RU2553500C2

RU2553500C2 - Композиции для гигиены полости рта и способы

Info

Publication number: RU2553500C2
Application number: RU2012130956/14A
Authority: RU
Inventors: Вэй Ван; Вирджиния БАНС; Харш М. ТРИВЕДИ; Тао СЮЙ
Original assignee: Колгейт-Палмолив Компани
Priority date: 2009-12-21
Filing date: 2010-12-21
Publication date: 2015-06-20
Also published as: MY154024A; RU2012130956A; AU2010339713A1; TW201141536A; JP2013515075A; US8883179B2; WO2011084781A2; US20150086490A1; MX2012006018A; EP2515895B1; WO2011084781A3; EP2515895A2; CN102781439A; US9320696B2; US20120294915A1; BR112012015401A2; ZA201204530B; CA2780821A1; AU2010339713B2; JP5718360B2

Abstract

Группа изобретений относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использована для лечения состояний, связанных с повышенной экспрессией ММП-13, выбранных из группы, состоящей из потери фиксации одного или более зубов, выпадения зубов, подвижности зубов, образования карманов, потери костной ткани и комбинации двух и более указанных состояний. Для этого предложено применение 4-ацетамидофенил 2-изопропил-5-метилциклогексилкарбоната в производстве лекарственного средства для лечения этих состояний. Предложена также композиция для ухода за зубами, содержащая орально приемлемый носитель и терапевтически эффективное количество ингибитора ММП-13 в виде 4-ацетамидофенил 2-изопропил-5-метилциклогексилкарбоната. Группа изобретений обеспечивает эффективное лечение указанных состояний за счёт эффективного подавления ММП-13. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 5 табл., 5 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По этой заявке испрашивается приоритет согласно предварительной патентной заявке США № 61/288359, поданной 21 декабря 2009 г., которая включена в этот документ посредством ссылки.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Матриксные металлопротеиназы (ММП) представляют собой природное семейство кальций-зависимых и цинк-зависимых эндопептидаз, которые обнаруживаются у большинства млекопитающих. Было высказано предположение о том, что повышенная экспрессия и активация ММП или дисбаланс между ММП и ингибиторами ММП играют определенную роль в патогенезе заболеваний, характеризующихся разрушением внеклеточного матрикса или соединительных тканей.

Органический матрикс является основным компонентом периодонта (десен, цемента, периодонтальных связок и альвеолярных отростков). Матриксные металлопротеиназы (ММП) вовлечены в реконструкцию периодонтального матрикса. Деструктивные ММП разрушают различные компоненты внеклеточного матрикса, как в физиологических, так и в патологических условиях. Патологическая гиперпродукция деструктивных ММП приводит к неадекватному и чрезмерному разрушению матрикса. Гиперпродукция деструктивных ММП способствует резорбции костной ткани: сначала за счет разрушения остеоида (не минерализованного и новообразованного костного матрикса), а затем разрушения зрелого матрикса, что в результате приводит к клиническим проявлениям периодонтита, включая атрофию десневого края, формирование карманов, утрату фиксации, подвижность зубов и их выпадение.

Одной из основных деструктивных ММП является ММП-13, которая играет роль в разрушении внеклеточного матрикса. Уровень экспрессии ММП-13 коррелируется с клиническими показателями периодонтита. ММП-13 выявляют в нездоровой периодонтальной ткани и десневой жидкости, но в здоровой слизистой полости рта ММП-13 отсутствует. Uitto et al. American Journal of Pathophysiology, 152(6), 1489 (1998).

Матриксная металлопротеиназа-13 была идентифицирована как фермент, ответственный за резорбцию костной ткани и разрушение хряща при ревматоидном артрите и остеоартрите. Известно также, что уровень ММП-13 повышен в десневой жидкости у больных с хроническим периодонтитом. В дополнение к этому известно, что ММП-13 дает вклад в деструкцию как костной, так и соединительной ткани у больных с пародонтозом и пародонтитом. Ilgenli, T. et al. Oral Diseases, 12, 573 (2006).

В настоящее время для лечения заболеваний периодонта применяют противомикробные, нестероидные противовоспалительные средства (НСПВС), бифосфонаты и тетрациклины. Эти средства часто не обеспечивают адекватного облегчения симптомов и, по-видимому, не оказывают существенного влияния на естественное развитие заболевания. Кроме того, большинство таких терапевтических методик связано с серьезными побочными эффектами. Поэтому существует большая потребность в безопасном и эффективном терапевтическом лечении таких заболеваний.

Хотя существует много способов лечения, направленных на разные аспекты заболевания периодонта, сохраняется потребность в разработке улучшенной оральной композиции, содержащей активные ингредиенты, которые нацелены на деструктивные ММП, способствующие резорбции костной ткани и вызывающие разрушение тканей. Особенно остро ощущается потребность в разработке улучшенных оральных композиций, нацеленных на ММП-13, которая дает вклад как в резорбцию костной ткани, так и в деструкцию соединительной ткани.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте - способ подавления матричной металлопротеиназы ММП-13, включающий введение субъекту эффективного терапевтического количества ингибитора матричной металлопротеиназы ММП-13, при этом ингибитор матричной металлопротеиназы ММП-13 выбирают из группы, состоящей из НДМ (недиализируемого материала) клюквенного экстракта, ацетил-кето-β-босвеллиевой кислоты, ресвератрола, 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-гидроксифенилкарбамата, 4-ацетамидофенил 2-изопропил-5-метилциклогексилкарбоната и их комбинаций.

Этот способ обеспечивает новый механизм эффективного подавления матриксной металлопротеиназы ММП-13 и, следовательно, лечения или профилактики состояний, вызванных экспрессией ММП-13. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что НДМ из клюквенного экстракта, ацетил-кето-β-босвеллиевая кислота (АКББК), ресвератрол, 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-гидроксифенилкарбамат, 4-ацетамидофенил 2-изопропил-5-метилциклогексил карбонат и их комбинации эффективно подавляют матриксную металлопротеиназу ММП-13.

Во втором аспекте - композиция для гигиены полости рта, включающая орально приемлемый носитель и соединение, выбранное из группы, состоящей из недиализируемого материала клюквенного экстракта, ацетил-кето-β-босвеллиевой кислоты, ресвератрола, 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-гидроксифенилкарбамата, 4-ацетамидофенил 2-изопропил-5-метилциклогексилкарбоната и их комбинаций, при этом соединение представлено в количестве, эффективном для подавления ММП-13.

В третьем аспекте - композиция для гигиены полости рта, включающая соединение, выбранное из группы, состоящей из недиализируемого материала клюквенного экстракта, ацетил-кето-β-босвеллиевой кислоты, ресвератрола, 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-гидроксифенилкарбамата, 4-ацетамидофенил 2-изопропил-5-метилциклогексил карбоната и их комбинаций, применяемая для лечения или профилактики состояний, вызванных экспрессией ММП-13.

Также предлагается способ лечения разрушений внеклеточного матрикса, потери фиксации, выпадения зубов, подвижности зубов, образования карманов и потери костной ткани.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Во всем этом документе диапазоны используются как условное обозначение любой величины, попадающей в указанный диапазон. В качестве конечной точки диапазона может быть выбрана любая величина в пределах диапазона. В дополнение к этому все источники, процитированные в этом документе, включены в настоящий документ посредством ссылки во всей полноте их содержания. В случае конфликта определений между настоящим раскрытием изобретения и процитированной ссылкой преимущество имеет настоящее раскрытие изобретения.

Если специально не указано иное, то все процентные доли и количества, указанные здесь и в других местах описания, должны восприниматься как проценты по весу. Приведенные количества основаны на активном весе материала.

При использовании в этом документе термин "ароматизатор" относится к любому материалу или смеси материалов, которые улучшают вкус композиции.

Композиции

В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагается композиция, включающая терапевтически эффективное количество ингибитора ММП-13 и орально приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибитор ММП-13 выбирают из группы, состоящей из недиализируемого материала клюквенного экстракта, ацетил-кето-β-босвеллиевой кислоты, ресвератрола, 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-гидроксифенилкарбамата, 4-ацетамидофенил 2-изопропил-5-метилциклогексилкарбоната и комбинации двух или более этих веществ.

В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибитор ММП-13 выбирают из группы, состоящей из недиализируемого материала клюквенного экстракта, ацетил-кето-β-босвеллиевой кислоты, ресвератрола, 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-гидроксифенилкарбамата, 4-ацетамидофенил 2-изопропил-5-метилциклогексилкарбоната и комбинации двух или более этих веществ.

В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция дополнительно включает средство против зубного налета, отбеливатель, антибактериальное средство, очищающее средство, ароматизатор, подсластитель, связывающее вещество, поверхностно-активное вещество, модулятор пены, абразив, модификатор pH, увлажнитель, вкусовое средство, краситель, средство против образования зубного камня (антикалькулезное), источник ионов фтора, стимулятор слюноотделения, питательное вещество или комбинацию двух и более этих веществ.

Некоторые варианты осуществления изобретения дополнительно включают подсластитель, спирт, глицерин, сорбит, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, полимер, алкилполигликозид (АПГ), полисорбат, касторовое масло или ментол.

В некоторых вариантах осуществления изобретения подсластитель представляет собой сахарин или сахарин натрия. В некоторых вариантах осуществления изобретения спирт представляет собой этанол. В некоторых вариантах осуществления изобретения полимер представляет собой POLOXAMER^® 407 или PLURONIC^® F108 (оба продукта доступны от корпорации BASF). В некоторых вариантах осуществления изобретения полиэтиленгликоль представляет собой PEG40.

Можно использовать любой орально приемлемый натуральный или синтетический ароматизатор, такой как ароматизирующие масла, ароматизирующие альдегиды, сложные эфиры, спирты, сходные материалы и их комбинации. Ароматизаторы включают ванилин, шалфей, майоран, масло петрушки, масло мяты кудрявой, коричное масло, винтергреневое масло (метилсалицилат), масло мяты перечной, гвоздичное масло, лавровое масло, анисовое масло, эвкалиптовое масло, цитрусовые масла, плодовые масла и эссенции, включая полученные из лимона, апельсина, лайма, грейпфрута, абрикоса, банана, винограда, яблока, земляники, вишни, ананаса и т.д., ароматизаторы, полученные из бобов и орехов, таких как кофе, какао, кола, арахис, миндаль и т.д., адсорбированные и инкапсулированные ароматизаторы или их смеси. В этом документе понятие "ароматизаторы" также охватывает такие ингредиенты, которые создают во рту ощущение приятного запаха и/или вызывают другой сенсорный эффект, включая эффекты прохлады или тепла. Такие ингредиенты включают ментол, ментилацетат, ментиллактат, камфору, эвкалиптовое масло, эвкалиптол, анетол, евгенол, кассию, оксанон, [альфа]-иризон, пропенилгуайетол, тимол, линалоол, бензальдегид, коричный альдегид, N-этил-p-метан-3-карбоксамин, N,2,3-триметил-2-изопропилбутанамид, 3-l-ментоксипропан-l,2-диол, глицеринацетат коричного альдегида (ГКА), метонглицеринацетат (МГА) и их смеси. Один или более ароматизаторов необязательно могут быть представлены в общем количестве приблизительно от 0,01% до 5%, а в других вариантах осуществления изобретения (также необязательно) приблизительно от 0,05 до 2%, приблизительно от 0,1% до 2,5% и приблизительно от 0,1 до 0,5%.

Подсластители, полезные применительно к настоящему изобретению, включают декстрозу, полидекстрозу, сахарозу, мальтозу, декстрин, высушенный инвертированный сахар, маннозу, ксилозу, рибозу, фруктозу, левулезу, галактозу, кукурузный сироп, частично гидролизованный крахмал, гидрогенизированный гидролизат крахмала, сорбит, маннит, ксилит, мальтит, изомальт, аспартам, неотам, сахарин и их соли, сукралозу, интенсивные подсластители на основе дипептидов, цикламаты, дигидрохалконы и их смеси.

Средства, вызывающие во рту различные ощущения, включают материалы, которые при их включении в композицию придают ей желательную структуру или вызывают другие ощущения. Такие средства могут включать агломерированные частицы диоксида кремния, которые способны распадаться при механическом возбуждении, в частности, серия веществ SORBOSIL^® BFG (например, BFG 10, BFG 50, BFG 100 и т.д.), диоксиды кремния CBT60S, CBT70 или AC33/43, коммерчески доступные от корпорации PQ, Valley Forge, штат Пенсильвания.

Красители, полезные применительно к настоящему изобретению, включают пигменты, краски, лаки и агенты, придающие композиции особый блеск или отражательную способность, например перламутровые средства. В различных вариантах осуществления изобретения красители действуют, создавая на зубной поверхности белое или светлоокрашенное покрытие, то есть являются индикатором расположения на зубной поверхности, которая вступила в эффективный контакт с композицией, и/или модифицируя внешний вид композиции, особенно ее цвет и/или матовость, чтобы сделать ее более привлекательной для потребителя. Можно использовать любой орально приемлемый краситель, включая краски и пигменты FD&C (для продуктов питания, лекарств и косметических средств), тальк, слюду, карбонат магния, карбонат кальция, силикат магния, алюмосиликат магния, диоксид кремния, диоксид титана, оксид цинка, красную, желтую, коричневую и черную окиси железа, железистосинеродистый аммоний, марганцево-фиолетовый пигмент, ультрамарин, титановую слюду, хлорокись висмута и их смеси. Один или более красителей необязательно могут быть представлены в композиции в общем количестве приблизительно от 0,001% до 20%, например приблизительно от 0,01% до 10% или приблизительно от 0,1% до 5%.

В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции могут дополнительно включать необязательный абразив, полезный, например, в качестве полирующего средства. Можно использовать любой орально приемлемый абразив, но тип, мелкозернистость (размер частиц) и количество абразива следует подбирать таким образом, чтобы при нормальном применении композиции эмаль зубов не подвергалась избыточному истиранию. Подходящие необязательные абразивы включают диоксид кремния, например, в виде осаждённого диоксида кремния или в смеси с окисью алюминия, нерастворимые фосфаты, карбонат кальция и их смеси. К числу нерастворимых фосфатов, полезных в качестве абразивов, относятся ортофосфаты, полиметафосфаты и пирофосфаты. Наглядными примерами являются двуводный ортофосфат дикальция, пирофосфат кальция, трикальцийфосфат, полиметафосфат кальция и нерастворимый полиметафосфат натрия.

В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция необязательно включает средство против образования зубного камня (антикалькулезное). Средства против образования зубного камня, полезные применительно к настоящему изобретению, включают соли любых агентов этого класса, например соли щелочных металлов и соли аммония: фосфаты и полифосфаты (например, пирофосфаты), полиаминопропансульфоновую кислоту (AMPS), полиолефинсульфонаты, полиолефинфосфаты, дифосфонаты, такие как азациклоалкан-2,2-дифосфонаты (например, азациклогептан-2,2-дифосфоновая кислота), N-метилазациклопентан-2,3-дифосфоновую кислоту, этан-1-гидрокси-1,1-дифосфоновую кислоту (EHDP), этан-1-амино-1,1-дифосфонат и фосфоноалканкарбоновые кислоты. Полезные неорганические фосфатные и полифосфатные соли включают одноосновные, двухосновные и трехосновные фосфаты натрия, триполифосфат натрия, тетраполифосфат, моно-, ди-, три- и тетранатрий пирофосфаты, триметафосфат натрия, гексаметафосфат натрия и их смеси.

В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция необязательно включает источник ионов фтора, полезный, например, в качестве средства против кариеса. Можно использовать любой орально приемлемый порошковый источник ионов фтора, включая фториды калия, натрия и аммония, а также монофторфосфаты, фторид олова, фторид индия, аминофториды, такие как олафлур (N'-октадецилтриметилендиамин-N,N,N'-трис(2-этанол)-дифторгидрат) и их смеси. Один или более источников ионов фтора необязательно могут быть представлены в оральной композиции в таком количестве, которое обеспечивает клинически эффективную дозу растворимых ионов фтора.

В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции необязательно включают средство, стимулирующее слюноотделение, которое полезно, например, для увлажнения сухой полости рта. Можно использовать любое орально приемлемое средство для стимуляции слюноотделения, включая, без ограничений, пищевые кислоты, такие как лимонная, молочная, яблочная, янтарная, аскорбиновая, адипиновая, фумаровая и винная, а также их смеси. Одно или более средств, стимулирующих слюноотделение, могут быть представлены в таком общем количестве, которое эффективно стимулирует слюноотделение.

В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции необязательно включают питательное вещество. Подходящие питательные вещества включают витамины, минералы, аминокислоты и их смеси. Витамины включают витамины C и D, тиамин, рибофлавин, пантотенат кальция, никотиновую кислоту, фолиевую кислоту, никотинамид, пиридоксин, цианокобаламин, парааминобензойную кислоту, биофлавоноиды и их смеси. Пищевые добавки включают аминокислоты (такие как L-триптофан, L-лизин, метионин, треонин, левокарнитин и L-карнитин), липотропные вещества (такие как холин, инозитол, бетаин и линолевая кислота), а также их смеси.

В различных вариантах осуществления изобретения оральную композицию, соответствующую изобретению, специально не проглатывают, а скорее задерживают в полости рта на такое время, которое достаточно для осуществления полезного целевого эффекта. В других портативных вариантах осуществления изобретения (таких как пастилка, мятная лепешка, шарик, облатка, жидкость, предназначенная для внесения в полость рта из маленького портативного небулайзера, жидкость, предназначенная для внесения в полость рта из маленькой портативной бутылочки-капельницы, или мягкая жевательная таблетка) оральную композицию специально проглатывают в необязательном порядке после задержки в полости рта на такое время, которое достаточно для осуществления полезного целевого эффекта.

Композиции для гигиены полости рта в различных вариантах осуществления изобретения предпочтительно имеют форму средства для ухода за зубами. Термин "средство для ухода за зубами" при использовании во всем этом описании изобретения означает пасту, гель или жидкий состав. Средство для ухода за зубами может существовать в любой желательной форме, такой как зубная паста (включая пасты с глубокими полосками, поверхностными полосками, многослойные пасты, пасты, имеющие снаружи гелевое покрытие), зубной порошок, гранулы, жидкость для полоскания рта, зубной эликсир, пастилка, гель для зубов, периодонтальный гель, жидкость для подкрашивания зубной поверхности, жевательная резинка, растворимая, частично растворимая или нерастворимая пленка либо полоска, облатка, влажный платок или салфетка, имплантат, пена, лепешка, зубная нить, жидкость, предназначенная для внесения в полость рта из маленького портативного небулайзера (аэрозольного баллончика), жидкость, предназначенная для внесения в полость рта из маленькой портативной бутылочки-капельницы, мягкая жевательная таблетка ("жвачка") или любая комбинация этих форм. При использовании в этом документе термин "орально приемлемый носитель" относится к материалу или комбинации материалов, которые безопасны для использования в композициях, то есть соответствуют разумному соотношению между выгодой и риском.

При использовании в этом документе термины "орально приемлемый наполнитель" или "орально приемлемый носитель" относятся к любому наполнителю, полезному для составления любого из описанных выше средств для ухода за зубами. Подходящие орально приемлемые наполнители включают, например, один или более из следующих материалов: растворитель, щелочное вещество, увлажнитель, загуститель, сурфактант, абразив, антикалькулезное средство, пигмент, ароматизирующее средство, краситель, калийсодержащую соль, антибактериальное средство, десенсибилизирующие средства, средства, уменьшающие появление пятен и изменение цвета зубов, а также их смеси.

В некоторых вариантах осуществления изобретения также предлагается композиция, выбранная из группы, состоящей из: пастилки, мятной лепешки, гранул, облатки, маленького портативного небулайзера, содержащего указанную смесь в жидкой форме, предназначенной для внесения в полость рта в виде аэрозоля, маленькой портативной бутылочки, содержащей указанную смесь в жидкой форме, предназначенной для внесения в полость рта в виде капель, и мягкой жевательной таблетки.

Недиализируемый материал (НДМ) из клюквенного экстракта получают из концентрата клюквенного сока. Клюквенный сок содержит вещества высокого молекулярного веса (НДМ), которые подавляют адгезию бактерий к клеткам-хозяевам, а также коагрегацию многих оральных бактерий. НДМ из клюквенного экстракта получали в соответствии с методикой, описанной Weiss E, Lev-Dor, R., Kashmamn, Y., Goldhar, J. Sharon, N., Ofek, Itzhak, J. Am. Dent. Assoc. 129, 1719 (1998).

Ацетил-кето-β-босвеллиевая кислота (АКББК) представляет собой полезное активное соединение, выделенное из растения Boswellia и обладающее антибактериальной, противовоспалительной и антиоксидантной активностью. Boswellia представляет собой род деревьев, вырабатывающих экстракты, которые обладают противовоспалительными свойствами, включая соединения босвеллиевой кислоты. Подходящие экстракты вырабатывают, например, Boswellia sacra, B.frereana, B. serrate и B. papyrifera, а также их подвиды.

Ресвератрол (3,5,4'-тригидроксистильбен), родительское соединение семейства молекул, включающего глюкозиды и полимеры, является мощным антагонистом АГР (арил-гидрокарбоновых рецепторов), как это описано во французской патентной заявке № 9805673, зарегистрированной 5 мая 1998 г. Он представляет собой противогрибковое средство или фитоалексин и вырабатывается растениями, классифицированными как сперматофиты, важнейшими представителями которого считаются виноград, арахис и сосна (Soleas et al., 1997, Clin Biochemistry, 30:91-113). Как антагонист АГР ресвератрол, химическое название которого - 3,5,4'-тригиброксистильбен, в общем и целом полезен для предупреждения токсических эффектов, связанных с воздействием окружающей среды на лиганды АГР, включая, например, галогенированные и полициклические арил-углеводороды, полиароматические углеводороды и полихлорированные бифенилы. В дополнение к этому было продемонстрировано, что ресвератрол предупреждает индукцию провоспалительного цитокина IL-1 бета лигандами АГР (Casper et al. 1999, Molecular Pharmacology, 56:784-790).

Способы применения

Некоторые варианты осуществления изобретения связаны со способами лечения патологических состояний, ассоциированных с аномальной экспрессией ММП-13, которые заключаются во введении нуждающемуся в этом животному терапевтически эффективного количества ингибитора ММП-13. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция пригодна для введения в ротовую полость животного.

В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагается применение ингибитора ММП-13 в производстве лекарственного средства для лечения патологических состояний, связанных с аномальной экспрессией ММП-13.

В других вариантах осуществления изобретения ингибитор ММП-13 выбирают из группы, состоящей из НДМ клюквенного экстракта, ацетил-кето-β-босвеллиевой кислоты, ресвератрола, 2-изопропил-5-метилциклогексил 2-гидроксифенилкарбамата, 4-ацетамидофенил 2-изопропил-5-метилциклогексилкарбоната и комбинации двух или более этих веществ. В некоторых вариантах осуществления изобретения патологическое состояние, связанное с экспрессией ММП-13, выбирают из периодонтального заболевания, разрушения внеклеточного матрикса, подвижности зубов, кариеса, потери фиксации, выпадения зубов, формирования карманов или потери костной ткани.

ПРИМЕРЫ

Паратиреоидный гормон (ПТГ) стимулирует транскрипцию ММП-13. Экспериментальный способ использует ПТГ для стимуляции ММП-13 в клетках UMR 106-01, которые представляют собой клетки, полученные из линии остеобластных клеток крысы. Клеточная линия UMR 106-01 обеспечивает полезную модельную систему для изучения воздействий ПТГ на остеобласты in vitro. См., например, Qin, L. et al. Journal of Biological Chemistry, 278(22), 19723 (2003).

Материал

Паратиреоидный гормон (крысиный ПТГ 1-34) был закуплен в компании Sigma.

Клеточная культура

Клетки UMR 106-01 культивировали в минимальной питательной среде Игла (EMEM) с добавлением 25 мM Hepes pH 7,4, 1% заменимых аминокислот, 100 единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 5% эмбриональной телячьей сыворотки.

Количественная ОТ-ПЦР в реальном масштабе времени

Клетки UMR 06-01 были высеяны в 12-луночные планшеты и культивированы 2-3 дня в питательной среде для культивирования клеток. После слияния клеток культуральную среду заменяли на 1% эмбриональную телячью сыворотку (не 5% эмбриональную телячью сыворотку) для голодания клеток в течение ночи. Клетки преинкубировали с активным ингредиентом в течение 15 минут, а затем инкубировали с ПТГ (10^-8 M) в течение 4 часов.

Тотальную РНК из клеток UMR 106-01, стимулированную с ПТГ или без ПТГ, выделяли с реактивом TRIzol. Тотальную РНК (0,1 мкг) обратно транскрибировали в кДНК с набором Superscript компании Invitrogen в соответствии с инструкциями производителя. ПЦР проводили на кДНК, используя праймеры, последовательности которых перечислены ниже. Все амплификации проводили, добавляя 2,5 мкл кДНК к смеси ПЦР (22,5 мкл), содержащей каждый праймер (0,2 мкМ) и 12,5 мкл смеси Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG (Invitrogen). Реакции преинкубировали при 50°C в течение 2 минут для деконтаминации dU-содержащей ДНК посредством UDG, а затем при 95°C в течение 2 минут для инактивации UDG и активации Taq. Программу ПЦР продолжали, выполняя 49 циклов денатурации при 95°C в течение 15 секунд, отжига и элонгации праймеров при 60°C в течение 30 секунд. Относительную квантификацию экспрессии гена проводили, используя метод 2-delta delta CT, при этом кратные изменения в экспрессии гена определяли относительно контрольных образцов. Все образцы были нормализованы по β-актину.

Последовательности праймеров

Крысиный ген ММП-13

5'-GCCCTATCCCTTGATGCCATT-3' (смысловой)

5'-ACAGTTCAGGCTCAACCTGCTG-3 ' (антисмысловой)

Крысиный β-актин

5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3' (смысловой)

5'-ACCCTCATAGATGGGCACAG-3' (антисмысловой)

Пример 1

Был протестирован ингибирующий эффект недиализируемого материала (НДМ) из клюквенного экстракта в отношении стимулированной ПТГ экспрессии ММП-13.

НДМ из клюквенного экстракта приготовили способом, описанным Weiss, et al, J. Am. Dent. Assoc. 129(12), 1719 (1998). НДМ из экстракта клюквы получали, диализируя клюквенный сок через отсекающий диализный мешок высокого молекулярного веса. Остающееся в мешке вещество, которое не выходит наружу, представляет собой недиализируемый материал (НДМ).

НДМ из клюквенного экстракта в концентрации 10 част./млн., 4 част./млн. и 1 част./млн. в простом растворе проявлял ингибиторную активность в отношении ММП-13. Кратность изменений экспрессии гена ММП-13 относительно контрольного образца показана в таблице 1.

Таблица 1
	Средняя	Стандартное отклонение
Отрицательный контроль	1,07	0,35
ПТГ	72,88	2,01
Клюквенный НДМ 10 част./млн.	0,78	0,32
Клюквенный НДМ 4 част./млн.	1,22	0,15
Клюквенный НДМ 1 част./млн.	2,57	1,41
ПТГ + клюквенный НДМ 10 част./млн.	33,03	11,04
ПТГ + клюквенный НДМ 4 част./млн.	46,72	9,27
ПТГ + клюквенный НДМ 1 част./млн.	54,49	5,86

Результаты, показанные в таблице 1, демонстрируют, что НДМ из клюквенного экстракта снижает экспрессию гена ММП-13, стимулированную ПТГ. Это позволяет предположить, что НДМ из клюквенного экстракта предупреждает разрушение матрикса за счет снижения экспрессии ММП-13.

Пример 2

Был протестирован ингибиторный эффект АКББК в отношении стимулированной ПТГ экспрессии ММП-13. АКББК закупали в корпорации Sabinsa.

АКББК в концентрации 10 част./млн. в простом растворе демонстрировала ингибирующую активность в отношении ММП-13, что показано в таблице 2. Кратность изменений экспрессии гена ММП-13 относительно контрольного образца показана в таблице 2.

Таблица 2
	Средняя	Стандартное отклонение
Отрицательный контроль	0,89	0,25
ПТГ	406,05	122,16
АКББК 10 част./млн.	1,45	0,62
ПТГ + АКББК 10 част./млн.	59,77	18,33

Результаты, показанные в таблице 2, демонстрируют, что АКББК снижает экспрессию гена ММП-13, стимулированную ПТГ. Это позволяет предположить, что АКББК предупреждает разрушение матрикса за счет снижения экспрессии ММП-13.

Пример 3

Ресвератрол (3,5,4'-тригидростильбен) представляет собой полифенольное соединение, обнаруживаемое в винограде, особенно в его кожуре и семенах. Ресвератрол закупали в корпорации Sabinsa.

Ресвератрол в концентрации 100 част./млн., 50 част./млн., 10 част./млн., 1 част./млн. и 0,1 част./млн. в простом растворе демонстрировал ингибирующую активность в отношении ММП-13 (таблица 3). Кратность изменений экспрессии гена ММП-13 относительно контрольного образца показана в таблице 3.

Таблица 3
	Средняя	Стандартное отклонение
Отрицательный контроль	0,68	0,28
ПТГ	54,64	6,03
Ресвератрол 100 част./млн.	1,09	0,04
Ресвератрол 50 част./млн.	0,38	0,22
Ресвератрол 10 част./млн.	0,65	0,09
Ресвератрол 1 част./млн.	0,71	0,06
Ресвератрол 0,1 част./млн.	1,07	0,24
ПТГ + ресвератрол 100 част./млн.	0,65	0,24
ПТГ + ресвератрол 50 част./млн.	0,91	0,79
ПТГ + ресвератрол 10 част./млн.	1,86	0,69
ПТГ + ресвератрол 1 част./млн.	19,97	1,81
ПТГ + ресвератрол 0,1 част./млн.	46,02	5,78

Результаты, показанные в таблице 3, демонстрируют, что ресвератрол снижает экспрессию гена ММП-13, стимулированную ПТГ. Это позволяет предположить, что ресвератрол предупреждает разрушение матрикса за счет снижения экспрессии ММП-13.

Пример 4

Соединение A (2-изопропил-5-метилциклогексил 2-гидроксифенилкарбамат) имеет следующую характерную структуру:

Соединение A в концентрации 7 част./млн. в простом растворе демонстрировало ингибирующую активность в отношении ММП-13 (таблица 4). Кратность изменений экспрессии гена ММП-13 относительно контрольного образца показана в таблице 4.

Таблица 4
	Средняя	Стандартное отклонение
Отрицательный контроль	1,19	0,16
ПТГ	445,18	111,95
Соединение A (7 част./млн.)	7,41	2,65
ПТГ + соединение A (7 част./млн.)	14,674	3,68

Результаты, показанные в таблице 4, демонстрируют, что соединение A снижает экспрессию гена ММП-13, стимулированную ПТГ. Это позволяет предположить, что соединение A предупреждает разрушение матрикса за счет снижения экспрессии ММП-13.

Пример 5

Соединение B (4-ацетамидофенил 2-изопропил-5-метилциклогексил карбонат) имеет следующую характерную структуру:

Соединение B в концентрации 10 част./млн. в простом растворе демонстрировало ингибирующую активность в отношении ММП-13 (таблица 5). Кратность изменений экспрессии гена ММП-13 относительно контрольного образца показана в таблице 5.

Таблица 5
	Средняя	Стандартное отклонение
Отрицательный контроль	1,24	0,24
ПТГ	257,03	20,82
Соединение B (10 част./млн.)	5,78	1,94
ПТГ + соединение B (10 част./млн.)	49,86	25,03

Результаты, показанные в таблице 5, демонстрируют, что соединение B снижает экспрессию гена ММП-13, стимулированную ПТГ. Поскольку уровень ММП-13 коррелируется с периодонтальными клиническими показателями, можно предположить, что соединение B предупреждает разрушение матрикса за счет снижения уровня ММП-13, стимулированной паратиреоидным гормоном (ПТГ).

Claims

1. Применение 4-ацетамидофенил 2-изопропил-5-метилциклогексилкарбоната в производстве лекарственного средства для лечения состояния, связанного с повышенной экспрессией ММП-13, которое выбирают из группы, состоящей из потери фиксации одного или более зубов, выпадения зубов, подвижности зубов, образования карманов, потери костной ткани и комбинации двух и более указанных состояний.

2. Композиция для ухода за зубами, содержащая терапевтически эффективное количество ингибитора ММП-13 и орально приемлемый носитель, где ингибитор ММП-13 представляет собой 4-ацетамидофенил 2-изопропил-5-метилциклогексилкарбонат.

3. Композиция для ухода за зубами по п. 2, где композиция представлена в форме, которую выбирают из группы, состоящей из: зубной пасты, зубной пасты с глубокими полосками, зубной пасты с поверхностными полосками, многослойной зубной пасты, зубной пасты, имеющей снаружи гелевое покрытие, зубного порошка, гранул, жидкости для полоскания рта, зубного эликсира, пастилки, геля для зубов, периодонтального геля, жидкости для подкрашивания зубной поверхности, жевательной резинки, растворимой, частично растворимой или нерастворимой пленки или полоски, облатки, влажного платка или салфетки, имплантата, пены, лепешки, зубной нити, жидкости, предназначенной для внесения в полость рта из маленького портативного небулайзера, жидкости, предназначенной для внесения в полость рта из маленькой портативной бутылочки-капельницы, мягкой жевательной таблетки или их комбинации из двух или более.