RU2538149C2 - CELL OF MYCELIAL FUNGUS Penicillium canescens - XYLANASE AND LACCASE PRODUCENT, METHOD OF OBTAINING COMBINED EXYME XYLANASE AND LACCASE PREPARATION - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine, pharmaceutics.

SUBSTANCE: group of inventions relates to biotechnology. Claimed is cell of mycelial fungus Penicillium canescens with removed catabolite repression and arabinose induction, producing xylanase and laccase. Cell is transformed with plasmid, containing promoter of gene bgaS, bgaS leader peptide, xylanase-coding DNA fragment, bgaS terminator, β-lactamase gene and pMB1 replicon, and plasmid, which contains promoter of gene bgaS, bgaS leader peptide, laccase-coding DNA fragment, bgaS terminator, β-lactamase gene and pMB1 replicon. Also claimed is method of enzyme preparation of xylanase and laccase with application of said cell of Penicillium canescens.

EFFECT: group of inventions provides increased output of target enzymes.

10 cl, 9 dwg, 3 tbl, 4 ex

Description

Область техникиTechnical field

Изобретение относится к микробиологической промышленности, генной инженерии и биотехнологии, в частности, к новому штамму Penicillium canescens - продуценту совместного ферментного препарата ксиланазы и лакказы, и к способу получения указанного ферментного препарата с использованием указанного штамма.The invention relates to the microbiological industry, genetic engineering and biotechnology, in particular, to a new strain of Penicillium canescens - producer of a joint enzyme preparation of xylanase and laccase, and to a method for producing said enzyme preparation using said strain.

Описание предшествующего уровня техникиDescription of the Related Art

В настоящее время ферментные препараты в целлюлозно-бумажной промышленности наиболее широко используются при отбелке сульфатной целлюлозы, которая традиционно осуществляется при использовании хлорсодержащих соединений, большинство из которых являются устойчивым токсичными мутагенами. Для этой цели в мировой практике используются коммерческие ферментные препараты ксиланаз, однако постоянно ведутся исследования и других микробных ферментов, перспективных для применения в технологических процессах производства целлюлозы и бумаги. Такие микробные ферменты, как целлюлазы, ксиланазы, пектиназы, липазы, лакказы и их комбинации в совокупности с методами химической и термомеханической обработки могут быть использованы для получения целлюлозы, гемицеллюлозы, лигнина или лигноцеллюлозы из древесной пульпы.Currently, enzyme preparations in the pulp and paper industry are most widely used in the bleaching of sulfate pulp, which is traditionally carried out using chlorine-containing compounds, most of which are resistant toxic mutagens. For this purpose, commercial xylanase enzyme preparations are used in world practice, however, research is also ongoing on other microbial enzymes that are promising for use in technological processes of pulp and paper production. Microbial enzymes such as cellulases, xylanases, pectinases, lipases, laccases and their combination in combination with chemical and thermomechanical processing methods can be used to produce cellulose, hemicellulose, lignin or lignocellulose from wood pulp.

Эндоксиланазы являются ферментами, расщепляющими ксилан - основной компонент гемицеллюлоз. Эндоксиланазы находят промышленное применение в бумажной индустрии в процессах отбеливания, в пищевой и кормовой промышленности и других сферах (Kulkami N., Shendye A., Rao M. FEMS Microbiology Reviews, 1999, v.23, p.411).Endoxylanases are enzymes that break down xylan, the main component of hemicelluloses. Endoxylanases find industrial application in the paper industry in bleaching processes, in the food and feed industry, and other fields (Kulkami N., Shendye A., Rao M. FEMS Microbiology Reviews, 1999, v.23, p.411).

Лакказа (ЕС 1.10.3.2 пара-дифенол: кислород оксидредуктаза) является полифенолоксидазой, принадлежащей к семейству голубых оксидаз. Лакказа катализирует окисление редуцирующего субстрата за счет восстановления молекулярного кислорода до воды. Продукты реакции - свободные радикалы редуцирующего субстрата и вода. Обычными субстратами лакказы являются: о-, м-, п-фенолы с различными заместителями, полифенолы, ароматические амины. Недавно были открыты реакции лакказ с участием медиаторов, - низкомолекулярных соединений, повышающих эффективность лакказы в биодеградации лигнина, - устойчивых соединений различной структуры, включая ксенобиотики и вещества, загрязняющие окружающую среду.Laccase (EC 1.10.3.2 para-diphenol: oxygen oxidoreductase) is a polyphenol oxidase belonging to the blue oxidase family. Laccase catalyzes the oxidation of a reducing substrate by reducing molecular oxygen to water. The reaction products are free radicals of a reducing substrate and water. Common laccase substrates are: o-, m-, p-phenols with various substituents, polyphenols, aromatic amines. Recently, laccase reactions with the participation of mediators, low molecular weight compounds that increase the effectiveness of laccase in the biodegradation of lignin, have been discovered - stable compounds of various structures, including xenobiotics and environmental pollutants.

В последнее время интенсивно ведутся исследования по разработке стратегии использования ферментных препаратов совместного действия. Так в результате действия ксиланаз лигнин оказывается на поверхности и становится более доступным для воздействия лакказ, в результате чего происходит его деградация, приводя к улучшению качества делигнификации целлюлозно-бумажной пульпы. Однако в этих случаях используют либо смешивание двух отдельных ферментных препаратов лакказ и ксиланаз, либо проводят сокультивирование двух отдельных штаммов продуцентов этих ферментов. Комплексное действие препаратов ксиланаз и лакказ используют также в хлебопечении для повышения реологических свойств теста и качества выпекаемого из него хлеба.Recently, intensive studies are underway to develop a strategy for the use of enzyme preparations of joint action. So, as a result of the action of xylanase, lignin appears on the surface and becomes more accessible for exposure to laccase, resulting in its degradation, leading to an improvement in the quality of delignification of pulp and paper pulp. However, in these cases, either mixing two separate enzyme preparations of laccase and xylanase is used, or two separate strains of producers of these enzymes are co-cultivated. The combined effect of xylanase and laccase is also used in baking to increase the rheological properties of the dough and the quality of the bread baked from it.

Однако в настоящее время нет сообщений, описывающих получение генно-инженерных конструкций, позволяющих создавать высокоэффективные штаммы-продуценты для ко-экспрессии рекомбинантных ферментов, в частности лакказ и ксиланаз.However, there are currently no reports describing the production of genetic engineering constructs that allow the creation of highly effective producer strains for co-expression of recombinant enzymes, in particular laccase and xylanases.

Краткое описание изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

Целью настоящего изобретения являются создание высокоэффективного штамма Р. canescens - продуцента ксиланазы и лакказы и предоставление способа получения комбинированного ферментного препарата ксиланазы и лакказы.The aim of the present invention is the creation of a highly effective strain of P. canescens - producer of xylanase and laccase and the provision of a method for producing a combined enzyme preparation of xylanase and laccase.

Поставленная задача была решена путем создания штамма Pemcillium canescens РСА-10-4/I-7/12 niaD^-, трансформированного плазмидами pBGlac и pBGxylD, -продуцента ксиланазы и лакказы, а также разработки и оптимизации способа получения комбинированного ферментного препарата ксиланазы и лакказы с использованием указанного штамма.The problem was solved by creating a strain of Pemcillium canescens PCA-10-4 / I-7/12 niaD ^- transformed with plasmids pBGlac and pBGxylD, a producer of xylanase and laccase, as well as developing and optimizing a method for producing a combined enzyme preparation of xylanase and laccase using the specified strain.

Целью настоящего изобретения является предоставление клетки мицелиального гриба Penicillium canescens, трансформированная плазмидой, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий ксиланазу, и плазмидой, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий лакказу, -продуцента ксиланазы и лакказы.An object of the present invention is to provide a Penicillium canescens mycelial fungal cell transformed with a plasmid containing a xylanase-encoded DNA fragment and a plasmid containing a laccase-encoded xylanase and laccase producing fragment.

Также целью настоящего изобретения является предоставление клетки, описанной выше, в которой указанными плазмидами являются плазмиды pBGlac и pBGxylD, соответственно.It is also an object of the present invention to provide a cell as described above, wherein said plasmids are plasmids pBGlac and pBGxylD, respectively.

Также целью настоящего изобретения является предоставление клетки штамма Penicillium canescens РСА-10-4/1-7/12 niaD^-, трансформированного плазмидами pBGlac и pBGxylD, - продуцента лакказы С1 лигнинолитического гриба Trametes hirsuta и ксиланазы XylD мицелиального гриба Penicillium canescens.It is also an object of the present invention to provide cells of the Penicillium canescens strain PCA-10-4 / 1-7 / 12 niaD ^- transformed with plasmids pBGlac and pBGxylD, the producer of laccase C1 of the ligninolytic fungus Trametes hirsuta and xylanase XylD of the mycelial fungus Penicillium canescens.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения ферментного препарата ксиланазы и лакказы, включающего стадии выращивания клеток мицелиального гриба Penicillium canescens, описанного выше, в питательной среде и выделения ферментного препарата ксиланазы и лакказы из культуральной жидкости.It is also an object of the present invention to provide a method for producing an enzyme preparation of xylanase and laccase, comprising the steps of growing cells of the mycelial fungus Penicillium canescens described above in a nutrient medium and isolating the enzyme preparation xylanase and laccase from the culture fluid.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа, описанного выше, где в качестве клеток мицелиального гриба используют клетки штамма Penicillium canescens, описанного выше.It is also an object of the present invention to provide the method described above, wherein cells of the Penicillium canescens strain described above are used as the cells of the mycelial fungus.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором выращивание клеток Penicillium canescens осуществляют в присутствии ингибиторов металлопротеиназ.It is also an object of the present invention to provide the method described above, in which the growth of Penicillium canescens cells is carried out in the presence of metalloproteinase inhibitors.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором в качестве ингибитора металлопротеиназ используют ЭДТА.It is also an object of the present invention to provide the method described above, in which EDTA is used as an inhibitor of metalloproteinases.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором выращивание клеток Penicillium canescens осуществляют в среде с рН в интервале 5.0-6.5.Another objective of the present invention is the provision of the above method, in which the cultivation of Penicillium canescens cells is carried out in a medium with a pH in the range of 5.0-6.5.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способ, в котором выделение ферментных препаратов ксиланазы и лакказы из культуральной жидкости осуществляют путем концентрирования с использованием ультрафильтрации на мембране с порогом отсечения 5 кДа с последующим вакуум-выпариванием фильтрата культуральной жидкости при температуре 40-70°С.It is also an object of the present invention to provide the method described above, in which the isolation of xylanase and laccase enzyme preparations from the culture fluid is carried out by concentration using ultrafiltration on a membrane with a cut-off threshold of 5 kDa, followed by vacuum evaporation of the culture fluid filtrate at a temperature of 40-70 ° C.

Настоящее изобретение позволяет реализовать технологию получения отечественных рекомбинантных высокопродуктивных штаммов продуцентов ферментов, в частности ксиланаз и лакказ, предназначенных для использования в крупнотоннажных промышленных процессах, так и технологию получения комбинированного ферментного препарата ксиланазы и лакказы для использования в целлюлозно-бумажной промышленности для отбеливания целлюлозы.The present invention makes it possible to implement a technology for producing domestic recombinant highly productive strains of enzyme producers, in particular xylanases and laccase, intended for use in large-capacity industrial processes, and a technology for producing a combined enzyme preparation xylanase and laccase for use in the pulp and paper industry for bleaching pulp.

Краткое описание рисунковBrief Description of Drawings

На Фиг.1 приведена карта плазмиды pPCG2.6. Указаны использованные сайты рестрикции, промотор, кодирующая часть, сигнальный пептид и терминатор гена bgaS, ген устойчивости в ампицилину bla и область, обеспечивающая репликацию плазмиды в Е. coli.Figure 1 shows a map of the plasmid pPCG2.6. The restriction sites used, the promoter, the coding part, the signal peptide and terminator of the bgaS gene, the resistance gene to bla ampicillin and the region that ensures plasmid replication in E. coli are indicated.

На Фиг.2 приведена карта экспрессионного вектора pPCGMX. Указаны использованные сайты рестрикции, промотор, кодирующая часть, сигнальный пептид и терминатор гена bgaS, ген устойчивости в ампицилину bla и область, обеспечивающая репликацию плазмиды в Е. coli.Figure 2 shows a map of the expression vector pPCGMX. The restriction sites used, the promoter, the coding part, the signal peptide and terminator of the bgaS gene, the resistance gene to bla ampicillin and the region that ensures plasmid replication in E. coli are indicated.

На Фиг.3 изображен поли-линкер перед стоп-кодоном гена bgaS из Р. canescens в экспрессионном векторе pPCGMX.Figure 3 shows the poly linker in front of the stop codon of the bgaS gene from P. canescens in the pPCGMX expression vector.

На Фиг.4 приведена карта экспрессионной плазмиды pBGlac. Указаны использованные сайты рестрикции, промотор, сигнальный пептид и терминатор гена bgaS, кодирующая последовательность гена lad из Т. hirsuta без сигнального пептида, ген устойчивости в ампицилину bla и область, обеспечивающая репликацию плазмиды в Е. coli.Figure 4 shows a map of the expression plasmid pBGlac. The restriction sites used, the promoter, the signal peptide and the terminator of the bgaS gene, encoding the lad gene sequence from T. hirsuta without the signal peptide, the resistance gene to ampicillin bla, and the region for plasmid replication in E. coli are indicated.

На Фиг.5 приведена карта экспрессионной плазмиды pBGxylD. Указаны использованные сайты рестрикции, промотор, сигнальный пептид и терминатор гена bgaS, кодирующая последовательность гена xylD из Р. canescens без сигнального пептида, ген устойчивости в ампицилину bla и область, обеспечивающая репликацию плазмиды в Е. coli.Figure 5 shows a map of the expression plasmid pBGxylD. The restriction sites used, the promoter, the signal peptide and the terminator of the bgaS gene, coding for the xylD gene sequence from P. canescens without the signal peptide, the resistance gene to bla ampicillin and the region for plasmid replication in E. coli are indicated.

На Фиг.6 приведена карта плазмиды pXRSlXh. Указаны кодирующие области генов xlnR из Р. canescens и bla устойчивости к ампицилину из Е. coli, терминатор гена xlnR, плазмидный и фаговый репликоны rep(pMB1) и f1(IG), соответственно. Также показаны использованные сайты рестрикции.Figure 6 shows a map of plasmid pXRSlXh. The coding regions of xlnR genes from P. canescens and bla ampicillin resistance from E. coli, the xlnR gene terminator, plasmid and phage replicons rep (pMB1) and f1 (IG), respectively, are indicated. The restriction sites used are also shown.

На Фиг.7 приведена карта плазмиды pGpdXlnR. Указаны конститутивный промотор TWugpdA глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы из A nidulans, кодирующие области генов xlnR из Р. canescens и bla устойчивости к ампицилину из Е. coli, терминатор генах xlnR, плазмидный и фаговый репликоны rep(pMB1) и f1(IG), соответственно. Показаны использованные сайты рестрикции.Figure 7 shows a map of plasmid pGpdXlnR. The constitutive TWugpdA promoter of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from A nidulans, coding regions of xlnR genes from P. canescens and bla ampicillin resistance from E. coli, xlnR gene terminator, plasmid and phage replicons rep (pMB1) and f1 (IG) , respectively. Shows used restriction sites.

На Фиг.8 приведено графическое представление количества копий генов lac1 из Т. hirsuta и xylD из Р. canescens в трансформантах 17, 47,110,180, определенное методом ПЦР РВ.Fig. 8 is a graphical representation of the number of copies of the lac1 genes from T. hirsuta and xylD from P. canescens in transformants 17, 47, 110, 180, determined by PCR.

На Фиг.9 показано накопление активностей ксиланазы и лакказы в ходе ферментации.Figure 9 shows the accumulation of xylanase and laccase activities during fermentation.

Подробное описание настоящего изобретенияDetailed description of the present invention

Для реализации настоящего изобретения главной технической задачей явилось создание штаммов мицелиального гриба Penicillium canescens - продуцентов рекомбинантной лакказы С1 лигнинолитического гриба Trametes hirsuta и ксиланазы XylD мицелиального гриба Penicillium canescens, способных к эффективной продукции и секреции активных целевых белков в культуральную жидкость. Поставленная задача была решена путем конструирования на основе экспрессионного вектора pPCGMX (Пример 1) рекомбинантных плазмид pBGlac и pBGxylD, содержащих гены, кодирующие синтез лакказы С1 лигнинолитического гриба Trametes hirsuta и ксиланазы XylD мицелиального гриба Penicillium canescens, соответственно, а также штамма Penicillium canescens РСА-10-4/1-7/12 niaD^-, трансформированного указанными плазмидами pBGlac и pBGxylD и обеспечивающего синтез и продукцию в секретируемой растворимой форме активной лакказы С1 лигнинолитического гриба Trametes hirsuta и активной и ксиланазы XylD мицелиального гриба Penicillium canescens. Поставленная задача также была решена путем разработки и оптимизации способа получения комбинированного ферментного препарата указанных ксиланазы и лакказы с использованием указанного штамма.To implement the present invention, the main technical task was the creation of strains of the mycelial fungus Penicillium canescens - producers of the recombinant C1 laccase of the ligninolytic fungus Trametes hirsuta and XylD xylanase of the mycelial fungus Penicillium canescens, capable of efficient production and secretion of active target proteins into the culture fluid. The problem was solved by constructing, on the basis of the expression vector pPCGMX (Example 1), recombinant plasmids pBGlac and pBGxylD containing genes encoding the synthesis of laccase C1 of the ligninolytic fungus Trametes hirsuta and xylanase XylD of the mycelial fungus Penicillium canescens, and 10 as well as -4 / 1-7 / 12, niaD ^-, transformed with these plasmids and pBGlac pBGxylD and providing the synthesis and production in a soluble form secreted active laccase C1 ligninolytic fungus Trametes hirsuta and active xylanase and filamentous XylD of the fungus Penicillium canescens. The problem was also solved by developing and optimizing a method for producing a combined enzyme preparation of the indicated xylanase and laccase using the specified strain.

Кксиланазы являются ферментами, расщепляющими ксилан - основной компонент гемицеллюлоз. Для мицелиального гриба Penicillium canescens известна эндо-1,4-β-D-ксиланаза (Ху1А), а также описаны штаммы гриба Penicillium canescens ВКПМ F-832 (патент РФ 2197526) и ВКПМ F-912 (патент РФ №2293115) - продуценты секретируемой эндо-(1-4)-β-D-ксиланазы. Недавно авторы настоящего изобретения обнаружили другие эндо-1-4-β-D-ксиланазы, XylB, XylC, XylD и XylE, 10-го и 11-го семейств гликозил-гидролаз мицелиального триба Penicillium canescens (патент РФ №2412246).Xylanases are xylan-cleaving enzymes, the main component of hemicelluloses. For mycelial fungus Penicillium canescens, endo-1,4-β-D-xylanase (Hu1A) is known, and strains of the fungus Penicillium canescens VKPM F-832 (RF patent 2197526) and VKPM F-912 (RF patent No. 2293115) are described as producers secreted endo (1-4) -β-D-xylanase. Recently, the inventors of the present invention found other endo-1-4-β-D-xylanases, XylB, XylC, XylD and XylE, of the 10th and 11th families of the glycosyl hydrolases of the mycelial tribe Penicillium canescens (RF patent No. 2412246).

Лакказа (ЕС 1.10.3.2 пара-дифенол: кислород оксидредуктаза) является полифенолоксидазой, принадлежащей к семейству голубых оксидаз. Лакказа катализирует окисление редуцирующего субстрата за счет восстановления молекулярного кислорода до воды. Продукты реакции - свободные радикалы редуцирующего субстрата и вода. Обычными субстратами лакказы являются: о-, м-, п-фенолы с различными заместителями, полифенолы, ароматические амины. Основные физико-химические характеристики мажорной изоформы лакказы, секретируемой грибом Trametes hirsuta 072 были недавно описаны, ген этой изоформы был клонирован, и его нуклеотидная последовательность была определена (Ребриков, Д.Н. и др. Прикладная биохимия и микробиология, 42, 6, 645-653 (2006)). Также получение индивидуальной рекомбинантной лакказы С1 лигнинолитического гриба Trametes hirsuta, обладающей высокой каталитической активностью, с использованием штаммов мицелиальных грибов Penicillium canescens недавно описано авторами настоящего изобретения (патент РФ №2394912).Laccase (EC 1.10.3.2 para-diphenol: oxygen oxidoreductase) is a polyphenol oxidase belonging to the blue oxidase family. Laccase catalyzes the oxidation of a reducing substrate by reducing molecular oxygen to water. The reaction products are free radicals of a reducing substrate and water. Common laccase substrates are: o-, m-, p-phenols with various substituents, polyphenols, aromatic amines. The main physicochemical characteristics of the major isoform of laccase secreted by the fungus Trametes hirsuta 072 were recently described, the gene of this isoform was cloned, and its nucleotide sequence was determined (Rebrikov, D.N. et al. Applied Biochemistry and Microbiology, 42, 6, 645 -653 (2006)). Also, the preparation of an individual recombinant C1 laccase of the ligninolytic fungus Trametes hirsuta, which has high catalytic activity, using Penicillium canescens strains of mycelial fungi has recently been described by the authors of the present invention (RF patent No. 2394912).

Фрагментом ДНК, кодирующим эндо-1,4-β-D-ксиланазу XylD, является, но не ограничивается им, ген xylD, описанный в патенте РФ №2412246. Структура гена, кодирующего эндо-1,4-β-D-ксиланазу XylD мицелиального гриба Penicillium canescens, его последовательность нуклеотидов и последовательность аминокислот лакказы С1 представлены в патенте РФ №2412246.The DNA fragment encoding XylD endo-1,4-β-D-xylanase is, but is not limited to, the xylD gene described in RF patent No. 2412246. The structure of the gene encoding the endo-1,4-β-D-xylanase XylD of the mycelial fungus Penicillium canescens, its nucleotide sequence and the amino acid sequence of laccase C1 are presented in RF patent No. 2412246.

Фрагментом ДНК, кодирующим лакказу С1 лигнинолитического гриба Trametes hirsuta, является, но не ограничивается им, ген мажорной лакказы, описанный в статье Ребрикова, Д.Н. и др. (Прикладная биохимия и микробиология, 42, 6, 645-653 (2006)). Структура гена, кодирующего лакказу С1 лигнинолитического гриба Trametes hirsuta, его последовательность нуклеотидов и последовательность аминокислот лакказы С1 представлены в патенте РФ №2394912.The DNA fragment encoding C1 laccase of the ligninolytic fungus Trametes hirsuta is, but is not limited to, the major laccase gene described in the article by D. D. Rebrikov. et al. (Applied Biochemistry and Microbiology, 42, 6, 645-653 (2006)). The structure of the gene encoding laccase C1 of the ligninolytic fungus Trametes hirsuta, its nucleotide sequence and the amino acid sequence of laccase C1 are presented in RF patent No. 2394912.

Указанные фрагменты ДНК также могут кодировать варианты эндо-1,4-β-D-ксиланазы XylD мицелиального гриба Penicillium canescens и лакказу С1 лигнинолитического гриба Trametes hirsuta, соответственно.These DNA fragments can also encode variants of the endo-1,4-β-D-xylanase XylD of the mycelial fungus Penicillium canescens and laccase C1 of the ligninolytic fungus Trametes hirsuta, respectively.

Термин «вариант» в значении, в котором он используется в настоящем изобретении, означает белок, который имеет изменения в аминокислотной последовательности, а именно делеции, вставки, добавления или замены аминокислот, при условии, что при этом сохраняется необходимый уровень активности белка, например, как минимум 10% от активности целевого фермента. Ряд изменений в варианте белка зависит от положения или от типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Количество изменений может составлять от 1-го до 30-ти, предпочтительно от 1-го до 15-ти и наиболее предпочтительно от 1-го до 5-ти изменений в последовательности соответствующих белков. Эти изменения могут иметь место в областях белка, которые не являются критичными для его функции. Это возможно благодаря тому, что аминокислоты обладают высокой гомологией друг с другом, и поэтому третичная структура или активность белка не нарушаются при таком изменении. Поэтому в качестве варианта белка может выступать белок, который имеет гомологию не менее чем 70%, предпочтительно не менее чем 80%, более предпочтительно, не менее чем 90% и наиболее предпочтительно, не менее чем 95% по отношению к полной аминокислотной последовательности белка при условии, что активность белка сохраняется. Гомология между аминокислотными последовательностями может быть установлена с использованием хорошо известных методов, например с помощью выравнивания последовательностей в компьютерной программе BLAST 2.0, которая вычисляет три параметра: счет, идентичность и сходство.The term "variant" in the sense in which it is used in the present invention means a protein that has changes in the amino acid sequence, namely, deletion, insertion, addition or replacement of amino acids, provided that this maintains the necessary level of protein activity, for example, at least 10% of the activity of the target enzyme. A number of changes in the variant of the protein depends on the position or type of amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein. The number of changes can be from 1 to 30, preferably from 1 to 15, and most preferably from 1 to 5 changes in the sequence of the corresponding proteins. These changes can occur in areas of the protein that are not critical to its function. This is possible due to the fact that amino acids have high homology with each other, and therefore the tertiary structure or activity of the protein is not violated by such a change. Therefore, as a variant of the protein can be a protein that has a homology of not less than 70%, preferably not less than 80%, more preferably not less than 90% and most preferably not less than 95% with respect to the total amino acid sequence of the protein at provided that the protein activity is maintained. Homology between amino acid sequences can be established using well-known methods, for example, using sequence alignment in the BLAST 2.0 computer program, which calculates three parameters: count, identity, and similarity.

Замена, делеция, вставка, добавление или замена одного или нескольких аминокислотных остатков будут представлять собой консервативную мутацию или консервативные мутации при условии, что активность белка при этом сохраняется. Примером консервативной мутации(ий) является консервативная замена(ы). Примеры консервативных замен включают замену Ala на Ser или Thr, замену Arg на Gln, His или Lys, замену Asn на Glu, Gln, Lys, His или Asp, замену Asp на Asn, Glu или Gln, замену Cys на Ser или Ala, замену Gln на Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg, замену Glu на Asn, Gln, Lys или Asp, замену Gly на Pro, замену His на Asn, Lys, Gln, Arg или Tyr, замену Ile на Leu, Met, Val или Phe, замену Leu на Ile, Met, Val или Phe, замену Lys на Asn, Glu, Gln, His или Arg, замену Met на Ile, Leu, Val или Phe, замену Phe на Trp, Tyr, Met, Ile или Leu, замену Ser на Thr или Ala, замену Thr на Ser или Ala, замену Trp на Phe или Tyr, замену Tyr на His, Phe или Trp и замену Val на Met, Ile или Leu.Substitution, deletion, insertion, addition or replacement of one or more amino acid residues will be a conservative mutation or conservative mutations, provided that the protein activity is maintained. An example of a conservative mutation (s) is a conservative substitution (s). Examples of conservative substitutions include replacing Ala with Ser or Thr, replacing Arg with Gln, His or Lys, replacing Asn with Glu, Gln, Lys, His or Asp, replacing Asp with Asn, Glu or Gln, replacing Cys with Ser or Ala, replacing Gln with Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg, replacing Glu with Asn, Gln, Lys or Asp, replacing Gly with Pro, replacing His with Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr, replacing Ile with Leu, Met, Val or Phe, replace Leu with Ile, Met, Val or Phe, replace Lys with Asn, Glu, Gln, His or Arg, replace Met with Ile, Leu, Val or Phe, replace Phe with Trp, Tyr, Met, Ile or Leu, replacing Ser with Thr or Ala, replacing Thr with Ser or Ala, replacing Trp with Phe or Tyr, replacing Tyr with His, Phe or Trp, and replacing Val with Met, Ile or Leu.

Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же функциональный белок, могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, кодирующего белок, например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что один или несколько аминокислотных остатков в определенном сайте будут делетированы, заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные, как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации.DNA fragments that encode essentially the same functional protein can be obtained, for example, by modifying the nucleotide sequence of a DNA fragment encoding a protein, for example, using the site-directed mutagenesis method, so that one or more amino acid residues at a particular site are deleted replaced, inserted or added. DNA fragments modified as described above can be obtained using traditional processing methods to obtain mutations.

Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же функциональный белок, могут быть получены путем экспрессии фрагментов ДНК, имеющих мутацию, описанную выше, в соответствующей клетке, и установления активности экспрессируемого продукта. Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же функциональный белок, также могут быть получены путем выделения фрагментов ДНК, которые гибридизуются с зондами, имеющими нуклеотидную последовательность, которая содержит, например, нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, в жестких условиях, и кодирует белок, обладающие активностью целевого белка. "Жесткие условия", в том значении, которое приписывается этому выражению в рамках настоящего изобретения, означает такие условия, при которых так называемые специфические гибриды образуются, а неспецифические гибриды не образуются. Например, демонстрацией жестких условий могут быть такие условия, при которых фрагменты ДНК, имеющие высокую гомологию, например фрагменты ДНК, имеющие гомологию не менее чем 50%, предпочтительней не менее чем 60%, более предпочтительней не менее чем 70%, еще более предпочтительней не менее, чем 80%, еще более предпочтительней не менее чем 90% и наиболее предпочтительней не менее чем 95% способны гибридизоваться друг с другом, а фрагменты ДНК, имеющие гомологию более низкую, чем описано выше, неспособны гибридизоваться друг с другом. Кроме того, демонстрацией жестких условий могут служить такие условия, при которых фрагменты ДНК гибридизуются при концентрации соли, эквивалентной условиям однократной отмывки при гибридизации по Саузерну, которые составляют 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS, при 60°С. Продолжительность отмывки зависит от типа мембраны, используемой для блотинга и, как правило, рекомендуется производителем набора. Например, рекомендуемая продолжительность отмывки для мембраны HybondTM N⁺ nylon (Amersham, США), в жестких условиях составляет приблизительно 15 минут. Желательно отмывку повторять 2-3 раза. В качестве зондов может быть также использована неполная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок. Зонды могут быть приготовлены с помощью ПЦР с использованием праймеров, синтезированных на основе этой нуклеотидной последовательности и на основе фрагментов ДНК, содержащих эту нуклеотидную последовательность в качестве матрицы. В тех случаях, когда фрагмент ДНК, имеющий длину около 300 п.о., используется в качестве зонда, условия отмывки в процессе гибридизации включают, например, 50°С, 2×SSC и 0.1% SDS.DNA fragments that encode essentially the same functional protein can be obtained by expressing DNA fragments having the mutation described above in the appropriate cell and establishing the activity of the expressed product. DNA fragments that encode essentially the same functional protein can also be obtained by isolating DNA fragments that hybridize with probes having a nucleotide sequence that contains, for example, a nucleotide sequence encoding a protein under stringent conditions, and encodes a protein having activity of the target protein. "Stringent conditions", as used in this expression in the framework of the present invention, means those conditions under which the so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, a demonstration of stringent conditions may be conditions under which DNA fragments having high homology, for example, DNA fragments having a homology of not less than 50%, more preferably not less than 60%, more preferably not less than 70%, even more preferably not less than 80%, even more preferably not less than 90%, and most preferably not less than 95% are able to hybridize with each other, and DNA fragments having a homology lower than described above are unable to hybridize with each other. In addition, conditions that can be used to demonstrate stringent conditions are those under which the DNA fragments hybridize at a salt concentration equivalent to the single wash conditions for Southern hybridization, which are 1 × SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 × SSC, 0.1% SDS, at 60 ° C. The duration of washing depends on the type of membrane used for blotting and is generally recommended by the kit manufacturer. For example, the recommended washing time for a HybondTM N ⁺ nylon membrane (Amersham, USA) under severe conditions is approximately 15 minutes. It is advisable to repeat the washing 2-3 times. An incomplete nucleotide sequence encoding a protein can also be used as probes. Probes can be prepared by PCR using primers synthesized based on this nucleotide sequence and based on DNA fragments containing this nucleotide sequence as a template. In cases where a DNA fragment having a length of about 300 bp is used as a probe, washing conditions during the hybridization process include, for example, 50 ° C, 2 × SSC and 0.1% SDS.

Замена, делеция, вставка или добавление нуклеотидов, так как они описаны выше, также включает мутации, которые имеют место в природе (мутант или вариант), например, обусловленные видовой изменчивостью.Substitution, deletion, insertion or addition of nucleotides, as described above, also includes mutations that occur in nature (mutant or variant), for example, due to species variation.

Показатели функциональной активности, при которой считается, что полученный белок обладает свойствами эндо-1-4-β-D-ксиланазы, определяются по его способности катализировать гидролиз ксилана, расположенного на поверхности целлюлозных волокон. Так, например, активность эндо-1-4-β-D-ксиланазы в культуральной жидкости определяют по количеству восстанавливающих сахаров, выделяемых при гидролизе березового ксилана. Инкубацию субстрата и фермента проводят при 50°С в течение 10 мин. За единицу активности принимают количество фермента, высвобождающее 1 мкмоль/мин восстанавливающих сахаров при указанных выше условиях. Восстанавливающие сахара определяют, например, методом Шомоди-Нельсона (Синицин А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В.М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. М., Изд-во МГУ, 1995). Считается, что вариант белка обладает свойствами эндо-1-4-β-D-ксиланазы при условии, что активность указанного варианта составляет не ниже 10% активности нативной эндо-1-4-β-D-ксиланазы.Indicators of functional activity, in which it is believed that the obtained protein has the properties of endo-1-4-β-D-xylanase, are determined by its ability to catalyze the hydrolysis of xylan, located on the surface of cellulose fibers. So, for example, the activity of endo-1-4-β-D-xylanase in the culture fluid is determined by the amount of reducing sugars released during the hydrolysis of birch xylan. Incubation of the substrate and the enzyme is carried out at 50 ° C for 10 minutes The unit of activity is the amount of enzyme releasing 1 μmol / min of reducing sugars under the above conditions. Reducing sugars are determined, for example, by the Shomody-Nelson method (Sinitsin A.P., Gusakov A.V., Chernoglazov V.M. Bioconversion of lignocellulosic materials. M., Moscow State University Publishing House, 1995). It is believed that the protein variant has the properties of endo-1-4-β-D-xylanase, provided that the activity of this variant is not less than 10% of the activity of native endo-1-4-β-D-xylanase.

Показатели функциональной активности, при которой считается, что полученный белок обладает свойствами лакказы, определяются по его способности окислять различные субстраты фенольной природы, такие, например, как о-, м-, н-фенолы с различными заместителями, полифенолы, ароматические амины. Также лакказы способны, повышающих эффективность биодеградации лигнина и устойчивых ароматических ксенобиотиков в присутствии медиаторов. Так, например, активность лакказы можно детектировать спектрофотометрически при 410 нм, используя в качестве хромогенного субстрата 10 мМ раствор пирокатехина в 0,1 М Na-ацетатном буфере, рН 4,9, при этом за "условную единицу активности" принимают увеличение оптической плотности в 1 мл реакционной смеси за 1 мин, пересчитанной на 1 мг вносимого белка (Ребриков, Д.Н. и др. Прикладная биохимия и микробиология, 42, 6, 645-653 (2006)).Indicators of functional activity, in which it is believed that the obtained protein has laccase properties, are determined by its ability to oxidize various phenolic substrates, such as, for example, o-, m-, n-phenols with various substituents, polyphenols, aromatic amines. Laccases are also capable of increasing the efficiency of lignin biodegradation and stable aromatic xenobiotics in the presence of mediators. For example, laccase activity can be detected spectrophotometrically at 410 nm using a 10 mM solution of pyrocatechol in 0.1 M Na-acetate buffer, pH 4.9 as a chromogenic substrate, and the increase in optical density is taken as the “standard unit of activity” 1 ml of the reaction mixture in 1 min, counted per 1 mg of the introduced protein (Rebrikov, D.N. et al. Applied Biochemistry and Microbiology, 42, 6, 645-653 (2006)).

Активность лакказы также можно определить по измерению начальных скоростей ферментативной реакции с помощью кислородного электрода Кларка в ячейке объемом 0,7 мл при 25°С и постоянном перемешивании. В качестве органического субстрата используют 10 мМ раствор пирокатехина в 0,015 М фосфатном буфере, рН 4,9. Концентрацию кислорода в растворе принимают равной 260 мкМ (согласно значению коэффициента Генри, 773 атм/моль×кг воды). Активность лакказы выражают в мкмолях поглощенного кислорода на 1 мг белка за 1 мин. Считается, что вариант белка обладает свойствами лакказы при условии, что активность указанного варианта составляет не ниже 10% активности нативной лакказы.Laccase activity can also be determined by measuring the initial rates of the enzymatic reaction using a Clark oxygen electrode in a 0.7 ml cell at 25 ° C with constant stirring. A 10 mM solution of pyrocatechol in 0.015 M phosphate buffer, pH 4.9, is used as an organic substrate. The oxygen concentration in the solution is taken equal to 260 μM (according to the value of the Henry coefficient, 773 atm / mol × kg of water). Laccase activity is expressed in micromoles of absorbed oxygen per 1 mg of protein for 1 min. It is believed that the protein variant has the properties of laccase, provided that the activity of this variant is not less than 10% of the activity of native laccase.

Рекомбинантная плазмида согласно настоящему изобретению содержит фрагмент ДНК, кодирующий эндо-1,4-β-В-ксиланазу XylD мицелиального гриба Penicillium canescens или ее вариант, под контролем промотора, функционирующего в эукариотической клетке.The recombinant plasmid according to the present invention contains a DNA fragment encoding the endic-1,4-β-B-xylanase XylD of the mycelial fungus Penicillium canescens or its variant, under the control of a promoter that functions in a eukaryotic cell.

Другая рекомбинантная плазмида согласно настоящему изобретению содержит фрагмент ДНК, кодирующий лакказу С1 лигнинолитического гриба Trametes hirsuta или ее вариант, под контролем промотора, функционирующего в эукариотической клетке.Another recombinant plasmid according to the present invention contains a DNA fragment encoding C1 laccase of the ligninolytic fungus Trametes hirsuta or its variant, under the control of a promoter that functions in a eukaryotic cell.

В качестве рекомбинантных плазмид согласно настоящему изобретению могут быть использованы любые бактериальные плазмиды, такие, например, как pBGxylD и pBGlac, но список плазмид не ограничивается ими.Any bacterial plasmid, such as, for example, pBGxylD and pBGlac, can be used as recombinant plasmids of the present invention, but the list of plasmids is not limited to them.

Рекомбинантная плазмида pBGxylD была сконструирована путем клонирования гена, кодирующего ксиланазу xylD и содержащего кодирующую последовательность без сигнального пептида и стоп-кодона, в плазмиду pPCGMX (см. Пример 1), содержащую полный ген bgaS β-галактозидазы Penicillium canescens, несущий уникальный сайт рестрикции Bspl20I непосредственно после про-области гена bgaS и область линкера перед стоп-кодоном, несущую уникальные сайты MluI, Bsp68I и XhoI.The recombinant plasmid pBGxylD was constructed by cloning a gene that encodes xylD xylanase and containing the coding sequence without a signal peptide and stop codon into the pPCGMX plasmid (see Example 1) containing the complete Penicillium canescens b20S β-galactosidase gene directly carrying the unique B20 site of restriction with the unique site of restriction after the pro-region of the bgaS gene and the linker region in front of the stop codon carrying the unique MluI, Bsp68I and XhoI sites.

Аналогичным образом была получена рекомбинантная плазмида pBGlac путем клонирования гена, кодирующего лакказу С1 без сигнального пептида и стоп-кодона, в плазмиду pPCGMX.Similarly, a recombinant plasmid pBGlac was obtained by cloning a gene encoding laccase C1 without a signal peptide and stop codon into plasmid pPCGMX.

При введении данных плазмид в клетку достигается высокий уровень транскрипции генов, кодирующих целевые ферменты, благодаря использованию высокоэффективного промотора гена β-галактозидазы.When these plasmids are introduced into the cell, a high level of transcription of genes encoding the target enzymes is achieved due to the use of the highly efficient promoter of the β-galactosidase gene.

В структуру экспрессионных кассет входят нуклеотидная последовательность, содержащая промотор гена β-галактозидазы, последовательность сигнального пептида гена β-галактозидазы Penicillium canescens; последовательность ДНК, кодирующая целевой белок или его вариант; и область терминации транскрипции гена β-галактозидазы Penicillium canescens. При введении данной плазмиды в клетку достигается высокий уровень транскрипции гена, кодирующего целевой белок, благодаря использованию высокоэффективного промотора гена β-галактозидазы.The structure of expression cassettes includes a nucleotide sequence containing a promoter of the β-galactosidase gene, a sequence of the signal peptide of the β-galactosidase gene Penicillium canescens; a DNA sequence encoding a target protein or its variant; and the transcription termination region of the β-galactosidase gene of Penicillium canescens. When this plasmid is introduced into the cell, a high level of transcription of the gene encoding the target protein is achieved due to the use of the highly efficient promoter of the β-galactosidase gene.

При помощи созданных плазмид можно трансформировать любую эукариотическую клетку, восприимчивую к подобной трансформации указанными плазмидами. Выбор клетки не является критическим, поскольку методология и приемы трансформации хорошо известны специалисту в данной области техники. И хотя в зависимости от вида клетки и условий культивирования полученного трансформанта уровень экспрессии целевого белка может варьироваться, факт экспрессии целевого белка будет иметь место при условии успешной трансформации клетки-реципиента.Using the created plasmids, any eukaryotic cell susceptible to such transformation with the indicated plasmids can be transformed. Cell selection is not critical, as the methodology and methods of transformation are well known to those skilled in the art. Although the level of expression of the target protein may vary depending on the type of cell and culturing conditions of the obtained transformant, the fact of expression of the target protein will take place subject to successful transformation of the recipient cell.

«Трансформация клетки плазмидой» означает введение плазмиды в клетку с помощью методов, хорошо известных специалисту в данной области техники. Трансформация этой плазмидой приводит к усилению экспрессии гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению, и к увеличению активности белка в бактериальной клетке. Методы трансформации включают любые стандартные методы, известные специалисту в данной области техники."Transformation of a cell with a plasmid" means the introduction of a plasmid into a cell using methods well known to those skilled in the art. Transformation with this plasmid enhances the expression of the gene encoding the protein of the present invention and increases the activity of the protein in the bacterial cell. Transformation methods include any standard methods known to those skilled in the art.

Предпочтительно использование клеток мицелиальных грибов в качестве реципиентов для трансформации рекомбинантной плазмидами, содержащими фрагменты ДНК, кодирующие целевые белки.It is preferable to use mycelial fungal cells as recipients for transformation with recombinant plasmids containing DNA fragments encoding the target proteins.

Примером штамма-реципиента для получения продуцента рекомбинантной лакказы согласно настоящему изобретению, является, но не ограничивается им, штамм мицелиальных грибов Penicillium canescens PCA-10 (niaD^-) (Aleksenko A.Y. et al., Curr. Genet., 28, 474-478 (1995)) или производный штамм Penicillium canescens PCA-10-4/1-7/12 niaD^-, трансформированный плазмидами pBGlac и pBGxylD (см. Пример 2).An example of a recipient strain for producing a recombinant laccase producer according to the present invention is, but is not limited to, Penicillium canescens PCA-10 (niaD ^- ) mycelial strain (Aleksenko AY et al., Curr. Genet., 28, 474-478 ( 1995)) or a derivative strain of Penicillium canescens PCA-10-4 / 1-7 / 12 niaD ^- transformed with plasmids pBGlac and pBGxylD (see Example 2).

Способ получения ферментного препарата ксиланазы и лакказы включает стадии выращивания эукариотических клеток, трансформированных описанными выше плазмидами, в питательной среде, подходящей для выращивания указанных эукариотических клеток, и выделения ферментного препарата ксиланазы и лакказы из культуральной жидкости.A method for producing an enzyme preparation of xylanase and laccase comprises the steps of growing eukaryotic cells transformed with the plasmids described above in a nutrient medium suitable for growing said eukaryotic cells and isolating the enzyme preparation xylanase and laccase from the culture fluid.

Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, различные органические кислоты, а также другие сырьевые материалы, такие как свекловичный жом, отруби и другие подобные материалы. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и т.п. В качестве источника ростовых факторов и аминокислот при культивировании грибных продуцентов также может использоваться кукурузный экстракт.The nutrient medium used for growing can be either synthetic or natural, provided that the medium contains sources of carbon, nitrogen, mineral additives and, if necessary, the appropriate amount of nutrient additives necessary for the growth of microorganisms. Carbon sources include various carbohydrates such as glucose and sucrose, various organic acids, and other raw materials such as beet pulp, bran, and other similar materials. Various inorganic ammonium salts, such as ammonia and ammonium sulfate, other nitrogen compounds, such as amines, natural nitrogen sources, such as peptone, soybean hydrolyzate, microorganism fermentolizate, can be used as a nitrogen source. As mineral additives, potassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, iron sulfate, manganese sulfate, calcium chloride and the like can be used. As vitamins, thiamine, yeast extract, and the like can be used. Corn source can also be used as a source of growth factors and amino acids in the cultivation of mushroom producers.

Авторы настоящего изобретения обнаружили падение активности ксиланазы после 80 ч культивирования вследствие протеолитической деградации ксиланазы секретируемыми протеиназами гриба. Затем авторы настоящего изобретения установили, что мажорная протеолитическая активность в культуральной жидкости связана с присутствием в ней металлопротеиназ, а добавление в ферментационную среду ингибитора металлопротеиназ, ЭДТА, способно предотвращать деградацию ксиланазы и стабилизировать ее активность в ходе ферментации.The inventors of the present invention found a decrease in xylanase activity after 80 hours of cultivation due to proteolytic degradation of xylanase by secreted fungal proteinases. Then, the authors of the present invention found that major proteolytic activity in the culture fluid is associated with the presence of metalloproteinases in it, and the addition of a metalloproteinase inhibitor, EDTA, to the fermentation medium can prevent xylanase degradation and stabilize its activity during fermentation.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как: при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 25 до 35°С. рН среды поддерживают в пределах от 4,0 до 9, предпочтительно от 4,0 до 6,5, наиболее предпочтительно от 4,0 до 5,0. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно, выращивание в течение от 5 до 7 дней приводит к накоплению целевого продукта в культуральной среде.The cultivation is preferably carried out under aerobic conditions, such as: at a temperature in the range from 20 to 40 ° C, preferably in the range from 25 to 35 ° C. The pH of the medium is maintained in the range from 4.0 to 9, preferably from 4.0 to 6.5, most preferably from 4.0 to 5.0. The pH of the medium can be adjusted by ammonia, calcium carbonate, various acids, bases and buffer solutions. Usually, growing for 5 to 7 days leads to the accumulation of the target product in the culture medium.

Очистка целевого продукта может осуществляться любым способом, известным специалисту в данной области техники, таким как, например, фильтрация, мембранная очистка, диализ, осаждение, хроматография с последующим концентрированном и сушкой, например, лиофильной сушкой.Purification of the target product can be carried out by any method known to a person skilled in the art, such as, for example, filtration, membrane purification, dialysis, precipitation, chromatography, followed by concentrated and drying, for example, freeze drying.

Использование указанного выше способа позволяет проводить синтез и эффективную продукцию в секретируемой растворимой форме комбинированного ферментного препарата ксиланазы и лакказы с высокой активностью.Using the above method allows the synthesis and efficient production of secreted soluble form of the combined enzyme preparation xylanase and laccase with high activity.

ПримерыExamples

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие примеры, не ограничивающие каким-либо образом рамки настоящего изобретения.The present invention will be described in more detail below with reference to the following examples, not limiting in any way the scope of the present invention.

Пример 1. Конструирование плазмид для экспрессии генов ксиланазы и лакказы в Р. canescens.Example 1. Construction of plasmids for the expression of xylanase and laccase genes in P. canescens.

Для экспрессии гена lac1 из Т. hirsuta (GenBank EU492907) и клонированного ранее авторами настоящего изобретения гена эндо-1-4-бета-ксиланазы xylD из Р. canescens (GenBank FJ 860893, патент РФ №2412246) в мицелиальном грибе Р. canescens использовали сильный промотор гена bgaS β-галактозидазы Р. canescens, ее лидерный пептид и терминатор (GenBank X70408).For expression of the lac1 gene from T. hirsuta (GenBank EU492907) and the gene of endo-1-4-beta-xylanase xylD from P. canescens (GenBank FJ 860893, RF patent No. 2412246) previously cloned by the authors of the present invention, P. canescens mycelium was used strong promoter of the bgaS β-galactosidase gene of P. canescens, its leader peptide and terminator (GenBank X70408).

На основе плазмиды pPCG2.6 (Вавилова, Е.А. и др. Механизм суперпродукции секретируемых ферментов у мицелиального гриба Penicillium canescens. Прикладная биохимия и микробиология, 2003, т.39, стр.284-292; Фиг.1) был создан экспрессионный вектор pPCGMX (Фиг.2), содержащий полный ген bgaS β-галактозидазы Р. canescens, несущий уникальный сайт рестрикции Bsp120I непосредственно после про-области гена bgaS и область линкера перед стоп-кодоном, несущую уникальные сайты MluI, Bsp68I и XhoI.Based on the plasmid pPCG2.6 (Vavilova, E.A. et al. Mechanism of superproduction of secreted enzymes in the mycelial fungus Penicillium canescens. Applied Biochemistry and Microbiology, 2003, v. 39, pp. 284-292; Figure 1) an expression the pPCGMX vector (Figure 2) containing the complete P. canescens β galactosidase bgaS gene carrying the unique Bsp120I restriction site immediately after the bgaS gene pro-region and the linker region in front of the stop codon carrying the unique MluI, Bsp68I and XhoI sites.

На первом этапе в плазмиде pPCG2.6 (Фиг.1) был удален сайт рестрикции XhoI путем рестрикции по этому сайту, достройкой липких концов фрагментом Кленова в присутствии dNTP и последующего лигирования.At the first stage, in the plasmid pPCG2.6 (Figure 1), the XhoI restriction site was deleted by restriction at this site, adding sticky ends to the Klenov fragment in the presence of dNTP and subsequent ligation.

На втором этапе был встроен поли-линкер перед стоп-кодоном гена bgaS (Фиг.3). Для этого были получены ПЦР-фрагменты плазмиды pPCG2.6, с использованием следующих пар праймеров N237 (SEQ ID NO:1), N238 (SEQ ID NO:2), N239 (SEQ ID NO:3) и N240 (SEQ ID NO:4).At the second stage, a poly linker was inserted in front of the stop codon of the bgaS gene (Figure 3). For this, PCR fragments of plasmid pPCG2.6 were obtained using the following primer pairs N237 (SEQ ID NO: 1), N238 (SEQ ID NO: 2), N239 (SEQ ID NO: 3) and N240 (SEQ ID NO: four).

Полученные фрагменты были элюированы из геля, и подвергнуты второй ПЦР с праймерами N237 (SEQ ID NO:1) и N238 (SEQ ID NO:2). Синтезированный фрагмент был обработан ферментами рестрикции BcuI и EcoRI и клонирован в плазмиде pPCG2.6 с удаленным сайтом XhoI по этим же сайтам вместо интактной последовательности. Так как EcoRI не являлся уникальным сайтом рестрикции в плазмиде, использовали частичное расщепление по этому сайту с последующей обработкой фосфатазой SAP. Таким образом был получен экспрессионный вектор pPCGMX (Фиг.2).The resulting fragments were eluted from the gel, and subjected to second PCR with primers N237 (SEQ ID NO: 1) and N238 (SEQ ID NO: 2). The synthesized fragment was processed with restriction enzymes BcuI and EcoRI and cloned in the plasmid pPCG2.6 with the deleted XhoI site at the same sites instead of the intact sequence. Since EcoRI was not a unique restriction site in the plasmid, partial cleavage at this site followed by treatment with SAP phosphatase was used. Thus, the expression vector pPCGMX was obtained (Figure 2).

Фрагмент гена lac1, содержащий кодирующую последовательность без сигнального пептида и стоп-кодон был амплифицирован с использованием PfuI полимеразы и пары праймеров с введенными сайтами рестрикции LacEco52 (SEQ ID NO:5) и LacXho2 (SEQ ID NO:6). Геномная ДНК гриба Т. hirsuta была использована в качестве матрицы.The lac1 gene fragment containing the coding sequence without signal peptide and the stop codon was amplified using PfuI polymerase and a pair of primers with the introduced restriction sites LacEco52 (SEQ ID NO: 5) and LacXho2 (SEQ ID NO: 6). The genomic DNA of T. hirsuta fungus was used as a template.

Синтезированный ПЦР фрагмент был обработан рестриктазами Eco52I и XhoI, после чего клонирован в плазмидный вектор pPCGMX, расщепленный по сайтам Bsp120I и XhoI, вместо исходной кодирующей области с сохранением рамки считывания. Таким образом была получена плазмида pBGlac (Фиг.4). Вставленный фрагмент был проверен на отсутствие мутаций секвенированием.The synthesized PCR fragment was digested with restriction enzymes Eco52I and XhoI, after which it was cloned into the pPCGMX plasmid vector, which was digested at the Bsp120I and XhoI sites, instead of the original coding region preserving the reading frame. Thus, the plasmid pBGlac was obtained (Figure 4). The inserted fragment was checked for the absence of mutations by sequencing.

Аналогичным образом была получена плазмида pBGxyID для экспрессии гена xyfD Р. canescens. Фрагмент гена xylD, содержащий кодирующую последовательность без сигнального пептида и стоп-кодон был амплифицирован с использованием PfuI полимеразы и пары праймеров с введенными сайтами рестрикции XlC2ApaI (SEQ ID NO:7) и XlC2XhoI (SEQ ID NO:8). Геномная ДНК гриба Р. canescens была использована в качестве матрицы.Similarly, the plasmid pBGxyID was obtained for the expression of the xyfD gene of P. canescens. The xylD gene fragment containing the coding sequence without signal peptide and the stop codon was amplified using PfuI polymerase and a pair of primers with the introduced restriction sites XlC2ApaI (SEQ ID NO: 7) and XlC2XhoI (SEQ ID NO: 8). Genomic DNA of P. canescens fungus was used as a template.

Синтезированный ПЦР фрагмент был обработан рестиктазами Bsp120I и XhoI, после чего клонирован в плазмидный вектор pPCGMX, расщепленный по этим же сайтам, вместо исходной кодирующей области с сохранением рамки считывания. Таким образом была получена плазмида pBGxylD (Фиг.5). Вставленный фрагмент был проверен на отсутствие мутаций секвенированием.The synthesized PCR fragment was processed with Bsp120I and XhoI restriction enzymes, after which it was cloned into the pPCGMX plasmid vector, split at the same sites, instead of the original coding region with preservation of the reading frame. Thus, the plasmid pBGxylD was obtained (Figure 5). The inserted fragment was checked for the absence of mutations by sequencing.

Плазмиды pBGlac и pBGxylD, используемые для трансформации гриба, выделяли с помощью QIAGEN Plasmid Midi Kit.The plasmids pBGlac and pBGxylD used to transform the fungus were isolated using the QIAGEN Plasmid Midi Kit.

Пример 2. Получение штамма Р. canescens - продуцента ксиланазы и лакказы.Example 2. Obtaining a strain of P. canescens - producer of xylanase and laccase.

1. Получение штамма, свободного от углеродной катаболитной репрессии.1. Obtaining a strain free of carbon catabolite repression.

В коллекции лаборатории ИНБИ РАН имеется штамм мицелиального гриба Р. canescens F178 (ВКПМ) - природный продуцент (3-галактозидазы и эндо-1,4-β-ксиланазы. Экспрессия генов xylA и bgaS в штамме F178 Р. canescens подвержена репрессии D-глюкозой и индуцируется L-арабинозой. Незначительная индукция экспрессии гена xylA происходит и при росте на D-ксилозе (Николаев И.В., Винецкий Ю.П. Биохимия. 1998, т.63, стр.1523-1528).The collection of the laboratory of INBI RAS contains a strain of mycelial fungus P. canescens F178 (VKPM), a natural producer (3-galactosidase and endo-1,4-β-xylanase. Expression of xylA and bgaS genes in P. canescens strain F178 is subject to repression by D-glucose and is induced by L-arabinose. Slight induction of xylA gene expression also occurs with growth on D-xylose (Nikolaev IV, Vinetskiy Yu.P. Biochemistry. 1998, v.63, p. 1523-1528).

Актуальным является получение мутантов, у которых транскрипция генов xylA и bgaS была бы освобождена от углеродной катаболитной репрессии. Для получения таких мутантных штаммов была сконструирована экспрессионная плазмида рХНРН, несущая ген hph гигромицин-Б-фосфотрансферазы Е. coli, которая обеспечивает устойчивость к антибиотику гигромицину Б, под контролем промотора гена xylA из Р. canescens (Чулкин, А. Мутационный анализ углеродной катаболитной репрессии у мицелиального гриба Penicillium canescens. Молекулярная биология, 2011, в печати). Плазмиду вводили в геном штамма Р. canescens РСА-10 (Aleksenko A.Y., et al., Curr. Genet., 1995, 28, 474-478) трансформацией.It is relevant to obtain mutants in which transcription of the xylA and bgaS genes would be freed from carbon catabolite repression. To obtain such mutant strains, the expression plasmid pXNRH was constructed, carrying the hph gene of hyphromycin-B-phosphotransferase E. coli, which provides resistance to the antibiotic hygromycin B, under the control of the xylA gene promoter from P. canescens (Chulkin, A. Mutation analysis of carbon catabolite repression in Penicillium canescens mycelial fungus, Molecular Biology, 2011, in press). The plasmid was introduced into the genome of the strain P. canescens PCA-10 (Aleksenko A.Y., et al., Curr. Genet., 1995, 28, 474-478) by transformation.

После мутагенеза споры выбранного штамма высевали на агаризованную среду, содержащую гигромицин Б в условиях катаболитной репрессии гена xylA. Получена серия мутантных по углеродной катаболитной репрессии штаммов мицелиального гриба Р. canescens. Два мутанта, имеющие наиболее отчетливый фенотип, проанализированы детально. Мутации в исследованных штаммах обусловлены изменениями в гене creA, кодирующим глобальный регулятор углеродной катаболитной репрессии в мицелиальных грибах. Также была показана необходимость присутствия индуктора, арабинозы, для экспрессии генов xylA и bgaS даже в мутантах по углеродной катаболитной репрессии.After mutagenesis, spores of the selected strain were plated on agar medium containing hygromycin B under conditions of catabolic repression of the xylA gene. A series of carbon catabolite repression mutant strains of P. canescens mycelial fungus was obtained. Two mutants with the most distinct phenotype were analyzed in detail. Mutations in the studied strains are caused by changes in the creA gene encoding the global regulator of carbon catabolite repression in mycelial fungi. The need for the presence of an inducer, arabinose, for the expression of xylA and bgaS genes, even in mutants for carbon catabolite repression, has also been shown.

Один из этих creA^- мутантов (РСА-10/1-7) был выбран как реципиент для дальнейших генетических манипуляций.One of these creA ^- mutants (SAR-10 / 1-7) was selected as a recipient for further genetic manipulation.

2. Изменение уровня экспрессии гена-активатора xlnR в штамме Р. canescens creA^- 2. Change in the expression level of the xlnR activator gene in the P. canescens creA strain ^-

Ранее был клонирован ген xlnR транскрипционного активатора ксиланолитических генов Р. canescens (Серебряный, В.А. и др., Синтез ксиланолитических ферментов и других карбогидраз в трансформантах гриба Penicillium canescens с измененным числом копий гена транскрипционального активатора xlnR. Прикладная биохимия и микробиология. 2006, т.42, №6, стр.665-673). Показано, что мультипликация этого гена в геноме Р. canescens приводила к значительному увеличению синтеза белка XylA эндоксиланазы Р. canescens, а его делеция к сильному уменьшению.Earlier, the xlnR gene of the transcriptional activator of xylanolytic genes P. canescens was cloned (Serebryany, V.A. et al., Synthesis of xylanolytic enzymes and other carbohydrases in transformants of the fungus Penicillium canescens with a modified number of copies of the transcriptional activator xlnR gene. Applied biochemistry 2006 microbiology. t. 42, No. 6, pp. 665-673). It was shown that the multiplication of this gene in the P. canescens genome led to a significant increase in the synthesis of P. canescens endoxylanase XylA protein, and its deletion to a strong decrease.

Как было показано ранее (Mathieu, M. et al., In vivo studies of upstream regulatory cis-acting elements of the alcR gene encoding the transactivator of the ethanol regulon in Aspergillus nidulans, Mol. Microbiol., 2000, v.36, N.1, p.123-131), транскрипция генов-трансактиваторов также может быть подвержена углеродной катаболитной репрессии («механизм двойного замка»). Для снятия углеродной катаболитной репрессии транскрипции гена xlnR была сконструирована плазмидная конструкция, несущая ген xlnR из Р. canescens под контролем конститутивного промотора reHugpdA глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы A. nidulans.As previously shown (Mathieu, M. et al., In vivo studies of upstream regulatory cis-acting elements of the alcR gene encoding the transactivator of the ethanol regulon in Aspergillus nidulans, Mol. Microbiol., 2000, v. 36, N .1, p.123-131), transcription of transactivator genes can also be subjected to carbon catabolite repression (the “double lock mechanism”). To remove the carbon catabolite repression of xlnR gene transcription, a plasmid construct was constructed that carried the xlnR gene from P. canescens under the control of the constitutive promoter reHugpdA of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase A. nidulans.

Для этого SalI-SalI фрагмент плазмиды рХР53 (Серебряный, В.А. и др. Синтез ксиланолитических ферментов и других карбогидраз в трансформантах гриба Penicillium canescens с измененным числом копий гена транскрипционального активатора xlnR. Прикладная биохимия и микробиология. 2006, т.42, №6, стр. 665-673) длиной 3161 п.н., несущий кодирующую часть гена xlnR без инициирующего ATG кодона и терминатор гена xlnR, был субклонирован в плазмидный вектор pBluescript II KS(+) («Fermentas», Канада), расщепленный эндонуклеазами Sail и XhoI, в ориентации, сохраняющей сайт SalI в кодирующей области xlnR и получена промежуточная плазмида pXRSlXh (Фиг.6).For this, the SalI-SalI fragment of plasmid pXP53 (Serebryany, V.A. et al. Synthesis of xylanolytic enzymes and other carbohydrases in transformants of the fungus Penicillium canescens with a modified number of copies of the transcriptional activator xlnR gene. Applied Biochemistry and Microbiology. 2006, v. 42, no. 6, pp. 665-673) 3161 bp long, carrying the coding portion of the xlnR gene without the ATG initiation codon and the xlnR gene terminator, was subcloned into the plasmid vector pBluescript II KS (+) (Fermentas, Canada), digested with endonucleases Sail and XhoI, in an orientation preserving the SalI site in the coding region xlnR and on the intermediate plasmid pXRSlXh (Fig.6).

ПЦР-фрагмент длиной около 2350 п.н., полученный с помощью Pfu ДНК-полимеразы («Fermentas», Канада) с использованием праймеров M13/pUC direct sequencing primer (-46) («Fermentas», Канада) и HPHSL (SEQ ID NO:9), с введенным сайтом рестрикции Sail после инициирующего ATG кодона гена hph из Е. coli, и ДНК плазмиды pAN7-1 (Punt, P.J. et al. Transformation of Aspergillus based on the hygromycin В resistance marker from Escherichia coli. Gene, 1987, v.56, p.117-124) в качестве матрицы, несущий конститутивный промотор гена gpdA из A. nidulans и ATG-кодон, был субклонирован в плазмиду pXRSlXh по сайтам EcoRI и SalI и таким образом была получена плазмида pGpdXlnR (Фиг.7).A PCR fragment of about 2350 bp in length obtained using Pfu DNA polymerase (Fermentas, Canada) using primers M13 / pUC direct sequencing primer (-46) (Fermentas, Canada) and HPHSL (SEQ ID NO: 9), with the Sail restriction site introduced after the ATG initiating codon of the hph gene from E. coli, and the DNA of the plasmid pAN7-1 (Punt, PJ et al. Transformation of Aspergillus based on the hygromycin B resistance marker from Escherichia coli. Gene, 1987, v.56, p.117-124) as a matrix, carrying the constitutive promoter of the gpdA gene from A. nidulans and the ATG codon, was subcloned into the pXRSlXh plasmid at EcoRI and SalI sites and thus the pGpdXlnR plasmid was obtained (Fig. 7).

Плазмида была введена в геном штамма РСА-10/I-7 (creA^-, niaD^-) методом ко-трансформации с селективной плазмидой pSTA-10 (Unkles, S.E. et al., The Aspergillus niger niaD gene encoding nitrate reductase: upstream nucleotide and amino acid sequence comparisons. Gene, 1992, v.111, p.149-155), несущей полный ген нитратредуктазы niaD мицелиального гриба Aspergillus niger.The plasmid was introduced into the genome of strain PCA-10 / I-7 (creA ^- , niaD ^- ) by co-transformation with the selective plasmid pSTA-10 (Unkles, SE et al., The Aspergillus niger niaD gene encoding nitrate reductase: upstream nucleotide and amino acid sequence comparisons. Gene, 1992, v.111, p. 149-155), carrying the complete niaD nitrate reductase gene of the mycelial fungus Aspergillus niger.

Процедуру трансформации проводили по следующей методике. Штамм Р. canescens PCA-10/I-7 (creA^-, niaD^-) выращивали 16 часов при 30°С на полной питательной среде: пептон ферментативный - 3 г/л, дрожжевой экстракт - 2 г/л, глюкоза - 10 г/л, NH⁴Cl - 10 mM, 50× раствор минеральных солей - 20 мл/л. Раствор минеральных солей (50×) имел следующий состав: KCl - 26 г/л, MgSO₄×7H₂O - 26 г/л, KH₂PO₄ - 76 г/л, раствор микроэлементов - 50 мл/л. Раствор микроэлементов включал в себя CuSO₄×5H₂O - 400 мг/л, FeSO₄×5H₂O - 800 мг/л, MgSO₄×2H₂O - 800 мг/л, Na₂MoO₄×2H₂O - 800 мг/л, ZnSO₄×7H₂O - 800 мг/ л, B₄Na₂O₇ - 40 мг/л. Мицелий переносили в раствор 1,2 М MgSO₄ и 10 мМ NaH₂PO₄, pH 5,8 и добавляли лизирующий фермент из Trichoderma harzianum (Sigma, США) (5 мг/мл). Протопластирование проводили в течение 2 часов при 30°С в условиях перемешивания. Суспензию переносили в центрифужную пробирку и наслаивали 1-2 см раствора: 0,6 М сорбитол, 10 мM CaCl, 10 мМ Трис-HCl. После центрифугирования при 3000 об/мин и 4°С в течение 10 мин отбирали интерфазу, содержащую протопласты. Протопласты промывали 2 раза в стабилизирующем растворе SCT (1.2 М сорбитола, 10 мМ Трис, pH 7,5, 10 мМ CaCl₂) и ресуспендировали в нем же до концентрации 108 протопластов/мл. Трансформацию проводили следующим образом: к 200 мкл суспензии протопластов добавляли 10 мкг трансформируемой ДНК pGpdXlnR и 1 мкг комплементирующей плазмиды pSTA-10, несущей полный ген niaD нитратредуктазы из A. niger, инкубировали в ледяной бане 20 мин, после чего проводили осмотический шок в течение 5 мин в РСТ (50% PEG 4000, 10 мМ CaCl₂, 10 мМ Трис-HCl) и высевали протопласты в верхнем слое на агаризованную селективную минимальную среду, содержащую 1,2 М сорбитола. В качестве селективного маркера использовали источник азота 10 мМ NaNO₃, вместо NH₄Cl.The transformation procedure was carried out according to the following procedure. The strain P. canescens PCA-10 / I-7 (creA ^- , niaD ^- ) was grown for 16 hours at 30 ° C in a complete nutrient medium: enzyme peptone - 3 g / l, yeast extract - 2 g / l, glucose - 10 g / l, NH ⁴ Cl - 10 mM, 50 × solution of mineral salts - 20 ml / l. The solution of mineral salts (50 ×) had the following composition: KCl - 26 g / l, MgSO ₄ × 7H ₂ O - 26 g / l, KH ₂ PO ₄ - 76 g / l, trace element solution - 50 ml / l. The trace element solution included CuSO ₄ × 5H ₂ O - 400 mg / l, FeSO ₄ × 5H ₂ O - 800 mg / l, MgSO ₄ × 2H ₂ O - 800 mg / l, Na ₂ MoO ₄ × 2H ₂ O - 800 mg / l, ZnSO ₄ × 7H ₂ O - 800 mg / l, B ₄ Na ₂ O ₇ - 40 mg / l. The mycelium was transferred to a solution of 1.2 M MgSO ₄ and 10 mM NaH ₂ PO ₄ , pH 5.8, and a lytic enzyme from Trichoderma harzianum (Sigma, USA) (5 mg / ml) was added. Protoplasty was performed for 2 hours at 30 ° C under stirring conditions. The suspension was transferred to a centrifuge tube and 1-2 cm of solution was layered: 0.6 M sorbitol, 10 mM CaCl, 10 mM Tris-HCl. After centrifugation at 3000 rpm and 4 ° C for 10 min, the interphase containing protoplasts was selected. Protoplasts were washed 2 times in a SCT stabilizing solution (1.2 M sorbitol, 10 mM Tris, pH 7.5, 10 mM CaCl ₂ ) and resuspended in it to a concentration of 108 protoplasts / ml. The transformation was carried out as follows: 10 μg of transformable pGpdXlnR DNA and 1 μg of the complementary plasmid pSTA-10 carrying the full niaD gene of nitrate reductase from A. niger were added to 200 μl of a suspension of protoplasts, incubated in an ice bath for 20 min, after which osmotic shock was performed for 5 min in PCT (50% PEG 4000, 10 mM CaCl ₂ , 10 mM Tris-HCl) and the protoplasts were seeded in the upper layer on an agarized selective minimal medium containing 1.2 M sorbitol. As a selective marker, a 10 mM NaNO ₃ nitrogen source was used instead of NH ₄ Cl.

Для качественной оценки активности эндоксиланаз полученные трансформанты высевали уколом на агаризованную среду с 5 мМ L-арабинозой и 10 мМ D-глюкозой и выращивали 24 ч при 30°С, после чего заливали верхний слой расплавленной 0,5% агарозой в 0.1М Na-ацетатном буфере рН 5,0, содержащем 1% окрашенный субстрат ксилана Blue Xylan (BX) («BioChemika» 95588) (Chalmers, J.H. et al. Chromogenic and fluorogenic substrates for assaying xylanases of Neurospora. Fungal Genetics Newsletter, 1990, v.37, p.25-31). После инкубации в течение 2-4 ч при 37°С активность эндоксиланаз оценивали по размеру зоны просветления.To qualitatively assess the activity of endoxylanases, the obtained transformants were plated on an agar medium with 5 mM L-arabinose and 10 mM D-glucose and grown for 24 h at 30 ° C, after which the upper layer was poured with molten 0.5% agarose in 0.1 M Na-acetate pH 5.0 buffer containing 1% stained Blue Xylan (BX) xylan substrate (BioChemika 95588) (Chalmers, JH et al. Chromogenic and fluorogenic substrates for assaying xylanases of Neurospora. Fungal Genetics Newsletter, 1990, v. 37, p.25-31). After incubation for 2-4 hours at 37 ° C, the activity of endoxylanases was evaluated by the size of the clearing zone.

Для проверки интеграции плазмиды pGpdXlnR в геном, из 5 штаммов с максимальной зоной просветления была выделена ДНК и использована для ПЦР со специфичными к плазмиде pGpdXlnR праймерами M13/pUC direct sequencing primer (-46) и HPHSL (ЫУЙ ШВ ТЩЖ 9). Результаты ПЦР подтвердили наличие плазмиды в 4 трансформантах. Один из них РСА-10-4/I-7 (pgpdA::xlnR, creA^-) был использован в дальнейшей работе.To verify the integration of the plasmid pGpdXlnR into the genome, DNA was isolated from 5 strains with a maximum clearing zone and used for PCR with plasmid specific pGpdXlnR primers M13 / pUC direct sequencing primer (-46) and HPHSL (FUWNW TGW 9). PCR results confirmed the presence of the plasmid in 4 transformants. One of them PCA-10-4 / I-7 (pgpdA :: xlnR, creA ^- ) was used in further work.

3. Получение индуцированных мутантов со снятой арабинозной индукцией в штамме Penicillium canescens CreA^-.3. Obtaining induced mutants with cleared arabinose induction in a strain of Penicillium canescens CreA ^- .

Как уже упоминалось, экспрессия генов xylA и bgaS в штамме гриба Р. canescens индуцируется L-арабинозой. При этом сама L-арабиноза является дорогостоящим субстратом, использование которого при крупномасштабном производстве нерентабельно. Таким образом, актуальной является задача получения мутантных культур гриба, у которых активационный уровень транскрипции целевых генов достигается в отсутствии L-арабинозы.As already mentioned, the expression of xylA and bgaS genes in a strain of P. canescens fungus is induced by L-arabinose. Moreover, L-arabinose itself is an expensive substrate, the use of which is unprofitable in large-scale production. Thus, the urgent task is to obtain mutant fungal cultures in which the activation level of transcription of target genes is achieved in the absence of L-arabinose.

Для решения поставленной задачи был использован следующий методический подход. Поскольку штамм РСА-10-4/I-7 (_pgpdA::xlnR, creA^-) содержит в геноме гибридный ген hph гигромицин-Б-фосфотрансферазы из Е. coli под контролем промотора гена xylA, искомые мутанты могут быть отобраны по фенотипу hphR на среде, не содержащей L-арабинозу.To solve this problem, the following methodological approach was used. Since the strain PCA-10-4 / I-7 ( _p gpdA :: xlnR, creA ^- ) contains the hybrid hph gene hygromycin-B-phosphotransferase from E. coli in the genome under the control of the xylA gene promoter, the desired mutants can be selected according to the hphR phenotype on medium not containing L-arabinose.

При получении мутантов была подобрана концентрация гигромицина Б (1000 мкг/мл) на среде ММ с 0,4% глюкозы на которой отсутствовал рост конидий штамма PCA-10-4/I-7 (_pgpdA::xlnR, creA^-).Upon receipt of the mutants, the concentration of hygromycin B (1000 μg / ml) was selected on MM medium with 0.4% glucose on which there was no growth of conidia of strain PCA-10-4 / I-7 ( _p gpdA :: xlnR, creA ^- ).

Споровая суспензия штамма PCA-10-4/I-7 (титр 3,2×10⁷) приготовили из 14-суточной культуры гриба, выращенной на среде ММ. Суспензию облучали УФ в течение 20 с, достигая эффективности выживания спор 6%. Облучение проводили при постоянном перемешивании. Конидии высевались на агаризованную среду ММ, содержащую глюкозу (0,4%), гигромицин Б (1000 мкг/мл) и X-gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозид, 100 мг/л) для получения 300 клонов на чашке с учетом эффективности выживания. Чашки инкубировали 7 суток при 30°С.A spore suspension of strain PCA-10-4 / I-7 (titer 3.2 × 10 ⁷ ) was prepared from a 14-day-old culture of the fungus grown on MM medium. The suspension was irradiated with UV for 20 s, achieving a spore survival efficiency of 6%. Irradiation was carried out with constant stirring. Conidia were plated on MM agar medium containing glucose (0.4%), hygromycin B (1000 μg / ml) and X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside, 100 mg / l) to obtain 300 clones per cup, taking into account the effectiveness of survival. The plates were incubated for 7 days at 30 ° C.

Получено 3,2×10⁶ клонов с фенотипом hphR. Среди них было отобрано 36 синих клона, продуцирующих β-галактозидазу в данных условиях (фенотип bgs⁺). Отобранные мутанты фенотипа hphR bgs⁺ были переколоты на среду для их отбора (см. выше) для повторного тестирования фенотипа. По результатам этого тестирования были выявлены синие клоны с воспроизводимым фенотипом. Мутантый клон PCA-10-4/I-7/12 был использован в дальнейшей работе.Received 3.2 × 10 ⁶ clones with the hphR phenotype. Among them, 36 blue clones producing β-galactosidase under these conditions (bgs ⁺ phenotype) were selected. The selected mutants of the hphR bgs ⁺ phenotype were split onto the medium for their selection (see above) for retesting the phenotype. According to the results of this testing, blue clones with a reproducible phenotype were identified. The mutant clone PCA-10-4 / I-7/12 was used in further work.

Было подтверждено, что мутация в штамме PCA-10-4/I-7/12 приводит к арабинозо-независимой индукции не только β-галактозидазы и эдоксиланазы, но и ряда других секреторных белков Р. canescens.It was confirmed that the mutation in strain PCA-10-4 / I-7/12 leads to arabinose-independent induction of not only β-galactosidase and edoxylanase, but also a number of other P. canescens secretory proteins.

4. Получение штамма-реципиента Penicillium canescens со снятой катаболитной репрессией и арабинозной индукцией.4. Obtaining a recipient strain of Penicillium canescens with removed catabolite repression and arabinose induction.

Для последующего использования мутантного штамма PCA-10-4/I-7/12 при создании на его основе штаммов-продуцентов необходимо решить задачу введения селектируемой мутации. В качестве такой мутации была использована мутация по гену нитратредуктазе (niaD^-).For the subsequent use of the mutant strain PCA-10-4 / I-7/12 when creating producer strains based on it, it is necessary to solve the problem of introducing a breeding mutation. As such a mutation, a mutation in the nitrate reductase gene (niaD ^- ) was used.

Получение мутантов по нитратредуктазе (niaD^-) проводили методом индуцированного мутагенеза. Для этого споровую суспензию штамма PCA-10-4/I-7/12 обрабатывали N-нитро-N-нитрозогуанидином (200 мкг/мл) 30 минут при 30°С. Затем отмывали 3 раза в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,0 и высевали на чашки с ММ. Чашки инкубировали 7 суток. Выживаемость спор при такой обработке составила 10%.The preparation of mutants by nitrate reductase (niaD ^- ) was carried out by the method of induced mutagenesis. For this, a spore suspension of strain PCA-10-4 / I-7/12 was treated with N-nitro-N-nitrosoguanidine (200 μg / ml) for 30 minutes at 30 ° C. Then washed 3 times in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.0 and plated on plates with MM. Cups were incubated for 7 days. Spore survival during this treatment was 10%.

Выросшие клоны пересевали на матричные чашки с различными источниками азота (10 мМ NH₄Cl, 10 мМ NaNO₃, 0,45 М хлорат Na, 5 мМ гипоксантин, 20 мМ NaNO₂). Отсутствие роста клонов на среде с 10 мМ NaNO₃ и его наличие на других источниках азота говорит о наличие фенотипа niaD^-. По результатам этого ростового теста отобрано 18 клонов. Все они были проверены по эффективности секреции β-галактозидазы при выращивании на агаризованной среде ММ, содержащей глюкозу (10 г/л) и X-gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозид, 100 мг/л).The grown clones were subcultured onto matrix plates with various nitrogen sources (10 mM NH ₄ Cl, 10 mM NaNO ₃ , 0.45 M Na chlorate, 5 mM hypoxanthine, 20 mM NaNO ₂ ). The absence of clone growth on a medium with 10 mM NaNO ₃ and its presence on other nitrogen sources indicates the presence of the niaD ^- phenotype. Based on the results of this growth test, 18 clones were selected. All of them were tested for the effectiveness of β-galactosidase secretion when grown on MM agar medium containing glucose (10 g / l) and X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside, 100 mg / l).

По результатам проведенного теста отобран мутант с максимальной продукцией β-галактозидазы, обозначенный РСА-10-4/I-7/12 niaD^-, который в дальнейшем использовали в качестве реципиентного штамма.According to the results of the test, a mutant with the maximum production of β-galactosidase, designated PCA-10-4 / I-7/12 niaD ^- , was selected, which was further used as a recipient strain.

Пример 3. Получение штамма Р. canescens - продуцента ксиланазы и лакказы.Example 3. Obtaining a strain of P. canescens - producer of xylanase and laccase.

Для получения штамма-продуцента ксиланазы и лакказы провели трансформацию реципиентного штамма гриба РСА-10-4/I-7/12 niaD^- плазмидами pBGlac и pBGxylD.For strain producing xylanase and laccase had a recipient strain transformed fungus SAR-10-4 / I-7/12 niaD ^- pBGlac plasmids and pBGxylD.

Процедуру трансформации проводили по следующей методике. Штамм Р. canescens РСА-10-4/I-7/12 niaD^- выращивали 24 часов при 30°С на полной питательной среде: пептон ферментативный - 3 г/л, дрожжевой экстракт - 2 г/л, глюкоза - 10 г/л, NH₄Cl - 10 мМ, 50× раствор минеральных солей - 20 мл/л. Раствор минеральных солей (50×) имел следующий состав: KCl - 26 г/л, MgSO₄×7H₂O - 26 г/л, KH₂PO₄ - 76 г/л, раствор микроэлементов - 50 мл/л. Раствор микроэлементов включал в себя CuSO₄×5H₂O - 400 мг/л, FeSO₄×5H₂O - 800 мг/л, MgSO₄×2H₂O - 800 мг/л, Na₂MoO₄×2Н₂О - 800 мг/л, ZnSO₄×7H₂O - 800 мг/ л, B₄Na₂O₇ - 40 мг/л. Мицелий переносили в раствор 1,2 М MgSO₄ и 10 мМ NaH₂PO₄, pH 5,8 и добавляли лизирующий фермент из Trichoderma harzianum (Sigma, США) (35 мг/мл). Протопластирование проводили в течение 2 часов при 30°С в условиях перемешивания. Суспензию переносили в центрифужную пробирку и наслаивали 1-2 см раствора: 0,6 М сорбитол, 10 мМ Трис-HCl. После центрифугирования при 5000 об/мин и 4°С в течение 10 мин отбирали интерфазу, содержащую протопласты. Протопласты промывали 2 раза в стабилизирующем растворе SCT (1,2 М сорбитола, 10 мМ Трис, pH 7,5, 10 мМ CaCl₂) и ресуспендировали в нем же до концентрации 108 протопластов/мл. Трансформацию проводили следующим образом: к 200 мкл суспензии протопластов добавляли 10 мкг трансформируемой ДНК плазмид pBGlac и pBGxylD и 1 мкг комплементирующей плазмиды pSTA-10, несущей полный ген niaD нитратредуктазы A. niger, инкубировали в ледяной бане 20 мин, после чего проводили осмотический шок в течение 5 мин в РСТ (50% PEG 4000, 10 мМ CaCl₂, 10 мМ Трис-HCl) и высевали протопласты в верхнем слое на агаризованную селективную минимальную среду, содержащую 1,2 М сорбитола. В качестве селективного маркера использовали источник азота 10 мМ NaNO₃, вместо NH₄Cl.The transformation procedure was carried out according to the following procedure. The strain P. canescens RSA-10-4 / I-7/12 niaD ^{- was} grown 24 hours at 30 ° C in a complete nutrient medium: enzyme peptone - 3 g / l, yeast extract - 2 g / l, glucose - 10 g / l, NH ₄ Cl - 10 mm, 50 × a solution of mineral salts - 20 ml / l. The solution of mineral salts (50 ×) had the following composition: KCl - 26 g / l, MgSO ₄ × 7H ₂ O - 26 g / l, KH ₂ PO ₄ - 76 g / l, trace element solution - 50 ml / l. The trace element solution included CuSO ₄ × 5H ₂ O - 400 mg / l, FeSO ₄ × 5H ₂ O - 800 mg / l, MgSO ₄ × 2H ₂ O - 800 mg / l, Na ₂ MoO ₄ × 2Н ₂ О - 800 mg / l, ZnSO ₄ × 7H ₂ O - 800 mg / l, B ₄ Na ₂ O ₇ - 40 mg / l. The mycelium was transferred to a solution of 1.2 M MgSO ₄ and 10 mM NaH ₂ PO ₄ , pH 5.8, and a lytic enzyme from Trichoderma harzianum (Sigma, USA) (35 mg / ml) was added. Protoplasty was performed for 2 hours at 30 ° C under stirring conditions. The suspension was transferred to a centrifuge tube and 1-2 cm of solution was layered: 0.6 M sorbitol, 10 mM Tris-HCl. After centrifugation at 5000 rpm and 4 ° C for 10 min, the interphase containing protoplasts was selected. Protoplasts were washed 2 times in a SCT stabilizing solution (1.2 M sorbitol, 10 mM Tris, pH 7.5, 10 mM CaCl ₂ ) and resuspended therein at a concentration of 108 protoplasts / ml. The transformation was carried out as follows: 10 μg of transformable DNA of plasmids pBGlac and pBGxylD and 1 μg of the complementing plasmid pSTA-10 carrying the full niaD gene of nitrate reductase A. niger were added to 200 μl of a suspension of protoplasts, then they were incubated in an ice bath for 20 min, after which osmotic shock was performed for 5 min in PCT (50% PEG 4000, 10 mM CaCl ₂ , 10 mM Tris-HCl) and protoplasts were seeded in the upper layer on an agarized selective minimal medium containing 1.2 M sorbitol. As a selective marker, a 10 mM NaNO ₃ nitrogen source was used instead of NH ₄ Cl.

Получен 201 клон ко-трансформантов, которые охарактеризованы в ходе последующего 2-этапного скрининга.Received 201 clone of co-transformants, which were characterized during the subsequent 2-stage screening.

Проведение Скрининга №1Screening No. 1

Первый этап скрининга проводили по оценке активности продуцируемой лакказы в условиях тестирования на чашках. Для этого споровые культуры грибных клонов выращивали в течение 10 суток на чашках со средой следующего состава:The first stage of the screening was performed to evaluate the activity of the produced laccase under test conditions on plates. For this, spore cultures of fungal clones were grown for 10 days on plates with medium of the following composition:

ГлюкозаGlucose 10 г/л10 g / l NaNO₃ NaNO ₃ 10 мМ10 mm Раствор минеральных солей 50×Mineral salt solution 50 × 20 мл/л20 ml / l АгарAgar 20 г/л20 g / l

После этого клоны были пересеяны путем перекалывания на чашки с другой средой:After that, the clones were seeded by chopping into cups with a different medium:

ГлюкозаGlucose 10 г/л10 g / l NH₄ClNH ₄ Cl 10 мМ10 mm Раствор минеральных солей 50×Mineral salt solution 50 × 20 мл/л20 ml / l АгарAgar 20 г/л20 g / l

После выращивания материала в течение 1 суток при 30°С чашки заливали верхним слоем агара (0,5%), содержащим 1,1 мг/мл АВТС в 0,1 М натрий-ацетатном буфере (рН 5,0) и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре (openwetware.org/wiki/laccase_protocols).After growing the material for 1 day at 30 ° C, the plates were poured with an upper layer of agar (0.5%) containing 1.1 mg / ml ABTS in 0.1 M sodium acetate buffer (pH 5.0) and incubated for 2 hours at room temperature (openwetware.org/wiki/laccase_protocols).

Клоны, продуцирующие лакказу, образуют в этих условиях зеленый ореол вокруг колоний. По результатам проведенного теста отобрано 44 клона трансформантов.Clones producing laccase form under these conditions a green halo around the colonies. Based on the results of the test, 44 clones of transformants were selected.

Проведение Скрининга №2Screening No. 2

Целью данного этапа скрининга был отбор клонов, демонстрирующих максимальные уровни продукции ксиланазы и лакказы. Для этого клоны, отобранные на предыдущем этапе, культивировали в плашках с последующим анализом культуральной жидкости.The purpose of this screening step was to select clones demonstrating maximum levels of xylanase and laccase production. For this, the clones selected in the previous step were cultured in plates followed by analysis of the culture fluid.

Культивирование в планшетах проводили после посева уколом при 30°С в течение 5 суток на среде следующего состава:Cultivation in the tablets was carried out after seeding by injection at 30 ° C for 5 days on a medium of the following composition:

ГлюкозаGlucose 20 г20 g (NH₄)SO₄ (NH ₄ ) SO ₄ 4,7 г4.7 g Концентрат микроэлементов 50×Trace Concentrate 50 × 20 мл20 ml Цитратно-фосфатный буфер 5×, 0,1 М рН 4,65 × citrate phosphate buffer, 0.1 M pH 4.6 20 мл20 ml Вода дистиллированнаяDistilled water До 1 лUp to 1 liter

Культуральные жидкости, отобранные после окончания эксперимента были проанализированы методом элекрофореза в ДДС-ПААГ 14%.The culture fluids selected after the end of the experiment were analyzed by electrophoresis in DDS-PAG 14%.

Культуральные жидкости, отобранные после культивирования клонов в плашках, были использованы для определения в них активности лакказы. Активность лакказы в культуральной жидкости штаммов детектировали спектрофотометрически (длина волны 450 нм), используя в качестве хромогенного субстрата 10 мМ раствор АБТС в 0,1 М Na-ацетатном буфере рН 5,0. Реакцию проводили в плашках в течение 1 мин. Реакционная смесь состояла из 150 мкл субстрата и 15 мкл культуральной жидкости. Культуральную жидкость штамма Р. canescens PCA-10-4/I-7/12 niaD^- использовали в качестве отрицательного контроля. Результаты измерения активности лакказы в культуральных жидкостях клонов-трансформантов приведены в таблице 1.The culture fluids selected after culturing the clones in the plates were used to determine the laccase activity in them. Laccase activity in the culture fluid of the strains was detected spectrophotometrically (wavelength 450 nm) using a 10 mM ABTS solution in 0.1 M Na-acetate buffer pH 5.0 as a chromogenic substrate. The reaction was carried out in dies for 1 min. The reaction mixture consisted of 150 μl of substrate and 15 μl of culture fluid. The culture fluid of the strain P. canescens PCA-10-4 / I-7/12 niaD ^{- was} used as a negative control. The results of measuring the activity of laccase in the culture fluids of transforming clones are shown in table 1.

Таблица 1Table 1 Активность лакказы в культуральной жидкости клонов-трансформантов, выраженная в µМ/мин·мг белкаThe activity of laccase in the culture fluid of transforming clones, expressed in μM / min · mg protein № клонаClone number АBUT № клонаClone number АBUT № клонаClone number АBUT № клонаClone number АBUT № клонаClone number АBUT I-7-1 (12)I-7-1 (12) 0,0130.013 3737 0,280.28 8787 0,310.31 134134 0,410.41 175175 0,370.37 55 0,080.08 4040 0,210.21 9898 0.250.25 141141 0,350.35 180180 0,290.29 66 0,370.37 4747 0,310.31 101101 0,230.23 144144 0,460.46 182182 0,330.33 77 0,320.32 50fifty 0,380.38 105105 0,410.41 147147 0,190.19 184184 0,440.44 1717 0,210.21 5151 0,30.3 110110 0,370.37 155155 0,40.4 189189 0,410.41 18eighteen 0,190.19 5353 0,40.4 111111 0,180.18 156156 0,320.32 193193 0,160.16 2121 0,160.16 7272 0,250.25 117117 0,430.43 162162 0,330.33 195195 0,320.32 2424 0,270.27 7474 0,0350,035 124124 0,380.38 165165 0,360.36 200200 0,250.25 3434 0,270.27 8080 0,380.38 132132 0,260.26 171171 0,230.23 201201 0,390.39

Отбор трансформированных клонов со множественной встройкой экспрессируемых генов ксиланазы и лакказы.Selection of transformed clones with multiple insertion of expressed xylanase and laccase genes.

Для определения количества копий генов lad из Т. hirsuta и xylD из Р. canescens в коллекции трансформантов был использован метод ПЦР в реальном времени.To determine the number of copies of the lad genes from T. hirsuta and xylD from P. canescens in the collection of transformants, the real-time PCR method was used.

На первом этапе был идентифицирован однокопийный продуцент лакказы. Для этого из трансформантов №№6, 7, 17, 18 и 21, имеющих активность лакказы, была выделена высокомолекулярная геномная ДНК с использованием следующей методики:At the first stage, a single-copy laccase producer was identified. For this, high molecular weight genomic DNA was isolated from transformants Nos. 6, 7, 17, 18, and 21 with laccase activity using the following method:

1) Споры гриба смывали с чашки, суспендировали в 100 мл минимальной среды (до концентрации 1×10⁶-5×10⁶ спор/мл), и растили 12-24 часа.1) The spores of the fungus were washed off the cup, suspended in 100 ml of minimal medium (to a concentration of 1 × 10 ⁶ -5 × 10 ⁶ spores / ml), and grown for 12-24 hours.

2) Мицелий отфильтровывали, промывали буфером и отжимали на фильтровальной бумаге.2) The mycelium was filtered off, washed with buffer and squeezed on filter paper.

Состав буфера:The composition of the buffer:

Tris HCl (pH 7,5)Tris HCl (pH 7.5) 50 мМ (5 мл 1 М на 100)50 mM (5 ml 1 M per 100) EDTAEDTA 20 мМ (4 мл 0.5 М на 100).20 mM (4 ml 0.5 M per 100).

3) 1 г грибного мицелия растирали в ступке, замораживая в жидком азоте, затем переносили в 5 мл буфера и осторожно перемешивали. Добавляли 330 мкл 10% SDS (до 0,5%) и протеиназу K до 0,1 мкг/мл и снова осторожно перемешивали. Инкубировали при 65°С в течение 30 мин.3) 1 g of mushroom mycelium was ground in a mortar, frozen in liquid nitrogen, then transferred to 5 ml of buffer and carefully mixed. 330 μl of 10% SDS (up to 0.5%) and proteinase K up to 0.1 μg / ml were added and again carefully mixed. Incubated at 65 ° C for 30 minutes.

4) После инкубирования к суспензии мицелия добавляли 1,5 мл 5М ацетата калия pH 5,0, осторожно перемешивали и инкубировали 30-60 мин в ледяной бане.4) After incubation, 1.5 ml of 5M potassium acetate pH 5.0 was added to the mycelial suspension, mixed gently and incubated for 30-60 minutes in an ice bath.

5) Центрифугировали 10 000 об/мин, 10 мин, 4°С.5) Centrifuged at 10,000 rpm, 10 min, 4 ° C.

6) Надосадочную жидкость отбирали; при необходимости фильтровали через два слоя марли, и добавляли к ней 15 мл этанола. Инкубировали 10-20 мин при -20°С.6) The supernatant was taken; if necessary, filtered through two layers of gauze, and 15 ml of ethanol was added to it. Incubated for 10-20 minutes at -20 ° C.

7) Центрифугировали 20 мин при 10 000 об/мин и температуре 4°С.7) Centrifuged for 20 min at 10,000 rpm and a temperature of 4 ° C.

8) Надосадочную жидкость сливали, осадок промывали 70% этанолом, подсушивали 10 мин при 37°С и растворяли в 3 мл деионизованной воды.8) The supernatant was decanted, the precipitate was washed with 70% ethanol, dried for 10 min at 37 ° C and dissolved in 3 ml of deionized water.

9) При необходимости удалить РНК добавляли 300 мкг РНК-азы А и инкубировали 30 мин при 37°С.9) If necessary, remove RNA was added 300 μg of RNAase A and incubated for 30 min at 37 ° C.

10) К раствору добавляли 1 объем (3 мл) изопропанола и аккуратно перемешивали. Выпавшую в осадок ДНК вынимали из раствора, наматывая на наконечник от пипетки, и переносили в 70% этанол, или осаждали центрифугированием 10 мин при 10000 об/мин и промывали 70% этанолом.10) 1 volume (3 ml) of isopropanol was added to the solution and gently mixed. The precipitated DNA was removed from the solution, wrapped around the tip from a pipette, and transferred to 70% ethanol, or precipitated by centrifugation for 10 min at 10,000 rpm and washed with 70% ethanol.

11) Осадок подсушивали 10 мин при 37°С и растворяли в 100-500 мкл деионизованной воды.11) The precipitate was dried for 10 min at 37 ° C and dissolved in 100-500 μl of deionized water.

5 мкг ДНК обрабатывались 10 единицами эндонуклеазы рестрикции SmaI в течение ночи при 30°С, после чего ДНК разделяли в 0,8% агарозном геле, переносили на нейлоновую мембрану и фиксировали ультрафиолетом.5 μg of DNA was treated with 10 units of SmaI restriction endonuclease overnight at 30 ° C, after which the DNA was separated on a 0.8% agarose gel, transferred to a nylon membrane and fixed with ultraviolet light.

Мембрану гибридизовали с α-³²P меченным с помощью DecaLabel™ DNA Labeling Kit (Fermentas, Канада) ПЦР-фрагментом геном lacl, полученным с использованием праймеров LacEco52 (SEQ ID NO:5) и LacXho2 (SEQ ID NO:6).The membrane was hybridized with α- ³² P labeled with DecaLabel ™ DNA Labeling Kit (Fermentas, Canada) by PCR fragment of the lacl gene obtained using the primers LacEco52 (SEQ ID NO: 5) and LacXho2 (SEQ ID NO: 6).

Для блот-гибридизации ДНК мембраны "HybondTM-N" (Amersham). Гибридизацию проводили при температуре 65°С 18 часов. Концентрации растворов для гибридизации и отмывки фильтров соответствовали рекомендациям производителя мембран:For blot hybridization of the DNA membrane "HybondTM-N" (Amersham). Hybridization was carried out at a temperature of 65 ° C for 18 hours. The concentration of the solutions for hybridization and filter washing was in accordance with the recommendations of the membrane manufacturer:

Раствор для предгибридизации и гибридизации:Solution for prehybridization and hybridization:

5×SSC5 × SSC

5×раствор Денхарда5 × Denhard solution

0,5% ДДС0.5% DDS

Денатурированная ДНК из спермы лосося 20 мкг/млDenatured Salmon Semen DNA 20 μg / ml

Отмывка фильтров:Filter washing:

2×SSC и 0,1% ДДС - 10 мин, 65°С2 × SSC and 0.1% DDS - 10 min, 65 ° C

1×SSC и 0,1% ДДС - 15 мин, 65°С1 × SSC and 0.1% DDS - 15 min, 65 ° C

0.1×SSC и 0,1% ДДС - 10 мин, 65°С 2 раза.0.1 × SSC and 0.1% DDS - 10 min, 65 ° C 2 times.

Так как сайт рестрикции SmaI уникален в плазмиде pBGlac и находится в середине кодирующей части гена, то однокопийный трансформант 17 показывал на радиоавтографе наличие только двух уникальных полос, в отличие от мультикопийных продуцентов.Since the SmaI restriction site is unique in the plasmid pBGlac and is located in the middle of the coding part of the gene, the single-copy transformant 17 showed only two unique bands on the radio-autograph, in contrast to multicopy producers.

Для определения количества копий генов lacl и xylD из нескольких трансформантов с высокими активностями ксиланазы и лакказы выделяли ДНК, разрушая клетки стеклянными шариками размером 0,05 мм на приборе FastPrep®-24 (МР, Великобритания), используя следующую методику:To determine the number of copies of the lacl and xylD genes, DNA was isolated from several transformants with high xylanase and laccase activities, destroying the cells with 0.05 mm glass beads on a FastPrep®-24 instrument (MR, UK) using the following procedure:

1) Гриб выращивали на чашке с минимальной средой, до образования спор (5-7 суток).1) The fungus was grown on a plate with minimal medium until spores formed (5-7 days).

2) 0,25-1 см² мицелия вырезали шпателем или скальпелем вместе с агаром и переносили в 2 мл микропробирку с крышкой, содержащую 50-100 мкг стеклянных шариков и 250 мкл буфера следующего состава:2) 0.25-1 cm ^{2 of} mycelium was excised with a spatula or scalpel along with agar and transferred into a 2 ml microtube with a lid containing 50-100 μg of glass beads and 250 μl of buffer of the following composition:

Буфер:Buffer:

Трис HCl (рН 7,5)Tris HCl (pH 7.5) 50 мМ (5 мл 1 М на 100)50 mM (5 ml 1 M per 100) ЭДТАEDTA 20 мМ (4 мл 0,5 М на 100)/*20 mM (4 ml 0.5 M per 100) / *

3) Пробирку помещали в гомогенизатор FastPrep®-24 и обрабатывали 3 раза по 30 сек при максимальной мощности.3) The tube was placed in a FastPrep®-24 homogenizer and processed 3 times for 30 seconds at maximum power.

4) Объем раздробленного мицелия измеряли, добавляли 1/20 объема 10% SDS, перемешивали и инкубировали при 65°С в течение 30 мин.4) The volume of fragmented mycelium was measured, 1/20 volume of 10% SDS was added, mixed and incubated at 65 ° C for 30 min.

5) После инкубирования к суспензии мицелия добавляли ¼ объема 5М ацетата калия (рН 5,0), перемешивали и инкубировали в ледяной бане 30-60 мин.5) After incubation, ¼ of a volume of 5 M potassium acetate (pH 5.0) was added to the mycelial suspension, mixed and incubated in an ice bath for 30-60 minutes.

6) Суспензию центрифугировали 10 мин при 10000-13000 об/мин, надосадочную жидкость отбирали и добавляли к ней двойной объем этанола, или равный объем изопропанола. Инкубировали 10-20 мин при температуре минус 20°С.6) The suspension was centrifuged for 10 min at 10,000-13,000 rpm, the supernatant was collected and a double volume of ethanol, or an equal volume of isopropanol, was added to it. Incubated for 10-20 minutes at a temperature of minus 20 ° C.

7) Центрифугировали 10 мин при 10000-13000 об/мин, надосадочную жидкость сливали, осадок промывали 70% этанолом, подсушивали 10 мин при 37°С и растворяли в 100 мкл деионизованной воды.7) Centrifuged for 10 min at 10000-13000 rpm, the supernatant was drained, the precipitate was washed with 70% ethanol, dried for 10 min at 37 ° C and dissolved in 100 μl of deionized water.

8) При наличии в растворе ДНК нерастворимых фрагментов или взвеси раствор центрифугировали 10 мин при 10000-13000 об/мин, надосадочную жидкость переносили в чистую пробирку.8) In the presence of insoluble fragments or suspension in the DNA solution, the solution was centrifuged for 10 min at 10,000-13,000 rpm, the supernatant was transferred to a clean tube.

Полученная ДНК была использована для проведения ПЦР РВ с праймерами на гены lac1 из Т. hirsutus, xylD из Р. canescens и клонированный нами ранее ген gpdA глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы Р. canescens (GenBank GQ996946): PCRTlacD1 (SEQ ID NO:10), PCRTlacR1 (SEQ ID NO:11), XDRTD (SEQ ID NO:12), XDRTR (SEQ ID NO:13), PCRTGPDD1 (SEQ ID NO:14), PCRTGPDR1 (SEQ ID NO:15).The obtained DNA was used to carry out PCR RV with primers for the lac1 genes from T. hirsutus, xylD from P. canescens and the gpdA gene we previously cloned glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase P. canescens (GenBank GQ996946): PCRTlacD1 (SEQ ID NO: 10) , PCRTlacR1 (SEQ ID NO: 11), XDRTD (SEQ ID NO: 12), XDRTR (SEQ ID NO: 13), PCRTGPDD1 (SEQ ID NO: 14), PCRTGPDR1 (SEQ ID NO: 15).

Для амплификации использовали Комплект реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии EVA Green («Компания СИНТОЛ», Россия). ПЦР-РВ проводили на приборе Bio-Rad CFX 96 («Bio-Rad Laboratories», США) в трех технических повтора для каждой пробы. Программа ПЦР-РВ: 95°С - 5 мин; (95°С - 15 сек; 60°С - 40 сек) 40 циклов. Анализ производили, используя программное обеспечение Bio-Rad CFX Manager v.1.6.541.1028, («Bio-Rad Laboratories», США). Так как количество копий гена gpdA не изменялось при трансформации, то он был выбран в качестве референсного гена, а изменение копий генов lac1 и xylD измерялось по отношению к однокопийному по гену lac1 штамму. Результаты ПЦР показаны на Фиг.8. Количественные данные приведены в таблице 2.For amplification, we used a PCR-RV Reagent Kit in the presence of EVA Green (SINTOL Company, Russia). PCR-RV was performed on a Bio-Rad CFX 96 instrument (Bio-Rad Laboratories, USA) in three technical replicates for each sample. PCR-RV program: 95 ° C - 5 min; (95 ° С - 15 sec; 60 ° С - 40 sec) 40 cycles. The analysis was performed using Bio-Rad CFX Manager software v.1.6.541.1028, (Bio-Rad Laboratories, USA). Since the number of copies of the gpdA gene did not change during transformation, it was chosen as the reference gene, and the change in copies of the lac1 and xylD genes was measured in relation to the single copy of the lac1 gene strain. PCR results are shown in FIG. Quantitative data are given in table 2.

Таблица 2
Количество копий генов lac1 из Т. hirsuta и xylD из Р. canescens в трансформантах 17, 47, 110, 180.table 2
The number of copies of the lac1 genes from T. hirsuta and xylD from P. canescens in transformants 17, 47, 110, 180. ГенGene ШтаммStrain Количество копийNumber of copies ПогрешностьError lac1lac1 1717 1.000001.00000 0.109930.10993 xylDxylD 1717 1.000001.00000 0.135720.13572 lac1Ilac1I 4747 1.055791.05579 0.035080.03508 xylDxylD 4747 38.8334938.83349 1.442981.44298 lac1lac1 110110 3.176183.17618 0.177960.17796 xylDxylD 110110 16.3057816.30578 0.689260.68926 lac1lac1 180180 6.293336.29333 0.701330.70133 xylDxylD 180180 35.5965635.59656 4.002974.00297

Как видно из полученных данных, количество копий гена lac1 слабо коррелирует с активностью лакказы в культуральной жидкости, что можно объяснить "эффектом положения", когда гены встраиваются в различные участки хроматина. В результате для дальнейшей работы отобраны три клона №47, №110 и №180.As can be seen from the obtained data, the number of copies of the lac1 gene weakly correlates with the activity of laccase in the culture fluid, which can be explained by the “position effect” when the genes are inserted into different regions of chromatin. As a result, three clones No. 47, No. 110 and No. 180 were selected for further work.

Отбор клона с максимальным уровнем выхода активных белковых продуктовSelection of a clone with a maximum yield of active protein products

Для изучения максимальной активности ксиланазы и лакказы отобраны следующие номера клонов-трансформантов 47, 110, 180 и штамм реципиент Р. canescens РСА-10-4/I-7/12 niaD^-, которые культивировали в колбах с последующим анализом культуральной жидкости.To study the maximum activity of xylanase and laccase, the following numbers of transforming clones 47, 110, 180 and the strain of the recipient P. canescens PCA-10-4 / I-7/12 niaD ^{- were} selected, which were cultured in flasks followed by analysis of the culture fluid.

Для получения посевного материала штаммы выращивали на агаризованной среде ММ в течение 14 суток. Водной суспензией конидий (105 конидий/мл) инокулировали 100 мл среды, следующего состава:To obtain seed, strains were grown on an agarized MM medium for 14 days. An aqueous suspension of conidia (105 conidia / ml) was inoculated with 100 ml of medium, of the following composition:

ГлюкозаGlucose 20 г20 g (NH₄)SO₄ (NH ₄ ) SO ₄ 4,7 г4.7 g Концентрат микроэлементов (50×)Trace Concentrate (50 ×) 20 мл20 ml Цитратно-фосфатный буфер 5×, 0.1 М рН 4,6Citrate Phosphate Buffer 5 ×, 0.1 M pH 4.6 20 мл20 ml CuSO₄×5H₂OCuSO ₄ × 5H ₂ O 0,25 г0.25 g CaCl₂×2H₂OCaCl ₂ × 2H ₂ O 0,15 г0.15 g Вода дистиллированнаяDistilled water До 1 лUp to 1 liter

Культивирование проводили в колбах на орбитальной качалке (250 об/мин) при 30°С в течение 6 суток. По завершению выращивания определяли активности эндоксиланазы и лакказы в культуральной жидкости (КЖ). Кроме этого, культуральная жидкость была проанализирована методом электрофореза в ПААГ. Результаты определения активностей ферментов ксиланазы и лакказы в культуральной жидкости представлены в таблице 3.Cultivation was carried out in flasks on an orbital shaker (250 rpm) at 30 ° C for 6 days. At the end of the growth, the activity of endoxylanase and laccase in the culture fluid (QL) was determined. In addition, the culture fluid was analyzed by electrophoresis in SDS page. The results of determining the activity of xylanase and laccase enzymes in the culture fluid are presented in table 3.

Активность эндо-1-4-β-D-ксиланазы в культуральной жидкости определяли по ГОСТ Р 53047-2008 с использованием березового ксилана в качестве субстрата. Для чего проводили инкубацию субстрата и фермента при температуре 50°С в течение 10 мин. Проба содержала 0,45 мл 1% раствора ксилана в 0,1 М ацетатном буферном растворе рН 5,0 и 0,05 мл фермента в соответствующем разведении. За единицу активности принимали количество фермента, высвобождающее 1 мкмоль/мин восстанавливающих сахаров при указанных выше условиях. Восстанавливающие сахара определяли методом Шомоди-Нельсона (А.П.Синицин, А.В.Гусаков, В.М.Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. - М.: Изд-во МГУ, 1995).The activity of endo-1-4-β-D-xylanase in the culture fluid was determined according to GOST R 53047-2008 using birch xylan as a substrate. For this, the substrate and the enzyme were incubated at a temperature of 50 ° С for 10 min. The sample contained 0.45 ml of a 1% solution of xylan in 0.1 M acetate buffer pH 5.0 and 0.05 ml of the enzyme in an appropriate dilution. The unit of activity was taken as the amount of enzyme releasing 1 μmol / min of reducing sugars under the above conditions. Reducing sugars were determined by the Shomody-Nelson method (A.P. Sinitsin, A.V. Gusakov, V.M. Chernoglazov. Bioconversion of lignocellulosic materials. - Moscow: Publishing House of Moscow State University, 1995).

Активность лакказы в культуральной жидкости штаммов детектировали спектрофотометрически (длина волны 410 нм), используя в качестве хромогенного субстрата 10 мМ раствор ПКХ в 0,1 М Na-ацетатном буфере рН 4,9. Пирокатехин был предварительно очищен возгонкой в вакууме. Реакционная смесь содержала 2 мл субстрата и 100 мкл культуральной жидкости.The activity of laccase in the culture fluid of the strains was detected spectrophotometrically (wavelength 410 nm) using a 10 mM PCB solution in 0.1 M Na-acetate buffer pH 4.9 as a chromogenic substrate. Pyrocatechol was previously purified by vacuum distillation. The reaction mixture contained 2 ml of substrate and 100 μl of culture fluid.

Таблица 3Table 3 Активности лакказы и ксиланазы в культуральных жидкостях отобранных клонов-трансформантовLaccase and Xylanase Activities in Culture Fluids of Selected Transformation Clones № штаммаStrain number Активность лакказы, УЕ/млThe activity of laccase, UE / ml Активность ксиланазы, Ед/млXylanase activity, U / ml PCA-10-4/I-7/12PCA-10-4 / I-7/12 отсутствуетabsent 4,64.6 №47Number 47 1,81.8 190190 №110No. 110 2,52,5 8484 №180No. 180 2,82,8 110110

В результате клоны №47, №110 и №180 могут считаться эффективными продуцентами ксиланазы и лакказы.As a result, clones No. 47, No. 110 and No. 180 can be considered effective producers of xylanase and laccase.

Пример 4. Оптимизация условий культивирования культивирования штамма Р. canescens - продуцента рекомбинантных ксиланазы и лакказы.Example 4. Optimization of cultivation conditions for the cultivation of a strain of P. canescens, a producer of recombinant xylanase and laccase.

В дальнейшей работе был использован штамм гриба Penicillium canscens PCA-10-4/I-7/12 №47.In further work, the Penicillium canscens strain PCA-10-4 / I-7/12 No. 47 was used.

Для определения оптимума рН среды для культивирования штамм РСА-10-4/I-7/12-47 для получения посевного материала выращивали на агаризованной среде следующего состава:To determine the optimum pH of the medium for cultivation, the strain PCA-10-4 / I-7 / 12-47 to obtain seed was grown on an agar medium of the following composition:

глюкозаglucose 10 г/л,10 g / l NH₄ClNH ₄ Cl 10 мМ,10 mm 50× раствор минеральных солей50 × solution of mineral salts 20 мл/л,20 ml / l агарagar 20 г/л20 g / l

Раствор минеральных солей (50×) имел состав: KCl - 26 г/л, MgSO₄×7Н₂О - 26 г/л, KH₂PO₄ - 76 г/л, микроэлементы - 50 мл/л. 50× раствор минеральных солей включал в себя CuSO₄×5H₂O - 400 мг/л, FeSO₄×5H₂O - 800 мг/л, MgSO₄×2H₂O - 800 мг/л, Na₂MoO₄×2H₂O - 800 мг /л, ZnSO₄×7H₂O - 800 мг/ л, B₄Ma₂O₇ - 40 мг/ л.A solution of mineral salts (50 ×) had the composition: KCl - 26 g / l, MgSO ₄ × 7Н ₂ О - 26 g / l, KH ₂ PO ₄ - 76 g / l, trace elements - 50 ml / l. A 50 × solution of mineral salts included CuSO ₄ × 5H ₂ O - 400 mg / L, FeSO ₄ × 5H ₂ O - 800 mg / L, MgSO ₄ × 2H ₂ O - 800 mg / L, Na ₂ MoO ₄ × 2H ₂ O - 800 mg / l, ZnSO ₄ × 7H ₂ O - 800 mg / l, B ₄ Ma ₂ O ₇ - 40 mg / l.

Выращивание проводили при 30°С в течение 7-10 суток до стадии конидиального спороношения.Cultivation was carried out at 30 ° C for 7-10 days to the stage of conidial sporulation.

По завершении этой стадии конидии смывали стерильной дистиллированной водой. Водной суспензией конидий инокулировали 100 мл среды (конечный титр засева - 1×10⁵ конидий/мл).At the end of this stage, conidia were washed off with sterile distilled water. An aqueous suspension of conidia was inoculated with 100 ml of medium (final inoculation titer - 1 × 10 ⁵ conidia / ml).

Была использована ферментационная среда следующего состава:The fermentation medium of the following composition was used:

глюкозаglucose 20 г20 g (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 4,7г4.7g концентрат микроэлементов 50×trace element concentrate 50 × 20 мл20 ml цитратно-фосфатный буфер 5×0,1 М рН 4,6 или рН 6,6citrate phosphate buffer 5 × 0.1 M pH 4.6 or pH 6.6 20 мл20 ml CaCl₂×2H₂OCaCl ₂ × 2H ₂ O 750 мг750 mg CuSO₄×5H₂OCuSO ₄ × 5H ₂ O 250 мг250 mg вода дистиллированнаяdistilled water до 1 лup to 1 l

В этой среде в качестве источника углерода используется глюкоза, поскольку штамм-продуцент является мутантом creA^-. Кроме этого, из состава среды исключен индуктор транскрипции целевых генов - арабиноза, поскольку реципиентный штамм получен как мутант с арабинозо-независимой индукцией. Концентрацию кукурузного экстракта в среде варьировали от 1% до 5%.In this environment, glucose is used as a carbon source, since the producer strain is a creA ^- mutant. In addition, the inducer of target gene transcription, arabinose, was excluded from the medium, since the recipient strain was obtained as a mutant with arabinose-independent induction. The concentration of corn extract in the medium ranged from 1% to 5%.

Культивирование проводили в ферментационной среде (100 мл) на орбитальной качалке при 240-250 об/мин в качалочных колбах на 750 мл в течение 140 часов. После этого культуральную жидкость отделяли центрифугированием в течение 3 мин при 12000 об/мин. В результате установлено, что уровень активности лакказы не зависит ни от рН среды культивирования, ни от концентрации кукурузного экстракта. В противоположность этому установлено, что продукция ксиланазы xylD сильно зависит от рН среды культивирования, наблюдается в диапазоне рН 4,0-6,0, имея максимум при рН 4,5. По результатам проведенного эксперимента оптимальными условиями признаны: рН среды культивирования 4,5; содержание в среде кукурузного экстракта 3%.Cultivation was carried out in a fermentation medium (100 ml) on an orbital shaker at 240-250 rpm in 750 ml rocking flasks for 140 hours. After that, the culture fluid was separated by centrifugation for 3 min at 12,000 rpm. As a result, it was found that the level of laccase activity does not depend either on the pH of the cultivation medium or on the concentration of the corn extract. In contrast, it was found that xylD xylanase production is highly dependent on the pH of the culture medium, observed in the pH range 4.0–6.0, with a maximum at pH 4.5. According to the results of the experiment, the optimal conditions were recognized: pH of the culture medium 4.5; the content in the medium of corn extract 3%.

Выбранные условия культивирования был проверены в ходе ферментации в аппарате Biostat Bplus (Sartorius) с рабочим объемом 2,0 л. Для этого штамм Penicillium canscens PCA-10-4/I-7/12 №47 выращивали по следующей схеме:The selected cultivation conditions were checked during fermentation in a Biostat Bplus apparatus (Sartorius) with a working volume of 2.0 l. For this, the strain Penicillium canscens PCA-10-4 / I-7/12 No. 47 was grown according to the following scheme:

Посевной материал выращивали на агаризованной среде при 30°С в течение 7-10 суток. Водной суспензией конидий инокулировали 100 мл посевной среды (конечная концентрация - 1×10⁵ конидий/мл) следующего состава:The seed was grown on an agar medium at 30 ° C for 7-10 days. An aqueous suspension of conidia was inoculated with 100 ml of inoculum (final concentration 1 × 10 ⁵ conidia / ml) of the following composition:

глюкозаglucose 20 г20 g концентрат микроэлементов 50× без медиtrace element concentrate 50 × copper free 20 мл20 ml цитратно-фосфатный буфер 5×, 0.1 М рН 4,6citrate-phosphate buffer 5 ×, 0.1 M pH 4.6 20 мл20 ml (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 4,7 г4.7 g вода дистиллированнаяdistilled water до 1 лup to 1 l

Культивирование проводили в ферментационной среде на орбитальной качалке при 240-250 об/мин в качалочных колбах на 750 мл в течение 24 часов.Cultivation was carried out in a fermentation medium on an orbital shaker at 240-250 rpm in 750 ml rocking flasks for 24 hours.

Ферментер засевали суточным посевным материалом в количестве 200 мл.The fermenter was seeded with daily seed in an amount of 200 ml.

Использовалась ферментационная среда следующего состава:Used fermentation medium of the following composition:

глюкозаglucose 15 г15 g (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 4,7 г4.7 g концентрат микроэлементов 50× без медиtrace element concentrate 50 × copper free 20 мл20 ml кукурузный экстрактcorn extract 30 г30 g цитратно-фосфатный буфер 5×, 0.1 М рН 4,6citrate-phosphate buffer 5 ×, 0.1 M pH 4.6 20 мл20 ml CaCl₂×2H₂OCaCl ₂ × 2H ₂ O 750 мг750 mg CuSO₄×5H₂OCuSO ₄ × 5H ₂ O 125 мг125 mg вода дистиллированнаяdistilled water до 1 лup to 1 l

Ферментацию проводили в 1,5 л среды при 30°С. Аэрацию в аппарате осуществляли с помощью двухъярусных грибных импеллеров при 300 об/мин. Подача стерильного воздуха составляла 1 V/V/мин.Fermentation was carried out in 1.5 l of medium at 30 ° C. Aeration in the apparatus was carried out using two-tier mushroom impellers at 300 rpm. The supply of sterile air was 1 V / V / min.

Активности лакказы и ксиланазы определяли как описано выше. Результаты представлены на Фиг.9. Как видно из представленных данных, в ходе ферментации происходит постоянное накопление активности лакказы. Активность ксиланазы накапливается после 1 суток культивирования и начинает снижаться после 80 ч культивирования.Laccase and xylanase activities were determined as described above. The results are presented in Fig.9. As can be seen from the data presented, during the fermentation there is a constant accumulation of laccase activity. Xylanase activity accumulates after 1 day of cultivation and begins to decline after 80 hours of cultivation.

Как было далее установлено, одной из причин падения активности ксиланазы являлась протеолитическая деградация ксиланазы секретируемыми протеиназами гриба. При этом мажорная протеолитическая активность в культуральной жидкости связана с присутствием в ней металлопротеиназ.As it was further established, one of the reasons for the decrease in xylanase activity was the proteolytic degradation of xylanase by secreted fungal proteinases. Moreover, major proteolytic activity in the culture fluid is associated with the presence of metalloproteinases in it.

С учетом полученных по ингибированию данных, приведенных выше, проверена продукция и стабильность ксиланаз при ферментации продуцента в присутствии ингибитора маталлопротеиназ - ЭДТА. Установлено, что максимальная продукция целевых ферментов достигается при добавлении ЭДТА в концентрации 0,2 мМ на 2-е сутки роста.Taking into account the above data on inhibition, the production and stability of xylanases during producer fermentation in the presence of a matalloproteinase inhibitor, EDTA, was verified. It was found that the maximum production of the target enzymes is achieved by adding EDTA at a concentration of 0.2 mM on the 2nd day of growth.

Пример 5. Подбор методов очистки и концентрирования ферментовExample 5. The selection of methods for purification and concentration of enzymes

Ксиланаза и лакказа являются экстарцеллюлярными (внеклеточными) ферментами, поэтому в качестве первой стадии очистки и выделения целевых ферментов можно рассматривать стадию отделения биомассы. Наиболее современными методами отделения биомассы являются баромембранные методы, а именно микрофильтрация.Xylanase and laccase are extracellular (extracellular) enzymes; therefore, the stage of separation of biomass can be considered as the first stage of purification and isolation of target enzymes. The most modern methods of separating biomass are baromembrane methods, namely microfiltration.

Культуральную жидкость, полученную после культивирования штамма Penicillium canscens PCA-10-4/I-7/12 №47 с активностью ксиланазы 450 Ед/мл и активностью лакказы 1,12 Ед/мл фильтровали на микрофильтрационной мембране 0,45 мкм при давлении 2 Бар (=1,974 Атм) и температуре 20°С. Степень концентрирования составляла K=2. Как показал проведенный опыт, при микрофильтрации культуральной жидкости не происходит разделения биомассы и ферментов. Происходит лишь концентрирование культуральной жидкости. Процесс диафильтрации в данном случае значительно не влияет на вымывание фермента. По-видимому, полученный результат можно объяснить двумя причинами: адсорбцией ферментов на биомассе и образованием высокомолекулярных соединений с фильтрационными характеристиками, не соответствующими ситовой фильтрации. Таким образом, отделение биомассы мембранными методами не эффективно.The culture fluid obtained after culturing Penicillium canscens strain PCA-10-4 / I-7/12 No. 47 with xylanase activity of 450 U / ml and laccase activity of 1.12 U / ml was filtered on a 0.45 μm microfiltration membrane at a pressure of 2 Bar (= 1.974 Atm) and a temperature of 20 ° C. The degree of concentration was K = 2. As shown by the experience, during microfiltration of the culture fluid, there is no separation of biomass and enzymes. Only the concentration of the culture fluid occurs. The diafiltration process in this case does not significantly affect the leaching of the enzyme. Apparently, the result can be explained by two reasons: adsorption of enzymes on biomass and the formation of high molecular weight compounds with filtration characteristics that do not correspond to sieve filtration. Thus, separation of biomass by membrane methods is not effective.

Далее проводили изучение эффективности концентрирования фермента на мембранах с молекулярной отсечкой 5 кДа, 10 кДа и 15 кДа (ультрафильтрация).Next, we studied the effectiveness of the concentration of the enzyme on membranes with a molecular cut-off of 5 kDa, 10 kDa, and 15 kDa (ultrafiltration).

Осветленный фильтрат культуральной жидкости с рН 5,5 концентрировали на лабораторной ультрафильтрационной установке LabScale производства MILLIPORE (США) в тангенциальном потоке.The clarified filtrate of the culture fluid with a pH of 5.5 was concentrated on a laboratory ultrafiltration unit LabScale manufactured by MILLIPORE (USA) in a tangential flow.

Технические характеристики системы:System Specifications:

Максимальное входное давлениеMaximum inlet pressure 4,2 Атм4.2 atm Скорость подачи раствораMortar feed rate 10-300 мл/мин10-300 ml / min Рабочий диапазон температурOperating temperature range 4-45°С4-45 ° C

В соответствии с данными электрофореза культуральной жидкости ксиланаза А, ксиланаза Д и лакказа имеют молекулярную массу около 30-и, 25-и 70-и кДа соответственно. В связи с чем для изучения возможности мембранной очистки и концентрирования ферментов в работе использовали кассеты типа Pellicon XL 50 с мембранами, предел отсечения которых составлял 5 кДа, 10 кДа и 30 кДа. Кассеты Pellicon XL 50 подсоединяются к установке LabScale и обладают линейной масштабируемостью, т.е. параметры процесса могут быть пересчитаны для работы на кассетах Pellicon с большей площадью фильтрации.According to the electrophoresis of the culture fluid of xylanase A, xylanase D and laccase have a molecular weight of about 30, 25 and 70 kDa, respectively. In this connection, to study the possibility of membrane purification and concentration of enzymes, we used Pellicon XL 50 cassettes with membranes with a cutoff limit of 5 kDa, 10 kDa, and 30 kDa. Pellicon XL 50 cassettes are connected to the LabScale installation and have linear scalability, i.e. process parameters can be recalculated to work on Pellicon cassettes with a larger filtration area.

Технические характеристики кассеты Pellicon XL 50:Technical characteristics of the cartridge Pellicon XL 50:

Материал мембраныMembrane material полиэфирсульфонpolyethersulfone Рабочий диапазон рНPH range 1-141-14 Рабочий диапазон температурOperating temperature range 4-45°С4-45 ° C Максимальное выходное давление насосаMaximum pump outlet pressure 5,8 Атм5.8 atm Минимальный объем для рециркуляцииMinimum volume for recirculation 10 мл10 ml

Процесс ультрафильтрации проводили при давлении Р=3 Бар (=2,961 Атм), с температурой Т=20°С. Степень концентрирования составляла K=5. По достижении степени концентрирования K=3 проводили процесс диафильтрации водой (V=2 л). Затем снова концентрировали до K=5.The ultrafiltration process was carried out at a pressure of P = 3 Bar (= 2.961 Atm), with a temperature of T = 20 ° C. The degree of concentration was K = 5. Upon reaching the degree of concentration K = 3, the process of diafiltration with water (V = 2 L) was carried out. Then concentrated again to K = 5.

В ходе проведенного опыта было показано, что ультрафильтрация культурального фильтрата в испытанных параметрах процесса не оказывает существенного инактивирующего влияния на целевые ферменты. Однако на мембранах предел отсечения которых составлял 10 кДа и 30 кДа наибольшая ксиланазная активность детектировалась в пермеате, в то время как на мембране с пределом отсечения 5 кДа, в пермеате ксиланазная активность детектировалась в минимальных количествах. Таким образом, для дальнейших исследований была выбрана ультрафильтрационная мембрана с пределом отсечения 5 кДа.In the course of the experiment, it was shown that ultrafiltration of the culture filtrate in the tested process parameters does not have a significant inactivating effect on the target enzymes. However, on membranes, the cutoff limit of which was 10 kDa and 30 kDa, the highest xylanase activity was detected in permeate, while on the membrane with a cutoff limit of 5 kDa, xylanase activity was detected in minimal amounts in permeate. Thus, for further studies, an ultrafiltration membrane with a cutoff limit of 5 kDa was chosen.

Далее изучали возможность получения концентрата целевых ферментов методом вакуум-выпаривания.Next, we studied the possibility of obtaining a concentrate of target enzymes by vacuum evaporation.

В работе также были получены образцы ферментного препарата путем имитации в лабораторных условиях вакуум-выпаривания с использованием ротационного испарителя Hei Vap Advantage HB/G3B производства Heidolph (Германия) в комплекте с вакуумным насосом Rotavac valve control.Samples of the enzyme preparation were also obtained by simulating vacuum evaporation under laboratory conditions using a Hei Vap Advantage HB / G3B rotary evaporator manufactured by Heidolph (Germany) complete with a Rotavac valve control vacuum pump.

Технические характеристики системы:System Specifications:

Скорость вращения ротораRotor speed 20-280 об/мин20-280 rpm Температура баниBath temperature 20-210°С20-210 ° C Точность поддержания температуры баниThe accuracy of maintaining the temperature of the bath ±1°С± 1 ° C Предельное давление вакуумаVacuum pressure limit 2 мбар2 mbar

Процесс вакуум-выпаривания осветленного фильтрата проводили при следующих температурах: Т=50, 55 и 60°С. Степень концентрирования составляла K=4 и K=8. В ходе проведенного опыта было показано, что при температурах Т=55 и 60°С происходит значительная (более 30%) инактивация ксиланазы. Проведение процесса вакуум-выпаривания при температуре Т=50°С не оказывает инактивирующего влияния на лакказу, при этом инактивация ксиланазы составляет около 10% при K=4 и около 15% при K=8. Следовательно оптимальной температурой для получения концентрата целевых ферментов является температура процесса вакуум-выпаривания Т=50°С.The vacuum evaporation of the clarified filtrate was carried out at the following temperatures: T = 50, 55 and 60 ° C. The degree of concentration was K = 4 and K = 8. During the experiment, it was shown that at temperatures T = 55 and 60 ° C there is a significant (more than 30%) inactivation of xylanase. The process of vacuum evaporation at a temperature of T = 50 ° C does not have an inactivating effect on laccase, while the inactivation of xylanase is about 10% at K = 4 and about 15% at K = 8. Therefore, the optimum temperature for obtaining the concentrate of the target enzymes is the temperature of the vacuum evaporation process T = 50 ° C.

Claims (10)

1. Клетка мицелиального гриба Penicillium canescens со снятой катаболитной репрессией и арабинозной индукцией, трансформированная плазмидой, по существу содержащей промотор гена bgaS, лидерный пептид bgaS, фрагмент ДНК, кодирующий ксиланазу, терминатор bgaS, ген β-лактамазы и репликон pMB1, и плазмидой, по существу содержащей промотор гена bgaS, лидерный пептид bgaS, фрагмент ДНК, кодирующий лакказу, терминатор bgaS, ген β-лактамазы и репликон pMB1, - продуцент ксиланазы и лакказы.1. Cell of mycelial fungus Penicillium canescens with eliminated catabolite repression and arabinose induction, transformed with a plasmid essentially containing a promoter of the bgaS gene, leader peptide bgaS, DNA fragment encoding xylanase, terminator bgaS, β-lactamase gene and replicon pMB1, and plasmid essentially containing the promoter of the bgaS gene, the leader peptide bgaS, the DNA fragment encoding laccase, the terminator bgaS, the β-lactamase gene and replicon pMB1, are the producers of xylanase and laccase. 2. Клетка по п.1, отличающаяся тем, что используют промотор, лидерный пептид и терминатор гена bgaS из Penicillium canescens.2. The cell according to claim 1, characterized in that the promoter, leader peptide and terminator of the bgaS gene from Penicillium canescens are used. 3. Клетка по п.1, отличающаяся тем, что указанными плазмидами являются плазмиды pBGxylD и pBGlac, соответственно.3. The cell according to claim 1, characterized in that said plasmids are plasmids pBGxylD and pBGlac, respectively. 4. Клетка по п.1, являющаяся трансформированной плазмидами pBGlac и pBGxylD клеткой штамма Penicillium canescens PCA-10-4/I-7/12 niaD^-.4. The cell of claim 1, which is transformed and plasmids pBGlac pBGxylD cell strain Penicillium canescens PCA-10-4 / I-7/12 niaD ^-. 5. Способ получения ферментного препарата ксиланазы и лакказы, включающий стадии выращивания клеток мицелиального гриба Penicillium canescens по п.1 в питательной среде и выделения ферментного препарата ксиланазы и лакказы из культуральной жидкости.5. A method of obtaining an enzyme preparation of xylanase and laccase, comprising the steps of growing cells of the mycelial fungus Penicillium canescens according to claim 1 in a nutrient medium and isolating the enzyme preparation of xylanase and laccase from the culture fluid. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что в качестве клеток мицелиального гриба используют трансформированные плазмидами pBGlac и pBGxylD клетки штамма Penicillium canescens PCA-10-4/I-7/12 niaD^-.6. The method according to claim 5, characterized in that cells of the Penicillium canescens strain PCA-10-4 / I-7/12 niaD ^- , transformed with plasmids pBGlac and pBGxylD, are used as mycelial fungus cells. 7. Способ по п.5, отличающийся тем, что выращивание клеток штамма продуцента осуществляют в присутствии ингибиторов металлопротеиназ.7. The method according to claim 5, characterized in that the cells of the producer strain are grown in the presence of metalloproteinase inhibitors. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что в качестве ингибитора металлопротеиназ используют ЭДТА.8. The method according to claim 7, characterized in that EDTA is used as an inhibitor of metalloproteinases. 9. Способ по п.5, отличающийся тем, что выращивание клеток осуществляют в среде с рН в интервале 4.0-6.0.9. The method according to claim 5, characterized in that the cell growth is carried out in a medium with a pH in the range of 4.0-6.0. 10. Способ по п.5, отличающийся тем, что выделение ферментных препаратов ксиланазы и лакказы из культуральной жидкости осуществляют путем концентрирования с использованием ультрафильтрации на мембране с порогом отсечения 5 кДа с последующим вакуум-выпариванием фильтрата культуральной жидкости при температуре 40-70°С. 10. The method according to claim 5, characterized in that the isolation of the enzyme preparations of xylanase and laccase from the culture fluid is carried out by concentration using ultrafiltration on a membrane with a cutoff threshold of 5 kDa, followed by vacuum evaporation of the filtrate of the culture fluid at a temperature of 40-70 ° C.

Images