RU2538169C1 - RECOMBINANT PLASMID DNA pET40CmAP/MBL-T CODING HYBRID BIFUNCTIONAL POLYPEPTIDE CmAP/MBL-T WITH PROPERTIES OF HIGH-ACTIVITY ALKALINE PHOSPHATASE CmAP AND MANNAN-BINDING LECTIN OF C-TYPE MBL-T, RECOMBINANT STRAIN E coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/MBL-T - PRODUCER OF HYBRID BIFUNCTIONAL POLYPEPTIDE CmAP/MBL-T, AND METHOD FOR ITS OBTAINING - Google Patents
RECOMBINANT PLASMID DNA pET40CmAP/MBL-T CODING HYBRID BIFUNCTIONAL POLYPEPTIDE CmAP/MBL-T WITH PROPERTIES OF HIGH-ACTIVITY ALKALINE PHOSPHATASE CmAP AND MANNAN-BINDING LECTIN OF C-TYPE MBL-T, RECOMBINANT STRAIN E coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/MBL-T - PRODUCER OF HYBRID BIFUNCTIONAL POLYPEPTIDE CmAP/MBL-T, AND METHOD FOR ITS OBTAINING Download PDFInfo
- Publication number
- RU2538169C1 RU2538169C1 RU2013141777/10A RU2013141777A RU2538169C1 RU 2538169 C1 RU2538169 C1 RU 2538169C1 RU 2013141777/10 A RU2013141777/10 A RU 2013141777/10A RU 2013141777 A RU2013141777 A RU 2013141777A RU 2538169 C1 RU2538169 C1 RU 2538169C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mbl
- cmap
- pet40cmap
- recombinant
- hybrid
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и позволяет получать микробиологическим синтезом по оптимизированной технологии новый гибридный бифункциональный полипептид CmAP/MBL-T со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы морской бактерии и высокоспецифичного к цервикальным онкомаркерам маннан-связывающего лектина С-типа дальневосточного трепанга, который может быть использован для ранней дифференциальной диагностики рака шейки матки, а также для исследования механизмов канцерогенеза в практической онкологии.The invention relates to biotechnology, in particular to genetic engineering, and allows microbiological synthesis using optimized technology to obtain a new hybrid bifunctional polypeptide CmAP / MBL-T with the properties of highly active alkaline phosphatase of a marine bacterium and highly specific cervical tumor markers of C-type mannan-binding lectin Far Eastern trepang, which can be used for early differential diagnosis of cervical cancer, as well as for studying the mechanisms of carcinogenesis in practice tion oncology.
Данные об углеводной специфичности пектинов и их способности выявлять углеводные детерминанты в составе гликоконъюгатов опухолевых клеток, особенно метастазирующих, нашли широкое применение в онкологии. Лектины используются как инструмент исследования перерождения нормальных клеток в злокачественные [1-3]. Полученная информация, в свою очередь, является составной частью изучения механизма канцерогенеза. Наиболее интересными с этой точки зрения являются пектины с высоконаправленной углеводной специфичностью. Нами было показано, что к числу таких пектинов относится маннан-связывающий лектин С-типа дальневосточного трепанга Apostichopus japonicus (MBL-T) [4]. Лектин MBL-T не взаимодействует с компонентами сыворотки крови здорового человека, что является крайне важным при использовании в различных диагностических исследованиях, в частности, с применением методов иммуноцитохимии, что позволяет избежать ложно-положительных результатов и получать достоверную информацию о структурных изменениях углеводных цепей гликоконъюгатов, сопровождающих патологические изменения. Результаты исследований углеводного профиля гликоконъюгатов пектинами находят практическое применение при разработке методов диагностики рака [5-7].Data on the carbohydrate specificity of pectins and their ability to detect carbohydrate determinants in the composition of glycoconjugates of tumor cells, especially metastatic ones, are widely used in oncology. Lectins are used as a tool for studying the transformation of normal cells into malignant [1-3]. The information obtained, in turn, is an integral part of the study of the mechanism of carcinogenesis. The most interesting from this point of view are pectins with highly directed carbohydrate specificity. We have shown that such pectins include mannan-binding C-type lectin of the Far Eastern trepang Apostichopus japonicus (MBL-T) [4]. Lectin MBL-T does not interact with the components of the blood serum of a healthy person, which is extremely important when used in various diagnostic studies, in particular, using immunocytochemistry methods, which avoids false-positive results and obtain reliable information about structural changes in the carbohydrate chains of glycoconjugates, accompanying pathological changes. The results of studies of the carbohydrate profile of glycoconjugates with pectins find practical application in the development of cancer diagnostic methods [5-7].
Использование пектинов для диагностики рака реализуется по двум основным направлениям. Первое направление осуществляется при выявлении пектинами углеводных детерминант исследуемых маркеров в сыворотке крови на твердой фазе или в геле (лектин-ферментные, лектин-иммуноферментные, лектин-иммунные методы), и второе направление заключается во взаимодействии лектинов с соответствующими лигандами, экспрессированными на поверхности клеток, получаемых путем смывов, выделением из крови, а также на срезах биопсийного материала.The use of pectins for the diagnosis of cancer is implemented in two main directions. The first direction is carried out when pectins identify the carbohydrate determinants of the studied markers in the blood serum on the solid phase or in the gel (lectin-enzyme, lectin-immunoenzyme, lectin-immune methods), and the second direction is the interaction of lectins with the corresponding ligands expressed on the cell surface, obtained by swabs, isolation from the blood, as well as on sections of biopsy material.
Классическим примером перспективности использования лектинов в диагностике служит коммерческий набор японской фирмы WAKO, позволяющий проводить раннюю и дифференциальную диагностику рака печени, цирроза печени и беременности. В основе метода заложена способность лектинов LCA-A (Lens culinaris agglutinin A - лектин, выделенный из бобов чечевицы) и РНА-Е4 (phaseolus vulgaris isolectin E-4 - лектин, выделенный из бобов фасоли обыкновенной) выявлять углеводные изоформы альфа-фетопротеинов (АФП) в сыворотке крови. Метод обладает высокой чувствительностью и информативен даже при концентрации АФП 5 нг/мл. Объем исследуемого образца - 3 мкл, срок проведения анализа - 3 часа, количество одновременно анализируемых проб - 10. Метод позволяет за 2-3 месяца до появления первых клинических симптомов выявлять рецидивы роста опухоли вследствие его высокой чувствительности.A classic example of the prospects of using lectins in diagnostics is the commercial kit of the Japanese company WAKO, which allows for early and differential diagnosis of liver cancer, liver cirrhosis and pregnancy. The method is based on the ability of LCA-A lectins (Lens culinaris agglutinin A - lectin isolated from lentil beans) and PHA-E4 (phaseolus vulgaris isolectin E-4 - lectin isolated from common bean beans) to detect carbohydrate isoforms of alpha-fetoproteins (A ) in blood serum. The method is highly sensitive and informative even at an AFP concentration of 5 ng / ml. The volume of the test sample is 3 μl, the analysis time is 3 hours, the number of simultaneously analyzed samples is 10. The method allows detecting relapse of tumor growth 2-3 months before the first clinical symptoms due to its high sensitivity.
Уникальность углеводной специфичности лектина дальневосточного трепанга MBL-T и перспективность его использования как диагностического маркера подтверждается результатами экспериментов по взаимодействию с раковоэмбриональными антигенами. Лектин трепанга показал способность взаимодействовать с такими маркерами опухолевого роста, как альфа-фетопротеин, раковоэмбриональный антиген, эмбриональный альфа-1-кислый гликопротеин, эмбриональный альфа-2-глобулин.The uniqueness of the carbohydrate specificity of MBL-T lectin of the Far Eastern trepang and the prospects of its use as a diagnostic marker are confirmed by the results of experiments on interaction with cancer embryonic antigens. Trepangin lectin showed the ability to interact with tumor growth markers such as alpha-fetoprotein, cancer embryonic antigen, embryonic alpha-1-acid glycoprotein, embryonic alpha-2-globulin.
На основе наличия у лектина MBL-T уникального углевод-распознающего домена, определяющего его способность распознавать микрогетерогенность гликоконъюгатов раковых и нормальных клеток, заявителем разработан новый метод диагностики рака шейки матки [8].Based on the presence of a unique carbohydrate-recognizing domain in MBL-T lectin, which determines its ability to recognize the microheterogeneity of glycoconjugates of cancer and normal cells, the applicant has developed a new method for the diagnosis of cervical cancer [8].
Определение концентрации пектин-связанных структур в эпителиальном секрете является принципиально новым подходом при выявлении злокачественных новообразований. Однако и такой анализ требует повышения эффективности наряду с простотой выполнения метода. Это возможно при использовании методов генной инженерии. Методами молекулярного клонирования установлена структура лектина дальневосточного трепанга MBL-T [GenBank, код доступа ААТ42221] и щелочной фосфатазы морской бактерии CmAP [GenBank, код доступа ABD92772]. Известен 3 способ получения высокоактивной рекомбинантной щелочной фосфатазы морской бактерии CmAP [9].Determining the concentration of pectin-related structures in epithelial secretion is a fundamentally new approach in the detection of malignant neoplasms. However, such an analysis requires an increase in efficiency along with the simplicity of the method. This is possible using genetic engineering methods. Molecular cloning methods have been used to establish the structure of the Far Eastern trepang lectin MBL-T [GenBank, access code AAT42221] and alkaline phosphatase of the marine bacteria CmAP [GenBank, access code ABD92772]. Known 3 method for producing highly active recombinant alkaline phosphatase of the marine bacteria CmAP [9].
Задача изобретения - конструирование рекомбинантного штамма-продуцента Escherichia coli, несущего такую экспрессирующую конструкцию (плазмиду), которая позволит нарабатывать целевой высокоочищенный недеградированный гибридный бифункциональный полипептид CmAP/MBL-T в препаративных количествах, при сохранении как иммуногенных свойств высокоспецифичного лектина дальневосточного трепанга MBL-T, так и ферментативных свойств высокоактивной щелочной фосфатазы морской бактерии CmAP, используемой для цветной визуализации лектин-связанных комплексов в лектин-иммуноферментном методе ранней диагностики рака шейки матки.The objective of the invention is the construction of a recombinant producer strain of Escherichia coli, carrying such an expressing construct (plasmid), which will allow to produce the target highly purified non-degraded hybrid bifunctional CmAP / MBL-T polypeptide in preparative quantities, while maintaining the immunogenic properties of highly specific MBL-T lectin, and the enzymatic properties of the highly active alkaline phosphatase of the marine bacteria CmAP, used for color visualization of lectin-associated complexes in ektin-ELISA method for early diagnosis of cervical cancer.
Поставленная задача решена путем конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pET40CmAP/MBL-T, кодирующей химерный полипептид CmAP/MBL-Т, и рекомбинантного штамма E.coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/MBL-T, обеспечивающие индуцируемый синтез с высоким и стабильным выходом активного растворимого бифункционального белка CmAP/MBL-T, обладающего свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы морской бактерии CmAP и высокочувствительного маннан-связывающего лектина С-типа дальневосточного трепанга MBL-T.The problem is solved by constructing a recombinant plasmid DNA pET40CmAP / MBL-T encoding the chimeric CmAP / MBL-T polypeptide and a recombinant E. coli Rosetta strain (DE3) / pET40CmAP / MBL-T, providing inducible synthesis with high and stable yield of active soluble bifunctional protein CmAP / MBL-T, which has the properties of highly active alkaline phosphatase of the marine bacteria CmAP and highly sensitive mannan-binding lectin C-type Far Eastern trepang MBL-T.
Технический результат заявленного изобретения - получение активного гибридного бифункционального полипептида CmAP/MBL-T со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы CmAP и высокочувствительного маннан-связывающего лектина С-типа дальневосточного трепанга MBL-T с высоким выходом и уровнем очистки.The technical result of the claimed invention is the preparation of an active hybrid bifunctional CmAP / MBL-T polypeptide with the properties of highly active alkaline phosphatase CmAP and highly sensitive mannan-binding C-type lectin of the Far Eastern trepang MBL-T with a high yield and level of purification.
Плазмида pET40CmAP/MBL-T имеет 8194 пар оснований (п.о.) и характеризуется наличием NcoI/SalI-фрагмента плазмиды pET-40b(+) (Novagen) и последовательности фрагмента ДНК размером 2034 п.о., содержащего химерный ген, начинающий трансляцию со щелочной фосфатазы CmAP (N-конец) и заканчивающийся маннан-связывающим лектином С-типа MBL-T с С-концевой части молекулы рекомбинантного белка, соединенным со щелочной фосфатазой гибким линкером (G)4S(G)4S(G)4SEL.Plasmid pET40CmAP / MBL-T has 8194 base pairs (bp) and is characterized by the presence of an NcoI / SalI fragment of plasmid pET-40b (+) (Novagen) and a 2034 bp DNA fragment sequence containing a chimeric gene starting translation from alkaline phosphatase CmAP (N-terminus) and ending with C-type MBL-T mannan-binding lectin from the C-terminal portion of the recombinant protein molecule connected to alkaline phosphatase by a flexible linker (G) 4S (G) 4S (G) 4SEL.
На фигуре 1 представлена физическая карта плазмиды pET40CmAP/MBL-T и область плазмиды, ответственная за экспрессию гибридного белка CmAP/MBL-T. Нуклеотидная последовательность фрагмента плазмиды pET40CmAP/MBL-T, фланкированная сайтами NcoI и SalI, содержит последовательность структурного гена CwAP, соответствующую открытой рамке считывания для белка СтАР, последовательность соединяющего линкера (G)4S(G)4S(G)4SEL и последовательность структурного гена MBL-Т, соответствующую открытой рамке считывания для белка MBL-T (SEQ ID N1).The figure 1 presents the physical map of the plasmid pET40CmAP / MBL-T and the region of the plasmid responsible for the expression of the hybrid protein CmAP / MBL-T. The nucleotide sequence of the pET40CmAP / MBL-T plasmid fragment flanked by the NcoI and SalI sites contains the CwAP structural gene sequence corresponding to the open reading frame for the StAP protein, the linker linker sequence (G) 4S (G) 4S (G) 4SEL, and the MBL structural gene sequence -T corresponding to the open reading frame for the MBL-T protein (SEQ ID N1).
Рекомбинантный штамм E.coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/MBL-T получен трансформацией клеток E.coli Rosetta(DE3) (Novagen) плазмидой pET40CwAP/MBL-T с использованием традиционной генно-инженерной технологии [10].The recombinant E. coli Rosetta (DE3) / pET40CmAP / MBL-T strain was obtained by transforming E.coli Rosetta (DE3) (Novagen) cells with the pET40CwAP / MBL-T plasmid using traditional genetic engineering technology [10].
Рекомбинантный штамм E.coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/MBL-T характеризуется следующими признаками.The recombinant E. coli Rosetta (DE3) / pET40CmAP / MBL-T strain is characterized by the following features.
Культурально-морфологические признаки.Cultural and morphological characters.
Клетки штамма образуют крупные круглые с ровными краями, выпуклые колонии до 5 мм в диаметре, поверхность колоний гладкая, консистенция слизистая. Пигмент не накапливается. Грамотрицательны, спор не образуют, капсулы не имеют. Колонии хорошо растут на простых питательных средах (LB). При росте в жидких средах образуют интенсивную ровную муть.The cells of the strain form large round with smooth edges, convex colonies up to 5 mm in diameter, the surface of the colonies is smooth, the mucous consistency. The pigment does not accumulate. Gram-negative, do not form a spore, do not have capsules. Colonies grow well on simple nutrient media (LB). When growing in liquid media, they form an intense smooth haze.
Физико-биологические признаки.Physico-biological signs.
Рекомбинантный штамм E.coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/MBL-T видотипичен по своим биохимическим свойствам. Штамм не обладает желатиназной активностью, не ферментирует лизин; расщепляет глюкозу, лактозу, маннит, сахарозу до кислоты и газа. Имеет мутацию в гене lac, обеспечивающую контроль уровня экспрессии, а также трансляцию редких кодонов. Оптимальной для роста является температура 37°С, а для продукции белка CmAP/MBL-T -16°С.The recombinant strain of E. coli Rosetta (DE3) / pET40CmAP / MBL-T is speciesotypic in its biochemical properties. The strain does not have gelatinase activity, does not ferment lysine; breaks down glucose, lactose, mannitol, sucrose to acid and gas. It has a mutation in the lac gene, which provides control of the expression level, as well as the translation of rare codons. The optimum temperature for growth is 37 ° C, and for the production of protein CmAP / MBL-T -16 ° C.
Устойчивость к антибиотикам.Antibiotic resistance.
Клетки штамма характеризуются устойчивостью к хлорамфениколу (34 мкг/мл) и канамицину (25 мкг/мл).The cells of the strain are resistant to chloramphenicol (34 μg / ml) and kanamycin (25 μg / ml).
Патогенность и токсичность.Pathogenicity and toxicity.
Рекомбинантный штамм E.coli Rosetta(DE3)/pET400CmAP/MBL-T не патогенен и не токсичен для теплокровных животных.The recombinant E. coli Rosetta strain (DE3) / pET400CmAP / MBL-T is neither pathogenic nor toxic to warm-blooded animals.
Штамм хранится обычным способом в суспензии с глицерином (30%) при -20°С.The strain is stored in the usual way in suspension with glycerol (30%) at -20 ° C.
Заявляемый способ получения гибридного бифункционального белка CmAP/MBL-T заключается в культивировании клеток штамма E.coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/MBL-T в жидкой питательной среде LB в течение 12 ч при 16°С, затем бактериальные клетки осаждают центрифугированием, суспензию клеток дезинтегрируют в буфере, далее экстракт центрифугируют, затем надосадочную жидкость помещают на колонку с ионообменной смолой, далее элюируют белок, затем белковый элюат помещают на колонку с металлоаффинной смолой, далее активные фракции концентрируют на ионообменной смоле и выделяют целевой продукт гель-фильтрацией.The inventive method of obtaining a hybrid bifunctional protein CmAP / MBL-T is to cultivate cells of a strain of E. coli Rosetta (DE3) / pET40CmAP / MBL-T in a liquid nutrient medium LB for 12 h at 16 ° C, then the bacterial cells are precipitated by centrifugation, suspension cells are disintegrated in a buffer, then the extract is centrifuged, then the supernatant is placed on a column with an ion-exchange resin, then the protein is eluted, then the protein eluate is placed on a column with a metal-affinity resin, then the active fractions are concentrated on an ion-exchange resin and pour the desired product by gel filtration.
Выход рекомбинантного гибридного бифункционального белка CmAP/MBL-T в результате применения описанного способа составляет не менее 10 мг рекомбинантного белка с 1 л культуры с удельной активностью щелочной фосфатазы не менее 10000 ед/мг белка и иммуногенными свойствами маннан-связывающего лектина С-типа, характерными для природного аналога MBL-T [4, 8].The yield of the recombinant bifunctional hybrid protein CmAP / MBL-T as a result of using the described method is at least 10 mg of recombinant protein with 1 liter of culture with a specific alkaline phosphatase activity of at least 10,000 u / mg protein and immunogenic properties of C-type mannan-binding lectin characteristic for the natural analogue of MBL-T [4, 8].
Рекомбинантный гибридный бифункциональный белок CmAP/MBL-T имеет молекулярную массу 105,5 кДа, включая плазмидный шаперон DsbC с молекулярной массой 32,5 кДа, широкий диапазон значений температуры (25-37°С) и рН (7,5-9,5) для проявления фосфатазной активности и аффинных свойств лектина в присутствии 2 мМ ионов Са2+. Плазмидный шаперон Dsb не дает существенного вклада в функциональную способность обоих частей химеры CmAP/MBL-T, поэтому этап его удаления из рекомбинантного белка с помощью энтерокиназы по предусмотренному генетической конструкцией сайту рестрикции не обязателен.The recombinant bifunctional hybrid protein CmAP / MBL-T has a molecular weight of 105.5 kDa, including a DsbC plasmid chaperone with a molecular weight of 32.5 kDa, a wide range of temperature values (25-37 ° C) and pH (7.5-9.5 ) for the manifestation of phosphatase activity and affinity properties of lectin in the presence of 2 mm Ca 2+ ions . The plasmid chaperone Dsb does not significantly contribute to the functional ability of both parts of the CmAP / MBL-T chimera; therefore, the step of removing it from the recombinant protein using enterokinase at the restriction site provided by the genetic design is not necessary.
Рекомбинантный гибридный бифункциональный полипептид CmAP/MBL-T успешно использован в доклинических испытаниях способности связывания лектинового компонента химеры с муцином, раковоэмбриональным антигеном (РЭА), а также другими онкомаркерами методом лектин-иммуноферментного анализа. Использование маннан-связывающего лектина в составе гибридного бифункционального полипептида CmAP/MBL-T с активностью щелочной фосфатазы позволяет сократить стадии и время иммуноферментного анализа, которые раньше требовались для получения конъюгатов лектина и фермента.The recombinant hybrid bifunctional CmAP / MBL-T polypeptide was successfully used in preclinical trials of the ability of the lectin component of the chimera to bind to mucin, cancer-embryonic antigen (CEA), and other tumor markers by enzyme-linked immunosorbent assay. The use of mannan-binding lectin in the composition of the hybrid bifunctional CmAP / MBL-T polypeptide with alkaline phosphatase activity reduces the stages and time of enzyme-linked immunosorbent assay, which were previously required to obtain lectin and enzyme conjugates.
На фиг.2 представлены результаты иммуно-ферментного анализа (ИФА), проведенного на микропланшете, сенсибилизированном муцином, с применением гибридного бифункционального полипептида CmAP/MBL-T, полученного от разных колоний трансгенного штамма E.coli Rosetta(DE3)/pET40 CmAP/MBL-T. Уровень аффинности рекомбинантного гибридного бифункционального полипептида CmAP/MBL-T определяли по концентрации пектин-связанных комплексов с муцином (по оси X). Визуализацию лектин-связанных комплексов осуществляли методом измерения фосфатазной активности рекомбинантного гибридного бифункционального полипептида CmAP/MBL-T (по оси Y).Figure 2 presents the results of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) performed on a mucin sensitized microplate using a hybrid bifunctional CmAP / MBL-T polypeptide obtained from different colonies of the transgenic E. coli Rosetta strain (DE3) / pET40 CmAP / MBL -T. The affinity level of the recombinant hybrid bifunctional CmAP / MBL-T polypeptide was determined by the concentration of pectin-associated complexes with mucin (along the X axis). Lectin-bound complexes were visualized by measuring the phosphatase activity of the recombinant hybrid bifunctional CmAP / MBL-T polypeptide (along the Y axis).
Существенными преимуществами заявляемого способа получения гибридного бифункционального полипептида CmAP/MBL-T являются:Significant advantages of the proposed method for producing a hybrid bifunctional CmAP / MBL-T polypeptide are:
использование рекомбинантного штамма-продуцента E.coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/MBL-T, что позволяет получать при биосинтезе большое количество высокоактивного бифункционального гибридного белка CmAP/MBL-T;the use of a recombinant producer strain E. coli Rosetta (DE3) / pET40CmAP / MBL-T, which allows to obtain a large amount of highly active bifunctional hybrid protein CmAP / MBL-T during biosynthesis;
использование несложной трехстадийной хроматографической очистки рекомбинантного белка, что позволяет получить чистый гибридный полипептид CmAP/MBL-T за короткое время и с малыми потерями.the use of a simple three-stage chromatographic purification of recombinant protein, which allows to obtain a pure hybrid CmAP / MBL-T polypeptide in a short time and with low losses.
Способ получения функционально-активного гибридного полипептида CmAP/MBL-T на основе использования химерного гена, кодирующего щелочную фосфатазу морской бактерии CmAP и маннан-связывающий лектин С-типа дальневосточного трепанга MBL-T, иллюстрируется следующими примерами.A method for producing a functionally active hybrid CmAP / MBL-T polypeptide based on the use of a chimeric gene encoding the alkaline phosphatase of the marine bacteria CmAP and C-type mannan-binding lectin of the Far Eastern trepang MBL-T is illustrated by the following examples.
Пример 1. Конструирование плазмиды pET40CmAP/MBL-T.Example 1. Construction of the plasmid pET40CmAP / MBL-T.
Рекомбинантную плазмиду pET40CmAP/MBL-T, содержащую химерный ген, кодирующий полноразмерную щелочную фосфатазу CmAP и полноразмерный маннан-связывающий лектин С-типа MBL-T, соединяющиеся через гибкий линкер (G)4S(G)4S(G)4SEL, фланкированный сайтами рестрикции NcoI и SalI, конструируют на основе коммерческой плазмиды pET-40b(+) (Novagen).Recombinant plasmid pET40CmAP / MBL-T containing the chimeric gene encoding the full-sized alkaline phosphatase CmAP and the full-size mannan-binding lectin C-type MBL-T, connecting through a flexible linker (G) 4S (G) 4S (G) 4SEL, flanked by restriction sites NcoI and SalI are constructed based on the commercial plasmid pET-40b (+) (Novagen).
Фрагмент ДНК, содержащий химерный ген гибридного полипептида CwAP/MBL-Т, получают в два этапа. На первом этапе проводят полимеразную цепную реакцию с использованием плазмиды 40Pho в качестве матрицы для получения гена щелочной фосфатазы СтАР и праймеров X-PhoN_F и Pho40X-SacI-R, где X-PhoN_F - праймер, специфичный по отношению к N-концевой последовательности CmAP, включающий сайт для рестриктазы NcoI; Pho40X-SacI-R - обратный праймер, специфичный по отношению к С-концевой последовательности CmAP, включающий полинуклеотид, кодирующий линкер (G)4S(G)4S(G)4SEL и сайт рестрикции SacI:A DNA fragment containing the chimeric gene of the hybrid CwAP / MBL-T polypeptide is obtained in two stages. At the first stage, a polymerase chain reaction is carried out using the 40Pho plasmid as a template to obtain the StAP alkaline phosphatase gene and X-PhoN_F and Pho40X-SacI-R primers, where X-PhoN_F is a primer specific for the N-terminal CmAP sequence, including restriction enzyme site NcoI; Pho40X-SacI-R is a reverse primer specific for the C-terminal CmAP sequence, including a polynucleotide encoding the (G) 4S (G) 4S (G) 4SEL linker and the SacI restriction site:
X-PhoN_F: 5'-TATTCCATGGCAGAGATCAAGAATGTCATTCTGAT-3'X-PhoN_F: 5'-TATTCCATGGCAGAGATCAAGAATGTCATTCTGAT-3 '
Pho40X-SacI-R: -5'-TTAAGAGCTCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACC CTTCGCTACCACTGTCTTCAGATACTGTCCT-3'.Pho40X-SacI-R: -5'-TTAAGAGCTCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACC CTTCGCTACCACTGTCTTCAGATACTGTCCT-3 '.
Данную реакцию проводят в следующих условиях: 10х Encycio буфер, 50х смесь полимераз Encyclo («Encyclo PCR kit», Евроген, Москва), 50х смесь dNTP (10 mM каждого), смесь праймеров (5 µМ каждого), 20 нг ДНК. Процесс амплификации состоит из следующих стадий: 30 циклов ПЦР (15 с - 95°С, 1 мин 30 с - 72°С) и инкубация 10 мин при 72°С. После амплификации ПЦР-продукт очищают электрофоретически в 1% агарозном геле. Фрагмент (1 мкг) обрабатывают рестриктазами NcoI и SacI в оптимальном буфере (Fermentas) в течение 3 часов, затем ферменты удаляют из реакционной среды по стандартной методике фенолом (1:1) [10]. В водную фракцию, содержащую фрагмент, добавляют 1/10 объема 0,3 М ацетата Na, pH 5,2 и 1/2 объема изопропанолового спирта и оставляют на -20°С в течение 30 мин. Затем центрифугируют при 14000 об/мин в течение 20 мин, осадок промывают 75% этанолом и высушивают при комнатной температуре. Осадок растворяют в 20 мкл деионизованной воды.This reaction is carried out under the following conditions: 10x Encycio buffer, 50x Encyclo polymerase mixture (Encyclo PCR kit, Eurogen, Moscow), 50x dNTP mixture (10 mM each), primer mixture (5 μM each), 20 ng DNA. The amplification process consists of the following stages: 30 PCR cycles (15 s - 95 ° C, 1 min 30 s - 72 ° C) and 10 min incubation at 72 ° C. After amplification, the PCR product is purified electrophoretically in a 1% agarose gel. The fragment (1 μg) was treated with restriction enzymes NcoI and SacI in optimal buffer (Fermentas) for 3 hours, then the enzymes were removed from the reaction medium according to the standard procedure with phenol (1: 1) [10]. 1/10 volume of 0.3 M Na acetate, pH 5.2 and 1/2 volume of isopropanol alcohol are added to the aqueous fraction containing the fragment and left at -20 ° C for 30 minutes. It is then centrifuged at 14,000 rpm for 20 minutes, the precipitate is washed with 75% ethanol and dried at room temperature. The precipitate was dissolved in 20 μl of deionized water.
2 мкг плазмидной ДНК рЕТ-40b(+) обрабатывают рестриктазами NcoI и SacI в соответствии с методикой, описанной выше, и из полученного гидролизата выделяют векторную часть плазмиды в 1% геле легкоплавкой агарозы.2 μg of pET-40b (+) plasmid DNA was digested with restriction enzymes NcoI and SacI in accordance with the procedure described above, and the vector part of the plasmid was isolated from the obtained hydrolyzate in a 1% low-melting agarose gel.
Полученный фрагмент гена CmAP и векторную часть плазмиды рЕТ-40b(+) сшивают при помощи лигазной реакции в 50 мкл буфера для лигирования согласно инструкции (Fermentas). 10 мкл реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli Rosetta(DE3). Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 25 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 16 ч при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК и анализируют на наличие мутаций при помощи автоматического секвенирования. Отбирают плазмидную ДНК pET40CmAP, содержащую последовательность CmAP с линкером (G)4S(G)4S(G)4SEL на С-концевой части.The resulting CmAP gene fragment and the vector part of the pET-40b (+) plasmid were crosslinked by ligase reaction in 50 μl of ligation buffer according to the instructions (Fermentas). 10 μl of the reaction mixture was used to transform competent E. coli Rosetta cells (DE3). Transformants are plated on LB agar containing 25 μg / ml kanamycin. After incubation for 16 hours at 37 ° C, the clones are plated, plasmid DNA is isolated and analyzed for mutations using automatic sequencing. The pET40CmAP plasmid DNA containing the CmAP sequence with the (G) 4S (G) 4S (G) 4SEL linker at the C-terminal portion is selected.
На втором этапе проводят амплификацию гена MBL-T с использованием к-ДНК дальневосточного трепанга и пары праймеров Lect-X-dir и Lect-X-rev, несущими сайты для рестриктаз SacI и SalI:At the second stage, the MBL-T gene is amplified using Far Eastern trepang c-DNA and a pair of Lect-X-dir and Lect-X-rev primers carrying SacI and SalI restriction enzyme sites:
Lect-X-dir: 5'-AGCTGAGCTCTGTCTGACGGCTTGTCCGGAGTTTTG-3Lect-X-dir: 5'-AGCTGAGCTCTGTCTGACGGCTTGTCCGGAGTTTTG-3
Lect-X-rev: 5'-CAGTGTCGACCTCCAAATGATACTCGATACAGGGAAG-3'Lect-X-rev: 5'-CAGTGTCGACCTCCAAATGATACTCGATACAGGGAAG-3 '
Для создания конструкции pET40CmAP/MBL-T полученный ген маннан-связывающего пектина С-типа MBL-T и 2 мкг плазмидной ДНК pET40CmAP обрабатывают рестриктазами SacI и SalI в соответствии с методикой, описанной выше, и очищают в 1% геле легкоплавкой агарозы. Очищенные ПЦР-фрагменты MBL-T и векторную часть плазмиды pET40CmAP сшивают при помощи лигазной реакции в 50 мкл буфера для лигирования согласно инструкции (Fermentas). 10 мкл реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli Rosetta(DE3). Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 25 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 16 ч при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК и анализируют на наличие мутаций при помощи автоматического секвенирования. Отбирают ДНК, содержащую необходимые последовательности генов CmAP и MBL-T, представляющую собой плазмиду pET40CmAP/MBL-T размером 8194 п.о. (фиг.1).To create the pET40CmAP / MBL-T construct, the obtained C-type MBL-T mannan-binding pectin gene and 2 μg of pET40CmAP plasmid DNA were treated with SacI and SalI restrictase enzymes in accordance with the procedure described above, and purified on a 1% low-melting agarose gel. The purified MBL-T PCR fragments and the vector portion of the pET40CmAP plasmid are crosslinked by ligase reaction in 50 μl of ligation buffer according to the instructions (Fermentas). 10 μl of the reaction mixture was used to transform competent E. coli Rosetta cells (DE3). Transformants are plated on LB agar containing 25 μg / ml kanamycin. After incubation for 16 hours at 37 ° C, the clones are plated, plasmid DNA is isolated and analyzed for mutations using automatic sequencing. A DNA was selected containing the desired CmAP and MBL-T gene sequences, which was a pET40CmAP / MBL-T plasmid of 8194 bp in size. (figure 1).
Пример 2. Получение рекомбинантного штамма E.coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/MBL-T - продуцента гибридного бифункционального полипептида CmAP/MBL-T.Example 2. Obtaining a recombinant strain of E. coli Rosetta (DE3) / pET40CmAP / MBL-T - producer of the hybrid bifunctional CmAP / MBL-T polypeptide.
Рекомбинантный штамм-продуцент E.coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/MBL-T получают путем трансформации клеток штамма E.coli Rosetta(DE3) рекомбинантной плазмидой pET40CmAP/MBL-T. Ночную культуру (0,5 мл LB) рекомбинантного штамма-продуцента гибридного бифункционального полипептида CmAP/MBL-T выращивают в литровой колбе в жидкой среде LB, содержащей на литр 10 г бакто-триптона, 5 г бакто-дрожжевого экстракта и 10 г NaCl, 25 мг/мл канамицина, рН 7,7, на шейкере при 200 об/мин при температуре 37°С в течение 2 часов до оптической плотности 0,6-0,8 (OD600), затем добавляют индуктор экспрессии IPTG до конечной концентрации 0,2 мМ и инкубируют далее при 16°С в течение 12 часов.The recombinant producer strain E. coli Rosetta (DE3) / pET40CmAP / MBL-T is obtained by transforming cells of the E. coli Rosetta (DE3) strain with the recombinant plasmid pET40CmAP / MBL-T. An overnight culture (0.5 ml LB) of the recombinant producer strain of the hybrid bifunctional CmAP / MBL-T polypeptide is grown in a liter flask in LB liquid medium containing 10 g bacto-tryptone, 5 g bacto-yeast extract and 10 g NaCl per liter, 25 mg / ml kanamycin, pH 7.7, on a shaker at 200 rpm at 37 ° C for 2 hours to an optical density of 0.6-0.8 (OD 600 ), then an IPTG expression inducer is added to a final concentration 0.2 mmol and incubated further at 16 ° C for 12 hours.
Для определения продуктивности штамма клеточные водные экстракты анализируют электрофорезом в 12,5% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Гель окрашивают Кумасси R-250 по стандартной методике и определяют относительное количество белка в полосе целевого продукта. Содержание рекомбинантного белка в растворимой клеточной фракции составляет не менее 30% от всех белков этой фракции.To determine the productivity of the strain, cellular aqueous extracts are analyzed by electrophoresis in 12.5% polyacrylamide gel with sodium dodecyl sulfate. The gel is stained with Coomassie R-250 by a standard method and the relative amount of protein in the strip of the target product is determined. The content of the recombinant protein in the soluble cell fraction is at least 30% of all proteins of this fraction.
Пример 3. Выделение и характеристика гибридного бифункционального полипептида CmAP/MBL-T.Example 3. Isolation and characterization of the hybrid bifunctional CmAP / MBL-T polypeptide.
Рекомбинантный штамм-продуцент гибридного бифункционального полипептида CmAP/MBL-T - E.coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/MBL-T инкубируют в литровой колбе в жидкой среде LB, содержащей на литр 10 г бакто-триптона, 5 г бакто-дрожжевого экстракта и 10 г NaCl, 0,5 мМ IPTG, 25 мг/мл канамицина, рН 7,7, на шейкере при 200 об/мин в течение 12 часов при 16°С. Бактериальные клетки осаждают на проточной центрифуге при 5000 об/мин в течение 10 мин. Суспензию клеток дезинтегрируют в 20 мл буфера А (0,05 М трис-HCl, рН 8,6, 0.01% NaN3) в течение 5×30 с, охлаждая во льду. Затем центрифугируют при 10000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость собирают и помещают на колонку с ДЕАЕ-52-целлюлозой (Whatman). Элюцию белка проводят градиентом концентрации NaCl (0,05 М-0,380 М) в буфере А. Активные фракции собирают и помещают на колонку с металлоаффинной смолой (Qiagen), предварительно уравновешенную буфером А. Элюцию белка проводят буфером В (50 мМ Tris-HCl, рН 8,6, 50 мМ EDTA, 0,01% NaN3). Активные фракции собирают, обессоливают и концентрируют на колонке с ДЕАЕ-Toyopearl 650М (Тоуо Soda), затем инкубируют с энтерокиназой (Invitrogen) при комнатной температуре в течение 12 часов. Затем раствор белка наносят на колонку для гель-фильтрации с Superdex 200 (Sigma). Выход рекомбинантного белка составляет 10 мг с 1 литра культуры.The recombinant strain producing hybrid bifunctional CmAP / MBL-T polypeptide - E. coli Rosetta (DE3) / pET40CmAP / MBL-T is incubated in a liter flask in LB liquid medium containing 10 g bacto-tryptone, 5 g bacto-yeast extract per liter and 10 g of NaCl, 0.5 mm IPTG, 25 mg / ml kanamycin, pH 7.7, on a shaker at 200 rpm for 12 hours at 16 ° C. Bacterial cells are pelleted in a flow centrifuge at 5000 rpm for 10 minutes. The cell suspension is disintegrated in 20 ml of buffer A (0.05 M Tris-HCl, pH 8.6, 0.01% NaN 3 ) for 5 × 30 s, cooling in ice. Then centrifuged at 10,000 rpm for 30 minutes The supernatant was collected and placed on a DEAE-52-cellulose column (Whatman). Protein elution is carried out with a NaCl concentration gradient (0.05 M-0.380 M) in buffer A. Active fractions are collected and placed on a column of metal-affinity resin (Qiagen), previously equilibrated with buffer A. Protein elution is carried out with buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 8.6, 50 mM EDTA, 0,01% NaN 3). The active fractions were collected, desalted and concentrated on a DEAE-Toyopearl 650M column (Touo Soda), then incubated with enterokinase (Invitrogen) at room temperature for 12 hours. The protein solution is then applied to a gel filtration column with Superdex 200 (Sigma). The recombinant protein yield is 10 mg per 1 liter of culture.
Полученный рекомбинантный полипептид определяют по первым 10 аминокислотам на автоматическом секвенаторе. Проведенное секвенирование препарата рекомбинантного белка, выделенного из клеток штамма E.coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/MBL-T, выявило аминокислотную последовательность А1а-Glu-Ile-Lys-Asn-Val-Ile-Leu-Met-Ile, соответствующую первым 10 аминокислотам щелочной фосфатазы CmAP, являющейся N-концевой составляющей химерного белка CmAP/MBL-T.The resulting recombinant polypeptide is determined by the first 10 amino acids on an automatic sequencer. Sequencing of a recombinant protein preparation isolated from cells of the E. coli Rosetta (DE3) / pET40CmAP / MBL-T strain revealed the amino acid sequence A1a-Glu-Ile-Lys-Asn-Val-Ile-Leu-Met-Ile corresponding to the first 10 amino acids of alkaline phosphatase CmAP, which is the N-terminal component of the chimeric protein CmAP / MBL-T.
Ферментативную функциональность гибридного полипептида CmAP/MBL-T проверяют по активности щелочной фосфатазы, которую определяют по расщеплению паранитрофенилфосфата (п-НФФ). Стандартная инкубационная смесь в объеме 500 мкл содержит 15 мМ п-НФФ, 1 М диэтаноламина (ДЭА), рН 10,3 и фермент либо 2 мМ п-НФФ, 0,1 М трис-HCl, 0.2 М KCl, рН 9,5-10,0. После 30 мин инкубации при 37°С реакцию останавливают добавлением 2 мл 0,5 М NaOH. Количество образовавшегося в процессе ферментативной реакции п-нитрофенола (п-НФ) определяют спектрофотометрически при 400 нм. За единицу активности щелочной фосфатазы принимают количество фермента, катализирующего освобождение 1 мкМ п-НФ (ε400 нм = 18600) в течение 1 мин инкубации. Удельную активность выражают в единицах активности фермента на 1 мг белка. Концентрацию белка в растворе определяют по методу Брэдфорда.The enzymatic functionality of the CmAP / MBL-T hybrid polypeptide is checked by alkaline phosphatase activity, which is determined by the cleavage of paranitrophenyl phosphate (p-NFF). A standard incubation mixture in a volume of 500 μl contains 15 mM p-NFF, 1 M diethanolamine (DEA), pH 10.3 and an enzyme or 2 mM p-NFF, 0.1 M Tris-HCl, 0.2 M KCl, pH 9.5 -10.0. After 30 min incubation at 37 ° C, the reaction is stopped by adding 2 ml of 0.5 M NaOH. The amount of p-nitrophenol (p-NF) formed during the enzymatic reaction is determined spectrophotometrically at 400 nm. The unit of alkaline phosphatase activity is the amount of an enzyme that catalyzes the release of 1 μM p-NP (ε 400 nm = 18600) during 1 min of incubation. The specific activity is expressed in units of enzyme activity per 1 mg of protein. The protein concentration in the solution is determined by the Bradford method.
Лектинную функциональность гибридного полипептида CmAP/MBL-T проверяют по уровню аффинности к муцину. На сенсибилизированный муцином полистирольный микропланшет вносят раствор (0,0015-0,1 мг/мл) гибридного полипептида CmAP/MBL-T и инкубируют 1,5 часа при комнатной температуре. Лектин-связанные комплексы отмывают буфером 10 мм трис-HCl, рН 9,0, 0,15 М NaCl, 0,05% Тритон Х-100, 20 мМ CaCl2 по 200 мкл в каждую лунку не менее 10 раз. Затем в лунки микропланшета добавляют буфер для активности щелочной фосфатазы с субстратом, как описано выше, для визуализации связавшихся комплексов (фиг.2).The lectin functionality of the CmAP / MBL-T fusion polypeptide is tested for mucin affinity. A solution (0.0015-0.1 mg / ml) of the CmAP / MBL-T hybrid polypeptide was added to a mucin sensitized polystyrene microplate and incubated for 1.5 hours at room temperature. Lectin-bound complexes are washed with 10 mm Tris-HCl buffer, pH 9.0, 0.15 M NaCl, 0.05% Triton X-100, 20 mM CaCl 2 , 200 μl per well at least 10 times. Then, a buffer for alkaline phosphatase activity with the substrate, as described above, is added to the wells of the microplate to visualize the bound complexes (FIG. 2).
Полученные данные по характеристике и функциональной активности продукта экспрессии искусственного химерного гена гибридного бифункционального полипептида CmAP/MBL-T в клетках рекомбинантного штамма E.coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/MBL-T свидетельствуют о соответствии исследуемого полипептида его природному аналогу - пектину MBL-T, применяемому в лектин-иммуноферментном методе ранней дифференциальной диагностики рака шейки матки [8].The obtained data on the characteristics and functional activity of the expression product of the artificial chimeric gene of the hybrid bifunctional CmAP / MBL-T polypeptide in the cells of the recombinant E. coli Rosetta (DE3) / pET40CmAP / MBL-T strain indicate the correspondence of the studied polypeptide to its natural analogue - MBL-T pectin used in the lectin-enzyme immunoassay method of early differential diagnosis of cervical cancer [8].
Как следует из приведенных примеров, заявляемая группа изобретений позволяет получать активный рекомбинантный гибридный бифункциональный полипептид CmAP/MBL-T со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы морской бактерии CmAP и высокоспецифичного маннан-связывающего лектина дальневосточного трепанга С-типа MBL-T с высоким выходом при относительно простой и надежной технологии.As follows from the above examples, the claimed group of inventions allows to obtain an active recombinant hybrid bifunctional CmAP / MBL-T polypeptide with the properties of highly active alkaline phosphatase of the marine bacteria CmAP and highly specific mannan-binding lectin of the Far Eastern C-type MBL-T trepang in high yield with a relatively simple and reliable technology.
Заявленное изобретение позволяет:The claimed invention allows you to:
- с помощью использования рекомбинантного штамма-продуцента E.coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/MBL-T получать путем биосинтеза большое количество активного гибридного бифункционального полипептида CmAP/MBL-T;- using a recombinant producer strain of E. coli Rosetta (DE3) / pET40CmAP / MBL-T to obtain by biosynthesis a large amount of the active hybrid bifunctional CmAP / MBL-T polypeptide;
- использование ионообменной, металлоаффинной и гель-фильтрационной хроматографий при очистке рекомбинантного белка из водного экстракта клеток рекомбинантного штамма-продуцента позволяет получать гибридный бифункциональный полипептид CmAP/MBL-T с чистотой более 98% в качестве аналога маннан-связывающего лектина С-типа MBL-T, конъюгированного с ферментом, применяемого для проведения иммуноферментного анализа.- the use of ion-exchange, metal-affinity and gel filtration chromatography in the purification of a recombinant protein from an aqueous extract of cells of a recombinant producer strain allows one to obtain a hybrid bifunctional CmAP / MBL-T polypeptide with a purity of more than 98% as an analogue of mannan-binding MBL-T C-type lectin conjugated to an enzyme used for enzyme immunoassay.
ЛитератураLiterature
1. Чиссов В.И., Старинский В.В., Сотникова Е.Н. Ранняя диагностика онкологических заболеваний. М.: 1994. С.193.1. Chissov V.I., Starinsky V.V., Sotnikova E.N. Early diagnosis of cancer. M .: 1994. P.193.
2. Davina J.H.М., Stadhouders А.М., van Haelst U.J.G.М., Lamers G.E.М., Kenemans P. Concanavalin A Peroxidase labeling in cervical exfoliative cytopathology. Gynecologic Oncology, 1985. - Vol.22. - I.2. - P.212-223.2. Davina J.H.M., Stadhouders A.M., van Haelst U.J.G.M., Lamers G.E.M., Kenemans P. Concanavalin A Peroxidase labeling in cervical exfoliative cytopathology. Gynecologic Oncology, 1985 .-- Vol. 22. - I.2. - P.212-223.
3. Reddi A. L., Sankaranarayanan K., Arulraj H. S., Devaraj N., Devaraj Enzime-linked PNA lectin-binding assay of serum T-antigen in patient with SCC of the uterine cervix. Cancer letters - 2000. - Vol.149, - P.207-211.3. Reddi A. L., Sankaranarayanan K., Arulraj H. S., Devaraj N., Devaraj Enzime-linked PNA lectin-binding assay of serum T-antigen in patient with SCC of the uterine cervix. Cancer letters - 2000. - Vol. 149, - P.207-211.
4. A.A. Bulgakov, M.G. Eliseikina, I.Yu. Petrova, E.L. Nazarenko, S.N. Kovalchuk Isolation and properties of a mannan-bind ing lectin from the holothurian Apostichopus japonicus. Glycobiology 2007, V.17, №12, P.1284-1298.4. A.A. Bulgakov, M.G. Eliseikina, I.Yu. Petrova, E.L. Nazarenko, S.N. Kovalchuk Isolation and properties of a mannan-bind ing lectin from the holothurian Apostichopus japonicus. Glycobiology 2007, V.17, No. 12, P.1284-1298.
5. Aoyagi Y., Suzuki Y., Isemura М., Nomoto М., Sekini C., Igarashi K., Ichida F. The fucosylation of alfa-fetoprotein and its usefulness in the early diagnosis of hepatocellular carcinoma. Cancer, 1988. - Vol.61. - N.4. P.769-774.5. Aoyagi Y., Suzuki Y., Isemura M., Nomoto M., Sekini C., Igarashi K., Ichida F. The fucosylation of alfa-fetoprotein and its usefulness in the early diagnosis of hepatocellular carcinoma. Cancer, 1988 .-- Vol. 61. - N.4. P.769-774.
6. 24. Yuan C.C, Wang P.H., Ng H.T., Tsai L.C., Juang C.M., Chiu L.M. Both TPA and SCC-Ag levels are prognostic even in high-risk stage Ib-IIa cervical carcinoma as determined by a stratification analysis. Eur. J. Gynaecol Oncol. 2002; 23(1):17-20.6. 24. Yuan C.C., Wang P.H., Ng H.T., Tsai L.C., Juang C.M., Chiu L.M. Both TPA and SCC-Ag levels are prognostic even in high-risk stage Ib-IIa cervical carcinoma as determined by a stratification analysis. Eur. J. Gynaecol Oncol. 2002; 23 (1): 17-20.
7. Chi-Mou Juang M.D., Peng-Hui Wang M.D., Ming-Shien Yen M.D., Chiung-Ru Lai M.D., Heung-Tat Ng M.D. and Chiou-Chung Yuan M.D. Application of Tumor Markers CEA, TPA, and SCC-Ag in Patients with Low-Risk FIGO Stage IB and IIA Squamous Cell Carcinoma of the Uterine Cervix. Gynecologic Oncology. 2000; 76(1):103-106.7. Chi-Mou Juang M.D., Peng-Hui Wang M.D., Ming-Shien Yen M.D., Chiung-Ru Lai M.D., Heung-Tat Ng M.D. and Chiou-Chung Yuan M.D. Application of Tumor Markers CEA, TPA, and SCC-Ag in Patients with Low-Risk FIGO Stage IB and IIA Squamous Cell Carcinoma of the Uterine Cervix. Gynecologic Oncology. 2000; 76 (1): 103-106.
8. RU 2343485 C1, 10.01.2009.8. RU 2343485 C1, 01/10/2009.
9. RU 2447151 C1, 10.04.2012.9. RU 2447151 C1, 04/10/2012.
10. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т. // Molecular Cloning. A. Laboratory Manual. 2bd ed. Cold Spring Harbor, NY, 1989.10. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. // Molecular Cloning. A. Laboratory Manual. 2bd ed. Cold Spring Harbor, NY 1989.
Перечень нуклеотидных и аминокислотных последовательностей приведен в конце описания.A list of nucleotide and amino acid sequences is given at the end of the description.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013141777/10A RU2538169C1 (en) | 2013-09-11 | 2013-09-11 | RECOMBINANT PLASMID DNA pET40CmAP/MBL-T CODING HYBRID BIFUNCTIONAL POLYPEPTIDE CmAP/MBL-T WITH PROPERTIES OF HIGH-ACTIVITY ALKALINE PHOSPHATASE CmAP AND MANNAN-BINDING LECTIN OF C-TYPE MBL-T, RECOMBINANT STRAIN E coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/MBL-T - PRODUCER OF HYBRID BIFUNCTIONAL POLYPEPTIDE CmAP/MBL-T, AND METHOD FOR ITS OBTAINING |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013141777/10A RU2538169C1 (en) | 2013-09-11 | 2013-09-11 | RECOMBINANT PLASMID DNA pET40CmAP/MBL-T CODING HYBRID BIFUNCTIONAL POLYPEPTIDE CmAP/MBL-T WITH PROPERTIES OF HIGH-ACTIVITY ALKALINE PHOSPHATASE CmAP AND MANNAN-BINDING LECTIN OF C-TYPE MBL-T, RECOMBINANT STRAIN E coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/MBL-T - PRODUCER OF HYBRID BIFUNCTIONAL POLYPEPTIDE CmAP/MBL-T, AND METHOD FOR ITS OBTAINING |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2538169C1 true RU2538169C1 (en) | 2015-01-10 |
Family
ID=53287996
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013141777/10A RU2538169C1 (en) | 2013-09-11 | 2013-09-11 | RECOMBINANT PLASMID DNA pET40CmAP/MBL-T CODING HYBRID BIFUNCTIONAL POLYPEPTIDE CmAP/MBL-T WITH PROPERTIES OF HIGH-ACTIVITY ALKALINE PHOSPHATASE CmAP AND MANNAN-BINDING LECTIN OF C-TYPE MBL-T, RECOMBINANT STRAIN E coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/MBL-T - PRODUCER OF HYBRID BIFUNCTIONAL POLYPEPTIDE CmAP/MBL-T, AND METHOD FOR ITS OBTAINING |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2538169C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2634871C1 (en) * | 2016-08-03 | 2017-11-07 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук (ТИБОХ ДВО РАН) | RECOMBINANT PLASMID pET40CmAP/ MPF DNA, ENCODING BIFUNCTIONAL HYBRID CmAP/OmpF POLYPEPTIDE WITH PROPERTIES OF HIGHLY-ACTIVE ALKALINE PHOSPHATASE CmAP AND PORE-FORMING MEMBRANE OmpF PROTEIN, AND RECOMBINANT STRAIN OF E. COLI ROSETTA (DE3)/pET40CmAP/OmpF - PRODUCER OF BIFUNCTIONAL HYBRID CmAP/OmpF POLYPEPTIDE |
| CN110184320A (en) * | 2019-06-19 | 2019-08-30 | 青岛代山慧海生态科技有限公司 | A kind of preparation method of compound sea cucumber polypeptide |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020082209A1 (en) * | 1997-04-03 | 2002-06-27 | Jensenius Jens Chr. | MASP-2, a complement-fixing enzyme, and uses for it |
| RU2447181C1 (en) * | 2011-03-10 | 2012-04-10 | Учреждение Российской академии наук Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова РАН | Armor steel |
-
2013
- 2013-09-11 RU RU2013141777/10A patent/RU2538169C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020082209A1 (en) * | 1997-04-03 | 2002-06-27 | Jensenius Jens Chr. | MASP-2, a complement-fixing enzyme, and uses for it |
| RU2447181C1 (en) * | 2011-03-10 | 2012-04-10 | Учреждение Российской академии наук Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова РАН | Armor steel |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| GenBank: * |
| Найдено в Интернет по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov./protein/AAT42221, Найдено 03.06.2014. GenBank: * |
| Найдено в Интернет по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov./protein/ABD92772, Найдено 03.06.2014. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2634871C1 (en) * | 2016-08-03 | 2017-11-07 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук (ТИБОХ ДВО РАН) | RECOMBINANT PLASMID pET40CmAP/ MPF DNA, ENCODING BIFUNCTIONAL HYBRID CmAP/OmpF POLYPEPTIDE WITH PROPERTIES OF HIGHLY-ACTIVE ALKALINE PHOSPHATASE CmAP AND PORE-FORMING MEMBRANE OmpF PROTEIN, AND RECOMBINANT STRAIN OF E. COLI ROSETTA (DE3)/pET40CmAP/OmpF - PRODUCER OF BIFUNCTIONAL HYBRID CmAP/OmpF POLYPEPTIDE |
| CN110184320A (en) * | 2019-06-19 | 2019-08-30 | 青岛代山慧海生态科技有限公司 | A kind of preparation method of compound sea cucumber polypeptide |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hettwer et al. | Purification and characterization of an extracellular levansucrase from Pseudomonas syringae pv. phaseolicola | |
| JP5266265B2 (en) | Method for measuring hemoglobin A1c, enzyme used therefor and method for producing the same | |
| EA028490B1 (en) | Endoglycosidase from streptococcus pyogenes and methods using same | |
| KR101455624B1 (en) | Novel D-psicose-3-epimerase from Clostridium bolteae having production of functional rare sugar D-psicose and production method of D-psicose using thereof | |
| JP3905130B2 (en) | RECOMBINANT alpha -2,3-SIALYLTRANSFERASES AND THEIR USES | |
| RU2538169C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pET40CmAP/MBL-T CODING HYBRID BIFUNCTIONAL POLYPEPTIDE CmAP/MBL-T WITH PROPERTIES OF HIGH-ACTIVITY ALKALINE PHOSPHATASE CmAP AND MANNAN-BINDING LECTIN OF C-TYPE MBL-T, RECOMBINANT STRAIN E coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/MBL-T - PRODUCER OF HYBRID BIFUNCTIONAL POLYPEPTIDE CmAP/MBL-T, AND METHOD FOR ITS OBTAINING | |
| BRPI1013484B1 (en) | protease, dna, expression vector, transformed cell, and method for producing a protease | |
| CN108484779B (en) | Fusion protein of nano antibody and human placenta alkaline phosphatase and application | |
| Wolfe et al. | (3] Purification and characterization of leader peptidase from Escherichia coli | |
| JP7105761B2 (en) | Methods for Affinity Purification of Recombinant Proteins Based on the Lectin Activity of Galectin CRDs | |
| RU2557306C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pET40CmAP/CGL ENCODING HYBRID BIFUNCTIONAL POLYPEPTIDE CmAP/CGL WITH PROPERTIES OF HIGHLY ACTIVE ALKALINE PHOSPHATASE CmAP AND GALACTOSE SPECIFIC LECTIN CGL, RECOMBINANT STRAIN OF E coli Rosetta (DE3)/pET40CmAP/CGL - PRODUCER OF HYBRID BIFUNCTIONAL POLYPEPTIDE CmAP/CGL AND METHOD OF ITS PREPARATION | |
| RU2447151C1 (en) | ALKALINE PHOSPHATASE CmAP SYNTHESIS-DETERMINING 40Ph PLASMID, E. coli rosetta(DE3)/40Ph STRAIN - PRODUCER OF CHIMERIC PROTEIN, CONTAINING AMINO ACID SEQUENCE OF RECOMBINANT ALKALINE PHOSPHATASE CmAP, AND PRODUCTION METHOD THEREOF | |
| CN101730739A (en) | Polysialic acid transferring enzyme through engineered enzymic activity improvement | |
| KR101695741B1 (en) | The Sialic Acid-Specific Binding Affinity Lectin from the Mushroom Hericium erinaceum | |
| JP2007189905A (en) | Dna containing alkaliphilic cyclodextran synthase gene, recombinant dna and method for producing the alkaliphilic cyclodextran synthase | |
| KR101944857B1 (en) | A beta-agarase AgaJ11 from Gayadomonas joobiniege G7 and use thereof | |
| KR101842226B1 (en) | Mushroom Hericium erinaceus lectin specifically binding to core 1 O-linked glycan and uses thereof | |
| RU2606014C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pEFN877, DETERMINING EXPRESSION OF THE HYBRID POLYPEPTIDE WITH PROPERTIES OF 10-TH FIBRONECTIN DOMAIN ON THE SURFACE OF ESCHERICHIA COLI CELLS, AND STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA coli BL21(DE3)pLysS/pEFN877 - PRODUCER OF HYBRID POLYPEPTIDE WITH PROPERTIES OF 10-TH FIBRONECTIN DOMAIN ON THE CELLS SURFACE | |
| KR101673195B1 (en) | The Recombinant Sialic Acid-Specific Binding Lectin, PSL1b, from the Mushroom Polyporus squamosus | |
| JPWO2018052005A1 (en) | Modified sarcosine oxidase, gene and production method thereof | |
| RU2634871C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID pET40CmAP/ MPF DNA, ENCODING BIFUNCTIONAL HYBRID CmAP/OmpF POLYPEPTIDE WITH PROPERTIES OF HIGHLY-ACTIVE ALKALINE PHOSPHATASE CmAP AND PORE-FORMING MEMBRANE OmpF PROTEIN, AND RECOMBINANT STRAIN OF E. COLI ROSETTA (DE3)/pET40CmAP/OmpF - PRODUCER OF BIFUNCTIONAL HYBRID CmAP/OmpF POLYPEPTIDE | |
| US11739305B2 (en) | Sialyltransferase variants having neosialidase activity | |
| CN109765370B (en) | Prostate cancer diagnostic kit, preparation method and application | |
| CN108642024B (en) | CK-MB expression and purification method | |
| CN112048494A (en) | Preparation method of alpha-L-fucosidase |