RU2538621C2 - Method for stimulating restoration of tissue innervation following injuries and ischemia by means of vector construct - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: therapeutically effective amount of a recombinant plasmid with a nucleotide sequence of SEQ ID NO:1, which contains a modified nucleotide sequence coding human BDNF, and the Kozak consensus sequence, is introduced into an involved muscle; pVax1 Invitrogen is used as a plasmid vector.

EFFECT: invention discloses an effective method to accelerate the restoration of the structure and conductivity of peripheral nerves after an injury, by transfection of the muscles innervated by the injured nerve, by means of a new plasmid construct coding the brain-derived neurotrophic factor.

3 cl, 5 dwg, 4 ex

Description

Настоящее изобретение относится к области генной инженерии и генной терапии и может быть использовано в регенеративной медицине, травматологии, трансплантологии и нейробиологии для стимуляции роста и регенерации нервов и восстановления иннервации ишемизированных тканей. Предлагается способ, позволяющий ускорить восстановление структуры и проводимости периферических нервов после травм, путем трансфекции мышц, иннервируемых поврежденным нервом, новой плазмидной конструкцией, кодирующей мозговой нейротрофический фактор (BDNF).The present invention relates to the field of genetic engineering and gene therapy and can be used in regenerative medicine, traumatology, transplantology and neurobiology to stimulate the growth and regeneration of nerves and restore the innervation of ischemic tissues. A method is proposed that allows to accelerate the restoration of the structure and conductivity of peripheral nerves after injuries by transfecting the muscles innervated by the damaged nerve with a new plasmid construct encoding brain neurotrophic factor (BDNF).

ВведениеIntroduction

Нарушения периферической иннервации, вызванные травмами, ишемией и нейродегенеративными заболеваниями являются важнейшей причиной временной и стойкой инвалидности населения России трудоспособного возраста [1]. Недостаточное восстановление иннервации также существенно снижает успешное приживление трансплантированных тканей и органов (печени, почек, сердца).Disorders of peripheral innervation caused by trauma, ischemia and neurodegenerative diseases are the most important cause of temporary and permanent disability of the Russian population of working age [1]. Inadequate restoration of innervation also significantly reduces the successful engraftment of transplanted tissues and organs (liver, kidneys, heart).

Стимуляция роста и восстановления периферического нерва - результат сложнейшего процесса, включающего множество физиологических и биохимических реакций. Для его осуществления, прежде всего, требуется поддержка выживания и регенерации нейронов и регуляция направления роста аксонов, в обеспечении которых основную роль нейротрофические факторы: мозговой нейротрофический фактор (BDNF), глиальный фактор роста (GDNF) и фактор роста нервов (NGF).Stimulation of the growth and restoration of the peripheral nerve is the result of a complex process, including many physiological and biochemical reactions. For its implementation, first of all, it is necessary to support the survival and regeneration of neurons and to regulate the direction of axon growth, in which neurotrophic factors play a major role: cerebral neurotrophic factor (BDNF), glial growth factor (GDNF) and nerve growth factor (NGF).

Таким образом, уже на основе теоретического анализа вопроса можно заключить, что на процесс регенерации нерва и восстановления периферической иннервации в участке повреждения стимулирующее воздействие может оказать локальное повышение продукции нейротрофических факторов.Thus, based on a theoretical analysis of the issue, we can conclude that a local increase in the production of neurotrophic factors can have a stimulating effect on the process of nerve regeneration and restoration of peripheral innervation in the lesion site.

Уровень техникиState of the art

Одним из наиболее разработанных подходов к решению вопроса локального обеспечения определенных органов, тканей и их отдельных зон необходимыми полипептидными продуктами (гормонами, ферментами, ростовыми факторами и т.д.) является применение векторных конструкций, включающих гены, которые кодируют нужные белки, в данном случае ключевые факторы, стимулирующие рост нервов и восстановление периферической иннервации.One of the most developed approaches to solving the issue of local provision of certain organs, tissues and their individual zones with the necessary polypeptide products (hormones, enzymes, growth factors, etc.) is the use of vector constructs that include genes that encode the desired proteins, in this case key factors stimulating nerve growth and restoration of peripheral innervation.

Известны способы стимуляции восстановления периферической иннервации, предусматривающие введение пациенту последовательности, кодирующей BDNF, в составе адено- и аденоассоциированных вирусов, а также в виде лентивирусных конструкций [2]. Ранее в нашей лаборатории был разработан способ стимуляции восстановления периферической иннервации посредством введения невирусной векторной конструкции, содержащей оптимизированную последовательность кДНК BDNF человека.Known methods of stimulating the restoration of peripheral innervation, involving the introduction to the patient of a sequence encoding BDNF, as part of adeno- and adeno-associated viruses, as well as lentiviral constructs [2]. Earlier in our laboratory, a method was developed to stimulate the restoration of peripheral innervation by introducing a non-viral vector construct containing an optimized human BDNF cDNA sequence.

В силу указанных выше причин аналогами предлагаемого изобретения можно считать работу Alrashdan [3] и наши собственные данные [4, 5], где описаны способы регенерации периферического нерва после травмы.Due to the above reasons, the work of Alrashdan [3] and our own data [4, 5], which describes methods for the regeneration of a peripheral nerve after an injury, can be considered analogues of the present invention.

В основе способа, предложенного Alrashdan et al., лежит стимуляция процесса путем инъекции в область нарушения иннервации аденовирусной конструкции, содержащей ген BDNF (BDNF-Ad), с целью локального повышения содержания данного клеточного фактора, участвующего в восстановлении нервных клеток. При этом, кроме того, что использование рекомбинантных вирусов для трансфекции не может считаться абсолютно безопасным, предложенное использование конструкции BDNF-Ad оказалось еще и недостаточно эффективным: период восстановления иннервации, по оценкам авторов, составлял примерно 3 недели.The method proposed by Alrashdan et al. Is based on stimulation of the process by injection into the area of the innervation disorder of the adenovirus construct containing the BDNF gene (BDNF-Ad), with the aim of locally increasing the content of this cell factor involved in the restoration of nerve cells. Moreover, in addition to the fact that the use of recombinant viruses for transfection cannot be considered absolutely safe, the proposed use of the BDNF-Ad construct was also not effective enough: the recovery period of innervation, according to the authors, was approximately 3 weeks.

В отношении способа, предложенного ранее, необходимо отметить, что несмотря на то, что удалось продемонстрировать положительное влияние разработанной невирусной конструкции на восстановление периферической иннервации, эффект был недостаточно выражен.Regarding the method proposed earlier, it should be noted that despite the fact that it was possible to demonstrate the positive effect of the developed non-viral construct on the restoration of peripheral innervation, the effect was not sufficiently pronounced.

В связи с этим, была предпринята попытка усовершенствовать способ стимуляции восстановления периферической иннервации с помощью метода рекомбинантных ДНК в направлении повышения его эффективности.In this regard, an attempt was made to improve the method of stimulating the restoration of peripheral innervation using the method of recombinant DNA in the direction of increasing its efficiency.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

При разработке настоящего изобретения во внимание были приняты следующие факты.In developing the present invention, the following facts have been taken into account.

Первое. Для успешной стимуляции роста и восстановления периферического нерва требуется поддержка выживания и регенерации нейронов, а также регуляция направления роста аксонов. Данную функцию выполняют нейротрофические факторы, такие как BDNF, глиальный фактор роста (GDNF) и фактор роста нервов (NGF). Соответственно, можно заключить, что стимуляции роста нервных окончаний и восстановления нервов с высокой степенью вероятности можно достичь, обеспечив долговременную продукцию нейротрофических факторов в участке повреждения.The first one. Successful stimulation of growth and recovery of the peripheral nerve requires support for the survival and regeneration of neurons, as well as regulation of the direction of axon growth. This function is performed by neurotrophic factors such as BDNF, glial growth factor (GDNF) and nerve growth factor (NGF). Accordingly, we can conclude that stimulation of the growth of nerve endings and restoration of nerves with a high degree of probability can be achieved by providing long-term production of neurotrophic factors in the lesion.

Второе. Известно, что долговременная продукция нейротрофических факторов может быть обеспечена путем введения в поврежденную ткань генно-инженерных конструкций, содержащих кДНК этих белков. Для последовательности кДНК BDNF человека характерно высокое содержание т.н. «редких триплетов», что может негативно влиять на эффективность ее экспрессии. Ранее в нашей лаборатории такие триплеты были заменены на те, которые встречаются в генах человека наиболее часто, без изменения кодируемой аминокислотной последовательности, что обеспечило долговременную продукцию этого белка в поврежденных скелетных мышцах [4].The second one. It is known that long-term production of neurotrophic factors can be achieved by introducing into the damaged tissue genetic engineering constructs containing cDNA of these proteins. The human BDNF cDNA sequence is characterized by a high content of so-called “Rare triplets”, which may negatively affect the efficiency of its expression. Earlier in our laboratory, such triplets were replaced by those that are most often found in human genes, without changing the encoded amino acid sequence, which ensured long-term production of this protein in damaged skeletal muscles [4].

Добиться дальнейшего повышения эффективности продукции трансгена можно благодаря введению в его структуру консенсусной последовательности Козак [6].A further increase in the efficiency of transgene production can be achieved by introducing a Kozak consensus sequence into its structure [6].

Учитывая перечисленные факты, добиться повышения эффективности экспрессии BDNF в участках повреждения можно путем введения в экспрессионный вектор консенсусной последовательности Козак.Given the above facts, achieve increased efficiency expression of BDNF in the lesion sites can be achieved by introducing a Kozak consensus sequence into the expression vector.

Третье. Для успешной стимуляции восстановления иннервации в ишемизированной ткани необходимо обеспечить высокий уровень продукции нейротрофного фактора. Соответственно, эффективным способом стимуляции восстановления иннервации в ишемизированных тканях с высокой вероятностью могло бы быть применение плазмидной конструкции, кодирующей мозговой нейротрофный фактор и обеспечивающей максимально возможную продукцию трансгена.The third. To successfully stimulate the restoration of innervation in ischemic tissue, it is necessary to ensure a high level of neurotrophic factor production. Accordingly, the use of a plasmid construct encoding the brain neurotrophic factor and providing the maximum possible transgene production could be a high probability of stimulating the restoration of innervation in ischemic tissues.

С учетом этого, решение поставленной задачи предполагало:With this in mind, the solution of the task involved:

а) создание плазмидной конструкции, содержащей оптимизированную кДНК мозгового нейротрофического фактора (BDNF), в которую внесена консенсусная последовательность Козак;a) creating a plasmid construct containing optimized brain neurotrophic factor cDNA (BDNF), into which the Kozak consensus sequence has been introduced;

б) оценка эффективности экспрессии созданной плазмидной конструкции in vitro; иb) evaluation of the expression efficiency of the created plasmid construct in vitro; and

в) определение результата введения плазмидной конструкции на эффективность восстановления периферического нерва после травмы, а также на восстановление иннервации в ишемизированной ткани.c) determining the result of the introduction of the plasmid construct on the effectiveness of the recovery of the peripheral nerve after injury, as well as on the restoration of innervation in ischemic tissue.

При осуществлении изобретения впервые была сконструирована (пример 1) рекомбинантная плазмида с SEQ ID NO: 1, приведенной в перечне последовательностей, содержащая оптимизированную последовательность кДНК BDNF (выделена серым затенением и полужирным шрифтом на SEQ ID NO: 1) и консенсусную последовательность Козак (выделена двойным подчеркиванием на SEQ ID NO: 1). При этом наилучшие результаты были получены при использовании в качестве вектора плазмиды pVax1 (#V260-20, Invitrogen), однако для клонирования могут быть использованы и другие плазмидные векторы, для которых характерна высококопийная репликация в Е.coli и высокий уровень экспрессии клонируемого гена в клетках млекопитающих.When carrying out the invention, a recombinant plasmid with SEQ ID NO: 1, shown in the sequence listing, containing the optimized BDNF cDNA sequence (highlighted in gray shading and bold on SEQ ID NO: 1) and the Kozak consensus sequence (double highlighted) was first constructed (Example 1) underlined on SEQ ID NO: 1). In this case, the best results were obtained when pVax1 (# V260-20, Invitrogen) was used as the plasmid vector, however, other plasmid vectors, which are characterized by high copy replication in E. coli and a high level of expression of the cloned gene in cells, can be used for cloning mammals.

В результате исследования экспрессии полученных плазмидных конструкций, было показано, что через 48 часов после трансфекции клеток наблюдается секреция соответствующих белков в среду культивирования. Благодаря включению оптимизированных нуклеотидных последовательностей применение плазмидных конструкций для экспрессии BDNF человека позволило достичь повышения продукции целевых белков примерно в 3 раза (пример 2).As a result of the study of the expression of the obtained plasmid constructs, it was shown that 48 hours after transfection of cells, secretion of the corresponding proteins into the culture medium is observed. Due to the inclusion of optimized nucleotide sequences, the use of plasmid constructs for the expression of human BDNF allowed us to achieve an increase in the production of target proteins by about 3 times (example 2).

На модели травматического повреждения периферического нерва мыши было получено экспериментальное подтверждение того, что сконструированная плазмидная конструкция после введения в мышцу, иннервируемую поврежденным нервом, существенно ускоряет восстановление структуры и проводимости поврежденного нерва. При этом было установлено, что введение плазмиды pVax1-K-BDNF обеспечивает дополнительное 1,5-2 кратное (в сравнении с использованием плазмиды, не содержащей консенсусной последовательности Козак, pVax1-BDNF) ускорение восстановления структуры и проводимости нерва, а следовательно, и иннервации соответствующих скелетных мышц (пример 3).On the model of traumatic damage to the peripheral nerve of the mouse, experimental confirmation was obtained that the constructed plasmid construct, after introduction into the muscle innervated by the damaged nerve, significantly accelerates the restoration of the structure and conductivity of the damaged nerve. It was found that the introduction of the plasmid pVax1-K-BDNF provides an additional 1.5-2 fold (in comparison with the use of a plasmid that does not contain the Kozak consensus sequence, pVax1-BDNF) acceleration of the restoration of the structure and conductivity of the nerve, and hence the innervation corresponding skeletal muscles (example 3).

Впервые на модели ишемии задней конечности мыши была применена созданная плазмидная конструкция. Введение плазмидной конструкции pVax1-K-BDNF позволило достичь увеличения числа и суммарной длины аксонов в ишемизированной мышце в 2-3 раза, в отличие от разработанной ранее плазмиды pVax1-BDNF (пример 4).For the first time, the created plasmid construct was used on the mouse hind limb ischemia model. The introduction of the plasmid construct pVax1-K-BDNF allowed us to achieve an increase in the number and total length of axons in the ischemic muscle by 2-3 times, in contrast to the previously developed plasmid pVax1-BDNF (example 4).

Таким образом, в результате создания настоящего изобретения разработан способ стимулирования восстановления иннервации мышцы после травмы или ишемии, сущность которого состоит в том, что в мышцу, иннервируемую поврежденным нервом, вводят терапевтически эффективное количество плазмидного вектора, содержащего оптимизированную нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующую BDNF.Thus, as a result of the creation of the present invention, a method for stimulating recovery of muscle innervation after trauma or ischemia is developed, the essence of which is that a therapeutically effective amount of a plasmid vector containing the optimized nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is introduced into a muscle innervated by a damaged nerve. encoding BDNF.

При этом основным техническим результатом является повышение эффективности способа: при использовании, по существу, одной и той же модели травматизации перферического нерва значения основных показателей иннервации ткани увеличились в сравнении с прототипом примерно вдвое. Дополнительными результатами данного способа следует считать возможность применения разработанной конструкции для стимуляции иннервации ишемизированных тканей и отказ от применения небезопасных аденовирусных конструкций.In this case, the main technical result is to increase the efficiency of the method: when using essentially the same model of trauma to the peripheral nerve, the values of the main indicators of tissue innervation increased approximately twofold in comparison with the prototype. Additional results of this method should be considered the possibility of using the developed design to stimulate the innervation of ischemic tissues and the rejection of the use of unsafe adenoviral structures.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

Фиг.1. Анализ эффективности продукции мозгового нейротрофного фактора, клетками траснфицированными плазмидными конструкциями.Figure 1. Analysis of the production efficiency of brain neurotrophic factor by cells transfected with plasmid constructs.

Фиг.2. Восстановление функции мышц-разгибателей стопы. По оси ординат - значение PFI, усл.ед.; по оси абсцисс - время после повреждения, дни.Figure 2. Restoration of the function of the extensor muscles of the foot. On the y-axis - the value of PFI, conventional units; abscissa - time after damage, days.

Фиг.3. Восстановление количества аксонов в поврежденном нерве. А. - нерв мыши, которой вводили плазмиду, не содержащую трансген. Б. - нерв мыши, которой вводили плазмидную конструкцию pVax1-BDNF. В. - нерв мыши, которой вводили плазмидную конструкцию pVax1-K-BDNF. Количество аксонов оценивали с помощью окрашивания кроличьими антителами к цитоскелету аксонов, белку NF200. Г. - результаты морфометрического анализа количества аксонов на срезе поврежденного нерва. По оси ординат - количество аксонов, шт.Figure 3. Restoring the number of axons in a damaged nerve. A. - the nerve of the mouse, which was introduced plasmid that does not contain a transgene. B. - the nerve of the mouse, which was injected with the plasmid construct pVax1-BDNF. B. - the nerve of the mouse, which was injected with the plasmid construct pVax1-K-BDNF. The number of axons was evaluated by staining with rabbit antibodies to the axon cytoskeleton, protein NF200. G. - the results of a morphometric analysis of the number of axons on a cut of a damaged nerve. The ordinate axis is the number of axons, pcs.

Фиг.4. Восстановление проводимости нерва. А. - восстановление латентного периода СПДН, по оси ординат - длительность латентного периода, мс. Б. - восстановление амплитуды СПДН, по оси ординат - амплитуда СПДН, мВ.Figure 4. Restoring nerve conduction. A. - restoration of the latent period of SPDN, along the ordinate axis - the duration of the latent period, ms. B. - restoration of the SPDN amplitude, along the ordinate axis - the SPDN amplitude, mV.

Фиг.5. Восстановление количества нервных волокон в ишемизированной ткани. А. - ишемизированная мышца мыши, которой вводили плазмиду, не содержащую трансген. Б. - ишемизированная мышца мыши, которой вводили плазмидную конструкцию pVax1-BDNF. В. - ишемизированная мышца мыши, которой вводили плазмидную конструкцию pVax1-K-BDNF. Количество нервных волокон оценивали с помощью окрашивания кроличьими антителами к цитоскелету аксонов, белку NF200. Г. - восстановление количества нервных волокон на поперечных срезах ишемизированной мышцы, по оси ординат - количество нервных волокон, шт.; по оси абсцисс - время после повреждения, дни. Д. - восстановление суммарной длины нервных волокон на продольных срезах ишемизированной мышцы, по оси ординат - суммарная длина нервных, мкм; по оси абсцисс - время после повреждения, дни.Figure 5. Restoring the number of nerve fibers in ischemic tissue. A. - ischemic muscle of the mouse, which was introduced plasmid that does not contain a transgene. B. - ischemic muscle of the mouse, which was injected with the plasmid construct pVax1-BDNF. B. - ischemic muscle of a mouse injected with the plasmid construct pVax1-K-BDNF. The number of nerve fibers was evaluated by staining with rabbit antibodies to the axon cytoskeleton, protein NF200. G. - restoration of the number of nerve fibers on transverse sections of the ischemic muscle, along the ordinate axis - the number of nerve fibers, pcs .; abscissa - time after damage, days. D. - restoration of the total length of nerve fibers in longitudinal sections of the ischemic muscle, along the ordinate axis - the total length of nerve, μm; abscissa - time after damage, days.

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

При осуществлении изобретения, помимо методов, подробно раскрытых в нижеследующих примерах, были использованы стандартные технологии генной инженерии, культивирования клеток млекопитающих и описанные ранее методы анализа регенерации нерва после травмы.In the implementation of the invention, in addition to the methods described in detail in the following examples, standard technologies of genetic engineering, culturing mammalian cells and the previously described methods for analyzing nerve regeneration after injury were used.

Пример 1. Создание плазмидной конструкции, кодирующей BDNF человекаExample 1. Creating a plasmid construct encoding a human BDNF

Как описано ранее, дизайн оптимизированной плазмидной конструкции, кодирующей кДНК BDNF человека, производили следующим образом. Используя частоты встречаемости кодонов, приведенные на веб-сайте http://del.mediaglyphs.org/mg/bf/nucs_aa.html, среди триплетов нуклеотидов, кодирующих аминокислоты белковой последовательности природной кДНК BDNF, выявляли такие, которые встречаются в генах человека наиболее редко. Выявленные редкие триплеты, а также соседние с ними триплеты меняли на триплеты, кодирующие те же аминокислоты, но при этом встречающиеся в генах человека наиболее часто.As previously described, an optimized plasmid construct encoding human BDNF cDNA was designed as follows. Using the codon frequencies found on the website http://del.mediaglyphs.org/mg/bf/nucs_aa.html, among the triplets of nucleotides encoding the amino acids of the protein sequence of the natural BDNF cDNA, those that are found most rarely in human genes . Identified rare triplets, as well as neighboring triplets, were exchanged for triplets encoding the same amino acids, but which are most often found in human genes.

Для того чтобы повысить эффективность трансляции мРНК BDNF, в кДНК встраивали консенсусную последовательность Козак [6]. А именно, внесли 2 триплета, до старт-кодона 3'-GCCACC-5'. Для получения «сильной» последовательности Козак также необходимо было внести G непосредственно после старт-кодона. Для этого в последовательность был введен триплет GTG, кодирующий аминокислоту валин. Данный подход позволил достичь внедрения «сильной» последовательности Козак в кДНК BDNF, избежав при этом сдвига рамки считывания. Полученная последовательность нуклеотидов, кодирующая BDNF, представлена на фиг.1. Эту последовательность получали с помощью прямого химического синтеза фрагментов и последующей их сборки. Идентичность полученной последовательности ожидаемой определяли с помощью секвенирования.In order to increase the translation efficiency of BDNF mRNA, the Kozak consensus sequence was inserted into cDNA [6]. Namely, 2 triplets were introduced, up to the start codon 3'-GCCACC-5 '. To obtain a “strong” Kozak sequence, it was also necessary to introduce G immediately after the start codon. For this, a GTG triplet encoding the amino acid valine was introduced into the sequence. This approach made it possible to introduce the “strong” Kozak sequence into the BDNF cDNA, while avoiding the shift of the reading frame. The obtained nucleotide sequence encoding BDNF is presented in figure 1. This sequence was obtained using direct chemical synthesis of the fragments and their subsequent assembly. The identity of the expected sequence was determined by sequencing.

Для клонирования оптимизированной кДНК в экспрессионный вектор к ее 5`- и 3`-концам добавляли последовательности, распознаваемые эндонуклеазами EcoRI и EcoRV (5`-GAATTC-3` и 5`-GATATC-3` соответственно). В данном примере в качестве вектора использовали плазмиду pVax1 (#V260-20, Invitrogen), однако, для клонирования могли быть использованы и другие плазмидные векторы, для которых характерна высококопийная репликация в Е.coli и высокий уровень экспрессии клонируемого гена в клетках млекопитающих.To clone the optimized cDNA into the expression vector, sequences recognized by the EcoRI and EcoRV endonucleases (5`-GAATTC-3` and 5`-GATATC-3`, respectively) were added to its expression vector at its 5` and 3` ends. In this example, plasmid pVax1 (# V260-20, Invitrogen) was used as a vector, however, other plasmid vectors, which are characterized by high copy replication in E. coli and a high level of expression of the cloned gene in mammalian cells, could be used for cloning.

Пример 2.Example 2

Анализ эффективности полученной плазмидной конструкцииAnalysis of the effectiveness of the obtained plasmid construct

Эффективность экспрессии разработанной плазмиды определяли по продукции целевого белка клетками линии HEK293, трансфицированными данной плазмидой. Клетки HEK293, высеянные в лунки 24-луночной плашки (50000 клеток на лунку) в среде DMEM, содержащей 2% эмбриональной телячьей сыворотки, трансфицировали плазмидами pVax1, pVax1-BDNF или pVax1-K-BDNF. Трансфекцию проводили с использованием по 1 мкг одной из плазмидных ДНК и по 1 мкл реагента Липофектамин 2000 (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. Через 24 ч после трансфекции культуральную среду заменяли на свежую. Концентрацию BDNF в среде анализировали через следующие 48 часов культивирования.The expression efficiency of the developed plasmid was determined by the production of the target protein by HEK293 cells transfected with this plasmid. HEK293 cells seeded in wells of a 24-well plate (50,000 cells per well) in DMEM medium containing 2% fetal calf serum were transfected with plasmids pVax1, pVax1-BDNF or pVax1-K-BDNF. Transfection was performed using 1 μg of one of the plasmid DNAs and 1 μl of reagent Lipofectamine 2000 (Invitrogen) in accordance with the manufacturer's protocol. 24 hours after transfection, the culture medium was replaced with fresh. The concentration of BDNF in the medium was analyzed after the next 48 hours of cultivation.

Концентрацию BDNF в культуральной среде измеряли при помощи набора «ChemikineTM BDNF ELISA Kit» (Millipore, США) в соответствии с протоколом производителя. Согласно этим измерениям, продукция BDNF в культуральную среду клеток, трансфицированных плазмидой, не содержащей последовательности Козак, не более 2,5 нг/мл. При использовании плазмиды, содержащей оптимизированную кДНК, и последовательность Козак, концентрация BDNF в культуральной среде составляла около 5 нг/мл. При использовании плазмиды с оптимизированной кДНК и последовательностью Козак, выход целевого белка увеличивается примерно в 2 раза по сравнению с использованием ранее разработанной плазмиды, что свидетельствует о высокой эффективности плазмиды pVax1-K-BDNF, в которую включена консенсусная последовательность Козак (фиг.2).The concentration of BDNF in the culture medium was measured using a ChemikineTM BDNF ELISA Kit (Millipore, USA) in accordance with the manufacturer's protocol. According to these measurements, the production of BDNF into the culture medium of cells transfected with a Kozak-free plasmid is not more than 2.5 ng / ml. Using a plasmid containing optimized cDNA and a Kozak sequence, the concentration of BDNF in the culture medium was about 5 ng / ml. When using a plasmid with optimized cDNA and a Kozak sequence, the yield of the target protein is approximately 2 times higher than using the previously developed plasmid, which indicates the high efficiency of the plasmid pVax1-K-BDNF, which includes the Kozak consensus sequence (Fig. 2).

Пример 3.Example 3

Влияние плазмиды pVax1-K-BDNF на восстановление периферического нерва и иннервации мышцы после травмыThe effect of plasmid pVax1-K-BDNF on the restoration of the peripheral nerve and innervation of the muscle after injury

Для исследования процесса регенерации перферического нерва использовали модель повреждения общего малоберцового нерва, как описано ранее [4, 5]. Сразу после повреждения нерва в переднюю большеберцовую мышцу вводили от 60 до 200 мкг плазмидной ДНК pVax1, pVax1-BDNF или pVax1-K-BDNF. Данная терапевтически эффективная концентрация была подобрана по результатам предварительных экспериментов.To study the process of regeneration of the peripheral nerve, a model of damage to the common fibular nerve was used, as described previously [4, 5]. Immediately after nerve damage, 60 to 200 μg of plasmid DNA pVax1, pVax1-BDNF or pVax1-K-BDNF was introduced into the anterior tibial muscle. This therapeutically effective concentration was selected according to the results of preliminary experiments.

Восстановление иннервации мышц оценивали через 1, 2, 4 и 7 суток по восстановлению функции мышц-разгибателей пальцев стопы. Восстановление функции мышц-разгибателей стопы анализировали с помощью измерения функционального индекса малоберцового нерва (PFI)Э, как описано ранее [5]. Было обнаружено, что уже через 2 суток у животных, которым была инъецирована pVax1-K-BDNF, значение PFI было примерно в 1,6 раза выше, чем в контроле, и в 1,4 раза выше, чем у животных, которым была инъецирована плазмида pVax1-BDNF (фиг.3).Recovery of muscle innervation was evaluated after 1, 2, 4, and 7 days by restoring the function of the extensor muscles of the toes of the toes. Restoration of the function of the extensor muscles of the foot was analyzed by measuring the functional index of the peroneal nerve (PFI) E, as described previously [5]. It was found that after 2 days in animals that were injected with pVax1-K-BDNF, the PFI value was about 1.6 times higher than in the control, and 1.4 times higher than in animals that were injected plasmid pVax1-BDNF (figure 3).

Восстановление структурной целостности нерва оценивали с помощью иммуннофлуоресцентного окрашивания замороженных срезов поврежденных нервов через 4 суток после повреждения как описано ранее [4, 5]. Уже через 4 дня после повреждения у животных, которым была инъецирована pVax1-K-BDNF наблюдали примерно в 2,5 раза больше аксонов, содержащих NF200, по сравнению с нервами животных, которым вводили плазмиду pVax1, не содержащую трансгена (p<0,05; n=18) и примерно в 1,3 раза больше по сравнению с животными, которым была инъецирована плазмида pVax1-BDNF. Эти данные свидетельствуют о более быстром росте и лучшей выживаемости аксонов в поврежденных нервах животных, которым была инъецирована pVax1-K-BDNF.The restoration of the structural integrity of the nerve was evaluated using immunofluorescence staining of frozen sections of damaged nerves 4 days after the damage as described previously [4, 5]. Approximately 2.5 times more axons containing NF200 were observed in animals injected with pVax1-K-BDNF already 4 days after injury compared with nerves of animals that were injected with plasmid pVax1 without transgene (p <0.05 ; n = 18) and about 1.3 times more compared with animals that were injected with the plasmid pVax1-BDNF. These data indicate faster growth and better axon survival in damaged nerves of animals injected with pVax1-K-BDNF.

Восстановление функции чувствительных нервных волокон оценивали с помощью вызванных потенциалов действия, регистрируемых с поверхностной веточки общего малоберцового нерва, как описано ранее [4, 5]. Полученные данные анализировали следующим образом. Регистрируемый СПДН содержит два параметра, позволяющие судить о степени восстановления нерва: латентный период и амплитуду.Recovery of function of sensitive nerve fibers was evaluated using evoked action potentials recorded from the surface branch of the common peroneal nerve, as described previously [4, 5]. The data obtained were analyzed as follows. The registered SPDN contains two parameters that make it possible to judge the degree of nerve recovery: latent period and amplitude.

Латентный период - промежуток времени от момента стимуляции нерва до момента регистрации вызванного потенциала действия, измеряется в миллисекундах (мс). Исходя из определения понятно, что латентный период характеризует скорость проведения возбуждения по нерву, причем величина латентного периода обратно пропорциональна скорости проведения возбуждения по нерву. Таким образом, укорочение латентного периода свидетельствует о большей скорости проведения вызванных потенциалов, что, в свою очередь, говорит о степени миелинизации для миелинизированных нервных волокон или об увеличении толщины безмиелиновых нервных волокон.The latent period is the time interval from the moment of nerve stimulation to the moment of registration of the evoked action potential, measured in milliseconds (ms). Based on the definition, it is clear that the latent period characterizes the rate of stimulation of the nerve, and the magnitude of the latent period is inversely proportional to the speed of the excitation of the nerve. Thus, the shortening of the latent period indicates a higher rate of evoked potentials, which, in turn, indicates the degree of myelination for myelinated nerve fibers or an increase in the thickness of non-myelinated nerve fibers.

Амплитуда характеризует количество нервных волокон, участвующих в проведении возбуждения; измеряется в милливольтах (мВ). Чем больше амплитуда - тем больше количество восстановившихся нервных волокон.The amplitude characterizes the number of nerve fibers involved in conducting the excitation; measured in millivolts (mV). The larger the amplitude, the greater the number of restored nerve fibers.

При помощи регистрации вызванных потенциалов действия нерва через 7 суток после повреждения удалось показать, что инъекция генетической конструкции pVax1-K-BDNF стимулирует восстановление нерва. Инъекция плазмиды вызывала уменьшение латентного периода примерно в 1,6 раза и увеличение амплитуды СПДН примерно в 3 раза по сравнению с соответствующими значениями СПДН мышей, получивших плазмиду pVax1, не содержащую трансгена (фиг.5).By recording evoked nerve action potentials 7 days after the damage, it was possible to show that injection of the pVax1-K-BDNF genetic construct stimulates nerve repair. Injection of the plasmid caused a decrease in the latent period of about 1.6 times and an increase in the SPDN amplitude by about 3 times compared with the corresponding values of the SPDN of mice that received plasmid pVax1 without transgene (Fig. 5).

При этом инъекция плазмиды pVax1-K-BDNF приводила к более выраженному восстановлению проводимости нерва по сравнению с разработанной ранее плазмидой pVax1-BDNF. Так, у животных, получивших pVax1-K-BDNF, укорочение латентного периода было примерно в 1,5 раза, а увеличение амплитуды СПДН примерно в 1,3 раза больше по сравнению с соответствующими значениями для мышей, которым была инъецирована pVax1-BDNF. Эти данные свидетельствуют о том, что инъекция pVax1-K-BDNF стимулирует восстановление проводимости нервных волокон. Moreover, injection of plasmid pVax1-K-BDNF led to a more pronounced restoration of nerve conduction compared to the previously developed plasmid pVax1-BDNF. So, in animals treated with pVax1-K-BDNF, the latent period was shortened by about 1.5 times, and the increase in the SPDN amplitude was about 1.3 times larger than the corresponding values for mice injected with pVax1-BDNF. These data indicate that injection of pVax1-K-BDNF stimulates the restoration of nerve fiber conduction.

Пример 4.Example 4

Влияние плазмиды pVax1-K-BDNF на восстановление иннервации мышцы после ишемииThe effect of plasmid pVax1-K-BDNF on the restoration of muscle innervation after ischemia

Для изучения процесса восстановления иннервации в ишемизированных мышцах задней конечности существует ряд методов, в основе которых лежит пережатие или иссечение бедренной артерии мыши. При этом использовали собственную модификацию известных моделей ишемии задней конечности у грызунов (Takeshita, 1994; Tsurumi, 1996). В работе использовали самцов мышей линии C57H1 весом 30 г. Все экспериментальные процедуры на животных соответствовали «Руководству по контролю над экспериментами с животными», одобренному местным этическим комитетом. Операцию проводили под анестезией ингаляцией 2,5% авертина. Производился продольный разрез кожи левого бедра мыши от области паховой связки до коленной области. Артерия выделялась целиком от начала бифуркации брюшной аорты до разделения на a.poplitae и a.saphenous и ее ветви, включая a.epigastrica inferior, a.femoralis profunda, a.circumflexus lateralis, перевязывались и отсекались. Также перевязывались и отсекались а.poplitae и a.saphenous. Бедренная артерия удалялась на всем протяжении от паховой связки до бифуркации на a.poplitae и a.saphenous.To study the process of restoration of innervation in ischemic muscles of the hind limb, there are a number of methods based on clamping or excision of the femoral artery of the mouse. In this case, they used their own modification of the known models of hind limb ischemia in rodents (Takeshita, 1994; Tsurumi, 1996). Male C57H1 mice weighing 30 g were used in the work. All experimental animal procedures were in accordance with the Guidelines for the Control of Animal Experiments, approved by the local ethics committee. The operation was performed under anesthesia by inhalation of 2.5% avertin. A longitudinal incision was made of the skin of the left thigh of the mouse from the inguinal ligament to the knee region. The artery was isolated completely from the onset of bifurcation of the abdominal aorta to the division into a.poplitae and a.saphenous and its branches, including a.epigastrica inferior, a.femoralis profunda, a.circumflexus lateralis, ligated and cut off. A. poplitae and a.saphenous were also bandaged and cut off. The femoral artery was removed all the way from the inguinal ligament to the bifurcation on a.poplitae and a.saphenous.

Проведенные эксперименты показали, что такой способ повреждения является оптимальным для создания ишемии задней конечности мыши и позволяет достичь снижения кровотока до уровня менее 10% от контрольного. Другие способы индукции ишемии задней конечности, например, с помощью перевязки бедренной артерии мыши, оказались менее эффективными, поскольку приводили лишь к кратковременному нарушению кровотока в конечности и быстрому спонтанному восстановлению ее функциональной активности, что не позволило бы оценить эффект от введения генного лекарственного средства.The experiments showed that this method of damage is optimal for creating ischemia of the hind limb of the mouse and can achieve a decrease in blood flow to less than 10% of the control. Other methods of inducing ischemia of the hind limb, for example, by ligation of the femoral artery of the mouse, turned out to be less effective, since they led only to a short-term disturbance of blood flow in the limb and a quick spontaneous restoration of its functional activity, which would not allow to evaluate the effect of the introduction of the gene drug.

Исследования терапевтической эффективности Иннервина для восстановления иннервации ишемизированной мышцы проводили в течение 11 дней после индукции ишемии задней конечности. Для этого растворы плазмидной конструкции, содержащей кДНК BDNF либо контрольной плазмиды, не несущей кДНК нейротрофного фактора, в стерильном фосфатно-солевом буфере вводили на следующий день после операции путем чрескожных инъекций в мышцы конечности - 1 инъекция по 60 мкл, всего 200 мкг ДИК на мышь. Через 4, 7 и 11 дней у летально анестезированных животных изолировали m.tibialis anterior и замораживали в среде для замораживания Tissue-Tek (Sakura Finetek) с помощью плавного погружения в жидкий азот. Из замороженных мышц готовили поперечные и продольные криосрезы толщиной 6 мкм.Studies of the therapeutic effectiveness of Innervine to restore the innervation of the ischemic muscle were performed for 11 days after the induction of hind limb ischemia. For this, solutions of a plasmid construct containing BDNF cDNA or a control plasmid that does not carry neurotrophic factor cDNA were injected in sterile phosphate-buffered saline the day after surgery by percutaneous injection into limb muscles - 1 injection of 60 μl, total 200 μg of DIC per mouse . After 4, 7, and 11 days, m.tibialis anterior was isolated from lethally anesthetized animals and frozen in Tissue-Tek (Sakura Finetek) freezing medium by smooth immersion in liquid nitrogen. Transverse and longitudinal cryosections 6 μm thick were prepared from frozen muscles.

Критериями оценки эффективности Иннервина для восстановления иннервации порежденных мышц являются количество и суммарная длина нервных волокон, оцениваемые с помощью иммуннофлуоресцентного окрашивания криосрезов мышц с использованием специфичных антител к белку цитоскелета зрелых аксонов NF200. Окрашивание криосрезов проводили следующим образом: срезы после высыхания на предметном стекле фиксировали 4% формалином на фосфатном буфере в течение 5 минут, затем отмывали от фиксатора, помещали в 0,05 M раствор ацетата аммония на фосфатном буфере для блокирования аутофлуоресценции срезов на 10 минут и в 1% раствор бычьего сывороточного альбумина на фосфатном буфере для блокирования неспецифического связывания антител. Первичные и вторичные антитела разводили на фосфатно-солевом буфере, содержащем детергент 0,1% Triton X-100 и 5% нормальной козьей сыворотки. На срезы наносили первичные кроличьи антитела к белку цитоскелета зрелых аксонов NF200 (фирмы Abcam, разведение 1:80). Часть срезов окрашивали кроличьими неспецифическими иммуноглобулинами IgG в качестве отрицательного контроля (фирмы Thermo scientific). Срезы с нанесенными на них первичными антителами инкубировали во влажной камере при температуре 4°C в течение ночи. Далее срезы отмывали в фосфатно-солевом буфере (pH 7,0) 3 раза по 5 мин и наносили на них вторичные антитела: антитела козы против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с флуорохромом AlexaFluor 488 (фирмы Invitrogen). Срезы инкубировали в темном месте во влажной камере в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем срезы, оберегая от света, отмывали в фосфатно-солевом буфере (pH 7,0). Далее срезы, оберегая от света, инкубировали в течение 2 мин, а затем снова отмывали в фосфатно-солевом буфере (pH 7,0) 3 раза по 5 мин. Со срезов стряхивали избыточную жидкость и заключали в специальную не флюоресцирующую среду Mounting Media (фирмы Vector).The criteria for assessing the effectiveness of Innervin for restoring the innervation of damaged muscles are the number and total length of nerve fibers, estimated using immunofluorescence staining of cryosections of muscles using specific antibodies to the cytoskeleton protein of mature axons NF200. Cryosections were stained as follows: sections after drying on a glass slide were fixed with 4% formalin on phosphate buffer for 5 minutes, then washed from the fixative, placed in a 0.05 M solution of ammonium acetate on phosphate buffer to block autofluorescence of the sections for 10 minutes and in 1% bovine serum albumin solution in phosphate buffer to block non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies were diluted in phosphate-buffered saline containing 0.1% Triton X-100 detergent and 5% normal goat serum. Primary rabbit antibodies to the mature axon cytoskeleton protein NF200 (Abcam, dilution 1:80) were applied to the sections. Some sections were stained with rabbit non-specific IgG immunoglobulins as a negative control (Thermo scientific). Sections coated with primary antibodies were incubated in a humid chamber at 4 ° C overnight. Next, the sections were washed in phosphate-buffered saline (pH 7.0) 3 times for 5 min and secondary antibodies were applied onto them: goat antibodies against rabbit immunoglobulins conjugated with AlexaFluor 488 fluorochrome (Invitrogen). Sections were incubated in a dark place in a humid chamber for 1 hour at room temperature. Then the sections, protected from light, were washed in phosphate-buffered saline (pH 7.0). Next, the sections, protected from light, were incubated for 2 minutes, and then again washed in phosphate-buffered saline (pH 7.0) 3 times for 5 minutes. Excess fluid was shaken off from the sections and enclosed in a special, non-fluorescent Mounting Media (Vector).

Съемку полученных срезов осуществляли с помощью флуоресцентного микроскопа Leica6000, оборудованного CCD камерой (Leica Microsystems). Возбуждение красителя AlexaFluor 488 осущесствляли при длине волны 488 нм, а регистрацию вызванного возбуждения - при длине волны 546 нм. Количество окрашенных аксонов и их длину на полученных снимках оценивали при помощи программы Metamorph 7.1.The obtained sections were recorded using a Leica6000 fluorescence microscope equipped with a CCD camera (Leica Microsystems). The excitation of AlexaFluor 488 dye was carried out at a wavelength of 488 nm, and the registration of induced excitation was carried out at a wavelength of 546 nm. The number of stained axons and their length in the obtained images was evaluated using the Metamorph 7.1 program.

При анализе поперечных срезов ишемизированных мышц, окрашенных антителами против белка цитоскелета зрелых аксонов NF200, было обнаружено, что количество нервных волокон в мышцах животных, которым было введено генное лекарственное средство Иннервин было больше по сравнению с мышами, получившими контрольную плазмиду уже через 7 дней после индукции ишемии и введения плазмид, однако выявленное различие не было статистически достоверным. Через 11 дней после введения плазмид количество нервных волокон в мышцах животных, которым было введено генное лекарственное средство Иннервин было примерно в 4 раза больше по сравнению с мышами, получившими контрольную плазмиду (фиг.6).When analyzing cross-sections of ischemic muscles stained with antibodies against the cytoskeleton protein of mature axons NF200, it was found that the number of nerve fibers in the muscles of animals that were injected with the gene drug Innerwin was higher compared to mice that received the control plasmid 7 days after induction ischemia and introduction of plasmids, however, the detected difference was not statistically significant. 11 days after the introduction of plasmids, the number of nerve fibers in the muscles of animals that were injected with the gene drug Innerwin was approximately 4 times higher compared with mice that received the control plasmid (Fig.6).

При анализе продольных срезов мышц, окрашенных антителами против белка цитоскелета зрелых аксонов NF200, было обнаружено, что суммарная длина нервных волокон в мышцах животных, которым было введено генное лекарственное средство Иннервин, была больше уже через 4 дня после индукции ишемии и введения плазмид. Различия сохранялись и через 7 дней наблюдений, а через 11 дней суммарная длина нервных волокон у животных, которым было введено генное лекарственное средство Иннервин, была примерно в 3 раза больше по сравнению с мышами, получившими контрольную плазмиду.When analyzing longitudinal sections of muscles stained with antibodies against the cytoskeleton protein of mature axons NF200, it was found that the total length of nerve fibers in the muscles of animals that were injected with the Innervin gene drug was longer already 4 days after the induction of ischemia and the introduction of plasmids. Differences persisted after 7 days of observation, and after 11 days, the total length of nerve fibers in animals that were injected with the Innerwin gene drug was approximately 3 times greater than in mice that received the control plasmid.

ЗаключениеConclusion

В результате проведенных исследований, впервые было показано, что инъекция плазмидной конструкци pVax1-K-BDNF в мышцу, иннервируемую повреждаемым нервом, с последующей электропорацией стимулирует регенерацию:As a result of the studies, it was first shown that the injection of the plasmid construct pVax1-K-BDNF into the muscle innervated by the damaged nerve, followed by electroporation, stimulates the regeneration of:

примерно в 1,6 раза в сравнении с контролем и в 1,4 раза в сравнении с разработанной ранее плазмидой ускоряется восстановление иннервации (сравни кривые на фиг.3), которое сопровождается увеличением числа аксонов в поврежденном нерве в 2,5 и 1,3 раза соответственно, (сравни столбцы на фиг.4), уменьшением латентного периода примерно в 1,6 и 1,5 раза соответственно, а также возрастанием почти в три и 1,3 раза соответственно, амплитуды суммарного потенциала действия нерва (сравни столбцы на фиг.5).approximately 1.6 times in comparison with the control and 1.4 times in comparison with the previously developed plasmid, the restoration of innervation is accelerated (compare the curves in Fig. 3), which is accompanied by an increase in the number of axons in the damaged nerve by 2.5 and 1.3 times, respectively (compare the columns in FIG. 4), a decrease in the latent period of about 1.6 and 1.5 times, respectively, as well as an increase of almost three and 1.3 times, respectively, of the amplitude of the total potential action of the nerve (compare the columns in FIG. .5).

Установлено, что введение плазмиды pVax1-K-BDNF в ишемизированную мышцу с последующей электропорацией стимулирует восстановление иннервации, что выражается в увеличении числа аксонов в 7 раз, а суммарной длины нервных волокон более чем в 3 раза (сравни кривые на фиг.6).It was found that the introduction of the plasmid pVax1-K-BDNF into the ischemic muscle with subsequent electroporation stimulates the restoration of innervation, which is manifested in an increase in the number of axons by 7 times and the total length of nerve fibers by more than 3 times (compare the curves in Fig.6).

На основании полученных данных был сделан вывод о том, что стимуляция восстановления структуры и функции нерва после травмы, а также иннервации ишемизированной ткани может быть достигнута путем введения плазмидной конструкции, содержащей оптимизированную нуклеотидную последовательность BDNF человека и консенсусную последовательность Козак. Высокая продукция целевого белка, достигнутая в результате проведенной модификации, обеспечила не только возможность использования этой плазмиды для стимуляции восстановления нервов после травмы, но и позволила стимулировать восстановление иннервации ишемизированной мышцы.Based on the obtained data, it was concluded that the stimulation of restoration of the nerve structure and function after injury, as well as the innervation of ischemic tissue, can be achieved by introducing a plasmid construct containing the optimized human BDNF nucleotide sequence and Kozak consensus sequence. The high production of the target protein achieved as a result of the modification provided not only the possibility of using this plasmid to stimulate the restoration of nerves after an injury, but also allowed to stimulate the restoration of the innervation of the ischemic muscle.

Список литературыBibliography

1. Одинак М.М., Живолупов С.А. Заболевания и травмы периферической нервной системы. Санкт-Петербург, СпецЛит., 2009.1. Odinak M.M., Zhivolupov S.A. Diseases and injuries of the peripheral nervous system. St. Petersburg, SpetsLit., 2009.

2. Kwon BK, Liu J, Lam С, Plunet W, Oschipok LW, Hauswirth W, Di Polo A, Blesch A, Tetzlaff W. Brain-derived neurotrophic factor gene transfer with adeno-associated viral and lentiviral vectors prevents rubrospinal neuronal atrophy and stimulates regeneration-associated gene expression after acute cervical spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 2007; 32(11): 1164-73.2. Kwon BK, Liu J, Lam C, Plunet W, Oschipok LW, Hauswirth W, Di Polo A, Blesch A, Tetzlaff W. Brain-derived neurotrophic factor gene transfer with adeno-associated viral and lentiviral vectors prevents rubrospinal neuronal atrophy and stimulates regeneration-associated gene expression after acute cervical spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 2007; 32 (11): 1164-73.

3. Alrashdan MS, Sung MA, Kim Kwon Y, Chung HJ, Kim SJ, Lee JH. Effects of combining electrical stimulation with BDNF gene transfer on the regeneration of crushed rat sciatic nerve. Acta Neurochir (Wien), 2011 (on line 09.06.2011)3. Alrashdan MS, Sung MA, Kim Kwon Y, Chung HJ, Kim SJ, Lee JH. Effects of combining electrical stimulation with BDNF gene transfer on the regeneration of crushed rat sciatic nerve. Acta Neurochir (Wien), 2011 (on line 06/09/2011)

4. Заявка на получение патента «Способ стимулирования восстановления периферической иннервации тканей с помощью векторных конструкций», Заявка 2011143050, Дата подачи заявки 25 октября 2011, Заявитель: Государственное учебно-научное учреждение Факультет фундаментальной медицины Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова4. Patent application "Method of stimulating the restoration of peripheral tissue innervation using vector designs", Application 2011143050, Submission date October 25, 2011, Applicant: State Educational and Scientific Institution Faculty of Fundamental Medicine, Moscow State University named after M.V. Lomonosov

5. Lopatina Т, Kalinina N, Karagyaur M, Stambolsky D, Rubina K, Revischin A, Pavlova G, Parfyonova Y, Tkachuk V. Adipose-derived stem cells stimulate regeneration of peripheral nerves: BDNF secreted by these cells promotes nerve healing and axon growth de novo. PLoS One. 2011; 6(3): e17899.5. Lopatina T, Kalinina N, Karagyaur M, Stambolsky D, Rubina K, Revischin A, Pavlova G, Parfyonova Y, Tkachuk V. Adipose-derived stem cells stimulate regeneration of peripheral nerves: BDNF secreted by these cells promotes nerve healing and axon growth de novo. Plos one. 2011; 6 (3): e17899.

6. Kozak M (October 1987). "An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs". Nucleic Acids Res. 15 (20): 8125-8148.6. Kozak M (October 1987). "An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs." Nucleic Acids Res. 15 (20): 8125-8148.

Claims (3)

1. Способ стимуляции восстановления иннервации поврежденной ткани с помощью введения в область повреждения векторной конструкции, обеспечивающей высокий уровень экспрессии фактора, участвующего в процессе регенерации нерва, который отличается тем, что в поврежденную мышцу вводят терапевтически эффективное количество рекомбинантной плазмиды с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1, которая содержит модифицированную нуклеотидную последовательность, кодирующую BDNF человека, и последовательность Козак, в качестве плазмидного вектора используют pVax1 Invitrogen.1. A method of stimulating the restoration of the innervation of damaged tissue by introducing into the damage region a vector construct that provides a high level of expression of a factor involved in the nerve regeneration process, which is characterized in that a therapeutically effective amount of a recombinant plasmid with the nucleotide sequence of SEQ ID NO is introduced into the damaged muscle: 1, which contains a modified nucleotide sequence encoding a human BDNF, and a Kozak sequence, as a plasmid vector pVax1 Invitrogen is used. 2. Способ по п.1, в котором повреждение представляет собой травму периферического нерва.2. The method according to claim 1, in which the damage is a trauma to the peripheral nerve. 3. Способ по п.1, в котором повреждение представляет собой ишемическое повреждение конечности. 3. The method according to claim 1, in which the damage is ischemic damage to the limb.

Images