RU2539752C2 - HUMANISED ANTIBODY AND ANTIGENBINDING FRAGMENT (Fab), WHICH BINDS WITH HUMAN INTERFERON-γ, DNA FRAGMENTS CODING CLAIMED ANTIBODY AND ANTIGEN-BINDING FRAGMENT, CELL, TRANSFORMED BY DNA FRAGMENT, AND METHOD OF OBTAINING CLAIMED ANTIBODY AND ANTIGEN-BINDING FRAGMENT - Google Patents
HUMANISED ANTIBODY AND ANTIGENBINDING FRAGMENT (Fab), WHICH BINDS WITH HUMAN INTERFERON-γ, DNA FRAGMENTS CODING CLAIMED ANTIBODY AND ANTIGEN-BINDING FRAGMENT, CELL, TRANSFORMED BY DNA FRAGMENT, AND METHOD OF OBTAINING CLAIMED ANTIBODY AND ANTIGEN-BINDING FRAGMENT Download PDFInfo
- Publication number
- RU2539752C2 RU2539752C2 RU2013123639/10A RU2013123639A RU2539752C2 RU 2539752 C2 RU2539752 C2 RU 2539752C2 RU 2013123639/10 A RU2013123639/10 A RU 2013123639/10A RU 2013123639 A RU2013123639 A RU 2013123639A RU 2539752 C2 RU2539752 C2 RU 2539752C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- fab
- fragment
- antigen
- cells
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Изобретение относится к антителам, в частности к гуманизированным антителам, связывающимся с интерфероном-γ человека.The invention relates to antibodies, in particular to humanized antibodies that bind to human interferon-γ.
Уровень техникиState of the art
Развитие иммунного ответа млекопитающих обеспечивается несколькими типами клеток, которые специфично взаимодействуют с чужеродным материалом, то есть антигенами. Один из типов клеток, B-клетки, отвечает за продукцию антител. Другой тип клеток, T-клетки, включающий в себя ряд клеточных субпопуляций, который обеспечивает разрушение клеток, инфицированных вирусом, или контроль за функциями B-клеток и гемопоэтических клеток in vivo, а также самих T-клеток. Третий тип клеток, макрофаги, обрабатывают и представляют антигены в комплексе молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC) T-клеткам. Взаимодействия между этими типами клеток обеспечиваются совместным действием цитокинов, таких как интерлейкины-1-6 и интерферон-γ (ИФН-γ) (см. в основном Paul, W.E., Fundamental Immunology, 3rd ed., Raven Press, New York (1993).The development of the immune response of mammals is provided by several types of cells that specifically interact with foreign material, that is, antigens. One type of cell, B cells, is responsible for antibody production. Another type of cell, T cells, includes a series of cell subpopulations that destroy the cells infected with the virus or control the functions of B cells and hematopoietic cells in vivo, as well as the T cells themselves. The third type of cells, macrophages, process and present antigens in the complex with molecules of the main histocompatibility complex (MHC) to T cells. Interactions between these cell types are mediated by the combined action of cytokines such as interleukins-1-6 and interferon-γ (IFN-γ) (see mainly Paul, WE, Fundamental Immunology, 3 rd ed., Raven Press, New York (1993 )
Одним из важнейших цитокинов является ИФН-γ, секретируемый некоторыми T-клетками. ИФН-γ обладает противовирусной активностью, а также стимулирует NK-клетки и T-хелперные клетки 1 типа (T×1), активирует макрофаги и стимулирует экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости на поверхности клеток (Paul, стр.764-766). Таким образом, в случае аутоиммунных заболеваний, при которых наблюдается повышенная активность иммунной системы, использование антагонистов ИФН-γ может способствовать нейтрализации стимулирующих эффектов данного цитокина и, соответственно, быть полезно для терапии таких заболеваний. Результаты клинических исследований показали, что использование поликлональных антител к ИФН-γ способствует терапии Th1-опосредованных аутоиммунных заболеваний (Skurkovich В. & S. Skurkovich. Anti-interferon-γ antibodies in the treatment of autoimmune diseases. Curr. Opin. in Mol. Therapeutics (2003) 5(1): 52-57).One of the most important cytokines is IFN-γ, secreted by some T cells. IFN-γ has antiviral activity and also stimulates NK cells and type 1 T-helper cells (T × 1), activates macrophages and stimulates the expression of the molecules of the main histocompatibility complex on the cell surface (Paul, pp. 764-766). Thus, in the case of autoimmune diseases in which there is an increased activity of the immune system, the use of IFN-γ antagonists can help to neutralize the stimulating effects of this cytokine and, accordingly, be useful for the treatment of such diseases. Clinical studies have shown that the use of polyclonal antibodies to IFN-γ promotes the treatment of Th1-mediated autoimmune diseases (Skurkovich, B. & S. Skurkovich. Anti-interferon-γ antibodies in the treatment of autoimmune diseases. Curr. Opin. In Mol. Therapeutics (2003) 5 (1): 52-57).
Компанией Protein Design Labs был получен препарат на основе моноклонального антитела против ИФН-γ - Fontolizumab (US Patent Application Publication: Humanized antibodies to gamma-interferon. Pub. No.: US 2002/0091240 A1, Jul. 11, 2002). Были проведены клинические испытания эффективности данного препарата для терапии болезни Крона (Reinisch W, de Villiers W, Bene L, Simon L et al., Inflamm Bowel Dis. 2010 Feb; 16(2): 233-42).Protein Design Labs obtained a drug based on a monoclonal anti-IFN-γ antibody, Fontolizumab (US Patent Application Publication: Humanized antibodies to gamma-interferon. Pub. No .: US 2002/0091240 A1, Jul. 11, 2002). Clinical trials of the effectiveness of this drug for the treatment of Crohn's disease have been conducted (Reinisch W, de Villiers W, Bene L, Simon L et al., Inflamm Bowel Dis. 2010 Feb; 16 (2): 233-42).
Использование моноклональных антител животного происхождения имеет ряд недостатков при терапии заболеваний человека, особенно выраженных при повторных введениях препарата. Например, мышиные моноклональные антитела имеют короткое время циркуляции в организме человека, а также вследствие неспособности их Fc-фрагмента связываться с человеческими рецепторами на поверхности эффекторных клеток не обладают важными функциональными характеристиками.The use of monoclonal antibodies of animal origin has a number of disadvantages in the treatment of human diseases, especially pronounced during repeated injections of the drug. For example, murine monoclonal antibodies have a short circulation time in the human body, and also due to the inability of their Fc fragment to bind to human receptors on the surface of effector cells, they do not have important functional characteristics.
Возможно, более важной особенностью мышиных моноклональных антител является то, что они содержат аминокислотные последовательности, которые являются иммуногенными для человека. Ряд исследований показывает (R. Fagnani, Immunol. Ser. 61 (1994) 3-22; M.B. Khazaeli, R.M. Conry, A.F. LoBuglio, J Immunother. 15 (1994) 42-52; K. Kuus-Reichel, L.S. Grauer, L.M. Karavodin, C. Knott, M. Krusemeier, N.E. Kay, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1 (1994) 365-372), что введение чужеродного антитела может вызывать сильный иммунный ответ у пациента и в конечном итоге приводит к неэффективности терапии уже на ранней стадии лечения. Более того, при использовании мышиных или других чужеродных (для человека) антител для лечения различных заболеваний последующее лечение другими мышиными антителами может быть неэффективно или даже опасно из-за кросс-реактивности используемых антител.Perhaps a more important feature of murine monoclonal antibodies is that they contain amino acid sequences that are immunogenic to humans. A number of studies show (R. Fagnani, Immunol. Ser. 61 (1994) 3-22; MB Khazaeli, RM Conry, AF LoBuglio, J Immunother. 15 (1994) 42-52; K. Kuus-Reichel, LS Grauer, LM Karavodin, C. Knott, M. Krusemeier, NE Kay, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1 (1994) 365-372) that the introduction of a foreign antibody can cause a strong immune response in the patient and ultimately leads to treatment failure already at an early stage of treatment. Moreover, when using murine or other foreign (for humans) antibodies to treat various diseases, subsequent treatment with other murine antibodies can be ineffective or even dangerous due to the cross-reactivity of the antibodies used.
Для снижения неблагоприятных реакций пациентов при использовании антител в терапии указанные антитела или их части должны быть гуманизированы для того, чтобы быть менее иммуногенными, чем их мышиные прототипы. Так, авторы настоящего изобретения на основе мышиных моноклональных антител, обладающих способностью с высокой специфичностью и высоким аффинитетом связываться с человеческим ИФН-γ, и каркасных участков антител человека сконструировали гуманизированные антигенсвязывающие фрагменты (Fab) против ИФН-γ.To reduce the adverse reactions of patients when using antibodies in therapy, these antibodies or parts thereof must be humanized in order to be less immunogenic than their murine prototypes. Thus, the authors of the present invention based on murine monoclonal antibodies with the ability to bind to human IFN-γ with high specificity and high affinity, and human antibody framework fragments constructed humanized antigen-binding fragments (Fab) against IFN-γ.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Задачей, решаемой авторами настоящего изобретения, было получение гуманизированного антитела и, в частности, антигенсвязывающего участка антитела (Fragment antigen binding, Fab), способного к связыванию с человеческим ИФН-γ.The problem solved by the authors of the present invention was to obtain a humanized antibody and, in particular, antigen binding site of the antibody (Fragment antigen binding, Fab), capable of binding to human IFN-γ.
Техническим результатом является получение нового гуманизированного антитела, способного к связыванию с человеческим ИФН-γ, характеризующегося Кд 4,6 нМ и параметром IC50 в тесте на клетках U937 не менее 1,5 нМ.EFFECT: obtaining a new humanized antibody capable of binding to human IFN-γ, characterized by a CD of 4.6 nM and an IC 50 parameter of at least 1.5 nM in the test on U937 cells.
Поставленная задача решается путем конструирования гуманизированного антигенсвязывающего фрагмента (Fab) против человеческого ИФН-γ на основе ранее изолированного авторами настоящего изобретения моноклонального мышиного антитела против человеческого ИФН-γ и демонстрации высокой специфичности указанного антитела в связывании с человеческим ИФН-γ.The problem is solved by constructing a humanized antigen-binding fragment (Fab) against human IFN-γ based on a monoclonal mouse antibody against human IFN-γ previously isolated by the authors of the present invention and demonstrating the high specificity of this antibody in binding to human IFN-γ.
Таким образом, настоящее изобретение предоставляет новое гуманизированное антитело, селективно связывающее человеческий ИФН-γ, отличающееся тем, что вариабельный участок тяжелой цепи (VH) указанного антитела содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, а вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2.Thus, the present invention provides a new humanized antibody that selectively binds human IFN-γ, characterized in that the variable region of the heavy chain (VH) of the indicated antibody contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the variable region of the light chain (VL) of the indicated antibody contains amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
Также настоящее изобретение предоставляет изолированный фрагмент ДНК, кодирующий гуманизированное антитело, описанное выше, или его фрагмент, представляющий собой вариабельный участок тяжелой цепи, характеризующийся последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 1, или вариабельный участок легкой цепи, характеризующийся последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 2.The present invention also provides an isolated DNA fragment encoding the humanized antibody described above, or a fragment thereof, which is a variable region of the heavy chain, characterized by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or a variable region of the light chain, characterized by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
Также настоящее изобретение предоставляет гуманизированный антигенсвязывающий фрагмент (Fab), селективно связывающий человеческий ИФН-γ, который содержит вариабельный участок тяжелой цепи (VH) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 1, соединенной с доменом CH1 человеческого иммуноглобулина, и вариабельный участок легкой цепи (VL) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 2, соединенной с CL человеческого иммуноглобулина.The present invention also provides a humanized antigen binding fragment (Fab) that selectively binds human IFN-γ, which contains the variable region of the heavy chain (VH) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, connected to the
Также настоящее изобретение предоставляет гуманизированный антигенсвязывающий фрагмент (Fab), описанный выше, отличающийся тем, что доменом CH1 является домен CH1 человеческого иммуноглобулина IgG1, а доменом CL является домен CL человеческого иммуноглобулина каппа.The present invention also provides a humanized antigen binding fragment (Fab) described above, characterized in that the
Также настоящее изобретение предоставляет изолированный фрагмент ДНК, кодирующий антигенсвязывающий фрагмент (Fab) против человеческого ИФН-γ, описанный выше.The present invention also provides an isolated DNA fragment encoding an antigen binding fragment (Fab) against human IFN-γ described above.
Также настоящее изобретение предоставляет плазмидную ДНК, содержащую изолированный фрагмент ДНК, кодирующий антигенсвязывающий фрагмент (Fab) против человеческого ИФН-γ, описанный выше.The present invention also provides plasmid DNA containing an isolated DNA fragment encoding an antigen binding fragment (Fab) against human IFN-γ described above.
Также настоящее изобретение предоставляет бактериальную клетку, содержащую упомянутую выше плазмидную ДНК, обладающую способностью к продукции Fab.The present invention also provides a bacterial cell containing the aforementioned plasmid DNA having the ability to produce Fab.
Также настоящее изобретение предоставляет упомянутую выше бактериальную клетку, которая представляет собой клетку Escherichia coli.The present invention also provides the bacterial cell mentioned above, which is an Escherichia coli cell.
Также настоящее изобретение предоставляет плазмидную ДНК, содержащую изолированный фрагмент ДНК, кодирующий гуманизированное антитело против человеческого ИФН-γ, описанное выше.The present invention also provides plasmid DNA containing an isolated DNA fragment encoding a humanized anti-human IFN-γ antibody described above.
Также настоящее изобретение предоставляет клетку эукариот, содержащую упомянутую выше плазмидную ДНК, обладающую способностью к продукции гуманизированного антитела.The present invention also provides a eukaryotic cell containing the aforementioned plasmid DNA having the ability to produce a humanized antibody.
Также настоящее изобретение предоставляет упомянутую выше клетку эукариот, которая представляет собой клетку яичников Cricetulus griseus (CHO).The present invention also provides the aforementioned eukaryotic cell, which is an ovarian cell of Cricetulus griseus (CHO).
Также настоящее изобретение предоставляет способ получения гуманизированного антитела, включающий в себя культивирование клеток в питательной среде и выделение указанного антитела из культуральной жидкости.The present invention also provides a method for producing a humanized antibody, comprising culturing cells in a culture medium and isolating said antibody from the culture fluid.
Также настоящее изобретение предоставляет способ получения антигенсвязывающего фрагмента (Fab), включающий в себя культивирование клеток в питательной среде и выделение указанного антиген-связывающего фрагмента из культуральной жидкости.The present invention also provides a method for producing an antigen binding fragment (Fab), comprising culturing cells in a culture medium and isolating said antigen binding fragment from the culture fluid.
Краткое описание фигурBrief Description of the Figures
На Фиг.1 показана схема секвенирования, нуклеотидная последовательность клонированного гена, кодирующего вариабельный домен тяжелой цепи и часть первого константного домена IgG1 мышиного антитела против ИФН-γ, и соответствующая аминокислотная последовательность. Нуклеотидные последовательности ген-специфических праймеров, использованных для секвенирования гена тяжелой цепи антитела против ИФН-γ, подчеркнуты, аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела выделена жирным шрифтом, аминокислотная последовательность, относящаяся к первому константному домену IgG1 антитела мыши, выделена курсивом.Figure 1 shows the sequencing scheme, the nucleotide sequence of the cloned gene encoding the variable domain of the heavy chain and part of the first constant IgG1 domain of a mouse anti-IFN-γ antibody, and the corresponding amino acid sequence. The nucleotide sequences of the gene-specific primers used for sequencing the anti-IFN-γ antibody heavy chain gene are underlined, the amino acid sequence of the antibody heavy chain variable domain is shown in bold, the amino acid sequence corresponding to the first constant IgG1 domain of the mouse antibody is shown in italics.
На Фиг.2 показана схема секвенирования, нуклеотидная последовательность клонированного гена, кодирующего вариабельный домен легкой цепи и часть константного домена легкой каппа-цепи мышиного антитела против ИФН-γ, и соответствующая аминокислотная последовательность. Нуклеотидные последовательности ген-специфических праймеров, использованных для секвенирования гена тяжелой цепи антитела против ИФН-γ, подчеркнуты, аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела выделена жирным шрифтом, аминокислотная последовательность, относящаяся к константному домену легкой каппа-цепи антитела мыши, выделена курсивом.Figure 2 shows the sequencing scheme, the nucleotide sequence of the cloned gene encoding the variable domain of the light chain and part of the constant domain of the light Kappa chain of a mouse anti-IFN-γ antibody, and the corresponding amino acid sequence. The nucleotide sequences of gene-specific primers used for sequencing the anti-IFN-γ antibody heavy chain gene are underlined, the amino acid sequence of the antibody light chain variable domain is shown in bold, and the amino acid sequence corresponding to the constant domain of the mouse antibody kappa chain is shown in italics.
На Фиг.3 показано сравнение мышиной, человеческой и гуманизированной аминокислотных последовательностей вариабельного домена тяжелой цепи антитела против ИФН-γ.Figure 3 shows a comparison of the murine, human and humanized amino acid sequences of the variable domain of the heavy domain of antibodies against IFN-γ.
На Фиг.4 показано сравнение мышиной, человеческой и гуманизированной аминокислотных последовательностей вариабельного домена легкой цепи антитела против ИФН-γ.Figure 4 shows a comparison of the murine, human and humanized amino acid sequences of the variable domain of the light chain of the antibody against IFN-γ.
Подробное описание настоящего изобретенияDetailed description of the present invention
Антитела обычно состоят из двух тяжелых цепей, связанных между собой дисульфидными связями, и легких цепей, ассоциированных с N-концом каждой из тяжелых цепей. Каждая тяжелая цепь содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом на другом конце. Каждая легкая цепь содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом на другом конце. Вариабельные домены каждой пары легкой и тяжелой цепей образуют антигенсвязывающий участок. Вариабельные домены легкой и тяжелой цепей обладают похожей общей структурой, и каждый домен включает каркас из четырех участков, последовательности которых являются относительно консервативными, связанных посредством трех участков, определяющих комплементарность (complementarity determining regions, CDRs). Четыре каркасных участка формируют конформацию типа бета-складчатого слоя. Участки CDRs расположены в близком соседстве друг с другом благодаря каркасным участкам и вносят вклад в образование антигенсвязывающего участка. Участки CDRs и каркасные участки антител могут быть определены путем ссылки на нумерационную систему Кабата (Kabat numbering system, Kabat et al., 1987 "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office) в сочетании с данными рентгеноструктурного анализа, как указано в заявке WO 91/09967.Antibodies usually consist of two heavy chains linked together by disulfide bonds, and light chains associated with the N-terminus of each of the heavy chains. Each heavy chain contains at the N-terminus a variable domain with a constant domain at the other end. Each light chain contains at the N-terminus a variable domain with a constant domain at the other end. The variable domains of each pair of light and heavy chains form an antigen-binding site. The variable domains of light and heavy chains have a similar overall structure, and each domain includes a framework of four regions, the sequences of which are relatively conservative, linked through three regions that define complementarity (complementarity determining regions, CDRs). Four frame sections form a beta-fold type conformation. Plots of CDRs are located in close proximity to each other due to the skeleton plots and contribute to the formation of antigen-binding plot. Plots of CDRs and frame regions of antibodies can be determined by reference to the Kabat numbering system (Kabat numbering system, Kabat et al., 1987 "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office) in combined with X-ray diffraction analysis data, as described in WO 91/09967.
Для получения антитела, которое может связываться с каким-либо специфическим антигеном, обычно используют методику Kohler и Milstein (Kohler et al. (1976) Nature 256: 495-497). Моноклональные антитела получают путем слияния клеток селезенки из иммунизированного животного и клеток миеломы с получением гибридомы. Гибридомы могут быть проверены на способность к продукции нужного антитела, затем гибридомы могут быть выращены, из них могут быть выделены указанные антитела. Термин «выращенные клетки», использованный здесь, означает гибридомы или другие линии клеток, которые производят антитела. Методы получения и проверки таких выращенных клеток описаны Harlow и др. (Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1988). Получение материала, использующегося в качестве антигена, для инъекции животных включают в себя методики, хорошо известные из уровня техники, например использование полноразмерного белка, использование пептида, выбранного из иммуногенных участков белка, а также любыми другими методами, известными из уровня техники. См. Harlow и др. (см. выше).Kohler and Milstein (Kohler et al. (1976) Nature 256: 495-497) are usually used to produce antibodies that can bind to any specific antigen. Monoclonal antibodies are obtained by fusion of spleen cells from an immunized animal and myeloma cells to produce a hybridoma. Hybridomas can be tested for the ability to produce the desired antibody, then hybridomas can be grown, and these antibodies can be isolated. The term "grown cells", as used here, means hybridomas or other cell lines that produce antibodies. Methods for obtaining and testing such grown cells are described by Harlow et al. (Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1988). The preparation of material used as an antigen for injection of animals includes techniques well known in the art, for example using a full-sized protein, using a peptide selected from immunogenic regions of the protein, as well as any other methods known in the art. See Harlow et al. (See above).
Подходящий способ для выделения антител, эффективных для использования в рамках настоящего изобретения, включает (a) назначение животному эффективного количества белка или пептида с целью получения антител, (b) выделение указанных антител, (c) определение последовательности антител и конструирование гуманизировнных антител.A suitable method for isolating antibodies effective for use in the framework of the present invention includes (a) administering to the animal an effective amount of a protein or peptide to produce antibodies, (b) isolating said antibodies, (c) determining the sequence of antibodies and constructing humanized antibodies.
Ранее авторы настоящего изобретения получили панель мышиных моноклональных антител против человеческого ИФН-γ. В результате детального изучения свойств антител было отобрано антитело F1. Указанное антитело F1 обладает следующими характеристиками: 1) взаимодействует с человеческим ИФН-γ (константа диссоциации комплекса составляет 1,7×10-9 М; 2) обладает нейтрализующей активностью по отношению к человеческому ИФН-γ, IC50 в тесте на клетках U937 составила менее 1,5 нМ. Мышиное антитело имеет IgG1 изотип и содержит легкую каппа-цепь.Previously, the present inventors obtained a panel of murine monoclonal antibodies against human IFN-γ. As a result of a detailed study of the properties of antibodies, antibody F1 was selected. The indicated F1 antibody has the following characteristics: 1) interacts with human IFN-γ (the dissociation constant of the complex is 1.7 × 10 -9 M; 2) has neutralizing activity against human IFN-γ, IC 50 in the test on U937 cells amounted to less than 1.5 nM. The mouse antibody has an IgG1 isotype and contains a kappa light chain.
Затем авторы настоящего изобретения клонировали гены, кодирующие вариабельные домены тяжелой и легкой цепей мышиного антитела против человеческого ИФН-γ, и определили их последовательности (SEQ ID NO: 3 и 4 соответственно). Такое антитело содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 5 в качестве вариабельного участка тяжелой цепи (VH) антитела, последовательность аминокислот SEQ ID NO: 6 в качестве вариабельного участка легкой цепи (VL) антитела и консервативные участки обеих цепей, необходимые для функционирования антитела.The authors of the present invention then cloned the genes encoding the variable domains of the heavy and light chains of the mouse anti-human IFN-γ, and determined their sequences (SEQ ID NO: 3 and 4, respectively). Such an antibody contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 as the variable region of the heavy chain (VH) of the antibody, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 as the variable region of the light chain (VL) of the antibody, and the conserved regions of both chains necessary for the functioning of the antibody.
Затем были осуществлены дизайн и гуманизация мышиного антитела против человеческого ИФН-γ. Сначала были определены границы каркасных участков согласно Kabat, E.A., Wu, T.T., Reid-Miller, М., Perry, Н.М. and Gottesman, K.S. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, (1987) U.S. Department of Health and Human Services, NIH, Bethesda, MD). Для вариабельного домена каждой цепи были найдены ближайшие гомологи в базе данных человеческих последовательностей вариабельных доменов антител зародышевой линии - IGHV1-3*01-IGHJ6*01 и IGKV4-1*01-IGKJ2*01 для VH и VL соответственно. Окончательные последовательности гуманизированных вариабельных доменов антитела против ИФН-γ человека были составлены преимущественно из последовательностей каркасных участков выбранных генов вариабельных доменов антител человека и последовательностей мышиных CDR (Фиг.1 и 2). Термин "CDR" или "участок, определяющий комплементарность" относится к тем частям тяжелой и легкой цепи антитела, которые расположены в непосредственной близости друг от друга в трехмерном пространстве и формируют антигенсвязывающую поверхность антитела.Then, the design and humanization of a mouse antibody against human IFN-γ was carried out. First, the boundaries of the frame sections were determined according to Kabat, E.A., Wu, T.T., Reid-Miller, M., Perry, N.M. and Gottesman, K.S. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, (1987) U.S. Department of Health and Human Services, NIH, Bethesda, MD). For the variable domain of each chain, the closest homologues were found in the human sequence of germline antibody variable domains — IGHV1-3 * 01-IGHJ6 * 01 and IGKV4-1 * 01-IGKJ2 * 01 for VH and VL, respectively. The final sequences of the humanized variable domains of the anti-IFN-γ antibody were predominantly composed of the frame regions of the selected human antibody variable domain genes and murine CDR sequences (FIGS. 1 and 2). The term "CDR" or "complementarity determining region" refers to those parts of the heavy and light chains of an antibody that are located in close proximity to each other in three-dimensional space and form the antigen-binding surface of the antibody.
Так было выполнено настоящее изобретение.Thus, the present invention has been completed.
В частности, антителом согласно настоящему изобретению является гуманизированное антитело, обладающее способностью к связыванию человеческого ИФН-γ.In particular, the antibody of the present invention is a humanized antibody having the ability to bind human IFN-γ.
Таким антителом является антитело, содержащее последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1 в качестве вариабельного участка тяжелой цепи (VH) указанного антитела, последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2 в качестве вариабельного участка легкой цепи (VL) указанного антитела и консервативные участки обеих цепей, необходимых для функционирования указанного антитела. Такое новое гуманизированное антитело селективно ввязывается с человеческим ИФН-γ. Консервативные участки тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина IgG, IgM, IgA, IgD или IgE могут быть использованы в качестве консервативных участков для тяжелой цепи согласно настоящему изобретению. Консервативные участки легкой цепи человеческого иммуноглобулина каппа или лямбда могут быть использованы в качестве консервативных участков для легкой цепи антитела согласно настоящему изобретению.Such an antibody is an antibody comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as the variable region of the heavy chain (VH) of the indicated antibody, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as the variable region of the light chain (VL) of the indicated antibody and the conserved regions of both chains required for the functioning of the specified antibodies. Such a new humanized antibody selectively binds to human IFN-γ. Conservative sections of the heavy chain of the human immunoglobulin IgG, IgM, IgA, IgD or IgE can be used as conservative sections for the heavy chain according to the present invention. Conservative regions of the light chain of the human immunoglobulin kappa or lambda can be used as conservative regions for the light chain of an antibody of the present invention.
Также антигенсвязывающим фрагментом (Fab) согласно настоящему изобретению является изолированный Fab, который селективно связывается с человеческим ИФН-γ и который включает в себя вариабельный участок тяжелой цепи (VH) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 1, соединенный с доменом CH1 иммуноглобулина человека, и вариабельный участок легкой цепи (VL) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 2, соединенный с доменом CL иммуноглобулина человека. Домен CH1 тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина IgG, IgM, IgA, IgD или IgE может быть использован в качестве домена CH1 тяжелой цепи Fab согласно настоящему изобретению. Домен CL легкой цепи человеческого иммуноглобулина каппа или лямбда может быть использован в качестве домена CL легкой цепи Fab согласно настоящему изобретению. Такой Fab согласно настоящему изобретению представлен, но не ограничивается Fab, содержащим последовательности аминокислот SEQ ID NO: 7 (тяжелая цепь) и SEQ ID NO: 8 (легкая цепь) (Фиг.3 и 4).Also, the antigen-binding fragment (Fab) of the present invention is an isolated Fab that selectively binds to human IFN-γ and which includes a heavy chain variable region (VH) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 connected to the
В настоящем изобретении термин "антитело" использован для описания иммуноглобулинов или их фрагментов, мономеров или димеров легкой цепи или тяжелой цепи, одноцепочечных антител, таких как одноцепочечные антитела Fv's, в которых вариабельные домены тяжелой и легкой цепей соединены пептидным линкером, а также как природных, так и полученных методами рекомбинантных ДНК или другим образом, при условии, что антитело содержит, по крайней мере, один антигенсвязывающий участок. Остальная часть антитела не должна обязательно включать только последовательность, производную от иммуноглобулина. Например, может быть сконструирован ген, в котором часть цепи, последовательность ДНК, кодирующая часть цепи человеческого иммуноглобулина, соединена с последовательностью ДНК, кодирующей последовательность аминокислот полипептида эффектора или молекулы-репортера. Используемый в настоящем документе термин «антитело» предназначен для обозначения молекул иммуноглобулина, составленных из четырех полипептидных цепей, при этом две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи связываются друг с другом дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно называемую в настоящем документе VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов: CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно называемую в настоящем документе VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена: CL. Области VH и VL могут далее подразделяться на области гипервариабельности, которые называются определяющими комплементарность областями (CDR), перемежаемые областями с более высоким уровнем консервативности, называемыми каркасными областями (FR). Каждая область VH и VL образована тремя CDR и четырьмя FR, расположенными от амино-терминального конца к карбокси-терминальному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Используемый в настоящем документе термин «антиген-связывающая область» антитела обозначает один или несколько фрагментов антитела, которые сохраняют способность к специфическому связыванию с антигеном. К примерам связывающих фрагментов, включенных в термин «антиген-связывающая область» антитела, относятся (i) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) фрагмент F(ab')2, бивалентный фрагмент, состоящий из двух фрагментов Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH отдельной области антитела; (v) фрагмент dAb (Ward et al. (1989) Nature 241: 544-546), состоящий из домена VH; и (vi) отдельная определяющая комплементарность область (CDR). Более того, несмотря на то что два домена в фрагменте Fv, VL и VH кодируются различными генами, их можно объединить, используя рекомбинантные технологии, посредством синтетического линкера, который позволяет построить из них единую белковую цепочку, в которой области VL и VH связываются с образованием моновалентных молекул (известных как одиночная цепь Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также включаются в сферу охвата термина «антигенсвязывающая область» антитела.In the present invention, the term "antibody" is used to describe immunoglobulins or fragments thereof, monomers or dimers of a light chain or heavy chain, single chain antibodies, such as Fv's single chain antibodies, in which the variable domains of the heavy and light chains are connected by a peptide linker, as well as natural, and obtained by recombinant DNA methods or in another way, provided that the antibody contains at least one antigen binding site. The rest of the antibody does not need to include only the sequence derived from immunoglobulin. For example, a gene can be constructed in which a part of a chain, a DNA sequence encoding a part of a chain of human immunoglobulin, is connected to a DNA sequence encoding the amino acid sequence of an effector polypeptide or reporter molecule. As used herein, the term “antibody” is intended to refer to immunoglobulin molecules composed of four polypeptide chains, with two heavy (H) chains and two light (L) chains linking to each other by disulfide bonds. Each heavy chain contains a variable region of the heavy chain (abbreviated herein as VH) and a constant region of the heavy chain. The constant region of the heavy chain consists of three domains: CH1, CH2 and CH3. Each light chain contains a variable region of the light chain (abbreviated herein as VL) and a constant region of the light chain. The constant region of the light chain consists of one domain: CL. The VH and VL regions can be further subdivided into hypervariability regions, which are called complementarity determining regions (CDRs), interspersed by regions with a higher level of conservatism, called framework regions (FR). Each VH and VL region is formed by three CDRs and four FRs, located from the amino-terminal end to the carboxy-terminal end in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As used herein, the term “antigen binding region” of an antibody refers to one or more fragments of an antibody that retain the ability to specifically bind to an antigen. Examples of binding fragments included in the term “antigen binding region” of an antibody include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and CH1 domains; (ii) a F (ab ′) 2 fragment, a bivalent fragment consisting of two Fab fragments linked by a disulfide bridge in the hinge region; (iii) a Fd fragment consisting of the VH and CH1 domains; (iv) an Fv fragment consisting of the VL and VH domains of a single region of an antibody; (v) a dAb fragment (Ward et al. (1989) Nature 241: 544-546) consisting of the VH domain; and (vi) a separate complementarity determining region (CDR). Moreover, despite the fact that the two domains in the Fv, VL, and VH fragments are encoded by different genes, they can be combined using recombinant technologies using a synthetic linker that allows them to build a single protein chain in which the VL and VH regions bind to form monovalent molecules (known as single chain Fv (scFv); see, for example, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Such single chain antibodies are also included within the scope of the term “antigen binding region” of an antibody.
Термин "гуманизированное антитело" используется для описания антитела, содержащего по крайней мере один, а предпочтительно два или три участка CDR в одном или обоих вариабельных участках, полученных из антитела первого вида животного, это понимается как то, что он может содержать определенный выбранный каркасный участок из аминокислот, соединенный с определенной гипервариабельной последовательностью аминокислот. Оставшиеся части антитела, полученные из иммуноглобулина Ig, получают из одного или нескольких различных антител. Вариабельные домены могут быть получены с использованием техники рекомбинантных ДНК или пептидным синтезом.The term "humanized antibody" is used to describe an antibody containing at least one, and preferably two or three, sections of the CDR in one or both of the variable regions derived from the antibodies of the first animal species, this is understood to mean that it may contain a specific selected frame section from amino acids connected to a specific hypervariable amino acid sequence. The remaining parts of the antibody obtained from Ig immunoglobulin are obtained from one or more different antibodies. Variable domains can be obtained using recombinant DNA techniques or peptide synthesis.
Гуманизированные антитела или их связывающие белки согласно настоящему изобретению содержат последовательности аминокислот, включающие в себя все или части CDR, полученные главным образом из моноклонального антитела, обладающего специфичностью к человеческому ИФН-γ. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения таким моноклональным антителом является мышиное по происхождению антитело. Аминокислотные последовательности каркасных участков вариабельных доменов антитела или их части являются главным образом человеческими по происхождению в наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения и, следовательно, "гуманизированными антителами". Эта "гуманизация" считается полезной в снижении иммуногенности указанного антитела при терапевтическом назначении пациентам. Определенные выбранные аминокислотные остатки в каркасных участках остаются мышиными, а не человеческими. Считается, что это необходимо для достижения нужной трехмерной структуры молекулы и таким образом для повышения связывающей специфичности и аффинности к человеческому ИФН-γ.Humanitariannet antibodies or their binding proteins according to the present invention contain amino acid sequences including all or part of the CDR, obtained mainly from monoclonal antibodies with specificity for human IFN-γ. In a most preferred embodiment, the monoclonal antibody is a murine antibody of origin. The amino acid sequences of the framework regions of the variable domains of an antibody, or parts thereof, are mainly human in origin in the most preferred embodiment of the invention and, therefore, "humanized antibodies". This "humanization" is considered useful in reducing the immunogenicity of the indicated antibodies for therapeutic use in patients. Certain selected amino acid residues in the framework regions remain murine, not human. It is believed that this is necessary to achieve the desired three-dimensional structure of the molecule and thus to increase the binding specificity and affinity for human IFN-γ.
В настоящем изобретении фраза "антитело или Fab, обладающий способностью к связыванию с человеческим ИФН-γ" означает молекулу, которая связывается с человеческим ИФН-γ и образует стабильный комплекс. Способность антитела или Fab к связыванию с антигеном может быть определена специалистом в данной области с использованием методов, включающих, но не ограничивающихся методом иммуноферментного анализа (ИФА), равновесным диализом, с использованием плазмон-поверхностного резонанса. Методы определения аффинности хорошо известны специалисту в данной области техники, подробно описаны Janeway и др. (Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Garland Publishing Company, 1996)). Изолированным фрагментом ДНК, кодирующим антитело, согласно настоящему изобретению является экспрессирующийся фрагмент ДНК, содержащий промотор, сигнальную последовательность, последовательность нуклеотидов, кодирующую структурные части тяжелой и легкой цепи антитела, участок терминации транскрипции.In the present invention, the phrase "antibody or Fab having the ability to bind to human IFN-γ" means a molecule that binds to human IFN-γ and forms a stable complex. The ability of an antibody or Fab to bind to an antigen can be determined by a person skilled in the art using methods including but not limited to enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), equilibrium dialysis, using plasmon surface resonance. Methods for determining affinity are well known to those skilled in the art, described in detail by Janeway et al. (Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Garland Publishing Company, 1996)). An isolated DNA fragment encoding an antibody according to the present invention is an expressed DNA fragment containing a promoter, a signal sequence, a nucleotide sequence encoding the structural parts of the antibody heavy and light chains, a transcription termination site.
Изолированным фрагментом ДНК, кодирующим антитело, согласно настоящему изобретению является экспрессирующийся фрагмент ДНК, содержащий промотор, сигнальную последовательность, нуклеотидную последовательность, кодирующую структурные части тяжелой и легкой цепей антитела, участок терминации транскрипции.An isolated DNA fragment encoding an antibody according to the present invention is an expressed DNA fragment containing a promoter, a signal sequence, a nucleotide sequence encoding the structural parts of the antibody heavy and light chains, and a transcription termination site.
В частности, нуклеотидные последовательности, кодирующие структурные части тяжелой и легкой цепи антитела согласно настоящему изобретению, содержат фрагмент ДНК, кодирующий вариабельный участок тяжелой цепи (VH) (SEQ ID NO: 9) и вариабельный участок легкой цепи (VL) (SEQ ID NO: 10), связанный с фрагментом ДНК, кодирующим консервативные участки обеих цепей, необходимые для функционирования указанного антитела. Нуклеотидные последовательности, кодирующие Fab согласно настоящему изобретению, представлены, но не ограничиваются нуклеотидными последовательностями с 1 по 711 нуклеотид в SEQ ID NO: 11 (тяжелая цепь) и с 1 по 660 нуклеотид в SEQ ID NO: 12 (легкая цепь) (Фиг.3 и 4). Фрагмент ДНК, кодирующий Fab согласно настоящему изобретению, может быть получен любым методом, известным специалисту в данной области техники, включая ПЦР с использованием набора перекрывающихся праймеров, химическим способом и т.д.In particular, the nucleotide sequences encoding the structural parts of the heavy and light chains of the antibodies of the present invention comprise a DNA fragment encoding the heavy chain variable region (VH) (SEQ ID NO: 9) and the light chain variable region (VL) (SEQ ID NO: 10) associated with a DNA fragment encoding the conserved regions of both chains necessary for the functioning of the specified antibodies. The nucleotide sequences encoding the Fab of the present invention are presented, but are not limited to
Ввиду вырожденности трансляционного кода могут быть различия в последовательности ДНК. Фрагменты ДНК согласно настоящему изобретению не ограничены фрагментами, показанными в SEQ ID NO: 9 или 10, при условии, что они кодируют участки цепей антитела с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 1 или 2.Due to the degeneracy of the translation code, there may be differences in the DNA sequence. The DNA fragments of the present invention are not limited to the fragments shown in SEQ ID NO: 9 or 10, provided that they encode antibody chain sections with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2.
Фрагменты ДНК, кодирующие гуманизированное антитело и гуманизированный антигенсвязывающий фрагмент (Fab), селективно связывающий человеческий ИФН-γ, может быть встроен в вектор (плазмиду). Под вектором подразумевается плазмида, содержащая набор генетических элементов для экспрессии клонированного фрагмента в бактериальных и эукариотических клетках. В частности, к векторам, способным обеспечивать экспрессию указанных антител в клетках бактерий Escherichia coli, относятся, но не ограничиваются этим перечнем вектора серии pET (Novagen), pQE (Qiagen), pTrc (GE Healthcare). К векторам, способным обеспечивать экспрессию указанных антител в эукариотических клетках, относятся, но не ограничиваются этим перечнем вектора серии pcDNA и pOptiVEC (Invitrogen). Для получения гуманизированного антитела и гуманизированного антигенсвязывающего фрагмента (Fab), селективно связывающего человеческий ИФН-γ, может быть использован любой метод получения рекомбинантных антител, известный специалисту в данной области. включающий в себяDNA fragments encoding a humanized antibody and a humanized antigen binding fragment (Fab) that selectively binds human IFN-γ can be inserted into a vector (plasmid). By vector is meant a plasmid containing a set of genetic elements for expression of a cloned fragment in bacterial and eukaryotic cells. In particular, vectors capable of expressing these antibodies in Escherichia coli bacterial cells include, but are not limited to, the pET (Novagen), pQE (Qiagen), pTrc (GE Healthcare) series vectors. Vectors capable of providing expression of these antibodies in eukaryotic cells include, but are not limited to, pcDNA and pOptiVEC (Invitrogen) series vectors. To obtain a humanized antibody and a humanized antigen binding fragment (Fab) that selectively binds human IFN-γ, any recombinant antibody method known to one skilled in the art can be used. including
Продукция антитела может быть осуществлена, в частности, в бактериальных и эукариотических клетках. Примером клетки бактерий, пригодных для продукции Fab, согласно настоящему изобретению являются, но не ограничиваются ими, клетки бактерии Escherichia coli. Фраза "бактерии Escherichia coli" означает, что указанные бактерии классифицируют как Escherichia coli (E.coli) в соответствии с классификацией, известной специалисту в данной области микробиологии. Примерами бактерий E.coli, применимых в рамках настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, бактерии E.coli BL-21 (DE3) (Novagen).Antibody production can be carried out, in particular, in bacterial and eukaryotic cells. An example of bacterial cells suitable for Fab production according to the present invention are, but are not limited to, Escherichia coli bacterial cells. The phrase "Escherichia coli bacteria" means that these bacteria are classified as Escherichia coli (E. coli) in accordance with a classification known to one skilled in the art of microbiology. Examples of E. coli bacteria useful in the framework of the present invention include, but are not limited to, E. coli BL-21 (DE3) bacteria (Novagen).
Примером эукариотической клетки, пригодной для продукции полноразмерного антитела, согласно настоящему изобретению являются, но не ограничиваются ими, клетки яичников Cricetulus griseus (CHO). Фраза "клетки яичников Cricetulus griseus" означает, что указанные эукариотические клетки классифицируют как клетки яичников С.griseus (CHO) в соответствии с классификацией, известной специалисту в данной области биотехнологии. Примерами клеток яичников Cricetulus griseus (CHO), применимых в рамках настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, клетки яичников Cricetulus griseus (CHO) клетки CHO DG44 (Invitrogen).An example of a eukaryotic cell suitable for the production of a full-sized antibody according to the present invention are, but are not limited to, ovarian cells Cricetulus griseus (CHO). The phrase “Cricetulus griseus ovarian cells” means that said eukaryotic cells are classified as C. griseus ovary (CHO) cells according to a classification known to one skilled in the art of biotechnology. Examples of Cricetulus griseus ovary cells (CHO) useful in the framework of the present invention include, but are not limited to, Cricetulus griseus ovary cells (CHO) CHO DG44 cells (Invitrogen).
Способом согласно настоящему изобретению является способ получения полноразмерного гуманизированного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий выращивание трансформированных клеток (Escherichia coli, клетки эукариот) в питательной среде и выделение полученных антител из культуральной жидкости. В настоящем изобретении выращивание, накопление и очистка антител из культуральной жидкости может быть осуществлена методом, сходным с традиционными методами ферментации, когда некий белок производится с использованием трансформированных клеток.The method according to the present invention is a method for producing a full-sized humanized antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising growing transformed cells (Escherichia coli, eukaryotic cells) in a nutrient medium and isolating the obtained antibodies from the culture fluid. In the present invention, the growth, accumulation and purification of antibodies from the culture fluid can be carried out by a method similar to traditional fermentation methods, when a certain protein is produced using transformed cells.
Выращивание клеток Escherichia coli осуществляют в аэробных условиях, таких как культивирование с перемешиванием, взбалтывание с аэрации при температуре от 20 до 37°C, предпочтительно от 28 до 30°C. Выращивание обычно продолжают в течение 18-24 часов.Cultivation of Escherichia coli cells is carried out under aerobic conditions, such as cultivation with stirring, shaking with aeration at a temperature of from 20 to 37 ° C, preferably from 28 to 30 ° C. Cultivation is usually continued for 18-24 hours.
Выращивание клеток эукариот осуществляют в атмосфере 5% CO2 в режиме культивирования с перемешиванием в синтетических средах, таких как среда OptiCHO, в течение нескольких 3-6 суток.The cultivation of eukaryotic cells is carried out in an atmosphere of 5% CO 2 in a culture mode with stirring in synthetic media, such as OptiCHO medium, for several 3-6 days.
После выращивания твердые компоненты, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрации с использованием мембраны, а затем антитела или Fab могут быть выделены и очищены методом осаждения с солями с использованием сульфата натрия или сульфата аммония, аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии, ионообменной хроматографии и т.п.After growth, solid components, such as cells, can be removed from the culture fluid by centrifugation or membrane filtration, and then the antibodies or Fab can be isolated and purified by salt precipitation using sodium sulfate or ammonium sulfate, affinity chromatography, and ion exchange chromatography ion exchange chromatography and the like
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Последующие примеры приведены для целей объяснения и не ограничивают каким-либо образом рамки настоящего изобретения.The following examples are provided for purposes of explanation and do not in any way limit the scope of the present invention.
Пример 1. Получение клеток гибридом, продуцирующих мышиные моноклональные антитела против ИФН-γExample 1. Obtaining hybridoma cells producing murine monoclonal antibodies against IFN-γ
Мыши линии Balb/c в возрасте 8 недель были иммунизированы введением внутрибрюшинно 50 мкг рекомбинантного человеческого ИФН-γ трижды с двухнедельными интервалами. Для первой иммунизации раствор антигена был смешан с равным объемом полного адъюванта Фрейнда до образования гомогенной эмульсии. Подобным образом, но с использованием неполного адъюванта Фрейнда был приготовлен антиген для второй иммунизации. Для третьей, и последней, иммунизации использовался раствор 50 мкг ИФН-γ в буфере PBS.8 week old Balb / c mice were immunized intraperitoneally with 50 μg of recombinant human IFN-γ three times at two-week intervals. For the first immunization, the antigen solution was mixed with an equal volume of Freund's complete adjuvant until a homogeneous emulsion formed. Similarly, but using incomplete Freund's adjuvant, an antigen was prepared for the second immunization. For the third and last immunization, a solution of 50 μg IFN-γ in PBS buffer was used.
На 4-й день после третьей иммунизации у мышей была взята кровь для получения сыворотки, которая использовалась в качестве положительного контроля. Селезенка была гомогенизирована, половина полученных лимфоцитов была заморожена в жидком азоте с добавлением диметилсульфоксида до 10%, остаток лимфоцитов был слит с клетками миеломы штамма SP2/0 с использованием 50% PEG4000 в соответствии со стандартным протоколом.On the 4th day after the third immunization, blood was taken from mice to obtain serum, which was used as a positive control. The spleen was homogenized, half of the obtained lymphocytes were frozen in liquid nitrogen with dimethyl sulfoxide added up to 10%, the remainder of the lymphocytes was fused to myeloma cells of strain SP2 / 0 using 50% PEG4000 in accordance with the standard protocol.
Клетки были высеяны на 96-луночные планшеты в среде DMEM с добавлением L-глютамина, пирувата натрия, гентамицина, НАТ (гипоксантин, аминоптерин, тимидин) и 8% фетальной сыворотки. Предварительно в лунки была внесена суспензия клеток-помощников - перитонеальных макрофагов, полученных промыванием перитонеальной полости здоровых мышей. Первичный рост культур оценивали визуально с помощью микроскопа. На 10-12 день после гибридизации супернатанты из лунок были проверены на содержание специфических антител методом ИФА.Cells were plated on 96-well plates in DMEM supplemented with L-glutamine, sodium pyruvate, gentamicin, NAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) and 8% fetal serum. Previously, a suspension of helper cells, peritoneal macrophages obtained by washing the peritoneal cavity of healthy mice, was introduced into the wells. Primary growth of cultures was evaluated visually using a microscope. On 10-12 days after hybridization, the supernatants from the wells were tested for the content of specific antibodies by ELISA.
Первичные культуры из лунок, содержащих моноклональные антитела (МоАТ), были дважды клонированы методом лимитирующих разведений в среде DMEM с теми же добавками, что и при первичном посеве, за исключением НАТ, на слое клеток-помощников. Положительные клоны, при необходимости, были реклонированы еще 1-3 раза, после чего были определены изотипы МоАт с использованием метода ИФА.Primary cultures from wells containing monoclonal antibodies (MoATs) were cloned twice by limiting dilution in DMEM medium with the same additives as in the initial plating, with the exception of NAT, on a layer of helper cells. Positive clones, if necessary, were re-cloned 1-3 more times, after which MoAb isotypes were determined using the ELISA method.
Пример 2. Выделение моноклональных антител против человеческого ИФН-γ и определение константы их взаимодействия с ИФН-γExample 2. Isolation of monoclonal antibodies against human IFN-γ and determination of the constant of their interaction with IFN-γ
Выбранные клоны гибридом были инокулированы в мышей, предварительно праймированных пристанем. Асциты собирали на 7-10 день после инокуляции клеток. Все МоАТ были выделены из асцитных жидкостей аффинной хроматографией на Protein G-сефарозе и диализованы против буфера PBS. Концентрация была измерена спектрофотометрически при длине волны 280 нм. Коэффициент экстинкции (E) иммуноглобулинов с концентрацией 1 мг/мл равен 1,4.Selected clones of hybridomas were inoculated in mice previously primed with marina. Ascites were collected 7-10 days after cell inoculation. All MoATs were isolated from ascites liquids by affinity chromatography on Protein G-Sepharose and dialyzed against PBS buffer. The concentration was measured spectrophotometrically at a wavelength of 280 nm. The extinction coefficient (E) of immunoglobulins with a concentration of 1 mg / ml is 1.4.
Асциты были взяты в объеме 6 мл, разведены в MES-буфере 1:4 и очищены методом хроматографии на колонке с Protein G-сефарозой.Ascites were taken in a volume of 6 ml, diluted in 1: 4 MES buffer and purified by Protein G-Sepharose column chromatography.
Константы диссоциации МоАТ определяли в соответствии с методикой, предложенной Klotz I.M. (The Proteins. Ed. H. Neurath and K. Bailey Academic Press, New York. 1953. V.1. P.727), с модификациями из В. Friguet и др. (В. Friguet et. al. Measurements of the True Affinity Constant in Solution of Antigen-Antibody Complex by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Journal of Immunological Methods, 77 (1985) 305-319).MoAT dissociation constants were determined in accordance with the method proposed by Klotz I.M. (The Proteins. Ed. H. Neurath and K. Bailey Academic Press, New York. 1953. V.1. P.727), with modifications from B. Friguet et al. (B. Friguet et. Al. Measurements of the True Affinity Constant in Solution of Antigen-Antibody Complex by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Journal of Immunological Methods, 77 (1985) 305-319).
Для установления равновесия в системе антиген-антитело в лунки планшета для ИФА, предварительно блокированные 0,25% желатином, вносили 50 мкл рекомбинантного человеческого ИФН-γ в концентрации 10-10 М в PBS-AT (PBS, 2 мг/мл BSA, 0.1% Tween 20) по три дорожки каждого и титровали серией двукратных разведении антител в объеме 50 мкл нужной концентрации. Проводили инкубацию при комнатной температуре на шейкере в течение двух часов. После инкубации содержимое всех лунок переносили в другой планшет, лунки которого предварительно покрывали рекомбинантным человеческим ИФН-γ в концентрации 5 мкг/мл в PBS, инкубировали 1 час, отмывали буфером PBS-T (PBS, 0.05% Tween 20) и добавляли 100 мкл конъюгата пероксидазы хрена с анти-мышиными IgG. После инкубации в течение 1 часа и отмывки добавляли раствор субстрата ТМВ. Через 20 мин реакцию останавливали добавлением равного объема 10% H2SO4 и проводили измерение оптической плотности при длине волны 450 нм на приборе Multiscan (Thermo Scientific).To establish equilibrium in the antigen-antibody system, 50 μl of recombinant human IFN-γ at a concentration of 10 -10 M in PBS-AT (PBS, 2 mg / ml BSA, 0.1) was added to the wells of an ELISA plate previously blocked with 0.25% gelatin. % Tween 20) three tracks each and were titrated with a series of two dilutions of antibodies in a volume of 50 μl of the desired concentration. Conducted incubation at room temperature on a shaker for two hours. After incubation, the contents of all wells were transferred to another plate, the wells of which were previously coated with recombinant human IFN-γ at a concentration of 5 μg / ml in PBS, incubated for 1 hour, washed with PBS-T buffer (PBS, 0.05% Tween 20) and 100 μl of conjugate was added horseradish peroxidase with anti-mouse IgG. After incubation for 1 hour and washing, a TMB substrate solution was added. After 20 minutes, the reaction was stopped by adding an equal volume of 10% H 2 SO 4 and optical density was measured at a wavelength of 450 nm on a Multiscan instrument (Thermo Scientific).
Константы диссоциации рассчитывали в соответствии с уравнением Клотца:Dissociation constants were calculated in accordance with the Klotz equation:
Ao/Ao-A=1+1/a Kd, гдеAo / Ao-A = 1 + 1 / a Kd, where
Ao - оптическая плотность, измеренная в лунках в отсутствие антигена,Ao is the optical density measured in the wells in the absence of antigen,
A - оптическая плотность, измеренная для свободных антител в смеси антиген-антитело,A is the optical density measured for free antibodies in a mixture of antigen-antibody,
a - концентрация антигена.a is the concentration of antigen.
Значения этих параметров для антитела F1 против человеческого ИФН-γ приведены в таблице. Концентрация антител для определения Kd выбрана в линейной части калибровочной кривой и составляла 30 нг/мл для антитела F1.The values of these parameters for antibody F1 against human IFN-γ are shown in the table. The concentration of antibodies to determine K d selected in the linear part of the calibration curve and was 30 ng / ml for antibody F1.
Как видно из приведенных данных, моноклональное антитело связывается с антигеном с высокой аффинностью, так как конечная точка титрования соответствует концентрации моноклонального антитела 3 нг/мл.As can be seen from the above data, the monoclonal antibody binds to the antigen with high affinity, since the end point of the titration corresponds to a concentration of monoclonal antibody of 3 ng / ml.
В результате проведенных вычислений было получено следующее значение константы диссоциации моноклонального антитела:As a result of the calculations, the following value of the dissociation constant of a monoclonal antibody was obtained:
Kd(F1)=1,7×10-9 MK d (F1) = 1.7 × 10 -9 M
Пример 3. Клонирование и секвенирование последовательностей кДНК, кодирующих вариабельные домены мышиного антитела F1 против человеческого ИФН-γExample 3. Cloning and sequencing of cDNA sequences encoding the variable domains of murine antibodies F1 against human IFN-γ
На первом этапе были выделены гены вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей МоАТ F1. Из 1-2×106 клеток гибридомы F1 выделяли тотальную РНК с помощью реагента Trizol (Invitrogen) согласно рекомендуемому производителем протоколу. С помощью реакции обратной транскрипции была синтезирована кДНК, кодирующая вариабельные фрагменты легкой и тяжелой цепей МоАТ. Для амплификации данных последовательностей были использованы следующие праймеры:At the first stage, the genes of the variable domains of the light and heavy chains of MoAT F1 were isolated. Total RNA was isolated from 1-2 × 10 6 cells of F1 hybridoma using Trizol reagent (Invitrogen) according to the protocol recommended by the manufacturer. Using the reverse transcription reaction, cDNA was synthesized encoding the variable fragments of the light and heavy chains of MoAT. The following primers were used to amplify these sequences:
SMRibo (SEQ ID NO: 13) 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCrGrGrGSMRibo (SEQ ID NO: 13) 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCrGrGrG
RT-KAP (SEQ ID NO: 14) 5'-GAGTCAGCACACGAAGAACTTGRT-KAP (SEQ ID NO: 14) 5'-GAGTCAGCACACGAAGAACTTG
NesG (SEQ ID NO: 15) 5'-CAGGGGCCAGTGGATAGACNesG (SEQ ID NO: 15) 5'-CAGGGGCCAGTGGATAGAC
Полученные ПЦР-фрагменты длиной около 450 п.о. клонировали во вспомогательный вектор pAL-TA (Евроген), после чего с помощью секвенирования были определены нуклеотидные последовательности. Полученные последовательности оценивали с помощью сравнения с гомологичными последовательностями, находящимися в базе данных GeneBank (IgBlast), что подтвердило их принадлежность к генам вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи антител Mus musculus. Таким образом, были получены нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.The resulting PCR fragments with a length of about 450 bp cloned into an auxiliary vector pAL-TA (Eurogen), after which nucleotide sequences were determined by sequencing. The obtained sequences were evaluated by comparison with homologous sequences located in the GeneBank database (IgBlast), which confirmed their belonging to the genes of the variable domains of the heavy and light chains of Mus musculus antibodies. Thus, the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 were obtained.
Пример 4. Дизайн вариабельных областей фрагмента Fab гуманизированного антитела F1 и конструирование генов, кодирующих фрагмент Fab гуманизированного антитела F1 против человеческого ИФН-γExample 4. Design of the variable regions of the Fab fragment of the humanized antibody F1 and the construction of genes encoding the Fab fragment of the humanized antibody F1 against human IFN-γ
Для сохранения аффинности мышиного антитела F1 в гуманизированном варианте в основном был использован метод Queen и др. (Queen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029 (1989) and U.S. Pat. Nos. 5,585,089 and 5,693,762). Выбор источника последовательностей каркасных областей для гуманизированного антитела может быть критичным для сохранения аффинности антитела. В принципе, последовательности каркасных областей любого человеческого антитела могут служить в качестве матрицы для пересадки CDR-областей; однако было показано, что простая замена CDR-областей в таком человеческом антителе может приводить к значительному снижению аффинности по отношению к антигену (Tempest et al., Biotechnology 9: 266 (1992)). Чем выше гомология между последовательностями человеческого и мышиного антитела, тем меньше вероятность внесения человеческими каркасными областями искажений в структуру CDR-последовательностей, приводящих к снижению аффинности.To maintain the affinity of the murine F1 antibody in the humanized version, the method of Queen et al. (Queen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029 (1989) and U.S. Pat. Nos. 5,585,089 and 5,693,762) was mainly used. The selection of the source of the framework region sequences for a humanized antibody may be critical to maintaining antibody affinity. In principle, the frame region sequences of any human antibody can serve as a template for transplanting CDR regions; however, it has been shown that simply replacing the CDR regions in such a human antibody can lead to a significant decrease in affinity for the antigen (Tempest et al., Biotechnology 9: 266 (1992)). The higher the homology between the sequences of the human and mouse antibodies, the less is the likelihood that human framework regions introduce distortions into the structure of CDR sequences, resulting in a decrease in affinity.
С использованием базы данных IgBlast из последовательностей функциональных вариабельных областей антител зародышевой линии человека были выбраны последовательности с наибольшей степенью гомологии по отношению к аминокислотным последовательностям вариабельных доменов мышиного антитела F1 - IGHV1-3*01-IGHJ6*01 и IGKV4-1*01-IGKJ2*01 для тяжелой и легкой цепи соответственно. На основании литературных данных и анализа пространственной модели вариабельных фрагментов легкой и тяжелой цепей мышиного антитела F1 против ИФН-γ, полученных с помощью сервера Rosetta (Rosetta antibody modeling server), были выбраны аминокислотные остатки в последовательностях человеческих каркасных областей тяжелой цепи, обратная замена которых на соответствующие остатки в мышином антителе F1, вероятно, приведет к восстановлению аффинности гуманизированного антитела F1. В результате проверки нескольких вариантов обратных замен были получены последовательности вариабельных доменов гуманизированного антитела F1, содержащие две обратные замены в тяжелой цепи: I69F и R71A (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2). Гены вариабельных доменов легких и тяжелых цепей гуманизированного Fab против ИФН-γ синтезировали из набора перекрывающихся олигонуклеотидов с помощью ПЦР. Фрагменты ДНК, кодирующие гены вариабельных доменов легких и тяжелых цепей гуманизированного Fab против ИФН-γ, с помощью метода ПЦР с перекрывающимися областями были объединены с генами константного домена легкой цепи человека каппа Cκ и константного домена тяжелой цепи IgG1 человека CH1 соответственно (SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12).Using the IgBlast database, sequences with the highest degree of homology with respect to the amino acid sequences of the variable domains of mouse antibodies F1 — IGHV1-3 * 01-IGHJ6 * 01 and IGKV4-1 * 01-IGKJ2 * were selected from the sequences of the functional variable regions of human germline antibodies. 01 for the heavy and light chains, respectively. Based on literature data and an analysis of the spatial model of variable fragments of the light and heavy chains of mouse anti-IFN-γ mouse antibodies obtained using the Rosetta server (Rosetta antibody modeling server), amino acid residues were selected in the sequences of human heavy chain framework regions, the reverse of which is the corresponding residues in the F1 mouse antibody are likely to restore the affinity of the humanized F1 antibody. As a result of checking several reverse substitution variants, the sequences of the humanized antibody F1 variable domains were obtained containing two reverse substitutions in the heavy chain: I69F and R71A (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2). Genes of the variable domains of the light and heavy chains of humanized Fab against IFN-γ were synthesized from a set of overlapping oligonucleotides using PCR. DNA fragments encoding the genes of the variable domains of the light and heavy chains of humanized Fab against IFN-γ, using PCR with overlapping regions were combined with the genes of the constant domain of the human light chain Kappa C κ and the constant domain of the heavy chain of
Пример 5. Получение антигенсвязывающих фрагментов (Fab) против человеческого ИФН-γ в клетках E.coliExample 5. Obtaining antigen-binding fragments (Fab) against human IFN-γ in E. coli cells
Гены, кодирующие фрагмент Fab гуманизированного антитела против человеческого ИФН-γ, были клонированы в экспрессионный вектор, описанный в статье (Калиниченко А.А. и др. Биоорганическая химия 36(1): 122-132, 2010), который был использован для синтеза фрагмента Fab гуманизированного антитела F1 в клетках E.coli. Для биосинтеза рекомбинантного Fab-фрагмента гуманизированного антитела F1 использовали метод автоиндукции, для чего клетки выращивали в питательной среде 2ZY, содержащей 2 мМ MgSO4, 25 мМ Na2HPO4, 25 мМ KH2PO4, 50 мМ NH4Cl, 5 мМ Na2SO4, 0.5% глицерина, 0.05% глюкозы, 0.2% моногидрата α-лактозы и ампициллин, в течение 20 ч при температуре 30°C. Оптическая плотность культуры к моменту завершения инкубации достигала 7 OE600. После завершения инкубации клетки осаждали, культуральную жидкость, содержащую целевой белок, концентрировали с помощью тангенциальной фильтрации через мембрану с нижней границей удержания 30 кДа (Millipore) и диализовали против буфера, содержащего 47 мМ K2HPO4, 3 мМ KH2PO4, 500 мМ KCl, 0,001% PMSF, pH 8.0. Полученный раствор наносили на Co2+-ИДА-сефарозу (GE Healthcare, США), уравновешенную калиево-фосфатным буфером, используемым для диализа. Белок элюировали фосфатно-солевым буфером (ФСБ) pH 7.4, содержащим 300 мМ имидазола. Наличие и чистоту целевого белка во фракциях анализировали с помощью электрофореза в восстанавливающих условиях в 12,5% ПААГ по методу Лэммли. Фракции, содержащие целевой белок соответствующего размера, объединяли и концентрировали с помощью концентратора Amicon Ultra (Millipore) с нижней границей удержания 30 кДа, после чего разбавляли буфером и наносили на колонку Superdex 75-10/300-GL (GE Healthcare). Фракция, выходящая на 22 минуте, была собрана, сконцентрирована и диализована против ФСБ, pH 7.4.Genes encoding a Fab fragment of a humanized anti-human IFN-γ antibody were cloned into the expression vector described in the article (Kalinichenko A.A. et al. Bioorganic chemistry 36 (1): 122-132, 2010), which was used for synthesis a Fab fragment of a humanized antibody F1 in E. coli cells. The autoinduction method was used for the biosynthesis of the recombinant Fab fragment of the humanized F1 antibody, for which the cells were grown in 2ZY growth medium containing 2 mM MgSO 4 , 25 mM Na 2 HPO 4 , 25 mM KH 2 PO 4 , 50 mM NH 4 Cl, 5 mM Na 2 SO 4 , 0.5% glycerol, 0.05% glucose, 0.2% α-lactose monohydrate and ampicillin, for 20 hours at a temperature of 30 ° C. The optical density of the culture at the time of completion of the incubation reached 7 OE 600 . After completion of the incubation, the cells were besieged, the culture fluid containing the target protein was concentrated by tangential filtration through a membrane with a lower retention limit of 30 kDa (Millipore) and dialyzed against a buffer containing 47 mM K 2 HPO 4 , 3 mM KH 2 PO 4 , 500 mM KCl, 0.001% PMSF, pH 8.0. The resulting solution was applied to Co 2+ IDA-Sepharose (GE Healthcare, USA), balanced with potassium phosphate buffer used for dialysis. The protein was eluted with phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 containing 300 mM imidazole. The presence and purity of the target protein in the fractions was analyzed by electrophoresis under reducing conditions in 12.5% SDS page according to the Laemmli method. Fractions containing the desired protein of the appropriate size were pooled and concentrated using an Amicon Ultra concentrator (Millipore) with a lower retention limit of 30 kDa, then diluted with buffer and applied to a Superdex 75-10 / 300-GL column (GE Healthcare). The fraction leaving at 22 minutes was collected, concentrated and dialyzed against FSB, pH 7.4.
В результате был получен Fab-фрагмент гуманизированного антитела против человеческого ИФН-γ, отличающееся тем, что вариабельный участок тяжелой цепи (VH) указанного антитела содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, a вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2.The result was a Fab fragment of a humanized anti-human IFN-γ antibody, characterized in that the variable region of the heavy chain (VH) of the indicated antibody contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the variable region of the light chain (VL) of the indicated antibody contains the amino acid sequence SEQ ID NO: 2.
Пример 6. Получение полноразмерного гуманизированного антитела против человеческого ИФН-γ в клетках линии CHOExample 6. Obtaining a full-sized humanized antibody against human IFN-γ in cells of the CHO line
Конструирование фрагмента ДНК, кодирующего нуклеотидную последовательность тяжелой цепи полноразмерного гуманизированного антитела против человеческого ИФН-γ проводили последовательным присоединением к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 9 фрагмента ДНК, кодирующего 5'-нетранслируемую область; последовательности лидерного пептида, обеспечивающего секрецию иммуноглоболинов; константных доменов CH1-CH3 тяжелой цепи человека IgG1-подкласса; фрагмента ДНК, кодирующего 3'-нетранслируемую область и содержащего сайт полиаденилирования.The construction of the DNA fragment encoding the nucleotide sequence of the heavy chain of a full-sized humanized anti-human IFN-γ antibody was carried out by sequentially adding to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 a DNA fragment encoding a 5'-untranslated region; sequences of a leader peptide that provides for the secretion of immunoglobulins; constant domains of the C H 1 -
Конструирование фрагмента ДНК, кодирующего нуклеотидную последовательность легкой цепи полноразмерного гуманизированного антитела против человеческого ИФН-γ, проводили последовательным присоединением к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 10 следующих нуклеотидных последовательностей: фрагмента ДНК, кодирующего 5'-нетранслируемую область; последовательности лидерного пептида, обеспечивающего секрецию иммуноглоболинов; константного домена легкой цепи человека каппа-подкласса; фрагмента ДНК, кодирующего 3'-нетранслируемую область и содержащего сайт полиаденилирования.The construction of the DNA fragment encoding the nucleotide sequence of the light chain of a full-sized humanized anti-human IFN-γ antibody was carried out by sequentially adding the following nucleotide sequences to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10: a DNA fragment encoding a 5'-untranslated region; sequences of a leader peptide that provides for the secretion of immunoglobulins; human Kappa subclass light chain constant domain; a DNA fragment encoding a 3'-untranslated region and containing a polyadenylation site.
Объединение указанных фрагментов в случае легкой цепи антитела осуществляли посредством метода ПЦР с перекрыванием амплифицируемых фрагментов (SOE-PCR). В случае тяжелых цепей присоединение 5'-нетранслируемой области и последовательности лидерного пептида также осуществляли методом SOE-PCR, в то время как присоединение константных доменов CH1-CH3 тяжелой цепи человека IgG1-подкласса и 3'-нетранслируемой области, содержащей сайт полиаденилирования, производили рестрикцией-лигированием по Apa I-сайту, присутствующему на 5'-конце нуклеотидной последовательности человеческого CH1 домена.The combination of these fragments in the case of an antibody light chain was carried out by PCR method with overlapping amplified fragments (SOE-PCR). In the case of heavy chains, the addition of the 5'-untranslated region and the leader peptide sequence was also carried out by the SOE-PCR method, while the addition of the constant domains of the C H 1 -
На 5'-конце полученных таким образом нуклеотидных последовательностей был размещен сайт рестрикции Nhe I, а на 3'-конце - сайт рестрикции Xho I. В результате был получен фрагмент ДНК, включающий в себя нуклеотидную последовательность зрелой тяжелой цепи полноразмерного гуманизированного антитела против человеческого ИФН-γ (SEQ ID NO: 13) и фрагмент ДНК, включающий в себя нуклеотидную последовательность зрелой легкой цепи полноразмерного гуманизированного антитела против человеческого ИФН-γ. Последовательность легкой цепи полноразмерного гуманизированного антитела против человеческого ИФН-γ полностью соответствует SEQ ID NO: 12.The Nhe I restriction site was located at the 5'-end of the nucleotide sequences thus obtained, and the Xho I restriction site was placed at the 3'-end. As a result, a DNA fragment was obtained that included the nucleotide sequence of the mature heavy chain of a full-sized humanized anti-human IFN antibody -γ (SEQ ID NO: 13) and a DNA fragment comprising the nucleotide sequence of a mature light chain of a full-sized humanized anti-human IFN-γ antibody. The light chain sequence of a full-sized humanized anti-human IFN-γ antibody is fully consistent with SEQ ID NO: 12.
Полученные нуклеотидные последовательности тяжелой и легкой цепей гуманизированного антитела были по отдельности встроены по NheI-XhoI сайтам в вектор pcDNA 3.1 (Invitrogen). Таким образом, были получены плазмиды pcDNA-L и pcDNA-H, содержащие легкую и тяжелую цепь гуманизированного антитела, соответственно.The obtained nucleotide sequences of the heavy and light chains of the humanized antibody were individually inserted at the NheI-XhoI sites into the pcDNA 3.1 vector (Invitrogen). Thus, pcDNA-L and pcDNA-H plasmids were obtained containing the light and heavy chains of a humanized antibody, respectively.
Полученные экспрессионные плазмиды использовали для трансфекции клеток CHO. До трансфекции клетки CHO культивировали при 37°C в атмосфере 5% CO2 в среде DMEM, содержащей 10% телячью сыворотку с пониженным содержанием иммуноглобулинов. Клетки высевали на 60 мм чашки и культивировали до плотности 90-95% до трансфекции. После проведения трансфекции клетки продолжали инкубировать 72 ч без замены среды. После инкубирования собирали культуральную среду, центрифугировали 1,500 rpm 5 мин и сохраняли супернатант.The resulting expression plasmids were used to transfect CHO cells. Prior to transfection, CHO cells were cultured at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 in DMEM medium containing 10% calf serum with a reduced content of immunoglobulins. Cells were plated on 60 mm plates and cultured to a density of 90-95% prior to transfection. After transfection, the cells continued to incubate for 72 hours without changing the medium. After incubation, the culture medium was collected, 1,500 rpm was centrifuged for 5 minutes and the supernatant was retained.
Выделение антител проводили с использованием метода аффинной хроматографии. Для выделения белкового препарата из фильтрованной среды использовали подготовленную колонку необходимого размера, содержащую Protein A - сефарозу (GE Healthcare). Объем носителя составлял не менее 5 мл.The selection of antibodies was carried out using the method of affinity chromatography. To isolate the protein preparation from the filtered medium, a prepared column of the required size containing Protein A - Sepharose (GE Healthcare) was used. The media volume was at least 5 ml.
Для уравновешивания колонки с Protein A - сефарозой колонку промывали 5-10 объемами отмывочного буфера, 50 мМ Трис-HCl, pH 7.0. Затем в колонку вносили диализованную против отмывочного буфера культуральную жидкость. После протекания концентрата через колонку и связывания белка колонку промывали 3-10 объемами отмывочного буфера.To balance the column with Protein A - Sepharose, the column was washed with 5-10 volumes of wash buffer, 50 mM Tris-HCl, pH 7.0. Then, the culture fluid dialyzed against wash buffer was added to the column. After concentrate flowed through the column and protein binding, the column was washed with 3-10 volumes of wash buffer.
Элюирование связанных антител проводили с помощью элюирующего буфера, 100 мМ Глицин, pH 3.0. Непосредственно после прохождения элюирующего буфера через колонку он смешивается в соотношении 20:1 с нейтрализующим буфером, 1 M Трис-HCl, pH 9.0 для восстановления нормального значения pH и сохранения связывающей способности антител. Осуществляли фракционную элюцию белка с колонки, для этого на колонку последовательно наносили 5-6 порций буфера для элюции, каждая из которых равна объему колонки. Каждая фракция после элюции смешивалась в соотношении 20:1 с нейтрализующим буфером, собиралась отдельно и затем исследовалась на наличие требуемого белка. Для этих целей использовали электрофоретический и хроматографический анализы. Фракции, содержащие искомые антитела, объединяли. В окончательном виде полученный образец гуманизированных антител к ИФН-γ был сконцентрирован и диализован относительно фосфатного буфера (pH 7,4).Elution of bound antibodies was performed using an elution buffer, 100 mM Glycine, pH 3.0. Immediately after passing the elution buffer through the column, it is mixed in a 20: 1 ratio with neutralizing buffer, 1 M Tris-HCl, pH 9.0 to restore the normal pH and maintain the binding capacity of antibodies. Fractional elution of the protein from the column was carried out; for this purpose, 5-6 portions of elution buffer were successively applied to the column, each of which is equal to the volume of the column. Each fraction after elution was mixed in a ratio of 20: 1 with a neutralizing buffer, collected separately and then examined for the presence of the desired protein. For these purposes, electrophoretic and chromatographic analyzes were used. Fractions containing the desired antibodies were combined. In the final form, the resulting sample of humanized antibodies to IFN-γ was concentrated and dialyzed relative to phosphate buffer (pH 7.4).
В результате было получено полноразмерное антитело IgG против человеческого ИФН-γ, содержащего аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13.The result was a full-length IgG antibody against human IFN-γ containing the amino acid sequences of SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13.
Пример 7. Характеристика аффинности фрагмента Fab гуманизированного антитела F1 против человеческого ИФН-γ, произведенного в клетках E.coliExample 7. Characterization of the affinity of the Fab fragment of the humanized antibody F1 against human IFN-γ produced in E. coli cells
Определение константы диссоциации (Kd) фрагмента Fab гуманизированного антитела F1 определяли в ходе двухступенчатого метода ИФА, как описано в Примере 2. Было установлено, что Kd для фрагмента Fab гуманизированного антитела F1 против человеческого ИФН-γ составляет 4,6×10-9 М.The determination of the dissociation constant (K d ) of the Fab fragment of the humanized antibody F1 was determined using the two-step ELISA as described in Example 2. It was found that K d for the Fab fragment of the humanized antibody F1 against human IFN-γ is 4.6 × 10 -9 M.
Пример 8. Определение нейтрализующей активности фрагмента Fab гуманизированного антитела против человеческого ИФН-γExample 8. Determination of the neutralizing activity of a Fab fragment of a humanized anti-human IFN-γ antibody
Экспрессия антигена HLA-DR была индуцирована на клетках U937, как было описано ранее (Gao J, Folghera S, Fiorentini S et al. The influence of fetal calf serum on interferon-γ induced HLA-DR expression on U937 cells. J Biol Regul Homeost Agents 1993; 7: 115-20). Кратко, 2×105 клеток инкубировались в течение 24 часов при 37°C в среде, содержащей 10 U/мл рИФН-γ (Prospec, Israel). МоАТ и Fab-фрагменты МоАТ добавлялись к клеткам в диапазоне концентраций от 200 нМ до 1,5 нМ (в двукратных разведениях). В качестве отрицательного контроля использовались клетки U937, которые культивировались в среде без добавок. В качестве положительного контроля использовались клетки U937, которые культивировались в среде с добавлением рИФН-γ. FITC-меченные анти-HLA-DR МоАТ были использованы для обнаружения молекул HLA-DR на поверхности клеток U937. Анализ проводился с использованием FACScan цитофлуориметра (Becton-Dickinson, San Jose, СА). Параметр IC50 рассчитывался как концентрация антитела, при которой доля HLA-DR-положительных клеток составляет половину от разницы значений положительного и отрицательного контролей. Таким образом, было определено, что фрагмент Fab гуманизированного антитела F1 обладает нейтрализующей активностью по отношению к человеческому ИФН-γ, IC50 в тесте на клетках U937 составила менее 1,5 нМ.HLA-DR antigen expression was induced on U937 cells as previously described (Gao J, Folghera S, Fiorentini S et al. The influence of fetal calf serum on interferon-γ induced HLA-DR expression on U937 cells. J Biol Regul Homeost Agents 1993; 7: 115-20). Briefly, 2 × 10 5 cells were incubated for 24 hours at 37 ° C in a medium containing 10 U / ml rIFN-γ (Prospec, Israel). MoAT and Fab fragments of MoAT were added to the cells in a concentration range from 200 nM to 1.5 nM (in double dilutions). U937 cells, which were cultured in a medium without additives, were used as a negative control. U937 cells, which were cultured in medium supplemented with rIFN-γ, were used as a positive control. FITC-labeled anti-HLA-DR MoATs were used to detect HLA-DR molecules on the surface of U937 cells. Analysis was performed using a FACScan cytofluorimeter (Becton-Dickinson, San Jose, CA). The parameter IC 50 was calculated as the concentration of antibodies at which the proportion of HLA-DR-positive cells is half the difference between the values of the positive and negative controls. Thus, it was determined that the Fab fragment of the humanized antibody F1 has a neutralizing activity against human IFN-γ, the IC 50 in the test on U937 cells was less than 1.5 nM.
Перечень последовательностейSequence listing
SEQ ID NO:1SEQ ID NO: 1
> 1> 1
> 123> 123
>PRT> PRT
> Artificial sequence> Artificial sequence
> Humanized VH fragment of heavy chain> Humanized VH fragment of heavy chain
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSSYWIEWVRQAPGQRLEWMGEILPGNTNTNYNGKFKGRVTFTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGADYGGDYYAMDYWGQGTTVTVSSAQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSSYWIEWVRQAPGQRLEWMGEILPGNTNTNYNGKFKGRVTFTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGADYGGDYYAMDYWGQGTTVTVSSA
SEQ ID NO:2SEQ ID NO: 2
> 113> 113
>PRT> PRT
> Artificial sequence> Artificial sequence
> Humanized VL fragment of light chain> Humanized VL fragment of light chain
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGQGTKLEIKDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGQGTKLEIK
> 3 (SEQ ID NO:3 - VH gene, murine, DNA)> 3 (SEQ ID NO: 3 - VH gene, murine, DNA)
> DNA> DNA
> Mouse Balb/c> Mouse Balb / c
caggttcagctgcagcagtctggagctgagctgatgaagcctggggcctcagtgaagatatcctgcaaggcaactggctacacattcagtagctactggatagagtggataaagcagaggcctggacatggccttgagtggattggagagattttacctggaaacactaatactaactacaatgagaagttcaagggcaaggccacattcactgcagatacaacttccaacacagcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaagactctgccgtctattactgtgcaagaggggcggattacggcggggattactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcc caggttcagctgcagcagtctggagctgagctgatgaagcctggggcctcagtgaagatatcctgcaaggcaactggctacacattcagtagctactggatagagtggataaagcagaggcctggacatggccttgagtggattggagagattttacctggaaacactaatactaactacaatgagaagttcaagggcaaggccacattcactgcagatacaacttccaacacagcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaagactctgccgtctattactgtgcaagaggggcggattacggcggggattactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca gcc
> 4 (SEQ ID NO:4 - VL gene, murine, DNA)> 4 (SEQ ID NO: 4 - VL gene, murine, DNA)
> DNA> DNA
> Mouse Balb/c> Mouse Balb / c
gacattgtgatgtcacagtctccatcctccctagctgtgtcaattggagagaaggttactatgagctgcaagtccagtcagagccttttatatagtagcaatcaaaagaactacttggcctggtaccagcagaaaccagggcagtctcctaaactgctgatttactgggcatccactagggaatctggggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtatgaaggctgaagacctggcagtttattactgtcagcaatattatagctatccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaatcaaa gacattgtgatgtcacagtctccatcctccctagctgtgtcaattggagagaaggttactatgagctgcaagtccagtcagagccttttatatagtagcaatcaaaagaactacttggcctggtaccagcagaaaccagggcagtctcctaaactgctgatttactgggcatccactagggaatctggggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtatgaaggctgaagacctggcagtttattactgtcagcaatattatagctatccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaatcaaa
> 5 (SEQ ID NO:5 - VH seq, murine, AA)> 5 (SEQ ID NO: 5 - VH seq, murine, AA)
> PRT> PRT
> Mouse Balb/c> Mouse Balb / c
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWIKQRPGHGLEWIGEILPGNTNTNYNEKFKGKATFTADTTSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGADYGGDYYAMDYWGQGTSVTVSSAQVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWIKQRPGHGLEWIGEILPGNTNTNYNEKFKGKATFTADTTSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGADYGGDYYAMDYWGQGTSVTVSSA
> 6 (SEQ ID NO:6 - VL seq, murine, AA)> 6 (SEQ ID NO: 6 - VL seq, murine, AA)
> PRT> PRT
> Mouse Balb/c> Mouse Balb / c
DIVMSQSPSSLAVSIGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSMKAEDLAVYYCQQYYSYPYTFGGGTKLEIKDIVMSQSPSSLAVSIGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSMKAEDLAVYYCQQYYSYPYTFGGGTKLEIK
> 7 (SEQ ID NO:7 -Heavy chain seq, humanized Fab, AA)> 7 (SEQ ID NO: 7-Heavy chain seq, humanized Fab, AA)
> PRT> PRT
> Artificial sequence> Artificial sequence
> Heavy chain of humanized Fab> Heavy chain of humanized Fab
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSSYWIEWVRQAPGQRLEWMGEILPGNTNTNYNGKFKGRVTFTADTSAQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSSYWIEWVRQAPGQRLEWMGEILPGNTNTNYNGKFKGRVTFTADTSA
STAYMELSSLRSEDTAVYYCARGADYGGDYYAMDYWGQGTTVTVSSAKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYSTAYMELSSLRSEDTATAVYYCARGADYGGDYYAMDYWGQGTTVTVSSAKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY
FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCLEHHHFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCLEHHH
HHHHHHHHH HHHHHHHHH
> 8 (SEQ ID NO:8 -Light chain seq, humanized Fab, humanized antibody, AA)> 8 (SEQ ID NO: 8 -Light chain seq, humanized Fab, humanized antibody, AA)
> PRT> PRT
> Artificial sequence> Artificial sequence
> Light chain of humanized Fab> Light chain of humanized Fab
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTD
FTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQKLKSGTASVVCLLNNFYPREAK
VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
> 9 (SEQ ID NO:9 VH humanized, DNA)> 9 (SEQ ID NO: 9 VH humanized, DNA)
> 369> 369
> DNA> DNA
> Artificial sequence> Artificial sequence
caggtccagcttgtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcttctggctacacattcagtagctactggatagagtgggtgcgccaggcccccggacaaaggcttgagtggatgggagagattttacctggaaacactaatactaactacaatgagaagttcaagggcagagtcaccttcaccgccgacacatccgcgagcacagcctacatggagctgagcagcctgcgttctgaagacacggctgtgtattactgtgcgagaggggcggattacggcggggattactatgctatggactactggggtcaaggaaccacggtcaccgtctcctcagcccaggtccagcttgtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcttctggctacacattcagtagctactggatagagtgggtgcgccaggcccccggacaaaggcttgagtggatgggagagattttacctggaaacactaatactaactacaatgagaagttcaagggcagagtcaccttcaccgccgacacatccgcgagcacagcctacatggagctgagcagcctgcgttctgaagacacggctgtgtattactgtgcgagaggggcggattacggcggggattactatgctatggactactggggtcaaggaaccacggtcaccgtctcctcagcc
> 10 (SEQ ID NO:10 VL humanized, DNA)> 10 (SEQ ID NO: 10 VL humanized, DNA)
> 339> 339
> DNA> DNA
> Artificial sequence> Artificial sequence
gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcaagtccagtcagagccttttatatagtagcaatcaaaagaactacttggcctggtaccagcagaaaccagggcagcctcctaagctgctcatttactgggcatccactagggaatctggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcagcaatattatagctatccgtacacgtttggccaggggaccaagctggagatcaaagacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcaagtccagtcagagccttttatatagtagcaatcaaaagaactacttggcctggtaccagcagaaaccagggcagcctcctaagctgctcatttactgggcatccactagggaatctggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcagcaatattatagctatccgtacacgtttggccaggggaccaagctggagatcaaa
> SEQ ID NO:11 (Heavy chain Fab humanized DNA)> SEQ ID NO: 11 (Heavy chain Fab humanized DNA)
> 711> 711
> DNA> DNA
> Artificial sequence> Artificial sequence
caggtccagcttgtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaagg cttctggctacacattcagtagctactggatagagtgggtgcgccaggcccccggacaaaggcttgagtg gatgggagagattttacctggaaacactaatactaactacaatgagaagttcaagggcagagtcaccttc accgccgacacatccgcgagcacagcctacatggagctgagcagcctgcgttctgaagacacggctgtgt attactgtgcgagaggggcggattacggcggggattactatgctatggactactggggtcaaggaaccac ggtcaccgtctcctcagccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggcaggtccagcttgtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaagg cttctggctacacattcagtagctactggatagagtgggtgcgccaggcccccggacaaaggcttgagtg gatgggagagattttacctggaaacactaatactaactacaatgagaagttcaagggcagagtcaccttc accgccgacacatccgcgagcacagcctacatggagctgagcagcctgcgttctgaagacacggctgtgt attactgtgcgagaggggcggattacggcggggattactatgctatggactactggggtcaaggaaccac ggtcaccgtctcctcagccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctggg
ggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcag gcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcag cgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagc aacaccaaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtctcgagcatcaccatcaccatcaccatcacc atcaccatcacc ggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcag gcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcag cgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagc aacaccaaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtctcgagcatcaccatcaccatcaccatcacc atcaccatcacc
> SEQ ID NO:12 (Light chain humanized Fab DNA, humanized antibody DNA)> SEQ ID NO: 12 (Light chain humanized Fab DNA, humanized antibody DNA)
> 660> 660
> DNA> DNA
> Artificial sequence> Artificial sequence
gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgca agtccagtcagagccttttatatagtagcaatcaaaagaactacttggcctggtaccagcagaaaccagg gcagcctcctaagctgctcatttactgggcatccactagggaatctggggtccctgaccgattcagtggc agcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattact gtcagcaatattatagctatccgtacacgtttggccaggggaccaagctggagatcaaacggactgtggcgacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgca agtccagtcagagccttttatatagtagcaatcaaaagaactacttggcctggtaccagcagaaaccagg gcagcctcctaagctgctcatttactgggcatccactagggaatctggggtccctgaccgattcagtggc agcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattact gtcagcaatattatagctatccgtacacgtttggccagggg accaagctggagatcaaa cggactgtggc
tgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgc
ctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggta actcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgct gagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgccc gtcacaaagagcttcaacaggggagagtgtctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggta actcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgcgcagcagcgagcagcgagcagcgaggagcagcgaggagcagcgagcgagcgagcagcgagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcccccfcdbc
> SEQ ID NO:13 (Heavy chain humanized antibody DNA)> SEQ ID NO: 13 (Heavy chain humanized antibody DNA)
caggtccagcttgtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaagg cttctggctacacattcagtagctactggatagagtgggtgcgccaggcccccggacaaaggcttgagtg gatgggagagattttacctggaaacactaatactaactacaatgagaagttcaagggcagagtcaccttc accgccgacacatccgcgagcacagcctacatggagctgagcagcctgcgttctgaagacacggctgtgt attactgtgcgagaggggcggattacggcggggattactatgctatggactactggggtcaaggaaccac ggtcaccgtctcctcagccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgggtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgacaggtccagcttgtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaagg cttctggctacacattcagtagctactggatagagtgggtgcgccaggcccccggacaaaggcttgagtg gatgggagagattttacctggaaacactaatactaactacaatgagaagttcaagggcagagtcaccttc accgccgacacatccgcgagcacagcctacatggagctgagcagcctgcgttctgaagacacggctgtgt attactgtgcgagaggggcggattacggcggggattactatgctatggactactggggtcaaggaaccac ggtcaccgtctcctcagccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgggtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctccc agcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
> SEQ ID NO:14 (Heavy chain humanized antibody, AA)> SEQ ID NO: 14 (Heavy chain humanized antibody, AA)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSSYWIEWVRQAPGQRLEWMGEILPGNTNTNYNGKFKGRVTFTADTSAQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSSYWIEWVRQAPGQRLEWMGEILPGNTNTNYNGKFKGRVTFTADTSA
STAYMELSSLRSEDTAVYYCARGADYGGDYYAMDYWGQGTTVTVSSAKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGADYGGDYYAMDYWGQGTTVTVSSAKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Claims (13)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013123639/10A RU2539752C2 (en) | 2013-05-23 | 2013-05-23 | HUMANISED ANTIBODY AND ANTIGENBINDING FRAGMENT (Fab), WHICH BINDS WITH HUMAN INTERFERON-γ, DNA FRAGMENTS CODING CLAIMED ANTIBODY AND ANTIGEN-BINDING FRAGMENT, CELL, TRANSFORMED BY DNA FRAGMENT, AND METHOD OF OBTAINING CLAIMED ANTIBODY AND ANTIGEN-BINDING FRAGMENT |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013123639/10A RU2539752C2 (en) | 2013-05-23 | 2013-05-23 | HUMANISED ANTIBODY AND ANTIGENBINDING FRAGMENT (Fab), WHICH BINDS WITH HUMAN INTERFERON-γ, DNA FRAGMENTS CODING CLAIMED ANTIBODY AND ANTIGEN-BINDING FRAGMENT, CELL, TRANSFORMED BY DNA FRAGMENT, AND METHOD OF OBTAINING CLAIMED ANTIBODY AND ANTIGEN-BINDING FRAGMENT |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013123639A RU2013123639A (en) | 2014-11-27 |
| RU2539752C2 true RU2539752C2 (en) | 2015-01-27 |
Family
ID=53286727
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013123639/10A RU2539752C2 (en) | 2013-05-23 | 2013-05-23 | HUMANISED ANTIBODY AND ANTIGENBINDING FRAGMENT (Fab), WHICH BINDS WITH HUMAN INTERFERON-γ, DNA FRAGMENTS CODING CLAIMED ANTIBODY AND ANTIGEN-BINDING FRAGMENT, CELL, TRANSFORMED BY DNA FRAGMENT, AND METHOD OF OBTAINING CLAIMED ANTIBODY AND ANTIGEN-BINDING FRAGMENT |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2539752C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2737466C1 (en) * | 2019-12-30 | 2020-11-30 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Humanised neutralizing antibody to human interferon-beta |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050004353A1 (en) * | 2002-10-16 | 2005-01-06 | Amgen, Inc., A Corporation Of The State Of Delaware | Human anti-IFN-gamma neutralizing antibodies as selective IFN-gamma pathway inhibitors |
| US20120058906A1 (en) * | 2008-11-07 | 2012-03-08 | Vaughn Smider | Combinatorial antibody libraries and uses thereof |
-
2013
- 2013-05-23 RU RU2013123639/10A patent/RU2539752C2/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050004353A1 (en) * | 2002-10-16 | 2005-01-06 | Amgen, Inc., A Corporation Of The State Of Delaware | Human anti-IFN-gamma neutralizing antibodies as selective IFN-gamma pathway inhibitors |
| US20120058906A1 (en) * | 2008-11-07 | 2012-03-08 | Vaughn Smider | Combinatorial antibody libraries and uses thereof |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CARMEN ESPEJO, et al., "Treatment with Anti-interferon-g Monoclonal Antibodies Modifies Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Interferon-g Receptor Knockout Mice", Experimental Neurology 172, (2001), pp. 460-468 * |
| ЛАРИНА М.В. и др. "Получение химерных антител против интерферона-γ человека", Тезисы докладов и стендовых сообщений, XXIII Международная зимняя молодежная научная школа "ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ", Москва, 7-10 февраля 2011 г. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2737466C1 (en) * | 2019-12-30 | 2020-11-30 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Humanised neutralizing antibody to human interferon-beta |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2013123639A (en) | 2014-11-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102662387B1 (en) | B7-H3 antibody, antigen-binding fragment thereof and medical uses thereof | |
| US20200255516A1 (en) | Tigit antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical use thereof | |
| US20190292258A1 (en) | Anti-cd47 antibodies | |
| US11472882B2 (en) | Anti-B7-H4 antibody, antigen-binding fragment thereof and pharmaceutical use thereof | |
| WO2018161872A1 (en) | Anti-b7-h3 antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof | |
| WO2021058000A1 (en) | Anti-human claudin 18.2 antibody and application thereof | |
| JP7257971B6 (en) | Anti-CD40 Antibodies, Antigen-Binding Fragments Thereof, and Medical Uses Thereof | |
| JP2020535799A (en) | Combination of new stable antibody variable region frameworks | |
| WO2019091449A1 (en) | Cd96 antibody, antigen-binding fragment and pharmaceutical use thereof | |
| JP7352973B2 (en) | Bispecific antibodies and their uses | |
| JP2021521881A (en) | Monoclonal antibodies against nerve growth factor, as well as genes encoding them and their use | |
| WO2021139758A1 (en) | New polypeptide complex | |
| WO2019141268A1 (en) | Anti-4-1bb antibody, antigen-binding fragment thereof and medical use thereof | |
| WO2018153366A1 (en) | Tim-3 antibody, antigen binding fragment thereof, and medicinal uses thereof | |
| JP2018509894A (en) | PCSK9 antibody, and pharmaceutical composition and use thereof | |
| US20230138315A1 (en) | Anti-angptl3 antibody and use thereof | |
| CN111196849B (en) | Anti-sclerostin antibodies, antigen-binding fragments thereof, and medical uses thereof | |
| JP2014527806A (en) | INUNIZED ANTIBODY AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME | |
| CN110114370B (en) | Antibodies or antigen-binding fragments thereof capable of binding to human interleukin-6 receptor | |
| JP2020532279A (en) | Anti-GITR antibody, its antigen-binding fragment, and its pharmaceutical use | |
| RU2539752C2 (en) | HUMANISED ANTIBODY AND ANTIGENBINDING FRAGMENT (Fab), WHICH BINDS WITH HUMAN INTERFERON-γ, DNA FRAGMENTS CODING CLAIMED ANTIBODY AND ANTIGEN-BINDING FRAGMENT, CELL, TRANSFORMED BY DNA FRAGMENT, AND METHOD OF OBTAINING CLAIMED ANTIBODY AND ANTIGEN-BINDING FRAGMENT | |
| WO2019109974A1 (en) | Anti-pd-l1 antibody and antigen-binding fragment thereof | |
| RU2737466C1 (en) | Humanised neutralizing antibody to human interferon-beta | |
| JP6579097B2 (en) | Bispecific antibody binding to novel human TLR2 and human TLR4 | |
| RU2729391C2 (en) | Monoclonal antibody capable of neutralizing biological activity of human interferon beta 1a |