RU2539035C2 - Preventive or therapeutic polyepitopic anti-tuberculosis vaccine construction providing induction of cellular immune response of cd4+ or cd8+ t-lymphocytes - Google Patents
Preventive or therapeutic polyepitopic anti-tuberculosis vaccine construction providing induction of cellular immune response of cd4+ or cd8+ t-lymphocytes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2539035C2 RU2539035C2 RU2011101276/10A RU2011101276A RU2539035C2 RU 2539035 C2 RU2539035 C2 RU 2539035C2 RU 2011101276/10 A RU2011101276/10 A RU 2011101276/10A RU 2011101276 A RU2011101276 A RU 2011101276A RU 2539035 C2 RU2539035 C2 RU 2539035C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tuberculosis
- antigens
- epitopes
- polyepitope
- lymphocytes
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к искусственным полиэпитопным конструкциям, включающим Т-клеточные эпитопы, выбранные из ряда иммунодоминантных антигенов Mycobacterium tuberculosis, и может быть использовано в молекулярной биологии, генетической инженерии и медицине, в частности в иммунологии, вакцинологии и клеточной терапии как основной компонент профилактической или терапевтической вакцины нового поколения для борьбы с таким тяжелым заболеванием человека, как туберкулез.The invention relates to artificial polyepitope constructs, including T-cell epitopes selected from a number of immunodominant antigens of Mycobacterium tuberculosis, and can be used in molecular biology, genetic engineering and medicine, in particular in immunology, vaccinology and cell therapy, as a main component of a preventive or therapeutic vaccine a new generation to combat such a serious human disease as tuberculosis.
В настоящее время около трети всего человечества заражено туберкулезом. Ежегодно выявляется около 8-9 миллионов человек с активным туберкулезом. Каждый год от туберкулеза умирает около 1.5 миллионов человек. В 2006 году зарегистрировано 9.2 миллиона новых случаев инфекции и 1.2 миллиона человек умерли от туберкулеза (WHO Report 2008: Global Tuberculosis Control - surveillance, planning, financing), в 2007 году: 9.27 и 1.8 миллионов, соответственно (WHO Report 2009: Global Tuberculosis Control - epidemiology, strategy, financing). Кроме того, в настоящее время все большее распространение получают лекарственно-устойчивые формы туберкулеза, в том числе формы со множественной (MDR - multiple-drug-resistant) и широкой лекарственной устойчивостью (XDR - extensively drug-resistant). Доля MDR среди всех выявленных в 2008 году новых случаев туберкулеза составила около 2.9 %, т.е. она была практически в три раза выше, чем в 2004 году. В бывших советских республиках доля MDR среди новых выявленных случаев туберкулеза достигла 22 % (WHO 2008, Antituberculosis drug resistance in the world: fourth global report). На февраль 2008 года XDR туберкулез был зарегистрирован в 45 странах: доля форм с широкой лекарственной устойчивостью доходит до 10-20 % (и даже до 30 %) от всех форм со множественной лекарственной устойчивостью (Shenoi S. and Friedland G., 2008, Annu. Rev. Med., 60:307-320). Currently, about a third of all humanity is infected with tuberculosis. About 8-9 million people with active tuberculosis are detected annually. About 1.5 million people die from tuberculosis each year. In 2006, 9.2 million new infections were reported and 1.2 million people died from tuberculosis (WHO Report 2008: Global Tuberculosis Control - surveillance, planning, financing), in 2007: 9.27 and 1.8 million, respectively (WHO Report 2009: Global Tuberculosis Control - epidemiology, strategy, financing). In addition, drug-resistant forms of tuberculosis, including multiple-drug-resistant and extensively drug-resistant (XDR), are currently becoming more common. The proportion of MDR among all new cases of tuberculosis detected in 2008 was about 2.9%, i.e. it was almost three times higher than in 2004. In the former Soviet republics, the proportion of MDR among newly diagnosed cases of tuberculosis reached 22% (WHO 2008, Antituberculosis drug resistance in the world: fourth global report). As of February 2008, XDR tuberculosis was reported in 45 countries: the proportion of drug-resistant forms reaches 10–20% (or even 30%) of all multidrug-resistant forms (Shenoi S. and Friedland G., 2008, Annu Rev. Med. 60: 307-320).
Лишь у 5-10% людей при инфекции развивается активный туберкулез. У большинства индивидуумов прогресс болезни эффективно подавляется иммунной системой (Barker L.F., 2009, Curr Opin Immunol, 21:331-338). У большинства из этих людей болезнь так и не разовьется, но примерно у 10 % из них при ослаблении организма неблагоприятными условиями жизни, другими инфекциями, развитием злокачественных новообразований или при реинфекции болезнь, не проявлявшая себя в течение многих лет, может реактивироваться. Риск развития активной формы туберкулеза очень сильно возрастает при заражении ВИЧ: у ВИЧ-инфицированных риск развития активной формы ТБ (при заражении Mycobacterium tuberculosis) составляет 5% в год (Hoft D.F. 2008, Lancet, 372:164-175; Barker L.F., 2009, Curr Opin Immunol, 21:331-338).Only 5-10% of people develop active tuberculosis with infection. In most individuals, disease progression is effectively suppressed by the immune system (Barker LF, 2009, Curr Opin Immunol, 21: 331-338). In most of these people, the disease will not develop, but in about 10% of them, when the body weakens with unfavorable living conditions, other infections, the development of malignant neoplasms, or with reinfection, a disease that has not manifested itself for many years can reactivate. The risk of developing active tuberculosis increases very much when infected with HIV: in HIV-infected people, the risk of developing active TB (when infected with Mycobacterium tuberculosis ) is 5% per year (Hoft DF 2008, Lancet, 372: 164-175; Barker LF, 2009, Curr Opin Immunol, 21: 331-338).
Для вакцинопрофилактики туберкулеза в настоящее время используется BCG - аттенуированный лабораторный штамм M. bovis. Однако эффективность данной вакцины сильно варьирует (от 40 до 80%). Заметно более эффективна вакцинация детей в раннем возрасте (до 90%). При вакцинации детей BCG они оказываются защищенными от развития милиарного туберкулеза и микобактериального менингита, но не от легочной инфекции в более позднем возрасте. Протективный иммунитет сохраняется на протяжении 12-15 лет, но ревакцинация оказывается неэффективной (Andersen P. and Doherty T.M., 2005, Nat Rev Microbiol, 3:656-662). Но вакцинация может оказаться не эффективной, если организм уже сенсибилизирован к микобактериальным антигенам, в ряде случаев при этом развивается Тх2-зависимый ответ, который не является протективным, и восприимчивость к инфекции усиливается. Кроме того, у индивидуумов с ослабленной иммунной системой BCG сама способна вызвать инфекцию. BCG, an attenuated laboratory strain of M. bovis, is currently used for vaccination against tuberculosis. However, the effectiveness of this vaccine varies greatly (from 40 to 80%). Vaccination of children at an early age is noticeably more effective (up to 90%). When vaccinating BCG children, they are protected from the development of miliary tuberculosis and mycobacterial meningitis, but not from lung infection at a later age. Protective immunity persists for 12-15 years, but revaccination is ineffective (Andersen P. and Doherty TM, 2005, Nat Rev Microbiol, 3: 656-662). But vaccination may not be effective if the body is already sensitized to mycobacterial antigens, in some cases, a Tx2-dependent response develops, which is not protective, and the susceptibility to infection increases. In addition, in individuals with a weakened immune system, BCG itself is capable of causing infection.
В связи с увеличением случаев заражения лекарственно устойчивыми формами M. tuberculosis, с распространением ВИЧ все большее внимание уделяется развитию эффективных способов терапии туберкулеза, разработке профилактических и терапевтических вакцин и способов надежного диагностирования заболевания. Due to the increase in cases of drug-resistant forms of infectionM. tuberculosis, with the spread of HIV, increasing attention is being paid to the development of effective methods of treating tuberculosis, the development of preventive and therapeutic vaccines and methods for reliable diagnosis of the disease.
Многочисленные исследования показали, что важнейшую роль в развитии протективного иммунного ответа, направленного против M. tuberculosis, играют CD4+ Т-лимфоциты. У мышей, нокаутных по гену CD4, нарушено формирование гранулем, ограничивающих рост и распространение микобактерий (Ladel et al., 1995, Eur J Immunol, 25:377-384; Caruso et al., 1999, J Immunol, 162:5407-5416; Saunders et al., 2002, Cell Immunol, 216:65-72). Истощение популяции CD4+ Т-лимфоцитов перед заражением делает мышей крайне восприимчивыми к M. tuberculosis (Scanga et al., 2000, J Exp Med, 192:347-358; Cowley and Elkins, 2003, J. Immunol., 171:4689-4699). Адоптивный перенос CD4+ Т-лимфоцитов, специфичных к антигенам M. tuberculosis, защищает иммунологически наивных животных от инфекции (Feng and Britton, 2000, J Infect Dis, 181:1846-1849; Wangoo et al., 2001, J immunol, 166:3432-3439; Andersen and Smedegaard, 2000, 68:621-629). По мере развития инфекции все большую роль приобретают CD8+ Т-лимфоциты. Показано, что мыши, нокаутные по генам CD8 или MHC класса I, в высокой степени восприимчивы к инфекции M. tuberculosis (Flynn et al., 1992, PNAS, 89:12013-12017). Содержащийся в цитотоксических гранулах CD8+ Т-лимфоцитов гранулизин обладает бактерицидным действием, и поэтому CD8+ цитотоксические лимфоциты способны не только разрушать клетки, несущие микобактерии, но и убивать самих инфекционных агентов, в том числе и экстраклеточные бактерии (Stenger et al., 1998, Science, 282:121-125). На мышиной модели туберкулеза показано, что CD8+ цитотоксические лимфоциты играют существенную роль в предотвращении реактивации латентной инфекции (van Pinxteren et al., 2000, Eur J Immunol, 30:3689-3698).Numerous studies have shown that a crucial role in the development of a protective immune response directed againstM. tuberculosis, play CD4 + T-lymphocytes. In CD4 knockout mice, granuloma formation is impaired, restricting the growth and spread of mycobacteria (Ladel et al., 1995, Eur J Immunol, 25: 377-384; Caruso et al., 1999, J Immunol, 162: 5407-5416 ; Saunders et al., 2002, Cell Immunol, 216: 65-72). The depletion of the population of CD4 + T-lymphocytes before infection makes the mice extremely susceptible toM. tuberculosis (Scanga et al., 2000, J Exp Med, 192: 347-358; Cowley and Elkins, 2003, J. Immunol., 171: 4689-4699). Adaptive transfer of CD4 + T-lymphocytes specific for antigensM. tuberculosisprotects immunologically naive animals from infection (Feng and Britton, 2000, J Infect Dis, 181: 1846-1849; Wangoo et al., 2001, J immunol, 166: 3432-3439; Andersen and Smedegaard, 2000, 68: 621-629). As infection progresses, CD8 + T-lymphocytes become increasingly important. Mice knocked out for the class I CD8 or MHC genes have been shown to be highly susceptible to infectionM. tuberculosis(Flynn et al., 1992, PNAS 89: 12013-12017). Granulosin contained in cytotoxic granules of CD8 + T-lymphocytes has a bactericidal effect, and therefore, CD8 + cytotoxic lymphocytes can not only destroy cells that carry mycobacteria, but also kill the infectious agents themselves, including extracellular bacteria (Stenger et al., 1998, Science, 282: 121-125). In a mouse model of tuberculosis, CD8 + cytotoxic lymphocytes have been shown to play a significant role in preventing the reactivation of latent infection (van Pinxteren et al., 2000, Eur J Immunol, 30: 3689-3698).
Кроме того, важную роль в контроле за развитием инфекции играют Т-лимфоциты, рестриктированные CD1, и γ/δ-Т-клетки, распознающие небелковые антигены и липопротеины (Hoft D.F. 2008, Lancet, 372:164-175). В последнее время значительное внимание уделяется CD4+ Т-лимфоцитам, продуцирующим ИЛ-17, - так называемым, Тх17, роль которых в противостоянии организма M. tuberculosis представляется крайне важной (Cooper, 2009, Annu Rev Immunol, 27:393-422). Так, показано, что отсутствие Тх17 препятствует развитию вторичного иммунного ответа и приводит к большей восприимчивости организма к инфекции (Cooper, 2009, Annu Rev Immunol, 27:393-422; Khader and Cooper, 2008, Cytokine, 41:79-83).In addition, CD1-restricted T cells and γ / δ-T cells that recognize non-protein antigens and lipoproteins play an important role in controlling the development of infection (Hoft DF 2008, Lancet, 372: 164-175). Recently, considerable attention has been paid to CD4 + T-lymphocytes producing IL-17, the so-called Tx17, whose role in opposing the M. tuberculosis organism is extremely important (Cooper, 2009, Annu Rev Immunol, 27: 393-422). Thus, it has been shown that the absence of Th17 inhibits the development of a secondary immune response and leads to a greater susceptibility to infection (Cooper, 2009, Annu Rev Immunol, 27: 393-422; Khader and Cooper, 2008, Cytokine, 41: 79-83).
Долгое время считалось, что гуморальный ответ не является протективным при туберкулезе из-за внутриклеточной локализации патогена. Однако показано, что введение микобактерий при экспериментальном туберкулезе одновременно с введением моноклональных антител к ManLAM или поверхностным белкам микобактерий вызывает усиленный фагоцитоз микобактериальных клеток, опсонизированных антителами через взаимодействие с Fc-рецепторами, что приводит к сильной активации макрофагов и быстрому уничтожению захваченных бактерий. Иммунизация животных ManLAM либо его конъюгатами с белковыми микобактериальными антигенами индуцировала протективный иммунный ответ (Maglione and Chan, 2009, Eur J Immunol, 39:676-686). Кроме того, существуют данные, указывающие на чрезвычайно важную роль B-лимфоцитов в регуляции активности эффекторных и регуляторных Т-лимфоцитов и в регуляции защитных и иммунопатологических реакций при туберкулезе (Maglione and Chan, 2009, Eur J Immunol, 39:676-686). For a long time it was believed that the humoral response is not protective in tuberculosis due to the intracellular localization of the pathogen. However, it was shown that the introduction of mycobacteria in experimental tuberculosis simultaneously with the introduction of monoclonal antibodies to ManLAM or surface proteins of mycobacteria causes enhanced phagocytosis of mycobacterial cells, opsonized by antibodies through interaction with Fc receptors, which leads to strong activation of macrophages and the rapid destruction of captured bacteria. Immunization of animals with ManLAM or its conjugates with mycobacterial protein antigens induced a protective immune response (Maglione and Chan, 2009, Eur J Immunol, 39: 676-686). In addition, there is evidence of an extremely important role for B-lymphocytes in regulating the activity of effector and regulatory T-lymphocytes and in regulating protective and immunopathological reactions in tuberculosis (Maglione and Chan, 2009, Eur J Immunol, 39: 676-686).
Известна конструкция рекомбинантной химерной ДНК, используемой для создания вакцины против туберкулеза, стимулирующей иммунный ответ у теплокровных животных (международная заявка WO, 2010010577, МПК А61К39/04, C12N15/30, опубл. 28.01.2010 г.).A known design of recombinant chimeric DNA used to create a vaccine against tuberculosis that stimulates the immune response in warm-blooded animals (international application WO, 2010010577, IPC A61K39 / 04, C12N15 / 30, published on January 28, 2010).
Наиболее близким аналогом (прототипом) является полинуклеотид, индуцирующий при введении в ткань позвоночного один или более антимикобактериальных иммунных ответов, выбранных из ответов, опосредованных антителами, цитотоксическими Т-лимфоцитами, хелперными Т-лимфоцитами, и защитных иммунных ответов, содержащий промотор транскрипции, такой как промотор CMV, связанный с первым цистроном, таким как ген, кодирующий микобактериальный белок, выбранный из группы, содержащей 85А, В и С, связанным с подходящей контрольной последовательностью, включающей сигнал терминации транскрипции, такой как терминатор транскрипции BGH или IRES, при необходимости связанной со вторым цистроном, таким как ген, кодирующий GM-CSF, IL-12, интерферон или член семейства В7 Т-клеточных костимулирующих белков, при необходимости связанным с сигналом терминации транскрипции, таким как терминатор транскрипции BGH, связанным с геном устойчивости к антибиотику, таким как ген устойчивости к ампициллину или канамицину, связанным с участком, включающим точку начала репликации (патент РФ №2186109, МПК А61К 39/04, опубл. 27.06.1999 г.).The closest analogue (prototype) is a polynucleotide that induces one or more antimycobacterial immune responses selected from antibodies mediated by antibodies, cytotoxic T-lymphocytes, helper T-lymphocytes, and protective immune responses, which contains a transcription promoter, such as a CMV promoter linked to a first cistron, such as a gene encoding a mycobacterial protein selected from the group consisting of 85A, B and C, linked to a suitable control sequence, incl. a transcription termination signal, such as a BGH or IRES transcription terminator, optionally linked to a second cistron, such as a gene encoding GM-CSF, IL-12, interferon, or a member of the B7 family of T-cell costimulatory proteins, if necessary associated with a termination signal transcription, such as a BGH transcription terminator, associated with an antibiotic resistance gene, such as an ampicillin or kanamycin resistance gene, associated with a site including a replication origin (RF patent No. 2186109, IPC A61K 39/04, publ. June 27, 1999).
Однако вышеприведенные аналоги и прототип не обеспечивают достаточно надежного протективного иммунного ответа.However, the above analogues and prototype do not provide a sufficiently reliable protective immune response.
Техническим результатом является создание такой вакцинной конструкции, которая обеспечивала бы формирование эффективного протективного и терапевтического Т-клеточного иммунного ответа не только антигенспецифических цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов, но и интенсивный ответ CD4+ Т-лимфоцитов.The technical result is the creation of such a vaccine construct that would ensure the formation of an effective protective and therapeutic T-cell immune response not only of antigen-specific cytotoxic CD8 + T-lymphocytes, but also an intense response of CD4 + T-lymphocytes.
Указанный технический результат достигается получением следующих девяти вариантов профилактической и терапевтической полиэпитопной противотуберкулезной вакцинной конструкции.The specified technical result is achieved by obtaining the following nine options for a preventive and therapeutic polyepitope anti-tuberculosis vaccine design.
1. pTBUi, обеспечивающая индукцию ответа CD8+ Т-лимфоцитов, представляющая собой универсальный полиэпитопный иммуноген, содержащий ЦТЛ-эпитопы, выбранные из иммунодоминантных антигенов M. tuberculosis, слитый с N-конца с убиквитином, с аминокислотной последовательностью, приведенной на фиг. 1 (SEQ ID NO 1).1. pTBUi, which provides the induction of the response of CD8 + T-lymphocytes, which is a universal polyepitope immunogen containing CTL epitopes selected from immunodominant antigens of M. tuberculosis, fused from the N-terminus with ubiquitin, with the amino acid sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO 1).
2. pTBUi_a0201, обеспечивающая индукцию ответа CD8+ Т-лимфоцитов, представляющая собой специфичный для аллеля HLA-A*0201 полиэпитопный иммуноген, содержащий ЦТЛ-эпитопы, выбранные из иммунодоминантных антигенов M. tuberculosis, слитый с N-конца с убиквитином, с аминокислотной последовательностью, приведенной на фиг. 2 (SEQ ID NO 2).2. pTBUi_a0201, providing the induction of the response of CD8 + T-lymphocytes, which is a HLA-A * 0201-specific allele polyepitope immunogen containing CTL epitopes selected from immunodominant antigens of M. tuberculosis, fused from the N-terminus with ubiquitin, with the amino acid sequence, shown in FIG. 2 (SEQ ID NO 2).
3. pTBUe, обеспечивающая индукцию ответа CD8+ Т-лимфоцитов, представляющая собой универсальный полиэпитопный иммуноген, содержащий ЦТЛ-эпитопы, выбранные из ESAT-подобных антигенов M. tuberculosis, слитый с N-конца с убиквитином, с аминокислотной последовательностью, приведенной на фиг. 3 (SEQ ID NO 3).3. pTBUe, which provides an induction of the response of CD8 + T-lymphocytes, which is a universal polyepitope immunogen containing CTL epitopes selected from ESAT-like antigens of M. tuberculosis, fused from the N-terminus with ubiquitin, with the amino acid sequence shown in FIG. 3 (SEQ ID NO 3).
4. pTBUe_a0201, обеспечивающая индукцию ответа CD8+ Т-лимфоцитов, представляющая собой специфичный для аллеля HLA-A*0201 полиэпитопный иммуноген, содержащий ЦТЛ-эпитопы, выбранные из ESAT-подобных антигенов M. tuberculosis, слитый с N-конца с убиквитином, с аминокислотной последовательностью, приведенной на фиг. 4 (SEQ ID NO 4).4. pTBUe_a0201, which provides the induction of the response of CD8 + T-lymphocytes, which is a HLA-A * 0201-specific allele polyepitope immunogen containing CTL epitopes selected from ESAT-like antigens of M. tuberculosis, fused from the N-terminus with ubiquitin, with amino acid the sequence shown in FIG. 4 (SEQ ID NO 4).
5. pTBUd, обеспечивающая индукцию ответа CD8+ Т-лимфоцитов, представляющая собой универсальный полиэпитопный иммуноген, содержащий ЦТЛ-эпитопы, выбранные из DosR антигенов M. tuberculosis, слитый с N-конца с убиквитином, с аминокислотной последовательностью, приведенной на фиг. 5 (SEQ ID NO 5).5. pTBUd, which induces the response of CD8 + T-lymphocytes, which is a universal polyepitope immunogen containing CTL epitopes selected from DosR antigens of M. tuberculosis, fused from the N-terminus with ubiquitin, with the amino acid sequence shown in FIG. 5 (SEQ ID NO 5).
6. pTBUd_a0201, обеспечивающая индукцию ответа CD8+ Т-лимфоцитов, представляющая собой специфичный для аллеля HLA-A*0201 полиэпитопный иммуноген, содержащий ЦТЛ-эпитопы, выбранные из DosR антигенов M. tuberculosis, слитый с N-конца с убиквитином, с аминокислотной последовательностью, приведенной на фиг. 6 (SEQ ID NO 6).6. pTBUd_a0201, which provides the induction of the response of CD8 + T-lymphocytes, which is a HLA-A * 0201-specific allele polyepitope immunogen containing CTL epitopes selected from M. tuberculosis DosR antigens , fused from the N-terminus with ubiquitin, with the amino acid sequence, shown in FIG. 6 (SEQ ID NO 6).
7. pTBih, обеспечивающая индукцию ответа CD4+ Т-хелперных лимфоцитов, представляющая собой полиэпитопный иммуноген, содержащий Т-хелперные эпитопы, выбранные из иммунодоминантных антигенов M. tuberculosis, слитый с N-конца с сигнальным пептидом, а с C-конца - с C-концевым фрагментом белка LAMP-1 человека, с аминокислотной последовательностью, приведенной на фиг. 7 (SEQ ID NO 7).7. pTBih, which provides the induction of the response of CD4 + T-helper lymphocytes, which is a polyepitope immunogen containing T-helper epitopes selected from immunodominant antigens of M. tuberculosis, fused from the N-terminus with a signal peptide, and from the C-terminus with C- the terminal fragment of the human LAMP-1 protein, with the amino acid sequence shown in FIG. 7 (SEQ ID NO 7).
8. pTBeh, обеспечивающая индукцию ответа CD4+ Т-хелперных лимфоцитов, представляющая собой полиэпитопный иммуноген, содержащий Т-хелперные эпитопы, выбранные из ESAT-подобных антигенов M. tuberculosis, слитый с N-конца с сигнальным пептидом, а с C-конца - с C-концевым фрагментом белка LAMP-1 человека, с аминокислотной последовательностью, приведенной на фиг. 8 (SEQ ID NO 8).8. pTBeh, which provides the induction of the response of CD4 + T-helper lymphocytes, which is a polyepitope immunogen containing T-helper epitopes selected from ESAT-like antigens of M. tuberculosis, fused from the N-terminus with a signal peptide, and from the C-terminus - with The C-terminal fragment of the human LAMP-1 protein, with the amino acid sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO 8).
9. pTBdh, обеспечивающая индукцию ответа CD4+ Т-хелперных лимфоцитов, представляющая собой полиэпитопный иммуноген, содержащий Т-хелперные эпитопы, выбранные из DosR антигенов M. tuberculosis, слитый с N-конца с сигнальным пептидом, а с C-конца - с C-концевым фрагментом белка LAMP-1 человека, с аминокислотной последовательностью, приведенной на фиг. 9 (SEQ ID NO 9).9. pTBdh, which provides the induction of the response of CD4 + T-helper lymphocytes, which is a polyepitope immunogen containing T-helper epitopes selected from M. tuberculosis DosR antigens , fused from the N-terminus with a signal peptide, and from the C-terminus with C- the terminal fragment of the human LAMP-1 protein, with the amino acid sequence shown in FIG. 9 (SEQ ID NO 9).
Данные соответствия заявленного технического решения критериям изобретения, основанные на новой стратегии вакцинацииCompliance data of the claimed technical solution with the criteria of the invention based on the new vaccination strategy
Исходя из изложенного выше, можно придти к выводу, что важнейшей задачей для формирования протективного ответа является наработка мощного Т-клеточного ответа. Важно получить не только антигенспецифические цитотоксические CD8+ Т-лимфоциты, но и интенсивный ответ CD4+ Т-лимфоцитов, поскольку именно они вовлекаются в формирование гранулемы на более ранних стадиях. От того, насколько интенсивным будет Т-клеточный ответ, будет зависеть эффективность контроля за развитием инфекции. Из-за особенностей патогена невозможно избежать болезни с помощью профилактической вакцины, но можно эффективно блокировать развитие патологического процесса, значительно снизить степень поражения тканей и избежать генерализации инфекции. Кроме того, вероятно, что использование Т-клеточных иммуногенов необходимо сочетать с индукцией мукозального гуморального ответа на ряд микобактериальных антигенов, в том числе и на антигены небелковой природы.Based on the foregoing, we can conclude that the most important task for the formation of a protective response is to generate a powerful T-cell response. It is important to obtain not only antigen-specific cytotoxic CD8 + T-lymphocytes, but also an intense response of CD4 + T-lymphocytes, since they are involved in the formation of granulomas at earlier stages. The effectiveness of the control of the development of the infection will depend on how intense the T-cell response is. Due to the characteristics of the pathogen, it is impossible to avoid the disease with the help of a preventive vaccine, but it is possible to effectively block the development of the pathological process, significantly reduce the degree of tissue damage and avoid generalization of the infection. In addition, it is likely that the use of T-cell immunogens must be combined with the induction of a mucosal humoral response to a number of mycobacterial antigens, including non-protein antigens.
Как было сказано выше, в настоящее время для вакцинопрофилактики туберкулеза у людей используется только BCG, живая вакцина, лабораторный аттенуированный штамм M. bovis. Несмотря на высокую эффективность вакцинации в раннем возрасте (новорожденные), при вакцинации в более позднем возрасте эффективность снижается. При ревакцинации может наблюдаться сенсибилизация. Кроме того, иммунологическая память сохраняется в течение примерно 15 лет и последующая ревакцинация неэффективна. BCG слабо эффективна в развивающихся странах. BCG также оказывается бессильной при заражении M. tuberculosis группы W-Beijing. В настоящее время ведутся работы по созданию новых вакцинных штаммов BCG или ауксотрофных и/или нокаутных по ключевым факторам вирулентности штаммов M. tuberculosis. Большое количество работ по разработке новых туберкулезных вакцин посвящено созданию субъединичных белковых вакцин в сочетании с адъювантами, эффективно стимулирующими развитие Тх1-зависимого иммунного ответа, ДНК-вакцин, кодирующих различные иммунодоминантные микобактериальные антигены, либо вирусных векторов, несущих гены, кодирующие микобактерианльные антигены. Разрабатываются новые протоколы иммунизации (Barker et al., 2009, Curr Opin Immunol, 21:331-338).As mentioned above, at present, only BCG, a live vaccine, a laboratory attenuated strain of M. bovis are used to vaccinate people with tuberculosis . Despite the high efficiency of vaccination at an early age (newborns), when vaccinated at a later age, the effectiveness decreases. With revaccination, sensitization may be observed. In addition, immunological memory persists for approximately 15 years and subsequent revaccination is ineffective. BCG is poorly effective in developing countries. BCG is also powerless when infected with M. tuberculosis of the W-Beijing group. Currently, work is underway to create new vaccine strains of BCG or auxotrophic and / or knockout for key virulence factors of M. tuberculosis strains . A large number of works on the development of new tuberculosis vaccines is devoted to the creation of subunit protein vaccines in combination with adjuvants that effectively stimulate the development of a Tx1-dependent immune response, DNA vaccines encoding various immunodominant mycobacterial antigens, or viral vectors carrying genes encoding mycobacterial antigens. New immunization protocols are being developed (Barker et al., 2009, Curr Opin Immunol, 21: 331-338).
Предлагаемая нами в данной работе стратегия является уникальной, в настоящее время неизвестно ни одной кандидатной туберкулезной вакцинной конструкции, созданной на основе полиэпитопных конструкций. В результате использования искусственного полиэпитопного иммуногена можно добиться высокого уровня ответа не только на доминантные, но и на субдоминантные эпитопы. При этом мы предполагаем, что расширение спектра специфичности Т-лимфоцитов, стимулируемых при вакцинации, позволит покрыть большую часть антигенных детерминант и позволит создать пул антигенспецифичных клеток с широким спектром распознаваемых эпитопов. Наряду с использованием микобактериальных цитотоксических эпитопов необходимо использование специфических для M. tuberculosis Тх-эпитопов, поскольку CD4+ лимфоциты важны для формирования гранулем, для активации макрофагов для эффективного контроля за развитием инфекции. Важным условием для создания успешной полиэпитопной антигенной конструкции является необходимость учитывать чрезвычайно высокий полиморфизм генов HLA (лейкоцитарный человеческий антиген, human leukocyte antigen) или MHC (главный комплекс тканевой совместимости, major histocompatibility complex) человека. Эта задача может быть решена:The strategy that we propose in this paper is unique; at present, not a single candidate tuberculosis vaccine construct based on polyepitope constructs is known. As a result of the use of an artificial polyepitope immunogen, it is possible to achieve a high level of response not only to dominant, but also to subdominant epitopes. At the same time, we suggest that the expansion of the specificity spectrum of T-lymphocytes stimulated by vaccination will cover most of the antigenic determinants and will allow the creation of a pool of antigen-specific cells with a wide range of recognized epitopes. Along with the use of mycobacterial cytotoxic epitopes, the use of specific for M. tuberculosis Tx epitopes is necessary, since CD4 + lymphocytes are important for the formation of granulomas, for the activation of macrophages to effectively control the development of infection. An important condition for creating a successful polyepitope antigenic construct is the need to take into account the extremely high polymorphism of the HLA (human leukocyte antigen, human leukocyte antigen) or MHC (major tissue compatibility complex, major histocompatibility complex) genes. This problem can be solved:
- за счет использования в полиэпитопной конструкции Т-клеточных эпитопов, способных связываться с приемлемым уровнем аффинности с широким спектром аллельных вариантов молекул MHC и в первую очередь с наиболее распространенными в мировой популяции аллельными вариантами молекул HLA, или- due to the use of T-cell epitopes in the polyepitope construct that can bind to an acceptable level of affinity with a wide range of allelic variants of MHC molecules and primarily with the most common allelic variants of HLA molecules in the world population, or
- путем создания «аллелеспецифических» антигенных конструкций, в состав которых включены эпитопы, взаимодействующие с определенными алломорфами HLA.- by creating “allelespecific” antigenic constructs that include epitopes that interact with specific HLA allomorphs.
Предложенные полиэпитопные конструкции могут использоваться в качестве ДНК-вакцин; в качестве рекомбинантных встроек в геном векторного микроорганизма (например, вируса или бактерии) для получения кандидатного вакцинного штамма; для получения антиген-презентирующих клеток (АПК), экспрессирующих целевые полиэпитопные иммуногены и способных индуцировать формирование адекватного Т-клеточного иммунного ответа, с целью использования таких АПК в виде клеточной вакцины (или для клеточной терапии) либо для индукции эффекторных антигенспецифических Т-лимфоцитов in vitro с целью использования полученных иммунокомпетентных Т-лимфоцитов в качестве вакцины либо для терапевтических целей. Предложенные вакцинные конструкции могут использоваться в качестве терапевтических вакцин, в том числе для дополнения лечения туберкулеза фармакологическими препаратами.The proposed polyepitope constructs can be used as DNA vaccines; as recombinant insertions into the genome of a vector microorganism (for example, a virus or bacteria) to obtain a candidate vaccine strain; to obtain antigen-presenting cells (APCs) expressing target polyepitope immunogens and capable of inducing the formation of an adequate T-cell immune response, to use such APCs as a cell vaccine (or for cell therapy), or to induce effector antigen-specific T lymphocytes in vitro in order to use the obtained immunocompetent T-lymphocytes as a vaccine or for therapeutic purposes. The proposed vaccine constructs can be used as therapeutic vaccines, including to supplement the treatment of tuberculosis with pharmacological drugs.
По сравнению с живыми, инактивированными и субъединичными вакцинами полиэпитопные антигены обладают следующими преимуществами: они более безопасны, поскольку не содержат живых микроорганизмов и полноразмерных белков, которые могут обладать иммуносупрессирующим действием или другой нежелательной биологической активностью; в состав таких конструкций могут входить эпитопы из различных белковых антигенов; полиэпитопные антигены могут содержать эпитопы, покрывающие заданное разнообразие аллельных вариантов молекул MHC; для увеличения иммуногенности и для оптимизации MHC I- или MHC II-зависимой презентации эпитопов в состав полиэпитопных конструкций могут быть включены сигнальные последовательности: лидерный пептид, направляющий синтезируемый белок в ЭР; С-концевой фрагмент LAMP-1, обеспечивающий перенаправление полипептида из секреторного пути на лизосомную деградацию; N-концевой убиквитин, направляющий синтезированный полипептид на протеасомную деградацию, и т.д.Compared to live, inactivated and subunit vaccines, polyepitope antigens have the following advantages: they are safer because they do not contain live microorganisms and full-sized proteins that may have an immunosuppressive effect or other undesirable biological activity; such structures may include epitopes from various protein antigens; polyepitope antigens may contain epitopes covering a given variety of allelic variants of MHC molecules; to increase immunogenicity and to optimize MHC I- or MHC II-dependent presentation of epitopes, signal sequences can be included in the composition of polyepitope constructs: leader peptide directing the synthesized protein to the ER; C-terminal fragment of LAMP-1, providing redirection of the polypeptide from the secretory pathway to lysosomal degradation; N-terminal ubiquitin, directing the synthesized polypeptide to proteasome degradation, etc.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами. На фиг. 1 приведена аминокислотная последовательность универсального полиэпитопного иммуногена pTBUi, содержащего ЦТЛ-эпитопы, выбранные из иммунодоминантных антигенов M. tuberculosis, слитого с N-конца с убиквитином. На фиг. 2 приведена аминокислотная последовательность специфичного для аллеля HLA-A*0201 полиэпитопного иммуногена pTBUi_a0201, содержащего ЦТЛ-эпитопы, выбранные из иммунодоминантных антигенов M. tuberculosis, слитого с N-конца с убиквитином. На фиг. 3 приведена аминокислотная последовательность универсального полиэпитопного иммуногена pTBUe, содержащего ЦТЛ-эпитопы, выбранные из ESAT-подобных антигенов M. tuberculosis, слитого с N-конца с убиквитином. На фиг. 4 приведена аминокислотная последовательность специфичного для аллеля HLA-A*0201 полиэпитопного иммуногена pTBUe_a0201, содержащего ЦТЛ-эпитопы, выбранные из ESAT-подобных антигенов M. tuberculosis, слитого с N-конца с убиквитином. На фиг. 5 приведена аминокислотная последовательность универсального полиэпитопного иммуногена pTBUd, содержащего ЦТЛ-эпитопы, выбранные из DosR антигенов M. tuberculosis, слитого с N-конца с убиквитином. На фиг. 6 приведена аминокислотная последовательность специфичного для аллеля HLA-A*0201 полиэпитопного иммуногена pTBUd_a0201, содержащего ЦТЛ-эпитопы, выбранные из DosR антигенов M. tuberculosis, слитого с N-конца с убиквитином. На фиг. 7 приведена аминокислотная последовательность полиэпитопного иммуногена pTBih, содержащего Т-хелперные эпитопы, выбранные из иммунодоминантных антигенов M. tuberculosis, слитого с N-конца с сигнальным пептидом, а с C-конца - с C-концевым фрагментом белка LAMP-1 человека. На фиг. 8 приведена аминокислотная последовательность полиэпитопного иммуногена pTBeh, содержащего Т-хелперные эпитопы, выбранные из ESAT-подобных антигенов M. tuberculosis, слитого с N-конца с сигнальным пептидом, а с C-конца - с C-концевым фрагментом белка LAMP-1 человека. На фиг. 9 приведена аминокислотная последовательность полиэпитопного иммуногена pTBdh, содержащего Т-хелперные эпитопы, выбранные из DosR антигенов M. tuberculosis, слитого с N-конца с сигнальным пептидом, а с C-конца - с C-концевым фрагментом белка LAMP-1 человека. На фиг. 10 представлены данные по оценке продукции γIFN для изучения Т-клеточного ответа (в качестве клеток-мишеней для каждого случая были использованы аутологичные ДК, инфицированные M. tuberculosis H37Rv). На фиг. 11 представлены данные по изучение цитотоксического ответа в результате лизиса клеток-мишеней (аутологичных макрофагов, инфицированных M. tuberculosis H37Rv).The invention is illustrated by the following graphic materials. In FIG. 1 shows the amino acid sequence of the universal polyepitope immunogen pTBUi containing CTL epitopes selected from immunodominant antigens of M. tuberculosis fused from the N-terminus with ubiquitin. In FIG. Figure 2 shows the amino acid sequence of the HLA-A * 0201 allele specific polyepitope immunogen pTBUi_a0201 containing CTL epitopes selected from immunodominant antigens of M. tuberculosis fused from the N-terminus with ubiquitin. In FIG. Figure 3 shows the amino acid sequence of the universal polyepitope immunogen pTBUe containing CTL epitopes selected from ESAT-like antigens of M. tuberculosis fused from the N-terminus with ubiquitin. In FIG. Figure 4 shows the amino acid sequence of the HLA-A * 0201 allele specific polyepitope immunogen pTBUe_a0201 containing CTL epitopes selected from ESAT-like M. tuberculosis antigens fused from the N-terminus with ubiquitin. In FIG. Figure 5 shows the amino acid sequence of the universal polyepitope immunogen pTBUd containing CTL epitopes selected from M. tuberculosis DosR antigens fused from the N-terminus with ubiquitin. In FIG. Figure 6 shows the amino acid sequence of the HLA-A * 0201 allele-specific polyepitope immunogen pTBUd_a0201 containing CTL epitopes selected from DosR antigens of M. tuberculosis fused from the N-terminus with ubiquitin. In FIG. Figure 7 shows the amino acid sequence of the pTBih polyepitope immunogen containing T helper epitopes selected from immunodominant antigens of M. tuberculosis fused from the N-terminus with a signal peptide, and from the C-terminus with the C-terminal fragment of human LAMP-1 protein. In FIG. Figure 8 shows the amino acid sequence of the pTBeh polyepitope immunogen containing T-helper epitopes selected from ESAT-like M. tuberculosis antigens fused from the N-terminus with a signal peptide, and from the C-terminus with the C-terminal fragment of human LAMP-1 protein. In FIG. Figure 9 shows the amino acid sequence of the polyepitope immunogen pTBdh containing T-helper epitopes selected from DosR antigens of M. tuberculosis fused from the N-terminus with a signal peptide, and from the C-terminus with the C-terminal fragment of human LAMP-1 protein. In FIG. 10 presents data on the assessment of γIFN production to study the T-cell response (autologous DCs infected with M. tuberculosis H37Rv were used as target cells for each case). In FIG. 11 presents data on the study of the cytotoxic response as a result of lysis of target cells (autologous macrophages infected with M. tuberculosis H37Rv).
Примеры получения заявляемых вакцинных конструкцийExamples of obtaining the claimed vaccine constructs
Поли-ЦТЛ конструкции на основе иммунодоминантных антигенов M. tuberculosis Poly-CTL constructs based on immunodominant antigens of M. tuberculosis
Для выбранных антигенов с помощью TEpredict было проведено предсказание ЦТЛ-эпитопов, рестриктированных 35 различными аллельными вариантами молекул HLA-A и HLA-B. При этом проводилось предсказание протеасомного и иммунопротеасомного процессинга антигенов, а также эффективности связывания потенциально антигенных пептидов с TAP. Затем для составления «универсальной» полиэпитопной конструкции был произведен выбор минимального количества потенциальных Т-клеточных эпитопов из иммунодоминантных антигенов M. tuberculosis, покрывающих выбранное разнообразие алломорф HLA класса I с пятикратной избыточностью. Выбраны фланкирующие аминокислотные последовательности, оптимизирующие взаимодействие выбранных пептидов с TAP человека.For the selected antigens, TEpredict was used to predict CTL epitopes restricted to 35 different allelic variants of the HLA-A and HLA-B molecules. In this case, the proteasome and immunoproteasome processing of antigens was predicted, as well as the efficiency of binding of potentially antigenic peptides to TAP. Then, to compile a “universal” polyepitope construct, the minimum number of potential T-cell epitopes was selected from immunodominant antigens of M. tuberculosis covering the selected variety of class I HLA allomorphs with fivefold redundancy. Flanking amino acid sequences have been selected that optimize the interaction of the selected peptides with human TAP.
Проведен дизайн «универсальной» поли-ЦТЛ-эпитопной конструкции на основе иммунодоминантных антигенов M. tuberculosis (SEQ ID NO 1). Были подобраны спейсерные аминокислотные последовательности, оптимизирующие как протеасомное, так и иммунопротеасомное высвобождение эпитопов, включенных в состав полиэпитопа. Итоговая аминокислотная последовательность приведена на фигуре 1.The design of a “universal” poly-CTL-epitope construct based on immunodominant antigens of M. tuberculosis (SEQ ID NO 1) was carried out. Spacer amino acid sequences were selected that optimized both the proteasome and immunoproteasome release of the epitopes included in the polyepitope. The resulting amino acid sequence is shown in figure 1.
Из выбранных иммунодоминантных антигенов M. tuberculosis аналогичным образом была создана аллелеспецифичная поли-ЦТЛ конструкция для наиболее распространенного в человеческой популяции аллеля HLA-A*0201 (SEQ ID NO 2). Итоговая аминокислотная последовательность приведена на фигуре 2.From the selected immunodominant antigens of M. tuberculosis , an allelespecific poly-CTL construct was similarly created for the HLA-A * 0201 allele most common in the human population (SEQ ID NO 2). The resulting amino acid sequence is shown in figure 2.
Поли-ЦТЛ конструкции на основе ESAT-подобных антигенов M. tuberculosis Poly-CTL constructs based on ESAT-like M. tuberculosis antigens
Для выбранных ESAT-подобных антигенов с помощью TEpredict было проведено предсказание ЦТЛ-эпитопов, рестриктированных 35 различными аллельными вариантами молекул HLA-A и HLA-B. Также проводилось предсказание протеасомного и иммунопротеасомного процессинга антигенов, а также эффективности связывания потенциально антигенных пептидов с TAP. Затем для составления «универсальной» полиэпитопной конструкции был произведен выбор минимального количества потенциальных Т-клеточных эпитопов из ESAT-подобных антигенов M. tuberculosis, покрывающих выбранное разнообразие алломорф HLA класса I с пятикратной избыточностью. Выбраны фланкирующие аминокислотные последовательности, оптимизирующие взаимодействие выбранных пептидов с TAP человека.For selected ESAT-like antigens, TEpredict was used to predict CTL epitopes restricted to 35 different allelic variants of HLA-A and HLA-B molecules. The prediction of proteasome and immunoproteasome processing of antigens, as well as the efficiency of binding of potentially antigenic peptides to TAP, was also carried out. Then, to compile a “universal” polyepitope construct, a minimum number of potential T-cell epitopes was selected from ESAT-like M. tuberculosis antigens covering the selected variety of class I HLA allomorphs with fivefold redundancy. Flanking amino acid sequences have been selected that optimize the interaction of the selected peptides with human TAP.
Проведен дизайн «универсальной» поли-ЦТЛ-эпитопной конструкции на основе ESAT-подобных антигенов M. tuberculosis (SEQ ID NO 3). Были подобраны спейсерные аминокислотные последовательности, оптимизирующие как протеасомное, так и иммунопротеасомное высвобождение эпитопов, включенных в состав полиэпитопа. Итоговая аминокислотная последовательность приведена на фигуре 3.A “universal” poly-CTL-epitope construct based on ESAT-like antigens of M. tuberculosis (SEQ ID NO 3) was designed. Spacer amino acid sequences were selected that optimized both the proteasome and immunoproteasome release of the epitopes included in the polyepitope. The resulting amino acid sequence is shown in figure 3.
Из выбранных ESAT-подобных антигенов M. tuberculosis аналогичным образом была создана аллелеспецифичная поли-ЦТЛ-эпитопная конструкция для наиболее распространенного в человеческой популяции аллеля HLA-A*0201 (SEQ ID NO 4). Итоговая аминокислотная последовательность приведена на фигуре 4.From the selected ESAT-like antigens of M. tuberculosis , an allele-specific poly-CTL-epitope construct was similarly created for the HLA-A * 0201 allele most common in the human population (SEQ ID NO 4). The resulting amino acid sequence is shown in figure 4.
Поли-ЦТЛ-эпитопные конструкции на основе DosR антигенов M. tuberculosis Poly-CTL-epitope constructs based on DosR antigens of M. tuberculosis
Для выбранных DosR антигенов M. tuberculosis с помощью TEpredict было проведено предсказание ЦТЛ-эпитопов, рестриктированных 35 различными аллельными вариантами молекул HLA-A и HLA-B. Также проводилось предсказание протеасомного и иммунопротеасомного процессинга антигенов, а также эффективности связывания потенциально антигенных пептидов с TAP. Затем для составления «универсальной» полиэпитопной конструкции был произведен выбор минимального количества потенциальных Т-клеточных эпитопов из DosR антигенов M. tuberculosis, покрывающих выбранное разнообразие алломорф HLA класса I с пятикратной избыточностью. Выбраны фланкирующие аминокислотные последовательности, оптимизирующие взаимодействие выбранных пептидов с TAP человека.For the selected DosR antigens of M. tuberculosis , TEpredict was used to predict CTL epitopes restricted to 35 different allelic variants of the HLA-A and HLA-B molecules. The prediction of proteasome and immunoproteasome processing of antigens, as well as the efficiency of binding of potentially antigenic peptides to TAP, was also carried out. Then, to compile a “universal” polyepitope construct, the minimum number of potential T-cell epitopes was selected from the DosR M. tuberculosis antigens covering the selected variety of class I HLA allomorphs with fivefold redundancy. Flanking amino acid sequences have been selected that optimize the interaction of the selected peptides with human TAP.
Проведен дизайн «универсальной» поли-ЦТЛ-эпитопной конструкции на основе DosR антигенов M. tuberculosis (SEQ ID NO 5). Были подобраны спейсерные аминокислотные последовательности, оптимизирующие как протеасомное, так и иммунопротеасомное высвобождение эпитопов, включенных в состав полиэпитопа. Итоговая аминокислотная последовательность приведена на фигуре 5.The design of a “universal” poly-CTL-epitope construct based on the DosR antigens of M. tuberculosis (SEQ ID NO 5) was carried out. Spacer amino acid sequences were selected that optimized both the proteasome and immunoproteasome release of the epitopes included in the polyepitope. The resulting amino acid sequence is shown in figure 5.
Из выбранных DosR антигенов M. tuberculosis аналогичным образом была создана аллелеспецифичная поли-ЦТЛ-эпитопная конструкция для наиболее распространенного в человеческой популяции аллеля HLA-A*0201 (SEQ ID NO 6). Итоговая аминокислотная последовательность приведена на фигуре 6.From the DosR antigens of M. tuberculosis selected, an allele-specific poly-CTL epitope construct was similarly created for the HLA-A * 0201 allele most common in the human population (SEQ ID NO 6). The resulting amino acid sequence is shown in figure 6.
Поли-Т-хелперные конструкции на основе антигенов M. tuberculosis Poly-T helper constructs based on M. tuberculosis antigens
Для выбранных антигенов с помощью TEpredict было проведено предсказание Т-хелперных эпитопов. При этом проводился выбор фрагментов, содержащих большое количество потенциальных эпитопов, взаимодействующих с наибольшим количеством алломорф молекул HLA класса II (HLA-DR). Из каждого антигена (из каждого набора) выбиралось по три наиболее перспективных антигенных фрагмента и затем из всего набора выбранных фрагментов отбиралось по 10 наиболее перспективных.TEpredict was used to predict T helper epitopes for selected antigens. In this case, fragments containing a large number of potential epitopes interacting with the largest number of allomorphs of HLA class II molecules (HLA-DR) were selected. Three most promising antigenic fragments were selected from each antigen (from each set), and then 10 most promising were selected from the entire set of selected fragments.
В соответствии с описанным выше алгоритмом был проведен дизайн поли-Т-хелперных конструкций на основе следующих наборов антигенов M. tuberculosis: из иммунодоминантных антигенов (SEQ ID NO 7), из ESAT-подобных антигенов (SEQ ID NO 8) и из антигенов DosR-регулона (SEQ ID NO 9). Итоговая аминокислотная последовательность поли-Т-хелперной конструкции на основе иммунодоминантных антигенов M. tuberculosis приведена на фигуре 7. Итоговая аминокислотная последовательность поли-Т-хелперной конструкции на основе ESAT-подобных антигенов M. tuberculosis приведена на фигуре 8. Итоговая аминокислотная последовательность поли-Т-хелперной конструкции на основе DosR антигенов M. tuberculosis приведена на фигуре 9.In accordance with the algorithm described above, poly-T helper constructs were designed based on the following sets of M. tuberculosis antigens: from immunodominant antigens (SEQ ID NO 7), from ESAT-like antigens (SEQ ID NO 8), and from DosR- antigens regulon (SEQ ID NO 9). The final amino acid sequence of the poly-T helper construct based on immunodominant antigens of M. tuberculosis is shown in Figure 7. The final amino acid sequence of the poly-T helper construct based on ESAT-like antigens of M. tuberculosis is shown in Figure 8. The final amino acid sequence of poly-T helper construct based on DosR antigens of M. tuberculosis shown in figure 9.
Результаты проведенных исследованийResearch results
Для разработанных полиэпитопных конструкций (SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8 и SEQ ID NO 9) были сконструированы кодирующие их искусственные гены. Последовательности генов были оптимизированы для экспрессии в клетках человека, для чего из них были исключены редко используемые кодоны. Дизайн генов проводился с таким расчетом, чтобы минимизировать сложность вторичной структуры матричной РНК.For the developed polyepitope constructs (
Для создания ДНК-вакцинных конструкций с использованием полученных искусственных генов была выбрана плазмида pDNAVACC-Ultra (pDNAVACC5, NBC, USA, http://www.natx.com/). В качестве отрицательного контроля также использовалась плазмида pDNAVACC5. To create DNA vaccine constructs using the obtained artificial genes, the plasmid pDNAVACC-Ultra (pDNAVACC5, NBC, USA, http://www.natx.com/) was selected. Plasmid pDNAVACC5 was also used as a negative control.
Было создано девять конструкций:Nine designs were created:
1) pTBUi - плазмида pDNAVACC со встроенной последовательностью, кодирующей универсальный полиэпитопный иммуноген, содержащий ЦТЛ-эпитопы, выбранные из иммунодоминантных антигенов M. tuberculosis, слитый с N-конца с убиквитином (SEQ ID NO 1);1) pTBUi is the plasmid pDNAVACC with an integrated sequence encoding a universal polyepitope immunogen containing CTL epitopes selected from immunodominant antigens of M. tuberculosis fused from the N-terminus with ubiquitin (SEQ ID NO 1);
2) pTBUi_a0201 - плазмида pDNAVACC со встроенной последовательностью, кодирующей специфичный для аллеля HLA-A*0201 полиэпитопный иммуноген, содержащий ЦТЛ-эпитопы, выбранные из иммунодоминантных антигенов M. tuberculosis, слитый с N-конца с убиквитином (SEQ ID NO 2);2) pTBUi_a0201 is a plasmid pDNAVACC with an integrated sequence encoding the HLA-A * 0201 allele-specific polyepitope immunogen containing CTL epitopes selected from M. tuberculosis immunodominant antigens fused from the N-terminus with ubiquitin (SEQ ID NO 2);
3) pTBUe - плазмида pDNAVACC со встроенной последовательностью, кодирующей универсальный полиэпитопный иммуноген, содержащий ЦТЛ-эпитопы, выбранные из ESAT-подобных антигенов M. tuberculosis, слитый с N-конца с убиквитином (SEQ ID NO 3);3) pTBUe - the plasmid pDNAVACC with an integrated sequence encoding a universal polyepitope immunogen containing CTL epitopes selected from ESAT-like M. tuberculosis antigens fused from the N-terminus with ubiquitin (SEQ ID NO 3);
4) pTBUe_a0201 - плазмида pDNAVACC со встроенной последовательностью, кодирующей специфичный для аллеля HLA-A*0201 полиэпитопный иммуноген, содержащий ЦТЛ-эпитопы, выбранные из ESAT-подобных антигенов M. tuberculosis, слитый с N-конца с убиквитином (SEQ ID NO 4);4) pTBUe_a0201 is a pDNAVACC plasmid with an integrated sequence encoding the HLA-A * 0201 allele-specific polyepitope immunogen containing CTL epitopes selected from ESAT-like M. tuberculosis antigens fused from the N-terminus with ubiquitin (SEQ ID NO 4) ;
5) pTBUd - плазмида pDNAVACC со встроенной последовательностью, кодирующей универсальный полиэпитопный иммуноген, содержащий ЦТЛ-эпитопы, выбранные из DosR антигенов M. tuberculosis, слитый с N-конца с убиквитином (SEQ ID NO 5);5) pTBUd - plasmid pDNAVACC with an integrated sequence encoding a universal polyepitope immunogen containing CTL epitopes selected from M. tuberculosis DosR antigens fused from the N-terminus with ubiquitin (SEQ ID NO 5);
6) pTBUd_a0201 - плазмида pDNAVACC со встроенной последовательностью, кодирующей специфичный для аллеля HLA-A*0201 полиэпитопный иммуноген, содержащий ЦТЛ-эпитопы, выбранные из DosR антигенов M. tuberculosis, слитый с N-конца с убиквитином (SEQ ID NO 6);6) pTBUd_a0201 - a plasmid pDNAVACC with an integrated sequence encoding the HLA-A * 0201 allele-specific polyepitope immunogen containing CTL epitopes selected from M. tuberculosis DosR antigens fused from the N-terminus with ubiquitin (SEQ ID NO 6);
7) pTBih - плазмида pDNAVACC со встроенной последовательностью, кодирующей полиэпитопный иммуноген, содержащий Т-хелперные эпитопы, выбранные из иммунодоминантных антигенов M. tuberculosis, слитый с N-конца с сигнальным пептидом, а с C-конца - с C-концевым фрагментом белка LAMP-1 человека (SEQ ID NO 7);7) pTBih - pDNAVACC plasmid with an integrated sequence encoding a polyepitope immunogen containing T helper epitopes selected from immunodominant antigens of M. tuberculosis, fused from the N-terminus with a signal peptide, and from the C-terminus with the C-terminal fragment of the LAMP protein -1 person (SEQ ID NO 7);
8) pTBeh - плазмида pDNAVACC со встроенной последовательностью, кодирующей полиэпитопный иммуноген, содержащий Т-хелперные эпитопы, выбранные из ESAT-подобных антигенов M. tuberculosis, слитый с N-конца с сигнальным пептидом, а с C-конца - с C-концевым фрагментом белка LAMP-1 человека (SEQ ID NO 8);8) pTBeh is the pDNAVACC plasmid with an integrated sequence encoding a polyepitope immunogen containing T helper epitopes selected from ESAT-like antigens of M. tuberculosis, fused from the N-terminus with a signal peptide, and from the C-terminus with a C-terminal fragment human LAMP-1 protein (SEQ ID NO 8);
9) pTBdh - плазмида pDNAVACC со встроенной последовательностью, кодирующей полиэпитопный иммуноген, содержащий Т-хелперные эпитопы, выбранные из DosR антигенов M. tuberculosis, слитый с N-конца с сигнальным пептидом, а с C-конца - с C-концевым фрагментом белка LAMP-1 человека (SEQ ID NO 9).9) pTBdh - pDNAVACC plasmid with an integrated sequence encoding a polyepitope immunogen containing T helper epitopes selected from M. tuberculosis DosR antigens , fused from the N-terminus with a signal peptide, and from the C-terminus with the C-terminal fragment of the LAMP protein -1 person (SEQ ID NO 9).
Описание процессинга и презентации антигеновDescription of the processing and presentation of antigens
Белковые антигены, синтезированные в цитоплазме клетки, как правило, презентируются молекулами MHC класса I. Эндогенные белковые антигены подвергаются протеолитическому разрезанию на олигопептидные фрагменты под действием протеасомы - крупного белкового комплекса, состоящего из регуляторных и протеолитических субъединиц (Rock KL and Goldberg AL, 1999, Annu. Rev. Immunol, 17:739-779; Niedermann G et al., 1999, Immunol. Rev, 172:29-48). Образованные в результате протеасомного процессинга олигопептиды с помощью гетеродимеров TAP1/TAP2 (Transporters associated with antigen processing) транспортируются в просвет эндоплазматического ретикулума (ЭР), где связываются с молекулами MHC класса I. Образовавшиеся комплексы антигенных пептидов с молекулами MHC класса I транспортируются на поверхность клетки для презентации специфическим CD8+ Т-лимфоцитам (Pamer E and Cresswell P, 1998, Ann. Rev. Immunol, 16:323-358). Процессинг антигенов в антигенпрезентирующих клетках может осуществляться иммунопротеасомой, несколько отличающейся от протеасомы по специфичности расщепления в результате включения в ее состав альтернативных протеолитических субъединиц, экспрессируемых клеткой под действием провоспалительных стимулов (Van den Eynde B. and Morel S. 2001. Curr Opin Immunol, 13:147-153; Rivett A. and Hearn A. 2004. Curr Prot Pept Sci, 5:153-161).Protein antigens synthesized in the cytoplasm of a cell are typically presented by MHC class I molecules. Endogenous protein antigens are proteolytically cut into oligopeptide fragments by the proteasome, a large protein complex consisting of regulatory and proteolytic subunits (Rock KL and Goldberg AL, 1999, Annu Rev. Immunol, 17: 739-779; Niedermann G et al., 1999, Immunol. Rev, 172: 29-48). Oligopeptides formed as a result of proteasome processing using TAP1 / TAP2 heterodimers (Transporters associated with antigen processing) are transported into the lumen of the endoplasmic reticulum (ER), where they bind to MHC class I molecules. The resulting complexes of antigenic peptides with MHC class I molecules are transported to the cell surface for presentations to specific CD8 + T lymphocytes (Pamer E and Cresswell P, 1998, Ann. Rev. Immunol, 16: 323-358). Processing of antigens in antigen-presenting cells can be carried out by an immunoproteasome, which differs somewhat from the proteasome by the specificity of cleavage as a result of the inclusion of alternative proteolytic subunits expressed by the cell under the action of pro-inflammatory stimuli (Van den Eynde B. and Morel S. 2001. Curr Opin Immunol, 13: 147-153; Rivett A. and Hearn A. 2004. Curr Prot Pept Sci, 5: 153-161).
Молекулы MHC класса II, как правило, презентируют пептидные фрагменты белков, интернализованных клеткой в результате эндоцитоза. Это могут быть растворимые белки, белки клеточной поверхности или белки захваченных микроорганизмов (вирусов, бактерий или простейших). Образованные в ЭР комплексы молекул MHC класса II с инвариантной цепью транспортируются в комплекс Гольджи и затем направляются в мультивизикулярные компартменты эндосомной/лизосомной сети. Здесь происходит протеолитическая деградация инвариантной цепи, процессинг захваченных белковых антигенов и ассоциация антигенных пептидов с молекулами MHC класса II. Образовавшиеся комплексы антигенных пептидов с молекулами MHC класса II транспортируются на поверхность клетки для презентации специфическим CD4+ Т-лимфоцитам (Cresswell P, 1994, Ann. Rev. Immunol, 12:259-293; Watts C., 1997, Ann. Rev. Immunol, 15:821-850). Кроме того, показано, что экзогенные антигены могут презентироваться и молекулами MHC класса I в результате кросс-презентации (Guermonprez P. et al., 2002. Annu Rev Immunol, 20:621-667).Class II MHC molecules typically present peptide fragments of proteins internalized by the cell as a result of endocytosis. These can be soluble proteins, cell surface proteins or proteins of trapped microorganisms (viruses, bacteria or protozoa). The complexes of MHC class II molecules with an invariant chain formed in the ER are transported to the Golgi complex and then sent to the multivisicular compartments of the endosomal / lysosomal network. Here, proteolytic degradation of the invariant chain occurs, processing of the captured protein antigens, and the association of antigenic peptides with MHC class II molecules. The resulting complexes of antigenic peptides with MHC class II molecules are transported to the cell surface for presentation to specific CD4 + T lymphocytes (Cresswell P, 1994, Ann. Rev. Immunol, 12: 259-293; Watts C., 1997, Ann. Rev. Immunol, 15: 821-850). In addition, it has been shown that exogenous antigens can also be presented by MHC class I molecules as a result of cross-presentation (Guermonprez P. et al., 2002. Annu Rev Immunol, 20: 621-667).
Описание алгоритма выбора ЦТЛ- и Тх-эпитопов и конструирования полиэпитопных Т-клеточных иммуногеновDescription of the algorithm for the selection of CTL and Tx epitopes and the construction of polyepitope T-cell immunogens
Выбор антигенов. Было решено сформировать три различные выборки антигенов M. tuberculosis: 1) состоящая из иммунодоминантных антигенов (Ag85A, Ag85B, Ag85C, Hsp65, Esat-6, CFP-10 и др.), 2) состоящая из Esx-подобных антигенов (все они характеризуются небольшими размерами и являются секретируемыми белками и иммунодоминантными антигенами. Данные белки играют важную роль не только на ранних, но и на более поздних стадиях инфекции, а следовательно, должны обладать эффективностью не только при использовании в составе профилактической, но и в качестве терапевтической вакцины) и 3) объединяющая ряд белков латентной фазы и белков из DosR регулона. The selection of antigens. It was decided to form three different samples of M. tuberculosis antigens: 1) consisting of immunodominant antigens (Ag85A, Ag85B, Ag85C, Hsp65, Esat-6, CFP-10, etc.), 2) consisting of Esx-like antigens (they are all characterized by They are small in size and are secreted proteins and immunodominant antigens.These proteins play an important role not only in the early but also in the later stages of the infection, and therefore should be effective not only when used as a prophylactic, but also as a therapeutic vaccine) and 3) combining schaya number of latent phase proteins and proteins of the DosR regulon.
Выбор Т-клеточных эпитопов. В настоящее время разработано большое количество алгоритмов для предсказания Т-клеточных эпитопов, обладающих высокой точностью. Некоторые из них уже доказали свою применимость для поиска новых эпитопов и дизайна вакцинных конструкций (Bian H et al., 2003, Methods. 29:299-309; Adotevi O et al., 2006, Clin. Cancer Res, 12:3158- 3167; Hundemer M et al., 2006, Exp. Hematol, 34:486-496; Mustafa AS and Shaban FA, 2006, Tuberculosis, 86:115-124;Sundar K et al., 2007, Virology, 360:257-263; Wen JS et al.,2008, Virus Res, 132:42-48). При разработке предложенных полиэпитопных конструкций мы использовали разработанное нами программное обеспечение TEpredict, предназначенное для предсказания Т-клеточных эпитопов и основных этапов процессинга антигенов (Антонец Д. и Максютов А. 2009. Мол Биол, 43:1-10). Дополнительно нами были использованы предсказательные модели веб-сервера NetMHC (Lundegaard C. et al. 2008. NAR, 36:W509-512). Selection of T cell epitopes. At present, a large number of algorithms have been developed for predicting T-cell epitopes with high accuracy. Some of them have already proved their applicability for the search for new epitopes and the design of vaccine constructs (Bian H et al., 2003, Methods. 29: 299-309; Adotevi O et al., 2006, Clin. Cancer Res, 12: 3158- 3167 ; Hundemer M et al., 2006, Exp. Hematol, 34: 486-496; Mustafa AS and Shaban FA, 2006, Tuberculosis, 86: 115-124; Sundar K et al., 2007, Virology, 360: 257-263 ; Wen JS et al., 2008, Virus Res, 132: 42-48). In developing the proposed polyepitope constructs, we used the TEpredict software developed by us, designed to predict T-cell epitopes and the main stages of antigen processing (Antonets D. and Maksyutov A. 2009. Mol Biol, 43: 1-10). Additionally, we used predictive NetMHC web server models (Lundegaard C. et al. 2008.Nar, 36: W509-512).
Предсказание цитотоксических Т-клеточных эпитопов проводилось для 30 различных аллельных вариантов молекул HLA класса I (HLA-A*0101, A*0201, A*0202, A*0203, A*0206, A*0301, A*2301, A*2402, A*2403, A*2601, A*2902, A*3001, A*3002, A*3101, B*0702, B*0801, B*1501, B*1801, B*2705, B*3501, B*4001, B*4002, B*4402, B*4403, B*4501, B*5101, B*5301, B*5401, B*5701, B*5801). Пептиды, для которых предсказанное значение pIC50 (характеристика аффинности взаимодействия пептида с молекулой MHC) было больше 6.8, были отобраны для дальнейшего анализа. Prediction of cytotoxic T-cell epitopes was carried out for 30 different allelic variants of class I HLA molecules (HLA-A * 0101, A * 0201, A * 0202, A * 0203, A * 0206, A * 0301, A * 2301, A * 2402 , A * 2403, A * 2601, A * 2902, A * 3001, A * 3002, A * 3101, B * 0702, B * 0801, B * 1501, B * 1801, B * 2705, B * 3501, B * 4001, B * 4002, B * 4402, B * 4403, B * 4501, B * 5101, B * 5301, B * 5401, B * 5701, B * 5801). Peptides for which the predicted pIC50 value (characterization of the affinity of the interaction of the peptide with the MHC molecule) was greater than 6.8 were selected for further analysis.
Показано, что предсказание аффинности связывания пептидов с комплексом TAP (связанные с процессингом транспортные белки, transporter associated with antigen processing) перед предсказанием пептидов, способных связываться с молекулами MHC класса I, снижает количество ложноположительно предсказанных эпитопов (Peters B et al., 2003, J. Immunol, 171:1741-1749), следовательно, предсказание аффинности взаимодействия пептидов с TAP может быть использовано в качестве фильтра при выборе потенциальных Т-клеточных эпитопов или в качестве оценочной функции для ранжирования пептидов согласно эффективности их взаимодействия с TAP. Для предсказания аффинности связывания пептидов с TAP могут быть использованы алгоритмы, разработанные Петерсом и др. (Peters B et al., 2003, J. Immunol, 171:1741-1749) либо Дойчиновой и др. (Doitchinova I. et al., 2004, J. Immunol, 173:6813-6819), реализованные в программе TEpredict либо с использованием другого программного обеспечения. При дизайне полиэпитопных ЦТЛ иммуногенов мы использовали алгоритм, разработанный Петерсом и др.It has been shown that predicting the affinity of binding of peptides to the TAP complex (processing associated transport proteins, transporter associated with antigen processing) before predicting peptides capable of binding to class I MHC molecules reduces the number of false-positively predicted epitopes (Peters B et al., 2003, J . Immunol, 171: 1741-1749), therefore, predicting the affinity of the interaction of peptides with TAP can be used as a filter for the selection of potential T-cell epitopes or as an evaluation function for ranking peptides according to ffektivnosti their interaction with TAP. Algorithms developed by Peters et al. (Peters B et al., 2003, J. Immunol, 171: 1741-1749) or Dojchinova et al. (Doitchinova I. et al., 2004 can be used to predict the affinity of binding of peptides to TAP. , J. Immunol, 173: 6813-6819) implemented in the TEpredict program or using other software. When designing polyepitope CTL immunogens, we used an algorithm developed by Peters et al.
C-конец большинства Т-клеточных эпитопов образуется под действием протеасомы (Craiu A et al., 1997, PNAS USA, 94:10850-10855; Stoltze L et al., 1998, Eur. J. Immunol, 28:4029-4036). Можно предположить, что предсказание протеасомного процессинга антигена также может увеличить точность предсказания Т-клеточных эпитопов, исключая из рассмотрения пептиды, не имеющие на своем С-конце сайта протеасомного расщепления. Однако было показано, что в результате специфичность предсказания эпитопов не увеличивается, а чувствительность предсказания может снижаться (Peters B et al., 2003, J. Immunol, 171:1741-1749). Тем не менее, мы предполагаем, что использование предсказания протеасомного процессинга в качестве фильтра позволит увеличить эффективность поиска эпитопов, более эффективно высвобождаемых протеасомой in vivo. Предсказание (иммуно)протеасомного процессинга проводилось с использованием моделей, разработанных Toes et al. (Toes RE et al., 2001, J. Exp. Med, 194:1-12). Определение пороговых значений для предсказания процессинга описано в работе Singh and Raghava (Singh H and Raghava GP, 2003, Bioinformatics, 19:1009-1014).The C-terminus of most T-cell epitopes is formed by the proteasome (Craiu A et al., 1997, PNAS USA, 94: 10850-10855; Stoltze L et al., 1998, Eur. J. Immunol, 28: 4029-4036) . It can be assumed that the prediction of proteasome antigen processing can also increase the accuracy of prediction of T-cell epitopes, excluding peptides that do not have a proteasome cleavage site at their C-terminus. However, it has been shown that, as a result, the specificity of epitope prediction does not increase, and the prediction sensitivity may decrease (Peters B et al., 2003, J. Immunol, 171: 1741-1749). Nevertheless, we suggest that using the prediction of proteasome processing as a filter will increase the efficiency of the search for epitopes that are more efficiently released by the proteasome in vivo . Prediction of (immuno) proteasome processing was carried out using models developed by Toes et al. (Toes RE et al., 2001, J. Exp. Med, 194: 1-12). The determination of thresholds for processing prediction is described in Singh and Raghava (Singh H and Raghava GP, 2003, Bioinformatics, 19: 1009-1014).
Предсказание Т-хелперных эпитопов (рестриктированных молекулами MHC класса II) проводилось с использованием программ TEpredict и NetMHC.Prediction of T helper epitopes (restricted by MHC class II molecules) was carried out using the TEpredict and NetMHC programs.
Далее производили выбор эпитопов для конструирования «универсальных» полиэпитопных иммуногенов: были сформированы выборки эпитопов, покрывающие разнообразие выбранных алломорф молекул MHC класса I и II с пятикратной избыточностью. Кроме того, для наиболее распространенного в человеческой популяции аллеля HLA-A*0201 были созданы выборки эпитопов для конструирования аллелеспецифичных полиэпитопных антигенов.Then, epitopes were selected for the construction of “universal” polyepitope immunogens: epitope samples were formed covering the diversity of selected allomorphs of MHC class I and II molecules with fivefold redundancy. In addition, for the most common HLA-A * 0201 allele in the human population, epitope samples were created to construct allele-specific polyepitope antigens.
Конструирование полиэпитопных антигенов. Несмотря на то, что первые работы показали способность полиэпитопных конструкций, составленных в результате простого объединения эпитопов, индуцировать цитотоксический Т-клеточный ответ на все эпитопы, включенные в состав таких антигенов (Thomson et al., 1995), в дальнейшем было показано, что иммуногенность пептидов в составе полиэпитопа в значительной степени зависит от фланкирующих аминокислотных остатков, и что при конструировании полиэпитопных иммуногенов следует учитывать особенности протеасомного процессинга антигенов и взаимодействия пептидов с ТАР. Было показано, что введение в состав полиэпитопного антигена спейсерных аминокислотных последовательностей, обеспечивающих образование сайтов протеасомного расщепления между эпитопами и оптимизирующих связывание пептидных фрагментов с TAP, приводит к увеличению иммуногенности таких конструкций за счет повышения эффективности процессинга и презентации целевых эпитопов иммунной системе. В настоящее время известны аминокислотные мотивы, определяющие аффинность связывания олигопептидов с комплексом TAP (Peters B et al., 2003, J. Immunol, 171:1741-1749; Doitchinova I. et al., 2004, J. Immunol, 173:6813-6819), и вырожденные мотивы, определяющие эффективность сайтов (иммуно)протесомного расщепления (Toes et al., 2001). На основе математических моделей, предсказывающих эффективность (иммуно)протеасомного процессинга антигенов и аффинность связывания пептидов с TAP, нами был разработан алгоритм конструирования полиэпитопных ЦТЛ-иммуногенов за счет подбора оптимальных спейсерных последовательностей для каждого паросочетания эпитопов и за счет выбора наилучших паросочетий эпитопов. Construction of polyepitope antigens. Despite the fact that the first studies showed the ability of polyepitope constructs composed as a result of a simple combination of epitopes to induce a cytotoxic T-cell response to all epitopes included in such antigens (Thomson et al., 1995), it was further shown that immunogenicity peptides in the composition of the polyepitope largely depends on flanking amino acid residues, and that when constructing polyepitope immunogens, the features of proteasome processing of antigens and interactions I have peptides with TAP. It was shown that the introduction of spacer amino acid sequences into the polyepitope antigen that ensures the formation of proteasome cleavage sites between epitopes and optimizes the binding of peptide fragments to TAP leads to an increase in the immunogenicity of such structures by increasing the efficiency of processing and presentation of target epitopes to the immune system. Currently, amino acid motifs are known that determine the affinity of binding of oligopeptides to the TAP complex (Peters B et al., 2003, J. Immunol, 171: 1741-1749; Doitchinova I. et al., 2004, J. Immunol, 173: 6813- 6819), and degenerate motifs that determine the effectiveness of (immuno) protesomal cleavage sites (Toes et al., 2001). Based on mathematical models that predict the effectiveness of (immuno) proteasome processing of antigens and the affinity of peptide binding to TAP, we developed an algorithm for constructing polyepitopic CTL immunogens by selecting optimal spacer sequences for each epitope matching and by choosing the best epitope matching.
Алгоритмы объединения выбранных эпитопов вAlgorithms for combining selected epitopes in
поли-ЦТЛ-эпитопную конструкциюpoly CTL epitope construct
Учет взаимодействия пептидов с TAP. Для оптимизации взаимодействия антигенных пептидов с TAP было решено добавлять при необходимости к выбранным олигопептидным эпитопам N-концевые фланкирующие аминокислотные остатки, усиливающие связывание. Аминокислотные остатки добавлялись только к тем пептидам, для которых была предсказана низкая аффинность взаимодействия с TAP. Accounting for the interaction of peptides with TAP. To optimize the interaction of antigenic peptides with TAP, it was decided to add, if necessary, N-terminal flanking amino acid residues that enhance binding to the selected oligopeptide epitopes. Amino acid residues were added only to those peptides for which a low affinity of interaction with TAP was predicted.
Алгоритм выбора фланкирующих а.к.о. основан на модели, предсказывающей аффинность связывания олигопептидов с TAP, разработанной Петерсом и др. (Peters B et al., 2003, J. Immunol, 171:1741-1749), включенной в состав программы TEpredict. Аффинность связывания рассчитывалась согласно формуле: N1+N2+N3+C, где N1 обозначает вклад первого (N-концевого) а.к.о. пептида, N2 - второго, N3 - третьего, а C обозначает вклад последнего а.к.о. (C-концевого). Поскольку C-конец пептида должен оставаться неизменным, следовательно, аминокислотные остатки могут быть добавлены только на N-конец. Согласно модели Петерса и др. оптимальным для связывания с TAP человека является N-концевой мотив ARY. Таким образом, сначала к пептиду (при необходимости) добавляется остаток Ala, если этого оказалось недостаточно, то к исходному пептиду добавляется мотив Ala-Arg, если же и этого оказалось недостатончно, то к исходному пептиду добавляется мотив Ala-Arg-Tyr. Конечно, фланкирующие а.к.о. могут выбираться и из вырожденного мотива, например, [ANRK][RQYW][YWFVI].Algorithm for selecting flanking a.k.o. based on a model predicting the affinity of binding of oligopeptides to TAP developed by Peters et al. (Peters B et al., 2003, J. Immunol, 171: 1741-1749) included in the TEpredict program. The binding affinity was calculated according to the formula: N1 + N2 + N3 + C, where N1 denotes the contribution of the first (N-terminal) a.a. peptide, N2 - the second, N3 - the third, and C denotes the contribution of the last a.k.o. (C-terminal). Since the C-terminus of the peptide must remain unchanged, therefore, amino acid residues can only be added to the N-terminus. According to the model of Peters et al., The N-terminal ARY motif is optimal for binding to human TAP. Thus, first, the Ala residue is added to the peptide (if necessary), if this was not enough, then the Ala-Arg motif is added to the original peptide, but if this was not enough, the Ala-Arg-Tyr motif is added to the original peptide. Of course, flanking a.k.o. can be selected from a degenerate motive, for example, [ANRK] [RQYW] [YWFVI].
Учет протеасомного/иммунопротеасомного процессинга. Для оптимизации (иммуно)протеасомного процессинга антигена для эффективного высвобождения целевых эпитопов необходимо для каждой пары эпитопов подобрать оптимальные спейсерные аминокислотные последовательности. Для этого могут быть использованы два подхода. Accounting for proteasome / immunoproteasome processing. To optimize the (immuno) proteasome antigen processing for the effective release of target epitopes, it is necessary to select the optimal spacer amino acid sequences for each pair of epitopes. Two approaches can be used for this.
В первом варианте алгоритма в качестве спейсерной последовательности была выбрана консенсусная последовательность из шести аминокислот: ADLVKV, являющийся оптимальным для одновременной оптимизации протеасомного и иммунопротеасомного процессинга (при дизайне фланков для оптимизации высвобождения С-конца эпитопов мы использовали матрицы из ProPred1). Для анализа сочетаний и представления данных мы использовали направленные графы: пептиды - узлы графа; ребра, соединяющие узлы А и В, обозначают сочетания, в которых на C-конце пептида А присутствует необходимый сайт расщепления.In the first version of the algorithm, a consensus sequence of six amino acids was chosen as the spacer sequence: ADLVKV, which is optimal for the simultaneous optimization of proteasome and immunoproteasome processing (when designing flanks, we used matrices from ProPred1 to optimize the release of the C-terminus of epitopes). For the analysis of combinations and presentation of data, we used directed graphs: peptides - nodes of the graph; the edges connecting nodes A and B denote combinations in which the necessary cleavage site is present at the C-terminus of peptide A.
Конечно, для данного алгоритма можно использовать и другие спейсерные последовательности. Например, ADLVAG для оптимизации протеасомного процессинга или ADLAVK для иммунопротеасомного процессинга. Эти мотивы могут быть вырожденными: любой аминокислотный остаток из спейсерного мотива может быть заменен на любой другой аминокислотный остаток из двадцати канонических а.к.о. При этом при составления спейсерной последовательности между пептидами А и В предпочтение отдается а.к.о., обеспечивающим наиболее эффективное высвобождение C-конца эпитопа А.Of course, other spacer sequences can be used for this algorithm. For example, ADLVAG for optimizing proteasome processing or ADLAVK for immunoproteasome processing. These motifs can be degenerate: any amino acid residue from the spacer motif can be replaced by any other amino acid residue from twenty canonical a.k.o. In this case, when compiling the spacer sequence between peptides A and B, a.k.o., which provides the most efficient release of the C-terminus of epitope A, is preferred.
Этот вариант алгоритма конструирования последовательности фрагмента полиэпитопного иммуногена можно представить в виде следующей последовательности шагов.This version of the algorithm for constructing the sequence of a fragment of a polyepitope immunogen can be represented as the following sequence of steps.
1. Добавление спейсерных последовательностей (для оптимизации связывания пептидов с TAP) для всех выбранных пептидов (при необходимости).1. Adding spacer sequences (to optimize the binding of peptides to TAP) for all selected peptides (if necessary).
2. Для всех вариантов фланкирующих последовательностей из набора [' ', 'A', 'AD', 'ADL', 'ADLV', 'ADLVK', 'ADLVKV'], пока не будет создан итоговый полиэпитопный фрагмент, содержащий все выбранные эпитопы, или пока не будут испытаны все варианты фланков.2. For all variants of flanking sequences from the set ['', 'A', 'AD', 'ADL', 'ADLV', 'ADLVK', 'ADLVKV'], until a final polyepitope fragment containing all selected epitopes is created , or until all flank options are tested.
Если не создан путь, включающий все выбранные эпитопы: If no path has been created that includes all selected epitopes:
2.1. проводится построение графа;2.1. graph is being constructed;
2.2. если в графе есть смежные вершины, то выбираем из него путь с максимальной длиной;2.2. if the graph has adjacent vertices, then choose the path with the maximum length from it;
2.3. исключение из графа вершин, соответствующих пептидам, вошедшим в выбранный путь;2.3. exclusion from the graph of vertices corresponding to peptides that have entered the selected path;
2.4. добавление к выборке пептида, представляющего выбранный путь;2.4. adding to the sample a peptide representing the selected path;
2.5. см. п. 2.2;2.5. see paragraph 2.2;
2.6. если в графе не осталось смежных вершин, то создаем новую выборку пептидов, состоящую из выбранных путей и оставшихся узлов графа; переходим к следующей итерации цикла (п. 2).2.6. if there are no adjacent vertices in the graph, then create a new selection of peptides, consisting of the selected paths and the remaining nodes of the graph; we pass to the next iteration of the cycle (Sec. 2).
3. В итоге должна получиться последовательность искомого полиэпитопного фрагмента; если не был выбран путь, включающий все эпитопы, то нужно повторить алгоритм с п. 2, снизив строгость протеасомного/иммунопротеасомного фильтра.3. The result should be the sequence of the desired polyepitope fragment; if a path including all epitopes has not been selected, then the algorithm from
Второй подход основан на использовании для оптимизации протеасомного и/или иммунопротеасомного процессинга вырожденного оптимального мотива [APRS] [DILT] [AGL] [AKV]. Из этого мотива строится набор фланкирующих последовательностей с длиной от 1 до 4 а.к.о., к которому дополнительно добавляется пустой элемент - ' ', который обозначает соединение пептидов стык-в-стык. При использовании данного мотива набор возможных фланкирующих последовательностей включает более 150 вариантов. Могут использоваться и другие мотивы, в том числе и мотивы большей длины, например:The second approach is based on the use of a degenerate optimal motif [APRS] [DILT] [AGL] [AKV] to optimize the proteasome and / or immunoproteasome processing. From this motif, a set of flanking sequences with a length of 1 to 4 a.k.o. When using this motive, the set of possible flanking sequences includes more than 150 variants. Other motives can be used, including longer motives, for example:
[ARSPNK] [DLITGV] [LGAVEK] [VKAFSI] [ALKSEI] [GVKLSE] или[ARSPNK] [DLITGV] [LGAVEK] [VKAFSI] [ALKSEI] [GVKLSE] or
[AGNRKP] [DIATVG] [LGANVE] [ASNVLK] [VIKAGP] [KAGVSE][AGNRKP] [DIATVG] [LGANVE] [ASNVLK] [VIKAGP] [KAGVSE]
Несмотря на то, что большинство используемых спейсерных последовательностей имеет длину в 3-4 а.к.о., они могут иметь и существенно большую длину. В указанных позициях спейсерные последовательности могут иметь аминокислотные остатки, отличные от указанных (если они не препятствуют образованию искомого сайта протеасомного/иммунопротеасомного расщепления между пептидами).Despite the fact that most of the spacer sequences used are 3-4 a.k.o. in length, they can have a significantly longer length. At these positions, spacer sequences may have amino acid residues other than those indicated (if they do not interfere with the formation of the desired proteasome / immunoproteasome cleavage site between the peptides).
При использовании второго подхода для каждого сочетания пептидов А и В из всех возможных спейсеров отбираются те, которые обеспечивают наличие сайта протеасомного расщепления на С-конце пептида А, предсказываемого с заданным уровнем строгости протеасомного фильтра. Для всех отобранных вариантов проводится предсказание эпитопов и затем отбирается один (критерии описаны ниже) для данной пары пептидов. Затем производится конструирование последовательности полиэпитопного фрагмента, при этом первый пептид может либо задаваться в качестве аргумента для функции, либо выбираться автоматически (как лучший по выбранным критериям). В результате получается полиэпитопный фрагмент, содержащий все эпитопы. Если какой-либо из пептидов (например, пептид Х) не вошел в итоговую конструкцию, программа проводит поиск пептидов, между которыми может быть вставлен пептид Х; либо, если возможного места вставки не было найдено, пептид Х используется в качестве стартового.When using the second approach, for each combination of peptides A and B, from all possible spacers, those are selected that ensure the presence of a proteasome cleavage site at the C-terminus of peptide A, predicted with a given level of severity of the proteasome filter. Epitopes are predicted for all selected variants and then one is selected (criteria are described below) for a given pair of peptides. Then, the construction of the sequence of the polyepitope fragment is carried out, while the first peptide can either be set as an argument for the function, or selected automatically (as the best according to the selected criteria). The result is a polyepitope fragment containing all epitopes. If any of the peptides (for example, peptide X ) is not included in the final design, the program searches for peptides between which peptide X can be inserted; or, if a possible insertion site was not found, peptide X is used as the starting one.
В качестве критериев выбора спейсерной последовательности для пары пептидов А и В могут использоваться следующие: количество “нецелевых” эпитопов, предсказанных для стыковки с использованием данного спейсера; количество алломорф MHC, с которыми взаимодействуют эти “нецелевые” эпитопы; длина спейсерной последовательности (как правило, при прочих равных условиях, лучшим считается спейсер меньшей длины); естественно, при выборе все варианты спейсерных последовательностей для данной пары пептидов (А и В) ранжируются по предсказанной эффективности высвобождения С-конца пептида А. Эти критерии могут использоваться как фильтры, они могут применяться по отдельности или все вместе в различной последовательности. Кроме того, при этом можно варьировать строгость предсказания потенциальных Т-клеточных эпитопов и протеасомного/иммунопротеасомного процессинга пептидных фрагментов. Кроме того, с целью уменьшения количества “нецелевых” эпитопов можно использовать для составления итоговой конструкции пептидные фрагменты, составленные из пересекающихся в последовательности целевых антигенов эпитопов.The following criteria can be used as criteria for selecting a spacer sequence for a pair of peptides A and B : the number of “non-targeted” epitopes predicted for docking using this spacer; the amount of allomorph MHC with which these “non-target” epitopes interact; the length of the spacer sequence (as a rule, ceteris paribus, the shorter spacer is considered the best); naturally, when choosing all variants of spacer sequences for a given pair of peptides ( A and B ) are ranked by the predicted release efficiency of the C-terminus of peptide A. These criteria can be used as filters, they can be applied individually or collectively in a different sequence. In addition, the severity of prediction of potential T-cell epitopes and proteasome / immunoproteasome processing of peptide fragments can be varied. In addition, in order to reduce the number of “non-target” epitopes, peptide fragments composed of intersecting target antigens of epitopes in sequence can be used to compose the final construct.
При конструировании итоговой последовательности полиэпитопного фрагмента критерии используются для выбора первой пары пептидов (если первый пептид не был задан изначально) и для выбора каждого следующего пептида.When constructing the final sequence of the polyepitope fragment, the criteria are used to select the first pair of peptides (if the first peptide was not originally defined) and to select each subsequent peptide.
Создание полиэпитопных конструкций для стимуляцииCreating polyepitope constructs for stimulation
ответа CD4+ Т-лимфоцитовCD4 + T-lymphocyte response
Поскольку для формирования Т-клеточного иммунного ответа, способного эффективно противостоять M. tuberculosis, необходимо индуцировать ответ не только цитотоксических (CD8+), но и хелперных (CD4+) T-лимфоцитов, нами были созданы полиэпитопные конструкции, содержащие Т-хелперные эпитопы микобактериальных антигенов. Для конструирования таких полиэпитопных иммуногенов мы использовали описанные выше наборы эпитопов, рестриктированных различными алломорфами молекул MHC класса II, предсказанных с помощью TEpredict.Since it is necessary to induce not only cytotoxic (CD8 +), but also helper (CD4 +) T-lymphocytes to form a T-cell immune response that can effectively resist M. tuberculosis , we have created polyepitope constructs containing T-helper epitopes of mycobacterial antigens. To construct such polyepitope immunogens, we used the sets of epitopes described above that were restricted by various allomorphs of MHC class II molecules predicted by TEpredict.
В результате анализа предсказаний (эпитопных карт микобактериальных антигенов) были выбраны фрагменты, содержавшие эпитопы, способные связываться с наибольшим количеством алломорф молекул MHC класса II человека (HLA-DR). При выборе фрагментов учитывался тот факт, что аминокислотные остатки, фланкирующие эпитоп в составе белка (целевого антигена), могут быть важны для взаимодействия с соответствующим Т-клеточным рецептором, поэтому в состав антигенного фрагмента включались 3-5 а.к.о., фланкирующих выбранный район. Пептиды объединялись с помощью спейсерных мотивов [KR][KR], являющихся сайтами расщепления для лизосомных катепсинов B и L, принимающих участие в процессинге экзогенных антигенов.As a result of the analysis of predictions (epitope maps of mycobacterial antigens), fragments containing epitopes capable of binding to the largest number of allomorphs of human MHC class II molecules (HLA-DR) were selected. When choosing fragments, the fact was taken into account that amino acid residues flanking the epitope in the composition of the protein (target antigen) may be important for interaction with the corresponding T-cell receptor; therefore, 3-5 a.k.o. selected area. The peptides were combined using spacer motifs [KR] [KR], which are cleavage sites for the lysosomal cathepsins B and L involved in the processing of exogenous antigens.
Увеличение иммуногенности полиэпитопных конструкций и направление процессинга полиэпитопных конструкций по MHC I- или по MHC II-зависимому пути. В результате многочисленных исследований было показано, что при включении в состав полиэпитопных конструкций или рекомбинантных антигенов N-концевых сигнальных пептидов и тирозинового C-концевого мотива лизосомной сортировки из белка LAMP-1 человека наблюдается очень высокий уровень Т-хелперного ответа, по сравнению с конструкциями, не имеющими указанных сигнальных последовательностей. При этом уровень ответа CD8+ Т-лимфоцитов снижается не столь сильно, а ряд исследователей, напротив, сообщает о его усилении. Суть включения этих сигналов в состав иммуногена заключается в том, что N-концевой сигнальный пептид обеспечивает поступление полипептида в ЭР и в секреторный путь, а LAMP-мотив направляет этот полипептид из секреторного пути на деградацию в лизосомы, где образующиеся пептидные фрагменты связываются с молекулами MHC класса II и затем презентируются на поверхности клеток. В качестве сигнального пептида, направляющего антигенный полипептид в ЭР, использован пептид MKLTTMIKTAVAVVAMAAIATFAAPVALA. На C-конец иммуногенов был добавлен лизосомный сортировочный сигнал - 11 C-концевых а.к.о. белка LAMP-1 человека: RKRSHAGYQTI. The increase in the immunogenicity of polyepitope constructs and the direction of processing of polyepitope constructs along the MHC I- or MHC II-dependent pathway. As a result of numerous studies, it was shown that when polypeptide constructs or recombinant antigens include N-terminal signal peptides and a tyrosine C-terminal motif of lysosomal sorting from human LAMP-1 protein, a very high level of T-helper response is observed, compared with constructs not having the indicated signal sequences. At the same time, the response level of CD8 + T-lymphocytes decreases not so much, and a number of researchers, on the contrary, report its strengthening. The essence of the inclusion of these signals in the composition of the immunogen is that the N-terminal signal peptide allows the polypeptide to enter the ER and the secretory pathway, and the LAMP motive directs this polypeptide from the secretory pathway to degradation into lysosomes, where the resulting peptide fragments bind to MHC molecules class II and then presented on the surface of the cells. As the signal peptide directing the antigenic polypeptide in the ER, the MKLTTMIKTAVAVVAMAAIATFAAPVALA peptide was used. At the C-terminus of immunogens, a lysosomal sorting signal was added - 11 C-terminal a.s. Human LAMP-1 Protein: RKRSHAGYQTI.
Для дополнительной стимуляции цитотоксического ответа (CD8+) на N-конец всех поли-ЦТЛ-эпитопных конструкций добавлен убиквитин V76 (UbV76).To further stimulate the cytotoxic response (CD8 +), ubiquitin V76 (UbV76) was added to the N-terminus of all poly-CTL epitope constructs.
Способы доставкиDelivery Methods
Стратегия вакцинации предполагает совместное введение одной или нескольких конструкций для вызова ответа CD8+ ЦТЛ и одной или нескольких конструкций для вызова ответа CD4+ Т-хелперных лимфоцитов.The vaccination strategy involves the simultaneous administration of one or more constructs to elicit a CD8 + CTL response and one or more constructs to elicit a CD4 + T helper lymphocyte response.
Предложенные кандидатные вакцинные конструкции могут быть использованы в виде ДНК-вакцины - плазмиды со встроенным геном, кодирующим целевую полиэпитопную конструкцию. Ген, кодирующий целевой полиэпитопный антиген, может быть встроен в геном вируса или бактерии для получения вакцинного штамма микроорганизма. Вместе с целевым полиэпитопным антигеном в состав плазмиды или в геном вакцинного штамма микроорганизма могут быть встроены гены, кодирующие дополнительные факторы, стимулирующие развитие клеточного иммунного ответа, например ИЛ-12, ИЛ-23, ГМ-КСФ и др. Кроме того, предложенные полиэпитопные антигены могут быть использованы в виде очищенных рекомбинантных белков в качестве субъединичной вакцины. Предложенные полиэпитопные антигены могут быть использованы для вакцинации в комбинации с адъювантами, в составе вирусоподобных частиц, липосом, в комбинации с катионными пептидами и других иммуностимулирующих комплексов. Предложенные полиэпитопные антигены могут быть использованы в различных комбинациях, вместе и по отдельности.The proposed candidate vaccine constructs can be used in the form of a DNA vaccine, a plasmid with an integrated gene encoding the target polyepitope construct. A gene encoding a target polyepitope antigen can be inserted into the genome of a virus or bacteria to produce a vaccine strain of a microorganism. Together with the target polyepitope antigen, genes encoding additional factors stimulating the development of the cellular immune response, for example, IL-12, IL-23, GM-CSF, etc. can be integrated into the plasmid or the genome of the vaccine strain of the microorganism. In addition, the proposed polyepitope antigens can be used as purified recombinant proteins as a subunit vaccine. The proposed polyepitope antigens can be used for vaccination in combination with adjuvants, as part of virus-like particles, liposomes, in combination with cationic peptides and other immunostimulating complexes. The proposed polyepitope antigens can be used in various combinations, together and separately.
Полинуклеотидные фрагменты, кодирующие целевые полиэпитопные антигены (либо векторные микроорганизмы, несущие соответствующие гены), могут быть использованы для стабильной или транзиентной трансфекции (или инфекции) клеток, например, антигенпрезентирующих клеток (дендритных клеток, клеток Лангерганса или других АПК). Эти клетки могут быть использованы для клеточной терапии (для стимуляции иммунного ответа in situ) или для стимуляции формирования эффекторных CD8+ и/или CD4+ Т-лимфоцитов in vitro с целью использования полученных антигенспецифических эффекторных Т-лимфоцитов в качестве клеточной вакцины.Polynucleotide fragments encoding target polyepitope antigens (or vector microorganisms carrying the corresponding genes) can be used for stable or transient transfection (or infection) of cells, for example, antigen-presenting cells (dendritic cells, Langerhans cells or other APCs). These cells can be used for cell therapy (to stimulate the immune response in situ ) or to stimulate the formation of effector CD8 + and / or CD4 + T-lymphocytes in vitro with the aim of using the obtained antigen-specific effector T-lymphocytes as a cell vaccine.
Предложенные кандидатные вакцинные конструкции, а также векторные микроорганизмы или иммуностимулирующие комплексы, содержащие гены, кодирующие данные антигены, или рекомбинантные полиэпитопные белки, а также АПК, презентирующие предложенные антигены, или антигенспецифичные эффекторные Т-лимфоциты, полученные in vitro, могут быть использованы в качестве профилактической или терапевтической туберкулезной вакцины, в том числе в качестве дополнения различных схем терапии туберкулеза. Описанные формы данных вакцинных конструкций могут вводиться подкожно, внурикожно, внутримышечно, внутривенно, орально, через респираторный тракт, в различных сочетаниях.The proposed candidate vaccine constructs, as well as vector microorganisms or immunostimulating complexes containing genes encoding these antigens, or recombinant polyepitope proteins, as well as APCs presenting the proposed antigens, or antigen-specific effector T lymphocytes obtainedin vitro, can be used as a preventive or therapeutic tuberculosis vaccine, including as a supplement to various treatment regimens for tuberculosis. The described forms of these vaccine constructs can be administered subcutaneously, intracutaneously, intramuscularly, intravenously, orally, through the respiratory tract, in various combinations.
Далее проводилась оценка эффективности индукции Т-клеточного ответа in vitro с помощью полученных полиэпитопных конструкций.Next, we evaluated the effectiveness of the induction of the T-cell response in vitro using the obtained polyepitope constructs.
Для этого было подобрано 10 здоровых доноров, преимущественно экспрессирующих аллельный вариант HLA-A*0201, поскольку помимо универсальной конструкции в экспериментах используется вариант полиэпитопного антигена, спроектированного именно для этого аллельного варианта молекулы MHC класса I человека, поскольку этот алломорф является одним из наиболее распространенных в мировой человеческой популяции. Генотипирование проводилось с помощью ПЦР с использованием коммерческого набора ALLSET™ GOLD HLA A LOW RES SSP (Invitrogen, USA). В итоге было отобрано 10 HLA-A*02-положительных доноров. Точного генотипирования аллельных вариантов HLA не проводилось, поскольку подавляющее число HLA-A*02-положительных индивидуумов несут аллель HLA-A*0201 (ожидаемый процент носителей данного аллельного варианта HLA-A среди HLA-A*02-положительных индивидуумов не менее 75-80%).For this, 10 healthy donors were selected, mainly expressing the HLA-A * 0201 allelic variant, since in addition to the universal design, the experiment uses a polyepitope antigen variant designed specifically for this allelic variant of the human MHC class I molecule, since this allomorph is one of the most common global human population. Genotyping was performed by PCR using a commercial ALLSET ™ GOLD HLA A LOW RES SSP kit (Invitrogen, USA). As a result, 10 HLA-A * 02-positive donors were selected. Precise genotyping of HLA allelic variants was not carried out, since the vast majority of HLA-A * 02-positive individuals carry the HLA-A * 0201 allele (the expected percentage of carriers of this HLA-A allelic variant among HLA-A * 02-positive individuals is not less than 75-80 %).
Из полученной периферической крови с помощью стандартной методики были выделены мононуклеарные клетки (МНК). В полученной фракции клеток проверяли уровень экспресии маркеров CD3, CD14. Из полученной фракции мононуклеарных клеток с помощью сорбции на пластике отбирали фракцию моноцитов. Проверяли уровень экспресии маркеров CD3, CD14 в полученной фракции клеток для оценки обогащения фракции моноцитами. МНК были выделены из периферической крови HLA-A2-положительных доноров с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (Sigma-Aldrich, USA; Schering, Germany). Фракцию МНК, обогащенную моноцитами, получали методом адгезии на пластике (Nunc, Denmark) в результате культивирования в течение 1 часа. Неприлипшие клетки удаляли и сохраняли для дальнейшего использования.Mononuclear cells (MNCs) were isolated from the obtained peripheral blood using standard techniques. In the obtained cell fraction, the level of expression of the markers CD3, CD14 was checked. From the obtained mononuclear cell fraction, a fraction of monocytes was selected using plastic sorption. Checked the level of expression of CD3, CD14 markers in the obtained cell fraction to assess the enrichment of the fraction with monocytes. MNCs were isolated from the peripheral blood of HLA-A2 positive donors by centrifugation in a density gradient of ficoll-urographin (Sigma-Aldrich, USA; Schering, Germany). The monocyte enriched MNC fraction was obtained by plastic adhesion (Nunc, Denmark) as a result of culturing for 1 hour. Non-adherent cells were removed and stored for future use.
Для получения незрелых дендритных клеток (ДК) фракция прилипающих МНК культивировалась в среде AIM-V (Invitrogen, USA), содержащей 50 нг/мл рчGM-CSF (BioVision, USA) и 200 нг/мл рчIL-4 (BioVision, USA) (Obermaier B. et.al, Biol Proced Online, 2003, (5):197-203). После 24 часов для созревания ДК в культуру добавлялся ЛПС (E. coli 055:B5, Sigma, USA) в количестве 5 мкг/мл. Через 24 часа после добавления ЛПС клетки собирались и использовались как зрелые ДК. Фенотип полученных ДК подтверждался с помощью моноклональных антител, меченных FITC или PE, специфичных к CD3, CD11c, CD14, CD83, CD86 и HLA-DR (BD Biosciences, USA). Интенсивность флуоресценции измерялась с помощью FACSCalibur (BD Biosciences, USA). Фагоцитирующая активность ДК оценивалась с использованием декстрана, конъюгированного с FITC (Sigma, USA) (Della Bella S. et. al, J. Leukocyte Biol., 2004, 75(1):106-16; Kato M. et.al. Int. Immunol., 2000, 11:1511-1519).To obtain immature dendritic cells (DC), the adherent MNC fraction was cultured in AIM-V medium (Invitrogen, USA) containing 50 ng / ml rhGM-CSF (BioVision, USA) and 200 ng / ml rhIL-4 (BioVision, USA) ( Obermaier B. et.al, Biol Proced Online, 2003, (5): 197-203). After 24 hours for the maturation of DC, LPS (E. coli 055: B5, Sigma, USA) was added to the culture in an amount of 5 μg / ml. 24 hours after the addition of LPS, the cells were harvested and used as mature DCs. The phenotype of the obtained DC was confirmed using monoclonal antibodies labeled with FITC or PE specific for CD3, CD11c, CD14, CD83, CD86 and HLA-DR (BD Biosciences, USA). Fluorescence intensity was measured using FACSCalibur (BD Biosciences, USA). The phagocytic activity of DC was evaluated using FITC conjugated dextran (Sigma, USA) (Della Bella S. et. Al, J. Leukocyte Biol., 2004, 75 (1): 106-16; Kato M. et.al. Int Immunol., 2000, 11: 1511-1519).
Полученные зрелые ДК были трансфецированы целевыми плазмидами с помощью специальной методики магнитной трансфекции (MATra - agnet assisted transfection, Promokine, Germany) согласно протоколу производителя (http://www.promokine.info/fileadmin/PDFs/Cell_Transfection/MATra_handbook_PromoKine.pdf). Эффективность трансфекции подтверждалась с помощью ОТ-ПЦР, а также с помощью флуоресцентной микроскопии. Флуоресцентные плазмиды были созданы с помощью кита для ник-трансляции (PromoKine, Germany).The obtained mature DCs were transfected with target plasmids using a special magnetic transfection technique (MATra - agnet assisted transfection, Promokine, Germany) according to the manufacturer's protocol (http://www.promokine.info/fileadmin/PDFs/Cell_Transfection/MATra_handbook_PromoKine.pdf). The effectiveness of transfection was confirmed by RT-PCR, as well as using fluorescence microscopy. Fluorescent plasmids were created using a nick translation kit (PromoKine, Germany).
Полученные зрелые ДК подвергались совместному культивированию с неприлипающими МНК в течение 48 часов в соотношении ДК:МНК = 1:10 в присутствии 40 нг/мл рчIL-18 и 10 нг/мл рчIL-12 (BioVision, USA) для стимуляции эффекторных Т-лимфоцитов.The resulting mature DCs were co-cultured with non-adherent MNCs for 48 hours at a ratio of DC: MNC = 1:10 in the presence of 40 ng / ml rchIL-18 and 10 ng / ml rchIL-12 (BioVision, USA) to stimulate effector T lymphocytes .
Макрофаги были получены в результате инкубации прилипающих МНК в среде AIM-V (Invitrogen, USA), содержащей 100 нг/мл рчМ-CSF (BioVision, USA), в течение 72 часов.Macrophages were obtained by incubating adherent MNCs in AIM-V medium (Invitrogen, USA) containing 100 ng / ml rhM-CSF (BioVision, USA) for 72 hours.
Далее проводилось получение незрелых ДК из моноцитов. Для этого фракция клеток, обогащенная моноцитами, инкубировалась с рекомбинантным человеческим GM-CSF (в концентрации 50 нг/мл) и рекомбинантным человеческим IL-4 (в концентрации 100 нг/мл). Исследовали фенотип полученных клеток: оценивали уровень экспрессии маркеров CD14, CD11c, CD83, CD86, HLA-DR и фагоцитирующую активность (по захвату Fitc-Dextran). Проводили трансфекцию незрелых ДК созданными вакцинными плазмидами с использованием набора MATra (Magnet assisted transfection, Promokine, USA) согласно протоколу, рекомендованному производителем. Оценку эффективности трансфекции проводили с помощью дот-блот анализа и проточной цитометрии с внутриклеточным окрашиванием. Полученные результаты подтверждают эффективность трансфекции и достаточно высокий уровень экспрессии целевых антигенов.Then, immature DCs from monocytes were obtained. For this, the cell fraction enriched in monocytes was incubated with recombinant human GM-CSF (at a concentration of 50 ng / ml) and recombinant human IL-4 (at a concentration of 100 ng / ml). The phenotype of the obtained cells was investigated: the expression level of the markers CD14, CD11c, CD83, CD86, HLA-DR and phagocytic activity (by Fitc-Dextran capture) were evaluated. Immature DCs were transfected with the created vaccine plasmids using the MATra kit (Magnet assisted transfection, Promokine, USA) according to the protocol recommended by the manufacturer. Efficiency of transfection was assessed using dot blot analysis and flow cytometry with intracellular staining. The obtained results confirm the efficiency of transfection and a rather high level of expression of target antigens.
Под действием ФНО проводилось созревание трансфецированных дендритных клеток. Созревание ДК подтверждали с помощью оценки уровня экспресии маркеров CD14, CD11c, CD83, CD86, HLA-DR и снижением фагоцитирующей активности (захват Fitc-Dextran). В итоге были получены зрелые ДК с доказанной экспрессией полиэпитопных антигенов.Under the action of TNF, transfected dendritic cells matured. DC maturation was confirmed by assessing the level of expression of the markers CD14, CD11c, CD83, CD86, HLA-DR and a decrease in phagocytic activity (capture Fitc-Dextran). As a result, mature DCs with proven expression of polyepitope antigens were obtained.
Полученные зрелые ДК использовали для совместного культивирования с полученными ранее аутологичными неадгезированными фракциями мононуклеарных клеток периферической крови (ПК) (в соотношении 1:10) в присутствии рекомбинантных человеческих цитокинов ИЛ-18 и ИЛ-12 для стимуляции клеточного иммунного ответа. Напомним, что стратегия вакцинации предполагает совместное введение одной или нескольких конструкций для вызова ответа CD8+ ЦТЛ и одной или нескольких конструкций для вызова ответа CD4+ Т-хелперных лимфоцитов. Было создано восемь групп (в скобках приведена смесь плазмид, которыми трансфецировались ДК):The resulting mature DCs were used for co-cultivation with previously obtained autologous non-adherent fractions of peripheral blood mononuclear cells (PCs) (1:10 ratio) in the presence of recombinant human cytokines IL-18 and IL-12 to stimulate a cellular immune response. Recall that the vaccination strategy involves the joint introduction of one or more constructs to elicit a CD8 + CTL response and one or more constructs to elicit a CD4 + T helper lymphocyte response. Eight groups were created (in parentheses is a mixture of plasmids that transfected DCs):
1. ДК:(pTBUi+pTBih) + МНК ПК;1. DK: (pTBUi + pTBih) + OLS PC;
2. ДК:(pTBUi_a0201+pTBih) + МНК ПК;2. DK: (pTBUi_a0201 + pTBih) + OLS PC;
3. ДК:(pTBUe+pTBih) + МНК ПК;3. DK: (pTBUe + pTBih) + OLS PC;
4. ДК:(pTBUe_a0201+pTBih) + МНК ПК;4. DK: (pTBUe_a0201 + pTBih) + OLS PC;
5. ДК:(pTBUd+pTBih) + МНК ПК;5. DC: (pTBUd + pTBih) + OLS PC;
6. ДК:(pTBUd_a0201+pTBih) + МНК ПК;6. DK: (pTBUd_a0201 + pTBih) + OLS PC;
7. ДК, стимулированные лизатом M. tuberculosis H37Rv, + МНК ПК;7. DC stimulated by the lysate of M. tuberculosis H37Rv, + MNC PK;
8. Не стимулированные МНК ПК.8. Not stimulated MNCs PC.
Для изучения Т-клеточного ответа в качестве клеток-мишеней для каждого случая были использованы аутологичные ДК, инфицированные M. tuberculosis H37Rv. В культурах ДК + МНК ПК проводилось изучение уровня продукции γIFN в ответ на добавление к культуре аутологичных макрофагов, инфицированных M. tuberculosis H37Rv, обработанных митомицином С для подавления пролиферации. Для предотвращения секреции цитокинов в культуру был добавлен Brefeldin A. Оценка продукции γIFN проводилась с помощью ELISpot. Результаты представлены на фиг. 10.To study the T-cell response, autologous DCs infected with M. tuberculosis H37Rv were used as target cells for each case. In cultures of DC + MNC PK, the level of γIFN production was studied in response to the addition to the culture of autologous macrophages infected with M. tuberculosis H37Rv treated with mitomycin C to suppress proliferation. To prevent cytokine secretion, Brefeldin A was added to the culture. Evaluation of γIFN production was performed using ELISpot. The results are shown in FIG. 10.
Было проведено изучение цитотоксического ответа. Для этого с помощью колориметрического метода (CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay, Promega, USA) определялся уровень активности лактат-дегидрогеназы (ЛДГ) - цитозольного фермента, высвобождаемого в результате лизиса клеток-мишеней (аутологичных макрофагов, инфицированных M. tuberculosis H37Rv) под действием полученных эффекторных Т-лимфоцитов, согласно протоколу изготовителя (http://www.promega.com/tbs/tb163/tb163.pdf). Интенсивность окраски, прямо пропорциональная количеству лизированных клеток, измерялась с помощью мультимодального ридера LB 941 TriStar (Berthold Technologies, Germany). Результаты этих экспериментов представлены на фиг. 11.A study of the cytotoxic response was conducted. For this, using the colorimetric method (CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay, Promega, USA), the level of activity of lactate dehydrogenase (LDH), a cytosolic enzyme released by lysis of target cells (autologous macrophages infected with M. tuberculosis H37Rv), was determined under the action of the obtained effector T-lymphocytes, according to the manufacturer's protocol (http://www.promega.com/tbs/tb163/tb163.pdf). The color intensity, directly proportional to the number of lysed cells, was measured using a multimodal reader LB 941 TriStar (Berthold Technologies, Germany). The results of these experiments are shown in FIG. eleven.
Оценка достоверности отличий полученных результатов проводилась с помощью теста Манна-Уитни. Значения p < 0.05 считались статистически достоверными (табл. 1). Как и ожидалось, все полиэпитопные конструкции продемонстрировали более высокую эффективность индукции Т-клеточного иммунного ответа, по сравнению с отрицательной контрольной группой (p < 0.001). Во всех экспериментальных группах количество клеток, продуцирующих γIFN спонтанно, было достоверно меньше (p < 0.05) количества γIFN-продуцирующих клеток после стимуляции клетками-мишенями (данные не приведены). Отличие эффективности индукции Т-клеточного иммунного ответа универсальными конструкциями (pTBUi, pTBUe и pTBUd) от соответствующих им аллелеспецифических вариантов (pTBUi_a0201, pTBUe_a0201 и pTBUd_a0201) для наиболее распространенного в человеческой популяции аллеля HLA-A*0201 оказалось статистически недостоверным (p > 0.1).Assessment of the significance of differences in the results was carried out using the Mann-Whitney test. Values p <0.05 were considered statistically significant (Table 1). As expected, all polyepitope constructs showed a higher efficiency of the induction of the T-cell immune response, compared with the negative control group (p <0.001). In all experimental groups, the number of cells producing γIFN spontaneously was significantly less (p <0.05) than the number of γIFN-producing cells after stimulation with target cells (data not shown). The difference in the efficiency of the induction of the T-cell immune response by universal constructs (pTBUi, pTBUe and pTBUd) from their corresponding allele-specific variants (pTBUi_a0201, pTBUe_a0201 and pTBUd_a0201) for the most common HLA-A * 0201 allele in the human population turned out to be statistically significant> 0.1 (0.1).
Таблица 1. Результаты статистического анализа экспериментальных данных.Table 1. The results of statistical analysis of experimental data.
Примечание. Анализ проводили с использованием теста Манна-Уитни, статистически достоверными считались значения p < 0.05.Note. The analysis was performed using the Mann-Whitney test; p <0.05 was considered statistically significant.
Обозначения.Designations.
DC:i - ДК:(pTBUi+pTBih) + МНК ПК; DC: i - DC: (pTBUi + pTBih) + OLS PC;
DC:i0201 - ДК:(pTBUi_a0201+pTBih) + МНК ПК;DC: i0201 - DC: (pTBUi_a0201 + pTBih) + OLS PC;
DC:e - ДК:(pTBUe+pTBih) + МНК ПК;DC: e - DC: (pTBUe + pTBih) + OLS PC;
DC:e0201 - ДК:(pTBUe_a0201+pTBih) + МНК ПК;DC: e0201 - DC: (pTBUe_a0201 + pTBih) + OLS PC;
DC:d - ДК:(pTBUd+pTBih) + МНК ПК;DC: d - DC: (pTBUd + pTBih) + OLS PC;
DC:d0201 - ДК:(pTBUd_a0201+pTBih) + МНК ПК;DC: d0201 - DK: (pTBUd_a0201 + pTBih) + OLS PC;
DC:Mtb - ДК, стимулированные лизатом M. tuberculosis H37Rv, + МНК ПК;DC: Mtb — DC stimulated by M. tuberculosis H37Rv lysate, + PC MNC;
PBMCu - не стимулированные МНК ПК.PBMCu - not stimulated MNCs PC.
Согласно полученным результатам, наиболее эффективно Т-клеточный иммунный ответ стимулировался ДК, трансфецированными смесью плазмид pTBUi, кодирующей поли-ЦТЛ-эпитоп, составленный на основе эпитопов иммунодоминантных антигенов M. tuberculosis, и pTBih, кодирующей поли-Т-хелперный иммуноген, составленный на основе эпитопов иммунодоминантных антигенов M. tuberculosis. Близкую, хотя и несколько меньшую, эффективность показала плазмида pTBUe, кодирующая поли-ЦТЛ-эпитоп, составленный на основе эпитопов ESAT-подобных антигенов M. tuberculosis.According to the results obtained, the T-cell immune response was most effectively stimulated by DC transfected with a mixture of pTBUi plasmids encoding a poly-CTL epitope composed of epitopes of M. tuberculosis immunodominant antigens and pTBih encoding a poly-T helper immunogen composed of epitopes of immunodominant antigens of M. tuberculosis . A close, albeit slightly lower, efficiency was shown by the plasmid pTBUe encoding a poly-CTL epitope composed of epitopes of ESAT-like antigens of M. tuberculosis .
Использование плазмид, кодирующих поли-Т-хелперные иммуногены, составленные на основе эпитопов ESAT-подобных (pTBeh) и DosR (pTBdh) антигенов M. tuberculosis, в соответствующих конструкциях ДК:(pTBUe+pTBeh) + МНК ПК и ДК:(pTBUd+pTBdh) + МНК ПК не показало достоверных отличий по сравнению с использованием плазмиды pTBih, кодирующей поли-Т-хелперный иммуноген, составленный на основе эпитопов иммунодоминантных антигенов M. tuberculosis. The use of plasmids encoding poly-T helper immunogens based on the epitopes of ESAT-like (pTBeh) and DosR (pTBdh) M. tuberculosis antigens in the corresponding constructs of DC: (pTBUe + pTBeh) + MNK PC and DC: (pTBUd + pTBdh) + PC MNCs did not show significant differences compared with the use of the pTBih plasmid encoding a poly-T helper immunogen composed of epitopes of immunodominant M. tuberculosis antigens .
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011101276/10A RU2539035C2 (en) | 2011-01-13 | 2011-01-13 | Preventive or therapeutic polyepitopic anti-tuberculosis vaccine construction providing induction of cellular immune response of cd4+ or cd8+ t-lymphocytes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011101276/10A RU2539035C2 (en) | 2011-01-13 | 2011-01-13 | Preventive or therapeutic polyepitopic anti-tuberculosis vaccine construction providing induction of cellular immune response of cd4+ or cd8+ t-lymphocytes |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2011101276A RU2011101276A (en) | 2012-07-20 |
| RU2539035C2 true RU2539035C2 (en) | 2015-01-10 |
Family
ID=46847109
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011101276/10A RU2539035C2 (en) | 2011-01-13 | 2011-01-13 | Preventive or therapeutic polyepitopic anti-tuberculosis vaccine construction providing induction of cellular immune response of cd4+ or cd8+ t-lymphocytes |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2539035C2 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2186109C2 (en) * | 1994-11-14 | 2002-07-27 | Мерк Энд Ко., Инк. | Polynucleotide antituberculosis vaccine |
| US20050058626A1 (en) * | 1995-04-07 | 2005-03-17 | Johnston Stephen A. | Expression library immunization |
| WO2010010577A1 (en) * | 2008-07-25 | 2010-01-28 | Department Of Biotechnology | Constructing a dna chimera for vaccine development against leishmaniasis and tuberculosis |
-
2011
- 2011-01-13 RU RU2011101276/10A patent/RU2539035C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2186109C2 (en) * | 1994-11-14 | 2002-07-27 | Мерк Энд Ко., Инк. | Polynucleotide antituberculosis vaccine |
| US20050058626A1 (en) * | 1995-04-07 | 2005-03-17 | Johnston Stephen A. | Expression library immunization |
| WO2010010577A1 (en) * | 2008-07-25 | 2010-01-28 | Department Of Biotechnology | Constructing a dna chimera for vaccine development against leishmaniasis and tuberculosis |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2011101276A (en) | 2012-07-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11135277B2 (en) | Antigen specific multi epitope-based anti-infective vaccines | |
| Gong et al. | Peptide-based vaccines for tuberculosis | |
| JP2023526495A (en) | SARS-CoV-2 vaccine | |
| JP2020518648A (en) | Alphavirus neonatal antigen vector | |
| EP3076992A1 (en) | Formulations for neoplasia vaccines | |
| Cong et al. | Toxoplasma gondii HLA-B* 0702-restricted GRA720-28 peptide with adjuvants and a universal helper T cell epitope elicits CD8+ T cells producing interferon-γ and reduces parasite burden in HLA-B* 0702 mice | |
| AU2010238943A1 (en) | A tuberculosis TB vaccine to prevent reactivation | |
| JP2009541373A (en) | Expansion of T cell repertoire containing subdominant epitopes by vaccination with antigen delivered as protein fragments or peptide cocktails | |
| US20230143215A1 (en) | Immunization against sars-cov-related diseases | |
| WO2013003579A1 (en) | Cytotoxic t-lymphocyte-inducing immunogens for prevention, treatment, and diagnosis of dengue virus infection | |
| Lu et al. | Epitope analysis, expression and protection of SAG5A vaccine against Toxoplasma gondii | |
| Wolkers et al. | Optimizing the efficacy of epitope-directed DNA vaccination | |
| JP2023521662A (en) | Infectious disease antigens and vaccines | |
| Sbai et al. | Use of T cell epitopes for vaccine development | |
| US20230181721A1 (en) | Vaccine against sars-cov virus | |
| Bettahi et al. | Protective immunity against ocular herpes infection and disease induced by highly immunogenic self-adjuvanting glycoprotein D lipopeptide vaccines | |
| González-López et al. | A novel multi-epitope recombinant protein elicits an antigen-specific CD8+ T cells response in Trypanosoma cruzi-infected mice | |
| RU2539035C2 (en) | Preventive or therapeutic polyepitopic anti-tuberculosis vaccine construction providing induction of cellular immune response of cd4+ or cd8+ t-lymphocytes | |
| ES2573105T3 (en) | Peptide sequences and compositions | |
| US20110305720A1 (en) | Peptide adjuvants | |
| JP2022017865A (en) | Cytotoxic t cell epitope peptide of sars-cov-2 and utilization thereof | |
| Cayabyab et al. | An unbiased peptide-wide discovery approach to select Mycobacterium tuberculosis antigens that target CD8+ T cell response during infection | |
| Paterson | Rational approaches to immune regulation | |
| Gao et al. | A novel DNA vaccine containing multiple TB‐specific epitopes cast in a natural structure elicits enhanced Th1 immunity compared with BCG | |
| Walton et al. | Immunization with hybrid recombinant Mycobacterium tuberculosis H37Rv proteins increases the TH1 cytokine response in mice following a pulmonary instillation of irradiated mycobacteria |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150208 |