RU2558242C1

RU2558242C1 - Peptide having curative effect against alzheimer disease

Info

Publication number: RU2558242C1
Application number: RU2014126483/10A
Authority: RU
Inventors: Наталья Викторовна Бобкова; Татьяна Даниловна Волкова; Ольга Марковна Вольпина; Анна Владимировна Камынина; Дмитрий Отарович Короев; Александр Николаевич Самохин
Priority date: 2014-06-30
Filing date: 2014-06-30
Publication date: 2015-07-27

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: biologically active peptide is obtained, which has curative effect against Alzheimer disease, and consisting of the amino acid sequence Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala.

EFFECT: invention enables to use the resulting peptide to create a drug effective in the therapy of Alzheimer disease.

1 dwg, 2 ex

Description

Изобретение относится к области биохимии, конкретно к новому биологически активному соединению - пептиду, обладающему лечебным действием против болезни Альцгеймера, и может быть использовано для создания препарата для терапии болезни Альцгеймера.The invention relates to the field of biochemistry, specifically to a new biologically active compound - a peptide having a therapeutic effect against Alzheimer's disease, and can be used to create a drug for the treatment of Alzheimer's disease.

Болезнь Альцгейметра (БА) представляет собой тяжелое нейродегенеративное заболевание, приводящее к потере памяти, психическим расстройствам и неизбежной смерти. В настоящее время в медицинской практике применяют препараты для симптоматического лечения БА методами компенсаторной терапии. Использование этих препаратов позволяет в некоторой мере задержать процесс прогрессирования болезни, но не излечить ее.Alzheimer's disease (AD) is a severe neurodegenerative disease, leading to memory loss, mental disorders and inevitable death. Currently, in medical practice, drugs are used for the symptomatic treatment of asthma with methods of compensatory therapy. The use of these drugs can to some extent delay the process of disease progression, but not cure it.

Наиболее широко применяемым классом препаратов являются ингибиторы холинэстераз (ИХЭ). ИХЭ увеличивают время действия нейромедиатора ацетилхолина на постсинаптические рецепторы, что ведет к увеличению холинергической иннервации. Эффективность применения ИХЭ существенно снижается на поздних стадиях БА. ИХЭ характеризуются достаточно высокой токсичностью и рядом других побочных эффектов [Watkins, P. B. et all. J. Am. Med. Assoc. 1994. V. 271. P. 992-998]. Известен препарат другого класса для симптоматического лечения БА - модулятор глутаматэргической системы, мемантин [Raina P. at all // Ann. Intern. Med. 2008. V. 148 (5). P. 379-397]. Наилучшие результаты дает его применение у больных с мягкой и умеренной деменцией альцгеймеровского типа, вместе с тем, препарат не обеспечивает полного излечивания БА. Важным недостатком компенсаторной терапии является то, что разрабатываемые внутри данного направления методы не воздействуют на механизм развития БА. Поэтому интенсивные исследования ведутся по поиску лекарств для радикальной терапии БА, способные не только компенсировать симптоматические нарушения, но и излечивать заболевание.The most widely used class of drugs are cholinesterase inhibitors (ICE). ICE increases the duration of action of the neurotransmitter acetylcholine on postsynaptic receptors, which leads to an increase in cholinergic innervation. The effectiveness of the use of IChE is significantly reduced in the late stages of AD. ICE are characterized by rather high toxicity and a number of other side effects [Watkins, P. B. et all. J. Am. Med. Assoc. 1994. V. 271. P. 992-998]. A known drug of another class for the symptomatic treatment of AD is a modulator of the glutamatergic system, memantine [Raina P. at all // Ann. Intern. Med. 2008.V. 148 (5). P. 379-397]. The best results are obtained by its use in patients with mild to moderate dementia of the Alzheimer's type, however, the drug does not provide a complete cure for AD. An important disadvantage of compensatory therapy is that the methods developed within this area do not affect the mechanism of AD development. Therefore, intensive research is underway to find drugs for the radical treatment of AD that can not only compensate for symptomatic disorders, but also cure the disease.

Одна из современных гипотез предполагает, что пептиды β-амилоидного ряда, в частности βА-(1-42) в результате нарушения обменных процессов способны образовывать скопления в центральной нервной системе в виде амилоидных бляшек, что приводит к разрушению мозговой ткани [Hardy J., Selkoe D.J. The amyloid hypothesis of Alzheimer′s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 2002. V. 297 (5580). P. 353-356].One of the modern hypotheses suggests that peptides of the β-amyloid series, in particular βA- (1-42), as a result of metabolic disturbances, can form clusters in the central nervous system in the form of amyloid plaques, which leads to destruction of brain tissue [Hardy J., Selkoe dj The amyloid hypothesis of Alzheimer′s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 2002. V. 297 (5580). P. 353-356].

В последние годы активно разрабатывались иммунотерапевтические методы предотвращения развития БА, направленные на коррекцию содержания в организме βА. Инъекции препаратами на основе βА вызывают образование специфических антител, которые способствуют удалению βА из мозга [Shenk D., Barbour R., Dunn W. Immunization with amyloid-β attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse. // Nature. 1999. V. 400( 6740). P. 173-177]. Ведущими западными фирмами разработано несколько препаратов [www.affiris.com/press_releases/press_release_mimoVAX_dec_11_06.pdf; www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00411580], однако, ни один из них не прошел успешно клинические испытания. Исследования были приостановлены в связи с тем, что у 6% пациентов, которые получали инъекцию бета-амилоида, обнаружился асептический менингоэнцефалит [Shenk D. Amyloid-β immunotherapy for Alzheimer′s disease: the end of the beginning. // Nat. Rev. Neurosci. 2002. V. 3 (10). P. 824-828; Senior K. Dosing in Phasell trial of Alzheimer′s vaccine suspended. Lancet. Neurol. 2002. V. 1 (1). P. 3; Orgogozo J.M., Gilman S., Dartigues J.F., Laurent В., Puel M., Kirby L.C., Jouanny P., Dubois В., Eisner L., Flitman S., Michel B.F., Boada M., Frank A., Hock C. Subacute meningoencephalitis in a subset of patients with AD after Aβ_1-42immunization. Neurology. 2003. V. 61 (1). P. 46-54]. Данные результаты ставят под сомнение безопасность использования препаратов на основе βА в качестве иммунотерапевтических средств.In recent years, immunotherapeutic methods have been actively developed to prevent the development of AD, aimed at correcting the content of βA in the body. Injections with βA-based drugs cause the formation of specific antibodies that help remove βA from the brain [Shenk D., Barbour R., Dunn W. Immunization with amyloid-β attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse. // Nature. 1999. V. 400 (6740). P. 173-177]. Leading Western firms have developed several drugs [www.affiris.com/press_releases/press_release_mimoVAX_dec_11_06.pdf; www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00411580], however, none of them successfully passed clinical trials. Studies were suspended due to the fact that 6% of patients who received an injection of beta-amyloid had aseptic meningoencephalitis [Shenk D. Amyloid-β immunotherapy for Alzheimers disease: the end of the beginning. // Nat. Rev. Neurosci. 2002. V. 3 (10). P. 824-828; Senior K. Dosing in Phasell trial of Alzheimer′s vaccine suspended. Lancet. Neurol. 2002. V. 1 (1). P. 3; Orgogozo JM, Gilman S., Dartigues JF, Laurent B., Puel M., Kirby LC, Jouanny P., Dubois B., Eisner L., Flitman S., Michel BF, Boada M., Frank A., Hock C Subacute meningoencephalitis in a subset of patients with AD after Aβ _1-42 immunization. Neurology. 2003. V. 61 (1). P. 46-54]. These results cast doubt on the safety of using βA-based drugs as immunotherapeutic agents.

Принципиально новым подходом является использование фрагментов белка рецептора конечных продуктов гликозилирования (RAGE) для лечения БА. Рецептор RAGE характеризуется многофункциональностью, способен специфически связываться со многими лигандами, участвует в процессах роста клеток нервной системы, а при гиперэкспрессии в пожилом возрасте способствует развитию ряда патологий, таких как сахарный диабет, рост опухолей, болезнь Альцгеймера. Предполагают, что связывание рецептора RAGE с β-амилоидом способствует проникновению последнего через гематоэнцефалический барьер центральной нервной системы и накоплению в виде амилоидных бляшек - основной причины болезни Альцгеймера [Leclerc Е., Sturchler Е., Vetter S. The S100B/RAGE Axis in Alzheimer′s Disease. Cardiovasc. Psychiatry Neurol. 2010. V. 2010. P. 1-11]. Помимо RAGE, закрепленного в мембране и связывающегося с бета-амилоидом на поверхности нейронов мозга, в крови имеется также растворимая форма RAGE, состоящая из внеклеточной части белка. Растворимый RAGE, связывая бета-амилоид и препятствуя его проникновению в мозг, проявляет протективное действие и восстанавливает состояние пространственной памяти у экспериментальных животных. [Deane R., Du Yan S, Submamaryan RK, LaRue B, Jovanovic S, Hogg E, Welch D, Manness L, Lin C, Yu J, Zhu H, Ghiso J, Frangione B, Stern A, Schmidt AM, Armstrong DL, Arnold B, Liliensiek B, Nawroth P, Hofman F, Kindy M, Stern D, Zlokovic B. RAGE mediates amyloid-beta peptide transport across the blood-brain barrier and accumulation in brain. Nature medicine. 2003. V. 9. P. 907-913]. Эти данные служат теоретическим обоснованием нашей гипотезы о том, что введенный в организм фрагмент RAGE будет способен восстанавливать пространственную память животных с экспериментально индуцированной формой болезни Альцгеймера.A fundamentally new approach is the use of fragments of the protein receptor of glycosylation end products (RAGE) for the treatment of AD. The RAGE receptor is characterized by multifunctionality, is able to specifically bind to many ligands, participates in the processes of growth of cells of the nervous system, and when overexpressed in old age, it contributes to the development of a number of pathologies, such as diabetes mellitus, tumor growth, Alzheimer's disease. It is believed that binding of the RAGE receptor to β-amyloid promotes the penetration of the RAGE through the blood-brain barrier of the central nervous system and accumulation in the form of amyloid plaques - the main cause of Alzheimer's disease [Leclerc E., Sturchler E., Vetter S. The S100B / RAGE Axis in Alzheimer ′ s Disease. Cardiovasc. Psychiatry Neurol. 2010. V. 2010. P. 1-11]. In addition to RAGE, which is fixed in the membrane and binds to amyloid beta on the surface of brain neurons, there is also a soluble form of RAGE in the blood, consisting of the extracellular portion of the protein. Soluble RAGE, by binding to amyloid beta and preventing its penetration into the brain, exhibits a protective effect and restores the state of spatial memory in experimental animals. [Deane R., Du Yan S, Submamaryan RK, LaRue B, Jovanovic S, Hogg E, Welch D, Manness L, Lin C, Yu J, Zhu H, Ghiso J, Frangione B, Stern A, Schmidt AM, Armstrong DL , Arnold B, Liliensiek B, Nawroth P, Hofman F, Kindy M, Stern D, Zlokovic B. RAGE mediates amyloid-beta peptide transport across the blood-brain barrier and accumulation in brain. Nature medicine. 2003. V. 9. P. 907-913]. These data serve as the theoretical basis for our hypothesis that the RAGE fragment introduced into the body will be able to restore the spatial memory of animals with an experimentally induced form of Alzheimer's disease.

Изобретение решает задачу расширения ассортимента препаратов, обладающих лечебным действием против болезни Альцгеймера.The invention solves the problem of expanding the range of drugs with therapeutic effect against Alzheimer's disease.

Поставленная задача решается за счет пептида, обладающего лечебным действием против болезни Альцгеймера, формулыThe problem is solved by a peptide that has a therapeutic effect against Alzheimer's disease, the formula

Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala.Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala.

Сущностью изобретения является новый пептидный фрагмент белка RAGE формулы Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala (I), получаемый с помощью стандартных методик пептидного синтеза. Предлагаемый препарат относится к терапевтическим средствам лечения БА. При интраназальном введении заявляемый синтетический пептид связывается с β-амилоидом и препятствует формированию комплекса, способного проникать через гематоэнцефалический барьер. Техническим результатом изобретения является отсутствие побочных эффектов при использовании пептида, высокая терапевтическая эффективность.The essence of the invention is a new peptide fragment of the RAGE protein of the formula Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala (I), obtained using standard peptide synthesis techniques. The proposed drug relates to therapeutic agents for the treatment of AD. With intranasal administration, the inventive synthetic peptide binds to β-amyloid and prevents the formation of a complex that can penetrate the blood-brain barrier. The technical result of the invention is the absence of side effects when using a peptide, high therapeutic efficacy.

Интраназальное введение заявляемого препарата (I) препятствует ухудшению пространственной памяти у числа животных с экспериментально индуцированной формой БА. Вместе с тем введение данного пептида не приводит к ухудшению пространственной памяти у контрольных животных.Intranasal administration of the claimed preparation (I) prevents the deterioration of spatial memory in the number of animals with experimentally induced form of AD. However, the introduction of this peptide does not lead to a deterioration in spatial memory in control animals.

В качестве модели БА используют мышей, перенесших операцию удаления обонятельных луковиц головного мозга (ольфакторной бульбэктомии), после которой у животных развиваются морфологические и поведенческие признаки БА.As a model of AD, mice undergo an operation to remove the olfactory bulbs of the brain (olfactory bulbectomy), after which the animals develop morphological and behavioral signs of AD.

Синтез целевого продукта осуществляют твердофазным методом с использованием алкоксибензильного полимера. Конденсации осуществляют при помощи гексафторфосфата бензтриазол-1-ил-N-окси-бис(диметиламино)урония. Для отделения пептида от полимерного носителя и конечного деблокирования используют трифторуксусную кислоту с добавкой тиоанизола, фенола, этандитиола, триизопропилсилана и воды.The synthesis of the target product is carried out by the solid-phase method using alkoxybenzyl polymer. Condensations are carried out using benztriazol-1-yl-N-hydroxybis (dimethylamino) uronium hexafluorophosphate. Trifluoroacetic acid with the addition of thioanisole, phenol, ethanedithiol, triisopropylsilane and water is used to separate the peptide from the polymer carrier and to final release.

Структуру и гомогенность целевого продукта подтверждают данными аминокислотного анализа, масс-спектра и высокоэффективной жидкостной хроматографии.The structure and homogeneity of the target product is confirmed by the data of amino acid analysis, mass spectrum and high performance liquid chromatography.

Пример 1. Синтез пептида Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala.Example 1. Synthesis of the peptide Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala.

Операция 1.Operation 1.

0,3 г алкоксибензильного полимера с содержанием ОН-групп 0,5 ммоль/г полимера помещают в проточный реактор, промывают диметилформамидом (2×10 мл), снова добавляют 10 мл диметилформамида и оставляют набухать в течение 5-10 мин, затем диметилформамид удаляют. Синтез пептида ведут в проточном реакторе при комнатной температуре.0.3 g of an alkoxybenzyl polymer with an OH group content of 0.5 mmol / g of polymer is placed in a flow reactor, washed with dimethylformamide (2 × 10 ml), 10 ml of dimethylformamide are added again and left to swell for 5-10 minutes, then dimethylformamide is removed . Peptide synthesis is carried out in a flow reactor at room temperature.

Операция 2. Получение Fmoc-Ala - полимера (I).Operation 2. Obtaining Fmoc-Ala - polymer (I).

В 4 мл диметилформамида растворяют 0,467 г (1,5 ммоль) Fmoc-Ala-OH, добавляют 116 мкл (0,75 ммоль) N,N′-диизопропилкарбодиимида и 1,8 мг (0,015 ммоль) 4-диметиламинопиридина. Раствор перемешивают при температуре 0°C. Через 10 мин раствор добавляют к алкоксибензильному полимеру, находящемуся в проточном реакторе. Полученную смесь выдерживают при периодическом перемешивании 12 часов. Полученный Fmoc-Ala-полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл) и снова диметилформамидом (2×10 мл). Непрореагировавшие аминогруппы ацилируют смесью 2 мл уксусного ангидрида, 2 мл пиридина и 6 мл диметилформамида в течение 2 ч. Промывки повторяют. Содержание Fmoc-Ala в продукте составляет 1,05 ммоль на 0,3 г полимера.0.467 g (1.5 mmol) of Fmoc-Ala-OH is dissolved in 4 ml of dimethylformamide, 116 μl (0.75 mmol) of N, N′-diisopropylcarbodiimide and 1.8 mg (0.015 mmol) of 4-dimethylaminopyridine are added. The solution was stirred at 0 ° C. After 10 minutes, the solution was added to the alkoxybenzyl polymer in the flow reactor. The resulting mixture was kept under periodic stirring for 12 hours. The resulting Fmoc-Ala polymer was washed with dimethylformamide (2 × 10 ml), ethanol (2 × 10 ml) and again with dimethylformamide (2 × 10 ml). Unreacted amino groups are acylated with a mixture of 2 ml of acetic anhydride, 2 ml of pyridine and 6 ml of dimethylformamide for 2 hours. The washing is repeated. The content of Fmoc-Ala in the product is 1.05 mmol per 0.3 g of polymer.

Операция 3. Получение Fmoc-Val-Ala-полимера (II).Operation 3. Obtaining Fmoc-Val-Ala-polymer (II).

а) Полученный Fmoc-Ala - полимер (I) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).a) The obtained Fmoc-Ala polymer (I) is treated with 10 ml of a 20% solution of piperidine in dimethylformamide for 20 minutes, washed with dimethylformamide (2 × 10 ml), a solution of dioxane in water (2: 1) (2 × 10 ml), again with dimethylformamide (2 × 10 ml).

б) 0,153 г (0,45 ммоль) Fmoc-Val-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).b) 0.153 g (0.45 mmol) of Fmoc-Val-OH and 0.145 g (0.45 mmol) of TBTU are dissolved in 4 ml of dimethylformamide. 77 μl (0.45 mmol) of N-ethyldiisopropylamine are added to the solution and stirred at 0 ° C for 10 minutes. The solution was added to the polymer and left to stand for 2 hours with periodic stirring. The polymer was washed with dimethylformamide (2 × 10 ml).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).c) The polymer is treated with a solution of 43 μl (0.45 mmol) of acetic anhydride and 77 μl (0.45 mmol) of N-ethyldiisopropylamine in 4 ml of dimethylformamide for 20 min, washed with dimethylformamide (2 × 10 ml), ethanol (2 × 10 ml), again with dimethylformamide (2 × 10 ml).

Операция 4. Получение Fmoc-Ser(Bu^t)-Val-Ala-полимера (III).Operation 4. Obtaining Fmoc-Ser (Bu ^t ) -Val-Ala-polymer (III).

а) Fmoc-Val-Ala-полимер (II) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).a) Fmoc-Val-Ala-polymer (II) is treated with 10 ml of a 20% solution of piperidine in dimethylformamide for 20 minutes, washed with dimethylformamide (2 × 10 ml), a solution of dioxane in water (2: 1) (2 × 10 ml) again with dimethylformamide (2 × 10 ml).

б) 0,173 г (0,45 ммоль) Fmoc-Ser(Bu^t)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).b) 0.173 g (0.45 mmol) of Fmoc-Ser (Bu ^t ) -OH and 0.145 g (0.45 mmol) of TBTU are dissolved in 4 ml of dimethylformamide. 77 μl (0.45 mmol) of N-ethyldiisopropylamine are added to the solution and stirred at 0 ° C for 10 minutes. The solution was added to the polymer and left to stand for 2 hours with periodic stirring. The polymer was washed with dimethylformamide (2 × 10 ml).

Операция 5. Получение Gmoc-Asp(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Val-Ala - полимера (IV).Operation 5. Obtaining Gmoc-Asp (Bu ^t ) -Ser (Bu ^t ) -Val-Ala - polymer (IV).

а) Ser(Bu^t)-Val-Ala-полимер (III) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).a) Ser (Bu ^t ) -Val-Ala-polymer (III) is treated with 10 ml of a 20% solution of piperidine in dimethylformamide for 20 min, washed with dimethylformamide (2 × 10 ml), a solution of dioxane in water (2: 1) (2 × 10 ml), again with dimethylformamide (2 × 10 ml).

б) 0,185 г (0,45 ммоль) Fmoc-Asp(Bu^t)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).b) 0.185 g (0.45 mmol) of Fmoc-Asp (Bu ^t ) -OH and 0.145 g (0.45 mmol) of TBTU are dissolved in 4 ml of dimethylformamide. 77 μl (0.45 mmol) of N-ethyldiisopropylamine are added to the solution and stirred at 0 ° C for 10 minutes. The solution was added to the polymer and left to stand for 2 hours with periodic stirring. The polymer was washed with dimethylformamide (2 × 10 ml).

Операция 6. Получение Fmoc-Trp-Asp(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Val-Ala - полимера (V).Operation 6. Obtaining Fmoc-Trp-Asp (Bu ^t ) -Ser (Bu ^t ) -Val-Ala - polymer (V).

а) Fmoc-Asp(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Val-Ala - полимер (IV) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).a) Fmoc-Asp (Bu ^t ) -Ser (Bu ^t ) -Val-Ala - polymer (IV) is treated with 10 ml of a 20% solution of piperidine in dimethylformamide for 20 min, washed with dimethylformamide (2 × 10 ml), a solution of dioxane in water (2: 1) (2 × 10 ml), again with dimethylformamide (2 × 10 ml).

б) 0,192 г (0,45 ммоль) Fmoc-Trp-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).b) 0.192 g (0.45 mmol) of Fmoc-Trp-OH and 0.145 g (0.45 mmol) of TBTU are dissolved in 4 ml of dimethylformamide. 77 μl (0.45 mmol) of N-ethyldiisopropylamine are added to the solution and stirred at 0 ° C for 10 minutes. The solution was added to the polymer and left to stand for 2 hours with periodic stirring. The polymer was washed with dimethylformamide (2 × 10 ml).

в) Полученный полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).c) The obtained polymer is treated with a solution of 43 μl (0.45 mmol) of acetic anhydride and 77 μl (0.45 mmol) of N-ethyldiisopropylamine in 4 ml of dimethylformamide for 20 min, washed with dimethylformamide (2 × 10 ml), ethanol (2 × 10 ml), again with dimethylformamide (2 × 10 ml).

Операция 7. Получение Fmoc-Trp-Asp(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Val-Ala - полимера (VI).Operation 7. Obtaining Fmoc-Trp-Asp (Bu ^t ) -Ser (Bu ^t ) -Val-Ala-polymer (VI).

а) Fmoc-Trp-Asp(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Val-Ala - полимер (V) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).a) Fmoc-Trp-Asp (Bu ^t ) -Ser (Bu ^t ) -Val-Ala - polymer (V) is treated with 10 ml of a 20% solution of piperidine in dimethylformamide for 20 min, washed with dimethylformamide (2 × 10 ml), a solution dioxane in water (2: 1) (2 × 10 ml), again with dimethylformamide (2 × 10 ml).

б) 0,152 г (0,45 ммоль) Fmoc-Pro-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).b) 0.152 g (0.45 mmol) of Fmoc-Pro-OH and 0.145 g (0.45 mmol) of TBTU are dissolved in 4 ml of dimethylformamide. 77 μl (0.45 mmol) of N-ethyldiisopropylamine are added to the solution and stirred at 0 ° C for 10 minutes. The solution was added to the polymer and left to stand for 2 hours with periodic stirring. The polymer was washed with dimethylformamide (2 × 10 ml).

Операция 8. Получение Fmoc-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Val-Ala - полимера (VII).Step 8. Preparation of Fmoc-Gly-Pro-Trp-Asp (Bu ^t ) -Ser (Bu ^t ) -Val-Ala - Polymer (VII).

а) Fmoc-Pro-Trp-Asp(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Val-Ala - полимер (VI) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).a) Fmoc-Pro-Trp-Asp (Bu ^t ) -Ser (Bu ^t ) -Val-Ala - polymer (VI) is treated with 10 ml of a 20% solution of piperidine in dimethylformamide for 20 minutes, washed with dimethylformamide (2 × 10 ml) , a solution of dioxane in water (2: 1) (2 × 10 ml), again with dimethylformamide (2 × 10 ml).

б) 0,134 г (0,45 ммоль) Fmoc-Gly-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).b) 0.134 g (0.45 mmol) of Fmoc-Gly-OH and 0.145 g (0.45 mmol) of TBTU are dissolved in 4 ml of dimethylformamide. 77 μl (0.45 mmol) of N-ethyldiisopropylamine are added to the solution and stirred at 0 ° C for 10 minutes. The solution was added to the polymer and left to stand for 2 hours with periodic stirring. The polymer was washed with dimethylformamide (2 × 10 ml).

Операция 9. Получение Fmoc-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Val-Ala - полимера (VIII).Step 9. Preparation of Fmoc-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp (Bu ^t ) -Ser (Bu ^t ) -Val-Ala - Polymer (VIII).

а) Fmoc-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Val-Ala - полимер (VII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).a) Fmoc-Gly-Pro-Trp-Asp (Bu ^t ) -Ser (Bu ^t ) -Val-Ala - polymer (VII) is treated with 10 ml of a 20% solution of piperidine in dimethylformamide for 20 minutes, washed with dimethylformamide (2 × 10 ml), a solution of dioxane in water (2: 1) (2 × 10 ml), again with dimethylformamide (2 × 10 ml).

Операция 10. Получение Fmoc-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Val-Ala - полимера (IX).Operation 10. Obtaining Fmoc-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp (Bu ^t ) -Ser (Bu ^t ) -Val-Ala - polymer (IX).

а) Fmoc-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Val-Ala - полимер (VIII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).a) Fmoc-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp (Bu ^t ) -Ser (Bu ^t ) -Val-Ala - polymer (VIII) is treated with 10 ml of a 20% solution of piperidine in dimethylformamide for 20 minutes, washed with dimethylformamide (2 × 10 ml), a solution of dioxane in water (2: 1) (2 × 10 ml), again with dimethylformamide (2 × 10 ml).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) JV-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).c) The polymer is treated with a solution of 43 μl (0.45 mmol) of acetic anhydride and 77 μl (0.45 mmol) of JV-ethyldiisopropylamine in 4 ml of dimethylformamide for 20 minutes, washed with dimethylformamide (2 × 10 ml), ethanol (2 × 10 ml), again with dimethylformamide (2 × 10 ml).

Операция 11. Получение Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Val-Ala - полимера (X).Step 11. Preparation of Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp (Bu ^t ) -Ser (Bu ^t ) -Val-Ala - Polymer (X).

a)Fmoc-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Val-Ala - полимер (IX) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).a) Fmoc-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp (Bu ^t ) -Ser (Bu ^t ) -Val-Ala - polymer (IX) is treated with 10 ml of a 20% solution of piperidine in dimethylformamide for 20 minutes, washed with dimethylformamide (2 × 10 ml), a solution of dioxane in water (2: 1) (2 × 10 ml), again with dimethylformamide (2 × 10 ml).

б) 0,166 г (0,45 ммоль) Fmoc-Gln-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).b) 0.166 g (0.45 mmol) of Fmoc-Gln-OH and 0.145 g (0.45 mmol) of TBTU are dissolved in 4 ml of dimethylformamide. 77 μl (0.45 mmol) of N-ethyldiisopropylamine are added to the solution and stirred at 0 ° C for 10 minutes. The solution was added to the polymer and left to stand for 2 hours with periodic stirring. The polymer was washed with dimethylformamide (2 × 10 ml).

Операция 12. Получение Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Val-Ala - полимера (XI).Step 12. Preparation of Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp (Bu ^t ) -Ser (Bu ^t ) -Val-Ala - Polymer (XI).

а) Fmoc-Gln-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Val-Ala - полимер (X) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).a) Fmoc-Gln-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp (Bu ^t ) -Ser (Bu ^t ) -Val-Ala - polymer (X) is treated with 10 ml of a 20% solution of piperidine in dimethylformamide for 20 minutes, washed with dimethylformamide (2 × 10 ml), a solution of dioxane in water (2: 1) (2 × 10 ml), again with dimethylformamide (2 × 10 ml).

Операция 13. Получение Fmoc-Ser(Bu^t)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu^t)-Ser(Bu^t)Val-Ala - полимера (XII).Step 13. Preparation of Fmoc-Ser (Bu ^t ) -Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp (Bu ^t ) -Ser (Bu ^t ) Val-Ala - Polymer (XII).

а) Fmoc-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Val-Ala - полимер (XI) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).a) Fmoc-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp (Bu ^t ) -Ser (Bu ^t ) -Val-Ala - polymer (XI) is treated with 10 ml of a 20% solution of piperidine in dimethylformamide 20 min, washed with dimethylformamide (2 × 10 ml), a solution of dioxane in water (2: 1) (2 × 10 ml), again with dimethylformamide (2 × 10 ml).

б) 0,172 г (0,45 ммоль) Fmoc-Ser(Bu^t)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).b) 0.172 g (0.45 mmol) of Fmoc-Ser (Bu ^t ) -OH and 0.145 g (0.45 mmol) of TBTU are dissolved in 4 ml of dimethylformamide. 77 μl (0.45 mmol) of N-ethyldiisopropylamine are added to the solution and stirred at 0 ° C for 10 minutes. The solution was added to the polymer and left to stand for 2 hours with periodic stirring. The polymer was washed with dimethylformamide (2 × 10 ml).

Операция 14. Получение Fmoc-Leu-Ser(Bu^t)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Val-Ala - полимера (XIII).Step 14. Preparation of Fmoc-Leu-Ser (Bu ^t ) -Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp (Bu ^t ) -Ser (Bu ^t ) -Val-Ala - Polymer (XIII).

а) Fmoc-Ser(Bu^t)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Val-Ala - полимер (XII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).a) Fmoc-Ser (Bu ^t ) -Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp (Bu ^t ) -Ser (Bu ^t ) -Val-Ala - polymer (XII) is treated with 10 ml of 20% - solution of piperidine in dimethylformamide for 20 min, washed with dimethylformamide (2 × 10 ml), a solution of dioxane in water (2: 1) (2 × 10 ml), again with dimethylformamide (2 × 10 ml).

б) 0,159 г (0,45 ммоль) Fmoc-Leu-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).b) 0.159 g (0.45 mmol) of Fmoc-Leu-OH and 0.145 g (0.45 mmol) of TBTU are dissolved in 4 ml of dimethylformamide. 77 μl (0.45 mmol) of N-ethyldiisopropylamine are added to the solution and stirred at 0 ° C for 10 minutes. The solution was added to the polymer and left to stand for 2 hours with periodic stirring. The polymer was washed with dimethylformamide (2 × 10 ml).

Операция 15. Получение Fmoc-Val-Leu-Ser(Bu^t)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Val-Ala - полимера (XIV).Operation 15. Obtaining Fmoc-Val-Leu-Ser (Bu ^t ) -Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp (Bu ^t ) -Ser (Bu ^t ) -Val-Ala - polymer (XIV) .

а) From-Leu-Ser(Bu^t)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Val-Ala - полимер (XIII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).a) From-Leu-Ser (Bu ^t ) -Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp (Bu ^t ) -Ser (Bu ^t ) -Val-Ala - polymer (XIII) is treated with 10 ml 20 % solution of piperidine in dimethylformamide for 20 minutes, washed with dimethylformamide (2 × 10 ml), a solution of dioxane in water (2: 1) (2 × 10 ml), again with dimethylformamide (2 × 10 ml).

Операция 16. Получение Fmoc-Lys(Boc)-Val-Leu-Ser(Bu^t)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu^t)-SerBu^t)-Val-Ala - полимера (XV).Step 16. Preparation of Fmoc-Lys (Boc) -Val-Leu-Ser (Bu ^t ) -Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp (Bu ^t ) -SerBu ^t ) -Val-Ala - polymer (Xv).

a) Fmoc-Val-Leu-Ser(Bu^t)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Val-Ala - полимер (XIV) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).a) Fmoc-Val-Leu-Ser (Bu ^t ) -Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp (Bu ^t ) -Ser (Bu ^t ) -Val-Ala - polymer (XIV) is treated 10 ml of a 20% solution of piperidine in dimethylformamide for 20 minutes, washed with dimethylformamide (2 × 10 ml), a solution of dioxane in water (2: 1) (2 × 10 ml), again with dimethylformamide (2 × 10 ml).

б) 0,211 г (0,45 ммоль) Fmoc-Lys(Boc)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).b) 0.211 g (0.45 mmol) of Fmoc-Lys (Boc) -OH and 0.145 g (0.45 mmol) of TBTU are dissolved in 4 ml of dimethylformamide. 77 μl (0.45 mmol) of N-ethyldiisopropylamine are added to the solution and stirred at 0 ° C for 10 minutes. The solution was added to the polymer and left to stand for 2 hours with periodic stirring. The polymer was washed with dimethylformamide (2 × 10 ml).

Операция 17. Получение Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Val-Leu-Ser(Bu^t)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Val-Ala - полимера (XVI).Operation 17. Obtaining Fmoc-Trp-Lys (Boc) -Val-Leu-Ser (Bu ^t ) -Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp (Bu ^t ) -Ser (Bu ^t ) -Val -Ala - polymer (XVI).

a) Fmoc-Lys(Boc)-Val-Leu-Ser(Bu^t)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Val-Ala - полимер (XV) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).a) Fmoc-Lys (Boc) -Val-Leu-Ser (Bu ^t ) -Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp (Bu ^t ) -Ser (Bu ^t ) -Val-Ala - polymer (XV) is treated with 10 ml of a 20% solution of piperidine in dimethylformamide for 20 minutes, washed with dimethylformamide (2 × 10 ml), a solution of dioxane in water (2: 1) (2 × 10 ml), again with dimethylformamide (2 × 10 ml) .

Операция 18. Получение H-Ala-Trp-Lys(Boc)-Val-Leu-Ser(Bu^t)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Тrp-Asp(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Val-Ala - полимера (XVII).Step 18. Preparation of H-Ala-Trp-Lys (Boc) -Val-Leu-Ser (Bu ^t ) -Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp (Bu ^t ) -Ser (Bu ^t ) -Val-Ala - polymer (XVII).

a) Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Val-Leu-Ser(Bu^t)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(Bu^t)-Ser(Bu^t)-Val-Ala - полимер (XVI) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).a) Fmoc-Trp-Lys (Boc) -Val-Leu-Ser (Bu ^t ) -Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp (Bu ^t ) -Ser (Bu ^t ) -Val-Ala - the polymer (XVI) is treated with 10 ml of a 20% solution of piperidine in dimethylformamide for 20 minutes, washed with dimethylformamide (2 × 10 ml), a solution of dioxane in water (2: 1) (2 × 10 ml), again with dimethylformamide (2 × 10 ml).

б) 0,140 г (0,45 ммоль) Fmoc-Ala-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).b) 0.140 g (0.45 mmol) of Fmoc-Ala-OH and 0.145 g (0.45 mmol) of TBTU are dissolved in 4 ml of dimethylformamide. 77 μl (0.45 mmol) of N-ethyldiisopropylamine are added to the solution and stirred at 0 ° C for 10 minutes. The solution was added to the polymer and left to stand for 2 hours with periodic stirring. The polymer was washed with dimethylformamide (2 × 10 ml).

в) Полимер обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).c) The polymer is treated with 10 ml of a 20% solution of piperidine in dimethylformamide for 20 minutes, washed with dimethylformamide (2 × 10 ml), a solution of dioxane in water (2: 1) (2 × 10 ml), again with dimethylformamide (2 × 10 ml) .

Операция 19. Получение целевого пептида Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala (XVII). 0,3 г пептидил-полимера (XVI) обрабатывают 4 мл смеси трифторуксусная кислота-тиоанизол-фенол-вода-этандитиол-триизопропилсилан в объемном соотношении 81,5:5:5:5:2,5:1 в течение 2 ч. Полимер отфильровывают, раствор упаривают, сухой остаток промывают сухим диэтиловым эфиром (2×50 мл). Растворяют в 10-% уксусной кислоте и очищают на препаративной ВЭЖХ при следующих условиях: колонка Phenomenex (США) Jupiter 10µ С18 300А (250×10 мм), растворитель А: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в воде, растворитель Б: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в ацетонитриле, градиент растворителя А в Б - 10-70% за 1 ч, скорость потока элюента - 3 мл/мин, выход пептида регистрируют при оптической длине волны 226 нм. Собранную после ВЭЖХ фракцию, содержащую целевой продукт лиофилизуют.Step 19: Preparation of the target Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala (XVII) peptide. 0.3 g of peptidyl polymer (XVI) is treated with 4 ml of a mixture of trifluoroacetic acid-thioanisole-phenol-water-ethanedithiol-triisopropylsilane in a volume ratio of 81.5: 5: 5: 5: 2.5: 1 for 2 hours. Polymer filtered, the solution was evaporated, the dry residue was washed with dry diethyl ether (2 × 50 ml). Dissolve in 10% acetic acid and purify on preparative HPLC under the following conditions: Phenomenex (USA) Jupiter 10µC18A column (250 × 10 mm), solvent A: 0.1% trifluoroacetic acid in water, solvent B: 0 , 1% trifluoroacetic acid in acetonitrile, the solvent gradient A in B is 10-70% for 1 h, the flow rate of the eluent is 3 ml / min, the yield of the peptide is recorded at an optical wavelength of 226 nm. The fraction collected after HPLC containing the desired product is lyophilized.

Данные аминокислотного анализа Asp 1,0 (1), Ser 1,8 (2), Glu 1,1 (1), Pro 1,7 (2), Gly 3,3 (3), Ala 1,8 (2), Val 2,0 (2), Leu 1,0 (1), Lys 1,0(1).Amino Acid Analysis Data Asp 1.0 (1), Ser 1.8 (2), Glu 1.1 (1), Pro 1.7 (2), Gly 3.3 (3), Ala 1.8 (2) Val 2.0 (2); Leu 1.0 (1); Lys 1.0 (1).

По данным масс-спектрометрии MH+1755. По данным аналитической ВЭЖХ время удерживания составляет 23,65 мин, условия: колонка Phenomenex (США) Jupiter 5µ С18 300А (250×4,6 мм), растворитель А: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в воде, растворитель Б: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в ацетонитриле, градиент растворителя А в Б - 10-70% за 1 ч, скорость потока элюента - 1 мл/мин, выход пептида регистрируют при оптической длине волны 226 нм.According to mass spectrometry MH + 1755. According to analytical HPLC, the retention time is 23.65 min, conditions: Phenomenex column (USA) Jupiter 5µ C18 300A (250 × 4.6 mm), solvent A: 0.1% trifluoroacetic acid in water, solvent B: 0 , 1% trifluoroacetic acid in acetonitrile, the solvent gradient A in B is 10-70% for 1 h, the flow rate of the eluent is 1 ml / min, the yield of the peptide is recorded at an optical wavelength of 226 nm.

Пример 2. Проведение биологических испытаний. Эксперименты проводят на мышах NMRI весом 20-30 г.Example 2. Biological testing. The experiments were carried out on NMRI mice weighing 20-30 g.

а) Операцию ольфакторной бульбэктомии проводят в стерильных условиях под гексеналовым наркозом (40 мг/кг внутрибрюшинно) с применением 0,5% раствора новокаина для местного обезболивания при скальпировании. Двустороннее удаление обонятельных луковиц проводят путем аспирации через трепанационное отверстие. Контрольных животных подвергают аналогичной манипуляции, но без удаления обонятельных луковиц.a) The olfactory bulbectomy operation is carried out under sterile conditions under hexenal anesthesia (40 mg / kg ip) using a 0.5% novocaine solution for local anesthesia during scalping. Bilateral removal of olfactory bulbs is carried out by aspiration through a trepanation hole. Control animals undergo a similar manipulation, but without removing the olfactory bulbs.

б) Из пептида, полученного по изобретению, готовят раствор в концентрации 5 мг/мл в физрастворе и через две недели после операции ольфакторной бульбэктомии начинают вводить мышам интраназально в объеме 4 мкл на одно животное ежедневно.b) A solution at a concentration of 5 mg / ml in saline solution is prepared from the peptide obtained according to the invention, and two weeks after the olfactory bulbectomy operation, they begin to be administered intranasally to mice in a volume of 4 μl per animal daily.

в) Через 4 недели после операции ольфакторной бульбэктомии проводят обучение животных в водном лабиринте Морриса. Экспериментальная камера представляет собой пластиковый круглый бассейн с диаметром 80 см, заполненный на 30 см водой с температурой 23°С. Площадь бассейна условно делится на четыре равных сектора, в одном из которых находится спасательная платформа диаметром 5 см. Вода забеляется молоком для того, чтобы животные не могли визуально обнаружить спасательную платформу.c) 4 weeks after olfactory bulbectomy surgery, animals are trained in the Morris water maze. The experimental chamber is a plastic round pool with a diameter of 80 cm, filled 30 cm with water at a temperature of 23 ° C. The pool area is conditionally divided into four equal sectors, in one of which there is a rescue platform with a diameter of 5 cm. Water is whitened with milk so that animals can not visually detect the rescue platform.

Для опытов отбирают мышей, умеющих хорошо плавать и быстро находить спасательную платформу. В течение 5 дней проводят по четыре сеанса обучения ежедневно. В результате всех животных обучают находить спасательную платформу менее, чем за 10 сек. Затем в течение одной минуты у животных тестируют уровень пространственной памяти при отсутствии спасательной платформы. Состояние пространственной памяти каждого животного оценивают по его способности помнить отсек обучения и выделять его из 3-х других отсеков. В течение 1 минуты учитывают время пребывания животных в каждом отсеке. Обучившимися считают животных, время нахождения которых в отсеке обучения достоверно превышает время нахождения в каждом из других отсеков.For experiments, mice that can swim well and quickly find a rescue platform are selected. Within 5 days, four training sessions are carried out daily. As a result, all animals are trained to find a rescue platform in less than 10 seconds. Then, for one minute, the animals test the level of spatial memory in the absence of a rescue platform. The state of the spatial memory of each animal is assessed by its ability to remember the learning compartment and to distinguish it from 3 other compartments. Within 1 minute, the residence time of animals in each compartment is taken into account. Students are considered animals whose residence time in the training compartment significantly exceeds the time spent in each of the other compartments.

Результаты биологических испытаний заявляемого препарата приведены на рис. 1.The results of biological tests of the claimed drug are shown in Fig. one.

В ходе биологических испытаний показано, что бульбэктомированные мыши, интраназально получавшие дозу исследуемого пептида (I) выделяли (находили) сектор со спасательной платформой (сектор 3) достоверно чаще по сравнению с бульбэктомированными мышами, не получавшими дозу пептида (I). Аналогичные результаты получены при измерении времени нахождения животных в секторе 3. Также показано, что интраназальное введение пептида (I) не ухудшает пространственную память ложнооперированным мышам.In the course of biological tests, it was shown that bulbectomized mice intranasally receiving a dose of the studied peptide (I) isolated (found) a sector with a rescue platform (sector 3) significantly more often compared to bulbectomized mice that did not receive a dose of peptide (I). Similar results were obtained when measuring the time spent by animals in sector 3. It was also shown that intranasal administration of the peptide (I) does not impair the spatial memory of mock-operated mice.

г) Токсичность полученного пептида исследуют на экспериментальных животных в системе in vivo. Исследование проводят на линейных мышах линии Balb/c весом 20 г с использованием максимальной дозы пептида 1 мг, вводимой подкожно. Животных держат под наблюдением в течение суток. По результатам наблюдения острой токсичности исследуемого препарата не выявлено.g) The toxicity of the obtained peptide is investigated in experimental animals in vivo. The study was conducted on linear Balb / c mice weighing 20 g using a maximum dose of 1 mg peptide administered subcutaneously. Animals are kept under observation during the day. According to the results of the observation of acute toxicity of the study drug was not detected.

Таким образом, получен новый пептид формулы Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala, который обладает лечебным действием против болезни Альцгеймера.Thus, a new peptide of the formula Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala, which has a therapeutic effect against Alzheimer's disease, is obtained.

Claims

Пептид, обладающий лечебным действием против болезни Альцгеймера, формулы:
Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala. A peptide having a therapeutic effect against Alzheimer's disease, of the formula:
Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala.