RU2549712C1 - METHOD OF ISOLATION OF SECRETION INHIBITOR OF SIDEROPHORES SYNTHESISED BY PGM-STRAINS Y. pestis AND ISOLATED INHIBITOR - Google Patents
METHOD OF ISOLATION OF SECRETION INHIBITOR OF SIDEROPHORES SYNTHESISED BY PGM-STRAINS Y. pestis AND ISOLATED INHIBITOR Download PDFInfo
- Publication number
- RU2549712C1 RU2549712C1 RU2013152473/10A RU2013152473A RU2549712C1 RU 2549712 C1 RU2549712 C1 RU 2549712C1 RU 2013152473/10 A RU2013152473/10 A RU 2013152473/10A RU 2013152473 A RU2013152473 A RU 2013152473A RU 2549712 C1 RU2549712 C1 RU 2549712C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ssi
- pestis
- centrifugation
- bacteria
- chloroform
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается поиска новых подходов к созданию антибактериальных препаратов, которые ингибируют такие существенные для патогенных бактерий свойства, как секреция сидерофоров, аутоагглютинация и вирулентность для животных.The invention relates to medical microbiology and concerns the search for new approaches to the creation of antibacterial drugs that inhibit properties essential for pathogenic bacteria, such as siderophore secretion, autoagglutination and virulence for animals.
В настоящее время в стратегии борьбы с инфекциями внимание исследователей привлекает процесс ассимиляции бактериями железа, в частности сидерофоры - низкомолекулярные хелаторы железа, используемые патогенными бактериями для извлечения железа из его комплексов с белками в организме хозяина. Сидерофоры являются признанными факторами вирулентности многих патогенных бактерий. Не исключением является и возбудитель чумы (Yersinia pestis), которому сидерофор иерсиниабактин (Ybt) необходим для роста в железодефицитных условиях при 37°C и проявления высокой вирулентности для лабораторных животных [1].Currently, researchers are attracting the attention of researchers to the process of assimilation of iron by bacteria, in particular siderophores - low molecular weight chelators of iron used by pathogenic bacteria to extract iron from its complexes with proteins in the host body. Siderophores are recognized virulence factors of many pathogenic bacteria. The plague pathogen (Yersinia pestis), for which siderophore yersiniabactin (Ybt) is necessary for growth under iron deficiency conditions at 37 ° C and the manifestation of high virulence for laboratory animals, is no exception [1].
Известны синтетические ингибиторы биосинтеза иерсиниабактина, которые обладали антибактериальной активностью против возбудителя чумы в железодефицитных условиях in vitro [2]. Данные о проверке эффективности этих препаратов на модели животных в литературе отсутствуют. Разработка этих препаратов была основана на представлении, что млекопитающие не синтезируют сидерофоры, и, следовательно, процесс ингибирования их синтеза представлялся специфичным для бактерий. Однако в 2010 г. сидерофоры и ферменты их биосинтеза, сходные с таковыми у бактерий, были обнаружены и у млекопитающих [3]. Было установлено, что сидерофоры млекопитающих образуют так называемый лабильный пул внутриклеточного железа, необходимый для образования реактивных соединений кислорода иммунокомпетентными клетками. Отсутствие у животных способности синтезировать эти сидерофоры приводило к нарушению метаболизма железа и повышению чувствительности к бактериальным инфекциям. Эти данные свидетельствуют о том, что терапевтическое применение ингибиторов, воздействующих на этап синтеза сидерофоров, может иметь побочные эффекты.Synthetic inhibitors of yersiniabactin biosynthesis are known that have antibacterial activity against the causative agent of plague in iron-deficient conditions in vitro [2]. There are no data on the verification of the effectiveness of these drugs on animal models in the literature. The development of these drugs was based on the notion that mammals do not synthesize siderophores, and therefore the process of inhibiting their synthesis seemed specific to bacteria. However, in 2010 siderophores and enzymes of their biosynthesis, similar to those in bacteria, were also found in mammals [3]. It was found that mammalian siderophores form the so-called labile pool of intracellular iron, which is necessary for the formation of reactive oxygen compounds by immunocompetent cells. The lack of ability of animals to synthesize these siderophores in animals led to disruption of iron metabolism and increased sensitivity to bacterial infections. These data indicate that the therapeutic use of inhibitors acting on the siderophore synthesis step can have side effects.
Наиболее близкой к предмету предлагаемого изобретения является работа [4], в которой получены первые сведения о том, что аттенуированные бактерии, которые с высокой частотой образуются в популяции эпидемических штаммов Y.pestis, синтезируют природный ингибитор сидерофорной активности. В этой работе авторы показали, что мутанты Y.pestis, в которых произошла делеция хромосомного pgm локуса (pgm- штаммы), кодирующего белки биосинтеза и транспорта сидерофора иерсиниабактина, не только не проявляют активности на индикаторной среде для выявления сидерофоров, но и выделяют в среду вещество, ингибирующее сидерофорную активность pgm+ штаммов. Однако это вещество не было выделено и охарактеризовано.Closest to the subject of the present invention is the work [4], in which the first information was obtained that attenuated bacteria that form with high frequency in the population of epidemic strains of Y. pestis synthesize a natural inhibitor of siderophore activity. In this paper, the authors showed that the mutants of Y.pestis, in which there was a deletion of the chromosomal locus pgm (pgm - strains) encoding biosynthesis and transport proteins siderophore iersiniabaktina, not only are not active on the test medium for detection of siderophores, but isolated in the environment a substance that inhibits siderophore activity of pgm + strains. However, this substance has not been isolated and characterized.
Проведенное авторами предлагаемого изобретения изучение этого ингибитора показало, что он влияет не на синтез, а на выделение сидерофоров в среду различными штаммами Y.pestis, и поэтому он был назван ингибитором секреции сидерофоров (siderophore secretion inhibitor, SSI).A study of this inhibitor carried out by the inventors of the invention showed that it does not affect synthesis, but on the release of siderophores into the environment by different strains of Y. pestis, and therefore it was called a siderophore secretion inhibitor (SSI).
Техническая задача предлагаемого изобретения состояла в разработке способа выделения ингибитора секреции сидерофоров (SSI) как препарата, снижающего вирулентность Y.pestis.The technical task of the invention was to develop a method for isolating siderophore secretion inhibitor (SSI) as a drug that reduces the virulence of Y. pestis.
Поставленная задача достигается тем, что способ выделения ингибитора секреции сидерофоров, синтезируемого pgm- штаммами Y.pestis, включает следующие стадии:The problem is achieved in that the method of isolation of the siderophore secretion inhibitor synthesized by pgm - Y.pestis strains includes the following stages:
а) в качестве штамма-продуцента используют штамм Y.pestis КМ 1279 (депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб»), который получен из pgm- вакцинного штамма Y.pestis EV76;a) as a producer strain, use strain Y.pestis KM 1279 (deposited in the State collection of pathogenic bacteria "Microbe"), which is obtained from pgm - vaccine strain Y.pestis EV76;
б) штамм Y.pestis КМ 1279 засевают петлей в 5 мл среды LB и выращивают в термостате при 26°C 48 час;b) strain Y. pestis KM 1279 seeded with a loop in 5 ml of LB medium and grown in an incubator at 26 ° C for 48 hours;
в) по 0,2 мл культуры засевают на 10 чашек Петри с 1,5% агаром LB (pH 7,2) и выращивают при 26°C в течение 48 час;c) 0.2 ml of culture is seeded in 10 Petri dishes with 1.5% LB agar (pH 7.2) and grown at 26 ° C for 48 hours;
г) бактерии смывают с поверхности агара холодным (4°C) забуференным фосфатом физраствором (ЗФР) и осаждают их центрифугированием (8000 об/мин) на холоду (4°C) в течение 15 минут;d) bacteria are washed off the agar surface with cold (4 ° C) phosphate-buffered saline (PBS) and precipitated by centrifugation (8000 rpm) in the cold (4 ° C) for 15 minutes;
д) бакмассу в количестве 10 г дважды отмывают от остатков питательной среды, суспендируя бактерии в ЗФР и осаждая их центрифугированием (8000 об/мин) на холоду (4°C) в течение 15 минут;e) 10 g of Bakmass is washed twice from the residues of the nutrient medium, suspending the bacteria in PBS and precipitating them by centrifugation (8000 rpm) in the cold (4 ° C) for 15 minutes;
е) клеточный осадок суспендируют в 100 мл раствора 5 мМ NaOH (рН 9,0), выдерживают, периодически встряхивая, при 37°C два часа и отделяют клетки центрифугированием (8000 об/мин) при 20°C в течение 15 минут, супернатант отбирают и процедуру повторяют трижды;f) the cell pellet is suspended in 100 ml of a solution of 5 mM NaOH (pH 9.0), incubated periodically by shaking at 37 ° C for two hours and the cells are separated by centrifugation (8000 rpm) at 20 ° C for 15 minutes, supernatant selected and the procedure is repeated three times;
ж) три супернатанта в объеме 300 мл объединяют и фильтруют через нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор 0,22 мкм и получают щелочной раствор, в котором содержится ингибитор;g) three supernatants in a volume of 300 ml are combined and filtered through a nitrocellulose membrane with a pore diameter of 0.22 μm to obtain an alkaline solution containing an inhibitor;
з) щелочной раствор трехкратно экстрагируют смесью хлороформ-метанол-вода (5:2:1) в количестве 50 мл, разделяя хлороформную и водно-метанольную фракции путем центрифугирования при 8000 об/мин 10 мин;h) the alkaline solution is extracted three times with a mixture of chloroform-methanol-water (5: 2: 1) in an amount of 50 ml, separating the chloroform and water-methanol fractions by centrifugation at 8000 rpm for 10 minutes;
и) хлороформные фракции отбирают, объединяют и освобождают от водорастворимых примесей путем экстракции водой, водную фракцию отделяют центрифугированием при 8000 об/мин 10 мин и удаляют;i) chloroform fractions are collected, combined and freed from water-soluble impurities by extraction with water, the aqueous fraction is separated by centrifugation at 8000 rpm for 10 minutes and removed;
к) хлороформную фракцию высушивают в вакуумном роторном испарителе и получают 10 мг сухого препарата.j) the chloroform fraction is dried in a vacuum rotary evaporator and 10 mg of a dry preparation is obtained.
Кроме того, ингибитор секреции сидерофоров, который расположен на поверхности бактерий Y.pestis и присутствие которого коррелирует со способностью клетки чумного микроба к блокировке сидерофорной активности и снижению аутоагглютинации бактерий, характеризуется:In addition, an inhibitor of siderophore secretion, which is located on the surface of Y. pestis bacteria and whose presence correlates with the ability of a plague microbe cell to block siderophore activity and reduce bacterial autoagglutination, is characterized by:
- молекулярной массой 380,6 Да;- molecular weight of 380.6 Da;
- присутствием ионов железа;- the presence of iron ions;
- флуоресценцией в ультрафиолете;- fluorescence in ultraviolet;
- липопептидной природой;- lipopeptide nature;
- гидрофобными свойствами;- hydrophobic properties;
- коричневой окраской сухих кристаллов.- brown color of dry crystals.
Способ выделения SSI осуществляется следующим образом.The method of allocating SSI is as follows.
В качестве штамма-продуцента SSI используют штамм Y.pestis КМ 1279 (депонирован заявителями в Государственной коллекции патогенных бактерий ФГУЗ Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» Роспотребнадзора). Штамм получен из pgm- штамма Y.pestis EV76 путем удаления из него трех характерных для возбудителя чумы плазмидных репликонов. Способ выделения SSI из штамма Y.pestis КМ 1279 включает следующие технические приемы:As the producer strain SSI, strain Y. pestis KM 1279 is used (deposited by applicants in the State collection of pathogenic bacteria of the Federal State Health Institution of the Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe" of Rospotrebnadzor). The strain was obtained from pgm - strain Y.pestis EV76 by removing from it three plasmid replicons characteristic of the plague pathogen. The method for isolating SSI from strain Y. pestis KM 1279 includes the following techniques:
I - получение бактериальной массы;I - obtaining a bacterial mass;
II - выделение SSI;II - allocation of SSI;
III - очистка препарата.III - purification of the drug.
Первый прием состоит в получении бактериальной массы штамма-продуцента SSI. С этой целью штамм Ypestis КМ 1279 предварительно засевают петлей в 5 мл среды LB (Difco, США) и выращивают в термостате при 26°C 48 час. После этого по 0,2 мл культуры засевают на 10 чашек Петри с 1,5% агаром LB (pH 7,2) и выращивают при 26°C на протяжении 48 час. Затем бактерии смывают с поверхности агара холодным (4°C) забуференным фосфатом физраствором (ЗФР) и осаждают их центрифугированием (8000 об/мин) на холоду (4°C) в течение 15 минут. Далее 10 г бакмассы дважды отмывают от остатков питательной среды, суспендируя бактерии в ЗФР и осаждая их центрифугированием (8000 об/мин) на холоду (4°C) в течение 15 минут.The first trick is to get the bacterial mass of the SSI producer strain. To this end, the strain Ypestis KM 1279 is pre-inoculated with a loop in 5 ml of LB medium (Difco, USA) and grown in an incubator at 26 ° C for 48 hours. After that, 0.2 ml of culture is seeded in 10 Petri dishes with 1.5% LB agar (pH 7.2) and grown at 26 ° C for 48 hours. The bacteria are then washed off the agar surface with cold (4 ° C) phosphate-buffered saline (PBS) and pelleted by centrifugation (8000 rpm) in the cold (4 ° C) for 15 minutes. Then 10 g of Bakmassa are washed twice from the remains of the nutrient medium, suspending the bacteria in PBS and precipitating them by centrifugation (8000 rpm) in the cold (4 ° C) for 15 minutes.
Второй прием заключается в смыве SSI с поверхности бактерий. Для этого полученный клеточный осадок суспендируют в 100 мл раствора 5 мМ NaOH (pH 9,0), выдерживают, периодически встряхивая, при 37°C два часа. После этого отделяют клетки центрифугированием (8000 об/мин) при 20°C в течение 15 минут, супернатант отбирают и процедуру повторяют трижды. Затем три супернатанта объединяют и фильтруют через нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор 0,22 мкм и получают щелочной раствор, в котором содержится SSI.The second technique is to flush SSI off the surface of bacteria. For this, the resulting cell pellet is suspended in 100 ml of a solution of 5 mM NaOH (pH 9.0), incubated periodically by shaking at 37 ° C for two hours. After that, the cells are separated by centrifugation (8000 rpm) at 20 ° C for 15 minutes, the supernatant is selected and the procedure is repeated three times. Then the three supernatants are combined and filtered through a 0.22 μm nitrocellulose membrane to give an alkaline solution containing SSI.
Третий прием представляет собой очистку препарата. Для этого к полученному щелочному раствору добавляют 50 мл смеси хлороформ-метанол-вода в соотношении (5:2:1) и проводят трехкратную экстракцию SSI. Хлороформную и водно-метанольную фракции разделяют путем центрифугирования при 8000 об/мин 10 мин. После этого хлороформные фракции отбирают, объединяют и освобождают от водорастворимых примесей путем экстракции водой, водную фракцию отделяют центрифугированием при 8000 об/мин 10 мин и удаляют. Затем хлороформную фракцию высушивают в вакуумном роторном испарителе и получают 10 мг сухого препарата SSI, представляющего собой кристаллы коричневого цвета.The third method is the purification of the drug. To this end, 50 ml of a mixture of chloroform-methanol-water in a ratio of (5: 2: 1) are added to the obtained alkaline solution, and SSI is extracted three times. The chloroform and water-methanol fractions are separated by centrifugation at 8000 rpm for 10 minutes After that, the chloroform fractions are collected, combined and freed from water-soluble impurities by extraction with water, the aqueous fraction is separated by centrifugation at 8000 rpm for 10 minutes and removed. Then the chloroform fraction is dried in a vacuum rotary evaporator and get 10 mg of a dry preparation of SSI, which is a brown crystal.
Характеристика физико-химических свойств SSICharacterization of the physicochemical properties of SSI
Полученный препарат SSI характеризуется следующими свойствами: а) сухой препарат SSI представляет собой кристаллы коричневого цвета, обладающие гидрофобными свойствами, поскольку не растворяются в воде, но растворяются в органических растворителях (этаноле, этилацетате, ацетоне, хлороформе, бензоле);The obtained SSI preparation is characterized by the following properties: a) a dry SSI preparation is brown crystals with hydrophobic properties, since it does not dissolve in water, but dissolves in organic solvents (ethanol, ethyl acetate, acetone, chloroform, benzene);
б) SSI является флуоресцирующим низкомолекулярным веществом липопептидной природы (пример 1);b) SSI is a fluorescent low molecular weight substance of lipopeptide nature (example 1);
в) SSI имеет молекулярную массу 380,6 Да (пример 2);c) SSI has a molecular weight of 380.6 Da (example 2);
г) в состав SSI входят ионы железа, которые выявляются в препарате после его обработки 30 мМ НСl (пример 3).g) the composition of the SSI includes iron ions, which are detected in the preparation after its treatment with 30 mm Hcl (example 3).
Таким образом, анализ физико-химических свойств полученного с помощью вышеописанного метода препарата показал, что SSI является низкомолекулярным, гидрофобным, флуоресцирующим веществом липопептидной природы. Присутствие ионов железа, которые выявляются только после обработки препарата кислотой, свидетельствует о том, что SSI представляет собой связанный с железом хелатор.Thus, the analysis of the physicochemical properties of the preparation obtained using the above method showed that SSI is a low molecular weight, hydrophobic, fluorescent substance of lipopeptide nature. The presence of iron ions, which are detected only after treatment of the drug with acid, indicates that SSI is a chelator associated with iron.
Характеристика функциональных свойств SSISSI functional characteristics
Использование выделенного препарата в микробиологических экспериментах и в опытах по заражению лабораторных животных бактериями высоковирулентного штамма Y.pestis позволило выявить у SSI следующие функциональные свойства:The use of the isolated preparation in microbiological experiments and in experiments on the infection of laboratory animals with bacteria of the highly virulent strain of Y. pestis revealed the following functional properties in SSI:
а) в присутствии SSI бактерии pgm+ штаммов Y.pestis, проявляющие сидерофорную активность на индикаторной среде для выявления сидерофоров, утрачивают способность выделять сидерофоры в среду (пример 4);a) in the presence of SSI, the bacteria pgm + of Y. pestis strains that show siderophore activity on an indicator medium for detecting siderophores lose their ability to excrete siderophores into the medium (example 4);
б) препарат SSI снижает аутоагглютинацию pgm+ бактерий Y.pestis, характеризующихся, в отличие от pgm- бактерий, высокой способностью к агрегации даже в дистиллированной воде (пример 5);b) preparation SSI reduces autoagglutination pgm + Y.pestis bacteria characterized unlike pgm - bacteria, a high capacity for aggregation even in distilled water (Example 5);
в) при введении препарата мышам вместе с высоковирулентным штаммом Y.pestis 231 SSI снижает способность штамма вызывать летальное заболевание животных (пример 6).c) when the drug is administered to mice, together with the highly
Следовательно, анализ функциональных свойств SSI показал, что он не только ингибирует выделение в среду сидерофоров, но и тормозит аутоагглютинацию бактерий, а также их вирулентность для мышей.Therefore, the analysis of the functional properties of SSI showed that it not only inhibits the release of siderophores into the medium, but also inhibits the autoagglutination of bacteria, as well as their virulence for mice.
Пример 1. Свидетельствующий о чистоте препарата и о липопептидной природе SSIExample 1. Evidence of the purity of the drug and the lipopeptide nature of SSI
Изучение свойств полученного с помощью вышеописанного метода препарата SSI путем гель-электрофореза и тонкослойной хроматографии было проведено при использовании в качестве контроля препарата сидерофора иерсиниахелина (Ych). Препарат Ych получают из штамма Y.pestis КМ 1279, как описано ранее [5]. Анализ препаратов SSI и Ych с помощью гель-электрофореза в полиакриламидном геле показал, что в низкомолекулярной области SSI дает одну полосу, которая интенсивно флуоресцирует при облучении ультрафиолетом с длиной волны 254 нм (см. фото 1А, где 1 - SSI ДО мкг, 2 - Ych, 10 мкг).The study of the properties of the SSI preparation obtained using the above method by gel electrophoresis and thin-layer chromatography was carried out using siderophore yersiniaheline (Ych) as a control. The Ych preparation is obtained from strain Y. pestis KM 1279, as described previously [5]. Analysis of SSI and Ych preparations by gel electrophoresis in polyacrylamide gel showed that in the low molecular weight region, SSI gives one band that intensively fluoresces when irradiated with ultraviolet light at a wavelength of 254 nm (see photo 1A, where 1 is SSI DO μg, 2 - Ych, 10 mcg).
После окраски гелей универсальным красителем «Stains-all» в препарате SSI также выявлялась одна полоса, окрашивающаяся в характерный для липидов желтый цвет. При этом препарат Ych не обладал флуоресценцией и не окрашивался красителем «Stains-all».After staining the gels with the universal dye “Stains-all”, one band was also detected in the SSI preparation, staining in yellow, which is characteristic of lipids. Moreover, the Ych preparation did not possess fluorescence and was not stained with Stains-all dye.
Отсутствие в препарате SSI примесей также подтверждалось с помощью восходящей тонкослойной хроматографии на пластинах силикагеля и использования 80% этанола в качестве мобильной фазы (см. фото 1Б, где 1 - SSI, 1 мкг, 2 - Ych, 1 мкг). И в этом анализе в образцах, содержащих SSI, на хроматограммах обнаруживалось одно пятно с Rf 0,9, которое окрашивалось в парах йода и флуоресцировало при облучении ультрафиолетом. При этом препарат Ych, имевший Rf 0,7, окрашивался йодом, но не обладал флуоресцентными свойствами. После опрыскивания пластин 0,2%-ным раствором нингидрина в ацетоне (с последующим прогреванием при 110°C) SSI, но не Ych, окрашивался в фиолетовый цвет, характерный для α-аминокислот и содержащих их пептидов.The absence of impurities in the SSI preparation was also confirmed by upward thin layer chromatography on silica gel plates and the use of 80% ethanol as the mobile phase (see photo 1B, where 1 - SSI, 1 μg, 2 - Ych, 1 μg). And in this analysis, in samples containing SSI, one spot with Rf 0.9 was found in the chromatograms, which was stained in iodine vapor and fluorescent when irradiated with ultraviolet light. In this case, the Ych preparation, having Rf 0.7, was stained with iodine, but did not possess fluorescence properties. After spraying the wafers with a 0.2% solution of ninhydrin in acetone (followed by heating at 110 ° C), SSI, but not Ych, was colored in purple, characteristic of α-amino acids and their peptides.
Вывод: SSI представляет собой липопептид, содержащий в своем составе флюорофор.Conclusion: SSI is a lipopeptide containing a fluorophore.
Пример 2. Иллюстрирующий молекулярную массу SSIExample 2. Illustrative molecular weight SSI
Молекулярную массу SSI определяют с помощью времяпролетной масс-спектрометрии с ионизацией лазерной десорбцией при содействии матрицы (matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass-spectrometry, MALDI-TOF-MS). С этой целью используют масс-спектрометр Bruker Reflex III (Bruker Daltonics Coventry, UK). В качестве матрицы используют оксибензойную кислоту, на которую наносили препарат SSI, растворенный в этилацетате. Спектр зарегистрирован в виде положительно заряженных ионов в диапазоне m/z 100-6000. Анализ спектра (см. график на Фиг.1) показал, что молекулярный ион SSI соответствует m/z 380,6.The molecular weight of SSI is determined by time-of-flight mass spectrometry with laser desorption ionization using a matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass-spectrometry (MALDI-TOF-MS). For this purpose, a Bruker Reflex III mass spectrometer (Bruker Daltonics Coventry, UK) is used. As the matrix, oxybenzoic acid is used, on which the SSI preparation dissolved in ethyl acetate was applied. The spectrum is recorded as positively charged ions in the range m / z 100-6000. Spectrum analysis (see graph in FIG. 1) showed that the molecular ion SSI corresponds to m / z 380.6.
Вывод: SSI является низкомолекулярным веществом с молекулярной массой 380,6 Да.Conclusion: SSI is a low molecular weight substance with a molecular weight of 380.6 Da.
Пример 3. Доказывающий присутствие в SSI связанного железаExample 3. Proving the presence of bound iron in SSI
В препарате SSI, который обрабатывают 30 мМ соляной кислотой, в отличие от необработанного препарата, были обнаружены ионы железа с помощью коммерческого хромогенного хелатора железа хромазурола S (CAS). Отделяющиеся от SSI в кислой среде ионы железа окрашивали CAS-реагент в синий цвет. Фракционирование обработанного кислотой препарата SSI с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) показало, что он содержит две фракции (см. график на Фиг.2).In the SSI preparation, which is treated with 30 mM hydrochloric acid, unlike the untreated preparation, iron ions were detected using the commercial chromogenic iron chelator chromazurol S (CAS). Iron ions separated from SSI in an acidic medium stained the CAS reagent blue. Fractionation of the acid-treated SSI preparation by high performance liquid chromatography (HPLC) showed that it contains two fractions (see graph in FIG. 2).
На графике (Фиг.2): А. ВЭЖХ на колонке С-18-Nucleosil ODS. Элюент - раствор ацетонитрила с линейным градиентом концентрации (0-60%) в течение 30 мин. Б. MALDI-TOF - масс-спектры двух фракций SSI, полученных при ВЭЖХ.On the graph (Figure 2): A. HPLC on a C-18-Nucleosil ODS column. Eluent is a solution of acetonitrile with a linear concentration gradient (0-60%) for 30 minutes. B. MALDI-TOF — mass spectra of two SSI fractions obtained by HPLC.
Первая из них (1) обладала слабой флуоресценцией и не ингибировала секрецию сидерофоров, т.е. не обладала свойствами SSI. Во второй фракции (2) содержалось интенсивно флуоресцирующее в ультрафиолете вещество, поэтому его поглощение при 215 нм было значительно ниже, чем у вещества из первой фракции.The first of them (1) possessed weak fluorescence and did not inhibit siderophore secretion, i.e. did not have SSI properties. The second fraction (2) contained a substance that intensively fluoresces in the ultraviolet; therefore, its absorption at 215 nm was much lower than that of a substance from the first fraction.
При MALDI-TOF-MS (Фиг.2Б) вещество 1 имело m/z 302,63, а вещество 2 - 359,9. При этом вещество с m/z 359,9, в отличие от вещества с m/z 302,63, обладало всеми свойствами SSI. Разница в m/z исходного препарата SSI и его фракций в кислой среде, а также выявление в препарате, обработанном кислотой, ионов железа позволили заключить, что значение m/z 380,6 соответствует натриевой соли связанного с железом вещества (m/z 359,9), которое в кислой среде теряет железо (m/z 302,6).With MALDI-TOF-MS (Fig. 2B),
Вывод: SSI является связанным с железом хелатором железа.Conclusion: SSI is an iron-bound iron chelator.
Пример 4. Подтверждающий способность препарата SSI блокировать секрецию сидерофоров бактериями Y.PestisExample 4. Confirming the ability of the drug SSI to block the secretion of siderophores by bacteria Y. Pestis
Сидерофор-ингибирующая активность препарата была исследована при его добавлении к индикаторному штамму Y.pestis 336 (подвид caucasica) и высеве бактерий на индикаторную среду для выявления сидерофоров. Среда содержит хромогенный хелатор железа хромазурол S (CAS), который при 30%-ном насыщении железом имеет сине-зеленую окраску, изменяющуюся на желтую после удаления ионов железа сидерофорами. Штамм Y.pestis 336, в отличие от большинства штаммов Y.pestis, которые с высокой частотой утрачивают pgm локус, стабильно сохраняет pgm локус и сидерофорную активность на индикаторной среде. Добавление SSI в дозе 1-10 мкг к 10 мкл суспензии Y.pestis 336, содержащей 109 кл./мл, и посеве суспензии на CAS-агар выявило способность препарата блокировать выделение сидерофоров в среду. В отличие от контрольной культуры, не содержащей SSI, культура с SSI не образовывала зон просветления СAS-реактива вокруг посева (см. фото 2).The siderophore-inhibiting activity of the drug was investigated by adding it to the indicator strain Y. pestis 336 (subspecies caucasica) and plating bacteria on the indicator medium to detect siderophores. The medium contains the chromogenic iron chelator chromazurol S (CAS), which, at 30% iron saturation, has a blue-green color that changes to yellow after removal of the iron ions by siderophores. The strain Y. pestis 336, unlike most strains of Y. pestis, which lose the pgm locus with high frequency, stably maintains the pgm locus and siderophore activity on the indicator medium. Addition of SSI at a dose of 1-10 μg to 10 μl of a suspension of Y. pestis 336 containing 10 9 cells / ml and inoculation of the suspension on CAS agar revealed the ability of the drug to block the release of siderophores into the medium. In contrast to the control culture, which did not contain SSI, the culture with SSI did not form the clarification zones of the CAS reagent around the seeding (see photo 2).
На фото: 1. Y.pestis 336 - контроль без добавления SSI. 2. Y.pestis 336+1 мкг SSI. 3. Y.pestis 336+5 мкг SSI. 4. Y.pestis 336+10 мкг SSI.In the photo: 1. Y.pestis 336 - control without adding SSI. 2. Y. pestis 336 + 1 μg SSI. 3. Y. pestis 336 + 5 μg SSI. 4. Y. pestis 336 + 10 μg SSI.
Вывод: SSI блокирует секрецию сидерофоров бактериями Y.pestis.Conclusion: SSI blocks the secretion of siderophores by Y. pestis bacteria.
Пример 5. Демонстрирующий способность препарата SSI снижать аутоагглютинацию Y.pestis Влияние SSI на экспрессию признака аутоагглютинации было выявлено при сравнении изогенных pgm+ и pgm- клонов штамма Y.pestis TS. Оба типа клеток обладали этим признаком, хотя он был выражен у них в разной степени. Продуцирующие SSI pgrri клетки, образующие легко диспергируемые хлопья в жидкой среде, по сравнению с pgm+ клетками, обладают большей поверхностной гидрофобностью и агглютинировали только в солевых растворах. Более выраженной АА была у не продуцирующих SSI pgm+ клеток, которые образовывают прочные агрегаты даже в дистиллированной воде, в отличие от pgm- клеток. Анализ способности pgm+ бактерий проявлять аутоагглютинацию в воде показал, что в присутствии SSI, они теряли способность агглютинировать в воде (см. Фото 3).Example 5 demonstrates the ability of the drug to reduce SSI autoagglutination Y.pestis Effect on the expression of SSI autoagglutination feature was revealed by comparison of isogenic pgm + and pgm - Y.pestis TS strain clones. Both types of cells possessed this sign, although it was expressed in them to varying degrees. SSI-producing pgrri cells, which form easily dispersible flakes in a liquid medium, are more hydrophobic in comparison with pgm + cells and are agglutinated only in saline solutions. AA was more pronounced in non-SSI-producing pgm + cells, which form strong aggregates even in distilled water, in contrast to pgm - cells. Analysis of the ability of pgm + bacteria to exhibit autoagglutination in water showed that in the presence of SSI, they lost their ability to agglutinate in water (see Photo 3).
На фото: 1. Y.pestis TS - контроль без добавления SSI. 2. Y.pestis TS+1 мкг SSI. 3. Y.pestis TS+5 мкг SSI. 4. Y.pestis TS+10 мкг SSI.In the photo: 1. Y.pestis TS - control without adding SSI. 2. Y. pestis TS + 1 μg SSI. 3. Y. pestis TS + 5 μg SSI. 4. Y. pestis TS + 10 μg SSI.
После взаимодействия с SSI pgm+ бактерии агглютинируют только в солевых растворах, как и pgm- бактерии.After the interaction with the bacteria SSI pgm + agglutinate only in brines, like pgm - bacteria.
Вывод: SSI снижает способность Y.pestis к аутоагглютинации.Conclusion: SSI reduces the ability of Y.pestis to autoagglutinate.
Пример 6. Выявляющий ингибирующее действие SSI на вирулентность возбудителя чумыExample 6. Detecting the inhibitory effect of SSI on the virulence of the plague pathogen
Влияние SSI на вирулентность возбудителя чумы анализируют при использовании высоковирулентного штамма Y.pestis 231 (LD50 2,5±1,4 кл.). В этом эксперименте трем группам мышей вводят подкожно по 1000 бактерий (первая группа), 1000 бактерий +10 мкг SSI (вторая группа), а также 1000 бактерий +10 мкг SSI, инактивированного путем удаления из него железа в кислой среде методом экстракции препарата 8-оксихинолином (третья группа). Анализ количества павших в течение 21 дня (срок наблюдения) после заражения животных показал, что препарат SSI снижает способность штамма Y.pestis 231 вызывать летальную инфекцию у мышей. В трех независимых экспериментах добавление к бактериям активного препарата SSI за 30 мин перед заражением приводило к выживанию больше половины животных. При этом инактивированный препарат SSI, утративший связанное железо и способность ингибировать секрецию сидерофоров и аутоагглютинацию, не влиял на вирулентность. Все животные, зараженные Y.pestis вместе с этим препаратом, погибали в сроки, достоверно не отличавшиеся от таковых в контрольной группе (см. Фиг.3).The effect of SSI on the virulence of the plague pathogen is analyzed using a highly virulent strain of Y. pestis 231 (LD 50 2.5 ± 1.4 cells). In this experiment, 1000 bacteria (the first group), 1000 bacteria + 10 μg SSI (second group), and 1000 bacteria + 10 μg SSI inactivated by removing iron from it in an acidic medium by the extraction of 8- hydroxyquinoline (third group). Analysis of the number of deaths within 21 days (observation period) after infection of animals showed that the SSI preparation reduces the ability of
Вывод: SSI снижает вирулентность возбудителя чумы.Conclusion: SSI reduces the virulence of the plague pathogen.
Таким образом, выделенный с помощью вышеописанного способа препарат SSI обладает ингибирующим действием на такие существенные для патогенных бактерий свойства Y.pestis, как секреция сидерофоров, аутоагглютинация и вирулентность для лабораторных животных.Thus, the SSI preparation isolated using the above method has an inhibitory effect on Y. pestis properties essential for pathogenic bacteria, such as siderophore secretion, autoagglutination, and virulence for laboratory animals.
Полученные результаты позволяют заключить, что SSI, продуцируемый аттенуированными pgm- клетками и отсутствующий у вирулентных pgm+ бактерий Y.pestis, является природным регулятором вирулентности возбудителя чумы. Дальнейшее изучение этого регулятора будет способствовать расшифровке молекулярных механизмов регуляции патогенных свойств Y.pestis, а также разработке препаратов нового поколения для патогенетического лечения чумы. Ингибирование вирулентных свойств Y.pestis, ограничивающее размножение бактерий в организме хозяина, будет не только усиливать действие применяемых антибиотиков, но и обеспечит иммунной системе возможность эффективно элиминировать возбудителя. Создание подобных препаратов может расширить арсенал средств борьбы с чумой как при самостоятельном применении, так и в сочетании с регламентированной этиотропной терапией.The results obtained allow us to conclude that the SSI, produced attenuated pgm - cells and absent in pgm + Y.pestis virulent bacteria is a natural regulator of the virulence of the causative agent of plague. Further study of this regulator will help to decipher the molecular mechanisms of regulation of the pathogenic properties of Y. pestis, as well as the development of new generation drugs for the pathogenetic treatment of plague. Inhibition of the virulent properties of Y. pestis, limiting the growth of bacteria in the host organism, will not only enhance the action of the antibiotics used, but will also provide the immune system with the ability to effectively eliminate the pathogen. The creation of such drugs can expand the arsenal of means of combating plague both with independent use and in combination with regulated etiotropic therapy.
Источники информацииInformation sources
1. Perry R., Fetherston J. Yersiniabactin iron uptake: mechanisms and role in Yersinia pestis pathogenesis. Microb. Infect. 2011, 13, 808-817.1. Perry R., Fetherston J. Yersiniabactin iron uptake: mechanisms and role in Yersinia pestis pathogenesis. Microb. Infect. 2011, 13, 808-817.
2. Stirrett K.L, Ferreras J.A., Jayaprakash V., Sinha B.N., Rene Т., Quadri L.E., N. Small molecules with structural similarities to siderophores as novel antimicrobials against Mycobacterium tuberculosis and Yersinia pestis. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18, 2662-2668.2. Stirrett K.L., Ferreras J.A., Jayaprakash V., Sinha B.N., Rene T., Quadri L.E., N. Small molecules with structural similarities to siderophores as novel antimicrobials against Mycobacterium tuberculosis and Yersinia pestis. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18, 2662-2668.
3. Devireddy L.R., Hart D.O., Goetz D.H. and Green M.R. A mammalian siderophore synthesized by an enzyme with a bacterial homolog involved in enterobactin production. Cell. 2010, 141, 1006-1017.3. Devireddy L.R., Hart D.O., Goetz D.H. and Green M.R. A mammalian siderophore synthesized by an enzyme with a bacterial homolog involved in enterobactin production. Cell. 2010, 141, 1006-1017.
4. Подладчикова O.H., Иванова B.C., Еременко H.C., Лебедева C.A. Характеристика мутантов возбудителя чумы, различающихся по признаку пигментсорбции. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2003, 1, 26-31.4. Podladchikova O.H., Ivanova B.C., Eremenko H.C., Lebedeva C.A. Characterization of mutants of the plague pathogen, which differ in pigment absorption. Like gen., microbiol. and viral. 2003, 1, 26-31.
5. Podladchikova О., Rykova V., Antonenka U., Rakin A. Yersinia pestis autoagglutination is mediated by Hep-like protein and siderophore yersiniachelin. Adv. Exp. Med. Biol. 2012, 954, 289-292.5. Podladchikova O., Rykova V., Antonenka U., Rakin A. Yersinia pestis autoagglutination is mediated by Hep-like protein and siderophore yersiniachelin. Adv. Exp. Med. Biol. 2012, 954, 289-292.
Claims (2)
а) в качестве штамма-продуцента SSI используют штамм Y. pestis КМ 1279 (депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб»), который получен из pgm- вакцинного штамма Y. pestis EV76;
б) штамм Y. pestis КМ 1279 засевают петлей в 5 мл среды LB и выращивают в термостате при 26°C 48 час;
в) по 0,2 мл культуры засевают на 10 чашек Петри с 1,5% агаром LB (рН 7,2) и выращивают при 26°C в течение 48 час;
г) бактерии смывают с поверхности агара холодным (4°C) забуференным фосфатом физраствором (ЗФР) и осаждают их центрифугированием (8000 об/мин) на холоду (4°C) в течение 15 минут;
д) бакмассу (10 г) дважды отмывают от остатков питательной среды, суспендируя бактерии в ЗФР и осаждая их центрифугированием (8000 об/мин) на холоду (4°C) в течение 15 минут;
е) клеточный осадок суспендируют в 100 мл раствора 5 мМ NaOH (рН 9,0), выдерживают, периодически встряхивая, при 37°С два часа и отделяют клетки центрифугированием (8000 об/мин) при 20°С в течение 15 минут, супернатант отбирают и процедуру повторяют трижды;
ж) три супернатанта объединяют в объеме 300 мл и фильтруют через нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор 0,22 мкм и получают щелочной раствор, в котором содержится ингибитор;
з) щелочной раствор трехкратно экстрагируют смесью хлороформ-метанол-вода (5:2:1) в количестве 50 мл, разделяя хлороформную и водно-метанольную фракции путем центрифугирования при 8000 об/мин 10 мин;
и) хлороформные фракции отбирают, объединяют и освобождают от водорастворимых примесей путем экстракции водой, водную фракцию отделяют центрифугированием при 8000 об/мин 10 мин и удаляют;
к) хлороформную фракцию высушивают в вакуумном роторном испарителе и получают 10 мг сухого препарата.1. The method of isolation of the siderophore secretion inhibitor synthesized by pgm - strains of Y. pestis, comprising the following stages:
a) strain Y. pestis KM 1279 (deposited in the State collection of pathogenic bacteria "Microbe"), which is obtained from pgm - vaccine strain Y. pestis EV76, is used as an SSI producer strain;
b) strain Y. pestis KM 1279 seeded with a loop in 5 ml of LB medium and grown in an incubator at 26 ° C for 48 hours;
c) 0.2 ml of culture is seeded in 10 Petri dishes with 1.5% LB agar (pH 7.2) and grown at 26 ° C for 48 hours;
d) bacteria are washed off the agar surface with cold (4 ° C) phosphate-buffered saline (PBS) and precipitated by centrifugation (8000 rpm) in the cold (4 ° C) for 15 minutes;
e) Bakmass (10 g) is washed twice from the remains of the nutrient medium, suspending bacteria in PBS and precipitating them by centrifugation (8000 rpm) in the cold (4 ° C) for 15 minutes;
f) the cell pellet is suspended in 100 ml of a solution of 5 mM NaOH (pH 9.0), incubated periodically by shaking at 37 ° C for two hours and the cells are separated by centrifugation (8000 rpm) at 20 ° C for 15 minutes, supernatant selected and the procedure is repeated three times;
g) the three supernatants are combined in a volume of 300 ml and filtered through a nitrocellulose membrane with a pore diameter of 0.22 μm and an alkaline solution is obtained containing the inhibitor;
h) the alkaline solution is extracted three times with a mixture of chloroform-methanol-water (5: 2: 1) in an amount of 50 ml, separating the chloroform and water-methanol fractions by centrifugation at 8000 rpm for 10 minutes;
i) chloroform fractions are collected, combined and freed from water-soluble impurities by extraction with water, the aqueous fraction is separated by centrifugation at 8000 rpm for 10 minutes and removed;
j) the chloroform fraction is dried in a vacuum rotary evaporator and 10 mg of a dry preparation is obtained.
- молекулярной массой 380,6 Да;
- присутствием ионов железа;
- флуоресценцией в ультрафиолете;
- липопептидной природой;
- гидрофобными свойствами;
- коричневой окраской сухих кристаллов,
полученный способом по п.1. 2. An inhibitor of siderophore secretion, which is located on the surface of Y. pestis bacteria and the presence of which correlates with the ability of a plague microbe cell to block siderophore activity and reduce bacterial autoagglutination, characterized by:
- molecular weight of 380.6 Da;
- the presence of iron ions;
- fluorescence in ultraviolet;
- lipopeptide nature;
- hydrophobic properties;
- brown color of dry crystals,
obtained by the method according to claim 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013152473/10A RU2549712C1 (en) | 2013-11-26 | 2013-11-26 | METHOD OF ISOLATION OF SECRETION INHIBITOR OF SIDEROPHORES SYNTHESISED BY PGM-STRAINS Y. pestis AND ISOLATED INHIBITOR |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013152473/10A RU2549712C1 (en) | 2013-11-26 | 2013-11-26 | METHOD OF ISOLATION OF SECRETION INHIBITOR OF SIDEROPHORES SYNTHESISED BY PGM-STRAINS Y. pestis AND ISOLATED INHIBITOR |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2549712C1 true RU2549712C1 (en) | 2015-04-27 |
Family
ID=53289854
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013152473/10A RU2549712C1 (en) | 2013-11-26 | 2013-11-26 | METHOD OF ISOLATION OF SECRETION INHIBITOR OF SIDEROPHORES SYNTHESISED BY PGM-STRAINS Y. pestis AND ISOLATED INHIBITOR |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2549712C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2670949C1 (en) * | 2017-09-01 | 2018-10-25 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Recombinant plasmid expressing cloned genes of biosynthesis of yersinia siderophore pestis, method of its production and yersinia pestis - yersinia superproducent strain |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2361926A2 (en) * | 2005-01-21 | 2011-08-31 | Epitopix, LLC | Yersinia SSP. polypeptides and methods of use |
| RU2473558C1 (en) * | 2011-05-31 | 2013-01-27 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Protein causeing cell autoagglutination property of plague microbes, and method for producing it |
-
2013
- 2013-11-26 RU RU2013152473/10A patent/RU2549712C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2361926A2 (en) * | 2005-01-21 | 2011-08-31 | Epitopix, LLC | Yersinia SSP. polypeptides and methods of use |
| RU2473558C1 (en) * | 2011-05-31 | 2013-01-27 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Protein causeing cell autoagglutination property of plague microbes, and method for producing it |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Karen L. Stirret et al., Small-molecules with structural similarities to siderophoresas novel antimicrobials against Mycobacterium tuberculosis and Yersinia pestis, Bioorg Med Chem Lett., 2008 April 15, Vol.18, No.8, pp.2662–2668 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2670949C1 (en) * | 2017-09-01 | 2018-10-25 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Recombinant plasmid expressing cloned genes of biosynthesis of yersinia siderophore pestis, method of its production and yersinia pestis - yersinia superproducent strain |
| RU2670949C9 (en) * | 2017-09-01 | 2018-11-26 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Recombinant plasmid expressing cloned genes of biosynthesis of yersinia siderophore pestis, method of its production and yersinia pestis – yersinia superproducent strain |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sundaram et al. | Plant-derived exosomal nanoparticles inhibit pathogenicity of Porphyromonas gingivalis | |
| Hood | Virulence factors of Francisella tularensis | |
| Torres et al. | Asparagine deprivation mediated by Salmonella asparaginase causes suppression of activation-induced T cell metabolic reprogramming | |
| KR101599982B1 (en) | Cyclic peptide from nonomuraea sp., process for the production thereof, and pharmaceutical composition for the prevention or treatment of mycobacteria related disease comprising the same | |
| Marchlewicz et al. | Lysis of erythrocytes by a hemolysin produced by a group B Streptococcus sp | |
| Maqbool et al. | Crude cell-free extract from Deinococcus radiodurans exhibit anticancer activity by inducing apoptosis in triple-negative breast cancer cells | |
| Gaidukevich et al. | Antibacterial effects of liposomes containing phospholipid cardiolipin and fluoroquinolone levofloxacin on Mycobacterium tuberculosis with extensive drug resistance | |
| JP2000511537A (en) | Inhibition of virulence factor expression in Staphylococcus aureus | |
| RU2549712C1 (en) | METHOD OF ISOLATION OF SECRETION INHIBITOR OF SIDEROPHORES SYNTHESISED BY PGM-STRAINS Y. pestis AND ISOLATED INHIBITOR | |
| WO2013163858A1 (en) | Lipopeptide and derivatives thereof, preparation method therefor and application thereof | |
| CA3112041A1 (en) | Bacteriotherapy against proprionibacterium acnes for the treatment of acne | |
| EA007472B1 (en) | Polyvalent strains of bacteriophages, methods for obtaining thereof, and medicaments containing said strains | |
| Suwandecha et al. | Novel antimicrobial peptide specifically active against Porphyromonas gingivalis | |
| JPH02167069A (en) | Staphylococcus epidermidis | |
| JPS6122A (en) | Chemically ruled vaccine for urinary tract infection | |
| CN106632230A (en) | Aspergillus unguis bromo-depsidone compound and preparation method and application thereof | |
| CA2750607C (en) | Composition comprising carbohydrate esters of mycolic acid derivatives_and process for the preparation thereof | |
| WO2015016617A1 (en) | Screening method for material for preventing or treating pseudomonas aeruginosa infections | |
| KR101795524B1 (en) | Vaccine for mycoplasma infection | |
| CN110615830B (en) | Application of antibacterial peptide in anti-mycobacterial infection medicine | |
| TWI692359B (en) | Metabolite of lactic acid bacteria and use of the metabolite of lactic acid bacteria for protecting lungs | |
| SU793408A3 (en) | Method of preparing nitrogen-containing polysaccharide promoting drug sensitiveness in bacteria resistant to antibionics | |
| Prabhu et al. | Antibacterial activity of starfish Stellaster equestris from Southeast Coast of India | |
| Trenozhnikova et al. | Characterization of the antibiotic compound no. 70 produced by Streptomyces sp. IMV-70 | |
| Li et al. | Ultrasmall Cortex Moutan Nanoclusters for the Therapy of Pneumonia and Colitis |