RU2549453C2

RU2549453C2 - SET OF SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDES FOR IDENTIFICATION OF SPECIES AFFILIATION OF COMMON HEATHER (Calluna vulgaris (L.) Hull.)

Info

Publication number: RU2549453C2
Application number: RU2013119727/15A
Authority: RU
Inventors: Максим Геннадьевич Куцев; Ольга Васильевна Уварова; Татьяна Александровна Синицына
Priority date: 2013-04-26
Filing date: 2013-04-26
Publication date: 2015-04-27
Also published as: RU2013119727A

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: invention relates to the field of molecular genetics, genosystematics and pharmacognosy and is intended for the identification of the species affinity of common heather (Calluna vulgaris (L.) Hull.). Claimed is a set of synthetic oligonucleotides for PCR with the fragment ITS2 of nuclear DNA, including forward and reverse primers and a degradable probe.

EFFECT: set possesses high sensitivity and specificity and makes it possible to carry out the identification of a medicinal plant in a fast and reliable way.

1 dwg, 1 ex

Description

Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности вереска обыкновенного (Calluna vulgaris (L.) Hull.)A set of synthetic oligonucleotides for identifying species of common heather (Calluna vulgaris (L.) Hull.)

Изобретение относится к области молекулярной генетики, геносистематики и фармакогнозии. Использование набора синтетических олигонуклеотидов позволяет достоверно идентифицировать видовую принадлежность лекарственного растения - вереска обыкновенного (Calluna vulgaris (L.) Hull.). Изобретение может быть использовано для выявления видовой принадлежности данного растения; в ходе проведения скрининга растительного сырья, для контроля на соответствие состава, декларированного производителем.The invention relates to the field of molecular genetics, genosystematics and pharmacognosy. Using a set of synthetic oligonucleotides allows one to reliably identify the species of a medicinal plant - common heather (Calluna vulgaris (L.) Hull.). The invention can be used to identify the species of this plant; during the screening of plant materials, to control the compliance of the composition declared by the manufacturer.

Среди большого количества методов генодиагностики с целью идентификации присутствия ДНК интересующего вида растений в образце, в качестве основы нашего изобретения был принят формат ПЦР с детекцией в режиме реального времени на основе разрушаемого зонда. ПЦР в реальном времени имеет преимущество перед обычными ПЦР-системами идентификации - отсутствие необходимости последующего анализа, что минимизирует риск контаминации в лаборатории. Характерна также повышенная чувствительность и отсутствие ложноположительного результата при неспецифичном отжиге праймеров. Кроме того, следует отметить обеспеченность практически всех молекулярно-генетических диагностических лабораторий оборудованием, необходимым для проведения ПЦР с детекцией в режиме реального времени и широкое использование метода в клинической диагностике и органами госконтроля. На основе анализа возможных методов детекции продукта полимеразной цепной реакции нами выбран метод на основе разрушаемого зонда, на основе того, что он относится к специфичным методам детекции, возможности свободного его использования без нарушения авторских и смежных прав (первоначально система разрушаемого зонда предложена в 1991 году, при этом все патенты на настоящий момент закончили свое действие).Among a large number of genetic diagnostic methods in order to identify the presence of DNA of a plant species of interest in a sample, the PCR format with real-time detection based on a destructible probe was adopted as the basis of our invention. Real-time PCR has an advantage over conventional PCR identification systems - there is no need for further analysis, which minimizes the risk of contamination in the laboratory. Hypersensitivity and the absence of a false positive result with non-specific annealing of primers are also characteristic. In addition, it should be noted that virtually all molecular genetic diagnostic laboratories are equipped with the equipment necessary for real-time PCR testing and the widespread use of the method in clinical diagnostics and state control bodies. Based on the analysis of possible methods for detecting the product of the polymerase chain reaction, we chose a method based on a destructible probe, based on the fact that it relates to specific detection methods, the possibility of its free use without violating copyright and related rights (the original system of destructible probe was proposed in 1991, however, all patents have now expired).

Техническим результатом заявляемого изобретения является разработка праймеров и разрушаемых зондов на основе данных видоспецифичных нуклеотидных последовательностей ядерной ДНК растений. В качестве видоспецифичных участков нами используется ITS2 фрагмент ядерной ДНК (internal transcribed spacer 2), обладающий большой копийностью в геноме [Alvarez, I. & Wendel, J. F. (2003) Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference // Mol. Phylogenet. Evol. 29, 417-434] и используемый в проектировании системы ДНК-баркодинга. В этом регионе показана высокая вариабельность и потенциальная применимость в качестве маркерного участка [Stoeckle, М. (2003) Use of DNA barcodes to identify flowering plants // Bioscience 53, 2-3].The technical result of the claimed invention is the development of primers and destructible probes based on data of species-specific nucleotide sequences of plant nuclear DNA. As species-specific sites, we use the ITS2 fragment of nuclear DNA (internal transcribed spacer 2), which has a high copy number in the genome [Alvarez, I. & Wendel, J. F. (2003) Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference // Mol. Phylogenet. Evol. 29, 417-434] and used in the design of a DNA barcoding system. This region shows high variability and potential applicability as a marker site [Stoeckle, M. (2003) Use of DNA barcodes to identify flowering plants // Bioscience 53, 2-3].

Рассмотрим идентификацию лекарственных растений с использованием фрагмента ITS2, амплифицированного специфичными праймерами [Chiou SJ, Yen JH, Fang CL, Chen HL, Lin TY Authentication of medicinal herbs using PCR-amplified ITS2 with specific primers // Planta Med. 2007, Oct; 73 (13): 1421-6. Epub 2007. Oct. 1]. В аналоге используются специфичные наборы праймеров BEL-1/BEL-3 и BEL-2/BEL-3 для амплификации ITS2 участка рДНК 55 лекарственных растений. Идентифицируются различные лекарственные растения с нуклеотидными последовательностями специфичных праймеров.Consider the identification of medicinal plants using the ITS2 fragment amplified with specific primers [Chiou SJ, Yen JH, Fang CL, Chen HL, Lin TY Authentication of medicinal herbs using PCR-amplified ITS2 with specific primers // Planta Med. 2007, Oct; 73 (13): 1421-6. Epub 2007. Oct. one]. In the analogue, specific sets of primers BEL-1 / BEL-3 and BEL-2 / BEL-3 are used to amplify the ITS2 region of the 55 rDNA of 55 medicinal plants. Various medicinal plants with nucleotide sequences of specific primers are identified.

Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности лекарственного растения - вереска обыкновенного (Calluna vulgaris (L.) Hull.), предназначенный для проведения полимеразной цепной реакции фрагмента ITS2 ядерной ДНК, включающий праймеры, характеризующийся тем, что для идентификации вереска обыкновенного (Calluna vulgaris (L.) Hull.) в качестве прямого праймера используется последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом:A set of synthetic oligonucleotides for identifying the species of a medicinal plant - common heather (Calluna vulgaris (L.) Hull.), Designed for polymerase chain reaction of a fragment of ITS2 nuclear DNA, including primers, characterized in that for identification of common heather (Calluna vulgaris (L .) Hull.) As a direct primer, a DNA sequence with the following nucleotide composition is used:

5'-CATTAGGCTGAAGGCACGTC-3',5'-CATTAGGCTGAAGGCACGTC-3 ',

в качестве обратного праймера используется последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом:as a reverse primer, a DNA sequence with the following nucleotide composition is used:

5'-ACAAAGAACAGCATGCACGA-3',5'-ACAAAGAACAGCATGCACGA-3 ',

в качестве разрушаемого зонда используется последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом:as a destructible probe, a DNA sequence with the following nucleotide composition is used:

(флуоресцентная метка)-5'-GTGCTCGGTCGGTCTAAAAG-3'-(гаситель).(fluorescent label) -5'-GTGCTCGGTCGGTCTAAAAG-3 '- (quencher).

Гаситель может располагается и на 5'-конце, а флуоресцентная метка на 3'-конце разрушаемых зондов.A quencher can be located at the 5'-end, and a fluorescent label at the 3'-end of destructible probes.

Работа над созданием праймеров строится следующим образом.Work on the creation of primers is constructed as follows.

1) С помощью открытых и коммерческих баз данных нуклеотидных последовательностей различных видов растений либо в результате самостоятельного определения нуклеотидной последовательности растений выбирается участок генома, встречающийся у всех видов.1) Using open and commercial databases of nucleotide sequences of various plant species or as a result of independent determination of the nucleotide sequence of plants, a portion of the genome that is found in all species is selected.

2) На основании выбранного участка генома с помощью специального программного обеспечения или вручную подбирается последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции (2 праймера и зонд). На данном этапе работа заключается в создании выравнивания многих последовательностей и выборе участка последовательности, где присутствуют отличия для создания прямого, обратного праймеров и зонда. Выравнивание геномных последовательностей означает сравнение последовательностей многих видов друг с другом, поиск гомологичных для растений участков.2) Based on the selected region of the genome, using the special software or manually selects the sequence of oligonucleotides used for the PCR reaction (2 primers and probe). At this stage, the work consists in creating the alignment of many sequences and selecting a portion of the sequence where differences are present to create forward, reverse primers and probe. Alignment of genomic sequences means comparing the sequences of many species with each other, searching for sites homologous to plants.

3) Изготовление праймеров и зонда производится на автоматических синтезаторах.3) The manufacture of primers and probe is made on automatic synthesizers.

4) С помощью практических экспериментов доказывается пригодность подобранных последовательностей для конкретных целей.4) Using practical experiments, the suitability of the selected sequences for specific purposes is proved.

Анализ нуклеотидного полиморфизма последовательности ITS2 на основании данных NCBI (http://www.ncbi. nlm.nih. gov/) и секвенированных de novo последовательностей видов, не размещенных в генбанке, позволяет применить данные последовательности в качестве основы для создания праймеров. Для детекции накопления продукта ПЦР в ходе реакции используют технологию с разрушаемым зондом (Holland P М, Abramson R D, Watson R, Gelfand D H. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'----3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. // Proc Natl Acad Sci USA. 1991 August 15; 88 (16): 7276-7280).Analysis of the nucleotide polymorphism of the ITS2 sequence based on the NCBI data (http: //www.ncbi. Nlm.nih. Gov /) and de novo sequenced sequences of species not located in the genebank allows us to use these sequences as the basis for creating primers. For the detection of the accumulation of the PCR product during the reaction, a destructible probe technology is used (Holland PM, Abramson RD, Watson R, Gelfand D H. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5 '---- 3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. // Proc Natl Acad Sci USA. 1991 August 15; 88 (16): 7276-7280).

В качестве флуоресцентной метки используют, например, FAM, в качестве гасителя BHQ1 (возможны другие комбинации флуорофоров и гасителей, и это не является предметом охраны авторских прав).For example, FAM is used as a fluorescent label, as a BHQ1 quencher (other combinations of fluorophores and quenchers are possible, and this is not subject to copyright protection).

Аналогичные наборы, реакционные смеси, праймеры для амплификации и выявления видовой принадлежности вереска обыкновенного (Calluna vulgaris (L.) Hull.) не известны.Similar kits, reaction mixtures, primers for amplification and identification of species of common heather (Calluna vulgaris (L.) Hull.) Are not known.

Ход работы с применением набора синтетических олигонуклеотидов для амплификации состоит из следующих шагов.The progress using a set of synthetic oligonucleotides for amplification consists of the following steps.

Пример:Example:

1) Растительный материал перед проведением ПЦР с помощью заявляемого набора проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора Diamont DNA kit, в соответствии с инструкцией производителя; в ходе этой процедуры из растительного материала выделяется ДНК, которую в свою очередь используют для ПЦР.1) Plant material before PCR using the inventive kit is carried out through a sample preparation procedure using the Diamont DNA kit, in accordance with the manufacturer's instructions; during this procedure, DNA is extracted from the plant material, which in turn is used for PCR.

2) Полимеразную цепную реакцию проводят на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, USA). Амплификация проводится по следующей программе: 1 цикл: 95°C - 3 мин; 40 циклов: 95°C - 10 сек, 58°C - 30 сек (на данной стадии производится сканирование уровня флуоресценции). Инкубационная смесь, конечным объемом 25 мкл содержит: 14,1 мкл H2O; 2 мкл ДНК; 2,5 мкл 10Х буфер; 2,5 мкл 25 мМ MgCl₂; по 1 мкл 10 мМ каждого праймера; 0,5 мкл зонда; 1,2 мкл 20 мМ dNTPs; 0,2 мкл Taq-полимеразы. Результат амплификации определяют по нарастанию уровня флуоресценции, рис. 1.2) The polymerase chain reaction is carried out on a CFX96 thermocycler (Bio-Rad, USA). Amplification is carried out according to the following program: 1 cycle: 95 ° C - 3 min; 40 cycles: 95 ° C - 10 sec, 58 ° C - 30 sec (at this stage, the fluorescence level is scanned). The incubation mixture, with a final volume of 25 μl contains: 14.1 μl of H2O; 2 μl of DNA; 2.5 μl of 10X buffer; 2.5 μl 25 mM MgCl ₂ ; 1 μl of 10 mm each primer; 0.5 μl of probe; 1.2 μl of 20 mM dNTPs; 0.2 μl of Taq polymerase. The amplification result is determined by the increase in the fluorescence level, Fig. one.

Для выявления вереска обыкновенного (Calluna vulgaris (L.) Hull.), в качестве прямого праймера используется последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: 5'-CATTAGGCTGAAGGCACGTC-3', в качестве обратного праймера используется последовательность ДНК со To identify common heather (Calluna vulgaris (L.) Hull.), A DNA sequence with the following nucleotide composition is used as a forward primer: 5'-CATTAGGCTGAAGGCACGTC-3 ', a DNA sequence with

следующим нуклеотидным составом: 5'-ACAAAGAACAGCATGCACGA-3', в качестве разрушаемого зонда используется последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом: (флуоресцентная метка)-5'-GTGCTCGGTCGGTCTAAAAG-3'-(гаситель).with the following nucleotide composition: 5'-ACAAAGAACAGCATGCACGA-3 ', a DNA sequence with the following nucleotide composition is used as a destructible probe: (fluorescent label) -5'-GTGCTCGGTCGGTCTAAAAG-3' - (quencher).

Пример амплификации со специфическими праймерами вереска обыкновенного (Calluna vulgaris (L.) Hull.) наблюдают на рис. 1, отрицательный контроль (вода).An example of amplification with specific primers of common heather (Calluna vulgaris (L.) Hull.) Is observed in Fig. 1, negative control (water).

Разработан новый набор синтетических олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности лекарственного растения - вереска обыкновенного (Calluna vulgaris (L.) Hull.), предназначенный для проведения полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме реального времени. Набор обладает высокой чувствительностью и специфичностью, позволяющий быстро и достоверно провести идентификацию рассмотренного лекарственного растения.A new set of synthetic oligonucleotides has been developed to identify the species of a medicinal plant - common heather (Calluna vulgaris (L.) Hull.), Designed for polymerase chain reaction with real-time detection. The kit has high sensitivity and specificity, allowing you to quickly and reliably identify the considered medicinal plant.

Claims

Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления видовой принадлежности вереска обыкновенного (Calluna vulgaris (L.) Hull.), предназначенный для проведения полимеразной цепной реакции фрагмента ITS2 ядерной ДНК, включающий праймеры, характеризующийся тем, что для идентификации вереска обыкновенного (Calluna vulgaris (L.) Hull.) в качестве прямого праймера используется последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом:
5'-CATTAGGCTGAAGGCACGTC-3',
в качестве обратного праймера используется последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом:
5'-ACAAAGAACAGCATGCACGA-3',
в качестве разрушаемого зонда используется последовательность ДНК со следующим нуклеотидным составом:
(флуоресцентная метка)-5'-GTGCTCGGTCGGTCTAAAAG-3'-(гаситель). A set of synthetic oligonucleotides for identifying species of common heather (Calluna vulgaris (L.) Hull.), Designed for polymerase chain reaction of a fragment of ITS2 nuclear DNA, including primers, characterized in that for identification of common heather (Calluna vulgaris (L.) Hull. .) as a direct primer, a DNA sequence with the following nucleotide composition is used:
5'-CATTAGGCTGAAGGCACGTC-3 ',
as a reverse primer, a DNA sequence with the following nucleotide composition is used:
5'-ACAAAGAACAGCATGCACGA-3 ',
as a destructible probe, a DNA sequence with the following nucleotide composition is used:
(fluorescent label) -5'-GTGCTCGGTCGGTCTAAAAG-3 '- (quencher).