль)-основанные сшивающие фрагменты представляют собой углеводородные цепи, содержащие этиленгликолевые единицы, необязательно также содержащие химические функциональные группы, где поли(этиленгликоль)-основанные сшивающие фрагменты содержат по меньшей мере каждый m этиленгликолевых единиц, где m является целым числом в диапазоне от 3 до 100, предпочтительно от 10 до 70. Предпочтительно поли(этиленгликоль)-основанные сшивающие фрагменты имеют молекулярную массу в диапазоне от 0,5 кДа до 5 кДа.Preferably, the crosslinking moieties are PEG-based, preferably represented by only one PEG-based molecular chain. Preferably, the poly (ethylene glycol) based crosslinking moieties are hydrocarbon chains containing ethylene glycol units, optionally also containing chemical functional groups, where the poly (ethylene glycol) based crosslinking moieties contain at least every m ethylene glycol units, where m is an integer in in the range of 3 to 100, preferably 10 to 70. Preferably, the poly (ethylene glycol) -based crosslinking moieties have a molecular weight in the range of 0.5 kDa to 5 kDa.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения сшивающий фрагмент состоит из ПЭГ, который симметрично соединен посредством сложноэфирных связей с двумя альфа-, омега-алифатическими дикарбоновыми спейсерами, предоставленными каркасными фрагментами, соединенными с гиперразветвленным дендритным фрагментом посредством устойчивых амидных связей.In a preferred embodiment of the present invention, the crosslinker moiety consists of PEG that is symmetrically linked via ester bonds to two alpha, omega-aliphatic dicarboxylic spacers provided by framework fragments linked to a hyperbranched dendritic moiety through stable amide bonds.

Дикарбоновые кислоты спейсерных фрагментов, соединенных с каркасным фрагментом и с другой стороны соединенных с сшивающим фрагментом, состоят из 3-12 атомов углерода, наиболее предпочтительно 5-8 атомами углерода и могут быть замещены у одного или более атомов углерода. Предпочтительными заместителями являются алкильные группы, гидроксильные группы или амидогруппы или замещенные аминогруппы. Одна или более из метиленовых групп алифатических дикарбоновых кислот могут быть замещены O или NH или алкил-замещенным N. Предпочтительный алкил является линейным или разветвленным алкилом с 1-6 атомами углерода.The dicarboxylic acids of the spacer moieties connected to the framework fragment and, on the other hand, connected to the crosslinking moiety are composed of 3-12 carbon atoms, most preferably 5-8 carbon atoms and can be substituted on one or more carbon atoms. Preferred substituents are alkyl groups, hydroxyl groups or amido groups or substituted amino groups. One or more of the methylene groups of aliphatic dicarboxylic acids may be substituted with O or NH or alkyl substituted with N. Preferred alkyl is linear or branched alkyl with 1-6 carbon atoms.

Предпочтительно, существует устойчивая амидная связь между гиперразветвленным дендритным фрагментом и спейсерным фрагментом, соединенным с каркасным фрагментом и с другой стороны соединенным со сшивающим фрагментом.Preferably, there is a stable amide bond between the hyperbranched dendritic moiety and the spacer moiety connected to the framework moiety and, on the other hand, connected to the crosslinking moiety.

Один предпочтительный сшивающий фрагмент представлен ниже; пунктирные линии указывают на соединяющие биоразрушаемые связи с каркасными фрагментами:One preferred crosslinking moiety is provided below; dashed lines indicate connecting biodegradable bonds with frame fragments:

где n является целым числом от 5 до 50.where n is an integer from 5 to 50.

Предпочтительно гидрогелевый носитель состоит из каркасных фрагментов, взаимосвязанных гидролитически разрушаемыми связями.Preferably, the hydrogel carrier consists of framework fragments interconnected by hydrolytically degradable bonds.

Более предпочтительно фрагменты каркаса содержат ветвящуюся сердцевину следующей формулы:More preferably, fragments of the framework comprise a branching core of the following formula:

где пунктирная линия указывает на место присоединения к остальной части фрагмента каркаса.where the dashed line indicates the point of attachment to the rest of the frame fragment.

Более предпочтительно, каркасные фрагменты включают структуру следующей формулы:More preferably, the fragments include the structure of the following formula:

где n является целым числом от 5 до 50, и пунктирная линия указывает на место присоединения к остальной части фрагмента каркаса.where n is an integer from 5 to 50, and the dashed line indicates the point of attachment to the rest of the frame fragment.

Предпочтительно каркасный фрагмент включает гиперразветвленный фрагмент Hyp.Preferably, the scaffold fragment includes a hyperbranched Hyp fragment.

Более предпочтительно, каркасный фрагмент включает гиперразветвленный фрагмент Hyp следующей формулы:More preferably, the framework fragment includes a hyperbranched Hyp fragment of the following formula:

где пунктирные линии указывают на места присоединения к остальной части молекулы, и атомы углерода, отмеченные звездочками, указывают на S-конфигурацию.where dashed lines indicate points of attachment to the rest of the molecule, and carbon atoms marked with asterisks indicate S-configuration.

Предпочтительно, фрагменты каркаса присоединены по меньшей мере к одному спейсеру следующей формулы:Preferably, fragments of the frame are attached to at least one spacer of the following formula:

где одна из пунктирных линий указывает на место присоединения к гиперразветвленному фрагменту Hyp и вторая пунктирная линия указывает на место присоединения к остальной части молекулы; и где m является целым числом от 2 до 4.where one of the dashed lines indicates the point of attachment to the hyperbranched Hyp fragment and the second dashed line indicates the point of attachment to the rest of the molecule; and where m is an integer from 2 to 4.

Предпочтительно, фрагменты каркаса связаны вместе посредством сшивающих фрагментов, имеющих следующую структуру:Preferably, fragments of the framework are linked together by means of crosslinking fragments having the following structure:

где q является целым числом от 3 до 100, предпочтительно от 5 до 50.where q is an integer from 3 to 100, preferably from 5 to 50.

В гидрогелевых пролекарствах согласно изобретению степень гидролиза биоразрушаемых связей между каркасными фрагментами и сшивающими фрагментами зависит или определяется по числу и типу связанных атомов, соседних с карбоксигруппой ПЭГ-сложного эфира. Например, путем выбора из янтарной, адипиновой или глутаровой кислоты для образования сложного эфира ПЭГ, можно изменить период полужизни биоразрушаемого гидрогелевого носителя согласно изобретению.In the hydrogel prodrugs of the invention, the degree of hydrolysis of the biodegradable bonds between the framework fragments and the crosslinking fragments depends or is determined by the number and type of bound atoms adjacent to the carboxy group of the PEG ester. For example, by choosing from succinic, adipic or glutaric acid to form a PEG ester, the half-life of a biodegradable hydrogel carrier according to the invention can be changed.

Предпочтительно фрагмент L² присоединен к Z через тиосукцинимидную группу, которая в свою очередь присоединена к фрагменту каркаса гидрогеля посредством спейсера, такого как олигоэтиленгликолевая цепь. Предпочтительно, сшивка указанной спейсерной цепи с фрагментом каркаса является прочной связью, предпочтительно амидной связью.Preferably, the L ² moiety is attached to Z via a thiosuccinimide group, which in turn is attached to the hydrogel skeleton fragment via a spacer, such as an oligoethylene glycol chain. Preferably, the crosslinking of said spacer chain with a backbone fragment is a strong bond, preferably an amide bond.

Биоразрушаемая способность гидрогелей согласно настоящему изобретению достигается путем введения гидролитически разрушаемых связей.The biodegradable ability of hydrogels according to the present invention is achieved by introducing hydrolytically degradable bonds.

Относительно взаимосвязанных функциональных групп, термин “гидролитически разрушаемые” относится в контексте настоящего изобретения к сшивкам, которые не разрушаются ферментативным гидролизом при физиологических условиях (водный буфер при рН 7,4, 37°С) с периодом полужизни, колеблющимся от одного часа до трех месяцев, включающим, но не ограничивающимся ими, аконитилы, ацетали, ангидриды карбоновых кислот, сложные эфиры, имины, гидразоны, амиды малеиновой кислоты, сложные орто-эфиры, фосфамиды, сложные фосфоэфиры, силиловые сложные эфиры кислот фосфора, силиловые сложные эфиры, сложные эфиры сульфокислот, ароматические карбаматы, их комбинации и тому подобное. Предпочтительными биоразрушаемыми сочленениями являются сложные эфиры карбоновых кислот, карбонаты, сложные фосфоэфиры и сложные эфиры сульфокислот, и наиболее предпочтительными являются сложные эфиры карбоновых кислот или карбонаты. Понятно, что для исследований in vitro ускоренные условия, подобные, например, рН 9, 37°С, водный буфер, могут быть использованы для практических целей.Relatively interrelated functional groups, the term “hydrolytically degradable” refers in the context of the present invention to cross-links that are not destroyed by enzymatic hydrolysis under physiological conditions (aqueous buffer at pH 7.4, 37 ° C) with a half-life ranging from one hour to three months including, but not limited to, aconityls, acetals, carboxylic anhydrides, esters, imines, hydrazones, maleic amides, ortho esters, phosphamides, phospho esters, silyl esters phosphorus acids, silyl esters, sulfonic acid esters, aromatic carbamates, combinations thereof and the like. Preferred biodegradable joints are carboxylic acid esters, carbonates, phosphoesters and sulfonic acid esters, and carboxylic esters or carbonates are most preferred. It is understood that for in vitro studies, accelerated conditions, such as, for example, pH 9, 37 ° C, aqueous buffer, can be used for practical purposes.

Прочные сшивки не разрушаются ферментативным гидролизом при физиологических условиях (водный буфер при рН 7,4, 37°С) с периодом полужизни, составляющим шесть месяцев или дольше, такие как, например, амиды.Strong crosslinking is not destroyed by enzymatic hydrolysis under physiological conditions (aqueous buffer at pH 7.4, 37 ° C) with a half-life of six months or longer, such as, for example, amides.

Деградация биоразрушаемого гидрогелевого носителя согласно изобретению является многоступенчатой реакцией, где множество разрушаемых связей расщепляется, приводя к образованию продуктов деградации, которые могут быть водорастворимыми или не растворимыми в воде. Однако не растворимые в воде продукты деградации могут также включать разрушаемые связи, так что они могут расщепляться с образованием водорастворимых продуктов деградации. Указанные водорастворимые продукты деградации могут содержать один или более фрагментов каркаса. Понятно, что высвобожденные каркасные фрагменты могут, например, быть прочно конъюгированы со спейсером или блокирующими группами или линкерными группами или группами, обладающими сходными свойствами, и/или продуктами деградации линкера пролекарства, и что водорастворимые продукты деградации также могут содержать разрушаемые связи.The degradation of a biodegradable hydrogel carrier according to the invention is a multi-step reaction, where many degradable bonds are cleaved, leading to the formation of degradation products, which may be water soluble or insoluble in water. However, water-insoluble degradation products may also include degradable bonds, so that they can break down to form water-soluble degradation products. Said water-soluble degradation products may contain one or more fragments of the framework. It is understood that the released framework fragments can, for example, be strongly conjugated to a spacer or blocking groups or linker groups or groups having similar properties and / or prodrug linker degradation products, and that water-soluble degradation products may also contain degradable bonds.

Структуры ветвящейся сердцевины, ПЭГ-основанных полимерных цепей, гиперразветвленных дендритных фрагментов и фрагментов, присоединенных к гиперразветвленным дендритным фрагментам, могут быть определены, исходя из соответствующих описаний, представленных в разделах, охватывающих гидрогелевые носители согласно настоящему изобретению. Понятно, что структура продукта деградации зависит от типа гидрогеля согласно изобретению, претерпевающего разрушение.Branched core structures, PEG-based polymer chains, hyperbranched dendritic fragments, and fragments attached to hyperbranched dendritic fragments can be determined from the corresponding descriptions presented in the sections covering hydrogel carriers of the present invention. It is understood that the structure of the degradation product depends on the type of hydrogel of the invention undergoing degradation.

Общее количество каркасных фрагментов можно измерить в растворе после полной деградации гидрогеля согласно изобретению, и в течение деградации, фракции растворимых продуктов деградации каркаса можно отделить от нерастворимого гидрогеля согласно изобретению и можно количественно определить без помех со стороны других растворимых продуктов деградации, высвобожденных из гидрогеля согласно изобретению. Гидрогелевый материал согласно изобретению может быть отделен от избытка воды или буфера физиологической осмоляльности путем седиментации или центрифугирования. Центрифугирование может быть осуществлено таким путем, что супернатант содержит по меньшей мере 10% объема набухшего гидрогеля согласно изобретению. Растворимые продукты деградации гидрогеля остаются в водном супернатанте после такой стадии седиментации или центрифугирования, и водорастворимые продукты деградации, содержащие один или более фрагментов каркаса, определяются посредством подходящего разделения аликвот такого супернатанта и/или с помощью аналитических методов.The total number of framework fragments can be measured in the solution after complete degradation of the hydrogel according to the invention, and during degradation, fractions of the soluble degradation products of the carcass can be separated from the insoluble hydrogel according to the invention and can be quantified without interference from other soluble degradation products released from the hydrogel according to the invention . The hydrogel material of the invention can be separated from excess water or physiological osmolality buffer by sedimentation or centrifugation. Centrifugation can be carried out in such a way that the supernatant contains at least 10% of the volume of the swollen hydrogel according to the invention. The soluble degradation products of the hydrogel remain in the aqueous supernatant after such a sedimentation or centrifugation step, and the water-soluble degradation products containing one or more fragments of the framework are determined by appropriately separating aliquots of such supernatant and / or using analytical methods.

Предпочтительно водорастворимые продукты деградации могут быть отделены от не растворимых в воде продуктов деградации путем фильтрации через фильтры с диаметром пор 0,45 мкм, после которой водорастворимые продукты деградации могут быть обнаружены в фильтрате. Водорастворимые продукты деградации также могут быть отделены от не растворимых в воде продуктов деградации путем комбинирования стадий центрифугирования и фильтрации.Preferably, the water-soluble degradation products can be separated from the water-insoluble degradation products by filtration through filters with a pore diameter of 0.45 μm, after which the water-soluble degradation products can be detected in the filtrate. Water-soluble degradation products can also be separated from water-insoluble degradation products by combining the centrifugation and filtration steps.

Например, фрагменты каркаса могут нести группы, которые имеют поглощение в УФ-области при таких длинах волн, при которых другие продукты деградации не имеют поглощение в УФ-области. Подобная избирательность УФ-поглощающих групп может быть обусловлена структурными компонентами каркасного фрагмента, такими как амидные связи, или может быть введена в каркас путем присоединения к его реакционноспособным функциональным группам посредством ароматических кольцевых систем, таких как индоильные группы.For example, fragments of the framework can carry groups that have absorption in the UV region at wavelengths at which other degradation products do not have absorption in the UV region. Such selectivity of UV absorbing groups may be due to structural components of the scaffold fragment, such as amide bonds, or may be introduced into the scaffold by attaching to its reactive functional groups via aromatic ring systems such as indoil groups.

В таких гидрогельсвязанных инсулиновых пролекарствах согласно изобретению желательно, чтобы почти весь инсулин высвобождался (>90%) до высвобождения значительного количества продуктов разложения каркаса (<10%). Это может быть достигнуто путем регуляции времени полужизни гидрогельсвязанного инсулинового пролекарства против кинетики разложения гидрогеля.In such hydrogel-bound insulin prodrugs according to the invention, it is desirable that almost all insulin is released (> 90%) prior to the release of a significant amount of carcass decomposition products (<10%). This can be achieved by adjusting the half-life of the hydrogel-bound insulin prodrug against the kinetics of degradation of the hydrogel.

Предпочтительно инсулиновые пролекарства имеют структуру формулы (IIa) или (IIb)Preferably, the insulin prodrugs have the structure of formula (IIa) or (IIb)

где N^ε-инсулин относится к инсулину, соединенному посредством боковой цепи одного остатка лизина; илиwhere N ^ε -insulin refers to insulin connected by the side chain of one lysine residue; or

Предпочтительно гидрогель в формуле (IIa) или (IIb) является биоразрушаемым полиэтиленгликоль (ПЭГ)-основанным не растворимым в воде гидрогелем.Preferably, the hydrogel in the formula (IIa) or (IIb) is a biodegradable polyethylene glycol (PEG) -based water-insoluble hydrogel.

Предпочтительно гидрогель в формуле (IIa) или (IIb) состоит из каркасных фрагментов, связанных друг с другом гидролитически разрушаемыми связями.Preferably, the hydrogel in the formula (IIa) or (IIb) consists of frame fragments connected to each other by hydrolytically destructible bonds.

Более предпочтительно фрагменты каркаса содержат ветвящуюся сердцевину следующей формулы:More preferably, fragments of the framework comprise a branching core of the following formula:

где пунктирная линия указывает на место присоединения к остальной части каркасной молекулы.where the dashed line indicates the point of attachment to the rest of the frame molecule.

Более предпочтительно фрагменты каркаса включают структуру следующей формулы:More preferably fragments of the framework include the structure of the following formula:

где n является целым числом от 5 до 50, и пунктирная линия указывает на место присоединения к остальной части молекулы.where n is an integer from 5 to 50, and the dotted line indicates the point of attachment to the rest of the molecule.

Предпочтительно фрагмент каркаса содержит гиперразветвленный фрагмент Hyp.Preferably, the carcass fragment contains a hyperbranched Hyp fragment.

Более предпочтительно фрагмент каркаса содержит гиперразветвленный фрагмент Hyp следующей формулы:More preferably, the carcass fragment contains a hyperbranched Hyp fragment of the following formula:

где пунктирная линия указывает на место присоединения к остальной части молекулы и атомы углерода, отмеченные звездочкой, указывают на S-конфигурацию.where the dashed line indicates the point of attachment to the rest of the molecule and the carbon atoms marked with an asterisk indicate the S-configuration.

Предпочтительно фрагменты каркаса присоединены по меньшей мере к одному спейсеру следующей формулы:Preferably, fragments of the framework are attached to at least one spacer of the following formula:

где одна из пунктирных линий указывает на место присоединения к гиперразветвленному фрагменту Hyp и вторая пунктирная линия указывает на место присоединения к остальной части молекулы; и где m является целым числом от 2 до 4.where one of the dashed lines indicates the point of attachment to the hyperbranched Hyp fragment and the second dashed line indicates the point of attachment to the rest of the molecule; and where m is an integer from 2 to 4.

Предпочтительно каркасные фрагменты связаны по меньшей мере с одним спейсером следующей формулы:Preferably, the fragments of the frame are associated with at least one spacer of the following formula:

где пунктирная линия, отмеченная звездочкой, указывает на связь между гидрогелем и N тиосукцинимидной группы,where the dashed line marked with an asterisk indicates a relationship between the hydrogel and N thiosuccinimide group,

где другая пунктирная линия указывает на место присоединения к Hyp и где р является целым числом от 0 до 10.where the other dashed line indicates the place of joining Hyp and where p is an integer from 0 to 10.

Предпочтительно фрагменты каркаса связаны вместе посредством сшивающих фрагментов, имеющих следующую структуруPreferably, fragments of the framework are linked together by crosslinking fragments having the following structure

где q является целым числом от 3 до 100.where q is an integer from 3 to 100.

Степень гидролиза биоразрушаемых связей между каркасом и сшивающими фрагментами определяется по числу и типу связанных атомов, соседних с карбоксигруппой ПЭГ-сложного эфира. Например, путем выбора из янтарной, адипиновой или глутаровой кислоты для образования сложного эфира ПЭГ, возможно изменить период полужизни сшивающего средства, претерпевающего разложение.The degree of hydrolysis of biodegradable bonds between the framework and the crosslinking fragments is determined by the number and type of bound atoms adjacent to the carboxy group of the PEG ester. For example, by selecting from succinic, adipic, or glutaric acid to form a PEG ester, it is possible to change the half-life of a crosslinking agent undergoing decomposition.

Гидрогельсвязанное пролекарство инсулина согласно настоящему изобретению может быть приготовлено, исходя из гидрогеля согласно настоящему изобретению обычными способами, известными в данной области. Практику в данной области понятно, что имеется несколько способов. Например, линкер пролекарства, описанный выше, к которому ковалентно присоединен биологически активный фрагмент, может взаимодействовать с реакционноспособными функциональными группами гидрогеля согласно настоящему изобретению, уже несущими активный фрагмент частично или целиком.The hydrogel-linked insulin prodrug of the present invention can be prepared from the hydrogel of the present invention by conventional methods known in the art. Practice in this field, it is clear that there are several ways. For example, the prodrug linker described above, to which the biologically active fragment is covalently attached, can interact with the reactive functional groups of the hydrogel according to the present invention, already bearing the active fragment partially or in whole.

В предпочтительном способе получения гидрогель получают химическими реакциями сшивания. Гидрогель может быть образован из двух макромолекулярных продуктов с комплементарными функциональностями, которые претерпевают реакцию, такую как конденсация или присоединение. Одним из указанных исходных материалов является сшивающий реагент по меньшей мере с двумя идентичными функциональными группами, и другим исходным материалом является многофункциональный гомоструктуры каркасный реагент. Подходящие функциональные группы, присутствующие в сшивающем реагенте, включают концевые аминогруппы, карбоновую кислоту и производные, малеимид и другие альфа,бета-ненасыщенные акцепторы Михаэля, подобные винилсульфону, тиолу, гидроксильным группам. Подходящие функциональные группы, присутствующие в каркасном реагенте, включают, но не ограничиваются ими, аминогруппы, карбоновую кислоту и производные, малеимид и другие альфа,бета-ненасыщенные акцепторы Михаэля, подобные винилсульфону, тиолу и гидроксильным группам.In a preferred method for producing a hydrogel, crosslinking reactions are obtained. A hydrogel can be formed from two macromolecular products with complementary functionalities that undergo a reaction, such as condensation or addition. One of these starting materials is a crosslinking reagent with at least two identical functional groups, and the other starting material is a multifunctional homostructure framework reagent. Suitable functional groups present in the crosslinking reagent include terminal amino groups, carboxylic acid and derivatives, maleimide and other alpha, beta unsaturated Michael acceptors like vinyl sulfone, thiol, hydroxyl groups. Suitable functional groups present in the framework reagent include, but are not limited to, amino groups, carboxylic acid and derivatives, maleimide and other alpha, beta-unsaturated Michael acceptors like vinylsulfone, thiol and hydroxyl groups.

Если реакционноспособные функциональные группы сшивающего реагента используют субстехиометрически относительно реакционноспособных функциональных групп каркаса, образующийся гидрогель должен быть реакционноспособным гидрогелем со свободными реакционноспособными функциональными группами, присоединенными к каркасной структуре.If the reactive functional groups of the crosslinking agent are used substoichiometrically with respect to the reactive functional groups of the carcass, the resulting hydrogel must be a reactive hydrogel with free reactive functional groups attached to the carcass structure.

Необязательно, линкер пролекарства может быть вначале конъюгирован с инсулином, и образующийся конъюгат инсулин-линкер пролекарства затем может взаимодействовать с реакционноспособными функциональными группами гидрогеля. Альтернативно, после активации одной из функциональных групп линкера пролекарства конъюгат линкер-гидрогель может вступать в контакт с инсулином на второй стадии реакции, и избыток инсулина может быть удален путем фильтрации после конъюгирования инсулина с гидрогельсвязанным линкером пролекарства.Optionally, the prodrug linker may first be conjugated to insulin, and the resulting insulin-prodrug linker conjugate can then interact with the reactive functional groups of the hydrogel. Alternatively, after activating one of the functional groups of the prodrug linker, the linker-hydrogel conjugate may come into contact with insulin in the second stage of the reaction, and excess insulin can be removed by filtration after conjugation of insulin with a hydrogel-linked prodrug linker.

Предпочтительный способ получения пролекарства согласно настоящему изобретению представлен ниже:A preferred method for producing a prodrug according to the present invention is presented below:

Предпочтительным исходным материалом для синтеза каркасного реагента является ПЭГ-тетраамин, представленный 4 ветвями полимера, или ПЭГ-октаамин, представленный 8 ветвями полимера, с ПЭГ молекулярной массы, колеблющейся от 2000 до 10000 Дальтон, наиболее предпочтительно от 2000 до 5000 Да. К таким ПЭГ-производным, состоящим из множества ветвей, остатки лизина присоединяют последовательно с образованием гиперразветвленного каркасного реагента. Понятно, что лизины могут быть частично или полностью защищены защитными группами в течение стадий присоединения и что конечный каркасный реагент также может содержать защитные группы. Предпочтительным элементарным звеном является бис-бок-лизин. Альтернативно, вместо последовательных добавлений остатков лизина дендритный полилизиновый фрагмент может быть вначале синтезирован и впоследствии соединен с представленным 4 ветвями ПЭГ-тетраамином или представленным 8 ветвями ПЭГ-октаамином. Желательно получить каркасный реагент, несущий 32 аминокислоты, поэтому семь лизинов должно быть присоединено к каждой ветви ПЭГ, представленного 4 ветвями, или пять лизинов должно быть присоединено к каждой ветви ПЭГ, представленного 8 ветвями. В другом варианте осуществления изобретения ПЭГ-производными, представленными множеством ветвей, являются тетра- или октакарбокси-ПЭГ. В таком случае дендритные фрагменты могут быть произведены из глутаровой или аспарагиновой кислоты и образовавшийся каркасный реагент должен нести 32 карбоксигруппы. Понятно, что все или часть функциональных групп каркасного реагента может присутствовать в свободном виде, в виде солей или конъюгатов с защитными группами. Понятно, что по практическим соображениям число лизинов каркасного реагента на ветвь ПЭГ должно составлять между шестью и семью остатками, более предпочтительно приблизительно семь остатков.The preferred starting material for the synthesis of the framework reagent is PEG-tetraamine, represented by 4 polymer branches, or PEG-octaamine, represented by 8 polymer branches, with a PEG of molecular weight ranging from 2000 to 10000 Daltons, most preferably from 2000 to 5000 Da. To such PEG derivatives, consisting of many branches, lysine residues are sequentially attached to form a hyperbranched scaffold reagent. It is understood that lysines can be partially or fully protected by protecting groups during the addition steps and that the final framework reagent may also contain protecting groups. A preferred element is bis-side-lysine. Alternatively, instead of sequential additions of lysine residues, a dendritic polylysine fragment can be first synthesized and subsequently coupled to PEG-tetraamine represented by 4 branches or PEG-octaamine represented by 8 branches. It is desirable to obtain a framework reagent carrying 32 amino acids, so seven lysines should be attached to each branch of PEG represented by 4 branches, or five lysines should be attached to each branch of PEG represented by 8 branches. In another embodiment, the PEG derivatives represented by a plurality of branches are tetra or octacarboxy PEG. In this case, dendritic fragments can be produced from glutaric or aspartic acid and the resulting frame reagent must carry 32 carboxy groups. It is understood that all or part of the functional groups of the carcass reagent may be present in free form, in the form of salts or conjugates with protective groups. It is understood that, for practical reasons, the number of lysines of the framework reagent per PEG branch should be between six and seven residues, more preferably about seven residues.

Предпочтительный каркасный реагент представлен ниже:A preferred framework reagent is presented below:

Синтез сшивающего реагента начинается с линейной цепи ПЭГ с молекулярной массой, колеблющейся от 0,2 до 5 кДа, более предпочтительно от 0,6 до 2 кДа, которая этерифицирована до неполного эфира дикарбоновой кислоты, большей частью адипиновой кислоты или глутаровой кислоты. Предпочтительной защитной группой для образования неполного эфира является бензильная группа. Образующиеся ПЭГ-неполные бис-эфиры дикарбоновой кислоты превращаются в более реакционноспособные карбоксисоединения, такие как хлорангидриды карбоновой кислоты или активированные эфиры, например, пентафторфенил или N-гидроксисукцинимидные эфиры, наиболее предпочтительно N-гидроксисукцинимидные эфиры, из которых предпочтительная выбранная структура представлена ниже.The synthesis of the crosslinking reagent begins with a linear PEG chain with a molecular weight ranging from 0.2 to 5 kDa, more preferably from 0.6 to 2 kDa, which is esterified to a partial ester of dicarboxylic acid, most of adipic acid or glutaric acid. A preferred protecting group for the formation of a partial ester is a benzyl group. The resulting PEG-incomplete dicarboxylic acid bis esters are converted to more reactive carboxy compounds, such as carboxylic acid chlorides or activated esters, for example pentafluorophenyl or N-hydroxysuccinimide esters, most preferably N-hydroxysuccinimide esters, of which the preferred selected structure is presented below.

Альтернативно, ПЭГ-неполные бис-эфиры дикарбоновой кислоты могут быть активированы в присутствии связывающего средства, такого как DCC, или HOBt, или PyBOP.Alternatively, PEG-incomplete dicarboxylic acid bis esters can be activated in the presence of a binding agent such as DCC, or HOBt, or PyBOP.

В альтернативном варианте осуществления изобретения каркасный реагент несет карбоксигруппы, и соответствующий сшивающий реагент должен быть выбран из содержащих сложный эфир аминоконцевых цепей ПЭГ.In an alternative embodiment of the invention, the scaffold reagent carries carboxy groups, and the corresponding crosslinking reagent must be selected from PEG ester-containing amino terminal chains.

Каркасный реагент и сшивающий реагент могут быть полимеризованы с образованием гидрогеля согласно изобретению при использовании обратной эмульсионной полимеризации. После выбора желаемой стехиометрии между функциональными группами каркаса и сшивающего реагента каркас и сшивающий реагент растворяют в ДМСО, и подходящее эмульгирующее средство с соответственно выбранной величиной HLB, предпочтительно Арлацел Р135, используют для образования обратной эмульсии посредством механической мешалки и контроля скорости перемешивания. Полимеризацию инициируют добавлением подходящего основания, предпочтительно N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина. После перемешивания в течение соответствующего количества времени реакцию гасят путем добавления кислоты, такой как уксусная кислота и вода. Шарики собирают, промывают и фракционируют согласно размеру частиц путем механического просеивания. Необязательно, защитные группы могут быть удалены на данной стадии.The framework reagent and the crosslinking reagent can be polymerized to form the hydrogel according to the invention using reverse emulsion polymerization. After selecting the desired stoichiometry between the functional groups of the framework and the crosslinking reagent, the framework and the crosslinking reagent are dissolved in DMSO, and a suitable emulsifying agent with an appropriately selected HLB value, preferably Arlacel P135, is used to form an inverse emulsion by means of a mechanical stirrer and control the stirring speed. The polymerization is initiated by the addition of a suitable base, preferably N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine. After stirring for an appropriate amount of time, the reaction is quenched by the addition of an acid, such as acetic acid and water. The balls are collected, washed and fractionated according to particle size by mechanical sieving. Optionally, protecting groups may be removed at this stage.

Кроме того, такой гидрогель согласно изобретению может быть функционализирован спейсером, несущим реакционноспособную функциональную группу, отличную от группы, предоставленной гидрогелем. Например, малеимидные реакционноспособные функциональные группы могут быть введены в гидрогель путем связывания подходящего гетеробифункционального спейсера, такого как Mal-PEG6-NHS, с гидрогелем. Такой функционализированный гидрогель также может быть конъюгирован с комплексами инсулин-линкер, несущими реакционноспособную тиоловую группу на линкерном фрагменте, с образованием гидрогельсвязанных пролекарств инсулина согласно настоящему изобретению.Furthermore, such a hydrogel according to the invention can be functionalized with a spacer carrying a reactive functional group other than that provided by the hydrogel. For example, maleimide reactive functional groups can be introduced into the hydrogel by binding a suitable heterobifunctional spacer, such as Mal-PEG6-NHS, to the hydrogel. Such a functionalized hydrogel can also be conjugated to insulin-linker complexes bearing a reactive thiol group on the linker moiety to form the hydrogel-linked insulin prodrugs of the present invention.

После введения конъюгата инсулин-линкер в функционализированный гидрогель, содержащий малеимидогруппы, все оставшиеся функциональные группы блокируют подходящим блокирующим средством, таким как меркаптоэтанол, для предотвращения побочных реакций.After the insulin-linker conjugate is introduced into the functionalized hydrogel containing maleimido groups, all remaining functional groups are blocked with a suitable blocking agent, such as mercaptoethanol, to prevent adverse reactions.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения конъюгат инсулин-линкер, несущий свободную тиоловую группу, соединенную с фрагментом линкера, взаимодействует с функционализированным малеимидом гидрогелем при температурах между комнатной температурой и 4°С, более предпочтительно при комнатной температуре, в буферном водном растворе при рН 2-5, предпочтительно при рН 2,5-4,5, более предпочтительно при рН 3,0-4,0. Далее, соответствующий образующийся конъюгат инсулин-линкер-гидрогель обрабатывают меркаптоэтанолом при температурах между комнатной температурой и 4°С, более предпочтительно при комнатной температуре, в буферном водном растворе при рН 2-5, предпочтительно при рН 2,5-4,0, более предпочтительно при рН 2,5-3,5.In a preferred embodiment, an insulin-linker conjugate bearing a free thiol group connected to a linker moiety is reacted with a functionalized maleimide hydrogel at temperatures between room temperature and 4 ° C, more preferably at room temperature, in a buffer aqueous solution at pH 2-5 preferably at a pH of 2.5-4.5, more preferably at a pH of 3.0-4.0. Further, the corresponding insulin-linker-hydrogel conjugate formed is treated with mercaptoethanol at temperatures between room temperature and 4 ° C, more preferably at room temperature, in a buffered aqueous solution at pH 2-5, preferably at pH 2.5-4.0, more preferably at a pH of 2.5-3.5.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения конъюгат инсулин-линкер, несущий малеимидную группу, соединенную с фрагментом линкера, взаимодействует с функционализированным тиолом гидрогелем при температурах между комнатной температурой и 4°С, более предпочтительно при комнатной температуре, в буферном водном растворе при рН 2-5, предпочтительно при рН 2,5-4,5, более предпочтительно при рН 3,0-4,0. Далее, соответствующий образующийся конъюгат инсулин-линкер-гидрогель обрабатывают низкомолекулярным соединением, содержащим малеимидную группу, предпочтительно малеимидсодержащим соединением массой от 100 до 300 Да, например N-этилмалеимидом, при температурах между комнатной температурой и 4°С, более предпочтительно при комнатной температуре, в буферном водном растворе при рН 2-5, предпочтительно при рН 2,5-4,0, более предпочтительно при рН 2,5-3,5.In another preferred embodiment, an insulin-linker conjugate carrying a maleimide group coupled to a linker moiety is reacted with a functionalized thiol hydrogel at temperatures between room temperature and 4 ° C, more preferably at room temperature, in a buffered aqueous solution at pH 2-5 preferably at a pH of 2.5-4.5, more preferably at a pH of 3.0-4.0. Further, the corresponding insulin-linker-hydrogel conjugate formed is treated with a low molecular weight compound containing a maleimide group, preferably a maleimide-containing compound weighing from 100 to 300 Da, for example N-ethyl maleimide, at temperatures between room temperature and 4 ° C, more preferably at room temperature, in buffered aqueous solution at pH 2-5, preferably at pH 2.5-4.0, more preferably at pH 2.5-3.5.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ, включающий следующие стадии:Another aspect of the present invention is a method comprising the following steps:

(а) контакт водной суспензии, содержащей микрочастицы функционализированного малеимидом гидрогеля, с раствором, содержащим реагент инсулин-линкер, несущий тиоловые группы, при температурах между комнатной температурой и 4°С, в буферном водном растворе при рН 2-5, с образованием конъюгата инсулин-линкер-гидрогель;(a) the contact of an aqueous suspension containing microparticles of a functionalized maleimide hydrogel with a solution containing an insulin-linker reagent carrying thiol groups at temperatures between room temperature and 4 ° C in a buffer aqueous solution at pH 2-5 to form an insulin conjugate -linker hydrogel;

(b) необязательно, обработка конъюгата инсулин-линкер-гидрогель со стадии (а) тиолсодержащим соединением молекулярной массы от 34 Да до 500 Да при температурах между комнатной температурой и 4°С в буферном водном растворе при рН 2-5.(b) optionally, treating the insulin-linker-hydrogel conjugate from step (a) with a thiol-containing compound of a molecular weight of 34 Da to 500 Da at temperatures between room temperature and 4 ° C. in an aqueous buffer at pH 2-5.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ, включающий следующие стадии:Another aspect of the present invention is a method comprising the following steps:

(а) контакт водной суспензии, содержащей микрочастицы функционализированного тиолом гидрогеля, с раствором, содержащим реагент инсулин-линкер, несущий малеимидные группы, при температурах между комнатной температурой и 4°С, в буферном водном растворе при рН 2-5, с образованием конъюгата инсулин-линкер-гидрогель;(a) the contact of an aqueous suspension containing microparticles of a functionalized thiol hydrogel with a solution containing an insulin linker reagent bearing maleimide groups, at temperatures between room temperature and 4 ° C, in a buffer aqueous solution at pH 2-5, with the formation of an insulin conjugate -linker hydrogel;

(b) необязательно, обработка конъюгата инсулин-линкер-гидрогель со стадии (а) малеимидсодержащим соединением молекулярной массы от 100 до 300 Да при температурах между комнатной температурой и 4°С в буферном водном растворе при рН 2-5.(b) optionally, treating the insulin-linker-hydrogel conjugate from step (a) with a maleimide-containing compound of molecular weight from 100 to 300 Da at temperatures between room temperature and 4 ° C. in an aqueous buffer at pH 2-5.

Наиболее предпочтительный способ получения пролекарства согласно настоящему изобретению включает следующие стадии:The most preferred method for producing a prodrug according to the present invention includes the following steps:

(а) взаимодействие соединения формулы C(A'-X¹)₄, где A'-X¹ представляет собой элемент А до его связывания с Hyp или предшественник Hyp, и Х¹ является подходящей функциональной группой, с соединением формулы Hyp'-X², где Hyp'-X² представляет собой Hyp до его связывания с А или предшественник Hyp, и Х² является подходящей функциональной группой для реакции с Х¹;(a) the interaction of the compounds of formula C (A'-X ¹ ) ₄ , where A'-X ¹ is an element A before binding to Hyp or the precursor Hyp, and X ¹ is a suitable functional group, with a compound of the formula Hyp'-X ² , wherein Hyp'-X ² is Hyp prior to binding to A or a Hyp precursor, and X ² is a suitable functional group for reaction with X ¹ ;

(b) необязательно взаимодействие образующегося на стадии (а) соединения, осуществляемое в одну или более стадии, с получением соединения формулы C(A-Hyp)₄, включающего по меньшей мере четыре функциональные группы;(b) optionally, reacting the compound formed in step (a) in one or more steps to produce a compound of formula C (A-Hyp) ₄ comprising at least four functional groups;

(с) взаимодействие по меньшей мере четырех функциональных групп образующегося на стадии (b) соединения со сшивающим предшественником, основанным на полиэтиленгликоле, где активированные сложноэфирные группы сшивающего предшественника используют в субстехиометрическом количестве в сравнении с общим числом реакционноспособных функциональных групп C(A-Hyp)₄ с образованием гидрогеля;(c) reacting at least four functional groups of the compound formed in step (b) with a polyethylene glycol-based crosslinking precursor, wherein the activated ester crosslinking group precursors are used in a sub-stoichiometric amount compared to the total number of reactive functional groups C (A-Hyp) ₄ with the formation of a hydrogel;

(d) взаимодействие остающихся, не участвующих в реакции функциональных групп (представляющих собой реакционноспособные функциональные группы каркаса, входящего в состав гидрогеля) каркаса гидрогеля со стадии (с), с ковалентным конъюгатом биологически активного фрагмента и неустойчивого линкера пролекарства, или вначале взаимодействие не участвующих в реакции функциональных групп с неустойчивым линкером пролекарства и затем с биологически активным фрагментом;(d) the interaction of the remaining non-participating functional groups (representing the reactive functional groups of the scaffold included in the hydrogel) of the hydrogel scaffold from step (c), with a covalent conjugate of a biologically active fragment and an unstable prodrug linker, or, first, the interaction of non-participating prodrugs reactions of functional groups with an unstable prodrug linker and then with a biologically active fragment;

(е) необязательно блокирование остающихся, не участвующих в реакции функциональных групп с получением пролекарства согласно настоящему изобретению.(e) optionally blocking the remaining non-reaction functional groups to produce a prodrug of the present invention.

Конкретно, гидрогели для пролекарств инсулина согласно настоящему изобретению синтезируют, как описано ниже.Specifically, hydrogels for insulin prodrugs of the present invention are synthesized as described below.

Относительно полимеризации в массе, каркасный реагент и сшивающий реагент смешивают в отношении амин/активированный эфир от 2:1 до 1,05:1.Regarding bulk polymerization, the framework reagent and the crosslinking reagent are mixed in an amine / activated ester ratio of from 2: 1 to 1.05: 1.

Как каркасный реагент, так и сшивающий реагент растворяют в ДМСО с получением раствора с концентрацией от 5 до 50 г на 100 мл, предпочтительно от 7,5 до 20 г на 100 мл и наиболее предпочтительно от 10 до 20 г на 100 мл.Both the framework reagent and the crosslinking reagent are dissolved in DMSO to give a solution with a concentration of 5 to 50 g per 100 ml, preferably 7.5 to 20 g per 100 ml, and most preferably 10 to 20 g per 100 ml.

Для проведения полимеризации, от 2 до 10% (об.) N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина (TMEDA) добавляют к раствору ДМСО, содержащему сшивающий реагент и каркасный реагент, и смесь встряхивают в течение от 1 до 20 сек и оставляют стоять. Смесь отвердевает в течение менее чем 1 мин.For polymerization, from 2 to 10% (vol.) N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine (TMEDA) is added to a DMSO solution containing a crosslinking reagent and a frame reagent, and the mixture is shaken for 1 to 20 seconds and left to stand. The mixture hardens in less than 1 minute.

Такой гидрогель согласно изобретению предпочтительно измельчают механическими способами, такими как перемешивание, дробление, фракционирование под давлением или размол, и необязательно просеивание.Such a hydrogel according to the invention is preferably ground by mechanical means, such as stirring, crushing, pressure fractionation or grinding, and optionally sieving.

Относительно эмульсионной полимеризации, реакционная смесь состоит из дисперсной фазы и непрерывной фазы.Regarding emulsion polymerization, the reaction mixture consists of a dispersed phase and a continuous phase.

Что касается дисперсной фазы, каркасный реагент и сшивающий реагент смешивают в отношении амин/активированный эфир, составляющем от 2:1 до 1,05:1, и смесь растворяют в ДМСО с получением раствора с концентрацией от 5 до 50 г на 100 мл, предпочтительно от 7,5 до 20 г на 100 мл и наиболее предпочтительно от 10 до 20 г на 100 мл.As for the dispersed phase, the framework reagent and the crosslinking reagent are mixed in an amine / activated ester ratio of 2: 1 to 1.05: 1, and the mixture is dissolved in DMSO to give a solution with a concentration of 5 to 50 g per 100 ml, preferably from 7.5 to 20 g per 100 ml, and most preferably from 10 to 20 g per 100 ml.

Дисперсионной средой является любой растворитель, который не смешивается с ДМСО, не основный, апротонный и имеет вязкость ниже, чем 10 Па. Предпочтительно растворитель не смешивается с ДМСО, не основный, апротонный, имеет вязкость ниже, чем 2 Па и является нетоксичным. Более предпочтительно растворителем является насыщенный линейный или разветвленный углеводород, содержащий от 5 до 10 атомов углерода. Наиболее предпочтительно растворителем является н-гептан.A dispersion medium is any solvent that does not mix with DMSO, is not basic, aprotic, and has a viscosity lower than 10 Pa. Preferably, the solvent is not miscible with DMSO, non-basic, aprotic, has a viscosity lower than 2 Pa and is non-toxic. More preferably, the solvent is a saturated linear or branched hydrocarbon containing from 5 to 10 carbon atoms. Most preferably, the solvent is n-heptane.

Для образования эмульсии дисперсной фазы в дисперсионной среде, эмульгатор добавляют к дисперсионной среде до добавления дисперсной фазы. Количество эмульгатора составляет от 2 до 50 мг на мл дисперсной фазы, более предпочтительно от 5 до 20 мг на мл дисперсной фазы, наиболее предпочтительно 10 мг на мл дисперсной фазы.To form a dispersed phase emulsion in a dispersion medium, an emulsifier is added to the dispersion medium before the dispersed phase is added. The amount of emulsifier is from 2 to 50 mg per ml of the dispersed phase, more preferably from 5 to 20 mg per ml of the dispersed phase, most preferably 10 mg per ml of the dispersed phase.

Эмульгатор имеет HLB-показатель от 3 до 8. Предпочтительно, эмульгатор является триэфиром сорбита и жирной кислоты или конъюгатом поли(жирная оксикислота)-поли(этиленгликоль). Более предпочтительно, эмульгатор является конъюгатом поли(жирная оксикислота)-поли(этиленгликоль), с линейным поли(этиленгликолем) молекулярной массы в диапазоне от 0,5 кДа до 5 кДа и единицами поли(жирной оксикислоты) молекулярной массы в диапазоне от 0,5 кДа до 3 кДа на каждом конце цепи. Наиболее предпочтительно, эмульгатор является диполигидроксистеарат поли(этиленгликоля), Cithrol DPHS (Cithrol DPHS, продукт конденсации Arlacel P135, Croda International Plc).The emulsifier has an HLB score of 3 to 8. Preferably, the emulsifier is a sorbitol fatty acid ester or a poly (fatty hydroxy acid) poly conjugate (ethylene glycol). More preferably, the emulsifier is a conjugate of a poly (fatty hydroxy acid) -field (ethylene glycol), with a linear poly (ethylene glycol) molecular weight in the range of 0.5 kDa to 5 kDa and units of poly (fatty hydroxy acid) molecular weight in the range of 0.5 kDa to 3 kDa at each end of the chain. Most preferably, the emulsifier is poly (ethylene glycol) dipolyhydroxystearate, Cithrol DPHS (Cithrol DPHS, condensation product Arlacel P135, Croda International Plc).

Капельки дисперсной фазы приготавливали путем перемешивания посредством аксиально-поточной мешалки с конфигурацией, подобной конфигурации мешалок, таких как осевой импеллер с изогнутыми лопастями, мешалка конструкции “Интермиг”, пропеллерная мешалка (EKATO Rühr- und Mischtechnik GmbH, Germany), наиболее предпочтительно использование мешалки, подобной осевому импеллеру с изогнутыми лопастями с диаметром от 50 до 90% диаметра реактора. Предпочтительно перемешивание начинают до добавления дисперсной фазы. Скорость перемешивания составляет от 0,6 до 1,7 м/сек. Дисперсную фазу добавляют при комнатной температуре, и концентрация дисперсной фазы составляет от 2% до 70%, предпочтительно от 5 до 50%, более предпочтительно от 10 до 40% и наиболее предпочтительно от 20 до 35% от общего реакционного объема. Смесь дисперсной фазы, эмульгатора и дисперсионной среды перемешивают в течение 5-60 мин до добавления основания для осуществления полимеризации.The droplets of the dispersed phase were prepared by stirring by means of an axial-flow mixer with a configuration similar to that of the mixers, such as an axial impeller with curved blades, an Intermig mixer, a propeller mixer (EKATO Rühr- und Mischtechnik GmbH, Germany), most preferably using a mixer, similar to an axial impeller with curved blades with a diameter of 50 to 90% of the diameter of the reactor. Preferably, stirring is started before the dispersed phase is added. The mixing speed is from 0.6 to 1.7 m / s. The dispersed phase is added at room temperature, and the concentration of the dispersed phase is from 2% to 70%, preferably from 5 to 50%, more preferably from 10 to 40% and most preferably from 20 to 35% of the total reaction volume. The mixture of the dispersed phase, emulsifier and dispersion medium is stirred for 5-60 minutes until the base is added for polymerization.

От 5 до 10 эквивалентов (относится к образованию каждой амидной связи) основания добавляют к смеси дисперсной фазы и непрерывной фазы. Основанием является апротонное, ненуклеофильное и растворимое в дисперсной фазе основание. Предпочтительно основание является апротонным, ненуклеофильным, хорошо растворимым как в дисперсной фазе, так и в ДМСО. Более предпочтительно основание является апротонным, ненуклеофильным, хорошо растворимым как в дисперсной фазе, так и в ДМСО, аминным основанием и нетоксичным. Наиболее предпочтительно основанием является N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин (TMEDA). Перемешивание в присутствии основания продолжается в течение от 1 до 16 ч.From 5 to 10 equivalents (refers to the formation of each amide bond), the bases are added to the mixture of the dispersed phase and the continuous phase. The base is an aprotic, non-nucleophilic and soluble in the dispersed phase base. Preferably, the base is aprotic, non-nucleophilic, highly soluble both in the dispersed phase and in DMSO. More preferably, the base is aprotic, non-nucleophilic, readily soluble both in the dispersed phase and in DMSO, amine base and non-toxic. Most preferably, the base is N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine (TMEDA). Stirring in the presence of a base continues for 1 to 16 hours.

В течение перемешивания капельки дисперсной фазы делаются твердыми с образованием сшитых шариков гидрогеля согласно изобретению, которые могут быть собраны и фракционированы по размеру. Фракционирование осуществляют на вибрационной, непрерывного действия просеивающей машине с диаметром пор деки 75 мкм и 32 мкм для получения микрочастиц гидрогеля согласно изобретению.During mixing, the droplets of the dispersed phase are solidified to form crosslinked hydrogel beads according to the invention, which can be collected and fractionated in size. The fractionation is carried out on a vibrating, continuous sieving machine with a deck pore diameter of 75 microns and 32 microns to obtain hydrogel microparticles according to the invention.

Другим аспектом настоящего изобретения являются конъюгаты инсулин-линкер формулы (IIIa) и (IIIb)Another aspect of the present invention are insulin-linker conjugates of the formula (IIIa) and (IIIb)

где N^ε-инсулин относится к инсулину, связанному посредством боковой цепи одного остатка лизина; иwhere N ^ε -insulin refers to insulin bound by the side chain of one lysine residue; and

Другим аспектом настоящего изобретения являются реагенты инсулин-линкер D-L^∗,Another aspect of the present invention are DL ^* insulin-linker reagents,

гдеWhere

D представляет собой фрагмент инсулина; иD represents a fragment of insulin; and

L^∗ является биологически неактивным линкерным реагентом, представленным формулой (IV),L ^∗ is a biologically inactive linker reagent represented by the formula (IV),

где пунктирная линия указывает на место присоединения к одной из аминогрупп инсулина с образованием амидной связи;where the dashed line indicates the point of attachment to one of the amino groups of insulin with the formation of an amide bond;

X является C(R³R^3a); или N(R³);X is C (R ³ R ^3a ); or N (R ³ );

R^1a, R^3a независимо выбирают из группы, состоящей из H, NH(R^2b), N(R^2b)C(O)R⁴ и C_1-4алкила;R ^1a , R ^{3a are} independently selected from the group consisting of H, NH (R ^2b ), N (R ^2b ) C (O) R ^4, and C _1-4 alkyl;

R¹, R², R^2a, R^2b, R³, R⁴ независимо выбирают из группы, состоящей из H и С_1-4алкила,R ¹ , R ² , R ^2a , R ^2b , R ³ , R ^{4 are} independently selected from the group consisting of H and C _1-4 alkyl,

где группа L^∗ замещена одним L^2∗ и необязательно также замещена, при условии, что водород, отмеченный звездочкой в формуле (IV), не заменен на заместитель и гдеwhere the group L ^{∗ is} substituted by one L ^{2 ∗} and optionally also substituted, provided that the hydrogen marked with an asterisk in formula (IV) is not replaced by a substituent and where

L^2∗ является спейсером, соединенным с L^∗ и содержащим химическую функциональную группу, предназначенную для конъюгирования с реакционноспособным биоразрушаемым гидрогелем.L ^{2 ∗} is a spacer connected to L ^∗ and contains a chemical functional group for conjugation with a reactive biodegradable hydrogel.

Предпочтительно R² в формуле (IV) заменен на L^2∗.Preferably, R ² in formula (IV) is replaced by L ^{2 ∗} .

Предпочтительно R¹ в формуле (IV) заменен на L^2∗.Preferably, R ¹ in formula (IV) is replaced by L ^{2 ∗} .

Предпочтительно X в формуле (IV) означает N(R³).Preferably X in the formula (IV) means N (R ³ ).

Более предпочтительно X в формуле (IV) означает C(R³R^3a) и R^3a означает N(R^2b)C(O)⁴.More preferably, X in formula (IV) is C (R ³ R ^3a ) and R ^3a is N (R ^2b ) C (O) ⁴ .

Более предпочтительно X в формуле (IV) является C(R³R^3a) и R^3a заменен на L^2∗.More preferably, X in formula (IV) is C (R ³ R ^3a ) and R ^{3a is} replaced by L ^{2 ∗} .

Даже более предпочтительно X в формуле (IV) является C(R³R^3a), R^3a является N(R^2b)-L^2∗.Even more preferably, X in formula (IV) is C (R ³ R ^3a ), R ^3a is N (R ^2b ) -L ^{2 ∗} .

Предпочтительно L^∗ в формуле (IV) также не замещен.Preferably, L ^* in formula (IV) is also not substituted.

Предпочтительно L^2∗ в формуле (IV) содержит тиоловую группу.Preferably, L ^{2 ∗} in formula (IV) contains a thiol group.

Предпочтительно L^2∗ в формуле (IV) содержит малеимидную группу.Preferably, L ^{2 ∗} in formula (IV) contains a maleimide group.

Гидрогель для пролекарства согласно настоящему изобретению может быть получен способами приготовления в виде микрочастиц. В предпочтительном варианте осуществления изобретения реакционноспособный гидрогель имеет определенную форму, такую как ячейка или стент. Наиболее предпочтительно гидрогель сформирован в виде шариков из микрочастиц, которые могут быть введены в виде подкожной или внутримышечной инъекции посредством стандартного шприца. Такие мягкие шарики могут иметь диаметр между 1 и 500 микрометрами.A prodrug hydrogel according to the present invention can be prepared by microparticle preparation methods. In a preferred embodiment, the reactive hydrogel has a specific shape, such as a cell or stent. Most preferably, the hydrogel is formed into beads of microparticles, which can be administered as subcutaneous or intramuscular injection via a standard syringe. Such soft balls may have a diameter between 1 and 500 micrometers.

Предпочтительно микрочастицы имеют диаметр между 10 и 100 микрометрами, если их суспендируют в изотоничной водной буферной смеси, более предпочтительно диаметр составляет между 20 и 100 микрометрами, наиболее предпочтительно диаметр составляет между 25 и 80 микрометрами.Preferably, the microparticles have a diameter between 10 and 100 micrometers, if they are suspended in an isotonic aqueous buffer mixture, more preferably the diameter is between 20 and 100 micrometers, most preferably the diameter is between 25 and 80 micrometers.

Предпочтительно микрочастицы могут быть введены посредством инъекции шприцом с внутренним диаметром иглы менее чем 0,3 мм, более предпочтителен внутренний диаметр иглы менее чем 0,175 мм и наиболее предпочтительно внутренний диаметр иглы составляет менее чем 0,16 мм.Preferably, the microparticles can be administered by injection with a syringe with an inner diameter of the needle of less than 0.3 mm, more preferred an inner diameter of the needle of less than 0.175 mm and most preferably an inner diameter of the needle of less than 0.16 mm.

Понятно, что термины “могут быть введены посредством инъекции”, “инъецируемые” или “подача” относится к комбинации факторов, таких как определенное усилие, применяемое к поршню шприца, содержащего биоразрушаемый гидрогель согласно изобретению, набухающий в жидкости при определенной концентрации (масс./об.) и при определенной температуре, игла заданного внутреннего диаметра, соединенная с выходным отверстием такого шприца, и время, требуемое для выдавливания определенного объема биоразрушаемого гидрогеля согласно изобретению из шприца через иглу.It is understood that the terms “can be introduced by injection”, “injectable” or “delivery” refer to a combination of factors, such as the specific force applied to the piston of a syringe containing the biodegradable hydrogel according to the invention, swelling in a liquid at a certain concentration (w / vol.) and at a certain temperature, a needle of a given inner diameter connected to the outlet of such a syringe, and the time required to squeeze a certain volume of biodegradable hydrogel according to the invention from sp Ritsa through the needle.

Для того чтобы произвести подачу, объем 1 мл пролекарств инсулина согласно изобретению, набухающих в воде до концентрации по меньшей мере 5% (масс./об.) и содержащихся в шприце, имеющем поршень диаметром 4,7 мм, может быть выдавлен при комнатной температуре в течение 10 секунд с применением усилия, менее чем 50 ньютон.In order to deliver, a volume of 1 ml of the prodrugs of insulin according to the invention, swelling in water to a concentration of at least 5% (w / v) and contained in a syringe having a piston with a diameter of 4.7 mm, can be squeezed out at room temperature within 10 seconds with a force of less than 50 Newton.

Предпочтительно подачу осуществляют для пролекарства инсулина согласно изобретению, набухающего в воде до концентрации приблизительно 10% (масс./об.).Preferably, the delivery is carried out for a prodrug of insulin according to the invention, swelling in water to a concentration of about 10% (w / v).

Кроме того, одноступенчатый способ осуществляют, чтобы избирательно ацилировать единственную свободную ε-аминогруппу, обнаруженную в В-цепи инсулина и его аналогов, ацилирующим средством, содержащим защищенную тиоловую или другую функциональную группу. Относительно рекомбинантного человеческого инсулина, инсулина гларгина и инсулина аспарта, сайтом ацилирования является ε-аминогруппа LysB29, в случае инсулина лизпро, сайтом ацилирования является ε-аминогруппа LysB28, и в случае инсулина глулизина, сайтом ацилирования является ε-аминогруппа LysB3. Понятно, что указанный способ не ограничивается упомянутым ранее инсулином и аналогами инсулина, но может быть использован для других аналогов инсулина, поскольку они содержат ε-аминогруппы, и специалист в данной области сможет идентифицировать соответствующий остаток лизина, подходящий для ацилирования.In addition, a single-step method is carried out to selectively acylate the only free ε-amino group found in the B-chain of insulin and its analogues by an acylating agent containing a protected thiol or other functional group. Regarding recombinant human insulin, insulin glargine and insulin aspart, the acylation site is the ε-amino group LysB29, in the case of insulin lyspro, the acylation site is the ε-amino group LysB28, and in the case of insulin glulisin, the acylation site is the ε-amino group LysB3. It is understood that this method is not limited to the previously mentioned insulin and insulin analogs, but can be used for other insulin analogs because they contain ε-amino groups, and one skilled in the art will be able to identify the corresponding lysine residue suitable for acylation.

Таким образом, другим аспектом настоящего изобретения является способ ацилирования ε-аминогруппы инсулина или аналога инсулина, имеющего одну или более свободных α-аминогрупп и свободную ε-аминогруппу, ацилирующим средством, содержащим одну или более защищенных функциональных групп, который включает взаимодействие инсулина или аналога инсулина с подходящим ацилирующим средством, содержащим одну или более защищенных функциональных групп, при рН от 8,0 до ниже 9,0 в полярном растворителе. Понятно, что следует использовать только такие защитные группы, которые является устойчивыми в описанных выше условиях.Thus, another aspect of the present invention is a method for the acylation of an ε-amino group of an insulin or insulin analog having one or more free α-amino groups and a free ε-amino group, with an acylating agent containing one or more protected functional groups, which comprises reacting an insulin or insulin analog with a suitable acylating agent containing one or more protected functional groups, at a pH of from 8.0 to below 9.0 in a polar solvent. It is understood that only those protecting groups that are stable under the conditions described above should be used.

Реакцию осуществляют путем взаимодействия ацилирующего средства, такого как линкерный реагент, который содержит одну или более защищенных функциональных групп, с ε-аминогруппой инсулина или аналога инсулина при щелочных условиях с рН, колеблющемся приблизительно от 8,00 до ниже 9,0, предпочтительно от 8,0 до 8,9, более предпочтительно от 8,3 до 8,7, в полярном растворителе, таком как водные смеси, например, метанола, этанола, пропанола, изопропанола, ДМСО, ДМФ, NMP, диметилацетамида, ацетонитрила.The reaction is carried out by reacting an acylating agent, such as a linker reagent, which contains one or more protected functional groups, with the ε-amino group of an insulin or insulin analog under alkaline conditions with a pH ranging from about 8.00 to below 9.0, preferably from 8 , 0 to 8.9, more preferably 8.3 to 8.7, in a polar solvent, such as aqueous mixtures, for example, methanol, ethanol, propanol, isopropanol, DMSO, DMF, NMP, dimethylacetamide, acetonitrile.

Другим аспектом настоящего изобретения является вещество инсулин, характеризующееся наличием ацильной группы, связанной с ε-азота инсулина или аналога инсулина, и где такая ацильная группа имеет одну или более защищенных функциональных групп.Another aspect of the present invention is an insulin substance, characterized by the presence of an acyl group associated with the ε-nitrogen of an insulin or insulin analogue, and where such an acyl group has one or more protected functional groups.

Другим аспектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая пролекарство согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль вместе с фармацевтически приемлемым наполнителем. Фармацевтическая композиция также описана в следующих параграфах.Another aspect of the present invention is a pharmaceutical composition comprising a prodrug of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof together with a pharmaceutically acceptable excipient. The pharmaceutical composition is also described in the following paragraphs.

Композиция пролекарства инсулин-гидрогель может быть представлена в виде суспензионной композиции или в виде сухой композиции. Предпочтительно, фармацевтическая композиция пролекарства инсулин-гидрогель является сухой композицией. Подходящими способами сушки являются, например, сушка распылением и лиофилизация (сушка вымораживанием). Предпочтительно фармацевтическую композицию пролекарства инсулин-гидрогель сушат лиофилизацией.The insulin hydrogel prodrug composition may be presented as a suspension composition or as a dry composition. Preferably, the insulin hydrogel prodrug pharmaceutical composition is a dry composition. Suitable drying methods are, for example, spray drying and lyophilization (freeze drying). Preferably, the insulin-hydrogel prodrug pharmaceutical composition is freeze dried.

Предпочтительно пролекарство инсулин-гидрогель достаточно дозируют в композиции для достижения терапевтически эффективного количества инсулина в течение по меньшей мере трех дней в один прием. Более предпочтительно одного приема пролекарства инсулин-гидрогель достаточно для одной недели.Preferably, the insulin hydrogel prodrug is sufficiently dosed in the composition to achieve a therapeutically effective amount of insulin for at least three days in one go. More preferably, one administration of an insulin hydrogel prodrug is sufficient for one week.

Фармацевтическая композиция пролекарства инсулин-гидрогель согласно настоящему изобретению содержит один или более наполнителей.An insulin hydrogel prodrug pharmaceutical composition according to the present invention contains one or more excipients.

Наполнители, используемые в парентеральных композициях, могут быть классифицированы как буферные средства, средства, изменяющие изотоничность, консерванты, стабилизирующие средства, противопоглощающие средства, средства, защищающие от окисления, загустители/повышающие вязкость средства или другие дополнительные средства. В некоторых случаях указанные ингредиенты могут иметь двойные или тройные функции. Композиции пролекарств инсулин-гидрогель согласно настоящему изобретению содержат один или более чем один наполнителей, выбранных из группы, состоящей из следующего:Excipients used in parenteral compositions may be classified as buffering agents, isotonicity modifiers, preservatives, stabilizing agents, anti-absorbing agents, anti-oxidizing agents, thickening / viscosity increasing agents, or other additional agents. In some cases, these ingredients may have double or triple functions. The insulin hydrogel prodrug compositions of the present invention comprise one or more excipients selected from the group consisting of:

(i) Буферные средства: физиологически допустимые буферы для поддержания рН в желаемом диапазоне, такие как фосфат натрия, бикарбонат, сукцинат, гистидин, цитрат и ацетат, сульфат, нитрат, хлорид, пируват. Антациды, такие как Mg(OH)₂ или ZnCO₃, также могут быть использованы. Буферную емкость можно регулировать, чтобы подобрать условия, наиболее чувствительные к рН-стабильности.(i) Buffer agents: physiologically acceptable buffers to maintain the pH in the desired range, such as sodium phosphate, bicarbonate, succinate, histidine, citrate and acetate, sulfate, nitrate, chloride, pyruvate. Antacids such as Mg (OH) ₂ or ZnCO ₃ can also be used. The buffer capacity can be adjusted to select the conditions most sensitive to pH stability.

(ii) Средства, изменяющие изотоничность: чтобы снизить до минимума боль, возникающую в результате клеточного повреждения из-за разницы осмотического давления при инъекции препарата-депо. Глицерин и хлорид натрия являются примерами. Эффективные концентрации можно определить путем осмометрии, используя допустимую осмоляльность 285-315 мОсмол/кг сыворотки.(ii) Isotonicity modifying agents: to minimize pain resulting from cell damage due to the difference in osmotic pressure during injection of the depot drug. Glycerin and sodium chloride are examples. Effective concentrations can be determined by osmometry using an acceptable osmolality of 285-315 mOsmol / kg of serum.

(iii) Консерванты и/или противомикробные средства: многодозовые парентеральные препараты требуют добавления консервантов при достаточной концентрации для снижения риска заражения больных инфекциями при инъецировании, и поэтому были установлены соответствующие регламентирующие требования. Обычные консерванты включают м-крезол, фенол, метилпарабен, этилпарабен, пропилпарабен, бутилпарабен, хлорбутанол, бензиловый спирт, фенилмеркурнитрат, тимерозол, сорбиновую кислоту, сорбат калия, бензойную кислоту, хлоркрезол и бензалкония хлорид.(iii) Preservatives and / or antimicrobials: multi-dose parenteral preparations require the addition of preservatives at a sufficient concentration to reduce the risk of infection of patients with infections during injection, and therefore, relevant regulatory requirements have been established. Common preservatives include m-cresol, phenol, methyl paraben, ethyl paraben, propyl paraben, butyl paraben, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenyl mercurnitrate, thimerosol, sorbic acid, potassium sorbate, benzoic acid, chlorocresol and benzalkonium chloride.

(iv) Стабилизирующие средства: стабилизация достигается путем усиления белок-стабилизирующих сил, дестабилизацией денатурированного состояния или путем прямого связывания наполнителей с белком. Стабилизирующими средствами могут быть аминокислоты, такие как аланин, аргинин, аспарагиновая кислота, глицин, гистидин, лизин, пролин, сахара, такие как глюкоза, сахароза, трегалоза, полиолы, такие как глицерин, маннит, сорбит, соли, такие как фосфат калия, сульфат натрия, хелатирующие средства, такие как ЭДТА, гексафосфат, лиганды, такие как ионы двухвалентных металлов (цинк, кальций и т.д.), другие соли или органические молекулы, такие как фенольные производные. Кроме того, олигомеры или полимеры, такие как циклодекстрины, декстран, дендримеры, ПЭГ или PVP или протамин или HAS могут быть использованы.(iv) Stabilizing agents: stabilization is achieved by enhancing protein-stabilizing forces, destabilizing a denatured state, or by directly binding excipients to a protein. The stabilizing agents may be amino acids such as alanine, arginine, aspartic acid, glycine, histidine, lysine, proline, sugars such as glucose, sucrose, trehalose, polyols such as glycerin, mannitol, sorbitol, salts such as potassium phosphate, sodium sulfate, chelating agents such as EDTA, hexaphosphate, ligands, such as divalent metal ions (zinc, calcium, etc.), other salts or organic molecules, such as phenolic derivatives. In addition, oligomers or polymers such as cyclodextrins, dextran, dendrimers, PEG or PVP or protamine or HAS can be used.

(v) Противопоглощающие средства: главным образом, ионные и неионные поверхностно-активные вещества или другие белки или растворимые полимеры используют для покрытия или адсорбции конкурентно на внутренней поверхности контейнера с композицией. Например, полоксамер (Плюроник F-68), ПЭГ додециловый сложный эфир (Brij 35), полисорбат 20 и 80, декстран, полиэтиленгликоль, ПЭГ-полигистидин, БСА и HSA и желатины. Выбор концентрации и тип наполнителя зависит от эффекта, которого следует избегать, но обычно монослой поверхностно-активного вещества формируется у поверхности немного выше СМС-величины.(v) Anti-absorbing agents: mainly ionic and nonionic surfactants or other proteins or soluble polymers are used to coat or adsorb competitively on the inner surface of the container with the composition. For example, poloxamer (Pluronic F-68), PEG dodecyl ester (Brij 35), polysorbate 20 and 80, dextran, polyethylene glycol, PEG-polyhistidine, BSA and HSA and gelatins. The choice of concentration and type of filler depends on the effect that should be avoided, but usually a monolayer of a surfactant is formed at the surface slightly above the SMS value.

(vi) Лио- и/или криопротектанты: В процессе сушки замораживанием или распылением наполнители могут противодействовать дестабилизирующим эффектам, возникающим в результате расщепления водородных связей и удаления воды. С этой целью сахара и полиолы могут быть использованы, но соответствующие положительные эффекты также наблюдали при использовании поверхностно-активных веществ, аминокислот, неводных растворителей и других пептидов. Трегалоза является наиболее эффективным средством для снижения вызванной увлажнением агрегации и также улучшает термостабильность, потенциально появляющуюся при воздействии воды на гидрофобные группы белка. Маннит и сахароза также могут быть использованы либо как единственный лио/криопротектант, либо в комбинации с любым другим средством, где более высокие отношения маннит:сахароза, как известно, усиливают физическую стабильность лиофилизированного материала. Маннит также можно комбинировать с трегалозой. Трегалоза также может быть комбинирована с сорбитом, или сорбит используют в качестве единственного протектанта. Крахмал или производные крахмала также могут быть использованы.(vi) Lyo and / or cryoprotectants: During freeze or spray drying, fillers can counteract the destabilizing effects resulting from the cleavage of hydrogen bonds and the removal of water. To this end, sugars and polyols can be used, but corresponding beneficial effects have also been observed using surfactants, amino acids, non-aqueous solvents and other peptides. Trehalose is the most effective way to reduce moisture-induced aggregation and also improves the thermal stability that potentially occurs when water affects the hydrophobic groups of a protein. Mannitol and sucrose can also be used either as a single lyo / cryoprotectant, or in combination with any other agent where higher mannitol: sucrose ratios are known to enhance the physical stability of the lyophilized material. Mannitol can also be combined with trehalose. Trehalose can also be combined with sorbitol, or sorbitol is used as the sole protectant. Starch or derivatives of starch can also be used.

(vii) Средства, защищающие от окисления: антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, эктоин, метионин, глутатион, монотиоглицерин, морин, полиэтиленимин (PEI), пропилгаллат, витамин E, хелатирующие средства, такие как лимонная кислота, ЭДТА, гексафосфат, тиогликолевая кислота.(vii) Anti-oxidation agents: antioxidants such as ascorbic acid, ectoin, methionine, glutathione, monothioglycerin, morin, polyethyleneimine (PEI), propyl gallate, vitamin E, chelating agents such as citric acid, EDTA, hexaphosphate, thioglycolic acid .

(viii) Загустители или повышающие вязкость средства: для торможения оседания частиц в пузырьке и шприце, и их используют, чтобы облегчить перемешивание и ресуспендирование частиц и сделать возможным более легкое инъецирование (т.е. малое усилие, создаваемое на поршень шприца). Подходящими загустителями или повышающими вязкость средствами являются, например, карбомерные загустители, подобные карбополу 940, карбополу Ultrez 10, производные целлюлозы, подобные гидроксипропилметилцеллюлозе (гипромеллоза, HPMC) или диэтиламиноэтилцеллюлозе (DEAE или DEAE-C), коллоидный силикат магния (Veegum) или силикат натрия, гидроксиапатитовый гель, трикальцийфосфатный гель, ксантаны, каррагенаны, подобные Satia gum UTC 30, алифатические поли(гидроксикислоты), такие как поли(D,L- или L-молочная кислота) (PLA) и поли(гликолевая кислота) (PGA) и их сополимеры (PLGA), терполимеры D,L-лактида, гликолида и капролактона, полоксамеры, гидрофильные блоки поли(оксиэтилена) и гидрофобные блоки поли(оксипропилена) для получения трехблочных сополимеров поли(оксиэтилен)-поли(оксипропилен)-поли(оксиэтилен) (например, Pluronic^®), сополимер простого и сложного эфиров, такой как сополимер полиэтиленгликольтерефталат/полибутилентерефталат, изобутират ацетата сахарозы (SAIB), декстран или его производные, комбинации декстранов и ПЭГ, полидиметилсилоксан, коллаген, хитозан, поливиниловый спирт (PVA) и производные, полиалкилимиды, поли(акриламид-со-диаллилдиметиламмоний (DADMA)), поливинилпирролидон (PVP), гликозаминогликаны (GAG), такие как дерматансульфат, хондроитинсульфат, кератансульфат, гепарин, гепарансульфат, гиалуронан, ABA трехблочные или AB блочные сополимеры, состоящие из гидрофобных A-блоков, таких как полилактид (PLA) или поли(лактид-со-гликолид) (PLGA), и гидрофильных B-блоков, таких как полиэтиленгликоль (PEG) или поливинилпирролидон. Такие блок-сополимеры, а также описанные выше полоксамеры могут проявлять способность к обратимому терморегулируемому гелеобразованию (жидкое состояние при комнатной температуре для облегчения введения и гелеобразное состояние при температуре выше температуры перехода золь-гель при температуре тела после инъекции).(viii) Thickeners or viscosifiers: to inhibit sedimentation of particles in a vial and syringe, and they are used to facilitate mixing and resuspension of particles and to allow easier injection (i.e., less force exerted on the syringe plunger). Suitable thickeners or viscosity enhancers are, for example, carbomer thickeners like carbopol 940, Ultrez 10 carbopol, cellulose derivatives like hydroxypropyl methylcellulose (hypromellose, HPMC) or diethylaminoethyl cellulose (DEAE or DEAE-C), colloidal magnesium silicate of magnesium (V) hydroxyapatite gel, tricalcium phosphate gel, xanthan gums, carrageenans like Satia gum UTC 30, aliphatic poly (hydroxy acids) such as poly (D, L or L-lactic acid) (PLA) and poly (glycolic acid) (PGA) and their copolymers (PLGA), terpolymers of D, L-lactide, glycolide and caprolactone, poloxamers, hydrophilic blocks of poly (oxyethylene) and hydrophobic blocks of poly (oxypropylene) to obtain three-block copolymers of poly (oxyethylene) poly (oxypropylene) poly (oxyethylene) (for example , Pluronic ^®), a copolymer of simple and complex esters such as the copolymer PETP / polybutylene terephthalate, sucrose acetate isobutyrate (SAIB), dextran or derivatives thereof, the combination of dextran and PEG, polydimethylsiloxane, collagen, chitosan, polyvinyl alcohol (PVA) and derivatives, poly- kilimides, poly (acrylamide-co-diallyldimethylammonium (DADMA)), polyvinylpyrrolidone (PVP), glycosaminoglycans (GAG), such as dermatan sulfate, chondroitin sulfate, keratan sulfate, heparin, heparan sulfate, AB hydrochloric, blocks, such as polylactide (PLA) or poly (lactide-co-glycolide) (PLGA); and hydrophilic B-blocks, such as polyethylene glycol (PEG) or polyvinylpyrrolidone. Such block copolymers, as well as the poloxamers described above, can exhibit reversible thermoregulated gelation (liquid state at room temperature to facilitate administration and a gel state at a temperature above the sol-gel transition temperature at body temperature after injection).

(ix) Способствующее проникновению или диффундирующее средство: средства, изменяющие проницаемость соединительной ткани посредством гидролиза компонентов внеклеточного матрикса в интерстициальном пространстве, такие как, но не ограниченные ими, гиалуроновая кислота, полисахарид, обнаруженные в межклеточном пространстве соединительной ткани. Способствующее проникновению средство, такое как, но не ограниченное им, гиалуронидаза, временно уменьшает вязкость внеклеточного матрикса и способствует диффузии инъецируемых лекарственных средств.(ix) Penetrating or diffusing agent: agents that modify the permeability of connective tissue by hydrolysis of extracellular matrix components in the interstitial space, such as, but not limited to, hyaluronic acid, a polysaccharide found in the intercellular space of connective tissue. An penetrating agent, such as, but not limited to, hyaluronidase, temporarily reduces the viscosity of the extracellular matrix and promotes the diffusion of injectable drugs.

(x) Другие дополнительные средства: такие как смачивающие средства, изменяющие вязкость средства, антибиотики, гиалуронидаза. Кислоты и основания, такие как хлористоводородная кислота и гидроксид натрия, являются вспомогательными средствами, необходимыми для регулирования рН в процессе производства.(x) Other additional agents: such as wetting agents, viscosity-modifying agents, antibiotics, hyaluronidase. Acids and bases, such as hydrochloric acid and sodium hydroxide, are auxiliary agents necessary for adjusting the pH during production.

Предпочтительно композиция пролекарства инсулин-гидрогель содержит один или более чем один загуститель и/или изменяющее вязкость средство.Preferably, the insulin hydrogel prodrug composition comprises one or more than one thickening agent and / or a viscosity-modifying agent.

Термин “наполнитель” предпочтительно относится к разбавителю, адъюванту или носителю, с которым терапевтическое средство вводят. Таким фармацевтическим связующим могут быть стерилизованные жидкости, такие как вода и масла, включающие продукты нефтепереработки, масла животного, растительного или искусственного происхождения, включающие, но не ограничивающиеся ими, арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное. Вода является предпочтительным наполнителем, когда фармацевтическую композицию вводят перорально. Физиологический раствор и водный раствор декстрозы являются предпочтительными наполнителями, когда фармацевтическую композицию вводят внутривенно. Физиологический раствор и водный раствор декстрозы и глицерина предпочтительно используют в качестве жидких связующих для инъецируемых растворов. Подходящие фармацевтические связующие включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, глицеринмоностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и тому подобного. Композиция, если желательно, также может содержать небольшие количества увлажняющих или эмульгирующих средств или регулирующие рН буферные средства. Указанные композиции могут быть изготовлены в виде растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, препаратов замедленного высвобождения и тому подобного. Композиция может быть изготовлена в виде суппозитория, с обычными связывающими средствами и связующими, такими как триглицериды. Пероральный препарат может включать обычные связующие, такие как фармацевтической чистоты маннит, лактозу, крахмал, стеарат магния, сахарид натрия, целлюлозу, карбонат магния и т.д. Примерами подходящих фармацевтических связующих являются вещества, описанные в “Remington's Pharmaceutical Sciences” автором E.W. Martin. Такие композиции будут содержать терапевтически эффективное количество терапевтического средства, предпочтительно в очищенном виде, вместе с подходящим количеством связующего с тем, чтобы приобрести форму для соответствующего введения больному. Препарат должен соответствовать способу введения.The term “excipient” preferably refers to a diluent, adjuvant or carrier with which the therapeutic agent is administered. Such pharmaceutical binders can be sterilized liquids, such as water and oils, including petroleum products, animal, vegetable or artificial oils, including, but not limited to, peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil, and the like. Water is a preferred excipient when the pharmaceutical composition is administered orally. Saline and aqueous dextrose are preferred excipients when the pharmaceutical composition is administered intravenously. Saline and an aqueous solution of dextrose and glycerol are preferably used as liquid binders for injectable solutions. Suitable pharmaceutical binders include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, skimmed milk powder, glycerin, propylene glycol, water, ethanol and the like. The composition, if desired, may also contain small amounts of moisturizing or emulsifying agents or pH adjusting buffers. These compositions can be made in the form of solutions, suspensions, emulsions, tablets, pills, capsules, powders, sustained release preparations and the like. The composition may be formulated as a suppository, with conventional binders and binders, such as triglycerides. The oral preparation may include conventional binders such as pharmaceutical grade mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharide, cellulose, magnesium carbonate, etc. Examples of suitable pharmaceutical binders are the substances described in “Remington's Pharmaceutical Sciences” by E.W. Martin Such compositions will contain a therapeutically effective amount of a therapeutic agent, preferably in purified form, together with a suitable amount of a binder in order to acquire a form for appropriate administration to a patient. The drug should match the route of administration.

В общем варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению, приготовлена ли она в сухом виде или в виде суспензии или в другом виде, может быть предназначена для однократного или многократного приема.In a general embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition according to the present invention, whether it is prepared in dry form or in the form of a suspension or in another form, may be intended for single or multiple administration.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения сухая композиция пролекарства инсулин-гидрогель предназначена в виде однократной дозы, что означает, что контейнер, в котором она находится, содержит одну фармацевтическую дозу.In one embodiment of the present invention, the dry insulin hydrogel prodrug composition is in a single dose, which means that the container in which it is contained contains one pharmaceutical dose.

Таким образом, в другом аспекте настоящего изобретения композиция предоставлена в виде композиции, содержащей разовую дозу.Thus, in another aspect of the present invention, the composition is provided as a composition containing a single dose.

Предпочтительно суспензионная композиция является композицией, предназначенной для многократного приема, что означает, что она содержит более чем одну терапевтическую дозу. Предпочтительно, композиция для многократного приема содержит по меньшей мере 2 дозы. Такая композиция для многократного приема инсулин-гидрогель может либо быть использована для разных больных по необходимости, либо может быть предназначена для использования одним больным, где остающиеся дозы хранятся после употребления первой дозы до тех пор, пока не потребуются.Preferably, the suspension composition is a composition intended for repeated administration, which means that it contains more than one therapeutic dose. Preferably, the composition for repeated administration contains at least 2 doses. Such a composition for repeated administration of an insulin-hydrogel can either be used for different patients as needed, or it can be intended for use by one patient, where the remaining doses are stored after consuming the first dose until required.

В другом аспекте настоящего изобретения композиция содержится в контейнере. Предпочтительно контейнер представляет собой двухкамерный шприц. В частности, сухая композиция согласно настоящему изобретению содержится в первой камере двухкамерного шприца, и раствор для реконструкции содержится во второй камере двухкамерного шприца.In another aspect of the present invention, the composition is contained in a container. Preferably, the container is a dual chamber syringe. In particular, the dry composition according to the present invention is contained in a first chamber of a two-chamber syringe, and a solution for reconstruction is contained in a second chamber of a two-chamber syringe.

До использования сухой композиции пролекарства инсулин-гидрогель больным по необходимости сухую композицию реконструируют. Реконструкцию можно осуществлять в контейнере, в котором сухая композиция, содержащая пролекарство инсулин-гидрогель, упакована, таком как пузырек, шприц, двухкамерный шприц, ампула и картридж. Реконструкцию осуществляют путем добавления предопределенного количества растворителя к сухой композиции. Растворителями являются стерилизованные жидкости, такие как вода или буфер, которые также могут содержать добавки, такие как консерванты и/или противомикробные средства. Если композиция, содержащая пролекарство инсулин-гидрогель, представлена в виде однократной дозы, растворитель может содержать один(одно) или более консервантов и/или противомикробных средств. Предпочтительно растворителем является стерилизованная вода. Если композиция, содержащая пролекарство инсулин-гидрогель, представлена в виде композиции, включающей множество доз, предпочтительно, чтобы растворитель содержал один или более консервант и/или противомикробное средство, такое как, например, бензиловый спирт и крезол.Before using the dry insulin-hydrogel prodrug prodrug composition to patients, the dry composition is reconstructed as necessary. Reconstruction can be carried out in a container in which a dry composition containing an insulin hydrogel prodrug is packaged, such as a vial, syringe, two-chamber syringe, ampoule and cartridge. The reconstruction is carried out by adding a predetermined amount of solvent to the dry composition. Solvents are sterilized liquids, such as water or a buffer, which may also contain additives, such as preservatives and / or antimicrobials. If the composition containing the insulin hydrogel prodrug is presented in a single dose, the solvent may contain one (one) or more preservatives and / or antimicrobials. Preferably, the solvent is sterilized water. If the composition containing the insulin-hydrogel prodrug is presented in a multi-dose composition, it is preferred that the solvent contains one or more preservatives and / or an antimicrobial agent, such as, for example, benzyl alcohol and cresol.

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к способу введения восстановленной композиции, содержащей пролекарство инсулин-гидрогель. Композиция, содержащая пролекарство инсулин-гидрогель, может быть введена посредством инъекции или инфузии, включающей внутрикожное, подкожное, внутримышечное, внутривенное, внутрикостное и внутрибрюшинное введение.An additional aspect of the present invention relates to a method for administering a reconstituted composition comprising an insulin hydrogel prodrug. A composition comprising an insulin hydrogel prodrug may be administered by injection or infusion, including intradermal, subcutaneous, intramuscular, intravenous, intraosseous and intraperitoneal administration.

Другим аспектом является способ получения восстановленной композиции, содержащей терапевтически эффективное количество пролекарства инсулин-гидрогель и, необязательно, одно или более фармацевтически приемлемых связующих, где инсулин временно связан с гидрогелем, способ, включающий следующие стадии:Another aspect is a method for producing a reconstituted composition comprising a therapeutically effective amount of an insulin-hydrogel prodrug and optionally one or more pharmaceutically acceptable binders, where the insulin is temporarily bound to the hydrogel, a method comprising the following steps:

• контакт композиции согласно настоящему изобретению с раствором для реконструкции.• contacting the composition according to the present invention with a solution for reconstruction.

Другим аспектом является восстановленная композиция, содержащая терапевтически эффективное количество пролекарства инсулин-гидрогель и, необязательно, одно или более фармацевтически приемлемых связующих, где инсулин временно связан с гидрогелем, получаемым описанным выше способом.Another aspect is a reconstituted composition comprising a therapeutically effective amount of an insulin-hydrogel prodrug and, optionally, one or more pharmaceutically acceptable binders, where the insulin is temporarily bound to the hydrogel obtained by the method described above.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ производства сухой композиции, содержащей пролекарство инсулин-гидрогель. В одном варианте осуществления изобретения такую суспензионную композицию приготавливают путемAnother aspect of the present invention is a method for producing a dry composition comprising an insulin hydrogel prodrug. In one embodiment of the invention, such a suspension composition is prepared by

(i) смешивания пролекарства инсулин-гидрогель с одним или более наполнителями,(i) mixing an insulin hydrogel prodrug with one or more excipients,

(ii) перенос количества, эквивалентного разовой дозе или множеству доз, в подходящий контейнер,(ii) transferring an amount equivalent to a single dose or multiple doses to a suitable container,

(iii) сушка композиции в указанном контейнере, и(iii) drying the composition in said container, and

(iv) герметичная упаковка контейнера.(iv) sealed container packaging.

Подходящими контейнерами являются пузырьки, шприцы, двухкамерные шприцы, ампулы и картриджи.Suitable containers are vials, syringes, dual chamber syringes, ampoules, and cartridges.

Другим аспектом является набор из элементов. В случае, когда устройством для введения является только шприц для подкожных введений, тогда набор может включать шприц, иглу и контейнер, содержащий сухую композицию, включающую пролекарство инсулин-гидрогель, для использования со шприцом, и второй контейнер, содержащий растворитель. В более предпочтительных вариантах осуществления изобретения инъекционным устройством является устройство, отличное от простого шприца для подкожных инъекций, и, таким образом, отдельный контейнер с восстановленным пролекарством инсулин-гидрогель приспосабливают для подключения к инъекционному устройству, так что при использовании устройства жидкая композиция в контейнере находится в жидкостном патрубке, соединенном с отверстием устройства для инъекции. Примеры устройств для введения включают, но не ограничиваются ими, шприцы для подкожных инъекций и шприц-ручки. В частности, предпочтительными устройствами для инъекций являются шприц-ручки, в случае которых контейнером является картридж, предпочтительно картридж одноразового действия.Another aspect is a set of elements. In the case where the administration device is only a hypodermic syringe, then the kit may include a syringe, a needle and a container containing a dry composition comprising an insulin hydrogel prodrug for use with a syringe and a second container containing a solvent. In more preferred embodiments, the injection device is a device other than a simple hypodermic syringe, and thus the separate insulin-hydrogel reconstituted prodrug container is adapted to be connected to the injection device, so that when using the device, the liquid composition in the container is in a fluid nozzle connected to an opening of the injection device. Examples of administration devices include, but are not limited to, hypodermic syringes and syringe pens. In particular, preferred injection devices are syringe pens, in which case the container is a cartridge, preferably a single-use cartridge.

Предпочтительный набор элементов включает иглу и контейнер, содержащий композицию согласно настоящему изобретению и необязательно также содержащий растворитель, причем контейнер приспособлен для использования с иглой. Предпочтительно контейнером является двухкамерный шприц.A preferred set of elements includes a needle and a container containing a composition according to the present invention and optionally also containing a solvent, the container being adapted for use with a needle. Preferably, the container is a dual chamber syringe.

В другом аспекте изобретение предоставляет картридж, содержащий композицию, включающую пролекарство инсулин-гидрогель, описанную выше, для использования со шприцом-ручкой. Картридж может содержать одноразовую дозу или множество доз инсулина.In another aspect, the invention provides a cartridge comprising a composition comprising the insulin hydrogel prodrug described above for use with a pen syringe. The cartridge may contain a single dose or multiple doses of insulin.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения суспензионная композиция, содержащая пролекарство инсулин-гидрогель, не только включает пролекарство инсулин-гидрогель и одно или более чем одно связующее, но также другие биологически активные средства, либо в их свободной форме, либо в виде пролекарств. Предпочтительно, таким дополнительным одним или более одного биологически активным средством является пролекарство, более предпочтительно гидрогелевое пролекарство. Такие биологически активные средства включают, но не ограничиваются ими, соединения следующих классов:In one embodiment of the present invention, a suspension composition comprising an insulin hydrogel prodrug not only includes an insulin hydrogel prodrug and one or more binders, but also other biologically active agents, either in their free form or in the form of prodrugs. Preferably, such an additional one or more biologically active agents is a prodrug, more preferably a hydrogel prodrug. Such biologically active agents include, but are not limited to, compounds of the following classes:

(i) сульфонилмочевины, такие как, например, хлорпропамид, толазамид, толбутамид, глибурид, глипизид, глимепирид и тому подобное,(i) sulfonylureas, such as, for example, chlorpropamide, tolazamide, tolbutamide, glyburide, glipizide, glimepiride and the like,

(ii) меглитиниды, такие как, например, репаглинид,(ii) meglitinides, such as, for example, repaglinide,

(iii) глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1) и его миметики, глюкозо-инсулинотропный пептид (GIP) и его миметики, эксендин и его миметики и ингибиторы дипептилпротеазы (DPPIV),(iii) glucagon-like peptide-1 (GLP-1) and its mimetics, glucose-insulinotropic peptide (GIP) and its mimetics, exendin and its mimetics and dipeptyl protease inhibitors (DPPIV),

(iv) бигуаниды, такие как, например, метформин,(iv) biguanides, such as, for example, metformin,

(v) тиазолидиндионы, такие как, например, розиглитазон, пиоглитазон, троглитазон, изаглитазон (известный как MCC-555), 2-[2-[(2R)-4-гексил-3,4-дигидро-3-оксо-2H-1,4-бензоксазин-2-ил]этокси]бензолуксусная кислота и тому подобное,(v) thiazolidinediones, such as, for example, rosiglitazone, pioglitazone, troglitazone, isaglitazone (known as MCC-555), 2- [2 - [(2R) -4-hexyl-3,4-dihydro-3-oxo-2H -1,4-benzoxazin-2-yl] ethoxy] benzeneacetic acid and the like,

(vi) GW2570 и тому подобное,(vi) GW2570 and the like,

(vii) модуляторы рецептора ретиноида-Х (RXR), такие как, например, таргретин, 9-цис-ретиноевая кислота и тому подобное,(vii) retinoid-X receptor modulators (RXR), such as, for example, tarretin, 9-cis-retinoic acid and the like,

(viii) другие инсулин-сенсибилизирующие средства, такие как, например, INS-1, ингибиторы PTP-1B, ингибиторы GSK3, ингибиторы гликогенфосфорилазы, ингибиторы фруктозо-1,6-бисфосфатазы и тому подобное,(viii) other insulin sensitizing agents such as, for example, INS-1, PTP-1B inhibitors, GSK3 inhibitors, glycogen phosphorylase inhibitors, fructose-1,6-bisphosphatase inhibitors and the like,

(ix) инсулины, включающие инсулины регулярного или короткого действия, промежуточного действия и длительного действия инсулины, ингалируемый инсулин и аналоги инсулина, такие как молекулы инсулина с минорными различиями в природной последовательности аминокислот,(ix) insulins, including regular or short acting insulins, intermediate and long acting insulins, inhaled insulin, and insulin analogs, such as insulin molecules with minor differences in the natural amino acid sequence,

(x) малая молекула имитирует инсулин, включающая, но не ограниченная ими, L-783281, TE-17411 и тому подобное,(x) a small molecule mimics insulin, including, but not limited to, L-783281, TE-17411 and the like,

(xi) ингибиторы котранспортера Na-глюкозы, такие как T-1095, T-1095A, флоризин и тому подобное,(xi) Na-glucose cotransporter inhibitors such as T-1095, T-1095A, florizin and the like,

(xii) агонисты амилина, которые включают, но не ограничиваются ими, прамлинтид и тому подобное,(xii) amylin agonists, which include, but are not limited to, pramlintide and the like,

(xiii) антагонисты глюкагона, такие как AY-279955, и тому подобное.(xiii) glucagon antagonists, such as AY-279955, and the like.

Кроме антидиабетических средств, биоактивными соединениями могут быть средства от ожирения, такие как орлистат, ингибитор панкреатической липазы, который предотвращает расщепление и абсорбцию жира; или сибутрамин, подавляющее аппетит средство и ингибитор обратного захвата серотонина, норэпинефрин и дофамин в головном мозге, факторы роста, увеличивающие мобилизацию жира (например, гормон роста, IGF-1, фактор, высвобождающий гормон роста), оксинтомодулин и модуляторы грелина. Другие потенциальные биоактивные средства от ожирения включают, но не ограничиваются ими, подавляющие аппетит средства, действующие посредством адренергических механизмов, такие как бензфетамин, фенметразин, фентермин, диэтилпропион, мазиндол, сибутрамин, фенилпропаноламин или эфедрин; подавляющие аппетит средства, действующие посредством серотонинергических механизмов, такие как квипазин, флуоксетин, сертралин, фенфлурамин или дексфенфлурамин; подавляющие аппетит средства, действующие посредством дофаминовых механизмов, например, апоморфин; подавляющие аппетит средства, действующие посредством гистаминергических механизмов (например, миметики гистамина, модуляторы Н3-рецепторов); усиливающие расход энергии средства, такие как агонисты бета-3 аденергических рецепторов и стимуляторы функции разобщающего белка; лептин и миметики лептина (например, метрелептин); антагонисты нейропептида Y; модуляторы рецепторов меланокортина-1, -3 и -4; агонисты холецистокинина; миметики глюкагоно-подобного пептида-1 (GLP-1) и аналоги (например, эксендин); андрогены (например, дегидроэпиандростерон и производные, такие как этиохоландион), тестостерон, анаболические стероиды (например, оксандролон) и стероидные гормоны; антагонисты рецептора галанина; цитокиновые средства, такие как цилиарный нейротрофический фактор; ингибиторы амилазы; агонисты/миметики энтеростатина; антагонисты орексина/гипокретина; антагонисты урокортина; агонисты бомбезина; модуляторы протеинкиназы А; миметики кортикотропин-рилизинг фактора; миметики кокаин- и амфетамин-регулируемого транскрипта; миметики пептида, кодируемого геном кальцитонина; и ингибиторы синтазы жирных кислот.In addition to antidiabetic agents, bioactive compounds may include anti-obesity agents, such as orlistat, a pancreatic lipase inhibitor that prevents the breakdown and absorption of fat; or sibutramine, an appetite suppressant and serotonin reuptake inhibitor, norepinephrine and dopamine in the brain, growth factors that increase fat mobilization (e.g., growth hormone, IGF-1, growth hormone releasing factor), oxyntomodulin and ghrelin modulators. Other potential bioactive anti-obesity drugs include, but are not limited to, appetite suppressants acting by adrenergic mechanisms such as benzphetamine, phenmethrazine, phentermine, diethyl propion, mazindole, sibutramine, phenylpropanolamine or ephedrine; appetite suppressants by serotonergic mechanisms such as quipazine, fluoxetine, sertraline, fenfluramine or dexfenfluramine; appetite suppressants, acting through dopamine mechanisms, for example, apomorphine; appetite suppressants, acting through histaminergic mechanisms (for example, histamine mimetics, H3 receptor modulators); energy-enhancing agents, such as beta-3 adenergic receptor agonists and stimulators of uncoupling protein function; leptin and leptin mimetics (e.g. metreleptin); antagonists of neuropeptide Y; melanocortin-1, -3, and -4 receptor modulators; cholecystokinin agonists; glucagon-like peptide-1 mimetics (GLP-1) and analogs (e.g., exendin); androgens (e.g., dehydroepiandrosterone and derivatives such as etiocholandion), testosterone, anabolic steroids (e.g. oxandrolone) and steroid hormones; galanin receptor antagonists; cytokine agents such as ciliary neurotrophic factor; amylase inhibitors; enterostatin agonists / mimetics; orexin / hypocretin antagonists; urocortin antagonists; bombesin agonists; protein kinase A modulators; mimetics of corticotropin releasing factor; ***e and amphetamine-regulated transcript mimetics; mimetics of the peptide encoded by the calcitonin gene; and fatty acid synthase inhibitors.

В альтернативном варианте осуществления изобретения композицию, содержащую пролекарство инсулин-гидрогель согласно настоящему изобретению, комбинируют со вторым биологически активным соединением таким способом, что пролекарство инсулин-гидрогель вводят больному по необходимости вначале с последующим введением второго соединения. Альтернативно, композицию, содержащую пролекарство инсулин-гидрогель, вводят больному по необходимости после введения другого соединения тому же больному.In an alternative embodiment, the composition comprising the insulin-hydrogel prodrug of the present invention is combined with the second biologically active compound in such a way that the insulin-hydrogel prodrug is administered to the patient, if necessary, first followed by administration of the second compound. Alternatively, a composition comprising an insulin hydrogel prodrug is administered to a patient as necessary after administration of another compound to the same patient.

Еще другим аспектом настоящего изобретения является пролекарство согласно настоящему изобретению или фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению для использования в качестве лекарственного препарата.Another aspect of the present invention is a prodrug of the present invention or a pharmaceutical composition of the present invention for use as a medicament.

Еще другим аспектом настоящего изобретения является пролекарство согласно настоящему изобретению или фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению для использования в способе лечения или предотвращения заболеваний или нарушений, которые можно лечить инсулином.Another aspect of the present invention is a prodrug according to the present invention or a pharmaceutical composition according to the present invention for use in a method for treating or preventing diseases or disorders that can be treated with insulin.

Такими заболеваниями или нарушениями являются, например, гипергликемия, предиабет, нарушение толерантности к глюкозе, диабет типа I, диабет типа II, синдром X, ожирение, гипертензия.Such diseases or disorders are, for example, hyperglycemia, prediabetes, impaired glucose tolerance, type I diabetes, type II diabetes, syndrome X, obesity, hypertension.

Пациентами, требующими лечения композициями инсулина длительного действия, описанными в настоящем изобретении, являются пациенты с высоким риском развития сопутствующих заболеваний. Соответственно, комбинацию инсулина длительного действия согласно настоящему изобретению с соответствующими биоактивными соединениями можно использовать, например, для предотвращения, замедления развития или лечения заболеваний и нарушений, выбранных из группы, состоящей из гипертензии (включающей, но не ограничивающейся ими, изолированную систолическую гипертензию и семейную дислипидемическую гипертензию), застойной сердечной недостаточности, гипертрофии левого желудочка, болезни периферических артерий, диабетической ретинопатии, дегенерации желтого пятна, катаракты, диабетической нефропатии, гломерулосклероза, хронической почечной недостаточности, диабетической нейропатии, синдрома Х, предменструального синдрома, ишемической болезни сердца, стенокардии, тромбоза, атеросклероза, инфаркта миокарда, преходящего нарушения мозгового кровообращения, удара, рестеноза сосуда, гипергликемии, гиперинсулинемии, гиперлипидемии, гипертриглицеридемии, инсулинорезистентности, нарушения метаболизма глюкозы, состояний нарушения толерантности к глюкозе, нарушенной гликемии натощак, ожирения, эректильной дисфункции, кожных заболеваний и нарушений со стороны соединительной ткани, диабетической стопы и язвенного колита, эндотелиальной дисфункции и нарушения податливости сосудов.Patients requiring treatment with the long acting insulin compositions described in the present invention are those at high risk of developing concomitant diseases. Accordingly, the combination of long-acting insulin according to the present invention with the corresponding bioactive compounds can be used, for example, to prevent, slow the development or treatment of diseases and disorders selected from the group consisting of hypertension (including, but not limited to, isolated systolic hypertension and familial dyslipidemic hypertension), congestive heart failure, left ventricular hypertrophy, peripheral artery disease, diabetic retinopath AI, macular degeneration, cataracts, diabetic nephropathy, glomerulosclerosis, chronic renal failure, diabetic neuropathy, X syndrome, premenstrual syndrome, coronary heart disease, angina pectoris, thrombosis, atherosclerosis, myocardial infarction, transient cerebrovascular accident, cerebrovascular accident, , hyperinsulinemia, hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, insulin resistance, impaired glucose metabolism, impaired glucose tolerance, impaired gly fasting kemia, obesity, erectile dysfunction, skin diseases and disorders of the connective tissue, diabetic foot and ulcerative colitis, endothelial dysfunction and impaired vascular compliance.

Предотвращение, замедление развития или лечение заболеваний и нарушений, выбранных из указанной выше группы, может быть достигнуто путем комбинирования композиции, содержащей инсулин длительного действия согласно настоящему изобретению по меньшей мере с одним биоактивным соединением, выбранным из классов лекарственных средств, используемых для лечения описанных выше состояний, включая антагонисты АТ₁-рецептора; ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента (АСЕ); ингибиторы ренина; блокаторы бета-адренергических рецепторов; блокаторы альфа-адренергических рецепторов; блокаторы кальциевых каналов; ингибиторы альдостеронсинтазы; антагонисты рецепторов альдостерона; ингибиторы нейтральной эндопептидазы (NEP); ингибиторы двойного действия ангиотензин-превращающего фермента/нейтральной эндопептидазы (ACE/NEP); антагонисты рецепторов эндотелина; диуретики; статины; нитраты; антикоагулянты; натрийуретические пептиды; препараты наперстянки; модуляторы PPAR.Prevention, retardation or treatment of diseases and disorders selected from the above group can be achieved by combining a composition containing long-acting insulin according to the present invention with at least one bioactive compound selected from the classes of drugs used to treat the above conditions including antagonists of the AT ₁ receptor; angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors; renin inhibitors; beta adrenergic receptor blockers; alpha adrenergic receptor blockers; calcium channel blockers; aldosterone synthase inhibitors; aldosterone receptor antagonists; neutral endopeptidase inhibitors (NEP); angiotensin converting enzyme / neutral endopeptidase double acting inhibitors (ACE / NEP); endothelin receptor antagonists; diuretics; statins nitrates; anticoagulants; natriuretic peptides; digitalis preparations PPAR modulators.

В случае биологически активных средств пролекарства, особенно пролекарства, включающие гидрогель, содержат одну или более кислотных или основных групп, изобретение также включает их соответствующие фармацевтически или токсикологически приемлемые соли, в частности, их фармацевтически приемлемые соли. Таким образом, пролекарства, которые содержат кислотные группы, могут быть использованы согласно изобретению, например, в качестве солей щелочных металлов, солей щелочноземельных металлов или аммониевых солей. Точнее, примеры таких солей включают натриевые соли, калиевые соли, кальциевые соли, магниевые соли или соли с аммиаком или органическими аминами, такими как, например, этиламин, этаноламин, триэтаноламин или аминокислоты. Пролекарства, которые содержат одну или более основных групп, т.е. групп, которые могут быть протонированы, могут быть представлены и использованы согласно изобретению в виде их аддитивных солей с неорганическими или органическими кислотами. Примеры подходящих кислот включают хлористоводородную кислоту, бромистоводородную кислоту, фосфорную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, метансульфокислоту, пара-толуолсульфокислоту, нафталиндисульфокислоты, щавелевую кислоту, уксусную кислоту, винную кислоту, молочную кислоту, салициловую кислоту, бензойную кислоту, муравьиную кислоту, пропионовую кислоту, триметилуксусную кислоту, диэтилуксусную кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, пимелиновую кислоту, фумаровую кислоту, малеиновую кислоту, яблочную кислоту, сульфаминовую кислоту, фенилпропионовую кислоту, глюконовую кислоту, аскорбиновую кислоту, изоникотиновую кислоту, лимонную кислоту, адипиновую кислоту и другие кислоты, известные специалисту в данной области. Если пролекарства одновременно содержат кислотные и основные группы в молекуле, изобретение также включает, кроме указанных выше солевых форм, внутренние соли или бетаины (цвиттерионы). Соответствующие соли могут быть получены общепринятыми способами, известными специалисту в данной области, подобно, например, взаимодействию их с органической или неорганической кислотой или основанием в растворителе или диспергирующем средстве, или анионному обмену или катионному обмену с другими солями. Настоящее изобретение также включает все соли пролекарств, которые из-за их низкой физиологической совместимости не используются прямо в качестве фармацевтических препаратов, но которые могут быть использованы, например, в качестве промежуточных соединений для химических реакций или для приготовления фармацевтически приемлемых солей.In the case of biologically active agents, prodrugs, especially prodrugs including a hydrogel, contain one or more acidic or basic groups, the invention also includes their respective pharmaceutically or toxicologically acceptable salts, in particular their pharmaceutically acceptable salts. Thus, prodrugs that contain acid groups can be used according to the invention, for example, as alkali metal salts, alkaline earth metal salts or ammonium salts. More specifically, examples of such salts include sodium salts, potassium salts, calcium salts, magnesium salts or salts with ammonia or organic amines, such as, for example, ethylamine, ethanolamine, triethanolamine or amino acids. Prodrugs that contain one or more major groups, i.e. groups that can be protonated can be represented and used according to the invention in the form of their addition salts with inorganic or organic acids. Examples of suitable acids include hydrochloric acid, hydrobromic acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, methanesulfonic acid, para-toluenesulfonic acid, naphthalene disulfonic acid, oxalic acid, acetic acid, tartaric acid, lactic acid, salicylic acid, benzoic acid, salicylic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid, benzoic acid , trimethylacetic acid, diethylacetic acid, malonic acid, succinic acid, pimelic acid, fumaric acid, maleic acid, malic acid, sulfa minic acid, phenylpropionic acid, gluconic acid, ascorbic acid, isonicotinic acid, citric acid, adipic acid and other acids known to the person skilled in the art. If prodrugs simultaneously contain acidic and basic groups in the molecule, the invention also includes, in addition to the salt forms indicated above, internal salts or betaines (zwitterions). Appropriate salts can be prepared by conventional methods known to one skilled in the art, for example, by reacting them with an organic or inorganic acid or base in a solvent or dispersant, or by anion exchange or cation exchange with other salts. The present invention also includes all salts of prodrugs which, due to their low physiological compatibility, are not directly used as pharmaceuticals, but which can be used, for example, as intermediates for chemical reactions or for the preparation of pharmaceutically acceptable salts.

Термин “фармацевтически приемлемый” означает, что он утвержден надзорным органом, таким как EMEA (Европа) и/или FDA (США) и/или любым другим национальным надзорным органом, для использования у животных, предпочтительно у людей.The term “pharmaceutically acceptable” means that it is approved by a regulatory authority such as EMEA (Europe) and / or FDA (USA) and / or any other national regulatory authority for use in animals, preferably humans.

Еще другим аспектом настоящего изобретения является способ лечения, контролирования, замедления или предотвращения у больного млекопитающего, предпочтительно у человека, при необходимости лечения одного или более состояний, включающий введение указанному больному терапевтически эффективного количества пролекарства согласно настоящему изобретению или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли.Another aspect of the present invention is a method of treating, controlling, slowing down or preventing a sick mammal, preferably a human, if necessary, treating one or more conditions, comprising administering to said patient a therapeutically effective amount of a prodrug of the present invention or a pharmaceutical composition of the present invention or its pharmaceutically acceptable salt.

На фиг.1a представлена UPLC хроматограмма конъюгата инсулин-линкер 12a.On figa presents UPLC chromatogram of the conjugate insulin-linker 12a.

На фиг.1b представлена UPLC хроматограмма конъюгата инсулин-линкер 12b.Figure 1b shows an UPLC chromatogram of an insulin-linker conjugate 12b.

На фиг.2 представлена средняя концентрация инсулина в плазме животного 1-10 после однократной подкожной дозы испытуемого препарата 11a, содержащего 6 мг инсулина, у здоровых крыс в течение 2-недельного периода (планки погрешностей даны как ± стандартное отклонение, которое определено для всех 10 животных, t₀ величины взяты в течение 3 дней до дозировки).Figure 2 shows the average concentration of insulin in animal plasma 1-10 after a single subcutaneous dose of the test drug 11a containing 6 mg of insulin in healthy rats over a 2-week period (error bars are given as ± standard deviation, which is defined for all 10 animals, t ₀ values taken within 3 days before dosing).

На фиг.3 показана средняя концентрация инсулина в плазме животного 1-8 после однократной дозы подкожно испытуемого препарата 11da, содержащего 3 мг инсулина, у здоровых крыс в течение периода 13 дней (планки погрешностей даны как ± стандартное отклонение, которое определено для всех 8 животных, t₀ величины взяты в течение 1 дня до дозировки).Figure 3 shows the average plasma insulin concentration of an animal 1-8 after a single dose of a subcutaneous test preparation 11da containing 3 mg of insulin in healthy rats over a period of 13 days (error bars are given as ± standard deviation, which is defined for all 8 animals , t ₀ values taken within 1 day before dosing).

На фиг.4 показана концентрация инсулина в плазме (квадраты серого цвета) и уровень глюкозы в крови (кружки черного цвета) после однократной дозы подкожно испытуемого препарата 11da, содержащего 6,4 мг инсулина, у крыс с диабетом (n=7) (планки погрешностей даны как ± стандартное отклонение, которое определено для всех 7 животных, t₀ величины взяты в течение 4 дней до дозировки).Figure 4 shows the plasma insulin concentration (gray squares) and blood glucose (black circles) after a single dose of the 11da subcutaneously tested drug containing 6.4 mg of insulin in rats with diabetes (n = 7) (bars errors are given as ± standard deviation, which is determined for all 7 animals, t ₀ values taken within 4 days before dosing).

На фиг.5 показан средний уровень инсулина в плазме после однократной дозы подкожно, содержащей 8 мг/кг испытуемого препарата 11db, у здоровых крыс в течение первых 24 часов после дозировки (анализ выброса). 8 крыс разделяли на 2 группы и образцы крови для фармакокинетики отбирали, чередуя между обеими группами. Ни в одной из групп не был заметен эффект выброса (планки погрешностей даны как ± стандартное отклонение, которое определено для всех животных на группу, t₀ величины взяты в течение 1 дня до дозировки).Figure 5 shows the average plasma insulin level after a single subcutaneous dose containing 8 mg / kg of the 11db test drug in healthy rats during the first 24 hours after dosing (emission analysis). 8 rats were divided into 2 groups and blood samples for pharmacokinetics were taken alternating between both groups. Ejection effect was not noticeable in any of the groups (error bars are given as ± standard deviation, which is defined for all animals per group, t ₀ values were taken within 1 day before dosing).

На фиг.6 показана концентрация инсулина в плазме (квадраты серого цвета) уровень глюкозы в крови (кружки черного цвета) в течение 4-недельного периода после подкожных доз 8 мг/кг испытуемого препарата 11da, вводимых один раз в неделю в течение 3 недель, у крыс с диабетом (n=8) (планки погрешностей даны как ± стандартное отклонение, которое определено для всех 8 животных, t₀ величины взяты в течение 3 дней до дозировки).6 shows the plasma insulin concentration (gray squares), the blood glucose level (black circles) for a 4-week period after subcutaneous doses of 8 mg / kg of the 11da test drug, administered once a week for 3 weeks, in rats with diabetes (n = 8) (error bars are given as ± standard deviation, which is defined for all 8 animals, t ₀ values were taken within 3 days before dosing).

На фиг.7 показана средняя концентрация инсулина в плазме животного 1-8 (животное 1-4 и животное 5-8 для 0,3, 1 ч, 2 и 4 ч величины, соответственно) после однократной инъекции подкожно инсулина 12 мг/кг, содержащегося в испытуемом препарате 11dc, у здоровых крыс в течение периода 13 дней (планки погрешностей даны как ± стандартное отклонение, которое определено для всех 8 животных, t₀ величины взяты в течение 4 дней до дозировки).7 shows the average concentration of insulin in the plasma of an animal 1-8 (animal 1-4 and animal 5-8 for 0.3, 1 h, 2 and 4 h values, respectively) after a single injection of subcutaneous insulin 12 mg / kg, contained in the test preparation 11dc, in healthy rats for a period of 13 days (error bars are given as ± standard deviation, which is defined for all 8 animals, t ₀ values were taken within 4 days before dosing).

На фиг.8 показано наложение высвобождения инсулина и деградации гидрогеля инсулин-линкер-гидрогеля 11а. Количество инсулина, содержащееся в инсулин-линкер-гидрогеле (треугольники), и высвобождение каркасных фрагментов (кружочки) при инкубации инсулин-линкер-гидрогеля при рН 7,4 и 37°С отложено на графике против времени инкубации.On Fig shows the overlap of the release of insulin and degradation of the hydrogel insulin-linker-hydrogel 11a. The amount of insulin contained in the insulin-linker-hydrogel (triangles) and the release of frame fragments (circles) during incubation of the insulin-linker-hydrogel at pH 7.4 and 37 ° C are plotted against the time of incubation.

На фиг.9 представлен график, изображающий кривые усилия против скорости потока при использовании иглы 30 G. Символьные знаки: черные квадраты = этиленгликоль; черные треугольники = вода; черные точки = пролекарство инсулин-гидрогель.Fig. 9 is a graph depicting force versus flow rate curves using a 30 G needle. Symbols: black squares = ethylene glycol; black triangles = water; black dots = prodrug insulin hydrogel.

ПримерыExamples

Материалы и методыMaterials and methods

Рекомбинантный человеческий инсулин получали от компании Biocon Ltd., Bangalore, India.Recombinant human insulin was obtained from Biocon Ltd., Bangalore, India.

Продукт ПЭГ-амин, представленный 4 ветвями полимера, 5 кДа получали от компании JenKem Technology, Beijing, P.R. China.The product PEG-amine, represented by 4 polymer branches, 5 kDa was obtained from JenKem Technology, Beijing, P.R. China

N-(3-малеимидопропил)-21-амино-4,7,10,13,16,19-гексаоксагенэйкозановой кислоты NHS-сложный эфир (Mal-ПЭГ6-NHS) получали от компании Celares GmbH, Berlin, Germany.N- (3-maleimidopropyl) -21-amino-4,7,10,13,16,19-hexaoxagenicheicosanoic acid NHS ester (Mal-PEG6-NHS) was obtained from Celares GmbH, Berlin, Germany.

2-хлортритилхлоридную смолу, HATU, N-циклогексилкарбодиимид-N'-метилполистирол и аминокислоты приобретали от компании Merck Biosciences GmbH, Schwalbach/Ts, Germany, если не указано иное.A 2-chlorotrityl chloride resin, HATU, N-cyclohexylcarbodiimide-N'-methyl polystyrene and amino acids were purchased from Merck Biosciences GmbH, Schwalbach / Ts, Germany, unless otherwise indicated.

Fmoc(NMe)-Asp(OtBu)-OH получали от компании Bachem AG, Bubendorf, Switzerland. S-тритил-6-меркаптогексановую кислоту приобретали от компании Polypeptide, Strasbourg, France. Используемые аминокислоты были L-конфигурации, если не указано иное.Fmoc (NMe) -Asp (OtBu) -OH was obtained from Bachem AG, Bubendorf, Switzerland. S-trityl-6-mercaptohexanoic acid was purchased from Polypeptide, Strasbourg, France. The amino acids used were in L configuration unless otherwise indicated.

Все другие вещества были от компании Sigma-ALDRICH Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany.All other substances were from Sigma-ALDRICH Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany.

Твердофазный синтез осуществляли на 2-хлортритилхлоридной смоле (TCP) с нагрузкой 1,3 ммоль/г. Шприцы, снабженные полипропиленовыми фриттами, использовали в качестве реакционных сосудов.Solid phase synthesis was carried out on a 2-chlorotrityl chloride resin (TCP) with a load of 1.3 mmol / g. Syringes equipped with polypropylene frits were used as reaction vessels.

Посадку первой аминокислоты на смолы осуществляли согласно инструкциям производителей.The landing of the first amino acid on the resin was carried out according to the instructions of the manufacturers.

Удаление группы Fmoc:Removing an Fmoc Group:

Для удаления Fmoc-защитной группы, смолу перемешивали со смесью 2/2/96 (об./об./об.) пиперидин/DBU/ДМФ (два раза, 10 мин каждый раз) и промывали ДМФ (десять раз).To remove the Fmoc-protecting group, the resin was mixed with a mixture of 2/2/96 (v / v / v) piperidine / DBU / DMF (two times, 10 minutes each time) and washed with DMF (ten times).

Удаление Fmoc-группы у Fmoc-Aib-нагруженных смол:Removal of the Fmoc group from Fmoc-Aib-loaded resins:

Удаление Fmoc-группы у иммобилизованного Fmoc-Aib-OH достигали путем перемешивания смолы в смеси ДМФ/пиперидин 4/1 (об./об.) при 50°С в течение 20 мин (2 раза).Removal of the Fmoc group in immobilized Fmoc-Aib-OH was achieved by mixing the resin in a mixture of DMF / piperidine 4/1 (vol./about.) At 50 ° C for 20 min (2 times).

Протокол расщепления для 2-хлортритилхлоридной смолы:Cleavage Protocol for 2-chlorotrityl chloride resin:

по окончании синтеза, смолу промывали DCM, сушили в вакууме и обрабатывали два раза в течение 30 минут смесью 6/4 (об./об.) DCM/HFIP. Элюаты объединяли, летучие соединения удаляли в токе азота, и полученный сырой продукт очищали ОФ-ВЭЖХ. Фракции после ВЭЖХ, содержащие продукт объединяли и лиофилизировали.upon completion of the synthesis, the resin was washed with DCM, dried in vacuo and treated twice for 30 minutes with 6/4 (v / v) DCM / HFIP. The eluates were combined, volatiles were removed in a stream of nitrogen, and the resulting crude product was purified by RP-HPLC. HPLC fractions containing the product were combined and lyophilized.

Аминсодержащие продукты, полученные в виде ТФУ-солей, превращали в соответствующие HCl-соли, используя ионообменную смолу (Discovery DSC-SAX, Supelco, USA). Указанную стадию осуществляли в случае, если остаточная кислота ТФУ, как полагали, препятствует, например, последующей реакции сочетания.Amine-containing products obtained as TFA salts were converted to the corresponding HCl salts using an ion exchange resin (Discovery DSC-SAX, Supelco, USA). The specified stage was carried out in the event that the residual acid TFA was believed to prevent, for example, the subsequent coupling reaction.

Очистка посредством ОФ-ВЭЖХ:Purification by RP-HPLC:

ОФ-ВЭЖХ осуществляли на колонке 100×20 мм или 100×40 мм C18 ReproSil-Pur 300 ODS-3 5 мкм (Dr. Maisch, Ammerbuch, Germany), соединенной с системой Waters 600 ВЭЖХ и детектором абсорбции 2487 фирмы Waters. Линейные градиенты раствора A (0,1% ТФУ в H₂O) и раствора B (0,1% ТФУ в ацетонитриле) использовали. Фракции с ВЭЖХ, содержащие продукт, лиофилизировали.RP-HPLC was carried out on a 100 × 20 mm or 100 × 40 mm C18 ReproSil-Pur 300 ODS-3 5 μm column (Dr. Maisch, Ammerbuch, Germany) connected to a Waters 600 HPLC system and a Waters 2487 absorption detector. The linear gradients of solution A (0.1% TFA in H ₂ O) and solution B (0.1% TFA in acetonitrile) were used. HPLC fractions containing the product were lyophilized.

Флэш-хроматография:Flash chromatography:

Очистки флэш-хроматографией осуществляли посредством системы lsolera One system из Biotage AB, Sweden, используя силикагельные патроны Biotage KP-Sil и н-гептан и этилацетат в качестве элюентов. Продукты подвергали детекции при 254 нм.Flash chromatography purifications were performed using the lsolera One system from Biotage AB, Sweden using Biotage KP-Sil silica gel cartridges and n-heptane and ethyl acetate as eluents. Products were detected at 254 nm.

Относительно шариков гидрогеля, шприцы, снабженные полипропиленовыми фриттами, использовали в качестве реакционных сосудов или на стадиях промывки.Regarding hydrogel beads, syringes equipped with polypropylene frits were used as reaction vessels or in washing steps.

Аналитические методыAnalytical methods

Аналитическую сверхэффективную ЖХ (UPLC) осуществляли посредством системы Waters Acquity, снабженной колонкой Waters BEH300 C18 (2,1×50 мм, размер частиц 1,7 мкм), соединенной с масс-спектрометром LTQ Orbitrap Discovery от компании Thermo Scientific.Analytical super-efficient LC (UPLC) was performed using a Waters Acquity system equipped with a Waters BEH300 C18 column (2.1 × 50 mm, particle size 1.7 μm) coupled to a Thermo Scientific LTQ Orbitrap Discovery mass spectrometer.

МС (масс-спектрометрия) ПЭГ-продуктов обнаружила серию фрагментов (CH₂CH₂O)_n вследствие полидисперсности ПЭГ исходных материалов. Для облегчения интерпретации данных, только один единственный характерный сигнал m/z представлен в примерах. МС конъюгатов инсулина представлена для характерных изотопов и относится к аддуктам, включающим четыре протона [M+4H]⁴⁺.MS (mass spectrometry) of the PEG products revealed a series of (CH ₂ CH ₂ O) _n fragments due to the polydispersity of the PEG starting materials. To facilitate the interpretation of data, only one single characteristic signal m / z is presented in the examples. MS of insulin conjugates is presented for characteristic isotopes and refers to adducts comprising four protons [M + 4H] ⁴⁺ .

Гель-фильтрацию (SEC) осуществляли, используя систему Amersham Bioscience AKTA основная, снабженную колонкой Superdex200 5/150 GL (Amersham Bioscience/GE Healthcare) с входным фильтром 0,45 мкм, если не указано иное. В качестве подвижной фазы использовали 20 мМ фосфата натрия, 140 мМ NaCl, pH 7,4.Gel filtration (SEC) was performed using the Amersham Bioscience AKTA primary system equipped with a Superdex200 5/150 GL column (Amersham Bioscience / GE Healthcare) with a 0.45 μm inlet filter, unless otherwise indicated. As the mobile phase, 20 mM sodium phosphate, 140 mM NaCl, pH 7.4 were used.

Пример 1Example 1

Синтез каркасного реагента 1gSynthesis of frame reagent 1g

Каркасный реагент 1g синтезировали из ПЭГ5000-амина, представленного в виде 4 ветвей полимеров, согласно следующей схеме:Frame reagent 1g was synthesized from PEG5000-amine, presented in the form of 4 branches of polymers, according to the following scheme:

Для синтеза соединения 1b ПЭГ5000-амин, представленный в виде 4 ветвей полимеров 1а (молекулярная масса приблизительно 5200 г/моль, 5,20 г, 1,00 ммоль, HCl-соль), растворяли в 20 мл ДМСО (безводный). Boc-Lys(Boc)-OH (2,17 г, 6,25 ммоль) в 5 мл ДМСО (безводный), EDC HCl (1,15 г, 6,00 ммоль), HOBt-H₂O (0,96 г, 6,25 ммоль) и коллидин (5,20 мл, 40 ммоль) добавляли. Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при кт. Реакционную смесь разбавляли 1200 мл дихлорметана и промывали 600 мл 0,1н H₂SO₄ (2×), насыщенным раствором соли (1×), 0,1M NaOH (2×) и смесью 1/1 (об./об.) насыщенный раствор соли/вода (4×). Водные слои вновь экстрагировали 500 мл DCM. Органические фазы сушили над Na₂SO₄, фильтровали и упаривали с получением 6,3 г сырого продукта 1b в виде бесцветного масла. Соединение 1b очищали ОФ-ВЭЖХ.For the synthesis of compound 1b, PEG5000-amine, represented as 4 branches of polymers 1a (molecular weight approximately 5200 g / mol, 5.20 g, 1.00 mmol, HCl salt), was dissolved in 20 ml DMSO (anhydrous). Boc-Lys (Boc) -OH (2.17 g, 6.25 mmol) in 5 ml DMSO (anhydrous), EDC HCl (1.15 g, 6.00 mmol), HOBt-H ₂ O (0.96 g, 6.25 mmol) and collidine (5.20 ml, 40 mmol) were added. The reaction mixture was stirred for 30 minutes at rt. The reaction mixture was diluted with 1200 ml of dichloromethane and washed with 600 ml of 0.1 N H ₂ SO ₄ (2 ×), brine (1 ×), 0.1 M NaOH (2 ×) and a mixture of 1/1 (v / v) brine / water (4 ×). The aqueous layers were again extracted with 500 ml of DCM. The organic phases were dried over Na ₂ SO ₄ , filtered and evaporated to give 6.3 g of crude product 1b as a colorless oil. Compound 1b was purified by RP-HPLC.

Выход 3,85 г (59%) бесцветного стеклообразного продукта 1b.Yield 3.85 g (59%) of a colorless glassy product 1b .

МС: m/z 1294,4 = [M+5H]⁵⁺ (вычислено = 1294,6).MS: m / z 1294.4 = [M + 5H] ⁵⁺ (calculated = 1294.6).

Соединение 1c получали путем перемешивания 3,40 г соединения 1b (0,521 ммоль) в 5 мл метанола и 9 мл 4н HCl в диоксане при кт в течение 15 мин. Летучие вещества удаляли в вакууме. Продукт использовали на следующей стадии без дальнейшей очистки.Compound 1c was prepared by stirring 3.40 g of compound 1b (0.521 mmol) in 5 ml of methanol and 9 ml of 4N HCl in dioxane at rt for 15 minutes. Volatiles were removed in vacuo. The product was used in the next step without further purification.

МС: m/z 1151,9 = [M+5H]⁵⁺ (вычислено = 1152,0).MS: m / z 1151.9 = [M + 5H] ⁵⁺ (calculated = 1152.0).

Для синтеза соединения 1d 3,26 г соединения 1c (0,54 ммоль) растворяли в 15 мл ДМСО (безводный). 2,99 г Boc-Lys(Boc)-OH (8,64 ммоль) в 15 мл ДМСО (безводный), 1,55 г EDC HCl (8,1 ммоль), 1,24 г HOBt-H₂O (8,1 ммоль) и 5,62 мл коллидина (43 ммоль) добавляли. Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при кт.To synthesize compound 1d, 3.26 g of compound 1c (0.54 mmol) was dissolved in 15 ml of DMSO (anhydrous). 2.99 g of Boc-Lys (Boc) -OH (8.64 mmol) in 15 ml of DMSO (anhydrous), 1.55 g of EDC HCl (8.1 mmol), 1.24 g of HOBt-H ₂ O (8 , 1 mmol) and 5.62 ml of collidine (43 mmol) were added. The reaction mixture was stirred for 30 minutes at rt.

Реакционную смесь разбавляли 800 мл DCM и промывали 400 мл 0,1н H₂SO₄ (2×), насыщенным раствором соли (1×), 0,1M NaOH (2×) и смесью 1/1 (об./об.) насыщенный раствор соли/вода (4×). Водные слои вновь экстрагировали 800 мл DCM. Органические фазы сушили с Na₂SO₄, фильтровали и упаривали с получением стеклообразного сырого продукта.The reaction mixture was diluted with 800 ml of DCM and washed with 400 ml of 0.1 N H ₂ SO ₄ (2 ×), brine (1 ×), 0.1 M NaOH (2 ×) and a mixture of 1/1 (v / v) brine / water (4 ×). The aqueous layers were again extracted with 800 ml of DCM. The organic phases were dried with Na ₂ SO ₄ , filtered and evaporated to give a glassy crude product.

Продукт растворяли в DCM и осаждали охлажденным (-18°C) диэтиловым эфиром. Указанную процедуру повторяли дважды, и осадок сушили в вакууме.The product was dissolved in DCM and precipitated with chilled (-18 ° C) diethyl ether. This procedure was repeated twice, and the precipitate was dried in vacuum.

Выход: 4,01 г (89%) бесцветного стеклообразного продукта 1d, который использовали на следующей стадии без дальнейшей очистки.Yield: 4.01 g (89%) of a colorless glassy product 1d , which was used in the next step without further purification.

МС: m/z 1405,4 = [M+6H]⁶⁺ (вычислено = 1405,4).MS: m / z 1405.4 = [M + 6H] ⁶⁺ (calculated = 1405.4).

Соединение 1e получали путем перемешивания раствора соединения 1d (3,96 г, 0,47 ммоль) в 7 мл метанола и 20 мл 4н HCl в диоксане при кт в течение 15 мин. Летучие вещества удаляли в вакууме. Продукт использовали на следующей стадии без дальнейшей очистки.Compound 1e was prepared by stirring a solution of compound 1d (3.96 g, 0.47 mmol) in 7 ml of methanol and 20 ml of 4 N HCl in dioxane at rt for 15 minutes. Volatiles were removed in vacuo. The product was used in the next step without further purification.

МС: m/z 969,6 = [M+7H]⁷⁺ (вычислено = 969,7).MS: m / z 969.6 = [M + 7H] ⁷⁺ (calculated = 969.7).

Для синтеза соединения 1f соединение 1e (3,55 г, 0,48 ммоль) растворяли в 20 мл ДМСО (безводный). Boc-Lys(Boc)-OH (5,32 г, 15,4 ммоль) в 18,8 мл ДМСО (безводный), EDC HCl (2,76 г, 14,4 ммоль), HOBt-H₂O (2,20 г, 14,4 ммоль) и 10,0 мл коллидина (76,8 ммоль) добавляли. Реакционную смесь перемешивали в течение 60 мин при кт.For the synthesis of compound 1f, compound 1e (3.55 g, 0.48 mmol) was dissolved in 20 ml of DMSO (anhydrous). Boc-Lys (Boc) -OH (5.32 g, 15.4 mmol) in 18.8 ml DMSO (anhydrous), EDC HCl (2.76 g, 14.4 mmol), HOBt-H ₂ O (2 20 g, 14.4 mmol) and 10.0 ml collidine (76.8 mmol) were added. The reaction mixture was stirred for 60 minutes at rt.

Реакционную смесь разбавляли 800 мл DCM и промывали 400 мл 0,1н H₂SO₄ (2×), насыщенным раствором соли (1×), 0,1M NaOH (2×) и смесью 1/1 (об./об.) насыщенный раствор соли/вода (4×). Водные слои вновь экстрагировали 800 мл DCM. Органические фазы сушили над Na₂SO₄, фильтровали и упаривали с получением сырого продукта 1f в виде бесцветного масла.The reaction mixture was diluted with 800 ml of DCM and washed with 400 ml of 0.1 N H ₂ SO ₄ (2 ×), brine (1 ×), 0.1 M NaOH (2 ×) and a mixture of 1/1 (v / v) brine / water (4 ×). The aqueous layers were again extracted with 800 ml of DCM. The organic phases were dried over Na ₂ SO ₄ , filtered and evaporated to give crude product 1f as a colorless oil.

Продукт растворяли в DCM и осаждали охлажденным (-18°С) диэтиловым эфиром. Указанную стадию повторяли дважды, и осадок сушили в вакууме.The product was dissolved in DCM and precipitated with chilled (-18 ° C) diethyl ether. The indicated step was repeated twice, and the precipitate was dried in vacuo.

Выход 4,72 г (82%) бесцветного стеклообразного продукта 1f, который использовали на следующей стадии без дальнейшей очистки. Мс: m/z 1505,3 = [M+8H]⁸⁺ (вычислено = 1505,4).Yield 4.72 g (82%) of a colorless glassy product 1f , which was used in the next step without further purification. MS: m / z 1505.3 = [M + 8H] ⁸⁺ (calculated = 1505.4).

Каркасный реагент 1g получали путем перемешивания раствора соединения 1f (молекулярная масса приблизительно 12035 г/моль, 4,72 г, 0,39 ммоль) в 20 мл метанола и 40 мл 4н HCl в диоксане при кт в течение 30 мин. Летучие вещества удаляли в вакууме.The framework reagent 1g was obtained by stirring a solution of compound 1f (molecular weight approximately 12035 g / mol, 4.72 g, 0.39 mmol) in 20 ml of methanol and 40 ml of 4N HCl in dioxane at rt for 30 minutes. Volatiles were removed in vacuo.

Выход 3,91 г (100%), стеклообразный продукт каркасный реагент 1g.Yield 3.91 g (100%), glassy product frame reagent 1g .

МС: m/z 977,2 = [M+9H]⁹⁺ (вычислено = 977,4).MS: m / z 977.2 = [M + 9H] ⁹⁺ (calculated = 977.4).

Альтернативный путь синтеза 1gAlternative synthesis route 1g

Для синтеза соединения 1b к суспензии ПЭГ5000-тетрамина, макромолекула которого состоит из 4 ветвей полимеров (1a) (50,0 г, 10,0 ммоль), в 250 мл изоPrOH (безводный), boc-Lys(boc)-OSu (26,6 г, 60,0 ммоль) и DIEA (20,9 мл, 120 ммоль) добавляли при 45°C и смесь перемешивали в течение 30 мин.For the synthesis of compound 1b to a suspension of PEG5000-tetramine, whose macromolecule consists of 4 branches of polymers ( 1a ) (50.0 g, 10.0 mmol), in 250 ml of isoPrOH (anhydrous), boc-Lys (boc) -OSu (26 6 g, 60.0 mmol) and DIEA (20.9 ml, 120 mmol) were added at 45 ° C and the mixture was stirred for 30 minutes.

Затем, н-пропиламин (2,48 мл, 30,0 ммоль) добавляли. Через 5 мин раствор разбавляли 1000 мл MTBE и хранили в течение ночи при -20°C без перемешивания. Приблизительно 500 мл супернатанта декантировали и отбрасывали. 300 мл холодного MTBE добавляли и после 1 мин встряхивания продукт собирали фильтрацией через стеклянный фильтр и промывали 500 мл холодного MTBE. Продукт сушили в вакууме в течение 16 ч.Then, n-propylamine (2.48 ml, 30.0 mmol) was added. After 5 min, the solution was diluted with 1000 ml MTBE and stored overnight at -20 ° C without stirring. Approximately 500 ml of the supernatant was decanted and discarded. 300 ml of cold MTBE was added and after 1 min of shaking, the product was collected by filtration through a glass filter and washed with 500 ml of cold MTBE. The product was dried in vacuo for 16 hours.

Выход: 65,6 г (74%) 1b в виде белого комковатого твердого вещества.Yield: 65.6 g (74%) 1b as a white lumpy solid.

МС: m/z 937,4 = [M+7H]⁷⁺ (вычислено = 937,6).MS: m / z 937.4 = [M + 7H] ⁷⁺ (calculated = 937.6).

Соединение 1c получали путем перемешивания соединения 1b с предыдущей стадии (48,8 г, 7,44 ммоль) в 156 мл 2-пропанола при 40°C. Смесь, состоящую из 196 мл 2-пропанола и 78,3 мл ацетилхлорида, добавляли при перемешивании в течение 1-2 мин. Полученный раствор перемешивали при 40°С в течение 30 мин и охлаждали до -30°C в течение ночи без перемешивания. Холодный MTBE 100 мл добавляли, суспензию встряхивали в течение 1 мин и охлаждали в течение 1 ч при -30°С. Продукт собирали фильтрацией через стеклянный фильтр и промывали 200 мл холодного MTBE. Продукт сушили в вакууме в течение 16 ч.Compound 1c was obtained by stirring compound 1b from the previous step (48.8 g, 7.44 mmol) in 156 ml of 2-propanol at 40 ° C. A mixture of 196 ml of 2-propanol and 78.3 ml of acetyl chloride was added with stirring over 1-2 minutes. The resulting solution was stirred at 40 ° C. for 30 minutes and cooled to −30 ° C. overnight without stirring. Cold MTBE 100 ml was added, the suspension was shaken for 1 min and cooled for 1 h at -30 ° C. The product was collected by filtration through a glass filter and washed with 200 ml of cold MTBE. The product was dried in vacuo for 16 hours.

Выход: 38,9 г (86%) 1c в виде белого порошкаYield: 38.9 g (86%) 1c as a white powder

МС: m/z 960,1 = [M+6H]⁶⁺ (вычислено = 960,2).MS: m / z 960.1 = [M + 6H] ⁶⁺ (calculated = 960.2).

Для синтеза соединения 1d к суспензии 1c с предыдущей стадии (19,0 г, 3,14 ммоль) в 80 мл 2-пропанола, boc-Lys(boc)-OSu (16,7 г, 37,7 ммоль) и DIEA (13,1 мл, 75,4 ммоль) добавляли при 45°C и смесь перемешивали в течение 30 мин при 45°C. Далее, н-пропиламин (1,56 мл, 18,9 ммоль) добавляли. Через 5 мин из раствора выпадал осадок при добавлении 600 мл холодного MTBE, и смесь центрифугировали (3000 мин^-1, 1 мин). Осадок сушили в вакууме в течение 1 ч и растворяли в 400 мл ТГФ. Диэтиловый эфир 200 мл добавляли, и продукт охлаждали до -30°C в течение 16 ч без перемешивания. Суспензию фильтровали через стеклянный фильтр, и осадок промывали 300 мл холодного MTBE. Продукт сушили в вакууме в течение 16 ч.For the synthesis of compound 1d to a suspension of 1c from the previous step (19.0 g, 3.14 mmol) in 80 ml of 2-propanol, boc-Lys (boc) -OSu (16.7 g, 37.7 mmol) and DIEA ( 13.1 ml, 75.4 mmol) was added at 45 ° C and the mixture was stirred for 30 min at 45 ° C. Next, n-propylamine (1.56 ml, 18.9 mmol) was added. After 5 min, a precipitate precipitated from the solution with the addition of 600 ml of cold MTBE, and the mixture was centrifuged (3000 min ^-1 , 1 min). The precipitate was dried in vacuo for 1 h and dissolved in 400 ml of THF. 200 ml diethyl ether was added and the product was cooled to -30 ° C for 16 hours without stirring. The suspension was filtered through a glass filter, and the precipitate was washed with 300 ml of cold MTBE. The product was dried in vacuo for 16 hours.

Выход: 21,0 г (80%) 1d в виде белого твердого вещества.Yield: 21.0 g (80%) 1d as a white solid.

МС: m/z 1405,4 = [M+6H]⁶⁺ (вычислено = 1405,4).MS: m / z 1405.4 = [M + 6H] ⁶⁺ (calculated = 1405.4).

Соединение 1e получали путем растворения соединения 1d с предыдущей стадии (15,6 г, 1,86 ммоль) в 3н HCl в метаноле (81 мл, 243 ммоль) и перемешивания в течение 90 мин при 40°С. MeOH 200 мл и 700 мл i-PrOH добавляли и смесь хранили в течение 2 ч при -30°C. Для полноты кристаллизации 100 мл MTBE добавляли и суспензию хранили при -30°C в течение ночи. Холодный MTBE 250 мл добавляли, суспензию встряхивали в течение 1 мин и фильтровали через стеклянный фильтр, и осадок промывали 100 мл холодного MTBE. Продукт сушили в вакууме.Compound 1e was obtained by dissolving compound 1d from the previous step (15.6 g, 1.86 mmol) in 3 N HCl in methanol (81 ml, 243 mmol) and stirring for 90 minutes at 40 ° C. MeOH 200 ml and 700 ml i-PrOH were added and the mixture was stored for 2 hours at -30 ° C. To complete crystallization, 100 ml of MTBE was added and the suspension was stored at -30 ° C overnight. Cold MTBE 250 ml was added, the suspension was shaken for 1 min and filtered through a glass filter, and the precipitate was washed with 100 ml of cold MTBE. The product was dried in vacuo.

Выход: 13,2 г (96%) 1e в виде белого порошка.Yield: 13.2 g (96%) 1e as a white powder.

МС: m/z 679,1 = [M+10H]¹⁰⁺ (вычислено = 679,1).MS: m / z 679.1 = [M + 10H] ¹⁰⁺ (calculated = 679.1).

Для синтеза соединения 1f к суспензии 1e с предыдущей стадии (8,22 г, 1,12 ммоль) в 165 мл 2-пропанола, boc-Lys(boc)-OSu (11,9 г, 26,8 ммоль) и DIEA (9,34 мл, 53,6 ммоль) добавляли при 45°С и смесь перемешивали в течение 30 мин. Далее, н-пропиламин (1,47 мл, 17,9 ммоль) добавляли. Через 5 мин раствор охлаждали до -18°С в течение 2 ч, затем 165 мл холодного MTBE добавляли, суспензию встряхивали в течение 1 мин и фильтровали через стеклянный фильтр. Далее, осадок на фильтре промывали смесью 4×200 мл холодный MTBE/i-PrOH 4:1 и 1×200 мл холодным MTBE. Продукт сушили в вакууме в течение 16 ч.For the synthesis of compound 1f to a suspension of 1e from the previous step (8.22 g, 1.12 mmol) in 165 ml of 2-propanol, boc-Lys (boc) -OSu (11.9 g, 26.8 mmol) and DIEA ( 9.34 ml, 53.6 mmol) was added at 45 ° C and the mixture was stirred for 30 minutes. Next, n-propylamine (1.47 ml, 17.9 mmol) was added. After 5 min, the solution was cooled to -18 ° C for 2 h, then 165 ml of cold MTBE was added, the suspension was shaken for 1 min and filtered through a glass filter. Next, the filter cake was washed with a mixture of 4 × 200 ml cold MTBE / i-PrOH 4: 1 and 1 × 200 ml cold MTBE. The product was dried in vacuo for 16 hours.

Выход: 12,8 г (90%) 1f в виде бледно-желтого комковатого твердого вещества.Yield: 12.8 g (90%) 1f as a pale yellow lumpy solid.

МС: m/z 1505,3 = [M+8H]⁸⁺ (вычислено = 1505,4).MS: m / z 1505.3 = [M + 8H] ⁸⁺ (calculated = 1505.4).

Каркасный реагент 1g получали путем растворения ПЭГ 5кДа(-LysLys₂Lys₄(boc)₈)₄ (1f), макромолекула которого состоит из 4 ветвей полимеров (15,5 г, 1,29 ммоль), в 30 мл MeOH и охлаждения до 0°C. 4н HCl в диоксане (120 мл, 480 ммоль, охлажденный до 0°C) добавляли в течение 3 мин, и баню со льдом отставляли. Через 20 мин 3н HCl в метаноле (200 мл, 600 ммоль, охлажденный до 0°С) добавляли в течение 15 мин и раствор перемешивали в течение 10 мин при комнатной температуре. Продукт из раствора осаждали добавлением 480 мл холодного MTBE и центрифугировали при 3000 об./мин в течение 1 мин. Осадок сушили в вакууме в течение 1 ч и вновь растворяли в 90 мл MeOH, осаждали 240 мл холодного MTBE и суспензию центрифугировали при 3000 об/мин в течение 1 мин. Продукт 1g сушили в вакууме.Frame reagent 1g was obtained by dissolving PEG 5kDa (-LysLys ₂ Lys ₄ (boc) ₈ ) ₄ ( 1f ), the macromolecule of which consists of 4 polymer branches (15.5 g, 1.29 mmol) in 30 ml of MeOH and cooling to 0 ° C. 4N HCl in dioxane (120 ml, 480 mmol, cooled to 0 ° C) was added over 3 min, and the ice bath was set aside. After 20 minutes 3N HCl in methanol (200 ml, 600 mmol, cooled to 0 ° C) was added over 15 minutes and the solution was stirred for 10 minutes at room temperature. The product from the solution was precipitated by adding 480 ml of cold MTBE and centrifuged at 3000 rpm for 1 min. The precipitate was dried in vacuum for 1 h and re-dissolved in 90 ml of MeOH, precipitated with 240 ml of cold MTBE and the suspension was centrifuged at 3000 rpm for 1 min. Product 1g was dried in vacuo.

Выход: 11,5 г (89%) в виде бледно-желтых хлопьев.Yield: 11.5 g (89%) as pale yellow flakes.

МС: m/z 1104,9 = [M+8H]⁸⁺ (вычислено = 1104,9).MS: m / z 1104.9 = [M + 8H] ⁸⁺ (calculated = 1104.9).

Пример 2Example 2

Синтез сшивающего реагента 2dSynthesis of Crosslinking Reagent 2d

Сшивающий реагент 2d получали из монобензилового эфира адипиновой кислоты (English, Arthur R. et al., Journal of Medicinal Chemistry, 1990, 33(1), 344-347) и ПЭГ2000 согласно следующей схеме:Crosslinking reagent 2d was obtained from adipic acid monobenzyl ester (English, Arthur R. et al., Journal of Medicinal Chemistry, 1990, 33 (1), 344-347) and PEG2000 according to the following scheme:

Раствор ПЭГ 2000 (2a) (11,0 г, 5,5 ммоль) и полуэфира бензиладипата (4,8 г, 20,6 ммоль) в дихлорметане (90,0 мл) охлаждали до 0°C. Дициклогексилкарбодиимид (4,47 г, 21,7 ммоль) добавляли с последующим добавлением каталитического количества DMAP (5 мг), и раствор перемешивали и оставляли достигать комнатной температуры в течение ночи (12 ч). Колбу оставляли при +4°С в течение 5 ч. Твердое вещество фильтровали и растворитель полностью удаляли дистилляцией в вакууме. Остаток растворяли в 1000 мл смеси 1/1 (об./об.) диэтиловый эфир/этилацетат и оставляли при кт в течение 2 часов, в течение которого небольшое количество хлопьевидного твердого вещества образовывалось. Твердое вещество удаляли фильтрацией через слой Celite^®. Раствор хранили в прочно закрытой колбе при -30°C в морозильнике в течение 12 ч до завершения кристаллизации. Кристаллический продукт фильтровали через стеклянную фритту и промывали охлажденным диэтиловым эфиром (-30°C). Осадок с фильтра сушили в вакууме. Выход: 11,6 г (86%) 2b в виде бесцветного твердого вещества. Продукт использовали без дальнейшей очистки на следующей стадии.A solution of PEG 2000 ( 2a ) (11.0 g, 5.5 mmol) and a half ester of benzyl adipate (4.8 g, 20.6 mmol) in dichloromethane (90.0 ml) was cooled to 0 ° C. Dicyclohexylcarbodiimide (4.47 g, 21.7 mmol) was added, followed by the addition of a catalytic amount of DMAP (5 mg), and the solution was stirred and allowed to reach room temperature overnight (12 h). The flask was left at + 4 ° C for 5 hours. The solid was filtered and the solvent was completely removed by vacuum distillation. The residue was dissolved in 1000 ml of a 1/1 (v / v) diethyl ether / ethyl acetate mixture and left at rt for 2 hours, during which a small amount of flocculent solid formed. The solid was removed by filtration through a pad of ^Celite® . The solution was stored in a tightly closed flask at -30 ° C in a freezer for 12 hours until crystallization was complete. The crystalline product was filtered through a glass frit and washed with chilled diethyl ether (-30 ° C). The filter cake was dried in vacuo. Yield: 11.6 g (86%) 2b as a colorless solid. The product was used without further purification in the next step.

МС: m/z 813,1 = [M+3H]³⁺ (вычислено = 813,3).MS: m / z 813.1 = [M + 3H] ³⁺ (calculated = 813.3).

В 500-мл стеклянном химическом реакторе, ПЭГ2000-бис-адипиновой кислоты бис-бензиловый эфир 2b (13,3 г, 5,5 ммоль) растворяли в этилацетате (180 мл), и добавляли 10% палладий-на-угле (0,4 г). Раствор подвергали гидрированию при давлении 6 бар, 40°С до тех пор, пока потребление водорода не заканчивалось (5-12 ч). Катализатор удаляли фильтрацией через слой Celite^®, и растворитель упаривали в вакууме. Выход: 12,3 г (количественный) 2c в виде желтоватого масла. Продукт использовали без дальнейшей очистки на следующей стадии.In a 500 ml glass chemical reactor, PEG2000-bis-adipic acid, bis-benzyl ester 2b (13.3 g, 5.5 mmol) was dissolved in ethyl acetate (180 ml), and 10% palladium-on-carbon (0, 4 g). The solution was hydrogenated at a pressure of 6 bar, 40 ° C until then, until the consumption of hydrogen was completed (5-12 hours). The catalyst was removed by filtration through a pad of Celite ^®, and the solvent evaporated in vacuo. Yield: 12.3 g (quantitative) 2c as a yellowish oil. The product was used without further purification in the next step.

МС: m/z 753,1 = [M+3H]³⁺ (вычислено = 753,2).MS: m / z 753.1 = [M + 3H] ³⁺ (calculated = 753.2).

Раствор ПЭГ2000-бис-адипиновой кислоты полуэфир 2c (9,43 г, 4,18 ммоль), N-гидроксисукцинимида (1,92 г, 16,7 ммоль) и дициклогексилкарбодиимида (3,44 г, 16,7 ммоль) в 75 мл DCM (безводный) перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь охлаждали до 0°C, и осадок отфильтровывали. DCM упаривали, и остаток кристаллизовали из ТГФ.A solution of PEG2000-bis-adipic acid, half ester 2c (9.43 g, 4.18 mmol), N-hydroxysuccinimide (1.92 g, 16.7 mmol) and dicyclohexylcarbodiimide (3.44 g, 16.7 mmol) in 75 ml of DCM (anhydrous) was stirred overnight at room temperature. The reaction mixture was cooled to 0 ° C, and the precipitate was filtered. DCM was evaporated and the residue was crystallized from THF.

Выход: 8,73 г (85%) сшивающего реагента 2d в виде бесцветного твердого вещества.Yield: 8.73 g (85%) of crosslinking reagent 2d as a colorless solid.

МС: m/z 817,8 = [M+3H]³⁺ (вычислено = 817,9 г/моль).MS: m / z 817.8 = [M + 3H] ³⁺ (calculated = 817.9 g / mol).

Пример 3Example 3

Получение гидрогелевых шариков (3) и (3a), содержащих свободные аминогруппыObtaining hydrogel beads (3) and (3a) containing free amino groups

Раствор 275 мг 1g и 866 мг 2d в 14 мл ДМСО добавляли к раствору 100 мг Arlacel P135 (Croda International PIc) в 60 мл гептана. Смесь перемешивали при 700 об/мин посредством специальной металлической мешалки в течение 10 мин при 25°С с образованием суспензии. N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин 1,0 мл добавляли для осуществления реакции полимеризации. Через 2 ч скорость перемешивания снижали до 400 об/мин, и смесь перемешивали в течение дополнительных 16 ч. Добавляли 1,5 мл уксусной кислоты и затем через 10 мин добавляли 50 мл воды. Через 5 мин перемешивание останавливали и водную фазу сливали.A solution of 275 mg of 1g and 866 mg of 2d in 14 ml of DMSO was added to a solution of 100 mg of Arlacel P135 (Croda International PIc) in 60 ml of heptane. The mixture was stirred at 700 rpm by means of a special metal stirrer for 10 min at 25 ° C to form a suspension. N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine 1.0 ml was added for the polymerization reaction. After 2 hours, the stirring speed was reduced to 400 rpm, and the mixture was stirred for an additional 16 hours. 1.5 ml of acetic acid was added and then after 10 minutes 50 ml of water was added. After 5 minutes, stirring was stopped and the aqueous phase was drained.

Для фракционирования шариков по размеру суспензию вода-гидрогель просеивали влажной на стальных ситах 75, 50, 40, 32 и 20 мкм меш. Фракции шариков, которые оставались на ситах 32, 40 и 50 мкм меш, объединяли и промывали 3 раза водой, 10 раз этанолом и сушили в течение 16 ч при 0,1 мбар с получением 3 в виде белого порошка.To size the balls by size, the water-hydrogel suspension was sieved wet on steel sieves of 75, 50, 40, 32, and 20 μm mesh. The bead fractions that remained on the 32, 40 and 50 μm mesh sieves were combined and washed 3 times with water, 10 times with ethanol and dried for 16 hours at 0.1 mbar to give 3 as a white powder.

3a получали, как описано для 3, за исключением использования 1200 мг 1g, 3840 мг 2d, 28,6 мл ДМСО, 425 мг Arlacel P135, 100 мл гептана и 4,3 мл TMEDA. Для определения добавляли 6,6 мл уксусной кислоты и затем через 10 мин добавляли 50 мл воды и 50 мл насыщенного водного раствора хлорида натрия. 3a was prepared as described for 3 , with the exception of 1200 mg 1g , 3840 mg 2d , 28.6 ml DMSO, 425 mg Arlacel P135, 100 ml heptane and 4.3 ml TMEDA. 6.6 ml of acetic acid was added for determination, and then after 10 minutes, 50 ml of water and 50 ml of a saturated aqueous solution of sodium chloride were added.

Содержание аминогрупп гидрогеля определяли путем конъюгирования fmoc-аминокислоты со свободными аминогруппами гидрогеля и последующего fmoc-определения, как описано Gude, M., J. Ryf, et al. (2002) Letters in Peptide Science 9(4): 203-206. Содержание аминогрупп 3 и 3a было определено и составляло между 0,11 и 0,16 ммоль/г.The amino group content of the hydrogel was determined by conjugation of the fmoc amino acid with the free amino groups of the hydrogel and subsequent fmoc determination, as described by Gude, M., J. Ryf, et al. (2002) Letters in Peptide Science 9 (4): 203-206. The content of amino groups 3 and 3a was determined and was between 0.11 and 0.16 mmol / g.

Пример 4Example 4

Получение функционализированных малеимидом гидрогелевых шариков (4) и (4a) и (4aa) и определение степени замещения малеимидомPreparation of Maleimide Functionalized Hydrogel Balls (4) and (4a) and (4aa) and Determination of Maleimide Substitution

Раствор 600 мг Mal-ПЭГ6-NHS (1,0 ммоль) в 4,5 мл смеси 2/1 (об./об.) ацетонитрил/вода добавляли к 200 мг сухих гидрогелевых шариков 3. Добавляли 500 мкл натрийфосфатного буфера (pH 7,4, 0,5M) и суспензию перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Шарики 4 промывали пять раз каждый смесью 2/1 (об./об.) ацетонитрил/вода, метанолом и смесью 1/1/0,001 (об./об./об.) ацетонитрил/вода/ТФУ.A solution of 600 mg of Mal-PEG6-NHS (1.0 mmol) in 4.5 ml of a 2/1 (v / v) acetonitrile / water mixture was added to 200 mg of dry hydrogel beads 3 . 500 μl of sodium phosphate buffer (pH 7.4, 0.5M) was added and the suspension was stirred for 30 minutes at room temperature. Balls 4 were washed five times each with 2/1 (v / v) acetonitrile / water, methanol and 1/1 / 0.001 (v / v / v) acetonitrile / water / TFA mixtures.

4a синтезировали, как описано выше, за исключением использования 3a вместо 3. 4a were synthesized as described above, except for using 3a instead of 3 .

Альтернативно, гидрогелевые шарики 3a предварительно промывали смесью 99/1 (об./об.) ДМСО/DIEA, промывали ДМСО и инкубировали в течение 45 мин с раствором Mal-ПЭГ6-NHS (2,0 экв. относительно теоретического количества аминогрупп гидрогеля) в ДМСО. Шарики 4aa промывали два раза ДМСО и три раза сукцинатом pH 3,0 (20 мМ, 1 мМ ЭДТА, 0,01% твин-20). Образец инкубировали в натрийфосфатном буфере pH 6,0 (50 мМ, 50 мМ этаноламин, 0,01% твин-20) в течение 1 ч при кт и промывали пять раз сукцинатом натрия рН 3,0 (20 мМ, 1 мМ ЭДТА, 0,01% твин-20).Alternatively, the hydrogel beads 3a were pre-washed with a mixture of 99/1 (v / v) DMSO / DIEA, washed with DMSO and incubated for 45 min with a solution of Mal-PEG6-NHS (2.0 equivalent to the theoretical amount of hydrogel amino groups) in DMSO. The 4aa beads were washed twice with DMSO and three times with succinate pH 3.0 (20 mM, 1 mM EDTA, 0.01% Tween-20). The sample was incubated in pH 6.0 sodium phosphate buffer (50 mM, 50 mM ethanolamine, 0.01% tween-20) for 1 h at rt and washed five times with sodium succinate pH 3.0 (20 mM, 1 mM EDTA, 0 , 01% tween-20).

Для определения содержания малеимидных групп аликвоту гидрогелевых шариков 4, 4a или 4aa, соответственно, лиофилизировали и взвешивали. Другую аликвоту гидрогелевых шариков 4, 4a или 4aa, соответственно, подвергали взаимодействию с избытком меркаптоэтанола (в 50 мМ натрийфосфатном буфере, 30 мин при кт) и расход меркаптоэтанола определяли, используя тест Эллмана (Ellman, G.L. et al., Biochem. Pharmacol., 1961, 7, 88-95). Содержание малеимида было определено и составляло между 0,11 и 0,13 ммоль/г сухого гидрогеля.To determine the content of maleimide groups, an aliquot of hydrogel beads 4 , 4a or 4aa , respectively, was lyophilized and weighed. Another aliquot of hydrogel beads 4 , 4a or 4aa , respectively, was reacted with an excess of mercaptoethanol (in 50 mM sodium phosphate buffer, 30 min at rt) and the rate of mercaptoethanol was determined using the Ellman test (Ellman, GL et al., Biochem. Pharmacol.,. 1961, 7, 88-95). The maleimide content was determined and was between 0.11 and 0.13 mmol / g dry hydrogel.

Пример 5Example 5

Синтез линкерного реагента 5dSynthesis of linker reagent 5d

Линкерный реагент 5d синтезировали согласно следующей схеме:Linker reagent 5d was synthesized according to the following scheme:

Синтез промежуточного линкерного реагента 5a:Synthesis of intermediate linker reagent 5a :

4-метокситритилхлорид (3 г, 9,71 ммоль) растворяли в DCM (20 мл) и добавляли по каплям к раствору этилендиамина (6,5 мл, 97,1 ммоль) в DCM (20 мл). Через два часа раствор выливали в диэтиловый эфир (300 мл) и промывали три раза смесью 30/1 (об./об.) насыщенный раствор соли/0,1M раствор NaOH (50 мл каждый) и один раз насыщенным раствором соли (50 мл). Органическую фазу сушили над Na₂SO₄ и летучие вещества удаляли при пониженном давлении с получением Mmt-защищенного промежуточного соединения (3,18 г, 9,56 ммоль).4-methoxytrityl chloride (3 g, 9.71 mmol) was dissolved in DCM (20 ml) and was added dropwise to a solution of ethylenediamine (6.5 ml, 97.1 mmol) in DCM (20 ml). After two hours, the solution was poured into diethyl ether (300 ml) and washed three times with a mixture of 30/1 (v / v) brine / 0.1 M NaOH solution (50 ml each) and once with brine (50 ml) ) The organic phase was dried over Na ₂ SO ₄ and the volatiles were removed under reduced pressure to give Mmt-protected intermediate (3.18 g, 9.56 mmol).

Mmt-защищенное промежуточное соединение (3,18 г, 9,56 ммоль) растворяли в безводном DCM (30 мл). 6-(тритилмеркапто)капроновую кислоту (4,48 г, 11,47 ммоль), PyBOP (5,67 г, 11,47 ммоль) и DIEA (5,0 мл, 28,68 ммоль) добавляли, и смесь перемешивали в течение 30 мин при кт. Раствор разбавляли диэтиловым эфиром (250 мл) и промывали три раза смесью 30/1 (об./об.) насыщенный раствор соли/0,1M раствор NaOH (50 мл каждый) и один раз насыщенным раствором соли (50 мл). Органическую фазу сушили над Na₂SO₄, и летучие вещества удаляли при пониженном давлении. 5a очищали флэш-хроматографией.The MMT-protected intermediate (3.18 g, 9.56 mmol) was dissolved in anhydrous DCM (30 ml). 6- (trityl mercapto) caproic acid (4.48 g, 11.47 mmol), PyBOP (5.67 g, 11.47 mmol) and DIEA (5.0 ml, 28.68 mmol) were added and the mixture was stirred in for 30 minutes at rt. The solution was diluted with diethyl ether (250 ml) and washed three times with a mixture of 30/1 (v / v) brine / 0.1 M NaOH solution (50 ml each) and once with brine (50 ml). The organic phase was dried over Na ₂ SO ₄ and the volatiles were removed under reduced pressure. 5a was purified by flash chromatography.

Выход: 5,69 г (8,09 ммоль).Yield: 5.69 g (8.09 mmol).

МС: m/z 705,4 = [M+H]⁺ (вычислено = 705,0).MS: m / z 705.4 = [M + H] ⁺ (calculated = 705.0).

Синтез промежуточного линкерного реагента 5b:Synthesis of intermediate linker reagent 5b :

К раствору 5a (3,19 г, 4,53 ммоль) в безводном ТГФ (50 мл) добавляли BH₃∙ТГФ (1M раствор, 8,5 мл, 8,5 ммоль) и раствор перемешивали в течение 16 часов при кт. Далее, BH₃∙ТГФ (1M раствор, 14 мл, 14 ммоль) добавляли и перемешивали в течение 16 часов при кт. Реакцию гасили добавлением метанола (8,5 мл), N,N-диметилэтилендиамин (3 мл, 27,2 ммоль) добавляли, и раствор нагревали с обратным холодильником и перемешивали в течение трех часов. Смесь разбавляли этилацетатом (300 мл) при кт, промывали насыщенным водным раствором Na₂CO₃ (2×100 мл) и насыщенным водным раствором NaHCO₃ (2×100 мл). Органическую фазу сушили над Na₂SO₄ и летучие вещества упаривали при пониженном давлении с получением сырого аминсодержащего промежуточного соединения (3,22 г).To a solution of 5a (3.19 g, 4.53 mmol) in anhydrous THF (50 ml) was added BH ₃ Г THF (1M solution, 8.5 ml, 8.5 mmol) and the solution was stirred for 16 hours at rt. Next, BH ₃ ∙ THF (1M solution, 14 ml, 14 mmol) was added and stirred for 16 hours at rt. The reaction was quenched by the addition of methanol (8.5 ml), N, N-dimethylethylenediamine (3 ml, 27.2 mmol) was added, and the solution was heated under reflux and stirred for three hours. The mixture was diluted with ethyl acetate (300 ml) at rt, washed with saturated aqueous Na ₂ CO ₃ (2 × 100 ml) and saturated aqueous NaHCO ₃ (2 × 100 ml). The organic phase was dried over Na ₂ SO ₄ and the volatiles were evaporated under reduced pressure to give a crude amine-containing intermediate (3.22 g).

Аминсодержащее промежуточное соединение растворяли в DCM (5 мл), Boc₂O (2,97 г, 13,69 ммоль), растворенный в DCM (5 мл) и DIEA (3,95 мл, 22,65 ммоль), добавляли и смесь перемешивали при кт в течение 30 мин. Смесь очищали флэш-хроматографией с получением сырого Boc- и Mmt-защищенного промежуточного соединения (3 г).The amine-containing intermediate was dissolved in DCM (5 ml), Boc ₂ O (2.97 g, 13.69 mmol) dissolved in DCM (5 ml) and DIEA (3.95 ml, 22.65 mmol), and the mixture was added stirred at rt for 30 minutes The mixture was purified by flash chromatography to give the crude Boc- and Mmt-protected intermediate (3 g).

МС: m/z 791,4 = [M+H]⁺, 519,3 = [M-Mmt+H]⁺ (вычислено = 791,1).MS: m / z 791.4 = [M + H] ⁺ , 519.3 = [M-Mmt + H] ⁺ (calculated = 791.1).

0,4M водный раствор HCl (48 мл) добавляли к раствору Boc- и Mmt-защищенного промежуточного соединения в ацетонитриле (45 мл). Смесь разбавляли ацетонитрилом (10 мл) и перемешивали в течение одного часа при кт. Далее, величину pH реакционной смеси доводили до рН 5,5 путем добавления 5M раствора NaOH, ацетонитрил удаляли при пониженном давлении, и водный раствор экстрагировали DCM (4×100 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и летучие вещества удаляли при пониженном давлении. Сырое промежуточное соединение 5b использовали без дальнейшей очистки.A 0.4M aqueous HCl solution (48 ml) was added to a solution of Boc- and Mmt-protected intermediate in acetonitrile (45 ml). The mixture was diluted with acetonitrile (10 ml) and stirred for one hour at rt. Next, the pH of the reaction mixture was adjusted to pH 5.5 by adding 5M NaOH solution, acetonitrile was removed under reduced pressure, and the aqueous solution was extracted with DCM (4 × 100 ml). The combined organic phases were dried over Na ₂ SO ₄ and volatiles were removed under reduced pressure. Crude intermediate 5b was used without further purification.

Выход: 2,52 г (3,19 ммоль).Yield: 2.52 g (3.19 mmol).

МС: m/z 519,3 = [M+H]⁺ (MW вычислено = 518,8 г/моль).MS: m / z 519.3 = [M + H] ⁺ (MW calculated = 518.8 g / mol).

Синтез промежуточного линкерного реагента 5c:Synthesis of intermediate linker reagent 5c :

5b (780 мг, 0,98 ммоль, ~65% чистоты) и NaCNBH₃ (128 мг, 1,97 ммоль) растворяли в безводном метаноле (13 мл). Раствор 2,4-диметоксибензальдегида (195 мг, 1,17 ммоль) в DCM (2 мл) добавляли и смесь перемешивали в течение 2 ч при кт. Растворители упаривали при пониженном давлении и сырой продукт растворяли в DCM и промывали насыщенным раствором NaCO₃. Водную фазу экстрагировали три раза DCM и объединенные органические фазы промывали насыщенным раствором соли, сушили над MgSO₄ и концентрировали при пониженном давлении. 5c очищали флэш-хроматографией, используя DCM и MeOH в качестве элюентов. 5b (780 mg, 0.98 mmol, ~ 65% pure) and NaCNBH ₃ (128 mg, 1.97 mmol) were dissolved in anhydrous methanol (13 ml). A solution of 2,4-dimethoxybenzaldehyde (195 mg, 1.17 mmol) in DCM (2 ml) was added and the mixture was stirred for 2 hours at rt. The solvents were evaporated under reduced pressure and the crude product was dissolved in DCM and washed with saturated NaCO ₃ solution. The aqueous phase was extracted three times with DCM and the combined organic phases were washed with brine, dried over MgSO _4, and concentrated under reduced pressure. 5c was purified by flash chromatography using DCM and MeOH as eluents.

Выход: 343 мг (0,512 ммоль).Yield: 343 mg (0.512 mmol).

МС: m/z 669,37 = [M+H]⁺, (вычислено = 669,95).MS: m / z 669.37 = [M + H] ⁺ , (calculated = 669.95).

Синтез линкерного реагента 5d:Synthesis of linker reagent 5d :

Fmoc-Aib-нагруженную TCP смолу (980 мг, ~0,9 ммоль) обрабатывали смесью ДМФ/пиперидин для удаления защиты, промывали ДМФ (5 раз) и DCM (6 раз) и сушили в вакууме. Смолу обрабатывали раствором пара-нитрофенилхлорформиата (364 мг, 1,81 ммоль) и коллидина (398 мкл, 3,0 ммоль) в безводном ТГФ (6 мл) и встряхивали в течение 30 мин. Раствор реагента удаляли фильтрацией и смолу промывали ТГФ (5 раз) до добавления раствора амина 5c (490 мг, 0,7 ммоль) и DIEA (1,23 мл, 7,1 ммоль) в безводном ТГФ (6 мл). После встряхивания в течение 18 ч при кт раствор реагента удаляли фильтрацией и смолу промывали DCM (5 раз). Линкерный реагент отщепляли от смолы и очищали ОФ-ВЭЖХ. Фракции продукта доводили до pH 6 путем добавления насыщенного водного раствора NaHCO₃ и концентрировали при пониженном давлении. Образовавшуюся суспензию распределяли между насыщенным водным раствором NaCl и DCM, и водный слой экстрагировали DCM. Объединенные органические фракции концентрировали досуха с получением линкерного реагента 5d.The Fmoc-Aib-loaded TCP resin (980 mg, ~ 0.9 mmol) was treated with DMF / piperidine to remove protection, washed with DMF (5 times) and DCM (6 times), and dried in vacuo. The resin was treated with a solution of para-nitrophenyl chloroformate (364 mg, 1.81 mmol) and collidine (398 μl, 3.0 mmol) in anhydrous THF (6 ml) and shaken for 30 minutes. The reagent solution was removed by filtration, and the resin was washed with THF (5 times) until a solution of amine 5c (490 mg, 0.7 mmol) and DIEA (1.23 ml, 7.1 mmol) in anhydrous THF (6 ml) was added. After shaking for 18 h at rt, the reagent solution was removed by filtration and the resin was washed with DCM (5 times). The linker reagent was cleaved from the resin and purified by RP-HPLC. Product fractions were adjusted to pH 6 by the addition of a saturated aqueous NaHCO ₃ solution and concentrated under reduced pressure. The resulting suspension was partitioned between saturated aqueous NaCl and DCM, and the aqueous layer was extracted with DCM. The combined organic fractions were concentrated to dryness to give the linker reagent 5d .

Выход: 230 мг (0,29 ммоль).Yield: 230 mg (0.29 mmol).

МС m/z 798,41 = [M+H]⁺, (вычислено = 798,1).MS m / z 798.41 = [M + H] ⁺ , (calculated = 798.1).

Пример 6Example 6

Синтез линкерного реагента 6cSynthesis of linker reagent 6c

Линкерный реагент 6c синтезировали согласно следующей схеме:Linker reagent 6c was synthesized according to the following scheme:

Синтез амина 6a:Synthesis of amine 6a :

Трифенилметантиол (11,90 г, 43,08 ммоль) суспендировали в ДМСО (40 мл). DBU (7,41 мл, 49,55 ммоль) и 6-бромгексилфталимид (13,32 г, 42,94 ммоль) добавляли и смесь оставляли для взаимодействия в течение приблизительно 15 мин. Реакционную смесь распределяли между этилацетатом (700 мл) и 0,1M HCl (200 мл). Водную фазу экстрагировали этилацетатом (3×50 мл) и объединенные органические фракции промывали насыщенным раствором NaHCO₃ (80 мл) и насыщенным раствором соли (80 мл), сушили над MgSO₄, фильтровали и концентрировали. Сырое желтое масло перекристаллизовывали из смеси н-гептан/этилацетат. Промежуточное соединение 6-(S-тритил)меркаптогексилфталимид получали в виде белого твердого вещества (13,3 г, 26,4 ммоль, 62%).Triphenylmethanethiol (11.90 g, 43.08 mmol) was suspended in DMSO (40 ml). DBU (7.41 ml, 49.55 mmol) and 6-bromohexylphthalimide (13.32 g, 42.94 mmol) were added and the mixture was allowed to react for approximately 15 minutes. The reaction mixture was partitioned between ethyl acetate (700 ml) and 0.1 M HCl (200 ml). The aqueous phase was extracted with ethyl acetate (3 × 50 ml) and the combined organic fractions were washed with saturated NaHCO ₃ solution (80 ml) and brine (80 ml), dried over MgSO ₄ , filtered and concentrated. The crude yellow oil was recrystallized from n-heptane / ethyl acetate. The intermediate 6- (S-trityl) mercaptohexylphthalimide was obtained as a white solid (13.3 g, 26.4 mmol, 62%).

6-(S-тритил)меркаптогексилфталимид (14,27 г, 28,2 ммоль) суспендировали в этаноле (250 мл). Гидрат гидразина (3,45 мл, 70,5 ммоль) добавляли и смесь нагревали с обратным холодильником в течение 2 ч. Смесь фильтровали и фильтрат концентрировали в вакууме. Хлороформ (180 мл) добавляли к остаточному маслу и образовавшуюся суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Смесь фильтровали и фильтрат экстрагировали водой (60 мл) и насыщенным раствором соли (60 мл), сушили над MgSO₄ и концентрировали с получением сырого 6-(тритилмеркапто)гексиламина (10,10 г, 26,87 ммоль, 95%).6- (S-trityl) mercaptohexylphthalimide (14.27 g, 28.2 mmol) was suspended in ethanol (250 ml). Hydrazine hydrate (3.45 ml, 70.5 mmol) was added and the mixture was refluxed for 2 hours. The mixture was filtered and the filtrate was concentrated in vacuo. Chloroform (180 ml) was added to the residual oil and the resulting suspension was stirred at room temperature for 1.5 hours. The mixture was filtered and the filtrate was extracted with water (60 ml) and brine (60 ml), dried over MgSO ₄ and concentrated to give crude 6- (trityl mercapto) hexylamine (10.10 g, 26.87 mmol, 95%).

МС: m/z 376,22 = [M+H]⁺, (вычислено = 376,20).MS: m / z 376.22 = [M + H] ⁺ , (calculated = 376.20).

DIEA (1,41 мл, 8,11 ммоль) и н-бутилхлорформиат (908 мкл, 7,14 ммоль, в 1 мл ТГФ) добавляли к охлажденному (0°C) раствору 6-(тритилмеркапто)гексиламина (2,44 г, 6,49 ммоль) в ТГФ (50 мл). LiAlH₄ (1M в ТГФ, 9,74 мл, 9,47 ммоль) добавляли через 30 мин и смесь нагревали с обратным холодильником в течение 90 мин. Добавление воды, 3,75M водного раствора NaOH и воды привело к образованию осадка, который удаляли из смеси фильтрованием. Фильтрат концентрировали в вакууме с получением 6a.DIEA (1.41 ml, 8.11 mmol) and n-butyl chloroformate (908 μl, 7.14 mmol, in 1 ml THF) were added to a cooled (0 ° C) solution of 6- (trityl mercapto) hexylamine (2.44 g 6.49 mmol) in THF (50 ml). LiAlH ₄ (1M in THF, 9.74 ml, 9.47 mmol) was added after 30 minutes and the mixture was heated under reflux for 90 minutes. The addition of water, a 3.75 M aqueous NaOH solution and water resulted in the formation of a precipitate, which was removed from the mixture by filtration. The filtrate was concentrated in vacuo to give 6a .

Выход: 2,41 г (6,20 ммоль).Yield: 2.41 g (6.20 mmol).

МС: m/z 390,22 = [M+H]⁺, (вычислено = 390,22).MS: m / z 390.22 = [M + H] ⁺ , (calculated = 390.22).

Синтез промежуточного линкерного реагента 6b:Synthesis of intermediate linker reagent 6b :

К раствору 6a (2,1 г, 5,31 ммоль) добавляли 2-бромэтилфталимид (1,96 Г, 7,7 ммоль) и K₂CO₃ (1,09 г, 7,9 ммоль) и смесь нагревали с обратным холодильником в течение 6 ч. После фильтрования и концентрирования, сырую смесь распределяли между этилацетатом и насыщенным водным раствором NaHCO₃. Сырое промежуточное соединение (2-(N-метил-N-(6-тритилмеркаптогексил)амино)этил)фталимид очищали флэш-хроматографией.To solution 6a (2.1 g, 5.31 mmol) was added 2-bromoethylphthalimide (1.96 g, 7.7 mmol) and K ₂ CO ₃ (1.09 g, 7.9 mmol) and the mixture was heated to reflux refrigerator for 6 hours. After filtration and concentration, the crude mixture was partitioned between ethyl acetate and saturated aqueous NaHCO ₃ . The crude intermediate (2- (N-methyl-N- (6-tritylmercaptohexyl) amino) ethyl) phthalimide was purified by flash chromatography.

Выход: 1,23 г (2,18 ммоль).Yield: 1.23 g (2.18 mmol).

МС: m/z: 563,27 = [M+H]⁺, (вычислено = 563,27).MS: m / z: 563.27 = [M + H] ⁺ , (calculated = 563.27).

К раствору (2-(N-метил-N-(6-тритилмеркаптогексил)амино)этил)фталимида (672 мг, 1,19 ммоль) в этаноле (12 мл) добавляли моногидрат гидразина (208 мкл, 4,17 ммоль) и смесь нагревали с обратным холодильником в течение 1 ч. Реакционную смесь фильтровали, концентрировали, и N-(2-аминоэтил)-N-(6-тритилмеркаптогексил)амин очищали ОФ-ВЭЖХ.To a solution of (2- (N-methyl-N- (6-tritylmercaptohexyl) amino) ethyl) phthalimide (672 mg, 1.19 mmol) in ethanol (12 ml) was added hydrazine monohydrate (208 μl, 4.17 mmol) and the mixture was refluxed for 1 h. The reaction mixture was filtered, concentrated, and N- (2-aminoethyl) -N- (6-tritylmercaptohexyl) amine was purified by RP-HPLC.

Выход: 624 мг (0,944 ммоль).Yield: 624 mg (0.944 mmol).

МС: m/z 433,27 = [M+H]⁺, (вычислено = 433,26).MS: m / z 433.27 = [M + H] ⁺ , (calculated = 433.26).

К раствору N-(2-аминоэтил)-N-(6-тритилмеркаптогексил)амина (151 мг, 0,229 ммоль) и NaCNBH₃ (30 мг, 0,463 ммоль) в безводном MeOH (6 мл) добавляли раствор 2,4-диметоксибензальдегида в безводном CH₂Cl₂ (0,6 мкл). После перемешивания в течение 1 ч при кт, реакционную смесь концентрировали, вновь растворяли в 2 мл смеси вода/ацетонитрил 1/9 (об./об.) и 6b очищали ОФ-ВЭЖХ.To a solution of N- (2-aminoethyl) -N- (6-tritylmercaptohexyl) amine (151 mg, 0.229 mmol) and NaCNBH ₃ (30 mg, 0.463 mmol) in anhydrous MeOH (6 ml) was added a solution of 2,4-dimethoxybenzaldehyde in anhydrous CH ₂ Cl ₂ (0.6 μl). After stirring for 1 h at rt, the reaction mixture was concentrated, redissolved in 2 ml of a water / acetonitrile 1/9 (v / v) mixture, and 6b was purified by RP-HPLC.

Выход: 177 мг (0,219 ммоль).Yield: 177 mg (0.219 mmol).

МС: m/z 583,33 = [M+H]⁺, (вычислено = 583,33).MS: m / z 583.33 = [M + H] ⁺ , (calculated = 583.33).

Синтез линкерного реагента 6c Synthesis of linker reagent 6c

Линкерный реагент 6c получали из Fmoc-Aib-нагруженной смолы (704 мг, ~0,6 ммоль), как описано для 5d, за исключением использования амина 6b (в виде ТФУ-соли, 430 мг, 0,53 ммоль) вместо 5c.Linker reagent 6c was prepared from an Fmoc-Aib-loaded resin (704 mg, ~ 0.6 mmol) as described for 5d, except for the use of amine 6b (as TFA salt, 430 mg, 0.53 mmol) instead of 5c .

Выход: 285 мг (0,330 ммоль).Yield: 285 mg (0.330 mmol).

МС: m/z 712,37 = [M+H]⁺, (вычислено = 712,37).MS: m / z 712.37 = [M + H] ⁺ , (calculated = 712.37).

Пример 7Example 7

Синтез линкерного реагента 7fSynthesis of linker reagent 7f

Линкерный реагент 7f синтезировали согласно следующей схеме:Linker reagent 7f was synthesized according to the following scheme:

К охлажденному (0°С) раствору N-метил-N-boc-этилендиамина (0,5 мл, 2,79 ммоль) и NaCNBH₃ (140 мг, 2,23 ммоль) в MeOH (10 мл) и уксусной кислоте (0,5 мл) добавляли раствор 2,4,6-триметоксибензальдегида (0,547 мг, 2,79 ммоль) в EtOH (10 мл). Смесь перемешивали при кт в течение 2 ч, подкисляли 2M HCl (1 мл) и нейтрализовали насыщенным водным раствором Na₂CO₃ (50 мл). Упариванием всех летучих веществ, экстракцией DCM образовавшейся водной суспензии и концентрированием органических фракций получали N-метил-N-boc-N'-tmob-этилендиамин (7a) в виде сырого масла, которое очищали ОФ-ВЭЖХ.To a chilled (0 ° C) solution of N-methyl-N-boc-ethylenediamine (0.5 ml, 2.79 mmol) and NaCNBH ₃ (140 mg, 2.23 mmol) in MeOH (10 ml) and acetic acid ( 0.5 ml) was added a solution of 2,4,6-trimethoxybenzaldehyde (0.547 mg, 2.79 mmol) in EtOH (10 ml). The mixture was stirred at rt for 2 h, acidified with 2M HCl (1 ml) and neutralized with saturated aqueous Na ₂ CO ₃ (50 ml). Evaporation of all volatiles, extraction with DCM of the resulting aqueous suspension and concentration of organic fractions gave N-methyl-N-boc-N'-tmob-ethylenediamine ( 7a ) as a crude oil, which was purified by RP-HPLC.

Выход: 593 мг (1,52 ммоль).Yield: 593 mg (1.52 mmol).

МС: m/z 377,35 = [M+Na]⁺, (вычислено = 377,14).MS: m / z 377.35 = [M + Na] ⁺ , (calculated = 377.14).

N-Fmoc-N-Me-Asp(OtBu)-OH (225 мг, 0,529 ммоль) растворяли в ДМФ (3 мл) и добавляли 7a (300 мг, 0,847 ммоль), HATU (201 мг, 0,529 ммоль) и коллидин (0,48 мл, 3,70 ммоль). Смесь перемешивали при кт в течение 2 ч с получением 7b. Для удаления fmoc, пиперидин (0,22 мл, 2,16 ммоль) добавляли, и перемешивание продолжали в течение 1 ч. Уксусную кислоту (1 мл) добавляли и 7c очищали ОФ-ВЭЖХ.N-Fmoc-N-Me-Asp (OtBu) -OH (225 mg, 0.529 mmol) was dissolved in DMF (3 ml) and 7a (300 mg, 0.847 mmol), HATU (201 mg, 0.529 mmol) and collidine ( 0.48 ml, 3.70 mmol). The mixture was stirred at rt for 2 hours to give 7b . To remove fmoc, piperidine (0.22 ml, 2.16 mmol) was added and stirring was continued for 1 h. Acetic acid (1 ml) was added and 7c was purified by RP-HPLC.

Выход: 285 мг (0,436 ммоль в виде ТФУ-соли).Yield: 285 mg (0.436 mmol as TFA salt).

МС: m/z 562,54 = [M+Na]⁺, (вычислено = 562,67).MS: m / z 562.54 = [M + Na] ⁺ , (calculated = 562.67).

6-тритилмеркаптогексановую кислоту (0,847 г, 2,17 ммоль) растворяли в безводном ДМФ (7 мл). HATU (0,825 г, 2,17 ммоль) и коллидин (0,8 мл, 6,1 ммоль) и 7c (0,78 г, 1,44 ммоль) добавляли. Реакционную смесь перемешивали в течение 60 мин при кт, подкисляли AcOH (1 мл) и очищали ОФ-ВЭЖХ. Фракции продукта нейтрализовали насыщенным водным раствором NaHCO₃ и концентрировали. Оставшуюся водную фазу экстрагировали DCM, и 7d выделяли при упаривании растворителя.6-tritylmercaptohexanoic acid (0.847 g, 2.17 mmol) was dissolved in anhydrous DMF (7 ml). HATU (0.825 g, 2.17 mmol) and collidine (0.8 ml, 6.1 mmol) and 7c (0.78 g, 1.44 mmol) were added. The reaction mixture was stirred for 60 min at rt, acidified with AcOH (1 ml) and purified by RP-HPLC. Product fractions were neutralized with saturated aqueous NaHCO ₃ and concentrated. The remaining aqueous phase was extracted with DCM, and 7d was isolated by evaporation of the solvent.

Выход: 1,4 г (94%).Yield: 1.4 g (94%).

Мс: m/z 934,7 = [M+Na]⁺, (вычислено = 934,5).MS: m / z 934.7 = [M + Na] ⁺ , (calculated = 934.5).

К раствору 7d (1,40 мг, 1,53 ммоль) в MeOH (12 мл) и H₂O (2 мл) добавляли LiOH (250 мг, 10,4 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в течение 14 ч при 70°C. Смесь подкисляли AcOH (0,8 мл) и 7e очищали ОФ-ВЭЖХ. Фракции продукта нейтрализовали насыщенным водным раствором NaHCO₃ и концентрировали. Водную фазу экстрагировали DCM и 7e выделяли при упаривании растворителя.To a solution of 7d (1.40 mg, 1.53 mmol) in MeOH (12 ml) and H ₂ O (2 ml) was added LiOH (250 mg, 10.4 mmol) and the reaction mixture was stirred for 14 hours at 70 ° C. The mixture was acidified with AcOH (0.8 ml) and 7e was purified by RP-HPLC. Product fractions were neutralized with saturated aqueous NaHCO ₃ and concentrated. The aqueous phase was extracted with DCM and 7e was isolated by evaporation of the solvent.

Выход: 780 мг (60%).Yield: 780 mg (60%).

МС: m/z 878,8 = [M+Na]⁺, (вычислено = 878,40).MS: m / z 878.8 = [M + Na] ⁺ , (calculated = 878.40).

К раствору 7e (170 мг, 0,198 ммоль) в безводном DCM (4 мл) добавляли DCC (123 мг, 0,59 ммоль) и N-гидроксисукцинимид (114 мг, 0,99 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при кт в течение 1 ч. Смесь фильтровали и фильтрат подкисляли 0,5 мл AcOH и 7f очищали ОФ-ВЭЖХ. Фракции продукта нейтрализовали насыщенным водным раствором NaHCO₃ и концентрировали. Оставшуюся водную фазу экстрагировали DCM и 7f выделяли при упаривании растворителя.To a solution of 7e (170 mg, 0.198 mmol) in anhydrous DCM (4 ml) was added DCC (123 mg, 0.59 mmol) and N-hydroxysuccinimide (114 mg, 0.99 mmol) and the reaction mixture was stirred at rt for 1 h. The mixture was filtered and the filtrate was acidified with 0.5 ml AcOH and 7f was purified by RP-HPLC. Product fractions were neutralized with saturated aqueous NaHCO ₃ and concentrated. The remaining aqueous phase was extracted with DCM and 7f was isolated by evaporation of the solvent.

Выход: 154 мг (0,161 ммоль).Yield: 154 mg (0.161 mmol).

Мс: m/z 953,4 = [M+H]⁺, (вычислено = 953,43).MS: m / z 953.4 = [M + H] ⁺ , (calculated = 953.43).

Альтернативно, линкерный реагент 7f синтезировали согласно следующей процедуре:Alternatively, linker reagent 7f was synthesized according to the following procedure:

Альтернативная реакционная схема:Alternative reaction scheme:

К раствору N-метил-N-boc-этилендиамина (2 г, 11,48 ммоль) и NaCNBH₃ (819 мг, 12,63 ммоль) в MeOH (20 мл) добавляли 2,4,6-триметоксибензальдегид (2,08 мг, 10,61 ммоль) порциями. Смесь перемешивали при кт в течение 90 мин, подкисляли 3M HCl (4 мл) и перемешивали еще 15 мин. Реакционную смесь добавляли к насыщенному раствору NaHCO₃ (200 мл) и экстрагировали 5× CH₂Cl₂. Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄, и растворители упаривали в вакууме. Образовавшийся N-метил-N-boc-N′-tmob-этилендиамин (7a) полностью сушили в высоком вакууме и использовали в следующей реакции без дальнейшей очистки.To a solution of N-methyl-N-boc-ethylenediamine (2 g, 11.48 mmol) and NaCNBH ₃ (819 mg, 12.63 mmol) in MeOH (20 ml) was added 2,4,6-trimethoxybenzaldehyde (2.08 mg, 10.61 mmol) in portions. The mixture was stirred at rt for 90 minutes, acidified with 3M HCl (4 ml) and stirred for another 15 minutes. The reaction mixture was added to a saturated solution of NaHCO ₃ (200 ml) and was extracted with 5 × CH ₂ Cl ₂ . The combined organic phases were dried over Na ₂ SO ₄ and the solvents were evaporated in vacuo. The resulting N-methyl-N-boc-N′-tmob-ethylenediamine ( 7a ) was completely dried under high vacuum and used in the next reaction without further purification.

Выход: 3,76 г (11,48 ммоль, 89% чистоты, 7a: сдвоенный Tmob-защищенный продукт = 8:1)Yield: 3.76 g (11.48 mmol, 89% pure, 7a : dual Tmob-protected product = 8: 1)

МС: m/z 355,22 = [M+H]⁺, (вычислено = 354,21).MS: m / z 355.22 = [M + H] ⁺ , (calculated = 354.21).

К раствору 7a (2 г, 5,65 ммоль) в CH₂Cl₂ (24 мл), COMU (4,84 г, 11,3 ммоль), N-Fmoc-N-Me-Asp(OBn)-OH (2,08 г, 4,52 ммоль) и коллидин (2,65 мл, 20,34 ммоль) добавляли. Реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч при кт, разбавляли CH₂Cl₂ (250 мл) и промывали 3× 0,1M H₂SO₄ (100 мл) и 3× насыщенным раствором соли (100 мл). Водные фазы экстрагировали CH₂Cl₂ (100 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄, фильтровали, и остаток концентрировали до объема 24 мл. 7g очищали, используя флэш-хроматографию.To a solution of 7a (2 g, 5.65 mmol) in CH ₂ Cl ₂ (24 ml), COMU (4.84 g, 11.3 mmol), N-Fmoc-N-Me-Asp (OBn) -OH ( 2.08 g, 4.52 mmol) and collidine (2.65 ml, 20.34 mmol) were added. The reaction mixture was stirred for 3 h at rt, diluted with CH ₂ Cl ₂ (250 ml) and washed with 3 × 0.1 M H ₂ SO ₄ (100 ml) and 3 × saturated brine (100 ml). The aqueous phases were extracted with CH ₂ Cl ₂ (100 ml). The combined organic phases were dried over Na ₂ SO ₄ , filtered, and the residue was concentrated to a volume of 24 ml. 7g was purified using flash chromatography.

Выход: 5,31 г (148%, 6,66 ммоль).Yield: 5.31 g (148%, 6.66 mmol).

Мс: m/z 796,38 = [M+H]⁺ (вычислено = 795,37).MS: m / z 796.38 = [M + H] ⁺ (calculated = 795.37).

К раствору 7g [5,31 г, макс. 4,51 ммоль относительно N-Fmoc-N-Me-Asp(OBn)-OH] в ТГФ (60 мл), DBU (1,8 мл, 3% об./об.) добавляли. Раствор перемешивали в течение 12 мин при кт, разбавляли CH₂Cl₂ (400 мл) и промывали 3× 0,1M H₂SO₄ (150 мл) и 3× насыщенным раствором соли (150 мл). Водные фазы экстрагировали CH₂Cl₂ (100 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄ и фильтровали. 7h выделяли при упаривании растворителя и использовали на следующей стадии без дальнейшей очистки.To 7g solution [5.31 g, max. 4.51 mmol relative to N-Fmoc-N-Me-Asp (OBn) -OH] in THF (60 ml), DBU (1.8 ml, 3% v / v) was added. The solution was stirred for 12 min at rt, diluted with CH ₂ Cl ₂ (400 ml) and washed with 3 × 0.1 M H ₂ SO ₄ (150 ml) and 3 × brine (150 ml). The aqueous phases were extracted with CH ₂ Cl ₂ (100 ml). The combined organic phases were dried over Na ₂ SO ₄ and filtered. 7h was isolated by evaporation of the solvent and used in the next step without further purification.

МС: m/z 574,31 = [M+H]⁺, (вычислено = 573,30).MS: m / z 574.31 = [M + H] ⁺ , (calculated = 573.30).

7h (5,31 г, 4,51 ммоль, неочищенный) растворяли в ацетонитриле (26 мл) и COMU (3,87 г, 9,04 ммоль), 6-тритилмеркаптогексановую кислоту (2,12 г, 5,42 ммоль) и коллидин (2,35 мл, 18,08 ммоль) добавляли. Реакционную смесь перемешивали в течение 4 ч при кт, разбавляли CH₂Cl₂ (400 мл) и промывали 3× 0,1M H₂SO₄ (100 мл) и 3× насыщенным раствором соли (100 мл). Водные фазы экстрагировали CH₂Cl₂ (100 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄, фильтровали и 7i выделяли при упаривании растворителя. Продукт 7i очищали флэш-хроматографией. 7h (5.31 g, 4.51 mmol, crude) was dissolved in acetonitrile (26 ml) and COMU (3.87 g, 9.04 mmol), 6-trityl mercaptohexanoic acid (2.12 g, 5.42 mmol) and collidine (2.35 ml, 18.08 mmol) was added. The reaction mixture was stirred for 4 h at rt, diluted with CH ₂ Cl ₂ (400 ml) and washed with 3 × 0.1 M H ₂ SO ₄ (100 ml) and 3 × brine (100 ml). The aqueous phases were extracted with CH ₂ Cl ₂ (100 ml). The combined organic phases were dried over Na ₂ SO ₄ , filtered and 7i was isolated by evaporation of the solvent. Product 7i was purified by flash chromatography.

Выход: 2,63 г (62%, 94% чистоты).Yield: 2.63 g (62%, 94% purity).

MS: m/z 856,41 = [M+H]⁺, (вычислено = 855,41).MS: m / z 856.41 = [M + H] ⁺ , (calculated = 855.41).

К раствору 7i (2,63 г, 2,78 ммоль) в i-PrOH (33 мл) и H₂O (11 мл) добавляли LiOH (267 мг, 11,12 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в течение 70 мин при кт. Смесь разбавляли CH₂Cl₂ (200 мл) и промывали 3× 0,1M H₂SO₄ (50 мл) и 3× насыщенным раствором соли (50 мл). Водные фазы экстрагировали CH₂Cl₂ (100 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na₂SO₄, фильтровали и 7e выделяли при упаривании растворителя. 7j очищали флэш-хроматографией.To a solution of 7i (2.63 g, 2.78 mmol) in i-PrOH (33 ml) and H ₂ O (11 ml) was added LiOH (267 mg, 11.12 mmol) and the reaction mixture was stirred for 70 min at ct The mixture was diluted with CH ₂ Cl ₂ (200 ml) and washed with 3 × 0.1 M H ₂ SO ₄ (50 ml) and 3 × brine (50 ml). The aqueous phases were extracted with CH ₂ Cl ₂ (100 ml). The combined organic phases were dried over Na ₂ SO ₄ , filtered and 7e was isolated by evaporation of the solvent. 7j was purified by flash chromatography.

Выход: 2,1 г (88%).Yield: 2.1 g (88%).

МС: m/z 878,4 = [M+Na]⁺, (вычислено = 878,40).MS: m / z 878.4 = [M + Na] ⁺ , (calculated = 878.40).

К раствору 7e (170 мг, 0,198 ммоль) в безводном DCM (4 мл) добавляли DCC (123 мг, 0,59 ммоль) и каталитическое количество DMAP. Через 5 мин N-гидроксисукцинимид (114 мг, 0,99 ммоль) добавляли и реакционную смесь перемешивали при кт в течение 1 ч. Реакционную смесь фильтровали, растворитель удаляли в вакууме и остаток поглощали 90% ацетонитрилом плюс 0,1% ТФУ (3,4 мл). Сырую смесь очищали ОФ-ВЭЖХ. Фракции продукта нейтрализовали 0,5M фосфатным буфером pH 7,4 и концентрировали. Остающуюся водную фазу экстрагировали DCM и 7f выделяли при упаривании растворителя.To a solution of 7e (170 mg, 0.198 mmol) in anhydrous DCM (4 ml) was added DCC (123 mg, 0.59 mmol) and a catalytic amount of DMAP. After 5 min, N-hydroxysuccinimide (114 mg, 0.99 mmol) was added and the reaction mixture was stirred at rt for 1 h. The reaction mixture was filtered, the solvent was removed in vacuo and the residue was taken up in 90% acetonitrile plus 0.1% TFA (3, 4 ml). The crude mixture was purified by RP-HPLC. Product fractions were neutralized with 0.5M phosphate buffer pH 7.4 and concentrated. The remaining aqueous phase was extracted with DCM and 7f was isolated by evaporation of the solvent.

Выход: 154 мг (81%).Yield: 154 mg (81%).

Мс: m/z 953,4 = [M+H]⁺, (вычислено = 953,43).MS: m / z 953.4 = [M + H] ⁺ , (calculated = 953.43).

Пример 8Example 8

Синтез конъюгатов NSynthesis of N conjugates ^αА1αA1 -инсулин-линкер 8b и 8c-insulin linker 8b and 8c

Синтез защищенного конъюгата инсулин-линкер 8а Synthesis of Protected Insulin Linker 8a Conjugate

Линкерный реагент 5d растворяли в DCM (20 мг/мл) и активировали N-циклогексилкарбодиимид-N'-метилполистироловой смолой (1,9 ммоль/г, 10 экв.) в течение 1 ч. Раствор активированного линкерного реагента добавляли к раствору инсулина (1,2 экв.) и DIEA (3,5 экв.) в ДМСО (100 мг инсулина/мл) и смесь встряхивали при кт в течение 45 мин. Раствор подкисляли уксусной кислотой, DCM упаривали при пониженном давлении и N^αА1-сопряженный защищенный конъюгат инсулин-линкер 8a очищали ОФ-ВЭЖХ.Linker reagent 5d was dissolved in DCM (20 mg / ml) and activated with N-cyclohexylcarbodiimide-N'-methyl polystyrene resin (1.9 mmol / g, 10 eq.) For 1 h. A solution of the activated linker reagent was added to the insulin solution (1 , 2 equiv.) And DIEA (3.5 equiv.) In DMSO (100 mg insulin / ml) and the mixture was shaken at rt for 45 minutes. The solution was acidified with acetic acid, DCM was evaporated under reduced pressure, and the N ^αA1 conjugated protected insulin-linker 8a conjugate was purified by RP-HPLC.

Лиофилизированный 8a обрабатывали смесью 90/10/2/2 (об./об./об./об.) HFIP/ТФУ/вода/триэтилсилан (2 мл/100 мг 8a) в течение 45 мин при кт. Реакционную смесь разбавляли водой, и все летучие вещества удаляли в токе азота. N^αА1-сопряженный конъюгат инсулин-линкер 8b очищали ОФ-ВЭЖХ.Lyophilized 8a was treated with 90/10/2/2 (v / v / v / v) HFIP / TFA / water / triethylsilane (2 ml / 100 mg 8a ) for 45 minutes at rt. The reaction mixture was diluted with water, and all volatiles were removed in a stream of nitrogen. The N ^αA1 conjugated insulin-linker 8b conjugate was purified by RP-HPLC.

8b: Выход: 139 мг (0,023 ммоль) из 62 мг (0,078 ммоль) линкера 5d 8b : Yield: 139 mg (0.023 mmol) of 62 mg (0.078 mmol) of linker 5d

МС: m/z 1524,45 = [M+4H]⁴⁺ (вычислено = 1524,75).MS: m / z 1524.45 = [M + 4H] ⁴⁺ (calculated = 1524.75).

N^αА1-сопряженный конъюгат инсулин-линкер 8c синтезировали, как описано для 8b, за исключением использования 6c (72 мг, 0,101 ммоль) вместо 5d.The N ^αA1 conjugated insulin-linker conjugate 8c was synthesized as described for 8b , except for using 6c (72 mg, 0.101 mmol) instead of 5d .

8c: Выход: 237 мг (0,039 ммоль). 8c : Yield: 237 mg (0.039 mmol).

МС: m/z 1528,23 = [M+4H]⁴⁺ (вычислено = 1528,28).MS: m / z 1528.23 = [M + 4H] ⁴⁺ (calculated = 1528.28).

Пример 9Example 9

Синтез конъюгата NSynthesis of Conjugate N ^αВ1αB1 -инсулин-линкер 9-insulin linker 9

N^α-Boc-Gly^A1-N^ε-boc-Lys⁸²⁹-инсулин с двойной защитой получали, как описано ранее (J. Markussen, J. Halstrøm, F.C. Wiberg, L. Schäffer, J. Biol. Chem. 1991, 266, 18814-18818). Линкерный реагент 5d (0,04 ммоль) растворяли в DCM (0,5 мл) и активировали N-циклогексилкарбодиимид-N'-метилполистироловой смолой (0,205 ммоль) при кт в течение 2 ч. Полученный раствор активированного линкерного реагента добавляли к раствору бис-boc-защищенного инсулина (24 мг, 0,004 ммоль) и DIEA (5 мкл, 0,0229 ммоль) и встряхивали при кт в течение 1 ч. Реакционную смесь подкисляли 100 мкл уксусной кислоты и защищенный конъюгат инсулин-линкер очищали ОФ-ВЭЖХ.Double-protected N ^α -Boc-Gly ^A1 -N ^ε- boc-Lys ⁸²⁹ -insulin was prepared as previously described (J. Markussen, J. Halstrøm, FC Wiberg, L. Schäffer, J. Biol. Chem. 1991, 266 , 18814-18818). Linker reagent 5d (0.04 mmol) was dissolved in DCM (0.5 ml) and activated with N-cyclohexylcarbodiimide-N'-methyl polystyrene resin (0.205 mmol) at rt for 2 hours. The resulting solution of the activated linker reagent was added to the solution of bis- boc-protected insulin (24 mg, 0.004 mmol) and DIEA (5 μl, 0.0229 mmol) were shaken at rt for 1 h. The reaction mixture was acidified with 100 μl of acetic acid and the protected insulin-linker conjugate was purified by RP-HPLC.

Выход: 5 мг (0,00075 ммоль).Yield: 5 mg (0.00075 mmol).

МС: m/z 1660,27 = [M+4H]⁴⁺ (вычислено = 1660,43).MS: m / z 1660.27 = [M + 4H] ⁴⁺ (calculated = 1660.43).

Лиофилизированный защищенный конъюгат инсулин-линкер обрабатывали 1 мл смеси 90/10/2/2 (об./об./об./об.) HFIP/ТФУ/вода/TES при кт в течение 45 мин. Реакционную смесь разбавляли 0,5 мл воды, и все летучие вещества удаляли в токе азота. N^αВ1-сопряженный конъюгат инсулин-линкер 9 очищали ОФ-ВЭЖХ.The lyophilized protected insulin-linker conjugate was treated with 1 ml of a 90/10/2/2 (v / v / v / v) HFIP / TFA / water / TES mixture at rt for 45 minutes. The reaction mixture was diluted with 0.5 ml of water, and all volatiles were removed in a stream of nitrogen. The N ^αB1 conjugated insulin-linker 9 conjugate was purified by RP-HPLC.

Выход: 4 мг (0,0007 ммоль).Yield: 4 mg (0.0007 mmol).

МС: m/z 1524,46 = [M+4H]⁴⁺ (вычислено = 1524,75).MS: m / z 1524.46 = [M + 4H] ⁴⁺ (calculated = 1524.75).

Пример 10Example 10

Синтез конъюгата NSynthesis of Conjugate N ^εВ29εB29 -инсулин-линкер 10-insulin linker 10

Инсулин (644 мг, 0,111 ммоль) растворяли в 6,5 мл ДМСО. Охлажденный (4°С) 3 мл 0,5М натрийборатный буфер (pH 8,5) и 7f (70 мг, 0,073 ммоль) в 2,5 мл ДМСО добавляли и смесь перемешивали в течение 5 мин при кт. AcOH 400 мкл добавляли и защищенный конъюгат инсулина очищали ОФ-ВЭЖХ.Insulin (644 mg, 0.111 mmol) was dissolved in 6.5 ml of DMSO. Chilled (4 ° C) 3 ml of 0.5 M sodium borate buffer (pH 8.5) and 7f (70 mg, 0.073 mmol) in 2.5 ml of DMSO were added and the mixture was stirred for 5 min at rt. AcOH 400 μl was added and the protected insulin conjugate was purified by RP-HPLC.

Выход: 172 мг (0,025 ммоль).Yield: 172 mg (0.025 mmol).

МС: m/z 1662,27 = [M+4H]⁴⁺ (вычислено = 1662,48).MS: m / z 1662.27 = [M + 4H] ⁴⁺ (calculated = 1662.48).

Удаление защитных групп осуществляли путем обработки лиофилизированных фракций продукта 6 мл смеси 90/10/2/2 (об./об./об./об.) HFIP/ТФУ/TES/вода в течение 1 ч при кт. N^εВ29-сопряженный конъюгат инсулин-линкер 10 очищали ОФ-ВЭЖХ.The removal of the protective groups was carried out by treating the lyophilized fractions of the product with 6 ml of a mixture of 90/10/2/2 (vol./about./about./vol.) HFIP / TFA / TES / water for 1 h at rt. The N ^εB29 conjugated insulin-linker 10 conjugate was purified by RP-HPLC.

Выход: 143 мг (0,023 ммоль).Yield: 143 mg (0.023 mmol).

Мс: m/z 1531,46 = [M+4H]⁴⁺ (вычислено = 1531,71).MS: m / z 1531.46 = [M + 4H] ⁴⁺ (calculated = 1531.71).

Пример 11Example 11

Получение инсулин-линкер-гидрогеля 11a, 11b, 11с, 11d, 11da, 11db и 11dcObtaining insulin-linker-hydrogel 11a, 11b, 11c, 11d, 11da, 11db and 11dc

Сухим гидрогелем 4, функционализированным малеимидом (82 мг, 10,3 мкмоль малеимидогрупп), наполняли шприц, снабженный фриттой для фильтрования. Раствор инсулин-линкер-тиол 8b (27,8 мг, 4,6 мкмоль) в 1,0 мл смеси ацетонитрил/вода/ТФУ 1/1/0,001 (об./об./об.) добавляли и суспензию инкубировали в течение 5 мин при кт. Ацетатный буфер (0,4 мл, pH 4,8, 1,0M) добавляли и образец инкубировали при кт в течение 1 ч. Расход тиола контролировали по тесту Эллмана. Гидрогель промывали 10 раз смесью 1/0,43/0,001 (об./об./об.) ацетонитрил/вода/ТФУ и 2 раза смесью 1/1/0,2/0,25 (об./об./об./об.) 1,0M саркозин pH 7,4/ацетонитрил/0,5M фосфатный буфер pH 7,4/вода. И, наконец, гидрогель суспендировали в растворе саркозина и инкубировали в течение 2 ч при кт.A dry hydrogel 4 functionalized with maleimide (82 mg, 10.3 μmol maleimido groups) was filled with a syringe equipped with a frit for filtering. A solution of insulin-linker-thiol 8b (27.8 mg, 4.6 μmol) in 1.0 ml of a mixture of acetonitrile / water / TFA 1/1 / 0.001 (v / v / v) was added and the suspension was incubated for 5 min at rt. Acetate buffer (0.4 ml, pH 4.8, 1.0 M) was added and the sample was incubated at rt for 1 h. Thiol flow was monitored by the Ellman test. The hydrogel was washed 10 times with 1 / 0.43 / 0.001 (v / v / v) acetonitrile / water / TFA and 2 times with 1/1 / 0.2 / 0.25 (v / v / v) ./ob.) 1.0 M sarcosine pH 7.4 / acetonitrile / 0.5 M phosphate buffer pH 7.4 / water. Finally, the hydrogel was suspended in a sarcosine solution and incubated for 2 hours at rt.

Инсулин-линкер-гидрогель 11a промывали 10 раз смесью ацетонитрил/вода/ТФУ 1/1/0,001 (об./об./об.) и хранили при 4°С.The insulin-linker-hydrogel 11a was washed 10 times with a mixture of acetonitrile / water / TFA 1/1 / 0.001 (v / v / v) and stored at 4 ° C.

Содержание инсулина определяли путем тотального гидролиза аликвоты инсулин-линкер-гидрогель при восстановленных условиях при pH 12 и последующего количественного анализа А-цепи инсулина и В-цепи инсулина посредством ОФ-ВЭЖХ.The insulin content was determined by total hydrolysis of an aliquot of the insulin-linker-hydrogel under reduced conditions at pH 12 and subsequent quantitative analysis of the insulin A chain and insulin B chain by RP-HPLC.

Нагрузка инсулина в препарате 11a: 175 мг инсулина/г инсулин-линкер-гидрогеля.The load of insulin in the preparation 11a : 175 mg of insulin / g of insulin-linker-hydrogel.

Количество инсулина в суспензии 11a в 10 мМ натрийацетатном буфере pH 5, 135 мМ хлорида натрия: 12 мг инсулина на 1 мл суспензии 11a.The amount of insulin in suspension 11a in 10 mM sodium acetate buffer pH 5, 135 mM sodium chloride: 12 mg of insulin per 1 ml of suspension 11a .

Препараты 11b, 11с и 11d получали, как описано выше, за исключением использования 8c, 9 и 10, соответственно, вместо 8b. Препарат 11da получали, как описано выше, за исключением использования 10 и 4a вместо 8b и 4.Preparations 11b , 11c and 11d were prepared as described above, except for using 8c , 9 and 10 , respectively, instead of 8b . 11da was prepared as described above, except for using 10 and 4a instead of 8b and 4 .

Препарат 11db получали следующим образом: Суспензией гидрогеля, функционализированного малеимидом, 4a в HCl рН 2,5, 0,01% твин-20 (5,0 мл, 119 мкмоль малеимидогрупп) наполняли шприц, снабженный фильтром. Раствор инсулин-линкер-тиол 10 (166 мг, 24,4 мкмоль) в 8,0 мл HCl pH 2,5, 0,01% твин-20 добавляли, и суспензию инкубировали в течение 5 мин при кт. Натрийсукцинатный буфер (3,9 мл, pH 4,0, 150 мМ; 1 мМ EDTA, 0,01% твин-20) добавляли до достижения pH 3,6, и образец инкубировали при кт в течение 90 мин. Расход тиола контролировали по тесту Эллмана. Гидрогель промывали 10 раз натрийсукцинатным буфером (pH 3,0, 50 мМ; 1 мМ EDTA, 0,01% твин-20) и 3 раза натрийсукцинатным буфером (pH 3,0, 50 мМ; 1 мМ ЭДТА, 0,01% твин-20), содержащим 200 мМ ацетилцистеина. И, наконец, гидрогель суспендировали в буфере, содержащем ацетилцистеин, и инкубировали в течение 1 ч при кт.The 11db preparation was prepared as follows: A suspension of a hydrogel functionalized with maleimide 4a in HCl pH 2.5, 0.01% tween-20 (5.0 ml, 119 μmol maleimide groups) was filled into a syringe equipped with a filter. A solution of insulin-linker-thiol 10 (166 mg, 24.4 μmol) in 8.0 ml of HCl pH 2.5, 0.01% tween-20 was added, and the suspension was incubated for 5 min at rt. Sodium succinate buffer (3.9 ml, pH 4.0, 150 mM; 1 mM EDTA, 0.01% tween-20) was added until a pH of 3.6 was reached, and the sample was incubated at rt for 90 min. Thiol consumption was monitored by the Ellman test. The hydrogel was washed 10 times with sodium succinate buffer (pH 3.0, 50 mM; 1 mM EDTA, 0.01% Tween-20) and 3 times with sodium succinate buffer (pH 3.0, 50 mM; 1 mM EDTA, 0.01% Tween -20) containing 200 mM acetylcysteine. Finally, the hydrogel was suspended in a buffer containing acetylcysteine and incubated for 1 h at rt.

Инсулин-линкер-гидрогель 11db промывали 10 раз сукцинатным буфером (pH 3,0, 50 мМ; 1 мМ ЭДТА, 0,01% твин-20) и 8 раз натрийацетатным буфером (pH 5,0, 10 мМ; 130 мМ NaCl, 0,01% твин-20).The 11db insulin-linker-hydrogel was washed 10 times with succinate buffer (pH 3.0, 50 mM; 1 mM EDTA, 0.01% Tween-20) and 8 times with sodium acetate buffer (pH 5.0, 10 mM; 130 mM NaCl, 0.01% Tween-20).

Нагрузка инсулина в препарате 11db: 6,12 мг инсулина на мл суспензии инсулин-линкер-гидрогель. 11db insulin load: 6.12 mg of insulin per ml of suspension of insulin-linker-hydrogel.

Препарат 11dc получали следующим образом: Суспензию гидрогеля, функционализированного малеимидом, 4a в HCl рН 2,5, 0,01% твин-20 (58,3 мл, 958 мкмоль малеимидогрупп) добавляли к реактору для твердофазного синтеза. Раствор инсулин-линкер-тиол 10 (117 мл, 460 мкмоль) в HCl рН 2,5, 0,01% твин-20 добавляли к 4a. Суспензию инкубировали при кт в течение 5 мин. Сукцинатный буфер (4,8 мл, pH 4,0, 150 мМ; 1 мМ ЭДТА, 0,01% твин-20) добавляли до достижения pH 3,6, и суспензию инкубировали при кт в течение 90 мин.The 11dc preparation was prepared as follows: A suspension of a maleimide functionalized hydrogel 4a in HCl pH 2.5, 0.01% tween-20 (58.3 ml, 958 μmol maleimide groups) was added to the solid-phase synthesis reactor. A solution of insulin-linker-thiol 10 (117 ml, 460 μmol) in HCl pH 2.5, 0.01% tween-20 was added to 4a . The suspension was incubated at rt for 5 min. Succinate buffer (4.8 ml, pH 4.0, 150 mM; 1 mM EDTA, 0.01% tween-20) was added until pH 3.6 was reached, and the suspension was incubated at rt for 90 min.

Расход тиола контролировали по тесту Эллмана. Гидрогель промывали 10 раз сукцинатным буфером (pH 3,0, 50 мМ; 1 мМ ЭДТА, 0,01% твин-20) и 2 раза сукцинатным буфером (pH 3,0, 50 мМ; 1 мМ ЭДТА, 0,01% твин-20), содержащим 10 мМ меркаптоэтанола. И, наконец, гидрогель суспендировали в буфере, содержащем меркаптоэтанол, и инкубировали в течение 3 ч при кт.Thiol consumption was monitored by the Ellman test. The hydrogel was washed 10 times with succinate buffer (pH 3.0, 50 mM; 1 mM EDTA, 0.01% tween-20) and 2 times with succinate buffer (pH 3.0, 50 mM; 1 mM EDTA, 0.01% tween -20) containing 10 mM mercaptoethanol. Finally, the hydrogel was suspended in a buffer containing mercaptoethanol and incubated for 3 hours at rt.

Инсулин-линкер-гидрогель 11dc промывали 10 раз сукцинатным буфером (pH 3,0, 50 мМ; 1 мМ ЭДТА, 0,01% твин-20) и 6 раз буфером сукцинат/трис (pH 5,0, 10 мМ; 85 г/л трегалозы, 0,01% твин-20).The 11dc insulin-linker-hydrogel was washed 10 times with succinate buffer (pH 3.0, 50 mM; 1 mM EDTA, 0.01% Tween-20) and 6 times with succinate / Tris buffer (pH 5.0, 10 mM; 85 g / l trehalose, 0.01% tween-20).

Нагрузка инсулина в препарате 11dc: 18,7 мг инсулина на мл суспензии инсулин-линкер-гидрогель.The load of insulin in the preparation 11dc : 18.7 mg of insulin per ml suspension of insulin-linker-hydrogel.

Альтернативно, микрочастицы гидрогеля, дериватизированного малеимидом, 4aa могут быть использованы вместо 4а.Alternatively, microparticles of the maleimide derivatized hydrogel 4aa may be used instead of 4a .

Пример 12Example 12

Кинетика высвобождения in vitro In vitro release kinetics

Инсулин-линкер-гидрогель 11a, 11b, 11с и 11d, соответственно (инсулин-линкер-гидрогель, содержащий приблизительно 1 мг инсулина), суспендировали в 2 мл 60 мМ фосфата натрия, 3 мМ ЭДТА, 0,01% твин-20, pH 7,4, и инкубировали при 37°С. Суспензии центрифугировали в определенные интервалы времени и супернатант анализировали ОФ-ВЭЖХ при 215 нм и ESI-МС. УФ-сигналы, коррелирующие с высвобождением инсулина, интегрировали и данные откладывали на графике против времени инкубации. Программу обработки кривых использовали для расчета соответствующего полупериода высвобождения.The insulin-linker-hydrogel 11a , 11b , 11c and 11d , respectively (insulin-linker-hydrogel containing approximately 1 mg of insulin), were suspended in 2 ml of 60 mm sodium phosphate, 3 mm EDTA, 0.01% tween-20, pH 7.4, and incubated at 37 ° C. Suspensions were centrifuged at specific time intervals and the supernatant was analyzed by RP-HPLC at 215 nm and ESI-MS. UV signals correlated with insulin release were integrated and data plotted against incubation time. The curve processing program was used to calculate the corresponding release half-cycle.

In vitro время полужизни для временных точек 16 дней, 10 дней, 30 дней и 14 дней определяли для 11a, 11b, 11c и 11d, соответственно. In vitro half-lives for time points of 16 days, 10 days, 30 days, and 14 days were determined for 11a , 11b , 11c, and 11d , respectively.

Альтернативно, инсулин-линкер-гидрогель 11db переносили в шприцы, снабженные фильтрами, суспендировали в 6 мл 60 мМ фосфата натрия, 3 мМ ЭДТА, 0,01% твин-20, pH 7,4 и инкубировали при 37°С. При определенных временных точках супернатант заменяли и высвобожденный инсулин количественно определяли ОФ-ВЭЖХ при 215 нм. Количество высвобожденного инсулина откладывали на графике против времени инкубации. Программу обработки кривых применяли и in vitro полупериод для временной точки 15 дней определяли для препарата 11db.Alternatively, 11db insulin-linker-hydrogel was transferred into syringes equipped with filters, suspended in 6 ml of 60 mM sodium phosphate, 3 mM EDTA, 0.01% tween-20, pH 7.4, and incubated at 37 ° C. At certain time points, the supernatant was replaced and the released insulin was quantified by RP-HPLC at 215 nm. The amount of insulin released was plotted against incubation time. A curve processing program was used and an in vitro half-period for a 15-day time point was determined for 11db .

Альтернативно, инсулин-линкер-гидрогель 11db загружали в хроматографическую колонку и помещали в инкубатор с контролируемой температурой (37°С). Натрий фосфат (pH 7,4, 60 мМ; 3 мМ ЭДТА, 0,01% твин-20) пропускали через колонку с насосом с постоянной скоростью потока 0,25 мл/ч (номинальная) и собирали снаружи инкубатора. При определенных временных точках, раствор анализировали ОФ-ВЭЖХ при 215 нм. Количество высвобожденного инсулина откладывали на графике против времени инкубации. Программу обработки кривых использовали и in vitro полупериод для временной точки 13 дней определяли для 11db.Alternatively, the 11db insulin-linker-hydrogel was loaded onto a chromatographic column and placed in a temperature-controlled incubator (37 ° C). Sodium phosphate (pH 7.4, 60 mM; 3 mM EDTA, 0.01% Tween-20) was passed through a column with a pump at a constant flow rate of 0.25 ml / h (nominal) and collected outside the incubator. At specific time points, the solution was analyzed by RP-HPLC at 215 nm. The amount of insulin released was plotted against incubation time. A curve processing program was used and an in vitro half period for a 13 day time point was determined for 11db .

Пример 13Example 13

Синтез конъюгата LysB29-линкера и инсулина (12а) и LysB28-линкера и инсулина лизпро (12b):Synthesis of the conjugate of the LysB29 linker and insulin (12a) and the LysB28 linker and insulin lispro (12b):

Синтез конъюгата LysB29-линкера и инсулина (12a)Synthesis of LysB29 Linker and Insulin Conjugate ( 12a )

Инсулин 1,2 г (0,206 ммоль, 0,85 экв.) растворяли в ДМСО при кт. Через 30 мин раствор охлаждали до 0°С, в то же время боратный буфер (0,5M, pH 8,5, 21,6 мл) добавляли в течение периода 4,40 мин. Температуру раствора поддерживали между 25 и 28°С. Линкерный реагент 7f 228 мг (0,239 ммоль, 1 экв.), растворенный в 40 мл ДМСО, добавляли независимо от времени в течение периода 3 мин. Баню со льдом отставляли и реакционную смесь перемешивали в течение 5 мин при кт. Реакцию гасили добавлением 70 мл MeCN/H₂O (1:1, 0,1% ТФУ) и 400 мкл AcOH. Препарат 12a очищали ОФ-ВЭЖХ (растворитель A: H₂O с 0,1% ТФУ, растворитель B: MeCN с 0,1% ТФУ, градиент: 30-80% B в течение 14 мин, скорость потока: 40 мл/мин).Insulin 1.2 g (0.206 mmol, 0.85 equiv.) Was dissolved in DMSO at rt. After 30 minutes, the solution was cooled to 0 ° C, while borate buffer (0.5 M, pH 8.5, 21.6 ml) was added over a period of 4.40 minutes. The temperature of the solution was maintained between 25 and 28 ° C. The 7f 228 mg linker reagent (0.239 mmol, 1 equiv.) Dissolved in 40 ml of DMSO was added regardless of the time over a period of 3 minutes. The ice bath was set aside and the reaction mixture was stirred for 5 minutes at rt. The reaction was quenched by adding 70 ml of MeCN / H ₂ O (1: 1, 0.1% TFA) and 400 μl AcOH. The preparation 12a was purified by RP-HPLC (solvent A: H ₂ O with 0.1% TFA, solvent B: MeCN with 0.1% TFA, gradient: 30-80% B for 14 min, flow rate: 40 ml / min )

Региоселективность согласно данным анализа UPLC (до очистки ОФ-ВЭЖХ): 0,70% 7f связывается с GlyA1 инсулина и 76,2% 7f связывается с LysB29 инсулина (см. фиг.1а).Regioselectivity according to UPLC analysis (before purification by RP-HPLC): 0.70% 7f binds to insulin GlyA1 and 76.2% 7f binds to insulin LysB29 (see figa ).

Выход: 862 мг (ТФУ-соль, 60%).Yield: 862 mg (TFA salt, 60%).

МС [M+H]_1/4 ⁺ = 1662,25 г/моль ((MW+H)_1/4 вычислено = 1662,35 г/моль).MS [M + H] _1/4 ⁺ = 1662.25 g / mol ((MW + H) _1/4 calculated = 1662.35 g / mol).

Синтез конъюгата LysB28-линкера и инсулина лизпро (12b)Synthesis of LysB28 Linker and Lyspro Insulin Conjugate ( 12b )

Инсулин лизпро 0,347 г (0,059 ммоль, 0,85 экв.) 1,2 г (0,206 ммоль, 0,85 экв.) растворяли в 6 мл ДМСО при кт. Через 30 мин раствор охлаждали до 0°С, в то же время боратный буфер (0,5M, pH 8,5, 21,6 мл) добавляли в течение периода 1,40 мин. Температуру раствора поддерживали между 25 и 30°С. Раствор 67 мг (0,070 ммоль, 1 экв.) 7f, растворенного в 8 мл ДМСО, добавляли независимо от времени в течение периода 2 мин. Баню со льдом отставляли и реакционную смесь перемешивали в течение 5 мин при кт. Реакцию гасили добавлением 20 мл MeCN/H₂O (1:1, 0,1% ТФУ) и 1 мл AcOH. Препарат 12b очищали ОФ-ВЭЖХ (растворитель A: H₂O с 0,1% ТФУ, растворитель B: MeCN с 0,1% ТФУ, градиент: 30-80% B в течение 14 мин, скорость потока: 40 мл/мин).Lyspro insulin 0.347 g (0.059 mmol, 0.85 equiv.) 1.2 g (0.206 mmol, 0.85 equiv.) Was dissolved in 6 ml of DMSO at rt. After 30 minutes, the solution was cooled to 0 ° C, while borate buffer (0.5 M, pH 8.5, 21.6 ml) was added over a period of 1.40 minutes. The temperature of the solution was maintained between 25 and 30 ° C. A solution of 67 mg (0.070 mmol, 1 equiv.) Of 7f dissolved in 8 ml of DMSO was added regardless of the time over a period of 2 minutes. The ice bath was set aside and the reaction mixture was stirred for 5 minutes at rt. The reaction was quenched by the addition of 20 ml MeCN / H ₂ O (1: 1, 0.1% TFA) and 1 ml AcOH. The preparation 12b was purified by RP-HPLC (solvent A: H ₂ O with 0.1% TFA, solvent B: MeCN with 0.1% TFA, gradient: 30-80% B for 14 min, flow rate: 40 ml / min )

Региоселективность согласно данным анализа UPLC (до очистки ОФ-ВЭЖХ): 1,3% продукта составлял 7f, связанный с GlyA1 инсулина лизпро, 76,7% продукта составлял 7f, связанный с LysB29 инсулина лизпро (см. фиг.1b).Regioselectivity according to UPLC analysis (before purification by RP-HPLC): 1.3% of the product was 7f linked to GlyA1 of insulin lispro, 76.7% of the product was 7f linked to LysB29 of insulin lispro (see fig. 1b ).

Выход: 305 мг (ТФУ-соль, 72%).Yield: 305 mg (TFA salt, 72%).

МС [M+H]_1/4 ⁺ = 1662,25 г/моль ((MW+H)_1/4 вычислено = 1662,35 г/моль).MS [M + H] _1/4 ⁺ = 1662.25 g / mol ((MW + H) _1/4 calculated = 1662.35 g / mol).

Пример 14Example 14

Фармакокинетические исследования на крысахPharmacokinetic studies in rats

Фармакокинетику препарата 11da определяли путем измерения концентрации инсулина в плазме после подкожной инъекции однократной дозы крысам.The pharmacokinetics of 11da were determined by measuring the plasma insulin concentration after subcutaneous injection of a single dose to rats.

Одну группу, состоящую из 10 крыс самцов линии Вистар (200-250 г), использовали для изучения уровней инсулина в плазме в течение периода 14 дней. Каждому из животных вводили подкожно одну инъекцию 500 мкл суспензии препарата 11а в ацетатном буфере, рН 5, содержащем 6 мг инсулина (12 мг инсулина/мл). Из расчета на животное и временную точку, 200 мкл крови отбирали сублингвально с получением 100 мкл плазмы с Li-гепарином. Образцы собирали до инъекции и после 4 ч, 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11 и 14 дней после инъекции. Образцы плазмы замораживали в течение 15 мин после забора крови и хранили при -80°С до анализа.One group of 10 Wistar male rats (200-250 g) was used to study plasma insulin levels over a period of 14 days. Each animal was injected subcutaneously with one injection of 500 μl of a suspension of 11a in acetate buffer, pH 5, containing 6 mg of insulin (12 mg of insulin / ml). Based on the animal and the time point, 200 μl of blood was taken sublingually to obtain 100 μl of plasma with Li-heparin. Samples were collected before injection and after 4 hours, 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, and 14 days after injection. Plasma samples were frozen for 15 min after blood sampling and stored at -80 ° C until analysis.

Концентрации инсулина в плазме измеряли, используя набор ELISA для сверхчувствительного анализа инсулина (Mercodia) согласно протоколу производителя. Образцы плазмы разбавляли в буфере ELISA (1:5 и 1:10 с калибратором 0) до измерения. Концентрации инсулина рассчитывали, исходя из калибровочной кривой, построенной на основании измерения стандартов инсулина в двух параллельных определениях, и приближения величин, используя линейную регрессию. Концентрацию инсулина определяли как среднюю величину, вычисленную на основании двух независимых серий разведений, скорректированную с помощью соответственного фактора разведения и отложенную на графике против времени. Усредненные концентрации инсулина в плазме для каждой временной точки получали путем расчета средней величины для всех используемых животных, как показано на фиг.2.Plasma insulin concentrations were measured using an ELISA kit for supersensitive analysis of insulin (Mercodia) according to the manufacturer's protocol. Plasma samples were diluted in ELISA buffer (1: 5 and 1:10 with calibrator 0) before measurement. Insulin concentrations were calculated based on a calibration curve based on measuring insulin standards in two parallel determinations and approximation using linear regression. Insulin concentration was determined as the average value calculated on the basis of two independent series of dilutions, adjusted using the corresponding dilution factor and plotted against time. The average plasma insulin concentration for each time point was obtained by calculating the average value for all animals used, as shown in figure 2.

В течение 14 дней наблюдали отсутствие выброса и замедленное высвобождение инсулина.For 14 days, there was a lack of release and a slow release of insulin.

Пример 15Example 15

Фармакокинетические изучения на крысахPharmacokinetic studies in rats

Фармакокинетику препарата 11da определяли путем измерения концентраций инсулина в плазме в течение периода 13 дней у здоровых крыс.The pharmacokinetics of 11da were determined by measuring plasma insulin concentrations over a period of 13 days in healthy rats.

8 крысам линии Вистар (приблизительно 250 г весом) вводили подкожно одноразовую инъекцию 500 мкл испытуемого препарата 11da в ацетатном буфере рН 5, содержащем 3 мг инсулина (приблизительно 12 мг/кг). Из расчета на животное и временную точку 200 мкл крови отбирали из хвостовой вены с получением приблизительно 100 мкл плазмы с Li-гепарином. Образцы собирали 1 день до и 4 ч, 1 день, 2 дня, 3 дня, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 10 дней и 13 дней после введения испытуемого препарата. Образцы плазмы замораживали и хранили при -80°С до анализа. Содержание инсулина в образцах плазмы измеряли, используя набор ELISA для сверхчувствительного анализа человеческого инсулина (DRG Instruments GmbH, Germany) согласно протоколу производителя. Контрольные пробы (калибратор 0) включали в калибровочную кривую и вычитали из величин, полученных для образцов, и калибровочные кривые строили, используя полиномиальное уравнение 3-го порядка. До анализа образцы плазмы встряхивали и разбавляли в реакционных пробирках (1:5 и 1:10 с калибратором 0). Для анализа OD при 450 нм измеряли посредством считывающего устройства для титрационных микропланшетов (Tecan Ultra) без коррекции опорной длины волны. Результаты исследования содержания инсулина вплоть до 13-го дня для всех животных представлены на фиг.3.Eight Wistar rats (approximately 250 g weight) were injected subcutaneously with a single injection of 500 μl of the test drug 11da in pH 5 acetate buffer containing 3 mg of insulin (approximately 12 mg / kg). Based on the animal and the time point, 200 μl of blood was taken from the tail vein to obtain approximately 100 μl of plasma with Li-heparin. Samples were collected 1 day before and 4 hours, 1 day, 2 days, 3 days, 6 days, 7 days, 8 days, 10 days and 13 days after administration of the test drug. Plasma samples were frozen and stored at -80 ° C until analysis. The insulin content in plasma samples was measured using an ELISA kit for supersensitive analysis of human insulin (DRG Instruments GmbH, Germany) according to the manufacturer's protocol. Control samples (calibrator 0) were included in the calibration curve and subtracted from the values obtained for the samples, and calibration curves were constructed using a third-order polynomial equation. Prior to analysis, plasma samples were shaken and diluted in reaction tubes (1: 5 and 1:10 with calibrator 0). For analysis, OD at 450 nm was measured by a microtiter plate reader (Tecan Ultra) without correction of the reference wavelength. The results of the study of insulin up to the 13th day for all animals are presented in figure 3.

После одноразовой подкожной инъекции 500 мкл препарата 11da, который содержал 3 мг инсулина, средний уровень инсулина в плазме поднялся до максимальной величины приблизительно 500 пМ на день 1. Как предполагали, концентрация инсулина в плазме впоследствии снижалась постоянно в течение 2 недель. Отношение пика к минимуму на графике уровней инсулина в плазме в течение первой недели исследования составляло приблизительно 1,7.After a single subcutaneous injection of 500 μl of 11da , which contained 3 mg of insulin, the average plasma insulin level rose to a maximum value of approximately 500 pM on day 1. It was assumed that the plasma insulin concentration subsequently decreased continuously for 2 weeks. The peak to minimum ratio in the plot of plasma insulin levels during the first week of the study was approximately 1.7.

Пример 16Example 16

Исследования фармакокинетики и фармакодинамики на крысахStudies of pharmacokinetics and pharmacodynamics in rats

Количество и биоактивность высвобожденного инсулина исследовали путем анализа концентрации инсулина в плазме и эффекта снижения глюкозы в крови в фармакокинетическом/фармакодинамическом изучении при использовании диабетических крыс линии Sprague-Dawley (SD).The amount and bioactivity of the released insulin was investigated by analyzing the plasma insulin concentration and the effect of lowering blood glucose in a pharmacokinetic / pharmacodynamic study using Sprague-Dawley (SD) diabetic rats.

С этой целью диабет вызывали у 8 крыс введением стрептозотоцина (STZ) и всех животных с уровнями глюкозы в крови, составляющими выше 350 мг/дл на день 0, включали в данное исследование. 7 из 8 крыс SD становились диабетическими, и им вводили подкожно инъекции 500 мкл испытуемого препарата 11da в ацетатном буфере рН 5, содержащем 6,4 мг инсулина. Из расчета на животное и временную точку 200 мкл крови отбирали из хвостовой вены с получением приблизительно 100 мкл плазмы с Li-гепарином. Образцы собирали 4 дня до и 2 ч, 1 день, 2 дня, 3 дня, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 10 дней и 13 дней после введения испытуемого препарата. Образцы плазмы замораживали и хранили при -80°С до анализа. Уровень глюкозы в крови из хвостовой вены измеряли посредством устройства AccuChek Comfort 3 раза до инъекции и 2 ч, 1 день, 2 дня, 3 дня, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 10 дней, 13 дней, 15 дней, 17 дней, 20 дней, 22 дня и 24 дня после введения испытуемого препарата. Содержание инсулина в образцах плазмы измеряли, используя набор ELISA с человеческим инсулином (DRG Instruments GmbH, Germany), согласно инструкциям производителя. Контрольные пробы (калибратор 0) включали в калибровочную кривую и вычитали из величин, полученных для образцов, и калибровочные кривые строили, используя полиномиальное уравнение 3-го порядка. До анализа образцы плазмы встряхивали и разбавляли в реакционных пробирках (1:5 и 1:10 с калибратором 0). Для анализа OD при 450 нм измеряли посредством считывающего устройства для титрационных микропланшетов (Tecan Ultra) без коррекции опорной длины волны. Уровень инсулина в плазме контролировали в течение 2 недель и уровень глюкозы в крови в течение 3-недельного периода, как показано на фиг.4.To this end, diabetes was induced in 8 rats by the administration of streptozotocin (STZ) and all animals with blood glucose levels above 350 mg / dl on day 0 were included in this study. 7 out of 8 SD rats became diabetic and were injected subcutaneously with 500 μl of the 11da test preparation in pH 5 acetate buffer containing 6.4 mg of insulin. Based on the animal and the time point, 200 μl of blood was taken from the tail vein to obtain approximately 100 μl of plasma with Li-heparin. Samples were collected 4 days before and 2 hours, 1 day, 2 days, 3 days, 6 days, 7 days, 8 days, 10 days and 13 days after administration of the test drug. Plasma samples were frozen and stored at -80 ° C until analysis. The blood glucose level from the tail vein was measured using an AccuChek Comfort device 3 times before injection and 2 hours, 1 day, 2 days, 3 days, 6 days, 7 days, 8 days, 10 days, 13 days, 15 days, 17 days, 20 days, 22 days, and 24 days after administration of the test drug. The insulin content in plasma samples was measured using a human insulin ELISA kit (DRG Instruments GmbH, Germany) according to the manufacturer's instructions. Control samples (calibrator 0) were included in the calibration curve and subtracted from the values obtained for the samples, and calibration curves were constructed using a third-order polynomial equation. Prior to analysis, plasma samples were shaken and diluted in reaction tubes (1: 5 and 1:10 with calibrator 0). For analysis, OD at 450 nm was measured by a microtiter plate reader (Tecan Ultra) without correction of the reference wavelength. Plasma insulin levels were monitored for 2 weeks and blood glucose levels over a 3-week period, as shown in FIG. 4.

После одноразовой подкожной инъекции инсулин-гидрогель 11da уровень глюкозы в крови эффективно понижался в течение периода 10 дней с величинами ниже 100 мг/дл без каких-либо признаков гипогликемии. Вследствие более высокой дозировки, составляющей 6,4 мг инсулина на животное, максимальная концентрация инсулина в плазме составляла приблизительно 800 пМ на день 1 и постоянно снижалась в течение 2 недель до величины приблизительно 300 пМ. Одновременно значения глюкозы в крови начинали повышаться после 10 дней и достигали уровней в крови до приема инсулина после 3 недель.After a single subcutaneous injection of 11da insulin hydrogel , the blood glucose level effectively decreased over a period of 10 days with values below 100 mg / dl without any signs of hypoglycemia. Due to the higher dosage of 6.4 mg of insulin per animal, the maximum plasma insulin concentration was approximately 800 pM on day 1 and continuously decreased over a period of 2 weeks to approximately 300 pM. At the same time, blood glucose values began to rise after 10 days and reached blood levels before taking insulin after 3 weeks.

Пример 17Example 17

Фармакокинетические исследования в течение 24 часов (изучение выброса) на крысахPharmacokinetic studies within 24 hours (study release) in rats

Для того чтобы удостовериться, что инсулин высвобождается из инсулин-линкер-гидрогеля без выброса, концентрацию инсулина в плазме контролировали в течение периода 24 часа у здоровых крыс.In order to ensure that insulin is released from the insulin-linker hydrogel without ejection, the plasma insulin concentration was monitored for a period of 24 hours in healthy rats.

8 крыс линии Sprague-Dawley (200-250 г массы тела) разделяли на 2 группы и вводили одноразовую подкожную инъекцию 2 мл испытуемого препарата 11db в ацетатном буфере рН 5 на кг массы тела. Испытуемый препарат содержал 4 мг/мл инсулина так, что каждое животное получало 8 мг инсулина на кг массы тела. Из расчета на животное и временную точку 200 мкл крови отбирали из хвостовой вены с получением приблизительно 100 мкл плазмы с Li-гепарином. Образцы из группы А собирали до приема препарата и 5 мин, 30 мин, 2 ч, 4 ч и 8 ч после применения испытуемого препарата и для группы В до приема препарата и 15 мин, 1 ч, 3 ч, 6 ч и 24 ч после введения испытуемого препарата. Образцы плазмы замораживали и хранили при -80°С до анализа. Содержание инсулина в образцах плазмы измеряли, используя набор ELISA для сверхчувствительного анализа человеческого инсулина (DRG Instruments GmbH, Germany) согласно протоколу производителя. Контрольные пробы (калибратор 0) включали в калибровочную кривую и вычитали из величин, полученных для образцов, и калибровочные кривые строили, используя полиномиальное уравнение 3-го порядка. До анализа образцы плазмы встряхивали и разбавляли в реакционных пробирках (1:5 и 1:10 с калибратором 0). Для анализа OD при 450 нм измеряли посредством считывающего устройства для титрационных микропланшетов (Tecan Ultra) без коррекции опорной длины волны. Результат представлен на фиг.5 и четко указывает, что инсулин высвобождается без какого-либо выброса.8 Sprague-Dawley rats (200-250 g body weight) were divided into 2 groups and a single subcutaneous injection of 2 ml of the 11db test preparation was administered in acetate buffer pH 5 per kg body weight. The test preparation contained 4 mg / ml of insulin so that each animal received 8 mg of insulin per kg of body weight. Based on the animal and the time point, 200 μl of blood was taken from the tail vein to obtain approximately 100 μl of plasma with Li-heparin. Samples from group A were collected before taking the drug and 5 minutes, 30 minutes, 2 hours, 4 hours and 8 hours after using the test drug and for group B before taking the drug and 15 minutes, 1 hour, 3 hours, 6 hours and 24 hours after the administration of the test drug. Plasma samples were frozen and stored at -80 ° C until analysis. The insulin content in plasma samples was measured using an ELISA kit for supersensitive analysis of human insulin (DRG Instruments GmbH, Germany) according to the manufacturer's protocol. Control samples (calibrator 0) were included in the calibration curve and subtracted from the values obtained for the samples, and calibration curves were constructed using a third-order polynomial equation. Prior to analysis, plasma samples were shaken and diluted in reaction tubes (1: 5 and 1:10 with calibrator 0). For analysis, OD at 450 nm was measured by a microtiter plate reader (Tecan Ultra) without correction of the reference wavelength. The result is shown in FIG. 5 and clearly indicates that insulin is released without any release.

Пример 18Example 18

Фармакокинетическое и фармакодинамическое исследование введения многократной дозы крысамPharmacokinetic and pharmacodynamic studies of multiple dose administration to rats

Фармакокинетику и фармакодинамику после введения доз 11da 1 раз в неделю в течение 3 недель определяли путем измерения концентраций инсулина в плазме и уровней глюкозы в крови в течение периода 4 недель у диабетических крыс.The pharmacokinetics and pharmacodynamics after dosing with 11da once a week for 3 weeks were determined by measuring plasma insulin concentrations and blood glucose levels over a period of 4 weeks in diabetic rats.

8 крыс линии Sprague-Dawley использовали со средней массой тела 239 г. Диабет вызывали введением стрептозотоцина (STZ) и всех животных с уровнями глюкозы в крови, составляющими выше 350 мг/дл на день 0 (день инъекции испытуемого препарата), включали в исследование. 8 из 8 крыс, которых обрабатывали STZ, становились диабетическими, и им вводили подкожно 1 раз в неделю в течение 3 недель инъекции на день 0, 7 и 14 2 мл испытуемого препарата 11da в ацетатном буфере рН 5 на кг массы тела. При концентрации инсулина 4 мг/мл в испытуемом препарате во вводимой дозе концентрация составляла 8 мг инсулина на кг массы тела. Из расчета на животное и временную точку 200 мкл крови отбирали из хвостовой вены с получением приблизительно 100 мкл плазмы с Li-гепарином. Образцы из группы А собирали 3 дня до и вплоть до 28 дней после введения испытуемого препарата. Образцы плазмы замораживали и хранили при -80°С до анализа. Уровень глюкозы в крови из хвостовой вены измеряли посредством устройства AccuChek Comfort 3 раза до инъекции и вплоть до 30 дней после инъекции. Содержание инсулина в образцах плазмы измеряли, используя набор ELISA для анализа человеческого инсулина (DRG Instruments GmbH, Germany) согласно протоколу производителя. Контрольные пробы (калибратор 0) включали в калибровочную кривую, и вычитали из величин, полученных для образцов, и строили калибровочные кривые, используя полиномиальное уравнение 3-го порядка. До анализа образцы плазмы встряхивали и разбавляли в реакционных пробирках (1:5 и 1:10 с калибратором 0). Для анализа OD при 450 нм измеряли посредством считывающего устройства для титрационных микропланшетов (Tecan Ultra) без коррекции опорной длины волны. Уровень инсулина в плазме и уровень глюкозы в крови контролировали в течение 4-недельного периода, и результаты представлены на фиг.6.Eight Sprague-Dawley rats were used with an average body weight of 239 g. Diabetes was caused by the administration of streptozotocin (STZ) and all animals with blood glucose levels above 350 mg / dl on day 0 (test injection day) were included in the study. 8 out of 8 rats treated with STZ became diabetic and were injected subcutaneously once a week for 3 weeks with injections on day 0, 7 and 14 of 2 ml of the test preparation 11da in acetate buffer pH 5 per kg body weight. At an insulin concentration of 4 mg / ml in the test preparation at the administered dose, the concentration was 8 mg of insulin per kg of body weight. Based on the animal and the time point, 200 μl of blood was taken from the tail vein to obtain approximately 100 μl of plasma with Li-heparin. Samples from group A were collected 3 days before and up to 28 days after administration of the test drug. Plasma samples were frozen and stored at -80 ° C until analysis. The blood glucose level from the tail vein was measured with an AccuChek Comfort device 3 times before injection and up to 30 days after injection. The insulin content in plasma samples was measured using an ELISA kit for analysis of human insulin (DRG Instruments GmbH, Germany) according to the manufacturer's protocol. Control samples (calibrator 0) were included in the calibration curve, and subtracted from the values obtained for the samples, and calibration curves were constructed using a third-order polynomial equation. Prior to analysis, plasma samples were shaken and diluted in reaction tubes (1: 5 and 1:10 with calibrator 0). For analysis, OD at 450 nm was measured by a microtiter plate reader (Tecan Ultra) without correction of the reference wavelength. Plasma insulin and blood glucose were monitored over a 4-week period, and the results are presented in Fig.6.

Форма кривых указывает, что высвобожденный инсулин был биоактивным на основании неуклонного снижения уровня глюкозы в крови до величин приблизительно 100 мг/дл после 3-й инъекции, который оставался низким в течение приблизительно недели. В то же самое время максимальная концентрация инсулина повышалась постоянно, начиная от 200 пМ после первой дозы и 300 пМ после второй дозы до 400 пМ после третьей дозы и далее уменьшалась вновь в течение 2 недель до значений, составляющих ниже 100 пМ.The shape of the curves indicates that the released insulin was bioactive based on a steady decline in blood glucose to approximately 100 mg / dl after the 3rd injection, which remained low for approximately a week. At the same time, the maximum insulin concentration increased continuously, starting from 200 pM after the first dose and 300 pM after the second dose to 400 pM after the third dose and then decreased again within 2 weeks to values below 100 pM.

Пример 19Example 19

Фармакокинетическое исследование на крысахPharmacokinetic study in rats

Фармакокинетику 11dc определяли путем измерения концентраций инсулина в плазме в течение периода 13 дней у здоровых крыс.The pharmacokinetics of 11dc were determined by measuring plasma insulin concentrations over a period of 13 days in healthy rats.

8 крыс линии Вистар (масса тела приблизительно 230 г) получали одноразовую подкожную инъекцию 2 мл/кг испытуемого препарата 11dc в сукцинатном буфере рН 5 (10 мМ сукцинат/трис, 85 г/л трегалозы, 0,01% твин-20, pH 5,0), содержащем 3 мг инсулина (доза 12 мг/кг). Из расчета на животное и временную точку 200 мкл крови отбирали из хвостовой вены с получением приблизительно 100 мкл плазмы с Li-гепарином. Образцы собирали 4 дня до и 0,3 ч (4 животных), 1 ч (4 животных), 2 ч (4 животных), 4 ч (4 животных), 1 день, 2 дня, 3 дня, 6 дней, 8 дней, 10 дней и 13 дней после введения испытуемого препарата. Образцы плазмы замораживали и хранили при -80°С до анализа. Содержание инсулина в образцах плазмы измеряли, используя набор ELISA для сверхчувствительного анализа человеческого инсулина (DRG Instruments GmbH, Germany) согласно протоколу производителя. Контрольные пробы (калибратор 0) включали в калибровочную кривую и вычитали из величин, полученных для образцов, и калибровочные кривые строили, используя полиномиальное уравнение 3-го порядка. До анализа образцы плазмы встряхивали и разбавляли в реакционных пробирках (1:5 и 1:10 с калибратором 0). Для анализа OD при 450 нм измеряли посредством считывающего устройства для титрационных микропланшетов (Tecan Ultra) без коррекции опорной длины волны. Результаты содержания инсулина в плазме вплоть до дня 13 для всех животных представлены на фиг.7.8 Wistar rats (body weight approximately 230 g) received a single subcutaneous injection of 2 ml / kg of the 11dc test drug in succinate buffer pH 5 (10 mM succinate / Tris, 85 g / L trehalose, 0.01% tween-20, pH 5 , 0) containing 3 mg of insulin (dose of 12 mg / kg). Based on the animal and the time point, 200 μl of blood was taken from the tail vein to obtain approximately 100 μl of plasma with Li-heparin. Samples were collected 4 days before and 0.3 h (4 animals), 1 h (4 animals), 2 h (4 animals), 4 h (4 animals), 1 day, 2 days, 3 days, 6 days, 8 days , 10 days and 13 days after administration of the test drug. Plasma samples were frozen and stored at -80 ° C until analysis. The insulin content in plasma samples was measured using an ELISA kit for supersensitive analysis of human insulin (DRG Instruments GmbH, Germany) according to the manufacturer's protocol. Control samples (calibrator 0) were included in the calibration curve and subtracted from the values obtained for the samples, and calibration curves were constructed using a third-order polynomial equation. Prior to analysis, plasma samples were shaken and diluted in reaction tubes (1: 5 and 1:10 with calibrator 0). For analysis, OD at 450 nm was measured by a microtiter plate reader (Tecan Ultra) without correction of the reference wavelength. The results of plasma insulin up to day 13 for all animals are presented in Fig.7.

После одноразовой подкожной инъекции 12 мг/кг 11dc средний уровень инсулина в плазме поднимался до максимальной величины приблизительно 500 пМ на день 1. Как и предполагали, концентрация инсулина в плазме впоследствии снижалась постоянно в течение 2 недель. Отношение пика к минимальной величине на кривой инсулина в плазме в течение первой недели составляло приблизительно 1,4.After a single subcutaneous injection of 12 mg / kg 11dc, the average plasma insulin level rose to a maximum value of approximately 500 pM on day 1. As expected, the plasma insulin concentration subsequently decreased continuously for 2 weeks. The ratio of peak to minimum on the plasma insulin curve during the first week was approximately 1.4.

Пример 20Example 20

Реальное время высвобождения инсулина и деградация гидрогеля при рН 7,4Real time of insulin release and hydrogel degradation at pH 7.4

Инсулин-линкер-гидрогель 11a (730 мкл, содержащий 3,19 мг инсулина) в ацетатном буфере pH 5,0 (10 мМ, 130 мМ NaCl, 0,01% (масс./об.) твин-20) помещали в пробирку для приготовления образца, промывали 3× буфером для высвобождения pH 7,4 (60 мМ фосфат натрия, 3 мМ ЭДТА, 0,01% (масс./об.) твин-20) и доливали до объема 1,00 мл. Аликвоту суспензии (0,5 мл, 1,59 мг инсулина) загружали в хроматографическую колонку и помещали в инкубатор с контролируемой температурой (37°C). Буфер для высвобождения (pH 7,4) пропускали через колонку с насосом с постоянной скоростью потока 0,25 мл/ч (номинальная) и собирали снаружи инкубатора. При определенных временных точках раствор анализировали ОФ-ВЭЖХ (215 нм). Количество высвобожденного инсулина откладывали на графике против времени инкубации и программу обработки кривых использовали для оценки соответствующего полупериода высвобождения. Определяли полупериод высвобождения для временной точки 9,4 дня для высвобождения инсулина.The insulin-linker-hydrogel 11a (730 μl containing 3.19 mg of insulin) in acetate buffer pH 5.0 (10 mm, 130 mm NaCl, 0.01% (wt./about.) Tween-20) was placed in a test tube to prepare the sample, it was washed with 3 × buffer to release pH 7.4 (60 mM sodium phosphate, 3 mM EDTA, 0.01% (w / v) tween-20) and added to a volume of 1.00 ml. An aliquot of the suspension (0.5 ml, 1.59 mg of insulin) was loaded onto a chromatographic column and placed in a temperature-controlled incubator (37 ° C). The release buffer (pH 7.4) was passed through a column with a pump at a constant flow rate of 0.25 ml / h (nominal) and collected outside the incubator. At certain time points, the solution was analyzed by RP-HPLC (215 nm). The amount of insulin released was plotted against the incubation time and the curve processing program was used to evaluate the corresponding release half-life. The half-life of release was determined for a time point of 9.4 days for insulin release.

После 39 дней инкубации при 37°С суспензию гидрогеля переносили в пробирку для приготовления образца, остаточный гидрогель вымывали из колонки буфером для высвобождения рН 7,4, и объем образца доводили 1,00 мл. Две аликвоты (300 мкл каждая) переносили в стерилизованные пробирки для приготовления образца, объем доводили до 1,5 мл и инкубировали при 37°С. Образцы отбирали при временных интервалах и анализировали гель-фильтрационной хроматографией. УФ-сигналы, соответствующие высвобожденным водорастворимым продуктам деградации гидрогеля, содержащим один или более каркасных фрагментов (соответствующие реакционноспособным функциональным группам), интегрировали, и величины откладывали против времени инкубации, см. фиг.8.After 39 days of incubation at 37 ° C, the hydrogel suspension was transferred to a sample preparation tube, the residual hydrogel was washed from the column with pH 7.4 release buffer, and the sample volume was adjusted to 1.00 ml. Two aliquots (300 μl each) were transferred into sterilized tubes for sample preparation, the volume was adjusted to 1.5 ml and incubated at 37 ° C. Samples were taken at time intervals and analyzed by gel filtration chromatography. UV signals corresponding to the released water-soluble hydrogel degradation products containing one or more scaffold fragments (corresponding to reactive functional groups) were integrated and the values were plotted against the incubation time, see Fig. 8.

Пример 21Example 21

Способность пролекарства инсулин-линкер-гидрогель к введению посредством инъекцииThe ability of the prodrug of insulin-linker-hydrogel to be administered by injection

Пролекарство инсулин-линкер-гидрогель 11dc 5 мл (распределение шариков по размеру 32-75 мкм, 18 мг инсулина/мл) в буфере янтарная кислота/трис рН 5,0 (10 мМ, 40 г/л маннита; 10 г/л дигидрата трегалозы; 0,05% твин-20) использовали. Суспензию пролекарства инсулин-линкер-гидрогель набирали в 1-мл шприц (длина 57 мм) иглой 20 G. Иглу 20 G заменяли иглой 30 G и размещали в рабочую часть шприца (Aqua Computer GmbH&Co. KG), и измерение начинали со скорости поршня 172 мм/мин (равно 50 мкл/сек) (стенд для испытания усилия: Мультитест 1-d, программа записи данных: EvaluatEmperor Lite, версия 1,16-015, прибор для измерения усилия: BFG 200н (все Mecmesin Ltd., UK). Эксперименты с увеличивающимися скоростями поршня, представленными в таблице ниже, осуществляли с новым образцом пролекарства инсулин-линкер-гидрогель. Эксперименты с водой и этиленгликолем осуществляли соответственно. Для всех экспериментов была использована одинаковая игла 30 G. Усилие против скорости потока при использовании иглы 30 G представлено на фиг.9.Prodrug insulin-linker-hydrogel 11dc 5 ml (distribution of beads by size 32-75 μm, 18 mg insulin / ml) in succinic acid / Tris buffer pH 5.0 (10 mM, 40 g / l mannitol; 10 g / l dihydrate trehaloses; 0.05% tween-20) were used. A prodrug suspension of insulin-linker-hydrogel was collected in a 1 ml syringe (length 57 mm) with a 20 G needle. A 20 G needle was replaced with a 30 G needle and placed into the working part of the syringe (Aqua Computer GmbH & Co. KG), and the measurement was started at a piston speed of 172 mm / min (equal to 50 μl / sec) (stand for force testing: Multitest 1-d, data recording program: EvaluatEmperor Lite, version 1.16-015, force measuring device: BFG 200n (all Mecmesin Ltd., UK) Experiments with increasing piston velocities presented in the table below were carried out with a new insulin-linker-hydrogel prodrug sample. Ode and ethylene glycol were carried out respectively .. For all experiments, the same 30 G needle was used. The force against flow rate when using a 30 G needle is shown in Fig. 9.

Скорость потока (сек/мл)Flow rate (sec / ml) Скорость потока (мкл/сек)Flow rate (μl / s) Скорость поршня (мм/мин)Piston speed (mm / min) Усилие/Н (вода)Force / N (water) Усилие/Н 11dcForce / N 11dc Усилие/Н (этилен-гликоль)Force / N (ethylene glycol) 66 167167 573573 1313 3636 8383 88 125125 430430 1010 2929th 6262 1010 100one hundred 344344 77 2424 5151 15fifteen 6767 229229 4four 2222 3535 20twenty 50fifty 172172 33 1717 2727

Сокращения:Abbreviations:

AcOHAcOH уксусная кислотаacetic acid AcOEtAcOEt этилацетатethyl acetate AibAib 2-аминоизомасляная кислота2-aminoisobutyric acid BnBn бензилbenzyl BocBoc трет-бутилоксикарбонилtert-butyloxycarbonyl COMUCOMU (1-циано-2-этокси-2-оксоэтилиденаминоокси)диметиламиноморфолино-карбения гексафторфосфат(1-cyano-2-ethoxy-2-oxoethylideneaminooxy) dimethylaminomorpholino-carbenium hexafluorophosphate DBUDBU 1,3-диазабицикло[5.4.0]ундецен1,3-diazabicyclo [5.4.0] undecene DCCDCC N,N-дициклогексилкарбодиимидN, N-Dicyclohexylcarbodiimide DCMDCM дихлорметанdichloromethane DIEADIEA диизопропилэтиламинdiisopropylethylamine DMAPDMAP диметиламинопиридинdimethylaminopyridine DMFDMF N,N-диметилформамид (ДМФ)N, N-dimethylformamide (DMF) DmobDmob 2,4-диметоксибензил2,4-dimethoxybenzyl DMSODmso диметилсульфоксид (ДМСО)dimethyl sulfoxide (DMSO) EDCEdc 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide EDTAEDTA этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) EqEq стехиометрический эквивалент (экв.)stoichiometric equivalent (equiv.) ESI-MSESI-MS масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылениемelectrospray ionization mass spectrometry EtOHEtOH этанолethanol FmocFmoc 9-флуоренилметоксикарбонил9-fluorenylmethoxycarbonyl HATUHatu O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфатO- (7-azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate HFIPHfip гексафторизопропанолhexafluoroisopropanol HPLCHPLC высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)high performance liquid chromatography (HPLC) HOBtHobt N-гидроксибензотриазолN-hydroxybenzotriazole i-PrOHi-PrOH 2-пропанол2-propanol LCMSLCMS масс-спектрометрия, соединенная с жидкостной хроматографиейliquid chromatography mass spectrometry MaIMai 3-малеимидопропил3-maleimidopropyl Mal-PEG6-NHSMal-peg6-nhs N-(3-малеимидопропил)-21-амино-4,7,10,13,16,19-гексаоксагенэйкозановой кислоты NHS-сложный эфирN- (3-maleimidopropyl) -21-amino-4,7,10,13,16,19-hexaoxagenicheicosanoic acid NHS ester MeMe метилmethyl MeCNMecn ацетонитрилacetonitrile MeOHMeoh метанолmethanol MmtMmt 4-метокситритил4-methoxytrityl MSMs масс-спектр/масс-спектрометрия (МС)mass spectrum / mass spectrometry (MS) MTBEMTBE метил трет-бутиловый эфирmethyl tert-butyl ether MWMW молекулярная массаmolecular mass n.d.n.d. не определялиnot determined NHSNHS N-гидроксисукцинимидN-hydroxysuccinimide ODOD оптическая плотностьoptical density OBuObu бутилоксиbutyloxy OtBuOtbu трет-бутилоксиtert-butyloxy PEGPeg поли(этиленгликоль) (ПЭГ)poly (ethylene glycol) (PEG) PhthPhth фтал-phthal PyBOPPybop бензотриазол-1-илокситриспирролидинофосфония гексафторфосфатbenzotriazol-1-yloxytrispyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate RP-HPLCRP-HPLC высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой (ОФ-ВЭЖХ)reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) rpmrpm оборотов в минуту (об/мин)revolutions per minute (rpm) RTRT комнатная температура (кт)room temperature (ct) SECSec гель-фильтрацияgel filtration SuSu сукцинимидилsuccinimidyl TCPTCP 2-хлортритилхлоридная смола2-chlorotrityl chloride resin TESTes триэтилсиланtriethylsilane TFATFA трифторуксусная кислота (ТФУ)trifluoroacetic acid (TFU) THFThf тетрагидрофуран (ТГФ)tetrahydrofuran (THF) TMEDATMEDA N,N,N'N'-тетраметилэтилендиаминN, N, N'N'-tetramethylethylenediamine TmobTmob 2,4,6-триметоксибензил2,4,6-trimethoxybenzyl TrtTrt трифенилметил, тритилtriphenylmethyl, trityl UPLCUPLC сверхэффективная жидкостная хроматографияhigh performance liquid chromatography UVUV ультрафиолет (УФ)ultraviolet (UV) VISVis видимыйvisible

Claims (65)

1. Конъюгат инсулин-линкер D-L или его фармацевтически приемлемая соль, где
D представляет собой фрагмент инсулина и
-L представляет собой биологически неактивный линкерный фрагмент -L¹, представленный формулой (I)

где пунктирная линия указывает на место присоединения к одной из аминогрупп инсулина путем образования амидной связи;
X является C(R³R^3a) или N(R³);
R^1a, R^3a независимо выбирают из группы, состоящей из Н, NH(R^2b), N(R^2b)C(O)R⁴ и C_1-4алкила;
R¹, R², R^2a, R^2b, R³, R⁴ независимо выбирают из группы, состоящей из Н и C_1-4алкила;
где L¹ замещен одним элементом L²-Z при условии, что водород, отмеченный звездочкой в формуле (I), не заменен заместителем, и где
L² является простой химической связью или L² означает C_1-20алкильную цепь, которая необязательно прерывается одной или более группами, независимо выбранными из -О- и С(О)N(R^3aa); необязательно замещена одной или более группами, независимо выбранными из ОН и С(О)N(R^3aaR^3aaa); и где R^3aa, R^3aaa независимо выбраны из группы, состоящей из Н и C_1-4алкила; и
Z означает гидрогель, содержащий каркасный фрагмент, который имеет четвертичный атом углерода C(A-Hyp)₄, где каждая группа А независимо выбрана из формулы (СН₂)_n1(ОСН₂СН₂)_nX₁-, где n1 равно 1 или 2; n является целым числом в диапазоне от 5 до 50 и X₁ является химической функциональной группой, ковалентно связывающей А и Hyp, где каждый фрагмент Hyp содержит от 5 до 32 лизинов.1. The conjugate insulin-linker DL or its pharmaceutically acceptable salt, where
D is a fragment of insulin and
-L is a biologically inactive linker moiety -L ¹ represented by formula (I)

where the dashed line indicates the place of attachment to one of the amino groups of insulin by the formation of an amide bond;
X is C (R ³ R ^3a ) or N (R ³ );
R ^1a , R ^{3a are} independently selected from the group consisting of H, NH (R ^2b ), N (R ^2b ) C (O) R ^4, and C _1-4 alkyl;
R ¹ , R ² , R ^2a , R ^2b , R ³ , R ^{4 are} independently selected from the group consisting of H and C _1-4 alkyl;
where L ^{1 is} substituted by one element of L ² -Z, provided that the hydrogen indicated by an asterisk in formula (I) is not replaced by a substituent, and where
L ² is a simple chemical bond or L ² is a C _1-20 alkyl chain that is optionally interrupted by one or more groups independently selected from —O— and C (O) N (R ^3aa ); optionally substituted with one or more groups independently selected from OH and C (O) N (R ^3aa R ^3aaa ); and where R ^3aa , R ^{3aaa are} independently selected from the group consisting of H and C _1-4 alkyl; and
Z means a hydrogel containing a framework fragment that has a Quaternary carbon atom C (A-Hyp) ₄ , where each group A is independently selected from the formula (CH ₂ ) _n1 (OCH ₂ CH ₂ ) _n X ₁ -, where n1 is 1 or 2; n is an integer ranging from 5 to 50 and X ₁ is a chemical functional group covalently linking A and Hyp, where each Hyp fragment contains from 5 to 32 lysines. 2. Конъюгат инсулин-линкер по п. 1, где в формуле (I) группа R² заменена L²-Z.2. The insulin-linker conjugate according to claim 1, wherein in formula (I) the group R ^{2 is} replaced by L ² -Z. 3. Конъюгат инсулин-линкер по п. 1, где в формуле (I) группа R¹ заменена L²-Z.3. The insulin-linker conjugate according to claim 1, wherein in formula (I) the group R ^{1 is} replaced by L ² -Z. 4. Конъюгат инсулин-линкер по любому из пп. 1-3, где в формуле (I) группа X является N(R³).4. The conjugate insulin-linker according to any one of paragraphs. 1-3, where in the formula (I) group X is N (R ³ ). 5. Конъюгат инсулин-линкер по любому из пп. 1-3, где в формуле (I) группа X является C(R³R^3a) и R^3a является N(R^2b)С(О)R⁴.5. The conjugate insulin-linker according to any one of paragraphs. 1-3, where in formula (I) the group X is C (R ³ R ^3a ) and R ^3a is N (R ^2b ) C (O) R ⁴ . 6. Конъюгат инсулин-линкер по п. 1, где X является C(R³R^3a) и группа R^3a заменена L²-Z.6. The insulin linker conjugate according to claim 1, wherein X is C (R ³ R ^3a ) and the group R ^{3a is} replaced by L ² -Z. 7. Конъюгат инсулин-линкер по п. 1, где X является C(R³R^3a), R^3a является N(R^2b)-L²-Z.7. The insulin linker conjugate of claim 1, wherein X is C (R ³ R ^3a ), R ^3a is N (R ^2b ) -L ² -Z. 8. Конъюгат инсулин-линкер по п. 1, где фрагмент инсулина присоединен к L¹ через азот N^αA1.8. The insulin-linker conjugate of claim 1, wherein the insulin fragment is attached to L ¹ via nitrogen N ^αA1 . 9. Конъюгат инсулин-линкер по п. 1, где инсулин является рекомбинантным человеческим инсулином.9. The insulin-linker conjugate of claim 1, wherein the insulin is recombinant human insulin. 10. Конъюгат инсулин-линкер по п. 9, где рекомбинантный человеческий инсулин присоединен к L¹ через азот боковой цепи лизина фрагмента инсулина.10. The insulin-linker conjugate of claim 9, wherein the recombinant human insulin is attached to L ¹ via a side chain nitrogen of the lysine of the insulin fragment. 11. Конъюгат инсулин-линкер по п. 1, где гидрогель состоит из каркасных фрагментов, взаимосвязанных гидролитически разрушаемыми связями.11. The insulin-linker conjugate according to claim 1, wherein the hydrogel consists of frame fragments interconnected by hydrolytically destructible bonds. 12. Конъюгат инсулин-линкер по п. 11, где каркасные фрагменты имеют молекулярную массу в диапазоне от 1 кДа до 20 кДа.12. The insulin-linker conjugate according to claim 11, wherein the frame fragments have a molecular weight in the range of 1 kDa to 20 kDa. 13. Конъюгат инсулин-линкер по п. 11, где каркасные фрагменты связаны вместе через фрагменты сшивающего реагента, каждый фрагмент сшивающего реагента оканчивается по меньшей мере двумя из гидролитически разрушаемых связей.13. The insulin-linker conjugate of claim 11, wherein the fragments are linked together through crosslinker reagent fragments, each crosslinker reagent moiety ends with at least two of the hydrolytically degradable bonds. 14. Конъюгат инсулин-линкер по п. 13, где фрагменты сшивающего реагента имеют молекулярную массу в диапазоне от 0,5 кДа до 5 кДа.14. The insulin-linker conjugate of claim 13, wherein the crosslinker reagent fragments have a molecular weight in the range of 0.5 kDa to 5 kDa. 15. Конъюгат инсулин-линкер по п. 11, где группа L² связана с каркасным фрагментом.15. The insulin-linker conjugate of claim 11, wherein the L ² group is linked to a framework fragment. 16. Конъюгат инсулин-линкер по п. 1, где группа L² присоединена к Z через концевую группу, имеющую следующую структуру

где пунктирные линии указывают на место присоединения к L² и Z соответственно.16. The insulin-linker conjugate according to claim 1, wherein the L ² group is attached to Z through an end group having the following structure

where the dashed lines indicate the point of attachment to L ² and Z, respectively. 17. Конъюгат инсулин-линкер по п. 1 формулы (IIa)

где N^ε-инсулин относится к инсулину, соединенному через боковую цепь одного остатка лизина.17. The insulin-linker conjugate according to claim 1 of the formula (IIa)

where N ^ε -insulin refers to insulin connected through the side chain of one lysine residue. 18. Конъюгат инсулин-линкер по п. 1 или 2 формулы (IIb)

18. The insulin linker conjugate according to claim 1 or 2 of the formula (IIb)

19. Конъюгат инсулин-линкер по п. 17, где гидрогелем является биоразрушаемый нерастворимый в воде гидрогель, основанный на поли(этиленгликоле) (ПЭГ).19. The insulin-linker conjugate of claim 17, wherein the hydrogel is a biodegradable, water-insoluble hydrogel based on poly (ethylene glycol) (PEG). 20. Конъюгат инсулин-линкер по п. 17, где гидрогель состоит из каркасных фрагментов, взаимосвязанных гидролитически разрушаемыми связями.20. The insulin-linker conjugate according to claim 17, wherein the hydrogel consists of frame fragments interconnected by hydrolytically destructible bonds. 21. Конъюгат инсулин-линкер по п. 11 или 20, где каркасные фрагменты содержат ветвящуюся сердцевину следующей формулы:

где пунктирная линия указывает на место присоединения к остальной части каркасного фрагмента.21. The insulin-linker conjugate according to claim 11 or 20, where the frame fragments contain a branching core of the following formula:

where the dashed line indicates the point of attachment to the rest of the frame fragment. 22. Конъюгат инсулин-линкер по п. 11 или 20, где каркасные фрагменты включают структуру следующей формулы:

где n является целым числом от 5 до 50 и пунктирная линия указывает на место присоединения к остальной части молекулы.22. The insulin-linker conjugate according to claim 11 or 20, where the frame fragments include the structure of the following formula:

where n is an integer from 5 to 50 and the dashed line indicates the point of attachment to the rest of the molecule. 23. Конъюгат инсулин-линкер по п. 11 или 20, где каркасный фрагмент включает гиперразветвленный фрагмент Hyp.23. The insulin-linker conjugate of claim 11 or 20, wherein the scaffold fragment includes a hyperbranched Hyp fragment. 24. Конъюгат инсулин-линкер по п. 23, где каркасный фрагмент включает гиперразветвленный фрагмент Hyp следующей формулы:

где пунктирные линии указывают на место присоединения к остальной части молекулы и атомы углерода, отмеченные звездочками, указывают на S-конфигурацию.24. The insulin-linker conjugate of claim 23, wherein the scaffold fragment includes a hyperbranched Hyp fragment of the following formula:

where the dashed lines indicate the point of attachment to the rest of the molecule and the carbon atoms marked with asterisks indicate the S-configuration. 25. Конъюгат инсулин-линкер по п. 20, где каркасные фрагменты присоединены по меньшей мере к одному спейсеру следующей формулы:

где одна из пунктирных линий указывает на место присоединения к гиперразветвленному фрагменту Hyp и вторая пунктирная линия указывает на место присоединения к остальной части молекулы и где m является целым числом от 2 до 4.25. The insulin-linker conjugate of claim 20, wherein the fragments are attached to at least one spacer of the following formula:

where one of the dashed lines indicates the point of attachment to the hyperbranched Hyp fragment and the second dashed line indicates the point of attachment to the rest of the molecule and where m is an integer from 2 to 4. 26. Конъюгат инсулин-линкер по п. 20, где каркасные фрагменты присоединены по меньшей мере к одному спейсеру следующей формулы:

где пунктирная линия, отмеченная звездочкой, указывает на связь между гидрогелем и N тиосукцинимидной группы по п. 16, где другая пунктирная линия указывает на присоединение к Hyp и где p является целым числом от 0 до 10.26. The insulin-linker conjugate according to claim 20, wherein the fragments are attached to at least one spacer of the following formula:

where the dashed line marked with an asterisk indicates the relationship between the hydrogel and the N thiosuccinimide group according to claim 16, where the other dashed line indicates attachment to Hyp and where p is an integer from 0 to 10. 27. Конъюгат инсулин-линкер по п. 13, где каркасные фрагменты связаны вместе посредством фрагментов сшивающего реагента, включающих следующую структуру:

где q является целым числом от 3 до 100.27. The insulin-linker conjugate according to claim 13, wherein the fragments are linked together by crosslinking reagent fragments comprising the following structure:

where q is an integer from 3 to 100. 28. Конъюгат инсулин-линкер по п. 1 в виде микрочастиц.28. The insulin-linker conjugate according to claim 1 in the form of microparticles. 29. Конъюгат инсулин-линкер по п. 28, где микрочастицы имеют диаметр между 20 и 100 мкм.29. The insulin-linker conjugate of claim 28, wherein the microparticles have a diameter of between 20 and 100 microns. 30. Конъюгат инсулин-линкер по п. 28, где микрочастицы могут быть введены путем инъекции через иглу менее чем 0,6 мм внутреннего диаметра.30. The insulin-linker conjugate of claim 28, wherein the microparticles can be administered by injection through a needle of less than 0.6 mm of the inner diameter. 31. Конъюгат инсулин-линкер по п. 28, где микрочастицы могут быть введены путем инъекции через иглу менее чем 0,3 мм внутреннего диаметра.31. The insulin-linker conjugate of claim 28, wherein the microparticles can be introduced by injection through a needle of less than 0.3 mm of the inner diameter. 32. Конъюгат инсулин-линкер по п. 28, где микрочастицы могут быть введены путем инъекции через иглу менее чем 0,2 мм внутреннего диаметра.32. The insulin-linker conjugate of claim 28, wherein the microparticles can be administered by injection through a needle of less than 0.2 mm of inner diameter. 33. Конъюгат инсулин-линкер формулы (IIIa)

где N^ε-инсулин относится к инсулину, соединенному через боковую цепь одного остатка лизина.33. The insulin-linker conjugate of the formula (IIIa)

where N ^ε -insulin refers to insulin connected through the side chain of one lysine residue. 34. Конъюгат инсулин-линкер формулы (IIIb)

34. The insulin linker conjugate of the formula (IIIb)

35. Фармацевтическая композиция, предназначенная для применения в способе лечения или предотвращения заболеваний или нарушений, которые можно лечить инсулином, содержащая конъюгат инсулин-линкер по любому из пп. 1-32 или его фармацевтически приемлемую соль вместе с фармацевтически приемлемым наполнителем.35. A pharmaceutical composition for use in a method for treating or preventing diseases or disorders that can be treated with insulin, comprising the insulin-linker conjugate according to any one of claims. 1-32 or a pharmaceutically acceptable salt thereof, together with a pharmaceutically acceptable excipient. 36. Фармацевтическая композиция по п. 35, где фармацевтическая композиция является сухой.36. The pharmaceutical composition of claim 35, wherein the pharmaceutical composition is dry. 37. Фармацевтическая композиция по п. 36, где фармацевтическая композиция высушена посредством лиофилизации.37. The pharmaceutical composition of claim 36, wherein the pharmaceutical composition is dried by lyophilization. 38. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 35-37, где конъюгат инсулин-линкер содержится в композиции в достаточной степени, чтобы доставить терапевтически эффективное количество инсулина по меньшей мере в течение трех дней в один прием.38. The pharmaceutical composition according to any one of paragraphs. 35-37, where the insulin-linker conjugate is contained in the composition sufficiently to deliver a therapeutically effective amount of insulin for at least three days in one go. 39. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 35-37, где она является однодозовой композицией.39. The pharmaceutical composition according to any one of paragraphs. 35-37, where it is a single dose composition. 40. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 35-37, где она является композицией, состоящей из множества доз.40. The pharmaceutical composition according to any one of paragraphs. 35-37, where it is a composition consisting of many doses. 41. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 35-37, содержащая одно или более дополнительных биологически активных средств, или их свободную форму, в виде конъюгатов инсулин-линкер, особенно в виде гидрогелевых конъюгатов инсулин-линкер, и где одно или более дополнительных биологически активных средств выбирают из группы, состоящей из сульфонилмочевин, таких как, например, хлорпропамид, толазамид, толбутамид, глибурид, глипизид, глимепирид и тому подобное; меглитинидов, таких как, например, репаглинид; глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1) и его миметиков, глюкозоинсулинотропного пептида (GIP) и его миметиков, эксендина и его миметиков и ингибиторов протеазы дипептидилпептидазы (DPPIV); бигуанидов, таких как, например, метформин; тиазолидиндионов, таких как, например, розиглитазон, пиоглитазон, троглитазон, изаглитазон (известный как МСС-555), 2-[2-[(2R)-4-гексил-3,4-дигидро-3-оксо-2Н-1,4-бензоксазин-2-ил]этокси]бензолуксусная кислота и тому подобное; GW2570 и тому подобное; модуляторов рецептора ретиноида-X (RXR), таких как, например, таргретин, 9-цис-ретиноевая кислота и тому подобное; других инсулин-сенсибилизирующих средств, таких как, например, INS-1, ингибиторы РТР-1B, ингибиторы GSK3, ингибиторы гликогенфосфорилазы, ингибиторы фруктозо-1,6-бисфосфатазы и тому подобное; инсулинов, включающих инсулины регулярного или короткого действия, промежуточного действия и длительного действия инсулины, ингалируемый инсулин и аналоги инсулина, такие как молекулы инсулина с минорными различиями в природной последовательности аминокислот; малой молекулы, имитирующей инсулин, включающей, но не ограниченной ими, L-783281, ТЕ-17411 и тому подобное; ингибиторов котранспортера Na-глюкозы, таких как Т-1095, Т-1095А, флоризин и тому подобное; агонистов амилина, которые включают, но не ограничиваются ими, прамлинтид и тому подобное; антагонистов глюкагона, таких как AY-279955, и тому подобное; антидиабетических средств, таких как орлистат, ингибитор панкреатической липазы; сибутрамина; норэпинефрина и дофамина; гормона роста, IGF-1, фактора, высвобождающего гормон роста; оксинтомодулина и модуляторов грелина; подавляющих аппетит средств, таких как бензфетамин, фенметразин, фентермин, диэтилпропион, мазиндол, сибутрамин, фенилпропаноламин или эфедрин; подавляющих аппетит средств, таких как квипазин, флуоксетин, сертралин, фенфлурамин или дексфенфлурамин; подавляющих аппетит средств, таких как апоморфин; подавляющих аппетит средств, таких как миметики гистамина, модуляторы рецепторов H3; усиливающих расход энергии средств, таких как агонисты бета-3 аденергических рецепторов и стимуляторы функции разобщающего белка; лептина и миметиков лептина (например, метрелептин); антагонистов нейропептида Y; модуляторов рецепторов меланокортина-1, 3 и 4; агонистов холецистокинина; миметиков глюкагоноподобного пептида-1 и аналогов, подобных, например, эксендину; андрогенов, таких как дегидроэпиандростерон и производные, такие как этиохоландион; тестостерона, анаболических стероидов, таких как оксандролон и стероидные гормоны; антагонистов рецептора галанина; цитокиновых средств, таких как цилиарный нейротрофический фактор; ингибиторов амилазы.41. The pharmaceutical composition according to any one of paragraphs. 35-37, containing one or more additional biologically active agents, or their free form, in the form of insulin-linker conjugates, especially in the form of insulin-linker hydrogel conjugates, and where one or more additional biologically active agents is selected from the group consisting of sulfonylureas such as, for example, chlorpropamide, tolazamide, tolbutamide, glyburide, glipizide, glimepiride and the like; meglitinides, such as, for example, repaglinide; glucagon-like peptide-1 (GLP-1) and its mimetics, glucose insulinotropic peptide (GIP) and its mimetics, exendin and its mimetics and dipeptidyl peptidase protease inhibitors (DPPIV); biguanides, such as, for example, metformin; thiazolidinediones, such as, for example, rosiglitazone, pioglitazone, troglitazone, isaglitazone (known as MCC-555), 2- [2 - [(2R) -4-hexyl-3,4-dihydro-3-oxo-2H-1, 4-benzoxazin-2-yl] ethoxy] benzeneacetic acid and the like; GW2570 and the like; retinoid-X receptor modulators (RXR), such as, for example, tarretin, 9-cis-retinoic acid and the like; other insulin sensitizing agents, such as, for example, INS-1, PTP-1B inhibitors, GSK3 inhibitors, glycogen phosphorylase inhibitors, fructose-1,6-bisphosphatase inhibitors and the like; insulins, including regular or short acting insulins, intermediate and long acting insulins, inhaled insulin and insulin analogs, such as insulin molecules with minor differences in the natural amino acid sequence; a small molecule that mimics insulin, including, but not limited to, L-783281, TE-17411 and the like; Na-glucose cotransporter inhibitors such as T-1095, T-1095A, phlorizin and the like; amylin agonists, which include, but are not limited to, pramlintide and the like; glucagon antagonists, such as AY-279955, and the like; antidiabetic agents such as orlistat, a pancreatic lipase inhibitor; sibutramine; norepinephrine and dopamine; growth hormone, IGF-1, a growth hormone releasing factor; oxyntomodulin and ghrelin modulators; appetite suppressants such as benzfetamine, phenmetrazine, phentermine, diethylpropion, mazindole, sibutramine, phenylpropanolamine or ephedrine; appetite suppressants such as quipazine, fluoxetine, sertraline, fenfluramine or dexfenfluramine; appetite suppressants such as apomorphine; appetite suppressants, such as histamine mimetics, H3 receptor modulators; energy-enhancing agents such as beta-3 adenergic receptor agonists and stimulators of uncoupling protein function; leptin and leptin mimetics (e.g. metreleptin); neuropeptide Y antagonists; melanocortin-1, 3, and 4 receptor modulators; cholecystokinin agonists; glucagon-like peptide-1 mimetics and analogs, such as, for example, exendin; androgens such as dehydroepiandrosterone and derivatives such as etiocholandion; testosterone, anabolic steroids such as oxandrolone and steroid hormones; galanin receptor antagonists; cytokine agents such as ciliary neurotrophic factor; amylase inhibitors. 42. Контейнер, содержащий фармацевтическую композицию по пп. 35-41, предназначенный для применения в способе лечения или предотвращения заболеваний или нарушений, которые можно лечить инсулином.42. A container containing the pharmaceutical composition according to paragraphs. 35-41, intended for use in a method for treating or preventing diseases or disorders that can be treated with insulin. 43. Контейнер по п. 42, где контейнер представляет собой двухкамерный шприц.43. The container according to claim 42, where the container is a two-chamber syringe. 44. Суспензия, предназначенная для применения в способе лечения или предотвращения заболеваний или нарушений, которые можно лечить инсулином, содержащая фармацевтическую композицию по пп. 35 и 38-41.44. A suspension intended for use in a method for the treatment or prevention of diseases or disorders that can be treated with insulin, containing the pharmaceutical composition according to claims. 35 and 38-41. 45. Способ приготовления суспензии по п. 44, включающий стадии восстановлений сухой фармацевтической композиции по п. 36 или 37 путем добавления восстанавливающего раствора.45. A method of preparing a suspension according to claim 44, comprising the steps of reconstituting a dry pharmaceutical composition according to claim 36 or 37 by adding a reducing solution. 46. Набор, предназначенный для применения в способе лечения или предотвращения заболеваний или нарушений, которые можно лечить инсулином, включающий иглу и контейнер, содержащий восстанавливающий раствор и сухую композицию по п. 36 или 37 для использования с иглой.46. A kit intended for use in a method of treating or preventing diseases or disorders that can be treated with insulin, comprising a needle and a container containing a reconstituting solution and a dry composition according to claim 36 or 37 for use with a needle. 47. Набор по п. 46, где контейнер представляет собой двухкамерный шприц и где одна из двух камер двухкамерного шприца содержит сухую фармацевтическую композицию и вторая камера указанного двухкамерного шприца содержит восстанавливающий раствор.47. The kit of claim 46, wherein the container is a two-chamber syringe and where one of the two chambers of the two-chamber syringe contains a dry pharmaceutical composition and the second chamber of the specified two-chamber syringe contains a reconstituting solution. 48. Конъюгат инсулин-линкер по п. 1, предназначенный для применения в способе лечения или предотвращения заболеваний или нарушений, которые можно лечить инсулином.48. The insulin-linker conjugate according to claim 1, intended for use in a method for treating or preventing diseases or disorders that can be treated with insulin. 49. Реагент инсулин-линкер D-L^*, предназначенный для получения конъюгата по п. 1, где
D представляет собой фрагмент инсулина и
L^* является биологически неактивным линкерным реагентом, представленным формулой (IV)

где пунктирная линия указывает на место присоединения к одной из аминогрупп инсулина путем образования амидной связи;
X означает C(R³R^3a) или N(R³);
R^1a, R^3a независимо выбирают из группы, состоящей из Н, NH(R^2b), N(R^2b)C(O)R⁴ и C_1-4алкила;
R¹, R², R^2a, R^2b, R³, R⁴ независимо выбирают из группы, состоящей из Н и C_1-4алкила;
где реагент L^* замещен одной группой L^2* и необязательно дополнительно замещен при условии, что водород, отмеченный звездочкой в формуле (IV), не заменен заместителем, и где
L^2* является спейсером, соединенным с L^* и содержащим химическую функциональную группу, предназначенную для конъюгирования с реакционноспособным биоразрушаемым гидрогелем.49. The reagent insulin-linker DL ^* , designed to obtain the conjugate according to claim 1, where
D is a fragment of insulin and
L ^* is a biologically inactive linker reagent represented by the formula (IV)

where the dashed line indicates the place of attachment to one of the amino groups of insulin by the formation of an amide bond;
X is C (R ³ R ^3a ) or N (R ³ );
R ^1a , R ^{3a are} independently selected from the group consisting of H, NH (R ^2b ), N (R ^2b ) C (O) R ^4, and C _1-4 alkyl;
R ¹ , R ² , R ^2a , R ^2b , R ³ , R ^{4 are} independently selected from the group consisting of H and C _1-4 alkyl;
where the reagent L ^{* is} substituted by one group L ^{2 *} and optionally further substituted, provided that the hydrogen indicated by an asterisk in formula (IV) is not replaced by a substituent, and where
L ^{2 *} is a spacer connected to L ^* and containing a chemical functional group for conjugation with a reactive biodegradable hydrogel. 50. Реагент инсулин-линкер по п. 49, где в формуле (IV) R² заменен L^2*.50. The insulin linker reagent according to claim 49, wherein, in the formula (IV), R ^{2 is} replaced by L ^{2 *} . 51. Реагент инсулин-линкер по п. 50, где в формуле (IV) R¹ заменен L^2*.51. The insulin linker reagent according to claim 50, wherein in formula (IV) R ^{1 is} replaced by L ^{2 *} . 52. Реагент инсулин-линкер по любому из пп. 49-51, где в формуле (IV) X является N(R³).52. The reagent insulin-linker according to any one of paragraphs. 49-51, where in the formula (IV) X is N (R ³ ). 53. Реагент инсулин-линкер по любому из пп. 49-51, где в формуле (IV) X является C(R³R^3a) и R^3a является N(R^2b)С(О)R⁴.53. The reagent insulin-linker according to any one of paragraphs. 49-51, where in the formula (IV) X is C (R ³ R ^3a ) and R ^3a is N (R ^2b ) C (O) R ⁴ . 54. Реагент инсулин-линкер по п. 49, где X является C(R³R^3a) и R^3a заменен L^2*.54. The insulin linker reagent according to claim 49, wherein X is C (R ³ R ^3a ) and R ^{3a is} replaced by L ^{2 *} . 55. Реагент инсулин-линкер по п. 49, где X является C(R³R^3a), R^3a является N(R^2b)-L^2*.55. The insulin linker reagent according to claim 49, wherein X is C (R ³ R ^3a ), R ^3a is N (R ^2b ) -L ^{2 *} . 56. Реагент инсулин-линкер по любому из пп. 49-51, где L^* дополнительно не замещен.56. The reagent insulin-linker according to any one of paragraphs. 49-51, where L ^{* is} not further substituted. 57. Реагент инсулин-линкер по любому из пп. 49-51, где L^2* содержит тиоловую группу.57. The reagent insulin-linker according to any one of paragraphs. 49-51, where L ^{2 *} contains a thiol group. 58. Реагент инсулин-линкер по любому из пп. 49-51, где L^2* содержит малеимидную группу.58. The reagent insulin-linker according to any one of paragraphs. 49-51, where L ^{2 *} contains a maleimide group. 59. Способ получения конъюгата инсулин-линкер по любому из пп. 1-32 и 48, включающий стадии:
(a) контактирования водной суспензии, содержащей функционализированные малеимидом микрочастицы гидрогеля, с раствором, содержащим реагент инсулин-линкер по п. 57, при температурах между комнатной температурой и 4°C в буферном водном растворе при pH 2-5, приводящего к образованию конъюгата инсулин-линкер-гидрогель;
(b) необязательно, обработки конъюгата инсулин-линкер-гидрогель со стадии (а) тиолсодержащим соединением молекулярной массой от 34 Да до 500 Да при температурах между комнатной температурой и 4°C в буферном водном растворе при pH 2-5.59. The method of obtaining the conjugate insulin-linker according to any one of paragraphs. 1-32 and 48, including the stages:
(a) contacting an aqueous suspension containing maleimide functionalized hydrogel microparticles with a solution containing the insulin-linker reagent according to claim 57, at temperatures between room temperature and 4 ° C in a buffer aqueous solution at pH 2-5, leading to the formation of an insulin conjugate -linker hydrogel;
(b) optionally treating the insulin-linker-hydrogel conjugate from step (a) with a thiol-containing compound with a molecular weight of from 34 Da to 500 Da at temperatures between room temperature and 4 ° C in an aqueous buffer at a pH of 2-5. 60. Способ получения конъюгата инсулин-линкер по любому из пп. 1-32 и 48, включающий стадии:
(a) контактирования водной суспензии, содержащей функционализированные тиолом микрочастицы гидрогеля, с раствором, содержащим реагент инсулин-линкер по п. 58, при температурах между комнатной температурой и 4°C в буферном водном растворе при pH 2-5, что приводит к образованию конъюгата инсулин-линкер-гидрогель;
(b) необязательно, обработки конъюгата инсулин-линкер-гидрогель со стадии (а) малеимидсодержащим соединением молекулярной массой от 100 до 300 Да при температурах между комнатной температурой и 4°C в буферном водном растворе при pH 2-5.60. The method of obtaining the conjugate insulin-linker according to any one of paragraphs. 1-32 and 48, including the stages:
(a) contacting an aqueous suspension containing thiol functionalized hydrogel microparticles with a solution containing an insulin-linker reagent according to claim 58, at temperatures between room temperature and 4 ° C in a buffer aqueous solution at pH 2-5, which leads to the formation of a conjugate insulin-linker-hydrogel;
(b) optionally, treating the insulin-linker-hydrogel conjugate from step (a) with a maleimide-containing compound with a molecular weight of from 100 to 300 Da at temperatures between room temperature and 4 ° C in a buffer aqueous solution at a pH of 2-5. 61. Способ приготовления инъецируемого иглой конъюгата инсулин-линкер, включающий стадии:
(a) получения конъюгата инсулин-линкер по п. 28 в виде микрочастиц;
(b) просеивания микрочастиц;
(c) отбора фракции с диаметром шариков конъюгата инсулин-линкер между 25 и 80 мкм;
(d) суспендирования фракции шариков со стадии (с) в водном буферном растворе, подходящем для инъецирования.61. A method of preparing a needle-injected insulin-linker conjugate, comprising the steps of:
(a) obtaining an insulin-linker conjugate according to claim 28 in the form of microparticles;
(b) screening the microparticles;
(c) selecting a fraction with an insulin-linker conjugate bead diameter between 25 and 80 microns;
(d) suspending the bead fraction from step (c) in an aqueous buffer solution suitable for injection. 62. Инъецируемый иглой конъюгат инсулин-линкер, приготовленный способом по п. 61.62. The needle-injected insulin-linker conjugate prepared by the method of claim 61. 63. Конъюгат инсулин-линкер по п. 62, инъецируемый посредством иглы с внутренним диаметром менее чем 300 мкм.63. The insulin-linker conjugate according to claim 62, injected with a needle with an inner diameter of less than 300 microns. 64. Конъюгат инсулин-линкер по п. 62, инъецируемый посредством иглы с внутренним диаметром менее чем 225 мкм.64. The insulin-linker conjugate according to claim 62, injected with a needle with an inner diameter of less than 225 microns. 65. Конъюгат инсулин-линкер по п. 62, инъецируемый посредством иглы с внутренним диаметром менее чем 175 мкм. 65. The insulin-linker conjugate according to claim 62, injected with a needle with an inner diameter of less than 175 microns.

Images