RU2539768C2 - INTEGRATIVE GENETIC CONSTRUCTION pWpr-le - Google Patents
INTEGRATIVE GENETIC CONSTRUCTION pWpr-le Download PDFInfo
- Publication number
- RU2539768C2 RU2539768C2 RU2012105584/10A RU2012105584A RU2539768C2 RU 2539768 C2 RU2539768 C2 RU 2539768C2 RU 2012105584/10 A RU2012105584/10 A RU 2012105584/10A RU 2012105584 A RU2012105584 A RU 2012105584A RU 2539768 C2 RU2539768 C2 RU 2539768C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- pwpr
- construct
- ghrh
- peptide
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к созданию интегративной генетической конструкции для экспрессии гена релизинг фактора гормона роста человека/свиньи (GHRH_le) в бактериях.The invention relates to the field of biotechnology, in particular to the creation of an integrative genetic construct for expression of a human / pig growth hormone growth factor (GHRH_le) gene in bacteria.
Уровень техникиState of the art
Известен способ создания рекомбинантных продуцентов интерферона альфа человека на базе Bacillus licheniformis (см. патент RU №98112850/13 кл. C12N 1/20, А61К 35/74, C12N 1/20, C12R 1:10 2001.08.20). Способ основан на использовании автономно реплицирующегося плазмидного вектора рВМВ 105, несущего целевой ген и ген канамицинфосфотрансферазы, обеспечивающего устойчивость к канамицину. Способ обеспечивает возможность продукции целевого белка при поддержании бациллярной культуры в стерильных условиях в присутствии канамицина. Однако за счет низкой репликативной стабильности плазмида быстро утрачивается при культивировании штамма в отсутствии селекции антибиотиком. Плазмидный вектор способен легко переноситься в клетки широкого круга грамположительных микроорганизмов, в том числе, представителей резидентной микрофлоры кишечника человека и животных. Таким образом, ввиду низкой стабильности и биологической опасности штамм оказывается непригоден для производства пробиотических препаратов зооветеринарного назначения.A known method of creating recombinant producers of human interferon alfa based on Bacillus licheniformis (see patent RU No. 98112850/13
Настоящее изобретение состоит в создании новой векторной системы для экспрессии гена пептида GHRH_le в бактериях, обладающей высокой стабильностью при получении бактерийного препарата пробиотического назначения в промышленных условиях и его пероральной доставки животным.The present invention consists in the creation of a new vector system for expression of the GHRH_le peptide gene in bacteria, which is highly stable in the preparation of a probiotic bacterial preparation under industrial conditions and its oral delivery to animals.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Сущностью изобретения является способ создания интегративной генетической конструкции для экспрессии гена пептида GHRH_le в бактериях. Для интеграции гена пептида GHRH_le в хромосомный локус Wpr бактерий рода Bacillus создана конструкция, состоящая из следующих компонентов (фиг.1).The essence of the invention is a method for creating an integrative genetic construct for expression of the gene of the peptide GHRH_le in bacteria. To integrate the GHRH_le peptide gene into the Wpr chromosomal locus of bacteria of the genus Bacillus, a construct consisting of the following components was created (Fig. 1).
1. Промотор гена Wpr A (1000 п.н.)1. The promoter of the Wpr A gene (1000 bp)
Ген wprA кодирует субтилизиноподобную протеиназу, прочно связанную с клеточной стенкой (CWBP). Использование нуклеотидной последовательности, соответствующей последовательности промотора данного гена, предполагает интеграцию целевой конструкции (pWpr-le) в геном В.subtilis AJ73. При этом выключение гена WprA, происходящее в результате рекомбинации, не приводит к нарушению жизнедеятельности клетки, а активность промотора гена wprA обеспечивает синтез целевого белка (GHRH_le) в цитоплазму.The wprA gene encodes a subtilisin-like proteinase tightly bound to the cell wall (CWBP). The use of the nucleotide sequence corresponding to the promoter sequence of this gene implies the integration of the target construct (pWpr-le) into the genome of B. subtilis AJ73. Moreover, the shutdown of the WprA gene as a result of recombination does not lead to disruption of cell activity, and the activity of the wprA gene promoter ensures the synthesis of the target protein (GHRH_le) into the cytoplasm.
2. Мини-ген (15 п.н.) пентапептида (Е-пептид), экспрессия которого придает клеткам бацилл устойчивость к эритромицину. Использование мини-гена Е-пептида в качестве транскрипционного репортера позволяет существенно облегчить поиск наиболее продуктивных клонов путем выращивания культур на постепенно повышающихся концентрациях эритромицина и отбора наиболее устойчивых к антибиотику.2. Mini-gene (15 bp) of the pentapeptide (E-peptide), the expression of which gives bacillus cells resistance to erythromycin. The use of the E-peptide mini-gene as a transcriptional reporter can significantly facilitate the search for the most productive clones by growing cultures at gradually increasing concentrations of erythromycin and selecting the most resistant to antibiotic.
3. Последовательность, кодирующая GHRH_le (100 п.н.)3. The sequence encoding GHRH_le (100 bp)
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения интегративной генетической конструкции для экспрессии гена пептида GHRH_le в бактериях.Thus, the present invention relates to a method for producing an integrative genetic construct for expression of a GHRH_le peptide gene in bacteria.
Способ предусматривает:The method includes:
- получение плазмидной конструкции pWpr-le, несущей трифункциональный слитой ген;- obtaining a plasmid construct pWpr-le carrying a trifunctional fusion gene;
- введение конструкции в геном В.subtilis AJ73 методом химической трансформации по Спицайзену.- introduction of the construct into the genome of B. subtilis AJ73 by the method of chemical transformation according to Spitsaizen.
Краткое описание графических изображенийShort description of graphic images
Фиг.1. Плазмидная конструкция pWpr-le: принципиальная схема. Фиг.2. Последовательность трифункционального слитого гена, кодирующего GHRH_le, в составе конструкции pWpr-le.Figure 1. Plasmid construction pWpr-le: concept. Figure 2. The sequence of the trifunctional fusion gene encoding GHRH_le in the pWpr-le construct.
Фиг.3. Электрофорез геномной ДНК, выделенной из клонов (изолятов) бацилл, предназначенной для детекции интегрированной конструкции pWpr-le методом ПЦР.Figure 3. Electrophoresis of genomic DNA isolated from clones (isolates) of bacilli designed to detect the integrated pWpr-le construct by PCR.
Фиг.4. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР с целью идентификации конструкции pWpr_le, в том числе интегрированной в геном бацилл, с использованием праймеров SLN-H1 и SLN-H2.Figure 4. Electrophoretic analysis of PCR products to identify the pWpr_le construct, including the one integrated into the bacillus genome, using primers SLN-H1 and SLN-H2.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Методология исследования:Research Methodology:
1) получение конструкции pWpr-le,1) obtaining the pWpr-le construct,
2) введение в геном В.subtilis AJ73 полученной конструкции,2) the introduction into the genome of B. subtilis AJ73 of the resulting construct,
3) выделение геномной ДНК из В.subtilis AJ73 и детекция трансгена с помощью ПЦР.3) isolation of genomic DNA from B. subtilis AJ73 and detection of the transgene by PCR.
1) Получение конструкции pWpr-lе1) Obtaining the pWpr-le construct
Получение конструкции проводили по следующей схеме:The construction was carried out according to the following scheme:
1. ПЦР-клонирование кодирующей области зрелой формы GHRH_le с использованием праймеров ПЦР проводили с использованием праймеров к гену пептида GHRH_le:1. PCR cloning of the coding region of the mature form of GHRH_le using primers PCR was performed using primers to the GHRH_le peptide gene:
SLN_H1: GGGGATCCTATGCAGATGCCATCTTCACSLN_H1: GGGGATCCTATGCAGATGCCATCTTCAC
SLN_H2: GGGTCGACTATCCCTGCTGCCTGCTCATGASLN_H2: GGGTCGACTATCCCTGCTGCCTGCTCATGA
Размер ПЦР-продукта - 105 п.н. В качестве матрицы используется геномная ДНК человека.The size of the PCR product is 105 bp. As a matrix, human genomic DNA is used.
2. Обработка продукта ПЦР 1 эндонуклеазами рестрикции BamHI и SalI, клонирование в вектор pQE30 (Qiagen), расщепленный по сайтам BamHI и SalI.2. Processing of the
3. Получение ДНК-дуплекса искусственного мини-гена Е-пептида путем смешивания праймеров Еm2 и Em1.1 в эквимолярном соотношении с последующей достройкой полимеразой Pfu или обратной транскриптазой Mu-MLV (Promega).3. Obtaining the DNA duplex of the artificial E-peptide minigene by mixing the primers Em2 and Em1.1 in an equimolar ratio, followed by completion with Pfu polymerase or Mu-MLV reverse transcriptase (Promega).
4. Обработка ДНК-дуплекса эндонуклеазой рестрикции NdeI с последующим клонированием в вектор рЕТ23а, рЕТ23b или рЕТ23c, обработанный эндонуклеазами рестрикции NdeI и Ecl136.II.4. Processing of the DNA duplex with an NdeI restriction endonuclease, followed by cloning into the pET23a, pET23b or pET23c vector treated with the restriction endonucleases NdeI and Ecl136.II.
5. ПЦР-амплификация на матрице геномной ДНК В. subtilis AJ73 фрагмента, содержащего промотор гена wprA с праймерами Wpr41 и Wpr42 (размер продукта 935 п.н.).5. PCR amplification on a B. subtilis AJ73 genomic DNA matrix of a fragment containing the wprA gene promoter with Wpr41 and Wpr42 primers (product size 935 bp).
6. Обработка продукта ПЦР 3 эндонуклеазами рестрикции BglII и XbaI, лигирование с плазмидной ДНК конструкции 2 на базе вектора рЕТ23, несущей мини-ген Е-пептида устойчивости к эритромицину.6. Processing of the
7. Перенос фрагмента ДНК, содержащего промотор гена wprA и мини-ген Е-пептида устойчивости к эритромицину, из конструкции 6 в конструкцию 2. Для этого проводится обработка ДНК обеих конструкций эндонуклеазами рестрикции XhoI и EcoRI, проводится препаративная очистка фрагмента конструкции 6 длиной 999 п.н. элюцией из агарозного геля, лигирование очищенного фрагмента с расщепленной и очищенной фенольной экстракцией плазмидной ДНК конструкции 2.7. Transfer of the DNA fragment containing the wprA gene promoter and the erythromycin resistance E-mini-gene from construct 6 to construct 2. To do this, the DNA of both constructs is processed with XhoI and EcoRI restriction endonucleases, and preparative purification of construct 6 is carried out with a length of 999 p .n. elution from agarose gel, ligation of the purified fragment with cleaved and purified phenolic extraction of plasmid DNA of construction 2.
В составе конструкции (фиг.1 и фиг.2) можно выделить следующие элементы:The structure of the structure (figure 1 and figure 2) can distinguish the following elements:
- экспрессионный вектор pQE30 (Qiagen);- expression vector pQE30 (Qiagen);
- промотор гена WprA;- promoter of the WprA gene;
- мини-ген Е-пептида, обеспечивающий устойчивость бацилл к эритромицину;- E-peptide mini-gene, which provides the resistance of bacilli to erythromycin;
- ген, кодирующий зрелый ген пептида GHRH_le;- a gene encoding a mature gene of the peptide GHRH_le;
- фрагмент полилинкера вектора рЕТ32 (Novagen).- fragment polylinker vector pET32 (Novagen).
2) Введение в геном В.subtilis AJ73 полученной конструкции. Конструкцию pWpr-le вводили в клетки штамма В.subtilis AJ73 (ВКПМ В-5036) методом химической трансформации по Спицайзену [11].2) Introduction to the genome of B. subtilis AJ73 of the resulting construct. The pWpr-le construct was introduced into the cells of the strain B. subtilis AJ73 (VKPM B-5036) by the method of chemical transformation according to Spitsaisen [11].
Бактериальную культуру выращивали в течение 14-18 часов в бульоне Леннокса (дрожжевой экстракт (Difco) 5 г/л, бактопептон (Difco) 10 г/л, NaCl 5 г/л) при 37°С. Культуру разводили в 20 раз средой SpI и подращивали в течение 4-5 часов. Затем ее разводили теплой (37°С) средой SpII в 10 раз и добавляли MgCl2 до 2,5 мМ. Культуру инкубировали при аэрации на 37°С еще 2 часа. Затем добавляли ДНК (1-2 мкг/мл в случае плазмидной ДНК), клетки инкубировали 1,5-2 часа при 37°С и высевали на сухие чашки с LB - агаром и эритромицином.The bacterial culture was grown for 14-18 hours in Lennox broth (yeast extract (Difco) 5 g / l, bactopeptone (Difco) 10 g / l, NaCl 5 g / l) at 37 ° C. The culture was diluted 20 times with SpI medium and grown for 4-5 hours. Then it was diluted with warm (37 ° C) SpII medium 10 times and MgCl 2 was added to 2.5 mM. The culture was incubated with aeration at 37 ° C for another 2 hours. Then DNA was added (1-2 μg / ml in the case of plasmid DNA), the cells were incubated for 1.5-2 hours at 37 ° C and plated on dry plates with LB agar and erythromycin.
Селекцию колоний осуществляли по возникновению устойчивости к эритромицину в концентрации 15 мкг/мл.Colony selection was carried out by the appearance of resistance to erythromycin at a concentration of 15 μg / ml.
В дальнейшем хранение рекомбинантных штаммов проводилось на чашках Петри с LB - агаром (дрожжевой экстракт (Difco) 5 г/л, бактопептон (Difco) 10 г/л, NaCl 5 г/л, бактоагар (Ferak) 12 г/л), содержащим эритромицин (15 мкг/мл) при +4°С, повторно пересевая 1 раз в месяц.Subsequently, the recombinant strains were stored on Petri dishes with LB agar (yeast extract (Difco) 5 g / l, bactopeptone (Difco) 10 g / l, NaCl 5 g / l, bactoagar (Ferak) 12 g / l) containing erythromycin (15 μg / ml) at + 4 ° C, reseeding once a month.
3) Выделение геномной ДНК из культуры клеток В.subtilis AJ73 и детекция трансгена с помощью ПЦР.3) Isolation of genomic DNA from a cell culture of B. subtilis AJ73 and detection of the transgene by PCR.
Для выделения геномной ДНК культуру клеток клеток В.subtilis AJ73 выращивали в 3 мл среды Леннокса в течение 16 часов при 37°С в условиях интенсивной аэрации. Клетки осаждали центрифугированием при 5000 об/мин. Выделение геномной ДНК из полученных клеток В.subtilis AJ73 проводили с использованием «Комплекта реагентов для выделения ДНК на сорбенте «S-сорб» («Синтол»). Расход реагентов при выделении геномной ДНК из 3 мл культуры соответствовал указанным в инструкции к набору. Полученную геномную ДНК растворяли в 40-50 мкл элюирующего раствора №6 (фиг.3).To isolate genomic DNA, a cell culture of B. subtilis AJ73 cells was grown in 3 ml of Lennox medium for 16 hours at 37 ° C under intensive aeration. Cells were pelleted by centrifugation at 5000 rpm. Isolation of genomic DNA from the obtained B. subtilis AJ73 cells was performed using the “Reagent Kit for DNA Isolation on the S-Sorb” (“Synthol”) sorbent. The consumption of reagents during the isolation of genomic DNA from 3 ml of culture corresponded to those indicated in the instructions for the kit. The resulting genomic DNA was dissolved in 40-50 μl of elution solution No. 6 (figure 3).
Для детекции трансгена с помощью ПЦР были использованы следующие пары праймеров для получения ПЦР-продукта, включающего последовательность ДНК, соответствующую гену пептида GHRH-le - SLN_H1 - SLN_H2:To detect the transgene by PCR, the following primer pairs were used to obtain the PCR product, including the DNA sequence corresponding to the gene of the peptide GHRH - le - SLN_H1 - SLN_H2:
SLN_H1: GGGGATCCTATGCAGATGCCATCTTCACSLN_H1: GGGGATCCTATGCAGATGCCATCTTCAC
SLN_H2: GGGTCGACTATCCCTGCTGCCTGCTCATGA,SLN_H2: GGGTCGACTATCCCTGCTGCCTGCTCATGA,
Размер ПЦР-продукта - 105 п.н.The size of the PCR product is 105 bp.
ПЦР проводили с использованием четырехканального термоциклера ТП4-ПЦР-01-«Терцик» (ООО «НПО ДНК-Технология») в матричном режиме.PCR was performed using a four-channel thermal cycler TP4-PCR-01- "Tertsik" (LLC NPO DNA-Technology) in the matrix mode.
Температура отжига праймеров (Та) составляла +60°С.The primer annealing temperature (Ta) was + 60 ° С.
Объем ПЦР-смеси составил 20 мкл, использована ДНК-полимераза Taq (Fermentas).The volume of the PCR mixture was 20 μl; Taq DNA polymerase (Fermentas) was used.
Электрофорез ПЦР-продуктов проводили в агарозном геле (3%), в буфере ТАЕ (трис (основание) - 40 мМ, ЭДТА - 1 мМ, уксусная кислота - 31 мМ) с использованием молекулярно-весового стандарта GeneRuler™ 50 bp DNA Ladder (MBI Fermentas, кат. № SM 0373) (размеры фрагментов: 50-1000 п.н.) (фиг.4).Electrophoresis of PCR products was carried out on an agarose gel (3%), in TAE buffer (Tris (base) - 40 mM, EDTA - 1 mM, acetic acid - 31 mM) using the
Аутентичность продукта ПЦР в качестве фрагмента гена пептида GHRH_le может быть проконтролирована прямым секвенированием с использованием праймеров SLN-H1 или SLN-H2.The authenticity of the PCR product as a fragment of the GHRH_le peptide gene can be monitored by direct sequencing using SLN-H1 or SLN-H2 primers.
Список использованных источниковList of sources used
1. Bohlen P. Isolation and characterization of the porcine hypothalamic growth hormone releasing factor / Bohlen P., Esch F., Brazeau P., Ling N. and Guillemin R. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1983. - V.116, N.2. - P.726-734.1. Bohlen P. Isolation and characterization of the porcine hypothalamic growth hormone releasing factor / Bohlen P., Esch F., Brazeau P., Ling N. and Guillemin R. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1983 .-- V.116, N.2. - P.726-734.
2. Cravador A. Total DNA synthesis and cloning in Escherichia coli of a gene coding for the human growth hormone releasing factor / Cravador A., Jacobs P., Van Elsen A., Lacroix C., Colau В., Van Alphen P., Herzog A. and Bollen A. // Biochimie - 1985. - V.67. - N.7-8. - P.829-834.2. Cravador A. Total DNA synthesis and cloning in Escherichia coli of a gene coding for the human growth hormone releasing factor / Cravador A., Jacobs P., Van Elsen A., Lacroix C., Colau B., Van Alphen P. , Herzog A. and Bollen A. // Biochimie - 1985 .-- V.67. - N.7-8. - P.829-834.
3. Draghia-Akli R. High-efficiency growth hormone releasing hormone plasmid vector administration into skeletal muscle mediated by electroporation in pigs. / Draghia - Akli R, Elllis KM, Hill L-A, Malone PB, Fiorotto ML // FASEB J. - 2003. - 17. - P.526-528.3. Draghia-Akli R. High-efficiency growth hormone releasing hormone plasmid vector administration into skeletal muscle mediated by electroporation in pigs. / Draghia - Akli R, Elllis KM, Hill L-A, Malone PB, Fiorotto ML // FASEB J. - 2003 .-- 17. - P.526-528.
4. Hirose I. Proteome analysis of Bacillus subtilis extracellular proteins: a two-dimensional protein electrophoretic study / Hirose I., Sano K., Shioda I., Kumano M., Nakamura K. and Yamane К. // Microbiology. - 2000. - 14. - P.65-75.4. Hirose I. Proteome analysis of Bacillus subtilis extracellular proteins: a two-dimensional protein electrophoretic study / Hirose I., Sano K., Shioda I., Kumano M., Nakamura K. and Yamane K. // Microbiology. - 2000. - 14. - P.65-75.
5. Lee S.J. Enhancement of secretion and extracellular stability of staphylokinase in Bacillus subtilis by wprA gene disruption / Lee S.J., Kim D.M., Bae K.H, Byun S.M. and Chung J.H. // Appl. Environ. Microbiol. - 2000. - 66. - P.476-480.5. Lee S.J. Enhancement of secretion and extracellular stability of staphylokinase in Bacillus subtilis by wprA gene disruption / Lee S.J., Kim D.M., Bae K.H, Byun S.M. and Chung J.H. // Appl. Environ. Microbiol. - 2000. - 66. - P.476-480.
6. Stephenson K. Influence of a cell wall associated protease on production of alpha-amylase by Bacillus subtilis / Stephenson K., Harwood C.R. // Appl. Environ. Microbiol. - 1998. - 64. P.2875-2881.6. Stephenson K. Influence of a cell wall associated protease on production of alpha-amylase by Bacillus subtilis / Stephenson K., Harwood C.R. // Appl. Environ. Microbiol. - 1998. - 64. P.2875-2881.
7. Stephenson K. The influence of protein folding on the late stages of the secretion of α-amylases from Bacillus subtilis / Stephenson K., Carter N.M., Harwood C.R., Petit Glatron M.F. and Chambert R. // FEBS Lett. - 1998. - 430. - P.385-389.7. Stephenson K. The influence of protein folding on the late stages of the secretion of α-amylases from Bacillus subtilis / Stephenson K., Carter N.M., Harwood C.R., Petit Glatron M.F. and Chambert R. // FEBS Lett. - 1998. - 430. - P.385-389.
8. Tjalsma H. et al. Proteomics of Protein Secretion by Bacillus subtilis: Separating the "Secrets" of the Secretome / Microbiology and molecular biology reviews. - 2004. - Vol.68. - No.2. - P.207-233.8. Tjalsma H. et al. Proteomics of Protein Secretion by Bacillus subtilis: Separating the "Secrets" of the Secretome / Microbiology and molecular biology reviews. - 2004 .-- Vol.68. - No.2. - P.207-233.
9. Margot, P. The wprA gene of Bacillus subtilis 168, expressed during exponential growth, encodes a cell-wall-associated protease / Margot, P., and D.Karamata. // Microbiology. - 1996. - 142. - P.3437-3444.9. Margot, P. The wprA gene of Bacillus subtilis 168, expressed during exponential growth, encodes a cell-wall-associated protease / Margot, P., and D. Karamata. // Microbiology. - 1996. - 142. - P.3437-3444.
10. Белявская В.А., Сорокулова И.Б., Ромашова Н.Г., соавт. Штамм бактерий Bacillus licheniformis, обладающий антивирусной и антибактериальной активностью. - патент РФ.10. Belyavskaya V.A., Sorokulova I.B., Romashova N.G., et al. The bacterial strain Bacillus licheniformis with antiviral and antibacterial activity. - RF patent.
11. Anagnostopoulos С.Requirements for transformation in Bacillus subtilis / Anagnostopoulos C., Spizizen J. // J. Bacteriol. - 1961. - V.81. - P.741-746.11. Anagnostopoulos C. Requirements for transformation in Bacillus subtilis / Anagnostopoulos C., Spizizen J. // J. Bacteriol. - 1961. - V.81. - P.741-746.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012105584/10A RU2539768C2 (en) | 2012-02-17 | 2012-02-17 | INTEGRATIVE GENETIC CONSTRUCTION pWpr-le |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012105584/10A RU2539768C2 (en) | 2012-02-17 | 2012-02-17 | INTEGRATIVE GENETIC CONSTRUCTION pWpr-le |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2012105584A RU2012105584A (en) | 2013-08-27 |
RU2539768C2 true RU2539768C2 (en) | 2015-01-27 |
Family
ID=49163374
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012105584/10A RU2539768C2 (en) | 2012-02-17 | 2012-02-17 | INTEGRATIVE GENETIC CONSTRUCTION pWpr-le |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2539768C2 (en) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2172343C2 (en) * | 1998-06-30 | 2001-08-20 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Strain of bacterium bacillus licheniformis showing antiviral and antibacterial activity |
US20030055017A1 (en) * | 1997-07-24 | 2003-03-20 | Baylor College Of Medicine And Genemedicine | Growth hormone releasing hormone expression system and methods of use, including use in animals |
US20050164946A1 (en) * | 2003-05-01 | 2005-07-28 | Fischer Laurent B. | Canine GHRH gene, polypeptides and methods of use |
-
2012
- 2012-02-17 RU RU2012105584/10A patent/RU2539768C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030055017A1 (en) * | 1997-07-24 | 2003-03-20 | Baylor College Of Medicine And Genemedicine | Growth hormone releasing hormone expression system and methods of use, including use in animals |
RU2172343C2 (en) * | 1998-06-30 | 2001-08-20 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Strain of bacterium bacillus licheniformis showing antiviral and antibacterial activity |
US20050164946A1 (en) * | 2003-05-01 | 2005-07-28 | Fischer Laurent B. | Canine GHRH gene, polypeptides and methods of use |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
примеры 1-4, формула изобретения. RU 2359033 C2 (СОСЬЕТЕ ДЕ КОНСЕЙ ДЕ РЕШЕРШ Э Д`АППЛИКАСЬОН СЬЕНТИФИК (С.К.Р.А.С.) (FR)), 20.06.2009, формула изобретения. * |
формула изобретения * |
формула изобретения. * |
формула изобретения. . * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2012105584A (en) | 2013-08-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Lin et al. | Molecular Characterization of a Plasmid-Borne (pTC82) Chloramphenicol Resistance Determinant (cat-TC) fromLactobacillus reuteriG4 | |
CA2738781C (en) | Reduced colonization of microbes at the mucosa | |
CN110564663B (en) | Controlled growth of microorganisms | |
Kullen et al. | Genetic modification of intestinal lactobacilli and bifidobacteria | |
KR101640325B1 (en) | Production of butanol from carbon monoxide by a recombinant microorganism | |
Berish et al. | Molecular cloning and characterization of the structural gene for the major iron-regulated protein expressed by Neisseria gonorrhoeae. | |
US20220112455A1 (en) | Auxotrophic strains of staphylococcus bacterium | |
CN107058175B (en) | Streptococcus salivarius and application thereof in preparation of halitosis removing medicines | |
WO2018195136A1 (en) | Compositions and methods for regulated gene expression | |
Majumdar et al. | Identification of the gene for the monomeric alkaline phosphatase of Vibrio cholerae serogroup O1 strain | |
Billington et al. | Identification of a native Dichelobacter nodosus plasmid and implications for the evolution of the vap regions | |
CN110195070B (en) | Mutant gene crp of escherichia coli global regulatory factor and application | |
RU2539768C2 (en) | INTEGRATIVE GENETIC CONSTRUCTION pWpr-le | |
CN101008014B (en) | Lactic acid galactococcus vector of food grade | |
Tanous et al. | Sequence analysis of the mobilizable lactococcal plasmid pGdh442 encoding glutamate dehydrogenase activity | |
Tanimoto et al. | Complete nucleotide sequencing and analysis of the 65-kb highly conjugative Enterococcus faecium plasmid pMG1: identification of the transfer-related region and the minimum region required for replication | |
Puspita et al. | Increase in bacterial colony formation from a permafrost ice wedge dosed with a Tomitella biformata recombinant resuscitation-promoting factor protein | |
CN109825531B (en) | Method for removing pXO2 plasmid in Bacillus anthracis | |
KR100801437B1 (en) | Novel plasmid isolated from l. reuteri from pig and use thereof | |
Nishiki et al. | Expression of the serum opacity factor gene and the variation in its upstream region in Streptococcus dysgalactiae isolates from fish | |
Bartosik et al. | Comparative characterization of repABC-type replicons of Paracoccus pantotrophus composite plasmids | |
CN114164159B (en) | Bivalent vaccine for preventing and treating salmonicida and Edwardsiella tarda infection of fish, and preparation method and application thereof | |
Kavitha et al. | Cloning and molecular characterisation of resuscitation promoting factor-like gene from Mycobacterium avium subspecies avium | |
RU2188233C2 (en) | Strain of bacterium bacillus subtilis pbco1e2 as producer of colicin e2 used for veterinary preparation production | |
Blanch Asensio et al. | Gibson Assembly-based direct cloning of plasmid DNA in Lactiplantibacillus plantarum WCSF1 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170218 |