RU2545998C2 - Method of diagnosing clear cell renal cell carcinoma and set for its realisation - Google Patents
Method of diagnosing clear cell renal cell carcinoma and set for its realisation Download PDFInfo
- Publication number
- RU2545998C2 RU2545998C2 RU2012141232/15A RU2012141232A RU2545998C2 RU 2545998 C2 RU2545998 C2 RU 2545998C2 RU 2012141232/15 A RU2012141232/15 A RU 2012141232/15A RU 2012141232 A RU2012141232 A RU 2012141232A RU 2545998 C2 RU2545998 C2 RU 2545998C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- neto2
- mrna
- tissue
- samples
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности онкологии и молекулярной биологии, и может быть использовано для ранней диагностики, светлоклеточной почечно-клеточной карциномы (СПК).The present invention relates to medicine, in particular oncology and molecular biology, and can be used for early diagnosis, clear cell renal cell carcinoma (SEC).
Уровень техникиState of the art
Почечно-клеточная карцинома (ПК) - тип рака почки, который обычно развивается из коркового слоя и составляет большую часть всех опухолей почки. Эта агрессивная опухоль, которая склонна к метастазированию и распространению на другие органы. В мире ежегодно выявляется в среднем 190 тыс. новых случаев почечно-клеточной карциномы (ПК), причем почти у 1/3 больных опухоль служит причиной смерти. Заболевание до 4% случаев имеет наследственный характер (синдром Хиппеля-Линдау) и связано с герминальными мутациями в соответствующих генах, тогда как подавляющее большинство представляют собой спорадические случаи. В настоящее время выделяют несколько типов ПК в зависимости от происхождения раковых клеток: наиболее распространенный - светлоклеточная почечноклеточная карцинома - СПК (70-75% всех опухолей почек). Папиллярная почечно-клеточная карцинома находится на втором месте по встречаемости (7-14%). Остальные гистологические типы встречаются крайне редко - это хромофобная почечноклеточная карцинома (4-10%), онкоцитарный рак почки (2-5%) и др. Для диагностики рака почки используют неинвазивные методы: ультразвуковая и рентгеновская компьютерная томография, магнитно-резонансная томография. Реже используют пункционную биопсию опухоли почки с последующим гистологическим исследованием. Часто рак почки выявляют на ранних стадиях только благодаря случайным обнаружениям при ультразвуковом обследовании. Около четверти пациентов на момент установления диагноза уже имеют метастазы.Renal cell carcinoma (PC) is a type of kidney cancer that usually develops from the cortical layer and makes up most of all kidney tumors. This is an aggressive tumor that is prone to metastasis and spread to other organs. An average of 190 thousand new cases of renal cell carcinoma (PC) is detected annually in the world, and in almost 1/3 of patients, the tumor causes death. The disease in up to 4% of cases is hereditary (Hippel-Lindau syndrome) and is associated with germline mutations in the corresponding genes, while the vast majority are sporadic cases. Currently, several types of PCs are distinguished depending on the origin of the cancer cells: the most common is clear cell renal cell carcinoma - SEC (70-75% of all kidney tumors). Papillary renal cell carcinoma is in second place in terms of occurrence (7-14%). The remaining histological types are extremely rare - this is chromophobic renal cell carcinoma (4-10%), oncocytic kidney cancer (2-5%), etc. Non-invasive methods are used to diagnose kidney cancer: ultrasound and X-ray computed tomography, magnetic resonance imaging. Less commonly used is a puncture biopsy of a kidney tumor followed by histological examination. Often, kidney cancer is detected in the early stages only due to random detection by ultrasound. About a quarter of patients already have metastases at the time of diagnosis.
Молекулярные маркеры, специфичные для ПК, в российской клинической практике практически не применяют. Только один опухолевый маркер М2-РК (изомерная форма пируваткиназы) используется для диагностики рака почки. Определение его содержания в крови применяют в качестве дополнительного исследования для диагностики, выявления метастазов и рецидивов некоторых опухолей, включая рак почки.Molecular markers specific for PCs are practically not used in Russian clinical practice. Only one tumor marker M2-PK (isomeric form of pyruvate kinase) is used to diagnose kidney cancer. The determination of its blood content is used as an additional study for the diagnosis, detection of metastases and relapses of some tumors, including kidney cancer.
В литературе предлагают новые маркеры, например, увеличение экспрессии гена CD70 на уровне мРНК и/или белка в опухолевых клетках. Методом иммуногистохимии показана сильная экспрессия этого гена в опухолях ПК и ее отсутствие в прилежащих к опухоли нормальных тканях [Diegmann J, Junker К, Gerstmayer В, Bosio A, Hindermann W, Rosenhahn J, von Eggeling F. 2005. Identification of CD70 as a diagnostic biomarker for clear cell renal cell carcinoma by gene expression profiling, real-time RT-PCR and immunohistochemistry. Eur J Cancer. 41(12), 1794-1801].New markers are proposed in the literature, for example, increasing the expression of the CD70 gene at the level of mRNA and / or protein in tumor cells. The method of immunohistochemistry showed strong expression of this gene in PC tumors and its absence in normal tissue adjacent to the tumor [Diegmann J, Junker K, Gerstmayer B, Bosio A, Hindermann W, Rosenhahn J, von Eggeling F. 2005. Identification of CD70 as a diagnostic biomarker for clear cell renal cell carcinoma by gene expression profiling, real-time RT-PCR and immunohistochemistry. Eur J Cancer. 41 (12), 1794-1801].
Развитие ПК - сложный процесс, при котором найдены изменения в нескольких десятках генов, расположенных на разных хромосомах [Velickovic M., Delahunt В., Grebe S.К. 1999. Loss of heterozygosity at 3p14.2 in clear cell renal cell carcinoma is an early event and is highly localized to the FHIT gene locus. Cancer Res. 59, 1323-1326; Lam JS, Leppert JT, Figlin RA, Belldegrun AS. 2005. Role of molecular markers in the diagnosis and therapy of renal cell carcinoma. Urology. 66 (5 Suppl), 1-9]. В настоящее время накоплен достаточно большой объем данных, касающихся молекулярно-генетических изменений различных типов ПК. И хотя спектр этих изменений в случае каждой конкретной опухоли носит индивидуальный характер, тем не менее, наблюдаются определенные закономерности, которые дают основания связывать их с развитием и/или прогрессией той или иной патологии.PC development is a complex process in which changes are found in several dozen genes located on different chromosomes [Velickovic M., Delahunt B., Grebe S.K. 1999. Loss of heterozygosity at 3p14.2 in clear cell renal cell carcinoma is an early event and is highly localized to the FHIT gene locus. Cancer Res. 59, 1323-1326; Lam JS, Leppert JT, Figlin RA, Belldegrun AS. 2005. Role of molecular markers in the diagnosis and therapy of renal cell carcinoma. Urology. 66 (5 Suppl), 1-9]. Currently, a rather large amount of data has been accumulated regarding the molecular genetic changes of various types of PC. And although the spectrum of these changes in the case of each particular tumor is individual, nevertheless, certain patterns are observed that give reason to associate them with the development and / or progression of a particular pathology.
Диагностическими признаками злокачественной трансформации клеток могут служить геномные изменения в опухолевых клетках: точечные мутации, микросателлитная нестабильность, аллельные потери, эпигеномные изменения (метилирование промоторных участков генов), а также изменения функциональной активности многих генов на уровне мРНК и белка. Особенно перспективными можно считать гены, экспрессия которых увеличивается в опухоли по сравнению с нормальной тканью, так как это может повысить чувствительность методики.Diagnostic signs of malignant transformation of cells can be genomic changes in tumor cells: point mutations, microsatellite instability, allelic losses, epigenomic changes (methylation of promoter regions of genes), as well as changes in the functional activity of many genes at the level of mRNA and protein. Especially promising are genes whose expression increases in the tumor compared to normal tissue, as this can increase the sensitivity of the technique.
На коротком плече хромосомы 16 идентифицирован ген NETO2 (другие обозначения Neuropilin (NRP) and tolloid (TLL) like 2, FLJ10430, FLJ14724, FLJ90456).The NETO2 gene was identified on the short arm of chromosome 16 (other designations are Neuropilin (NRP) and tolloid (TLL) like 2, FLJ10430, FLJ14724, FLJ90456).
У человека ген NETO2 локализируется на длинном плече 16 хромосомы и кодирует предполагаемый трансмембранный белок с N-терминальной сигнальной последовательностью и двумя консервативными внеклеточными CUB доменами антипараллельной β-листовой структуры. За этими доменами следует одна копия цистеин богатых липопротеинов низкой плотности класса A (LDLa), модуль β-шпилечной структуры. Белок NETO2 на 57% идентичен по аминокислотной последовательности белку NETO1 (представителю того же семейства) и имеет две изоформы (изоформа 1 и 2). Изоформа 2 характеризуется наличием 7-ми дополнительных аминокислотных остатков в N-терминальной области [Stohr Н., Berger С., Frohlich S., Weber В.Н.F. A novel gene encoding a putative transmembrane protein with two extracellular CUB domains and a low-density lipoprotein class A module: isolation of alternatively spliced isoforms in retina and brain. Gene. 286, 2002. 223-231].In humans, the NETO2 gene is localized on the long arm of
Оба белка, NETO1 и NETO2, обладают одинаковой уникальной структурой домена, что позволило отнести их к новому подсемейству CUB и LDLa содержащих белков. Модуль LDLa может принимать участие в белок-белковом взаимодействии и связываться с различными классами молекул. LDLa повторы инициируют процесс активного эндоцитоза путем иммобилизации лигандов на поверхности клетки. Такой комплекс необходим впоследствии для формирования клатриновых ямок. Цитоплазматические домены NETO1 и NETO2 не гомологичны другим известным белковым последовательностям, но содержат консервативные FXNPXY-подобные мотивы, необходимые для интернализации клатриновых пузырьков. Эти белки играют важную роль в молекулярных путях, в которых происходит взаимодействие рецептора и лиганда на клеточной поверхности, что вызывает каскад внутриклеточных сигналов.Both proteins, NETO1 and NETO2, have the same unique domain structure, which allowed them to be assigned to the new subfamily of CUB and LDLa containing proteins. The LDLa module can take part in protein-protein interaction and bind to various classes of molecules. LDLa repeats initiate the process of active endocytosis by immobilizing ligands on the cell surface. Such a complex is subsequently necessary for the formation of clathrin pits. The cytoplasmic domains NETO1 and NETO2 are not homologous to other known protein sequences, but contain conservative FXNPXY-like motifs necessary for the internalization of clathrin vesicles. These proteins play an important role in the molecular pathways in which the receptor and ligand interact on the cell surface, which causes a cascade of intracellular signals.
Ген экспрессируется в норме, главным образом, в тканях головного мозга и сетчатки, что позволяет предполагать роль кодируемого им трансмембранного пептида в транспорте лигандов в этих органах. Недавние исследования in vitro показали, что NETO2 взаимодействует, по крайней мере, с GluK2 и GluK5 субъединицами каинатных рецепторов, а также, что белки NETO1 и NETO2 могут значительно усиливать сигналы, опосредованные каинатными рецепторами [Perrais D., Veran J., Mulle Ch. Gating and permeation of kainite receptors: differences unveiled. Trends in Pharmacological Sciences. 31, 2011. 516-522, Diaz, E. Regulation of AMPA receptors by transmembrane accessory proteins. Eur. J. Neurosci. 32, 2010. 261-268].The gene is expressed normally, mainly in the tissues of the brain and retina, which suggests the role of the transmembrane peptide encoded by it in the transport of ligands in these organs. Recent in vitro studies have shown that NETO2 interacts with at least GluK2 and GluK5 subunits of kainate receptors, and that NETO1 and NETO2 proteins can significantly amplify signals mediated by kainate receptors [Perrais D., Veran J., Mulle Ch. Gating and permeation of kainite receptors: differences unveiled. Trends in Pharmacological Sciences. 31, 2011. 516-522, Diaz, E. Regulation of AMPA receptors by transmembrane accessory proteins. Eur. J. Neurosci. 32, 2010.261-268].
Далее в работах Horak Ch.E. изучалась экзогенная гиперэкспрессия гена супрессора метастазирования Nm23-H1. При нормальном функционировании экспрессия этого гена снижает метастатический потенциал различных типов раковых клеток. Было показано, девять генов, включая NETO2, экспрессируются на низком уровне в линии дикого типа, но не в линии, мутантной по nm23-H1. Уменьшение экспрессии этих генов совпадало с гиперэкспрессией nm23-H1, наблюдаемой в опухоли молочной железы у человека, клеточной линии рака груди и гепатоцеллюлярной карциноме [Horak Ch.E., Lee J.H., Elkahloun A.G., et al. Nm23-H1 Suppresses Tumor Cell Motility by Down-regulating the Lysophosphatidic Acid Receptor EDG2. Cancer Research. 67, 2007. 7238-7246].Further in the works of Horak Ch.E. The exogenous hyperexpression of the Nm23-H1 metastasis suppressor gene was studied. Under normal functioning, the expression of this gene reduces the metastatic potential of various types of cancer cells. Nine genes, including NETO2, have been shown to be expressed at a low level in the wild-type line, but not in the nm23-H1 mutant line. The decrease in the expression of these genes coincided with the overexpression of nm23-H1 observed in human breast tumors, breast cancer cell lines and hepatocellular carcinoma [Horak Ch.E., Lee J.H., Elkahloun A.G., et al. Nm23-H1 Suppresses Tumor Cell Motility by Down-regulating the Lysophosphatidic Acid Receptor EDG2. Cancer Research. 67, 2007. 7238-7246].
Недавно показано, что экспрессия NETO2 повышена в детских пролиферирующих гемангиомах [Calicchio M.L., Collins Т., Kozakewich H.P. Identification of Signaling Systems in Proliferating and Involuting Phase Infantile Hemangiomas by Genome-Wide Transcriptional Profiling. The American Journal of Pathology. 5, 2009. 1638-1649]. Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о вероятной вовлеченности NETO2 в процесс канцерогенеза. Данных по экспрессии гена NETO2 в тканях опухолей почки к настоящему моменту в литературе нет.Recently, NETO2 expression has been shown to be increased in proliferating childhood hemangiomas [Calicchio M.L., Collins T., Kozakewich H.P. Identification of Signaling Systems in Proliferating and Involuting Phase Infantile Hemangiomas by Genome-Wide Transcriptional Profiling. The American Journal of Pathology. 5, 2009. 1638-1649]. Thus, the data presented indicate the probable involvement of NETO2 in the carcinogenesis process. Data on the expression of the NETO2 gene in the tissues of kidney tumors are currently not available in the literature.
Изобретение, предлагающее способ диагностики различных карцином человека, в том числе РЛ, а также лимфом и лейкемий, основано на выявлении цитогенетических изменений и аллельных потерь для 10-ти генов-супрессоров опухолевого роста, расположенных в критичной области LUCA хромосомы 3 [Ji L., Minna J., Roth J., Lerman M. Chromosome 3p21.3 genes are tumor suppressors. 2002. Международные патенты № WO 0204511, № US 2004016006].The invention, a method for diagnosing various human carcinomas, including RL, as well as lymphomas and leukemia, is based on the detection of cytogenetic changes and allelic losses for 10 tumor suppressor genes located in the critical region of LUCA chromosome 3 [Ji L., Minna J., Roth J., Lerman M. Chromosome 3p21.3 genes are tumor suppressors. 2002. International Patents No. WO 0204511, No. US 2004016006].
Изобретение, относящееся к способу диагностики рака молочной железы, толстой кишки, мочевого пузыря, основано на обнаружении методом ПЦР с радиоактивно меченными праймерами повышения уровня мРНК множественных сплайсированных форм гена поверхностного гликопротеина CD44 в опухолевых тканях, соответствующих метастазах и биоптатах по сравнению с нормальными тканями [Tarin D., Matsumura Y. Diagnostic method. 1994. Международный патент № WO 94/02633].The invention related to a method for the diagnosis of breast, colon, and bladder cancer is based on the detection of multiple spliced forms of the CD44 surface glycoprotein gene in tumor tissues corresponding to metastases and biopsy compared to normal tissues by PCR with radioactively labeled primers. D., Matsumura Y. Diagnostic method. 1994. International Patent No. WO 94/02633].
Изобретение, предлагающее способ диагностики лимфом, основано на сравнении относительного уровня мРНК генов легких λ- и κ-иммуноглобулинов, вовлеченных в развитие лимфом, методом ПЦР-РВ [Stalberg A., Kubista M. Method to measure gene expression ratio of key genes. 2002. Международный патент № WO 02/09913].An invention providing a method for diagnosing lymphomas is based on comparing the relative mRNA level of the λ and κ immunoglobulin genes involved in the development of lymphomas by PCR-PB [Stalberg A., Kubista M. Method to measure gene expression ratio of key genes. 2002. International Patent No. WO 02/09913].
Изобретение, предлагающее способ диагностики светлоклеточной почечноклеточной карциномы, основанный на определении содержания мРНК гена CHL1 (CALL) [Кудрявцева А.В., Анедченко Е.А., Кондратьева Т.Т., ЛЕРМАН М.И., Сенченко В.Н.. "Способ диагностики светлоклеточной почечноклеточной карциномы и набор для его осуществления". Дата приоритета 20.02.09, Регистрационный номер 2393472, Роспатент].An invention offering a method for the diagnosis of clear cell renal cell carcinoma based on the determination of the mRNA content of the CHL1 (CALL) gene [Kudryavtseva A.V., Anedchenko E.A., Kondratyeva T.T., LERMAN M.I., Senchenko V.N. "A method for the diagnosis of clear cell renal cell carcinoma and a kit for its implementation." Priority date 02.20.09, Registration number 2393472, Rospatent].
Данный аналог наиболее близок по технической сущности заявленному изобретению и принят за прототип.This analogue is closest in technical essence to the claimed invention and adopted as a prototype.
Проведен поиск охранных документов и/или патентных заявок для гена NETO2 по базам данных с учетом следующих различных обозначений и вариантов написания названия гена: Neuropilin (NRP) and tolloid (TLL) like 2, FLJ10430, FLJ14724, FLJ90456. Ни для одного из перечисленных вариантов не обнаружено охранных документов и/или патентных заявок, ограничивающих возможность использования повышения содержания мРНК гена NETO2, в том числе с использованием метода ПЦР-РВ, для диагностики СПК.The search for protection documents and / or patent applications for the NETO2 gene was carried out in the databases, taking into account the following different notations and spellings of the gene name: Neuropilin (NRP) and tolloid (TLL) like 2, FLJ10430, FLJ14724, FLJ90456. No protective documents and / or patent applications were found for any of the above options that limited the possibility of using the increase in the mRNA content of the NETO2 gene, including using the PCR-PB method, for the diagnosis of SEC.
Для оценки содержания мРНК генов используют различные методы. Современный высокочувствительный метод ПЦР-РВ отличается от традиционных качественных и полуколичественных методов тем, что позволяет быстро и точно определить количество копий ДНК или кДНК в широком диапазоне концентраций [Livak K.J., Flood S.J., Marmaro J., Giusti W., Deets K. 1995. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Appl. 4, 357-362]. Метод широко используют в мире как для научных, так и клинических целей, благодаря высокой производительности, обычно проводят 96 или 384 реакций. В отличие от обычной ПЦР, когда количество продуктов определяют на конечной стадии реакции, ПЦР-РВ позволяет следить за накоплением продуктов в экспоненциальной фазе реакции. В этой системе наряду с праймерами используют зонд (пробу), меченный флуоресцентным красителем. Зонд является олигонуклеотидом, который гибридизуется с последовательностью ДНК/кДНК между двумя фланкирующими праймерами. ПЦР-РВ состоит из двух основных этапов: 1) гибридизации исследуемой матрицы с зондом и 2) ПЦР, катализируемой ТаqДНК-полимеразой, обладающей 5′-экзонуклеазной активностью, расщепляющей зонд, что приводит к появлению и нарастанию флуоресцентного сигнала. На мировом рынке представлены различные модели приборов для ПЦР-РВ, разработанные известными фирмами-изготовителями - Applied Biosystems, Bio-Rad, Invitrogene, Eppendorf и др., а также отечественные приборы ДТ-322 (ДНК-Технология), АНК-32 (Институт Аналитического Приборостроения РАН, http://www.syntol.ru/productank.htm).Various methods are used to evaluate the mRNA content of genes. The modern highly sensitive PCR-RV method differs from traditional qualitative and semi-quantitative methods in that it allows you to quickly and accurately determine the number of copies of DNA or cDNA in a wide range of concentrations [Livak KJ, Flood SJ, Marmaro J., Giusti W., Deets K. 1995. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Appl. 4, 357-362]. The method is widely used in the world for both scientific and clinical purposes, due to its high productivity, usually 96 or 384 reactions are carried out. Unlike conventional PCR, when the amount of products is determined at the final stage of the reaction, PCR-PB allows you to monitor the accumulation of products in the exponential phase of the reaction. In this system, along with primers, a probe (probe) labeled with a fluorescent dye is used. A probe is an oligonucleotide that hybridizes to a DNA / cDNA sequence between two flanking primers. PCR-RV consists of two main steps: 1) hybridization of the test matrix with the probe; and 2) PCR catalyzed by TaqDNA polymerase, which has 5′-exonuclease activity, splitting the probe, which leads to the appearance and increase of a fluorescent signal. Various models of PCR-RV devices developed by well-known manufacturers - Applied Biosystems, Bio-Rad, Invitrogene, Eppendorf and others, as well as domestic devices DT-322 (DNA-Technology), ANK-32 (Institute Analytical Instrumentation RAS, http://www.syntol.ru/productank.htm).
В России этот метод все больше применяется для количественной оценки содержания мРНК генов как в фундаментальных исследованиях, так и в клинике. Появление на отечественном рынке недорогих приборов, разработанных российскими фирмами, а также недорогих отечественных наборов реактивов («Синтол», «ДНК-Технологии», «Изоген» и др.), сравнимых по эффективности с зарубежными наборами, обеспечит более широкое распространения этого технологичного метода [Манзенюк О.Ю., Малахо С.Г., Пехов В.М., Косорукова И.С., Полтараус А.Б. 2006. Характеристика универсальных отечественных наборов реагентов для ПЦР в реальном времени. Опыт использования в молекулярной онкодиагностике. Молекулярная биология. 40, 349-356]. Методики и протоколы, описанные в данной заявке, предполагают, в основном, использование отечественных наборов и хотя выполнены на приборе ABI Prism 7500 (Applied Biosystems, США), могут быть адаптированы для отечественных приборов. Сочетание недорогих приборов и отечественных наборов реактивов позволит сделать доступным этот технологичный метод для отечественных научных и клинических лабораторий.In Russia, this method is increasingly used to quantify the content of mRNA genes both in basic research and in the clinic. The appearance on the domestic market of low-cost devices developed by Russian companies, as well as low-cost domestic sets of reagents (Syntol, DNA-Technology, Isogen, etc.), comparable in efficiency with foreign sets, will ensure a wider distribution of this technological method [Manzenyuk O.Yu., Malakho S.G., Pekhov V.M., Kosorukova I.S., Poltaraus A.B. 2006. Characterization of universal domestic sets of reagents for PCR in real time. Experience in molecular oncology diagnostics. Molecular biology. 40, 349-356]. The methods and protocols described in this application mainly involve the use of domestic kits, and although performed on an ABI Prism 7500 device (Applied Biosystems, USA), they can be adapted for domestic devices. The combination of low-cost devices and domestic reagent kits will make this technological method available for domestic scientific and clinical laboratories.
Из изложенного ясно, что изменение содержания мРНК онкозначимых генов в опухолях по сравнению с нормальными тканями в качестве молекулярного маркера для диагностики большинства карцином, в том числе рака почки, пока не нашло широкого практического применения в клиниках. В данной области существует потребность в поиске новых диагностических маркеров, позволяющих достоверно и уже на ранних стадиях диагностировать заболевания, а также в разработке на их основе, чувствительного, надежного, применимого в условиях клинических или поликлинических медицинских учреждений способа диагностики рака почки, а именно СПК - наиболее распространенного типа.It is clear from the foregoing that a change in the mRNA content of oncologically significant genes in tumors compared with normal tissues as a molecular marker for the diagnosis of most carcinomas, including kidney cancer, has not yet found wide practical application in clinics. In this area, there is a need to search for new diagnostic markers that can reliably and early on diagnose diseases, as well as to develop, on their basis, a sensitive, reliable method for the diagnosis of kidney cancer, applicable in clinical or outpatient medical institutions, namely SEC - the most common type.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Данное изобретение стало возможным в результате проведенного авторами сравнительного анализа содержания мРНК гена NETO2 в образцах СПК, на разных клинических стадиях и открытия того факта, что уже на ранних стадиях при СПК, происходит значительное и частое повышение содержания мРНК гена NETO2.This invention was made possible as a result of a comparative analysis of the content of NETO2 gene mRNA in SEC samples at different clinical stages and the discovery of the fact that already in the early stages of SEC a significant and frequent increase in the content of NETO2 gene mRNA occurs.
Настоящее изобретение в своем первом аспекте относится к новому маркеру для диагностики СПК, который представляет собой изменение содержания мРНК гена NETO2. Повышенное содержание мРНК гена в предположительно пораженной раком ткани почки человека по сравнению с его содержанием в нормальных/здоровых тканях служит диагностическим маркером СПК.The present invention in its first aspect relates to a new marker for the diagnosis of SEC, which is a change in the mRNA content of the NETO2 gene. The increased content of the gene mRNA in the supposedly cancerous tissue of the human kidney compared with its content in normal / healthy tissues serves as a diagnostic marker of SEC.
В одном из воплощений рак почки, в отношении которого повышение мРНК гена NETO2 служит в качестве диагностического маркера, является ПК.In one embodiment, kidney cancer, for which an increase in the NETO2 gene mRNA serves as a diagnostic marker, is PC.
В одном из воплощений рак почки, маркером которого является повышение содержания мРНК гена NETO2, является СПК.In one embodiment, kidney cancer, the marker of which is an increase in the mRNA content of the NETO2 gene, is SEC.
В своем следующем аспекте настоящее изобретение относится к применению повышения содержания мРНК гена NETO2 в качестве маркера для диагностики СПК.In a further aspect, the present invention relates to the use of increasing the mRNA content of the NETO2 gene as a marker for diagnosing SEC.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики СПК.In another aspect, the present invention relates to a method for diagnosing SEC.
Данный способ включает следующие стадии:This method includes the following steps:
а) получение исходной пары образцов тканей от пациента, где один из образцов получен из предположительно пораженных раком тканей, а второй получен из прилегающих гистологически нормальных тканей;a) obtaining the initial pair of tissue samples from the patient, where one of the samples was obtained from tissue suspected of cancer, and the second was obtained from adjacent histologically normal tissues;
б) выделение и очистка препаратов РНК из исходной пары образцов;b) isolation and purification of RNA preparations from the initial pair of samples;
в) синтез одноцепочечной кДНК на матрице РНК с использованием олигонуклеотидных праймеров;c) synthesis of single-stranded cDNA on an RNA template using oligonucleotide primers;
г) проведение количественной реакции амплификации фрагмента гена NETO2 с использованием кДНК, полученной на стадии в), в качестве матрицы и пары геноспецифичных олигонуклеотидных праймеров и зонда;d) conducting a quantitative amplification reaction of the NETO2 gene fragment using the cDNA obtained in step c) as a template and a pair of gene-specific oligonucleotide primers and a probe;
д) сравнение количества амплифицированного фрагмента ДНК NETO2 в образце, полученном из предположительно пораженных раком тканей почки, с количеством амплифицированного фрагмента ДНК в образце, полученном из нормальных тканей, где указанные количества амплифицированного фрагмента ДНК отражают содержание мРНК гена NETO2, причем его повышение служит диагностическим маркером рака почки.e) comparing the amount of amplified NETO2 DNA fragment in a sample obtained from suspected cancerous kidney tissues with the amount of amplified DNA fragment in a sample obtained from normal tissues, where the indicated amounts of amplified DNA fragment reflect the NETO2 gene mRNA content, and its increase serves as a diagnostic marker kidney cancer.
В следующем воплощении способа настоящего изобретения для амплификации кДНК на стадии д) используют олигонуклеотидные праймеры и зонд, подобранные таким образом, что они специфически гибридизуются с кДНК даже в присутствии в препарате примеси геномной ДНК.In a further embodiment of the method of the present invention, oligonucleotide primers and a probe selected in such a way that they specifically hybridize with cDNA even in the presence of an impurity of genomic DNA are used to amplify the cDNA in step d).
В отдельном предпочтительном воплощении данного изобретения последовательность праймеров представлена SEQ ID NO: 1, 2.In a separate preferred embodiment of the invention, the primer sequence is represented by SEQ ID NO: 1, 2.
В отдельном предпочтительном воплощении данного изобретения последовательность зонда представлена SEQ ID NO: 3.In a separate preferred embodiment of the invention, the probe sequence is represented by SEQ ID NO: 3.
Еще одним аспектом настоящего изобретения является набор праймеров и зонда для осуществления полимеразной цепной реакции с целью определения содержания мРНК гена NETO2, имеющий последовательности SEQ ID NO: 1, 2 и 3.Another aspect of the present invention is a set of primers and probe for carrying out a polymerase chain reaction to determine the mRNA content of the NETO2 gene, having the sequences of SEQ ID NO: 1, 2 and 3.
В еще одном воплощении способа настоящего изобретения на стадии д) количественная реакция амплификации фрагмента гена NETO2 представляет собой ПЦР в реальном времени.In yet another embodiment of the method of the present invention, in step e), the quantitative amplification reaction of the NETO2 gene fragment is real-time PCR.
В следующем воплощении заявленного способа для рака почки на стадии д) в качестве контрольных генов используют гены GUSB или RPN1, кодирующие бета-глюкуронидазу и рибофорин 1 соответственно.In a further embodiment of the claimed method for kidney cancer in step e), the GUSB or RPN1 genes encoding beta-glucuronidase and
Перечень фигурList of figures
Далее изобретение будет более подробно раскрыто со ссылкой на отдельные иллюстративные примеры и фигуры, гдеThe invention will now be described in more detail with reference to certain illustrative examples and figures, where
Фиг.1. Относительное содержание мРНК (R) гена NETO2 в образцах светлоклеточной почечно-клеточной карциномы СПК. Фигура показывает, что повышение содержания мРНК гена NETO2 обнаружено в большинстве исследованных образцов СПК по сравнению с «условной нормой». Данные нормированы относительно контрольных генов RPN1 и GUSB.Figure 1. Relative content of NETO2 gene mRNA (R) in samples of clear cell renal cell carcinoma SEC. The figure shows that an increase in the mRNA content of the NETO2 gene was found in most of the studied SEC samples compared to the “conditional norm”. The data are normalized relative to the control genes RPN1 and GUSB.
Таблица 1. Клиническая характеристика исследованных образцов СПК.Table 1. Clinical characteristics of the studied samples of SEC.
Таблица 2. Частота (FI) и средний уровень повышения мРНК (LIcp) гена NETO2 при СПК.Table 2. Frequency (FI) and average level of mRNA increase (LI cp ) of the NETO2 gene in SEC.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Данное изобретение предлагает способ диагностики СПК на разных стадиях развития злокачественной трансформации, включая начальные, основанный на определении повышения содержания мРНК гена NETO2. Достоверно обнаруживаемое различие содержания мРНК гена NETO2 в нормальных и опухолевых тканях может быть использовано для обнаружения СПК.This invention provides a method for diagnosing SEC at various stages of the development of malignant transformation, including the initial ones, based on determining the increase in the content of the mRNA of the NETO2 gene. A reliably detectable difference in the NETO2 gene mRNA content in normal and tumor tissues can be used to detect SPK.
Образцы тканей для анализаTissue samples for analysis
В качестве образцов почки для проведения анализа могут быть использованы биоптаты или операционные образцы ткани.As samples of the kidney for analysis, biopsy samples or surgical tissue samples can be used.
Выделение РНК из образцов тканейIsolation of RNA from tissue samples
Способы выделения суммарной РНК из образцов тканей млекопитающих хорошо известны специалистам и, как правило, включают следующие стадии: измельчение в жидком азоте образцов опухолевых и нормальных тканей, лизис клеток, выделение РНК и ее очистку, проверку качества РНК электрофорезом в 1%-ном агарозном геле в присутствии красителя бромида этидия или в денатурирующем полиакриламидном геле, а также спектрофотометрическое определение количества РНК. Гомогенизацию кусочков тканей можно проводить вручную, растирая пестиком в керамической ступке, или с помощью механических гомогенизаторов, например, Omni Mixer или Micro-Dismembrator фирмы Sartorius (Германия). Для выделения РНК могут быть использованы различные протоколы, широко известные специалистам в данной области. В классических методах выделения РНК используют сильные хаотропные агенты, такие как гуанидинхлорид и гуанидинизотиоцианат, растворяющие белки, и последовательные экстракции фенолом и хлороформом для денатурации и удаления белков [Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. A laboratory Manual. 2nd Edition ed. Cold Spring Harbour: CSHL Press]. Широко используют также метод с использованием реагента Trizol [GIBCO/Life Technologies]. Для предотвращения разрушения РНК РНКазами могут быть использованы ингибиторы, такие как ингибитор RNAsin плацентарного или рекомбинантного происхождения или, например, ванадил-рибозидный комплекс - неспецифический ингибитор РНКаз широкого спектра действия.Methods of isolating total RNA from mammalian tissue samples are well known to specialists and, as a rule, include the following stages: grinding of tumor and normal tissue samples in liquid nitrogen, cell lysis, RNA isolation and purification, RNA quality control by electrophoresis in 1% agarose gel in the presence of ethidium bromide dye or in a denaturing polyacrylamide gel, as well as spectrophotometric determination of the amount of RNA. Homogenization of tissue pieces can be carried out manually, grinding with a pestle in a ceramic mortar, or using mechanical homogenizers, for example, Omni Mixer or Micro-Dismembrator from Sartorius (Germany). Various protocols can be used to isolate RNA that are well known to those skilled in the art. Classical RNA isolation methods employ strong chaotropic agents, such as guanidinochloride and guanidinoisothiocyanate, protein solubilizers and sequential phenol and chloroform extractions to denature and remove proteins [Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. A laboratory manual. 2nd Edition ed. Cold Spring Harbor: CSHL Press]. The Trizol reagent method [GIBCO / Life Technologies] is also widely used. In order to prevent RNA degradation by RNases, inhibitors such as an RNAsin inhibitor of placental or recombinant origin or, for example, a vanadyl riboside complex, a non-specific broad-spectrum RNAse inhibitor, can be used.
Быстрое и качественное выделение РНК можно проводить с использованием ряда коммерчески доступных наборов (Клоноген, Санкт-Петербург; RNeasy kits (Qiagen); SV Total RNA Isolation System, Promega (США) и т.д.). Использование различных приборов, например, QuickGene-810 (Life Science, Япония), позволяет исключить работу с агрессивными агентами, ускорить и упростить выделение РНК. Для экстракции РНК в этом приборе используют 80 мкм пористую мембрану, которая в 12,5 раз тоньше обычно используемого в таких приборах стеклянного фильтра (1000 мкм), что позволяет уменьшить деградацию РНК и увеличить ее выход.Rapid and high-quality RNA isolation can be performed using a number of commercially available kits (Klonogen, St. Petersburg; RNeasy kits (Qiagen); SV Total RNA Isolation System, Promega (USA), etc.). The use of various devices, for example, QuickGene-810 (Life Science, Japan), eliminates the work with aggressive agents, accelerate and simplify the isolation of RNA. For the extraction of RNA, this device uses an 80 μm porous membrane, which is 12.5 times thinner than the glass filter (1000 μm) commonly used in such devices, which makes it possible to reduce RNA degradation and increase its yield.
Реакция обратной транскрипции: синтез кДНК на матрице РНК, выделенной из образцов тканейReverse transcription reaction: cDNA synthesis on an RNA template isolated from tissue samples
Реакция обратной транскрипции, в результате которой на РНК-матрице синтезируют одноцепочечную цепь ДНК, при необходимости, с достройкой второй цепи, позволяет перейти от нестабильных молекул РНК к более стабильным молекулам ДНК. Дальнейшая ПЦР-амплификация позволяет использовать очень малые количества исходной РНК (на уровне нескольких нанограмм), а следовательно, и количества исследуемых легочных тканей, из которых выделяют РНК.The reverse transcription reaction, as a result of which a single-stranded DNA chain is synthesized on an RNA matrix, if necessary, with the completion of the second chain, allows us to switch from unstable RNA molecules to more stable DNA molecules. Further PCR amplification allows the use of very small amounts of the original RNA (at the level of several nanograms), and, consequently, the amount of lung tissue studied, from which RNA is isolated.
Реакцию обратной транскрипции можно проводить с использованием коммерчески доступных препаратов обратных транскриптаз, таких как обратная транскриптаза вируса лейкоза мышей Молони (M-MLV), вируса миелобластоза птиц (AMV), PowerScript (точечная мутация M-MLV-RT), С. Therm Polymerase и др., с помощью которых можно получать продукты амплификации длиною до нескольких тысяч и даже несколько десятков тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.). Может быть использована термостабильная ДНК-полимераза Thermus thermophilus (Tth), обладающая обратной транскриптазной активностью в присутствии ионов Mn2+.The reverse transcription reaction can be carried out using commercially available reverse transcriptase preparations, such as Moloney mouse leukemia virus (M-MLV), avian myeloblastosis virus (AMV) reverse transcriptase, PowerScript (M-MLV-RT point mutation), C. Therm Polymerase and etc., with the help of which it is possible to obtain amplification products up to several thousand and even several tens of thousands of nucleotide pairs (kb). Thermostable Thermus thermophilus (Tth) DNA polymerase can be used, with reverse transcriptase activity in the presence of Mn 2+ ions .
Для обратной транскрипции могут быть использованы различные праймеры, например:For reverse transcription, various primers can be used, for example:
1) Олиго(dT)n-содержащие праймеры связываются с эндогенным полиА-хвостом на 3′-конце мРНК (число n обычно равно 12-18, но может достигать и большей величины). Эти праймеры наиболее часто используют для получения полноразмерных кДНК. К олиго(dT)-последовательности часто добавляют на 3′-конце нуклеотиды А, С или G, чтобы «заякорить» праймер на границу транскрипта и поли-А тракта;1) Oligo (dT) n- containing primers bind to the endogenous polyA tail at the 3′-end of the mRNA (the number n is usually 12-18, but can reach a larger value). These primers are most often used to obtain full-size cDNA. Nucleotides A, C or G are often added to the oligo (dT) sequences at the 3′-end to “anchor” the primer to the border of the transcript and the poly-A tract;
2) Случайные гексануклеотидные праймеры (статистические затравки) гибридизуются с РНК в многочисленных участках. При обратной транскрипции с этими праймерами получают короткие кДНК. Случайные гексамеры используют для преодоления трудностей, связанных с вторичной структурой РНК, они более эффективны при обратной транскрипции 5′-областей мРНК;2) Random hexanucleotide primers (statistical primers) hybridize with RNA in numerous sites. When reverse transcription with these primers receive short cDNA. Random hexamers are used to overcome the difficulties associated with the secondary structure of RNA; they are more effective in reverse transcription of 5′-regions of mRNA;
3) Гексамеры или другие короткие олигонуклеотиды (10-12 нуклеотидов) случайного состава могут быть также использованы в комбинации с олигоdТ-содержащими праймерами;3) Hexamers or other short oligonucleotides (10-12 nucleotides) of random composition can also be used in combination with oligot-containing primers;
4) Специфические олигонуклеотидные праймеры используют для транскрипции участка мРНК, представляющего интерес для исследования. Эти праймеры успешно применяют для диагностических целей.4) Specific oligonucleotide primers are used to transcribe the mRNA region of interest for the study. These primers are successfully used for diagnostic purposes.
Анализ содержания мРНК гена можно проводить, используя одноцепочечную или двуцепочечную амплифицированную кДНК. Для синтеза второй цепи и ее амплификации наиболее часто используют специфичные праймеры. В продаже имеются наборы для синтеза кДНК, основанные на применении различных обратных транскриптаз и различных праймеров для затравки. Для получения кДНК разработан также SMART-метод (switching mechanism at the 5′ end of RNA templates of reverse transcriptase), в основе которого лежит свойство обратных транскриптаз добавлять на 3′-конец синтезированной первой цепи кДНК несколько нуклеотидных остатков, преимущественно dC. Эта олиго(dC)-последовательность служит местом отжига олигонуклеотидного адаптера, имеющего комплементарную олиго(dG)-последовательность на 3′-конце. Обратная транскриптаза воспринимает праймер как продолжение РНК-матрицы и продолжает синтез первой цепи [Schmidt W.M., Mueller M.W. 1999. CapSelect: a highly sensitive method for 5′ CAP-dependent enrichment of full-length cDNA in PCR-mediated analysis of mRNAs. Nucleic Acids Res. 27, e31]. Таким образом, первая цепь кДНК оказывается фланкирована с одной стороны последовательностью 3′-праймера с олиго(dT) на 3′-конце, а с другой - последовательностью, комплементарной адаптору. Эти праймеры имеют одинаковые внешние последовательности, отличаясь только на 3′-конце. Затем первую цепь амплифицируют в ПЦР с праймером, соответствующим внешней части 3′-праймера и адаптора. Нуклеотидную последовательность общей части этих праймеров подбирают в зависимости от дальнейших целей, например получения клонотек, применения вычитающей гибридизации и т.д. В результате получают двухцепочечную ДНК, обогащенную полноразмерными последовательностями. За счет использования адаптера с заблокированным 3′-концом достигается существенное снижение фоновой амплификации. При использовании модифицированного SMART-метода за короткое время происходит амплификация исходного материала более чем в 105 раз, что позволяет работать с очень небольшими количествами РНК (меньше 1 нанограмма), а следовательно, и с небольшим количеством исследуемых тканей [Zhu Y.Y., Machleder E.M., Chenchik A., Li R., Siebert P.D. 2001. Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30, 892-897]. Наборы для получения кДНК этим способом выпускают различные фирмы, например, Евроген, Россия (набор MINT), Clontech, США и т.п.Analysis of the mRNA content of a gene can be performed using single-stranded or double-stranded amplified cDNA. Specific primers are most often used for the synthesis of the second chain and its amplification. Commercially available kits for cDNA synthesis, based on the use of various reverse transcriptases and various primers for seed. To obtain cDNA, a SMART method has also been developed (switching mechanism at the 5 ′ end of RNA templates of reverse transcriptase), which is based on the property of reverse transcriptases to add several nucleotide residues, mainly dC, to the 3′-end of the synthesized first cDNA chain. This oligo (dC) sequence serves as the annealing site for the oligonucleotide adapter having a complementary oligo (dG) sequence at the 3′-end. Reverse transcriptase perceives the primer as an extension of the RNA matrix and continues the synthesis of the first chain [Schmidt WM, Mueller MW 1999. CapSelect: a highly sensitive method for 5 ′ CAP-dependent enrichment of full-length cDNA in PCR-mediated analysis of mRNAs. Nucleic Acids Res. 27, e31]. Thus, the first cDNA strand is flanked on one side by a 3′-primer sequence with oligo (dT) at the 3′-end, and on the other hand, by a sequence complementary to the adapter. These primers have the same external sequences, differing only at the 3′-end. Then, the first chain is amplified in PCR with a primer corresponding to the outer part of the 3′-primer and adapter. The nucleotide sequence of the common part of these primers is selected depending on further goals, for example, the production of clonotes, the use of subtractive hybridization, etc. The result is double-stranded DNA enriched with full-sized sequences. By using an adapter with a blocked 3′-end, a significant reduction in background amplification is achieved. When using the modified SMART method, the source material is amplified by more than 10 5 times in a short time, which allows working with very small amounts of RNA (less than 1 nanogram), and therefore with a small number of tissues [Zhu YY, Machleder EM, Chenchik A., Li R., Siebert PD 2001. Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30, 892-897]. Kits for producing cDNA by this method are produced by various companies, for example, Eurogen, Russia (MINT kit), Clontech, USA, etc.
Выбор специфических праймеров и зондовSelection of specific primers and probes
Выбор специфических праймеров и зондов осуществляют способом, хорошо известным специалистам в данной области, для чего используют имеющиеся программы, многие из которых находятся в свободном доступе в Интернете. Среди таких программ можно упомянуть Oligo (версия 6.42), PrimerSelect из пакета Lasergene (www.dnastar.com), Primer Express (Applied Biosystems, (USA), Primer Designer (ИМБ РАН), FastPCR (http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/fastpcr.htm), PrimerQuest (http://scitools.idtdna.com/Primerquest/) и др. С учетом сложности анализируемого генома, длина праймеров может быть выбрана в диапазоне от 18 до 25 п.н. Оптимальный размер ампликона около 150 п.н. Подбор зондов для проведения ПЦР-РВ осуществляется в соответствии со стандартными рекомендациями и требованиями метода.The selection of specific primers and probes is carried out in a manner well known to specialists in this field, for which they use the available programs, many of which are freely available on the Internet. Among such programs are Oligo (version 6.42), PrimerSelect from the Lasergene package (www.dnastar.com), Primer Express (Applied Biosystems, (USA), Primer Designer (IMB RAS), FastPCR (http: //www.biocenter. helsinki.fi/bi/Programs/fastpcr.htm), PrimerQuest (http://scitools.idtdna.com/Primerquest/), etc. Given the complexity of the analyzed genome, the length of the primers can be selected in the range from 18 to 25 p. The optimal amplicon size is about 150 bp. The selection of probes for PCR-RV is carried out in accordance with standard recommendations and the requirements of the method.
В предпочтительном воплощении используют праймеры и зонд:In a preferred embodiment, primers and a probe are used:
NETO2_F (SEQ ID NO: 1) 5′-GCTCTGCTCGGTCCTCAAAGTGTTG-3′;NETO2_F (SEQ ID NO: 1) 5′-GCTCTGCTCGGTCCTCAAAGTGTTG-3 ′;
NETO2_R (SEQ ID NO: 2) 5′-AAATGCCACACTGGGTTGCAGG-3′;NETO2_R (SEQ ID NO: 2) 5′-AAATGCCACACTGGGTTGCAGG-3 ′;
NETO2_Z (SEQ ID NO: 3) 5′-[FAM]ACTGGTAGTGGAAGGGATTGCCGTGGCCCA-[RTQ1]-3′, размер ампликона - 128 п.н.NETO2_Z (SEQ ID NO: 3) 5 ′ - [FAM] ACTGGTAGTGGAAGGGATTGCCGTGGCCCA- [RTQ1] -3 ′, amplicon size - 128 bp
Оценка содержания мРНК гена NETO2 методом ПЦР-РВAssessment of NETO2 Gene mRNA by PCR-RV
Количественная оценка содержания мРНК достигается с помощью параллельного проведения ПЦР-РВ с тестируемым и контрольным образцами. Выбору подходящего контрольного гена для нормализации количественных данных посвящено много обзоров [Radonic A., Thulke S., Mackay I.M., Landt O., Siegert W., Nitsche A. 2004. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochem Biophys Res Commun. 313, 856-862; Huggett J., Dheda K., Bustin S., Zumla A. 2005. Real-time RT-PCR normalisation; strategies and considerations. Genes and Immunity. 6, 279-284; Wong M.L, Medrano J.F. 2005. Real-time PCR for mRNA quantification. BioTechniques. 39, 1-11]. Чаще всего в качестве контрольных выбирают гены «домашнего хозяйства», хотя для этой цели может быть использован любой ген с относительно постоянным уровнем транскрипции в исследуемых образцах. Однако вариабельность содержания мРНК необходимо проверять для каждой исследуемой выборки образцов данного типа тканей. Решение о выборе того или иного гена в качестве контрольного зависит также от степени выбранной/требуемой точности. Согласно предпочтительной форме осуществления количественной оценки содержания мРНК генов необходимо выбрать контрольный ген, имеющий незначительную вариабельность содержания мРНК в опухолевых и нормальных тканях легкого по сравнению с исследуемым геном.A quantitative assessment of the mRNA content is achieved using parallel PCR-RV with the test and control samples. The selection of an appropriate control gene for normalizing quantitative data has been the subject of many reviews [Radonic A., Thulke S., Mackay I.M., Landt O., Siegert W., Nitsche A. 2004. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochem Biophys Res Commun. 313, 856-862; Huggett J., Dheda K., Bustin S., Zumla A. 2005. Real-time RT-PCR normalization; strategies and considerations. Genes and Immunity. 6, 279-284; Wong M.L., Medrano J.F. 2005. Real-time PCR for mRNA quantification. BioTechniques. 39, 1-11]. Most often, the “housekeeping” genes are chosen as control genes, although any gene with a relatively constant level of transcription in the studied samples can be used for this purpose. However, the variability of the mRNA content must be checked for each studied sample of samples of this type of tissue. The decision to select a gene as a control also depends on the degree of accuracy selected / required. According to a preferred embodiment of the quantitative assessment of the mRNA content of the genes, it is necessary to select a control gene having a slight variability in the content of mRNA in the tumor and normal lung tissues in comparison with the studied gene.
В настоящем изобретении для образцов рака почки и нормальных тканей почки выбраны два контрольных гена - GUSB (глюкуронидаза) и RPN1 (рибофорин 1) ввиду отсутствия в литературе оптимального контрольного гена для этого типа ткани. Вариабельность наиболее часто используемого в качестве контроля гена GAPDH также нами оценена, однако оказалась более значительной, чем для генов GUSB и RPN1. Можно использовать как оба эти гена совместно, а затем усреднять результат для целевого гена относительно них. Использование двух контрольных генов особенно актуально в тех случаях, когда содержание целевого гена изменяется незначительно. Поскольку содержание мРНК гена NETO2 в опухолях почки изменяется существенно, также допустимо использование одного контрольного гена (RPN1 или GUSB).In the present invention, two control genes, GUSB (glucuronidase) and RPN1 (riboforin 1), were selected for kidney and normal kidney tissue samples due to the lack of an optimal control gene for this type of tissue in the literature. We also estimated the variability of the GAPDH gene most often used as a control, but it turned out to be more significant than for the GUSB and RPN1 genes. You can use both of these genes together, and then average the result for the target gene relative to them. The use of two control genes is especially relevant in cases where the content of the target gene varies slightly. Since the content of NETO2 gene mRNA in kidney tumors varies significantly, the use of one control gene (RPN1 or GUSB) is also acceptable.
Оценка содержания мРНК генов может быть основана на абсолютном и относительном измерении количества копий исследуемых транскриптов - абсолютный метод (метод абсолютной стандартной прямой) и относительный количественный анализ (ΔΔCt-метод). Согласно предпочтительной форме осуществления количественной оценки содержания мРНК генов в качестве основного метода измерений выбран второй из них, позволяющий проводить двойное сравнение данных для исследуемого и контрольного генов в опухоли и норме и не требующий выравнивания концентраций опухолевых и нормальных образцов РНК/кДНК, которое необходимо при использовании других методов, например, ОТ-ПЦР.Assessment of the mRNA content of genes can be based on the absolute and relative measurement of the number of copies of the studied transcripts — the absolute method (absolute standard direct method) and relative quantitative analysis (ΔΔCt method). According to the preferred form of quantitative estimation of the mRNA content of genes, the second of them was chosen as the main measurement method, which allows a double comparison of the data for the studied and control genes in the tumor and normal and does not require equalization of the concentrations of tumor and normal RNA / cDNA samples, which is necessary when using other methods, for example, RT-PCR.
Выбор образцов сравненияSelection of reference samples
Согласно предпочтительной форме осуществления количественной оценки содержания мРНК генов важно проверить пригодность образцов сравнения, в данном случае «условных норм» [Кудрявцева А.В., Е.А. Анедченко, Н.Ю. Опарина, Г.С. Краснов и др. 2009. Экспрессия генов FTL и FTH, кодирующих субъединицы ферритина, при раке легкого и почки. Мол. биол. 43(6), 1-11].According to the preferred form of quantifying the mRNA content of genes, it is important to verify the suitability of the reference samples, in this case, “conditional norms” [Kudryavtseva A.V., E.A. Anedchenko, N.Yu. Oparina, G.S. Krasnov et al. 2009. Expression of FTL and FTH genes encoding ferritin subunits in lung and kidney cancer. Like biol. 43 (6), 1-11].
«Условной нормой» принято считать образец ткани с отсутствующими макро- и микроскопическими признаками опухолевого роста. При «непригодности» образца условно-нормальной ткани (т.е. в случаях, когда при микроскопии обнаруживали опухолевые клетки, или материал был трудно интерпретируемый) использовали усредненные нормы нескольких имеющихся «условных норм», а также ткани почки, полученные от людей, скончавшихся от не связанных с онкологией заболеваний. Поскольку не для всех опухолевых образцов имелись пригодные парные «условные нормы», расчеты относительного количества копий транскрипта гена NETO2 (RкДНК) проводили, используя разные образцы сравнения - парные «условные нормы» и/или усредненные «условные нормы» от нескольких больных. В качестве дополнительных образцов сравнения использовали также 6 образцов тканей почки от здоровых доноров, для этих образцов усредняли значение ΔCt=Ct(NETO2)-Ct(GUSB) или ΔCt=Ct(NETO2)-Ct(RPN1) и далее проводили расчеты RкДНК. Те «условные нормы», для которых значения Ct(NETO2)-Ct(GUSB) или Ct(NETO2)-Ct(RPN1) отличались от среднего более, чем в 2 раза, исключались из исследования.A “conditional norm” is considered to be a tissue sample with missing macro- and microscopic signs of tumor growth. If the conditionally normal tissue sample was “unsuitable” (that is, in cases when tumor cells were found under microscopy or the material was difficult to interpret), the average norms of several existing “conventional norms” were used, as well as kidney tissue obtained from people who died from non-oncological diseases. Since not all tumor samples had suitable paired “conditional norms”, the calculation of the relative copy number of the NETO2 gene transcript (R cDNA ) was performed using different comparison samples — paired “conditional norms” and / or averaged “conditional norms” from several patients. Six additional kidney tissue samples from healthy donors were also used as additional comparison samples; for these samples, ΔCt = Ct (NETO2) -Ct (GUSB) or ΔCt = Ct (NETO2) -Ct (RPN1) was averaged and R cDNA calculations were then performed. Those "conditional norms" for which the values of Ct (NETO2) -Ct (GUSB) or Ct (NETO2) -Ct (RPN1) differed from the average by more than 2 times were excluded from the study.
Учет эффективностей реакцийReaction Effectiveness
Согласно предпочтительной форме осуществления количественной оценки изменения содержания мРНК генов необходимо учитывать значения эффективности проводимых реакций, которые могут оказать заметное влияние на конечный результат. Для этого нами разработана программа математической обработки экспериментальных данных ПЦР-РВ с расчетом эффективностей реакций [Программа для ЭВМ «Анализ транскрипции генов». Свидетельство о государственной регистрации №2008612585, 2008, Роспатент]. Программа совместима с файлами экспериментальных данных (Ct, ΔRn и др.) из программного обеспечения RQ, Relative Quantification (Applied Biosystems, ABI Prism SDS Software) и также позволяет проводить статистическую оценку достоверности измеряемых изменений и оценку пригодности выбранного контрольного гена.According to the preferred form of quantifying the changes in the mRNA content of genes, it is necessary to take into account the effectiveness of the reactions that can have a noticeable effect on the final result. For this, we developed a program for mathematical processing of experimental PCR-RV data with calculation of reaction efficiencies [Computer program “Analysis of gene transcription”. State Registration Certificate No. 2008612585, 2008, Rospatent]. The program is compatible with experimental data files (Ct, ΔRn, etc.) from the RQ, Relative Quantification software (Applied Biosystems, ABI Prism SDS Software) and also allows a statistical assessment of the reliability of the measured changes and assessment of the suitability of the selected control gene.
Далее настоящее изобретение будет подробно проиллюстрировано со ссылкой на конкретные примеры, представляющие собой наиболее предпочтительные воплощения изобретения. Изобретение не ограничивается описанными воплощениями, напротив, предполагается, что оно включает любые альтернативы, модификации или эквиваленты, допустимые с учетом сущности и объема изобретения.The present invention will now be illustrated in detail with reference to specific examples representing the most preferred embodiments of the invention. The invention is not limited to the described embodiments, but rather is intended to include any alternatives, modifications, or equivalents that are acceptable given the nature and scope of the invention.
Пример 1. Образцы тканейExample 1. Tissue samples
Образцы опухолевых тканей (Т), прилегающие к опухолям морфологически нормальные ткани (N) (т.н. «условные нормы»), собраны и охарактеризованы в НИИ КО ГУ РОНЦ им Н.Н. Блохина РАМН. Образцы опухолевых тканей (опухоль, «условная норма») получены непосредственно после удаления опухоли. Каждый образец делили примерно на 3 равные части и хранили в жидком азоте.Samples of tumor tissues (T) adjacent to tumors of morphologically normal tissues (N) (the so-called "conditional norms") were collected and characterized at the Scientific Research Institute KO GU RONTs im N.N. Blokhina RAMS. Samples of tumor tissue (tumor, “conditional norm”) were obtained immediately after removal of the tumor. Each sample was divided into approximately 3 equal parts and stored in liquid nitrogen.
Коллекция образцов тканей СПК, подлежащих исследованию, составила 30 образцов, а также 30 образцов «условной нормы». Средний возраст больных с диагнозом СПК, среди которых 12 женщин и 18 мужчин, составляет 53 года (32-76 лет). Среди больных 3 человека имели метастазы в регионарные лимфоузлы.The collection of SEC tissue samples to be studied amounted to 30 samples, as well as 30 samples of “conditional norm”. The average age of patients with a diagnosis of SEC, including 12 women and 18 men, is 53 years old (32-76 years). Among patients, 3 people had metastases to regional lymph nodes.
Пример 2. Выделение РНК из образцов тканейExample 2. The selection of RNA from tissue samples
РНК из нормальных и опухолевых тканей человека выделяли с использованием набора реагентов RNeasy Mini Kit («Qiagen», Германия) согласно протоколу. Основные этапы включали: 1) разрушение ткани, замороженной в жидком азоте, с использованием микро-десмембратора («Sartorius» Германия) и гомогенизацию разрушенного образца в лизирующем буфере RLT в расчете 600 мкл на 30 мкг ткани. 2) центрифугирование 3 минуты при 14000 об/мин (4°C); 2) добавление равного объема водного 70% этилового спирта к супернатанту; 3) нанесение на колонку; 4) промывание колонки после сорбции РНК один раз буфером RW1 объемом 700 мкл и дважды буфером RPE объемом 500 мкл; 5) элюцию РНК водой, свободной от РНКаз. Концентрацию РНК определяли на спектрофотометре «NanoDrop ND1000», («NanoDrop Technologies Inc.», США) при длине волны 260 нм. Качество выделенной РНК проверяли с помощью электрофореза в 1% агарозе, а т в присутствии бромистого этидия, а также на приборе Bioanalyser Agilent 2100 («Agilent Technologies», США).RNA from normal and tumor human tissues was isolated using the RNeasy Mini Kit reagent kit (Qiagen, Germany) according to the protocol. The main steps included: 1) destruction of tissue frozen in liquid nitrogen using a micro-desmembrator (Sartorius Germany) and homogenization of the destroyed sample in RLT lysis buffer per 600 μl per 30 μg of tissue. 2) centrifugation for 3 minutes at 14,000 rpm (4 ° C); 2) adding an equal volume of aqueous 70% ethyl alcohol to the supernatant; 3) application to the column; 4) washing the column after sorption of RNA once with RW1 buffer with a volume of 700 μl and twice with RPE buffer with a volume of 500 μl; 5) RNA elution with RNase-free water. RNA concentration was determined on a NanoDrop ND1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies Inc., USA) at a wavelength of 260 nm. The quality of the isolated RNA was checked by electrophoresis in 1% agarose, and in the presence of ethidium bromide, as well as on a Bioanalyser Agilent 2100 instrument (Agilent Technologies, USA).
Нуклеотидный состав ампликонов подтверждали секвенированием на автоматическом секвенаторе 3730 DNA Analyzer ("Applied Biosystems"). Секвенирование проводили отдельно с 5′ и 3′-концевого праймеров с использованием реактивов DYEnamic ЕТ Terminator Cycler Sequencing Kit ("Amersham", США). Все праймеры и зонды были специфичны в условиях ПЦР-РВ, ампликоны имели ожидаемые нуклеотидные последовательности и размер.The nucleotide composition of the amplicons was confirmed by sequencing on a 3730 DNA Analyzer ("Applied Biosystems") automated sequencer. Sequencing was performed separately from the 5 ′ and 3 ′ end primers using DYEnamic ET Terminator Cycler Sequencing Kit reagents (Amersham, USA). All primers and probes were specific for PCR-PB; amplicons had the expected nucleotide sequences and size.
Пример 3. Реакция обратной транскрипцииExample 3. The reaction of reverse transcription
Для проведения реакции обратной транскрипции брали по 1 мкг РНК, полученной одним из двух вышеописанных методов с использованием наборов реагентов Trizol RNA Prep («Лаборатория Изоген») или реагентов RNeasy Mini Kit («Qiagen», Германия), предварительно обработанной не содержащей РНКаз ДНКазой I (Invitrogene), 100 нг гексануклеотидных праймеров, 1 мМ dNTP, 1x реакционный буфер («Fermentas», Литва), содержащий 250 мМ Tris-HCl (рН 8.3, 25°C), 250 мМ KCl, 20 мМ MgCl2, 50 мМ DTT, и 200 единиц обратной транскриптазы M-MuLV ((«Fermentas», Литва). Реакцию проводили в объеме 20 мкл при следующем температурном режиме: 25°C - 10 мин, 42°C - 60 мин, 50°C - 10 мин, 70°C - 10 мин.For the reverse transcription reaction, 1 μg of RNA obtained by one of the two methods described above using Trizol RNA Prep reagent kits (Isogen Laboratory) or RNeasy Mini Kit reagents (Qiagen, Germany) pretreated with RNase-free DNase I was taken (Invitrogene), 100 ng hexanucleotide primers, 1 mM dNTP, 1x reaction buffer (Fermentas, Lithuania) containing 250 mM Tris-HCl (pH 8.3, 25 ° C), 250 mM KCl, 20 mM MgCl2, 50 mM DTT , and 200 units of reverse transcriptase M-MuLV ((Fermentas, Lithuania). The reaction was carried out in a volume of 20 μl at the following temperature conditions: 25 ° C - 10 min, 42 ° C - 60 min, 50 ° C - 10 min, 70 ° C - 10 min.
Пример 4. Подбор условий для количественной оценки содержания мРНК гена NETO2 в опухолях почки.Example 4. Selection of conditions for the quantitative assessment of the content of mRNA of the NETO2 gene in kidney tumors.
Использовали специфичные праймеры и зонды для гена NETO2 (SEQ ID NO: 1, 2, 3).Specific primers and probes for the NETO2 gene were used (SEQ ID NO: 1, 2, 3).
Последовательности выбранных праймеров и зондов для контрольных генов:The sequence of the selected primers and probes for the control genes:
Прямой GUSB-F 5′-GATGGAAGAAGTGGTGCGTAGG-3′Direct GUSB-
Обратный GUSB-R 5′-TTAGAGTTGCTCACAAAGGTTCACAG-3′Reverse GUSB-
Зонд GUSB-Z - 5′-[FAM]-CGTCCCACCTAGAATCTGCTGGCTACTACTT-[RTQ1]-3′. Размер ампликона - 171 п.н.GUSB-Z probe - 5 ′ - [FAM] -CGTCCCACCTAGAATCTGCTGGCTACTACTT- [RTQ1] -3 ′. Amplicon size - 171 bp
Прямой RPN1-F 5′-CACCCTCAACAGTGGCAAGAAGG-3′Direct RPN1-
Обратный RPN1-R 5′-TGCATTTCGCTCACTCTGTCG-3′Reverse RPN1-
Зонд RPN1-Z - 5′-[FAM]-CCCTCTGTCTTCAGCCTGGACTGCA-[RTQ1]-3′.Probe RPN1-Z - 5 ′ - [FAM] -CCCTCTGTCTTCAGCCTGGACTGCA- [RTQ1] -3 ′.
Размер ампликона - 125 п.н.Amplicon size - 125 bp
Для проведения ПЦР-РВ подобраны оптимальные концентрации праймеров и зондов исследуемого и контрольного генов. Концентрации праймеров варьировали в диапазоне 100-500 nM при постоянной концентрации зондов равной 100 nM, затем концентрацию зондов варьировали от 100 до 500 nM при оптимальной концентрации праймеров. Для гена NETO2 оптимальные концентрации праймеров составили 300 нМ и зонда 400 нМ, для гена GUSB - концентрация праймеров - 300 нМ, зонда - 250 нМ, для гена RPN1 - концентрация праймеров - 350 нМ, зонда - 200 нМ.For PCR-RV, optimal concentrations of primers and probes of the studied and control genes were selected. Primer concentrations were varied in the range of 100-500 nM with a constant concentration of probes equal to 100 nM, then the concentration of probes was varied from 100 to 500 nM at an optimal concentration of primers. For the NETO2 gene, the optimal concentrations of primers were 300 nM and a probe of 400 nM, for the GUSB gene, the concentration of primers was 300 nM, the probe was 250 nM, for the RPN1 gene, the concentration of primers was 350 nM, and the probe was 200 nM.
Пример 5. Количественная оценка содержания мРНК гена NETO2Example 5. Quantification of the mRNA content of the NETO2 gene
Для количественных измерений использовали прибор ABI PRISM ® 7000 Sequence Detection System, Applied Biosystems, США.For quantitative measurements, an ABI PRISM ® 7000 Sequence Detection System, Applied Biosystems, USA was used.
Протокол определения содержания мРНК гена NETO2 методом ПЦР-РВProtocol for determining the content of mRNA of the NETO2 gene by PCR-RV
1. Готовили реакционные смеси для генов NETO2, RPN1 и GUSB, осторожно смешав все компоненты реакции, кроме матрицы (кДНК), из расчета 1 реакция объемом 25 мкл для каждого образца + 1 дополнительная реакция по 25 мкл.1. The reaction mixtures were prepared for the NETO2, RPN1 and GUSB genes, carefully mixing all the reaction components except the template (cDNA), at the rate of 1 reaction with a volume of 25 μl for each sample + 1 additional reaction of 25 μl.
Состав реакционной смеси для гена NETO2:Composition of the reaction mixture for the NETO2 gene:
Состав реакционной смеси для гена GUSB:The composition of the reaction mixture for the GUSB gene:
Состав реакционной смеси для гена RPN1:The composition of the reaction mixture for the RPN1 gene:
2. В 96-луночную планшету добавляли по 20 мкл приготовленных реакционных смесей без матрицы.2. In a 96-well plate, 20 μl of the prepared matrixless reaction mixtures were added.
3. Вносили по 5 мкл кДНК образца, плотно закрывали планшету пленкой.3. 5 μl of cDNA sample was added, and the plate was tightly closed with a film.
4. Помещали планшету в приборное отделение, задавали названия ячеек, температурный режим для 40 циклов: 95°C - 10 мин - денатурация и активация фермента, 95°C - 15 с - денатурация, 60°C - 1 мин - отжиг зонда и полимеризация, затем запускали прибор.4. The tablet was placed in the instrument compartment, the cell names were set, the temperature regime for 40 cycles: 95 ° C - 10 min - denaturation and enzyme activation, 95 ° C - 15 s - denaturation, 60 ° C - 1 min - probe annealing and polymerization , then they started the device.
5. Реакции проводили в режиме относительных количественных измерений (программное обеспечение RQ, Relative Quantification, Applied Biosystems).5. The reactions were carried out in the mode of relative quantitative measurements (software RQ, Relative Quantification, Applied Biosystems).
6. Нуклеотидный состав ампликонов подтверждали секвенированием на автоматическом секвенаторе 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, США). Секвенирование проводили отдельно с 5′ и 3′-концевого праймеров с использованием реактивов DYEnamic ET Terminator Cycler Sequencing Kit ("Amersham", США).6. The nucleotide composition of the amplicons was confirmed by sequencing on a 3730 DNA Analyzer automated sequencer (Applied Biosystems, USA). Sequencing was performed separately from the 5 ′ and 3 ′ end primers using the DYEnamic ET Terminator Cycler Sequencing Kit reagents (Amersham, USA).
7. Проводили математическую обработку данных ПЦР-РВ и представляли результаты в графическом и/или табличном виде.7. Conducted mathematical processing of PCR-RV data and presented the results in graphical and / or tabular form.
Пример 6. Математическая обработка данных ПЦР-РВExample 6. Mathematical processing of PCR-RV data
Данные ПЦР-РВ переносили в виде текстового файла в Microsoft Excel и проводили математическую обработку данных. Относительное содержание мРНК RкДНК (далее R), представляющее отношение количества копий исследуемой последовательности кДНК к количеству копий контрольной последовательности в опухоли (Т) по сравнению с нормой (N), связана с основными параметрами ПЦР-РВ пороговым циклом Ct и эффективностью реакции Е общим выражением [Бюллетень 2, http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf]
Интервал крайних значений R вычисляли с учетом рассчитанных отклонений Е для значений CtThe range of extreme values of R was calculated taking into account the calculated deviations E for the values of Ct
Сравнивали уровень повышения мРНК генов, равный 1/R и показывающий во сколько раз содержание мРНК каждого гена повышено в опухоли по сравнению с нормой. Эффективность ПЦР-РВ (Е) для генов GUSB, RPN1 и NETO2 рассчитывалась с помощью программы «Анализ Транскрипции Генов». В данной программе эффективность реакции рассчитывается по тангенсу угла наклона прямой, которая аппроксимирует кинетическую кривую на ее линейном участке с помощью метода наименьших квадратов. При дальнейшей обработке данных учитывали полученные значения эффективностей, которые составили в NETO2 в образцах почки для гена NETO2 Еопухоль=Енорма=(92±8)%, для гена GUSB - Еопухоль=Енорма=(80±9)%, для гена RPN1 - Еопухоль=Енорма=(86±9)%. Достоверность наблюдаемых изменений оценивали при помощи непараметрических тестов Уилкоксона и Манна-Уитни. Данные считали достоверными при Р<0,05, где Р - показатель статистической значимости данных.Compared the level of increase in mRNA of genes equal to 1 / R and showing how many times the content of mRNA of each gene is increased in the tumor compared with the norm. The effectiveness of PCR-PB (E) for the GUSB, RPN1, and NETO2 genes was calculated using the Gene Gene Transcription Analysis program. In this program, the reaction efficiency is calculated by the slope of the straight line, which approximates the kinetic curve in its linear section using the least squares method. Further processing of the data took into account the obtained efficiencies, which were in NETO2 in kidney samples for the NETO2 gene: E tumor = E normal = (92 ± 8)%, for the GUSB gene - E tumor = E normal = (80 ± 9)%, for RPN1 gene - E tumor = E norm = (86 ± 9)%. The reliability of the observed changes was evaluated using nonparametric tests of Wilcoxon and Mann-Whitney. Data was considered reliable at P <0.05, where P is an indicator of the statistical significance of the data.
Оценка содержания мРНК гена NETO2 при СПКAssessment of the mRNA content of the NETO2 gene in SEC
Во всех случаях СПК (97%, 29/30, Р<0.01) обнаружено повышение содержания мРНК гена NETO2 от 3-х до 100-х раз по сравнению с «условными» нормальными тканями (фиг.1). Значение LIcp (Level Increase - средний уровень повышения) для всей выборки составило 15 раз. Значения LIcp и FI (Frequency Increase - частота повышения) в образцах, соответствующих различным клиническим стадиям и для всей выборки близки.In all cases of SEC (97%, 29/30, P <0.01), an increase in the mRNA content of the NETO2 gene was detected from 3 to 100 times compared with “conditional” normal tissues (Fig. 1). The value of LI cp (Level Increase - the average level of increase) for the entire sample was 15 times. The values of LI cp and FI (Frequency Increase - frequency of increase) in samples corresponding to different clinical stages and for the entire sample are close.
Статистически значимых корреляций между степенью, частотой повышения содержания мРНК гена NETO2 и такими характеристиками, как клиническая стадия, размер первичной опухоли, возраст и пол пациента, не выявлено. В исследованной выборке всего 3 образца СПК с метастазами, поэтому разделения образцов на группы с метастазами и без метастазов не проводили.There were no statistically significant correlations between the degree, frequency of increase in the NETO2 gene mRNA content and such characteristics as the clinical stage, size of the primary tumor, age and gender of the patient. In the studied sample, there are only 3 samples of SEC with metastases, therefore, the separation of samples into groups with metastases and without metastases was not performed.
Представленное выше подробное описание изобретения и его конкретных воплощений, приведенных в примерах со ссылкой на фигуры, предназначено исключительно для более полного уяснения сущности заявленного изобретения, но не для его ограничения. Специалисту будет ясно, что могут быть сделаны различные изменения, которые, тем не менее, будут соответствовать сущности и объему настоящего изобретения, которые определяются прилагаемой формулой изобретения.The above detailed description of the invention and its specific embodiments given in the examples with reference to the figures, is intended solely to more fully understand the essence of the claimed invention, but not to limit it. It will be clear to a person skilled in the art that various changes can be made, which, however, will correspond to the nature and scope of the present invention, which are determined by the appended claims.
SEQUENCE LISTINGSEQUENCE LISTING
<110> ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК <110> FEDERAL STATE BUDGETARY INSTITUTION OF SCIENCE INSTITUTE OF MOLECULAR BIOLOGY V.A. ENGELGARDT OF THE RUSSIAN ACADEMY OF SCIENCES
INSTITUT MOLEKULYARNOI BIOLOGII ROSSIISKOI AKADEMII NAUKINSTITUT MOLEKULYARNOI BIOLOGII ROSSIISKOI AKADEMII NAUK
<120> СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СВЕТЛОКЛЕТОЧНОЙ ПОЧЕЧНО-КЛЕТОЧНОЙ КАРЦИНОМЫ И НАБОР ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ<120> METHOD FOR DIAGNOSTIC OF CELLULAR CELL RENAL CELL CARCINOMA AND KIT FOR ITS IMPLEMENTATION
<130> R06100200/44<130> R06100200 / 44
<160> 2 <160> 2
<170> PatentIn version 3.1<170> PatentIn version 3.1
<210> 1<210> 1
<211> 25<211> 25
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Forward primer NETO2_F<223> Forward primer NETO2_F
<400> 1<400> 1
gctctgctcg gtcctcaaag tgttg 25gctctgctcg gtcctcaaag tgttg 25
<210> 2<210> 2
<211> 21<211> 21
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Reverse primer NETO2_R<223> Reverse primer NETO2_R
<400> 2<400> 2
aaatgccaca ctgggttgca gg 22aaatgccaca ctgggttgca gg 22
<210> 3<210> 3
<211> 31<211> 31
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Probe NETO2_Z<223> Probe NETO2_Z
<400> 3<400> 3
5'- FAM -actggtagtg gaagggattg ccgtggccca -RTQ1- 3' 305'- FAM -actggtagtg gaagggattg ccgtggccca -RTQ1- 3 '30
Claims (4)
а) получение исходной пары образцов ткани от пациента, где один из образцов получен из предположительно пораженной раком ткани, а второй получен из прилегающей гистологически нормальной ткани («условной нормы»);
б) выделение и очистка препаратов РНК из исходной пары образцов;
в) синтез одноцепочечной или двуцепочечной кДНК на матрице РНК с использованием олигонуклеотидных праймеров;
г) проведение количественной реакции амплификации фрагмента гена NETO2 с использованием кДНК, полученной на стадии в), в качестве матрицы, и пары геноспецифичных олигонуклеотидных праймеров и зонда с последовательностями SEQ ID NO: 1, 2 и 3;
д) сравнение количества амплифицированного фрагмента ДНК NETO2 для образца, полученного из предположительно пораженной раком ткани, с количеством амплифицированного фрагмента ДНК для образца, полученного из нормальной ткани, где указанные количества амплифицированного фрагмента ДНК отражают изменение содержания мРНК гена NETO2, причем повышение содержания мРНК гена NETO2 служит диагностическим признаком СПК.1. A method for the diagnosis of clear cell renal cell carcinoma (SEC), comprising the following stages:
a) obtaining the initial pair of tissue samples from the patient, where one of the samples was obtained from tissue presumably affected by cancer, and the second was obtained from adjacent histologically normal tissue (“conditional norm”);
b) isolation and purification of RNA preparations from the initial pair of samples;
c) synthesis of single-stranded or double-stranded cDNA on an RNA template using oligonucleotide primers;
d) conducting a quantitative amplification reaction of the NETO2 gene fragment using the cDNA obtained in step c) as a template and a pair of gene-specific oligonucleotide primers and a probe with the sequences SEQ ID NO: 1, 2 and 3;
e) comparing the amount of amplified NETO2 DNA fragment for a sample obtained from a tissue presumably affected by cancer with the amount of amplified DNA fragment for a sample obtained from normal tissue, where the indicated amounts of amplified DNA fragment reflect a change in the NETO2 gene mRNA content, with an increase in the NETO2 gene mRNA content serves as a diagnostic sign of SEC.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012141232/15A RU2545998C2 (en) | 2012-09-27 | 2012-09-27 | Method of diagnosing clear cell renal cell carcinoma and set for its realisation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012141232/15A RU2545998C2 (en) | 2012-09-27 | 2012-09-27 | Method of diagnosing clear cell renal cell carcinoma and set for its realisation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012141232A RU2012141232A (en) | 2014-05-20 |
| RU2545998C2 true RU2545998C2 (en) | 2015-04-10 |
Family
ID=50695284
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012141232/15A RU2545998C2 (en) | 2012-09-27 | 2012-09-27 | Method of diagnosing clear cell renal cell carcinoma and set for its realisation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2545998C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2643586C1 (en) * | 2016-12-26 | 2018-02-02 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр" | Diagnostic method of renal cell carcinonma |
| RU2683251C1 (en) * | 2017-11-01 | 2019-03-27 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр" | Method of diagnosis of clear cell renal cell carcinoma and method for prediction of metastasis based on mirna genes group |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002079411A2 (en) * | 2001-03-29 | 2002-10-10 | Van Andel Institute | Microarray gene expression profiling in clear cell renal cell carcinoma: prognosis and drug target identification |
| RU2393472C1 (en) * | 2009-02-20 | 2010-06-27 | Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН | Diagnostic technique for clear cell renal adenocarcinoma and set for implementation thereof |
-
2012
- 2012-09-27 RU RU2012141232/15A patent/RU2545998C2/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002079411A2 (en) * | 2001-03-29 | 2002-10-10 | Van Andel Institute | Microarray gene expression profiling in clear cell renal cell carcinoma: prognosis and drug target identification |
| RU2393472C1 (en) * | 2009-02-20 | 2010-06-27 | Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН | Diagnostic technique for clear cell renal adenocarcinoma and set for implementation thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| HIROTA E. et al. Genome-wide gene expression profiles of clear cell renal cell carcinoma: Identification of molecular targets for treatment of renal cell carcinoma. International Journal of Oncology. 2006 Oct 1; 29(4): 799-827 . * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2643586C1 (en) * | 2016-12-26 | 2018-02-02 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр" | Diagnostic method of renal cell carcinonma |
| RU2683251C1 (en) * | 2017-11-01 | 2019-03-27 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр" | Method of diagnosis of clear cell renal cell carcinoma and method for prediction of metastasis based on mirna genes group |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2012141232A (en) | 2014-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Risinger et al. | Global expression analysis of cancer/testis genes in uterine cancers reveals a high incidence of BORIS expression | |
| RU2654587C2 (en) | Method for predicting breast cancer recurrent during endocrine treatment | |
| EP2867376B1 (en) | Targeted rna-seq methods and materials for the diagnosis of prostate cancer | |
| EP2342354B1 (en) | Molecular classifier for evaluating the risk of metastasic relapse in breast cancer | |
| EP3425061B1 (en) | Methods for predicting risk of metastasis in cutaneous melanoma | |
| Nashtahosseini et al. | Circulating status of microRNAs 660‐5p and 210‐3p in breast cancer patients | |
| CA2451483C (en) | Methods for detecting and monitoring cox-2 rna in plasma and serum | |
| RU2324186C1 (en) | Method and tool for diagnostics of pulmonary epidermoid carcinoma | |
| RU2545998C2 (en) | Method of diagnosing clear cell renal cell carcinoma and set for its realisation | |
| RU2351936C1 (en) | Method of diagnosing non-small cell lung cancer and set for realising it | |
| RU2393472C1 (en) | Diagnostic technique for clear cell renal adenocarcinoma and set for implementation thereof | |
| US20160244845A1 (en) | Method for determining the prognosis of pancreatic cancer | |
| RU2605829C2 (en) | Diagnostic technique for papillary cell renal carcinoma and set for implementation thereof | |
| RU2390780C1 (en) | Diagnostic technique for non-small cell carcinoma of lung and kit for implementation thereof | |
| RU2327162C1 (en) | Method of epidermoid lung cancer diagnostics and related set | |
| US9279157B2 (en) | EMX2 in cancer diagnosis and prognosis | |
| EA010571B1 (en) | Method for diagnosis of non-small cell carcinoma of lung and a kit therefor | |
| CN111041098B (en) | Application of reagent for detecting proline-rich and frizzled 2A expression level and kit | |
| KR20210101179A (en) | Gender-specific markers for diagnosing prognosis and determining treatment strategies of patient of clear cell renal cell carcinoma | |
| RU2545995C2 (en) | Method of diagnosing clear cell renal cell carcinoma and set for its realisation | |
| RU2586779C2 (en) | Method of diagnosing squamous cell carcinoma of lung and kit for implementation thereof | |
| RU2330285C1 (en) | Method of non-small cell lung carcinoma diagnostics and related analysis set | |
| RU2374647C1 (en) | Diagnostic technique for colon cancer and kit for implementing thereof | |
| KR20200104106A (en) | Recurrence-specific markers for determining treatment strategies and diagnosing prognosis of patient of clear cell renal cell carcinoma | |
| RU2671557C1 (en) | Set of reagents for determining the risk of recurrence of breast cancer |