RU2562869C1 - INTEGRATIVE pQ-SRUS GENETIC STRUCTURE FOR OBTAINING Yarrowia lipolytica YEAST STRAINS HAVING ABILITY FOR HOMOLOGICAL RECOMBINATION OF GENOME OF MITOCHONDRIA DUE TO EXPRESSION OF RecA PROTEIN GENE OF BACTERIAL ORIGIN - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnologies.

SUBSTANCE: invention relates to a genetic structure intended to be introduced to Yarrowia lipolytica chromosome of RecA gene from Bacillus subtilis. The proposed structure is characterised by SEQ ID NO 1 sequence. Addressing of RecA recombinant protein in a mitochondrion occurs due to leader sequences of mRNA of SOD2 gene, which have affinity for the outer surface of mitochondria and provide for co-translational transport of RecA inside mitochondria.

EFFECT: invention allows obtaining recombinant producers carrying transgenes in a mitochondrial genome and is intended to create a genetic modification system of the mitochondrial genome in vivo for the purpose of curing of genetic mitochondrial human diseases.

2 dwg

Description

Область техники, к которой относится изобретение:The technical field to which the invention relates:

Изобретение относится к области биоинженерии, в частности к конструированию эукариотических организмов с уникальной способностью осуществлять рекомбинацию ДНК в митохондриях. Предметом изобретения является генетическая конструкция pQ-SRUS с экспрессируемым геном RecA из Bacillus subtilis. При введении конструкции pQ-SRUS в штаммы Yarrowia lipolytica они становятся пригодными для конструирования рекомбинантных продуцентов целевых белков, накапливающих продукт в митохондриях. Это решение может быть особенно эффективным для тех белков, которые из-за неоптимальной структуры N-конца содержат дегроны, запускающие деградацию белка в протеосомах. Кроме того, в перспективе изобретение может быть использовано для получения препаратов интактного митохондриального генома человека путем введения в митохондрии дрожжей и последующей коррекции путем рекомбинации с искусственно вводимыми ДНК.The invention relates to the field of bioengineering, in particular to the construction of eukaryotic organisms with a unique ability to recombine DNA in mitochondria. The subject of the invention is the genetic construct of pQ-SRUS with the expressed RecA gene from Bacillus subtilis. When the pQ-SRUS construct is introduced into Yarrowia lipolytica strains, they become suitable for the construction of recombinant producers of target proteins that accumulate the product in mitochondria. This solution can be especially effective for those proteins that, due to the non-optimal structure of the N-terminus, contain degrons that trigger protein degradation in the proteosomes. In addition, in the future, the invention can be used to obtain preparations of the intact human mitochondrial genome by introducing yeast into the mitochondria and subsequent correction by recombination with artificially introduced DNA.

Уровень техники:The prior art:

В настоящее время ни для одного известного биологического вида не описан ферментативный механизм рекомбинации митохондриального генома [1, 2]. Имеются опубликованные данные популяционно-генетических исследований по статистическому анализу последовательностей митохондрий, позволяющие предполагать существование в природе явления рекомбинации генома митохондрий [3, 4, 5]. Однако имеющиеся источники не дают точных данных о механизмах и скорости гомологичной рекомбинации в митохондриях [6]. Известны отдельные белки, предположительно участвующие в этом процессе, например, Mgm101 [7]. Однако до настоящего времени не создано ни одной генетической системы, позволяющей направленно изменять митохондриальный геном какого-либо организма, вводя туда необходимые замены или дополнительные фрагменты [8]. Приведенные данные позволяют утверждать, что в митохондриях отсутствует наиболее распространенный фермент, ответственный за гомологичную рекомбинацию, типа RecA, встречающийся у всех известных прокариот и имеющий аналоги у эукариот. Очищенная до гомогенного состояния рекомбиназа RecA способна осуществлять все химические реакции, необходимые для гомологичной рекомбинации ДНК in vitro [9]. Дополнительные белки могут стимулировать ее активность, но не являются абсолютно необходимыми для протекания реакции. Поэтому было выдвинуто предположение, что введение бактериального белка RecA в митохондрии эукариот, например, дрожжей Yarrowia lipolytica, позволит осуществлять гомологичную рекомбинацию с участием эндогенного генома митохондрий. Решение этой задачи позволяет вводить в геном митохондрий дрожжей Y.lipolytica любые желаемые гены с использованием традиционных технологий на основе гомологичных «плеч» - фрагментов ДНК, идентичных участкам эндогенного генома: схемы с участием одного «плеча», находящегося в составе кольцевой ДНК или линейных фрагментов, фланкированных двумя «плечами». Поскольку гены, имеющиеся в митохондриальном геноме Y.lipolytica, входят в состав одного из двух оперонов, транскрибируемых с двух дивергентно расположенных промоторов, введение дополнительных генов в промежутки между эндогенными генами способно обеспечить устойчивую экспрессию трансгенов на уровне, характерном для собственного генома митохондрий, без использования дополнительных промоторов.At present, no enzymatic recombination mechanism of the mitochondrial genome has been described for any known biological species [1, 2]. There are published data from population genetic studies on the statistical analysis of mitochondrial sequences, suggesting the existence in nature of the phenomenon of recombination of the mitochondrial genome [3, 4, 5]. However, available sources do not provide accurate data on the mechanisms and rate of homologous recombination in mitochondria [6]. Separate proteins are known to be involved in this process, for example, Mgm101 [7]. However, to date, not a single genetic system has been created that allows directionally changing the mitochondrial genome of any organism, introducing the necessary replacements or additional fragments there [8]. These data suggest that in mitochondria the most common enzyme responsible for homologous recombination, such as RecA, is absent in all known prokaryotes and has analogues in eukaryotes. RecA recombinase purified to a homogeneous state is able to carry out all chemical reactions necessary for homologous DNA recombination in vitro [9]. Additional proteins can stimulate its activity, but are not absolutely necessary for the course of the reaction. Therefore, it was suggested that the introduction of the bacterial RecA protein into eukaryotic mitochondria, for example, Yarrowia lipolytica, will allow homologous recombination involving the endogenous mitochondrial genome. The solution to this problem allows introducing any desired genes into the mitochondria of the Y.lipolytica yeast using traditional technologies based on homologous “arms” - DNA fragments identical to parts of the endogenous genome: a scheme involving one “arm” that is part of circular DNA or linear fragments flanked by two “shoulders”. Since the genes present in the mitochondrial genome of Y.lipolytica are part of one of two operons transcribed from two divergent promoters, the introduction of additional genes between the endogenous genes can ensure stable expression of transgenes at a level characteristic of the mitochondrial genome without using additional promoters.

В литературе есть примеры генетических конструкций, используемых для введения бактериальных генов RecA и других бактериальных белков, участвующих в гомологичной рекомбинации, в митохондрии эукариот. В статье Paul R. с соавт. [10] описано введение гена белка RecA из Escherichia coli в культивируемые клетки человека. При этом с целью адресации белка RecA в митохондрии на его N-конец был искусственно введен пептид MTS. В работе [11] аналогичный подход был использован для введения в митохондрии Arabidopsis thaliana белка SSB из Е.coli, связывающего однонитевую ДНК и повышающего эффективность работы RecA. При этом на N-конец белка SSB присоединяли митохондриальный адресный пептид A.thaliana длиной 28 а.о., а на С-конец - зеленый флуоресцентный белок GFP. Продукт наблюдали в митохондриях клеток A.thaliana, подвергнутых транзиторному введению ДНК-конструкции с помощью бомбардировки металлическими микрочастицами. В работе [12] описано введение гена RecA из Mycobacterium tuberculosis в клетки пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Для обеспечения транспортировки его продукта в митохондрии использовался адресный пептид MTS от субъединицы цитохром С оксидазы CoxIVp. Скорость транспорта белка RecA в митохондрии исследовалась с помощью «белкового интрона» - последовательности белка интеина, введенного центр последовательности RecA.There are examples in the literature of the genetic constructs used to introduce the bacterial RecA genes and other bacterial proteins involved in homologous recombination into mitochondria of eukaryotes. In an article by Paul R. et al. [10] describes the introduction of a RecA protein gene from Escherichia coli into cultured human cells. At the same time, in order to address the RecA protein in the mitochondria, the MTS peptide was artificially introduced at its N-terminus. In [11], a similar approach was used to introduce SSB protein from E. coli into Arabidopsis thaliana mitochondria, binding single-stranded DNA and increasing the efficiency of RecA. At the same time, the mitochondrial address peptide of A. thaliana 28 A.O. was attached to the N-terminus of the SSB protein, and the green fluorescent GFP protein was attached to the C-terminus. The product was observed in the mitochondria of A.thaliana cells subjected to transient introduction of a DNA construct using metal microparticle bombardment. [12] described the introduction of the RecA gene from Mycobacterium tuberculosis into the cells of baker's yeast Saccharomyces cerevisiae. To ensure the transport of its product to mitochondria, the targeted MTS peptide from the subunit of cytochrome C oxidase CoxIVp was used. The rate of transport of the RecA protein in the mitochondria was studied using the “protein intron,” the intein protein sequence introduced by the center of the RecA sequence.

Описанные примеры доказывают возможность введения белка RecA в митохондрии эукариот и его стабильность в этой среде. Однако они не позволяют оценивать эффективность рекомбинации митохондриального генома с участием искусственно введенного белка RecA. В опубликованных источниках нет сведений о проведении подобных экспериментов с клетками дрожжей Y.lipolytica, которые являются перспективным объектом биотехнологии: хорошо культивируются в аэробных условиях, имеют разработанную систему для проведения генно-инженерных манипуляций. Кроме того, ни в одной из приведенных работ не упоминается использование альтернативного принципа адресации белка RecA в митохондрии с использованием специфических некодирующих последовательностей мРНК, имеющих сродство к внешней мембране митохондрий и обеспечивающих контрансляционный транспорт продукта внутрь органеллы. Этот принцип описан в работе [13] применительно к адресации белка АТР6 (компонент дыхательного комплекса V) с использованием некодирующих областей 5′-UTR и 3′-UTP гена митохондриальной железомарганцевой супероксиддисмутазы SOD2. Однако работа [13] выполнена с использованием линии клеток человека HeLa, и на клетках дрожжей, в том числе, Y.lipolytica не воспроизводилась.The described examples prove the possibility of introducing the RecA protein into eukaryotic mitochondria and its stability in this medium. However, they do not allow evaluating the efficiency of recombination of the mitochondrial genome with the participation of artificially introduced RecA protein. In published sources there is no information about conducting similar experiments with Y.lipolytica yeast cells, which are a promising object of biotechnology: they are well cultivated under aerobic conditions, and they have developed a system for carrying out genetic engineering manipulations. In addition, none of the cited works mentions the use of an alternative principle for addressing RecA protein in mitochondria using specific non-coding mRNA sequences that have affinity for the outer mitochondrial membrane and provide translational transport of the product inside the organelle. This principle was described in [13] with respect to addressing the ATP6 protein (component of the respiratory complex V) using the non-coding regions of the 5′-UTR and 3′-UTP of the mitochondrial ferromanganese superoxide dismutase gene SOD2 gene. However, the work [13] was performed using the human cell line HeLa, and was not reproduced on yeast cells, including Y.lipolytica.

Характеризуя наиболее близкие аналоги изобретения, касающиеся разработки систем экспрессии генов в Y.lipolytica, целесообразно указать на действующие в РФ патенты Юзбашевой и соавт. №2451749 [14] и Выборной и соавт. №2451075 [15]. В этих патентах описано получение на основе Y.lipolytica продуцентов липазы и генетической конструкции для экспозиции белка на поверхности клеточной стенки дрожжей. В этих заявках не упоминаются ни митохондрии (какие-либо митохондриальные белки), ни способы адресации белков в митохондрии, ни белок RecA. Таким образом, можно утверждать, что изобретение не затрагивает каких-либо принципов, описываемых в цитируемых патентах.Describing the closest analogues of the invention regarding the development of gene expression systems in Y.lipolytica, it is advisable to indicate the patents in force in the Russian Federation by Yuzbasheva et al. No. 2451749 [14] and Elective et al. No. 2451075 [15]. These patents describe the preparation of Y. lipolytica-based lipase producers and a genetic construct for exposing a protein to the surface of a yeast cell wall. Neither mitochondria (any mitochondrial proteins), nor methods for addressing proteins to mitochondria, nor RecA proteins are mentioned in these applications. Thus, it can be argued that the invention does not affect any of the principles described in the cited patents.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

В отличие от всех описанных аналогов в рамках изобретения для создания конструкции pQ-SRUS (SEQ ID NO 1, фиг. 1), предназначенной для введения гена, используется последовательность промотора, терминатора транскрипции, 5′-UTR и 3′-UTR гена SOD2 (железно-марганцевая митохондриальная супероксиддисмутаза - NCBI GenBank Locus tag RP1-56L9.2) штамма CLIB122 Y.lipolytica. Целевым геном, вводимым в клетки Y.lipolytica с помощью конструкции pQ-SRUS, является ген рекомбиназы RecA из Bacillus subtilis, штамм 168 (NCBI GenBank Locus tag CP003329.1).In contrast to all the analogs described, in the framework of the invention, the sequence of the promoter, transcription terminator, 5′-UTR and 3′-UTR of the SOD2 gene is used to create the pQ-SRUS construct (SEQ ID NO 1, Fig. 1) intended for introducing the gene ( iron-manganese mitochondrial superoxide dismutase - NCBI GenBank Locus tag RP1-56L9.2) strain CLIB122 Y.lipolytica. The target gene introduced into Y.lipolytica cells using the pQ-SRUS construct is the RecA recombinase gene from Bacillus subtilis, strain 168 (NCBI GenBank Locus tag CP003329.1).

Введение ДНК конструкции pQ-SRUS в клетки Y.lipolytica PO1f проводится методом трансформации с использованием солей Li⁺ и отбором трансформантов на минимальной синтетической среде, свободной от урацила. Для проведения трансформации ДНК конструкции pQ-SRUS препаративно выделяют из клеток Е.coli TG1 и линеаризуют с помощью рестриктазы BglI. Полученные штаммы-трансформанты тестируют на наличие способности к гомологичной рекомбинации с участием митохондриального генома.The DNA of the pQ-SRUS construct was introduced into Y.lipolytica PO1f cells by transformation using Li ⁺ salts and selection of transformants on a minimal synthetic medium free of uracil. To carry out DNA transformation, pQ-SRUS constructs were preparatively isolated from E. coli TG1 cells and linearized with BglI restriction enzyme. The resulting transformant strains are tested for the ability to homologous recombination with the mitochondrial genome.

Для проверки функциональности гена RecA, вводимого в клетки Y.lipolytica PO1f с помощью конструкции pQ-SRUS, используется тестерная конструкция pQ-NIHN, содержащая правое и левое плечи для гомологичной рекомбинации с геном ND1 митохондриального генома Y.lipolytica, ген зеленого флуоресцентного белка EYFP с областью инициации трансляции гена митохондриального ND1, ген устойчивости к гигромицину hph с областью инициации трансляции гена митохондриального ND1. Поддержание конструкции pQ-NIHN в Е.coli осуществляется за счет элементов из состава стандартного вектора pQE30 (Qiagen): репликона плазмиды рМС16 и гена β-лактамазы (детерминанта устойчивости к ампициллину) при условии поддержания соответсвующего рекомбинантного штамма Е.coli на среде, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл.To test the functionality of the RecA gene introduced into Y.lipolytica PO1f cells using the pQ-SRUS construct, the pQ-NIHN test construct containing the right and left shoulders for homologous recombination with the ND1 gene of the mitochondrial Y.lipolytica genome, the EYFP green fluorescent protein gene with mitochondrial ND1 gene translation initiation region, hph hygromycin resistance gene with mitochondrial ND1 gene translation initiation region. The construction of pQ-NIHN in E. coli is supported by elements from the standard vector pQE30 (Qiagen): replicon of plasmid pMS16 and the β-lactamase gene (determinant of resistance to ampicillin), provided that the corresponding recombinant E. coli strain is maintained on medium containing ampicillin at a concentration of 100 μg / ml.

Введение ДНК конструкции pQ-NIHN в клетки Y.lipolytica PO1f, несущие интегрированную конструкцию pQ-SRUS, проводится методом трансформации с использованием солей Li⁺ и отбором трансформантов на среде, содержащей 200 мкг/мл гигромицина (G458). Для проведения трансформации ДНК конструкции pQ-NIHN препаративно выделяют из клеток Ε.coli TGI и линеаризуют с помощью рестриктазы BglI. Полученные штаммы-трансформанты тестируют на наличие зеленой флуоресценции митохондрий, обусловленной накоплением в них белка EYFP. Выявление зеленой флуоресценции митохондрий проводится в живой культуре с помощью флуоресцентного микроскопа при длине волны возбуждающего света 450 нм. Для достоверности наблюдений с точки зрения интенсивности фоновой флуоресценции необходимо использовать контрольный родительский штамм Y.lipolytica PO1f, несущий интегрированную конструкцию pQ-SRUS, но не подвергавшийся трансформации тестерной конструкцией pQ-NIHN.The introduction of pQ-NIHN DNA into Y.lipolytica PO1f cells carrying the integrated pQ-SRUS construct was performed by transformation using Li ⁺ salts and selection of transformants on a medium containing 200 μg / ml hygromycin (G458). To carry out DNA transformation, pQ-NIHN constructs were preparatively isolated from Ε.coli TGI cells and linearized with BglI restriction enzyme. The obtained transforming strains are tested for the presence of green mitochondrial fluorescence due to the accumulation of EYFP protein in them. The detection of green fluorescence of mitochondria is carried out in a living culture using a fluorescence microscope at a wavelength of exciting light of 450 nm. For reliability of observations in terms of background fluorescence intensity, it is necessary to use the control parent strain Y.lipolytica PO1f, which carries the integrated pQ-SRUS construct, but which has not undergone transformation with the pQ-NIHN test construct.

Краткое описание графических изображенийShort description of graphic images

Фиг. 1. Схема функциональных элементов конструкции pQ-SRUS (SEQ ID NO 1), предназначенной для введения в клетки Y.lipolytica белка RecA с последующей адресацией белка в митохондрии за счет последовательностей 5′-UTR и 3′-UTR гена SOD2. Конструкция содержит левое (включая промотор) и правое (включая терминатор) плечи гена SOD2, ген RecA из В.subtilis 168, маркер компенсации ауксотрофности по урацилу URA3. Поддержание конструкции в Е.coli осуществляется за счет элементов из состава стандартного вектора pQE30 (Qiagen): репликона плазмиды рМС16 и гена β-лактамазы (детерминанта устойчивости к ампициллину).FIG. 1. Scheme of functional elements of the pQ-SRUS construct (SEQ ID NO 1), intended for introducing RecA protein into Y.lipolytica cells, followed by addressing the protein to mitochondria using the 5′-UTR and 3′-UTR of the SOD2 gene. The construct contains the left (including the promoter) and right (including the terminator) shoulders of the SOD2 gene, the RecA gene from B.subtilis 168, and the uracil URA3 compensation marker for auxotrophy. Maintenance of the construct in E. coli is carried out due to elements from the composition of the standard vector pQE30 (Qiagen): replicon of plasmid pMS16 and the β-lactamase gene (determinant of resistance to ampicillin).

Фиг. 2. Схема функциональных элементов конструкции pQ-NIHN (SEQ ID NO 2), предназначенной для тестирования эффективности работы искусственно введенного в митохондрии Y.lipolytica белка RecA.FIG. 2. Scheme of functional elements of the pQ-NIHN construct (SEQ ID NO 2), designed to test the performance of the RecA protein artificially introduced into the Y. lipolytica mitochondria.

Конструкция содержит правое и левое плечи для гомологичной рекомбинации с геном ND1 митохондриального генома, ген зеленого флуоресцентного белка EYFP с областью инициации трансляции гена митохондриального ND1, ген устойчивости к гигромицину hph с областью инициации трансляции гена митохондриального ND1. Поддержание конструкции в Е.coli осуществляется за счет элементов из состава стандартного вектора pQE30 (Qiagen): репликона плазмиды рМС16 и гена β-лактамазы (детерминанта устойчивости к ампициллину).The construct contains the right and left shoulders for homologous recombination with the mitochondrial genome ND1 gene, the EYFP green fluorescent protein gene with the mitochondrial ND1 gene translation initiation region, the hph hygromycin resistance gene with the mitochondrial ND1 gene translation initiation region. Maintenance of the construct in E. coli is carried out due to elements from the composition of the standard vector pQE30 (Qiagen): replicon of plasmid pMS16 and the β-lactamase gene (determinant of resistance to ampicillin).

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

1) Фрагмент, кодирующий 5′UTR SOD, амплифицируют с помощью ПЦР на матрице геномной ДНК Y.lipolytica CLIB122 с праймерами SOD2-1 и SOD2-2: размер продукта 840 п.н. Продукт очищают и подвергают рестрикции по сайтам EcoRI и BamHI. Проводят клонирование в вектор pQE-EYFP, линеаризованный по сайтам EcoRI и BamHI. Проводят трансформацию Е.coli TG1, отбирают колонии белого цвета.1) The fragment encoding 5′UTR SOD is amplified by PCR on a genomic DNA matrix of Y.lipolytica CLIB122 with primers SOD2-1 and SOD2-2: product size 840 bp The product is purified and subjected to restriction at EcoRI and BamHI sites. Cloning into the pQE-EYFP vector linearized at EcoRI and BamHI sites is carried out. Transformation of E. coli TG1 is carried out, white colonies are selected.

2) 3′UTR SOD амплифицируют с помощью ПЦР на матрице геномной ДНК Y.lipolytica CLIB122 с праймерами SOD2-3 и SOD2-4: размер продукта 600 п.н. Продукт очищают и подвергают рестрикции по SacI и SalI. Проводят клонирование в конструкцию, полученную на стадии 1 (pQE-SODL-EYFP), линеаризованную по сайтам SacI и SalI.2) 3′UTR SOD is amplified by PCR on a genomic DNA matrix of Y.lipolytica CLIB122 with primers SOD2-3 and SOD2-4: product size 600 bp The product is purified and subjected to restriction by SacI and SalI. Cloning is carried out into the construct obtained in step 1 (pQE-SODL-EYFP) linearized at the SacI and SalI sites.

3) Маркерный ген URA3 экстрагируют из конструкции pUC18-URA3 по сайтам Ncol и SalI и переносят в конструкцию, полученную на стадии 2 (pQE-SOD_L-EYFP-SOD_r), линеаризованную по сайтам Ncol и SalI.3) The URA3 marker gene is extracted from the pUC18-URA3 construct at the Ncol and SalI sites and transferred to the construct obtained in step 2 (pQE-SOD _L -EYFP-SOD _r ), linearized at the Ncol and SalI sites.

4) Ген RecA амплифицируют с помощью ПЦР на матрице геномной ДНК В.subtilis 168 с праймерами RecA1 и RecA2: размер продукта 1050 п.н. Проводят очистку продукта ПЦР и обработку рестриктазами BamHI nSacI. Проводят лигирование очищенного продукта рестрикции с ДНК конструкции pQE-SOD_L-EYFP-SOD_r-URA3, обработанной рестриктазами BamHI nSacI. Проводят трансформацию штамма Е.coli TGI по стандартной методике, высевают транформантов на среду LB с ампициллином в концентрации 100 мкг/мл, культивируют в течение 12-16 ч при 37°С, отбирают колонии, содержащие вставку с целевым фрагментом.4) The RecA gene is amplified by PCR on a genome of B. subtilis 168 genomic DNA with RecA1 and RecA2 primers: product size 1050 bp Purification of the PCR product and treatment with BamHI nSacI restriction enzymes is carried out. The purified restriction product is ligated with DNA of the pQE-SOD _L -EYFP-SOD _r -URA3 construct treated with BamHI nSacI restrictase. The E. coli TGI strain is transformed according to standard methods, transformants are seeded on LB medium with ampicillin at a concentration of 100 μg / ml, cultured for 12-16 hours at 37 ° C, colonies containing the insert with the target fragment are selected.

5) При проведении генноинженерного конструирования используют олигонуклеотидные ДНК-праймеры следующей структуры:5) When carrying out genetic engineering, oligonucleotide DNA primers of the following structure are used:

Праймер SOD2-1 (EcoRI/SpeI) GGGAAttctgactagtgcgaattttcPrimer SOD2-1 (EcoRI / SpeI) GG GAAttctgactagt gcgaattttc

Праймер SOD2-2 (BamHI) GG GGA TCc cat cea ctt aga ccg gag caPrimer SOD2-2 (BamHI) GG GGA TCc cat cea ctt aga ccg gag ca

Праймер SOD2-3 (SacI) GGGAGCTCtaagcccttccgagattaccaSOD2-3 Primer (SacI) GG GAGCTC taagcccttccgagattacca

Праймер SOD2-4 (SalI) acggtcgactgtatcatggagactcgPrimer SOD2-4 (SalI) acg gtcgac tgtatcatggagactcg

Праймер RecA1 (BamHI) GGGGATCCatgagtgatc gteaggeagePrimer RecA1 (BamHI) GG GGATCC atgagtgatc gteaggeage

Праймер RecA2 (SacI) GGGAGCTCAGCCTTTTGTATCATTTGAAPrimer RecA2 (SacI) GG GAGCTC AGCCTTTTGTATCATTTGAA

Список использованных источниковList of sources used

1. Aanen D.K., Spelbrink J.N., Beekman M. What cost mitochondria? The maintenance of functional mitochondrial DNA within and across generations. Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci. - 2014. - V. 369(1646): 20130438.1. Aanen D.K., Spelbrink J.N., Beekman M. What cost mitochondria? The maintenance of functional mitochondrial DNA within and across generations. Philos Trans R Soc Lond In Biol Sci. - 2014 .-- V. 369 (1646): 20130438.

2. Chattopadhyay K., Aldous C. A brief review on human mtDNA mutations and NRTI-associated mtDNA toxicity and mutations. Mitochondrial DNA.-2014. Sept. 11: 1-3. doi:10.3109/19401736.2014.958728.2. Chattopadhyay K., Aldous C. A brief review on human mtDNA mutations and NRTI-associated mtDNA toxicity and mutations. Mitochondrial DNA. 2014. Sept. 11: 1-3. doi: 10.3109 / 19401736.2014.958728.

3. Zbawicka M., Wenne R., Burzyński A. Mitogenomics of recombinant mitochondrial genomes of Baltic Sea Mytilus mussels. Mol Genet Genomics. - 2014. DOI 10.1007/s00438-014-0888-3.3. Zbawicka M., Wenne R., Burzyński A. Mitogenomics of recombinant mitochondrial genomes of Baltic Sea Mytilus mussels. Mol Genet Genomics. - 2014. DOI 10.1007 / s00438-014-0888-3.

4. Gerhold J.M., Sedman T., Visacka K., Slezakova J., Tomaska L., Nosek J., Sedman J. Replication intermediates of the linear mitochondrial DNA of Candida parapsilosis suggest a common recombination based mechanism for yeast mitochondria. J Biol Chem. - 2014. - V. 289. №33. - P. 22659-70.4. Gerhold J.M., Sedman T., Visacka K., Slezakova J., Tomaska L., Nosek J., Sedman J. Replication intermediates of the linear mitochondrial DNA of Candida parapsilosis suggest a common recombination based mechanism for yeast mitochondria. J Biol Chem. - 2014. - V. 289. No. 33. - P. 22659-70.

5. Salavirta H., Oksanen I., Kuuskeri J., Mäkelä M., Laine Ρ., Paulin L., Lundell T. Mitochondrial genome of Phlebia radiata is the second largest (156 kbp) among fungi and features signs of genome flexibility and recent recombination events. PLoS One. - 2014. - V. 9. - №5. - e97141.5. Salavirta H., Oksanen I., Kuuskeri J., Mäkelä M., Laine Ρ., Paulin L., Lundell T. Mitochondrial genome of Phlebia radiata is the second largest (156 kbp) among fungi and features signs of genome flexibility and recent recombination events. Plos one. - 2014. - V. 9. - No. 5. - e97141.

6. Fritsch E.S., Chabbert C.D., Klaus B., Steinmetz L.M. A Genome-wide map of mitochondrial DNA recombination in yeast. Genetics. - 2014. - V. 198. - №2. - P. 755-71.6. Fritsch E.S., Chabbert C.D., Klaus B., Steinmetz L.M. A Genome-wide map of mitochondrial DNA recombination in yeast. Genetics - 2014. - V. 198. - No. 2. - P. 755-71.

7. Wang X., Mbantenkhu M., Wierzbicki S., Chen X.J. Preparation of the Mgm101 recombination protein by MBP-based tagging strategy. J Vis Exp. - 2013. - №76. - e50448.7. Wang X., Mbantenkhu M., Wierzbicki S., Chen X.J. Preparation of the Mgm101 recombination protein by MBP-based tagging strategy. J Vis Exp. - 2013. - No. 76. - e50448.

8. Rai J., Pemmasani J.K., Voronovsky A., Jensen I.S., Manavalan A., Nyengaard J.R., Golas M.M., Sander B. Strep-tag II and twin-Strep based cassettes for protein tagging by homologous recombination and characterization of endogenous macromolecular assemblies in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biotechnol. - 2014. - V. 56. - №11. P. 992-1003.8. Rai J., Pemmasani JK, Voronovsky A., Jensen IS, Manavalan A., Nyengaard JR, Golas MM, Sander B. Strep-tag II and twin-Strep based cassettes for protein tagging by homologous recombination and characterization of endogenous macromolecular assemblies in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biotechnol. - 2014. - V. 56. - No. 11. P. 992-1003.

9. Liu J., Sneeden J., Heyer W.D. In vitro assays for DNA pairing and recombination-associated DNA synthesis. Methods Mol Biol. - 2011. V. 745. - P. 363-383.9. Liu J., Sneeden J., Heyer W. D. In vitro assays for DNA pairing and recombination-associated DNA synthesis. Methods Mol Biol. - 2011.V. 745. - P. 363-383.

10. Paul R., Dalibart R., Lemoine S., Lestienne P. Expression of E.coli RecA targeted to mitochondria of human cells. Mutat Res. - 2001. V. 486. - №1. - P. 11-9.10. Paul R., Dalibart R., Lemoine S., Lestienne P. Expression of E. coli RecA targeted to mitochondria of human cells. Mutat res. - 2001. V. 486. - No. 1. - P. 11-9.

11. Edmondson A.C., Song D., Alvarez L.A., Wall M.K., Almond D., McClellan D.A., Maxwell A., Nielsen B.L. Characterization of a mitochondrially targeted single-stranded DNA-binding protein in Arabidopsis thaliana. Mol Genet Genomics. - 2005. - V. 273. - №2. - P. 115-122.11. Edmondson A.C., Song D., Alvarez L.A., Wall M.K., Almond D., McClellan D.A., Maxwell A., Nielsen B.L. Characterization of a mitochondrially targeted single-stranded DNA-binding protein in Arabidopsis thaliana. Mol Genet Genomics. - 2005. - V. 273. - No. 2. - P. 115-122.

12. Williams L.R., Ellis S.R., Hopper A.K., Davis E.O., Martin N.C. Splicing before import - an intein in a mitochondrially targeted preprotein folds and is catalytically active in the cytoplasm in vivo. FEBS Lett. - 2000. - V.476. - №3. - P. 301-305.12. Williams L.R., Ellis S.R., Hopper A.K., Davis E.O., Martin N.C. Splicing before import - an intein in a mitochondrially targeted preprotein folds and is catalytically active in the cytoplasm in vivo. FEBS Lett. - 2000. - V.476. - Number 3. - P. 301-305.

13. Kaltimbacher V., Bonnet С., Lecoeuvre G., Forster V., Sahel J.A., Corral-Debrinski M. mRNA localization to the mitochondrial surface allows the efficient translocation inside the organelle of a nuclear recoded ATP6 protein. RNA. - 2006. - V. 12. - №7. - P. 1408-17.13. Kaltimbacher V., Bonnet S., Lecoeuvre G., Forster V., Sahel J.A., Corral-Debrinski M. mRNA localization to the mitochondrial surface allows the efficient translocation inside the organelle of a nuclear recoded ATP6 protein. RNA - 2006. - V. 12. - No. 7. - P. 1408-17.

14. Юзбашева Ε.Ю., Юзбашев Т.В., Лаптев И.Α., Ларина А.С., Синеокий С.П. Генетическая конструкция для экспозиции белка на поверхности клеточной стенки дрожжей Yarrowia lipolytica. Патент РФ на изобретение №2451749.14. Yuzbasheva Ε.Yu., Yuzbashev T.V., Laptev I.Α., Larina A.S., Sineokiy S.P. Genetic construct for exposure of protein to the surface of the cell wall of Yarrowia lipolytica yeast. RF patent for invention No. 2451749.

15. Выборная Т.В., Юзбашев Т.В., Соболевская Т.И., Лаптев И.Α., Юзбашева Е.Ю., Синеокий С.П. Рекомбинантный штамм дрожжей Yarrowia lipolytica - продуцент липазы. Патент РФ на изобретение №2451075.15. Elective T.V., Yuzbashev T.V., Sobolevskaya T.I., Laptev I.Α., Yuzbasheva E.Yu., Sineokiy S.P. The recombinant yeast strain Yarrowia lipolytica is a lipase producer. RF patent for invention No. 2451075.

Claims (1)

Интегративная генетическая конструкция pQ-SRUS, характеризующаяся нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO 1, предназначенная для введения в хромосому Yarrowia lipolytica гена RecA из Bacillus subtilis с его последующей транскрипцией под контролем промотора гена SOD2 и адресацией мРНК в митохондрии за счет последовательностей 5′-UTR и 3′-UTR гена SOD2 и обеспечивающая возможность интеграции в митохондриальный геном конструкций по принципу гомологичной рекомбинации. The pQ-SRUS integrative genetic construct, characterized by the nucleotide sequence of SEQ ID NO 1, designed to introduce the RecA gene from Bacillus subtilis into the Yarrowia lipolytica chromosome with its subsequent transcription under the control of the SOD2 gene promoter and mRNA addressing to mitochondria due to 5′-UTR and 3 sequences ′ -UTR of the SOD2 gene and providing the possibility of integration into the mitochondrial genome of constructs by the principle of homologous recombination.

Images