RU2524152C2

RU2524152C2 - Medication for treatment of rheumatoid arthritis

Info

Publication number: RU2524152C2
Application number: RU2011142183/10A
Authority: RU
Inventors: Томоюки ИГАВА; Синя ИСИИ; Ацухико МАЕДА; Мика САКУРАИ; Тецуо КОДЗИМА; Тацухико ТАТИБАНА; Хиротаке СИРАИВА; Хироюки ЦУНОДА; Йосинобу ХИГУТИ
Original assignee: Чугаи Сейяку Кабусики Кайся
Priority date: 2009-03-19
Filing date: 2010-03-19
Publication date: 2014-07-27
Also published as: JP4809930B2; TW201034685A; WO2010107108A1; KR20110139734A; RU2011142183A; KR101314880B1; JPWO2010107108A1; JP2011219478A; TWI457134B

Abstract

FIELD: medicine, pharmaceutics.

SUBSTANCE: claimed invention relates to the field of immunology. Disclosed is a method of treating rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children or Castelman's disease, application of an antibody in the said method, as well as application of an antibody in production of a medication for treatment of rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children or Castelman's disease. The antibody by the claimed invention possesses an improved antigen-neutralising ability, pharmacokinetics, immunogenicity, safety and physicochemical properties and can be further applied in therapy of diseases, associated with the activation of the receptor IL-6.

EFFECT: claimed is the medication for treatment of rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children or Castelman's disease, representing the antibody against the receptor IL-6, obtained on the basis of the antibody TOCILIZUMAB.

12 cl, 5 dwg, 2 ex

Description

Техническая областьTechnical area

Настоящее изобретение относится к лекарственным средствам для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которые содержат антитело к рецептору IL-6 в качестве активного ингредиента.The present invention relates to medicines for the treatment of rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children or Castleman's disease, which contain an antibody to the IL-6 receptor as an active ingredient.

Предпосылки изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION

IL-6 представляет собой цитокин с различными функциями и продуцируется различными видами клеток, такими, как Т-клетки, В-клетки, моноциты, фибробласты, остеобласты, кератиноциты, эндотелиальные клетки, мезангиальные клетки и синовиальные клетки (Непатентные документы 1 и 2). IL-6 связывается с IL-6-рецептором, и затем сигнал передается в клетки после связывания комплекса IL-6/рецептор IL-6 с gp130 (Непатентный документ 3). Существует два типа рецепторов IL-6: мембранного типа и растворимая форма. Растворимая форма рецептора IL-6 также может образовывать комплекс IL-6/рецептор IL-6 и, таким образом, способна обеспечивать передачу сигнала через связывание с gp130.IL-6 is a cytokine with various functions and is produced by various types of cells, such as T cells, B cells, monocytes, fibroblasts, osteoblasts, keratinocytes, endothelial cells, mesangial cells and synovial cells (Non-Patent Documents 1 and 2). IL-6 binds to the IL-6 receptor, and then the signal is transmitted to cells after binding of the IL-6 / IL-6 receptor complex to gp130 (Non-Patent Document 3). There are two types of IL-6 receptors: membrane type and soluble form. The soluble form of the IL-6 receptor can also form an IL-6 / IL-6 receptor complex and, thus, is able to provide signal transmission through binding to gp130.

Ревматоидный артрит (РА) представляет собой системное воспалительное заболевание неизвестной причины, и его основными симптомами являются частые артриты и прогрессирующее разрушение суставов. Внесуставные симптомы включают распространение патологических изменений в легкие, почки и подкожные ткани. Отличительным признаком РА является устойчивый синовит, несмотря на то, что существуют различные системные симптомы. Патологической функциональной особенностью этого заболевания является разрушение хрящей, синовит, который вызывает эрозию костей и последующую функциональную потерю сустава. При РА происходит увеличение кровеносных сосудов в суставах, и лейкоциты, такие как лимфоциты и макрофаги, мигрируют из кровеносных сосудов в суставные синовиальные ткани. В суставе происходит местный иммунный ответ, где воспалительная реакция индуцируется действием цитокинов, произведенных из лимфоцитов и макрофагов. В результате, деструкция хрящей/костей прогрессирует.Rheumatoid arthritis (RA) is a systemic inflammatory disease of an unknown cause, and its main symptoms are frequent arthritis and progressive destruction of the joints. Extraarticular symptoms include the spread of pathological changes to the lungs, kidneys, and subcutaneous tissue. A distinctive feature of RA is persistent synovitis, despite the fact that there are various systemic symptoms. The pathological functional feature of this disease is the destruction of cartilage, synovitis, which causes bone erosion and subsequent functional loss of the joint. In RA, there is an increase in blood vessels in the joints, and white blood cells, such as lymphocytes and macrophages, migrate from the blood vessels to the joint synovial tissues. A local immune response occurs in the joint, where an inflammatory response is induced by the action of cytokines derived from lymphocytes and macrophages. As a result, the destruction of cartilage / bone progresses.

При РА наблюдается следующее: увеличивается скорость осаждения эритроцитов, возрастает уровень СРБ (C-реактивного белка), увеличивается число тромбоцитов, увеличивается уровень поликлональных иммуноглобулинов и присутствует ревматоидный фактор. Возникло предложение, что IL-6 вовлечен в эти изменения. Как сообщалось, уровень IL-6 повышен в сыворотке и суставной жидкости больных РА, и, таким образом, существует корреляция между уровнем IL-6 и степенью активности заболевания РА (Непатентные документы от 4 до 6). Также было показано, что у пациентов с РА продуцирование IL-6 в синовиальной ткани увеличено (Непатентный документ 7). Кроме того, сообщалось, что IL-6 вовлечен в резорбцию кости путем активирования дифференциации клеток-предшественников остеокластов в остеокласты в присутствии растворимого рецептора IL-6 (Непатентный документ 8). Эти обнаружения позволяют предположить, что IL-6 и растворимый рецептор IL-6 принимают участие в разрушении сустава. Действительно, в суставной жидкости больных РА уровень растворимого рецептора IL-6 повышен. Концентрации растворимого рецептора IL-6 и IL-6 являются достаточно высокими и сравнимы с уровнями, которые дают возможность индуцировать остеокласты in vitro (Непатентный документ 9). Таким образом, предполагается, что IL-6 вовлечен в различные процессы, такие как образование антител, инфильтрация лимфоцитов, образование паннуса, разрушение суставов, острофазовая реакция и анемия в патогенезе РА (Непатентный документ 10). Результаты недавних клинических исследований РА продемонстрировали отличный эффект гуманизированного антитела против IL-6R (TOCILIZUMAB), которое может связываться как с рецептором IL-6R мембранного типа, так и растворимым рецептором IL-6 и, тем самым, ингибировать IL-6-сигнал. Это говорит о том, что ингибирование рецептора IL-6 является высокоэффективным терапевтическим способом лечения РА (Непатентный документ 10).In RA, the following is observed: the erythrocyte sedimentation rate increases, the level of CRP (C-reactive protein) increases, the number of platelets increases, the level of polyclonal immunoglobulins increases, and rheumatoid factor is present. There was a suggestion that IL-6 is involved in these changes. As reported, the level of IL-6 is increased in the serum and joint fluid of patients with RA, and thus there is a correlation between the level of IL-6 and the degree of activity of the disease of RA (Non-Patent Documents 4 to 6). It has also been shown that in patients with RA, the production of IL-6 in synovial tissue is increased (Non-Patent Document 7). In addition, it has been reported that IL-6 is involved in bone resorption by activating the differentiation of osteoclast progenitor cells into osteoclasts in the presence of a soluble IL-6 receptor (Non-Patent Document 8). These findings suggest that IL-6 and the soluble IL-6 receptor are involved in joint destruction. Indeed, the soluble IL-6 receptor level is increased in the joint fluid of patients with RA. The soluble IL-6 and IL-6 receptor concentrations are quite high and comparable to levels that make it possible to induce osteoclasts in vitro (Non-Patent Document 9). Thus, it is suggested that IL-6 is involved in various processes, such as antibody formation, lymphocyte infiltration, pannus formation, joint destruction, acute phase reaction and anemia in the pathogenesis of RA (Non-Patent Document 10). Recent clinical trials of RA have demonstrated the excellent effect of a humanized anti-IL-6R antibody (TOCILIZUMAB), which can bind both the membrane-type IL-6R receptor and the soluble IL-6 receptor and thereby inhibit the IL-6 signal. This suggests that inhibition of the IL-6 receptor is a highly effective therapeutic method for treating RA (Non-Patent Document 10).

Также известно, что, в дополнение к РА, TOCILIZUMAB является эффективным при лечении хронического артрита у детей и болезни Кастлемена.It is also known that, in addition to RA, TOCILIZUMAB is effective in treating chronic arthritis in children and Castlemen's disease.

Прототипные документы рассматриваемой области, связанные с настоящим изобретением, представлены ниже.Prototype documents of the subject area associated with the present invention are presented below.

Прототипные документы рассматриваемой областиPrototype documents of the considered area

[Непатентные документы][Non-Patent Documents]

[Непатентный документ 1] Kishimoto T. The biology of interleukin-6. Blood 1989; 74: 1-10. [Non-Patent Document 1] Kishimoto T. The biology of interleukin-6. Blood 1989; 74: 1-10.

[Непатентный документ 2] Guerne PA, Zuraw BL, Vaughan JH, Carson DA, Lцtz M. Synovium 20 as a source of interleukin 6 in vitro. Contribution to local and systemic manifestations of arthritis. J Clin Invest 1989; 83: 585-92.[Non-Patent Document 2] Guerne PA, Zuraw BL, Vaughan JH, Carson DA, Ltz M. Synovium 20 as a source of interleukin 6 in vitro. Contribution to local and systemic manifestations of arthritis. J Clin Invest 1989; 83: 585-92.

[Непатентный документ 3] Nishimoto N, Kishimoto T. Interleukin 6: from bench to bedside. Nature Clinical Practice Rheumatology 2006; 11: 19-26.[Non-Patent Document 3] Nishimoto N, Kishimoto T. Interleukin 6: from bench to bedside. Nature Clinical Practice Rheumatology 2006; 11: 19-26.

[Непатентный документ 4] Hirano T, Matsuda T, Turner M, Miyasaka N, Buchan G, Tang B, 25 Sato K, Shimizu M, Maini R, Feldmann M, Kishimoto T: Excessive production of interleukin 6/B cell stimulatory factor-2 in rheumatoid arthritis. European Journal of Immunology 1988; 18: 1797-1801.[Non-Patent Document 4] Hirano T, Matsuda T, Turner M, Miyasaka N, Buchan G, Tang B, 25 Sato K, Shimizu M, Maini R, Feldmann M, Kishimoto T: Excessive production of interleukin 6 / B cell stimulatory factor- 2 in rheumatoid arthritis. European Journal of Immunology 1988; 18: 1797-1801.

[Непатентный документ 5] Houssiau FA, Devogelaer JP, Van Damme J, De Deuxchaisnes CN, Van Snick J: Interleukin-6 in synovial fluid and serum of patients with rheumatoid arthritis and 30 other inflammatory arthritides. Arthritis & Rheumatism. 1988; 31: 784-788.[Non-patent document 5] Houssiau FA, Devogelaer JP, Van Damme J, De Deuxchaisnes CN, Van Snick J: Interleukin-6 in synovial fluid and serum of patients with rheumatoid arthritis and 30 other inflammatory arthritides. Arthritis & Rheumatism. 1988; 31: 784-788.

[Непатентный документ 6] Madhok R, Crilly A, Watson J, Capell HA. Serum interleukin 6 levels in rheumatoid arthritis: correlations with clinical and laboratory indices of disease activity. Ann Rheum Dis 1993; 52:232-4.[Non-Patent Document 6] Madhok R, Crilly A, Watson J, Capell HA. Serum interleukin 6 levels in rheumatoid arthritis: correlations with clinical and laboratory indices of disease activity. Ann Rheum Dis 1993; 52: 232-4.

[Непатентный документ 7] Sack U, Kinne RW, Marx T, Heppt P, Bender S, Emmrich F: 35 Interleukin-6 in synovial fluid is closely associated with chronic synovitis in rheumatoid arthritis. Rheumatolology International 1993; 13: 45-51.[Non-patent document 7] Sack U, Kinne RW, Marx T, Heppt P, Bender S, Emmrich F: 35 Interleukin-6 in synovial fluid is closely associated with chronic synovitis in rheumatoid arthritis. Rheumatolology International 1993; 13: 45-51.

[Непатентный документ 8] Tamura T, Udagawa N, Takahashi N, Miyaura C, Tanaka S, Yamada Y, Koishihara Y, Ohsugi Y, Kumaki K, Taga T, Kishimoto T, Suda T: Soluble interleukin-6 receptor triggers osteoclast formation by interleukin 6. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA 1993; 90: 11924-11928.[Non-patent Document 8] Tamura T, Udagawa N, Takahashi N, Miyaura C, Tanaka S, Yamada Y, Koishihara Y, Ohsugi Y, Kumaki K, Taga T, Kishimoto T, Suda T: Soluble interleukin-6 receptor triggers osteoclast formation by interleukin 6. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA 1993; 90: 11924-11928.

[Непатентный документ 9] Kotake S, Sato K, Kim KJ, Takahashi N, Udagawa N, Nakamura I, Yamaguchi A, Kishimoto T, Suda T, Kashiwazaki S: Interleukin-6 and soluble interleukin-6 receptors in the synovial fluids from rheumatoid arthritis patients are responsible for osteoclast- like cell formation. Journal of Bone & Mineral Research 1996; 11: 88-95.[Non-Patent Document 9] Kotake S, Sato K, Kim KJ, Takahashi N, Udagawa N, Nakamura I, Yamaguchi A, Kishimoto T, Suda T, Kashiwazaki S: Interleukin-6 and soluble interleukin-6 receptors in the synovial fluids from rheumatoid arthritis patients are responsible for osteoclast- like cell formation. Journal of Bone & Mineral Research 1996; 11: 88-95.

[Непатентный документ 10] Inhibiting interleukin-6 in rheumatoid arthritis. Choy E. Curr 10 Rheumatol Rep. 2008 Oct; 10(5): 413-7.[Non-Patent Document 10] Inhibiting interleukin-6 in rheumatoid arthritis. Choy E. Curr 10 Rheumatol Rep. 2008 Oct; 10 (5): 413-7.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

[Проблемы, разрешаемые путем изобретения][Problems solved by the invention]

Настоящее изобретение было осуществлено в свете вышеуказанных обстоятельств. Целью данного изобретения является предоставление лекарственных средств для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которые включают в качестве активного ингредиента антитело к рецептору IL-6. Конкретнее, настоящее изобретение представляет лекарственные средства для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которые включают в качестве активного ингредиента антитело против рецептора IL-6 с улучшенными антиген-нейтрализующей способностью, фармакокинетикой (сохранение в плазме), иммуногенностью, безопасностью и физико-химическими свойствами, благодаря замененным аминокислотам в Tocilizumab, которое применялось в качестве лекарственного средства для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена.The present invention has been made in light of the above circumstances. The aim of this invention is the provision of medicines for the treatment of rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children or Castleman's disease, which include an antibody to the IL-6 receptor as an active ingredient. More specifically, the present invention provides medicaments for the treatment of rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children, or Castlemen's disease, which include, as an active ingredient, an anti-IL-6 antibody with improved antigen-neutralizing ability, pharmacokinetics (plasma retention), immunogenicity, safety and physico-chemical properties, thanks to the substituted amino acids in Tocilizumab, which was used as a medicine for the treatment of rheumatoid arthritis, is chronic Who arthritis in children or illness Kastlemena.

[Средства для решения данных проблем][Means for solving these problems]

Авторы настоящего изобретения создали антитела против рецептора IL-6 с улучшенной антиген-нейтрализующей способностью, фармакокинетикой (сохранение в плазме), иммуногенностью, безопасностью и физико-химическими свойствами, благодаря замененным аминокислотам в Tocilizumab, которое применялось в качестве лекарственного средства для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена. Затем авторы настоящего изобретения показали, что фармацевтические вещества, включающие в качестве активного ингредиента описанное выше антитело против рецептора IL-6, полезны при лечении ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена.The authors of the present invention created antibodies against the IL-6 receptor with improved antigen-neutralizing ability, pharmacokinetics (plasma retention), immunogenicity, safety and physico-chemical properties, thanks to the substituted amino acids in Tocilizumab, which was used as a medicine for the treatment of rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children or Castlemen's disease. The inventors of the present invention then showed that pharmaceutical substances comprising the anti-IL-6 receptor antibody described above as an active ingredient are useful in the treatment of rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children or Castleman's disease.

Конкретнее, настоящее изобретение представляет следующие [1]-[3]:More specifically, the present invention provides the following [1] to [3]:

[1] средство для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которое включает в себя в качестве активного ингредиента описанное ниже антитело:[1] an agent for treating rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children or Castlemen’s disease, which includes the antibody described below as an active ingredient:

(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую:(a) an antibody that contains a heavy chain, including:

CDR1 (гипервариабельный участок 1), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),CDR1 (hypervariable region 1) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),

CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), иCDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), and

CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73);CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73);

(b) антитело, которое содержит легкую цепь, включающую:(b) an antibody that contains a light chain, including:

CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),

CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), иCDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), and

CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3); илиCDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3); or

(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую:(c) an antibody that contains a heavy chain, including:

CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),

CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73),CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73),

и легкую цепь, включающую:and a light chain including:

CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3);CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3);

[2] средство для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которое включает в качестве активного ингредиента описанное ниже антитело:[2] an agent for treating rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children or Castleman’s disease, which includes the antibody described below as an active ingredient:

(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73);(a) an antibody that contains a heavy chain comprising a heavy chain variable region with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (variable region VH3-M73);

(b) антитело, которое содержит легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3); или(b) an antibody that contains a light chain comprising the variable region of the light chain with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (variable region VL3); or

(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73), и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3); и(c) an antibody that contains a heavy chain comprising the variable region of the heavy chain with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (variable region VH3-M73), and a light chain comprising the variable region of the light chain with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (variable region VL3); and

[3] средство для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которое включает в качестве активного ингредиента описанное ниже антитело:[3] an agent for treating rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children or Castleman’s disease, which includes the antibody described below as an active ingredient:

(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73);(a) an antibody that contains a heavy chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (VH3-M73);

(b) антитело, которое содержит легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3); или(b) an antibody that contains a light chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 (VL3); or

(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73), и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3).(c) an antibody that contains a heavy chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (VH3-M73) and a light chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 (VL3).

Настоящее изобретение также предоставляет следующее:The present invention also provides the following:

[4] способ лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, который включает стадию введения описанного ниже антитела:[4] a method for treating rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children or Castleman’s disease, which comprises the step of administering the antibody described below:

и легкую цепь, включающую:and a light chain including:

[5] способ лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, который включает стадию введения описанного ниже антитела:[5] a method for treating rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children, or Castleman’s disease, which comprises the step of administering the antibody described below:

(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73), и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3);(c) an antibody that contains a heavy chain comprising the variable region of the heavy chain with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (variable region VH3-M73), and a light chain comprising the variable region of the light chain with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (variable region VL3);

[6] способ лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, который включает стадию введения описанного ниже антитела:[6] a method for treating rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children or Castleman’s disease, which comprises the step of administering the antibody described below:

(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73), и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3);(c) an antibody that contains a heavy chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (VH3-M73) and a light chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 (VL3);

[7] применение описанного ниже антитела:[7] the use of the antibodies described below:

и легкую цепь, включающую:and a light chain including:

CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3),CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3),

при производстве средства для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена;in the manufacture of a medicament for the treatment of rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children or Castleman's disease;

[8] применение описанного ниже антитела:[8] use of the antibody described below:

(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73), и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3),(c) an antibody that contains a heavy chain comprising the variable region of the heavy chain with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (variable region VH3-M73), and a light chain comprising the variable region of the light chain with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (variable region VL3),

[9] использование описанного ниже антитела:[9] use of the antibody described below:

(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73), и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3)(c) an antibody that contains a heavy chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (VH3-M73), and a light chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (VL3)

[10] описанное ниже антитело для применения в способе лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена:[10] the antibody described below for use in a method of treating rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children, or Castleman’s disease:

и легкую цепь, включающую:and a light chain including:

[11] описанное ниже антитело для применения в способе лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена:[11] the antibody described below for use in a method of treating rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children, or Castleman’s disease:

[12] описанное ниже антитело для применения в способе лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена:[12] the antibody described below for use in a method of treating rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children, or Castleman’s disease:

[Эффекты изобретения][Effects of the invention]

Средства для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которые включают в качестве активного ингредиента антитело к рецептору IL-6, производимое при помощи настоящего изобретения, обладающее улучшенными антиген-нейтрализующей способностью, фармакокинетикой (поддержание в плазме), иммуногенностью, безопасностью и физико-химическими свойствами. Поэтому можно уменьшать частоту введения, и они могут оказывать пролонгированный терапевтический эффект.Means for treating rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children, or Castleman disease, which include, as an active ingredient, an IL-6 receptor antibody produced by the present invention, having improved antigen-neutralizing ability, pharmacokinetics (maintenance in plasma), immunogenicity, safety and physico-chemical properties. Therefore, the frequency of administration can be reduced, and they can have a prolonged therapeutic effect.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

Фиг. 1 представляет собой график, демонстрирующий временную зависимость концентрации антитела в плазме после введения TOCILIZUMAB или Fv4-M73 в количестве 1 мг/кг яванским макакам.FIG. 1 is a graph showing the temporal dependence of plasma antibody concentration after administration of TOCILIZUMAB or Fv4-M73 in an amount of 1 mg / kg to cynomolgus monkeys.

Фиг. 2 представляет собой график, демонстрирующий временную зависимость концентрации СРБ в плазме после введения TOCILIZUMAB или Fv4-M73 в количестве 1 мг/кг яванским макакам.FIG. 2 is a graph showing the time dependence of plasma CRP concentration after administration of TOCILIZUMAB or Fv4-M73 in an amount of 1 mg / kg to cynomolgus monkeys.

Фиг. 3 представляет собой график, демонстрирующий временную зависимость соотношения несвязанного растворимого рецептора IL-6 в плазме после введения TOCILIZUMAB или Fv4-M73 в количестве 1 мг/кг яванским макакам.FIG. 3 is a graph showing the time dependence of the ratio of unbound soluble IL-6 receptor in plasma after administration of TOCILIZUMAB or Fv4-M73 in an amount of 1 mg / kg to cynomolgus monkeys.

Фиг. 4 представляет собой график, демонстрирующий ингибирующий эффект TOCILIZUMAB и Fv4-M73 на продуцирование MCP-1 синовиальными клетками, полученными из человеческих пациентов с РА.FIG. 4 is a graph showing the inhibitory effect of TOCILIZUMAB and Fv4-M73 on the production of MCP-1 by synovial cells obtained from human patients with RA.

Фиг. 5 представляет собой график, демонстрирующий ингибирующий эффект TOCILIZUMAB и Fv4-M73 на продуцирование VEGF синовиальными клетками, полученными из человеческих пациентов с РА.FIG. 5 is a graph showing the inhibitory effect of TOCILIZUMAB and Fv4-M73 on VEGF production by synovial cells derived from human patients with RA.

Способ воплощения изобретенияThe method of embodiment of the invention

Настоящее изобретение относится к средствам для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которые включают в качестве активного ингредиента антитело, перечисленное ниже:The present invention relates to agents for treating rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children or Castleman's disease, which include the antibody listed below as an active ingredient:

и легкую цепь, включающую:and a light chain including:

CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3).CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3).

Настоящее изобретение также относится к средствам для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которые включают в качестве активного ингредиента антитело, перечисленное ниже:The present invention also relates to agents for treating rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children, or Castlemen’s disease, which include the antibody listed below as an active ingredient:

(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую в вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73);(a) an antibody that contains a heavy chain comprising the heavy chain variable region with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (variable region VH3-M73);

(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73), и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3).(c) an antibody that contains a heavy chain comprising the variable region of the heavy chain with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (variable region VH3-M73), and a light chain comprising the variable region of the light chain with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (variable region VL3).

Настоящее изобретение также предоставляет антитела, содержащие аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько аминокислот (как правило, 30 аминокислот или менее, предпочтительно 10 аминокислот или менее, более предпочтительно пять аминокислот или менее, и еще более предпочтительно, три аминокислоты или менее) изменены (заменены, удалены, добавлены, и/или встроены) или модифицированы в антителе по настоящему изобретению, содержащем описанную выше аминокислотную последовательность. Такие антитела, содержащие изменения или модификации аминокислотной последовательности, предпочтительно обладают активностью (антиген-связывающей активностью, антиген-нейтрализующей активностью и др.), эквивалентной таковой исходного антитела.The present invention also provides antibodies comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids (typically 30 amino acids or less, preferably 10 amino acids or less, more preferably five amino acids or less, and even more preferably three amino acids or less) are changed ( replaced, deleted, added, and / or inserted) or modified in the antibody of the present invention containing the amino acid sequence described above. Such antibodies containing changes or modifications of the amino acid sequence preferably have an activity (antigen-binding activity, antigen-neutralizing activity, etc.) equivalent to that of the parent antibody.

Кроме того, антитела, используемые в качестве антител по настоящему изобретению, могут представлять собой биспецифические антитела. Биспецифическое антитело относится к антителу, которое имеет вариабельные области в одной и той же молекуле антитела, которые узнают разные эпитопы. Биспецифическое антитело по настоящему изобретению может представлять собой биспецифическое антитело, которое узнает разные эпитопы на молекуле рецептора IL-6, или биспецифическое антитело, в котором один из антиген-связывающих участков узнает рецептор IL-6, а другой антиген-связывающий участок узнает другое вещество. Примеры антигенов, которые связываются с другим антиген-связывающим участком биспецифического антитела, которое сконструировано из рецептор IL-6-узнающего антитела по настоящему изобретению, включают IL-6, TNFα, TNFR1, TNFR2, CD80, CD86, CD28, CD20, CD19, IL-1α, IL-β, IL-1R, RANKL, RANK, IL-17, IL-17R, IL-23, IL-23R, IL-15, IL-15R, BlyS, лимфотоксин α, лимфотоксин β, лиганд LIGHT, LIGHT, VLA-4, CD25, IL-12, IL-12R, CD40, CD40L, BAFF, CD52, CD22, IL-32, IL-21, IL-21R, GM-CSF, GM-CSFR, M-CSF, M-CSFR, IFN- α, VEGF, VEGFR, EGF, EGFR, CCR5, APRIL и APRILR.In addition, antibodies used as antibodies of the present invention may be bispecific antibodies. A bispecific antibody refers to an antibody that has variable regions in the same antibody molecule that recognize different epitopes. The bispecific antibody of the present invention can be a bispecific antibody that recognizes different epitopes on an IL-6 receptor molecule, or a bispecific antibody in which one of the antigen binding sites recognizes the IL-6 receptor and the other antigen binding site recognizes another substance. Examples of antigens that bind to another antigen-binding site of a bispecific antibody that is constructed from an IL-6 recognition antibody receptor of the present invention include IL-6, TNFα, TNFR1, TNFR2, CD80, CD86, CD28, CD20, CD19, IL -1α, IL-β, IL-1R, RANKL, RANK, IL-17, IL-17R, IL-23, IL-23R, IL-15, IL-15R, BlyS, lymphotoxin α, lymphotoxin β, LIGHT ligand, LIGHT, VLA-4, CD25, IL-12, IL-12R, CD40, CD40L, BAFF, CD52, CD22, IL-32, IL-21, IL-21R, GM-CSF, GM-CSFR, M-CSF, M-CSFR, IFN-α, VEGF, VEGFR, EGF, EGFR, CCR5, APRIL and APRILR.

Каркасные области FRs, используемые для антител по настоящему изобретению, не являются особенно ограниченными и могут быть соответствующим образом отобраны специалистами в рассматриваемой области. Никаких особых ограничений не существует, однако, предпочтительнее использовать каркасные области, полученные от людей. Каркасные области FRs могут представлять собой каркасные области, имеющие изменение аминокислот в природной последовательности.The frame regions of FRs used for the antibodies of the present invention are not particularly limited and can be appropriately selected by those skilled in the art. There are no particular limitations, however, it is preferable to use wireframe areas obtained from people. Frame regions of FRs may be frame regions having a change in amino acids in their natural sequence.

Константные области, использованные для антител по настоящему изобретению, не являются особенно ограниченными и могут быть соответствующим образом отобраны специалистами в рассматриваемой области. Никаких особых ограничений не существует, однако, предпочтительнее использовать константные области, полученные от людей. Константные области могут представлять собой константные области, имеющие изменение аминокислот в природной последовательности.The constant regions used for the antibodies of the present invention are not particularly limited and can be appropriately selected by those skilled in the art. There are no particular restrictions, however, it is preferable to use constant regions obtained from people. Constant regions can be constant regions having a change in amino acids in their natural sequence.

Описанные выше антитела по настоящему изобретению представляют собой антитела против рецептора IL-6, которые являются превосходящими по антиген-нейтрализующей способности, фармакокинетике (поддержание в плазме), иммуногенности, безопасности и/или физико-химическим свойствам. Антитела являются особенно полезными в качестве средств для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена.The antibodies of the present invention described above are anti-IL-6 receptor antibodies that are superior in antigen-neutralizing ability, pharmacokinetics (maintenance in plasma), immunogenicity, safety and / or physicochemical properties. Antibodies are especially useful as agents for treating rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children, or Castleman disease.

Антитела по настоящему изобретению можно производить способами, известными специалистам в рассматриваемой области.The antibodies of the present invention can be produced by methods known to those skilled in the art.

Антитела по настоящему изобретению можно производить, например, при помощи следующей генно-инженерной методологии. Ген, кодирующий антитело по настоящему изобретению, конструируют и вставляют в соответствующий вектор; а затем вектор вводят в хозяина для продуцирования антитела (смотри, например, Borrebaeck C. A. K. and Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).Antibodies of the present invention can be produced, for example, using the following genetic engineering methodology. The gene encoding the antibody of the present invention is constructed and inserted into the corresponding vector; and then the vector is introduced into the host to produce antibodies (see, for example, Borrebaeck C. A. K. and Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).

Таким образом, настоящее изобретение представляет способы продуцирования антитела по настоящему изобретению, которые включают стадию культивирования клетки-хозяина, содержащей вектор, в который введен ген, кодирующий антитело по настоящему изобретению.Thus, the present invention provides methods for producing an antibody of the present invention, which include the step of culturing a host cell containing a vector into which a gene encoding an antibody of the present invention is introduced.

Конкретнее, настоящее изобретение представляет способы продуцирования антитела по настоящему изобретению, которые включают стадии:More specifically, the present invention provides methods for producing the antibodies of the present invention, which include the steps of:

(a) культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор, в который введен ген, кодирующий антитело по настоящему изобретению; и(a) culturing a host cell containing a vector into which a gene encoding an antibody of the present invention has been introduced; and

(b) получение антитела, кодируемого геном.(b) obtaining an antibody encoded by a gene.

В частности, когда антитело производится с использованием клеток млекопитающих, ген такого антитела можно экспрессировать с использованием ДНК, в которой функционально соединены общеизвестный подходящий промотор, ген экспрессируемого антитела и сигнал полиаденилирования, расположенный ниже по течению от гена с 3'-стороны, или с использованием вектора, несущего ДНК. Примером промотора/энхансера является быстрый ранний промотор/энхансер цитомегаловируса человека.In particular, when an antibody is produced using mammalian cells, the gene of such an antibody can be expressed using DNA in which a well-known suitable promoter, an expressed antibody gene and a polyadenylation signal located downstream of the gene from the 3 ′ side are functionally connected, or using vector carrying DNA. An example of a promoter / enhancer is the fast early promoter / enhancer of human cytomegalovirus.

Кроме того, в качестве промотора/энхансера, который можно использовать для экспрессии антитела по настоящему изобретению, можно использовать вирусные промоторы/энхансеры ретровирусов, вирусов полиомы, аденовирусов, вакуолизирующий обезьяний вирус 40 (SV-40) или подобные, или промоторы/энхансеры, полученные из клеток млекопитающих, такие как промотор/энхансер фактора элонгации 1α (HEF1α) человека или подобные.In addition, viral promoters / enhancers of retroviruses, polyoma viruses, adenoviruses, vacuulizing monkey virus 40 (SV-40) or the like, or promoters / enhancers obtained can be used as a promoter / enhancer that can be used to express the antibodies of the present invention. from mammalian cells, such as a promoter / enhancer of human elongation factor 1α (HEF1α) or the like.

Экспрессию антитела можно легко осуществлять при помощи, например, способа Mulligan et al. (Mulligan, R. C. et al., Nature (1979) 277: 108-114) c использованием промотора/энхансера SV40, или способа Mizushima et al. (Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18: 5322) c использованием промотора/энхансера HEF1α.Antibody expression can be readily accomplished using, for example, the method of Mulligan et al . (Mulligan, RC et al. , Nature (1979) 277: 108-114) using the SV40 promoter / enhancer, or the method of Mizushima et al. (Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18: 5322) using the HEF1α promoter / enhancer.

В случае, когда антитело производится с использованием E. coli, антитело можно экспрессировать при помощи функционально связанного общераспространенного подходящего промотора, сигнальной последовательности для секреции антитела и гена антитела, который следует экспрессировать. Примеры промоторов включают промотор lacZ и промотор araB. Промотор lacZ можно использовать в соответствии со способом Ward et al. (Ward, E. S. et al., Nature (1989) 341: 544-546; Ward, E. S. et al., FASEB J. (1992) 6: 2422-2427), а промотор araB можно использовать в соответствии со способом Better et al. (Better, M. et al., Science (1988) 240: 1041-1043).In the case where the antibody is produced using E. coli, the antibody can be expressed using a functionally linked, common suitable promoter, a signal sequence for secretion of the antibody and the antibody gene to be expressed. Examples of promoters include the lacZ promoter and the araB promoter. The lacZ promoter can be used in accordance with the method of Ward et al. (Ward, ES et al. , Nature (1989) 341: 544-546; Ward, ES et al. , FASEB J. (1992) 6: 2422-2427), and the araB promoter can be used in accordance with the Better et al method . (Better, M. et al. , Science (1988) 240: 1041-1043).

В случае, когда продуцирование антитела осуществляется в периплазму E. coli, в качестве сигнальной последовательности для секреции антитела можно использовать сигнальную последовательность pelB (Lei, S. P. et al. J. Bacteriol. (1987) 169: 4379-4383). После отделения антител, продуцированных в периплазму, структуру антитела подвергают повторному сворачиванию и затем используют (смотри, например, WO 96/30394).In the case where antibody production is carried out in the periplasm of E. coli , the signal sequence pelB can be used as the signal sequence for secretion of the antibody (Lei, SP et al. J. Bacteriol. (1987) 169: 4379-4383). After separation of antibodies produced in the periplasm, the structure of the antibody is re-folded and then used (see, for example, WO 96/30394).

Участок начала репликации можно получить из SV-40, вирусов полиомы, аденовирусов, вируса папилломы крупного рогатого скота (BPV) и подобных. Кроме того, для увеличения числа копий гена в клетке-хозяине экспрессионный вектор может содержать, в качестве селективного маркера, ген аминогликозид фосфотрансферазы (APH), ген тимидинкиназы (TK), ген ксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (Ecogpt) E. Coli, ген дигидрофолатредуктазы (dhfr) и подобное.The replication start site can be obtained from SV-40, polyoma viruses, adenoviruses, cattle papilloma virus (BPV) and the like. In addition, to increase the number of copies of the gene in the host cell, the expression vector may contain, as a selective marker, the aminoglycoside phosphotransferase (APH) gene, the thymidine kinase (TK) gene, the E. coli xanthinguanine phosphoribosyl transferase (Ecogpt) gene , and the dihydrofolate reductase gene (d) like that.

Для получения антител по настоящему изобретению можно использовать любую систему продуцирования.To produce antibodies of the present invention, any production system can be used.

Системы продуцирования in vitro и in vivo пригодны в качестве систем для продуцирования антител. Системы продуцирования, в которых используются эукариотические клетки и прокариотические клетки, являются примерами систем продуцирования in vitro. In vitro and in vivo production systems are suitable as antibody production systems. Production systems using eukaryotic cells and prokaryotic cells are examples of in vitro production systems.

Системы продуцирования, которые используют клетки животных, клетки растений или клетки грибков, являются доступными при использовании эукариотических клеток. Известные клетки животных включают (1) клетки млекопитающих, например, CHO, COS, миеломы, почек детеныша хомячка (ВНК), HeLa, Vero и подобные, (2) клетки земноводных, такие как ооциты Xenopus laevis, и (3) клетки насекомых, такие как sf9, sf21, Tn5 и подобные. Известные клетки растений включают клетки, полученные из Nicotiana tabacum, и эти клетки можно культивировать в качестве каллюсов. Известные клетки грибков включают дрожжи, например, рода Saccharomyces, как, например, Saccharomyces cerevisiae, и мицелиальные грибы, например, рода Aspergillus, такие как Aspergillus niger.Production systems that use animal cells, plant cells, or fungal cells are available using eukaryotic cells. Known animal cells include (1) mammalian cells, for example, CHO, COS, myeloma, hamster baby kidneys (BHK), HeLa, Vero and the like, (2) amphibian cells such as Xenopus laevis oocytes , and (3) insect cells, such as sf9, sf21, Tn5 and the like. Known plant cells include cells derived from Nicotiana tabacum , and these cells can be cultured as calluses. Known fungal cells include yeast, for example, of the genus Saccharomyces, such as, for example, Saccharomyces cerevisiae , and mycelial fungi, for example, of the genus Aspergillus, such as Aspergillus niger .

Системы продуцирования, которые используют бактериальные клетки, являются доступными при использовании прокариотических клеток. Примеры бактериальных клеток включают E. coli и Bacillus subtilis. Production systems that use bacterial cells are available using prokaryotic cells. Examples of bacterial cells include E. coli and Bacillus subtilis.

Антитела можно получать путем введения представляющего интерес гена антитела в эти клетки при помощи трансформации, а затем культивирования этих трансформантов in vitro. Трансформанты можно культивировать с использованием известных способов. Например, в качестве питательной среды можно использовать DMEM, МЭМ, RPMI 1640 или IMDM, и это можно применять с добавлением сывороток, таких как фетальная телячья сыворотка (ФТС). Кроме того, антитела можно продуцировать in vivo путем передачи клеток с введенным геном антитела в брюшную полость или подобное у животных.Antibodies can be obtained by introducing an antibody gene of interest into these cells by transformation and then culturing these transformants in vitro . Transformants can be cultured using known methods. For example, DMEM, MEM, RPMI 1640, or IMDM can be used as a growth medium, and this can be applied with the addition of sera such as fetal calf serum (FCS). In addition, antibodies can be produced in vivo by transferring cells with the introduced antibody gene into the abdominal cavity or the like in animals.

С другой стороны, системы продуцирования in vivo включают системы продуцирования с использованием животных и системы продуцирования с использованием растений. Млекопитающие, насекомые и т.п. используются в системах продуцирования с использованием животных.On the other hand, in vivo production systems include animal production systems and plant production systems. Mammals, insects, etc. used in animal production systems.

Можно использовать млекопитающих, таких как коза, свинья, овца, мышь и крупный рогатый скот (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Альтернативно можно использовать насекомых, таких как шелковичный червь. При использовании растений можно использовать, например, табак.Mammals such as goats, pigs, sheep, mice, and cattle can be used (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Alternatively, insects such as silkworm can be used. When using plants, for example, tobacco can be used.

Гены антител вводят в такие животные или растения, после чего антитела продуцируют в организме животных или растений, а затем извлекают. Например, ген антитела подготавливают в качестве слитого гена путем встраивания гена антитела в ген, кодирующий белок, который специфически производится в молоке, такой как ген β-казеина коз. Фрагменты ДНК, содержащие слитый ген, в которой был встроен ген антитела, затем инъецируют в эмбрионы козы, которые затем вводят в коз. Нужное антитело затем можно получать из молока, произведенного трансгенными козами, которые рождены козами, получившими эмбрионы, или их потомством. Для увеличения производства молока, содержащего представляющее интерес антитело, в трансгенных коз можно надлежащим образом вводить гормоны (Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12: 699-702).Antibody genes are introduced into such animals or plants, after which the antibodies are produced in animals or plants and then recovered. For example, an antibody gene is prepared as a fusion gene by embedding an antibody gene in a gene encoding a protein that is specifically produced in milk, such as a goat β-casein gene. DNA fragments containing the fused gene in which the antibody gene was inserted are then injected into goat embryos, which are then introduced into the goats. The desired antibody can then be obtained from milk produced by transgenic goats that are born by goats that received embryos, or their offspring. To increase the production of milk containing the antibody of interest, hormones can be properly introduced into transgenic goats (Ebert, KM et al. , Bio / Technology (1994) 12: 699-702).

В случае использования шелковичного червя, для инфицирования шелковичных червей применяют бакуловирусы, несущие ген представляющего интерес антитела, после чего представляющее интерес антитело получают из жидкостей организма (Maeda, S. et al., Nature (1985) 315: 592-594). В случае использования табака, ген представляющего интерес антитела встраивают в экспрессионный вектор растений, например, pMON 530, и вектор затем можно вводить в бактерию, как, например, Agrobacterium tumefaciens. Бактерии затем используют для инфицирования табака, как, например, Nicotiana tabacum, после чего из листьев этого табака получают нужные антитела (Julian К.-С. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 131-138).When using silkworm, baculoviruses carrying the gene of interest of the antibody are used to infect silkworms, after which the antibody of interest is obtained from body fluids (Maeda, S. et al. , Nature (1985) 315: 592-594). In the case of tobacco, the gene of interest is inserted into the expression vector of plants, for example, pMON 530, and the vector can then be introduced into a bacterium, such as, for example, Agrobacterium tumefaciens . The bacteria are then used to infect tobacco, such as Nicotiana tabacum , after which the desired antibodies are obtained from the leaves of this tobacco (Julian K.-C. Ma et al ., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 131-138) .

При продуцировании антитела с использованием системы продуцирования in vitro или in vivo, как описано выше, каждую ДНК, кодирующую тяжелую цепь (H-цепь) или легкую цепь (L-цепь) антитела, можно по отдельности включать в экспрессионный вектор для одновременной трансформации клетки-хозяина, или альтернативно ДНК, кодирующие H-цепь и L-цепь, можно встраивать в один экспрессионный вектор, для трансформации клетки-хозяина (смотри Международную патентную заявку No. WO 94/11523).When producing antibodies using an in vitro or in vivo production system as described above, each DNA encoding a heavy chain (H chain) or light chain (L chain) of an antibody can be individually incorporated into an expression vector to simultaneously transform the cell - the host, or alternatively DNA encoding the H chain and L chain, can be inserted into a single expression vector to transform the host cell (see International Patent Application No. WO 94/11523).

Антитела, продуцируемые и экспрессируемые, как описано выше, можно выделять из внутреннего содержания клеток или из клеточного окружения или из организмов-хозяев, и затем очищать до гомогенности. Антитела, используемые в настоящем изобретении, можно выделять/очищать с помощью аффинной хроматографии. Колонки, используемые в аффинной хроматографии, включают, например, протеин-А колонки и протеин-G колонки. Носители, используемые для аффинной хроматографии, включают, например, HyperD, POROS и Sepharose F.F. Кроме того, возможно использование других традиционных способов выделения и/или очистки белков. Такие способы не являются особенно ограниченными.Antibodies produced and expressed as described above can be isolated from the internal content of cells or from the cell environment or from host organisms, and then purified to homogeneity. Antibodies used in the present invention can be isolated / purified by affinity chromatography. Columns used in affinity chromatography include, for example, protein-A columns and protein-G columns. Carriers used for affinity chromatography include, for example, HyperD, POROS, and Sepharose F.F. In addition, you can use other traditional methods of isolation and / or purification of proteins. Such methods are not particularly limited.

Например, антитела по настоящему изобретению можно выделять/очищать с помощью соответствующим образом выбранных/скомбинированных хроматографий, фильтров, ультрафильтрации, высаливания, диализа и т.д., в дополнение к описанной выше аффинной хроматографии. Такие хроматографии включают, например, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию и гель-фильтрацию, и могут применяться для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Кроме того, возможно использование обращенно-фазовой ВЭЖХ.For example, the antibodies of the present invention can be isolated / purified by suitably selected / combined chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, etc., in addition to the above affinity chromatography. Such chromatographies include, for example, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography and gel filtration, and can be used for high performance liquid chromatography (HPLC). In addition, reverse phase HPLC may be used.

Концентрацию антитела, подготовленного, как описано выше, можно определить путем измерения оптической плотности, иммуноферментным анализом (ИФА) или т.д. В частности, в случае измерения оптической плотности раствор антитела разводят PBS(-) и измеряют оптическую плотность при длине волны 280 нм. Концентрацию рассчитывают по оптической плотности (1,35 OD=1 мг/мл). Альтернативно, в случае использования ИФА химический анализ может проводиться по следующей методике. А именно, 100 мкл антител козла к IgG человека (TAG) в разведении 1 мкг/мл в 0,1 М бикарбонатном буфере (pH 9,6) добавляют к 96-луночному планшету (Nunc) и инкубируют в течение ночи при 4°C для иммобилизации антител. После блокирования к планшету добавляют соответствующим образом разведенное антитело по настоящему изобретению, соответствующим образом разведенный образец, содержащий антитело, или IgG (CAPPEL) человека в качестве стандарта (100 мкл), затем планшет выдерживают в течение одного часа при комнатной температуре.The concentration of antibodies prepared as described above can be determined by measuring optical density, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), etc. In particular, in the case of measuring the optical density, the antibody solution is diluted with PBS (-) and the optical density is measured at a wavelength of 280 nm. The concentration is calculated by optical density (1.35 OD = 1 mg / ml). Alternatively, if ELISA is used, a chemical analysis may be carried out using the following procedure. Namely, 100 μl of goat anti-human IgG antibodies (TAG) in a dilution of 1 μg / ml in 0.1 M bicarbonate buffer (pH 9.6) was added to a 96-well plate (Nunc) and incubated overnight at 4 ° C for immobilization of antibodies. After blocking, an appropriately diluted antibody of the present invention, an appropriately diluted sample containing the antibody, or human IgG (CAPPEL) as a standard (100 μl) is added to the plate, then the plate is kept for one hour at room temperature.

После промывки добавляют 100 мкл разведенных в 5000 раз антител к IgG человека, меченных щелочной фосфатазой (BIO SOURCE), и инкубируют один час при комнатной температуре. После промывки добавляют раствор субстрата и инкубируют, и оптическую плотность измеряют при 405 нм, используя ридер для микропланшетов Model 3550 (Bio-Rad), для расчета концентрации представляющего интерес антитела.After washing, 100 μl of 5,000-fold diluted anti-human IgG antibodies labeled with alkaline phosphatase (BIO SOURCE) are added and incubated for one hour at room temperature. After washing, a substrate solution is added and incubated, and the absorbance is measured at 405 nm using a Model 3550 microplate reader (Bio-Rad) to calculate the concentration of antibody of interest.

Активность антитела, используемого в настоящем изобретении, по ингибированию IL-6-обусловленной передачи сигнала можно оценить с помощью традиционных способов, известных специалистам в рассматриваемой области. Например, IL-6 добавляют к культурам IL-6-зависимых миеломных клеточных линий человека (S6B45 и KPMM2), T-клеточной линии лимфомы Леннерта человека KT3 или IL-6-зависимой клеточной линии MH60.BSF2; и накопление ³H-тимидина IL-6-зависимыми клетками определяют в присутствии ингибитора IL-6. Альтернативно, культивируют экспрессирующие рецептор IL-6 клетки U266, и к культуре одновременно добавляют ¹²⁵I-меченый IL-6 и ингибитор IL-6, и затем определяют ¹²⁵I-меченый IL-6, связанный с клетками, экспрессирующими рецептор IL-6. В дополнение к группе ингибиторов IL-6, в описанные выше тест-системы включают группу отрицательного контроля без ингибитора IL-6. IL-6-ингибирующую активность ингибитора IL-6 можно оценить путем сравнения результатов для обеих групп.The activity of an antibody used in the present invention in inhibiting IL-6-mediated signaling can be evaluated using traditional methods known to those skilled in the art. For example, IL-6 is added to cultures of IL-6-dependent human myeloma cell lines (S6B45 and KPMM2), human Lennert T lymphoma cell line KT3, or IL-6-dependent cell line MH60.BSF2; and the accumulation of ³ H-thymidine by IL-6-dependent cells is determined in the presence of an IL-6 inhibitor. Alternatively, U266 cells expressing IL-6 receptor are cultured, and ¹²⁵ I-labeled IL-6 and an IL-6 inhibitor are simultaneously added to the culture, and then ¹²⁵ I-labeled IL-6 bound to cells expressing IL-6 receptor is added. In addition to the IL-6 inhibitor group, the negative control group without the IL-6 inhibitor is included in the test systems described above. IL-6 inhibitory activity of an IL-6 inhibitor can be assessed by comparing the results for both groups.

Антитела, используемые в настоящем изобретении, могут представлять собой фрагменты антител или модифицированные продукты этого, при условии, что они могут соответствующим образом использоваться в настоящем изобретении. Например, такие фрагменты антител включают Fab, F(ab')2, Fv и отдельную цепь Fv (scFv) и sc(Fv)2, в которой Fvs H- и L-цепей связываются вместе с помощью соответствующих линкеров.Antibodies used in the present invention may be fragments of antibodies or modified products thereof, provided that they can be suitably used in the present invention. For example, such antibody fragments include Fab, F (ab ') 2, Fv, and a single Fv (scFv) chain and sc (Fv) 2, in which the Fvs of the H and L chains are linked together using the corresponding linkers.

Антитела, используемые в настоящем изобретении, также включают модифицированные антитела, такие как антитела, связанные с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Здесь «антитело» включает такие модифицированные антитела. Такие модифицированные антитела можно получать путем химической модификации полученного антитела. Такие способы ранее были приняты в данной области.Antibodies used in the present invention also include modified antibodies, such as antibodies bound to various molecules, such as polyethylene glycol (PEG). As used herein, an “antibody” includes such modified antibodies. Such modified antibodies can be obtained by chemical modification of the resulting antibody. Such methods have previously been adopted in the art.

Tocilizumab, которое представляет собой гуманизированное антитело против рецептора IL-6 человека, было одобрено в Японии в качестве лекарственного средства для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей (например, подростковый идиопатический артрит, который действует в большинстве суставов, и системный подростковый идиопатический артрит) и болезни Кастлемена.Tocilizumab, which is a humanized anti-human IL-6 receptor antibody, has been approved in Japan as a medicine for treating rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children (for example, adolescent idiopathic arthritis, which works on most joints, and systemic adolescent idiopathic arthritis) and Castleman disease.

Описанные выше антитела по настоящему изобретению представляют собой антитела, у которых антиген-нейтрализующая способность, кинетика в крови, иммуногенность, безопасность и физико-химические свойства были улучшены путем изменения аминокислот в Tocilizumab. Само собой разумеется, что описанные выше антитела по настоящему изобретению обладают тем же терапевтическим эффектом, что и Tocilizumab, и, таким образом, могут использоваться в качестве лекарственных средств для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей и болезни Кастлемена.The antibodies of the present invention described above are antibodies in which the antigen-neutralizing ability, blood kinetics, immunogenicity, safety and physicochemical properties have been improved by changing amino acids in Tocilizumab. It goes without saying that the antibodies of the present invention described above have the same therapeutic effect as Tocilizumab, and thus can be used as medicaments for the treatment of rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children and Castlemen's disease.

Лекарственные средства по настоящему изобретению можно вводить в виде фармацевтического препарата и можно вводить системно или местно при помощи перорального или парентерального способов. Например, можно выбрать внутривенное введение, внутримышечное введение, внутрибрюшинное введение, подкожное введение, введение при помощи суппозиториев, инфузию в толстую кишку или кишечнорастворимое средство для перорального введения. Соответствующий способ введения можно выбрать в зависимости от возраста пациента и симптомов. В большинстве случаев, эффективную дозу выбирают в пределах диапазона от 0,01 до 100 мг/кг массы тела при каждом введении. Альтернативно, дозу можно выбрать в пределах диапазона от 1 до 1000 мг/пациента, предпочтительно в пределах диапазона от 50 до 250 мг/пациента. Предпочтительную дозу также могут подобрать специалисты в рассматриваемой области.The drugs of the present invention can be administered in the form of a pharmaceutical preparation and can be administered systemically or topically by oral or parenteral routes. For example, you can choose intravenous administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration, subcutaneous administration, administration by suppository, infusion into the colon or an enteric drug for oral administration. An appropriate route of administration may be selected depending on the patient's age and symptoms. In most cases, an effective dose is selected within the range of 0.01 to 100 mg / kg body weight with each administration. Alternatively, the dose may be selected within the range of 1 to 1000 mg / patient, preferably within the range of 50 to 250 mg / patient. The preferred dose can also be selected by specialists in the field in question.

Лекарственные средства по настоящему изобретению могут содержать фармацевтически приемлемые носители, такие как консерванты и стабилизаторы. «Фармацевтически приемлемый носитель» означает материал, который можно вводить совместно с описанными выше лекарственными средствами и который может оказывать или может не оказывать вышеописанный терапевтический эффект. Альтернативно, такой носитель может представлять собой материал, который не обладает терапевтическим эффектом, но создает дополнительный или синергический стабилизирующий эффект, в случае применения в комбинации с антителом.The medicines of the present invention may contain pharmaceutically acceptable carriers, such as preservatives and stabilizers. "Pharmaceutically acceptable carrier" means a material that can be administered in conjunction with the above drugs and which may or may not have the above therapeutic effect. Alternatively, such a carrier may be a material that does not have a therapeutic effect, but creates an additional or synergistic stabilizing effect when used in combination with an antibody.

Примеры фармацевтически приемлемых материалов включают стерилизованную воду, физиологический раствор, стабилизаторы, наполнители, буферы, консерванты, сурфактанты, комплексообразующие средства (например, ЭДТК) и связующие вещества и тому подобное.Examples of pharmaceutically acceptable materials include sterilized water, saline, stabilizers, excipients, buffers, preservatives, surfactants, complexing agents (e.g., EDTA) and binders and the like.

В настоящем изобретении, примеры сурфактантов включают неионный сурфактант. Типичные примеры включают сорбитановые эфиры жирных кислот, такие как сорбитановый эфир монокаприловой кислоты, сорбитановый эфир монолауриловой кислоты или сорбитановый эфир монопальмитиновой кислоты; глицериновые эфиры жирных кислот, такие как глицериновый эфир монокаприловой кислоты, глицериновый эфир мономиристиновой кислоты или глицериновый эфир моностеариновой кислоты; полиглицериновые эфиры жирных кислот, таких как декаглицериновый эфир моностеариновой кислоты, декаглицериновый эфир дистеариновой кислоты или декаглицериновый эфир монолинолевой кислоты; полиоксиэтиленсорбитановые эфиры жирных кислот, таких как полиоксиэтиленсорбитановый эфир монолауриловой кислоты, полиоксиэтиленсорбитановый эфир моноолеиновой кислоты, полиоксиэтиленсорбитановый эфир моностеариновой кислоты, полиоксиэтиленсорбитановый эфир монопальтитиновой кислоты, полиоксиэтиленсорбитановый эфир триолеиновой кислоты или полиоксиэтиленсорбитановый эфир тристеариновой кислоты; полиоксиэтиленсорбитоловые эфиры жирных кислот, такие как полиоксиэтиленсорбитоловый эфир тетрастеариновой кислоты, полиоксиэтиленсорбитоловый эфир тетраолеиновой кислоты; полиоксиэтиленглицероловые эфиры жирных кислот, такие как полиоксиэтиленглицероловый эфир моностеариновой кислоты; полиэтиленгликолевые эфиры жирных кислот, такие как полиэтиленгликолевый эфир дистеариновой кислоты; полиоксиэтиленалкиловые эфиры, такие как полиоксиэтиленлауриловый эфир; полиоксиэтиленполиоксипропиленалкиловый эфир, такой как полиоксиэтиленполиоксипропиленгликоль, полиоксиэтиленполиоксипропиленпропиловый эфир или полиоксиэтиленполиоксипропиленцетиловый эфир; полиоксиэтилен алкилфениловый эфир, такой как полиоксиэтилен нонилфениловый эфир; полиоксиэтиленовые затвердевшие касторовые масла, такие, как полиоксиэтиленовое касторовое масло, или полиоксиэтиленовое затвердевшее касторовое масло (полиоксиэтиленовое гидрогенизированное касторовое масло); полиоксиэтиленовые производные пчелиного воска, такие как полиоксиэтиленсорбитоловый пчелиный воск; полиоксиэтиленланолиновые производные, такие как полиоксиэтиленланолин; и полиоксиэтиленамид жирных кислот с гидрофильно-липофильным балансом (HLB) от 6 до 18, такой как полиоксиэтиленстеариламид.In the present invention, examples of surfactants include a nonionic surfactant. Representative examples include sorbitan fatty acid esters such as monocaprylic acid sorbitan ester, monolauryl acid sorbitan ester or monopalmitic acid sorbitan ester; fatty acid glycerol esters such as monocaprylic acid glycerol ester, monomyristic acid glycerol ester or monostearic acid glycerol ester; polyglycerol esters of fatty acids such as decaglycerol ester of monostearic acid, decaglycerol ester of distearic acid or decaglycerol ester of monolinoleic acid; polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as monoxyuric acid polyoxyethylene sorbitan ester, monooleic acid polyoxyethylene sorbitan ester, monostearic acid polyoxyethylene sorbitan ester, monopaltitinic acid polyoxyethylene sorbitan ester, polyoxyethylene triethoxy sorbitanic acid or polyoxyethylene sorbitanic acid orbitol acid; fatty acid polyoxyethylene sorbitol esters such as tetrastearic acid polyoxyethylene sorbitol ester, tetraoleic acid polyoxyethylene sorbitol ester; fatty acid polyoxyethylene glycerol esters such as monostearic acid polyoxyethylene glycerol ester; fatty acid polyethylene glycol esters such as distearic acid polyethylene glycol ether; polyoxyethylene alkyl ethers such as polyoxyethylene lauryl ether; a polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether such as polyoxyethylene polyoxypropylene glycol, polyoxyethylene polyoxypropylene ether or polyoxyethylene polyoxypropylene ether; polyoxyethylene alkylphenyl ether, such as polyoxyethylene nonylphenyl ether; polyoxyethylene hardened castor oils, such as polyoxyethylene castor oil, or polyoxyethylene hardened castor oil (polyoxyethylene hydrogenated castor oil); polyoxyethylene beeswax derivatives such as polyoxyethylene sorbitol beeswax; polyoxyethylene lanolin derivatives such as polyoxyethylene lanolin; and hydrophilic-lipophilic balance (HLB) fatty acid polyoxyethyleneamide 6 to 18, such as polyoxyethylene stearylamide.

В качестве сурфактантов можно также перечислить анионные сурфактанты. Типичные примеры анионных сурфактантов могут включать алкилсульфатные соли, имеющие алкильную группу от 10 до 18 атомов углерода, такие как цетилсульфат натрия, лаурилсульфат натрия или олеилсульфат натрия; полиоксиэтиленалкилэфирсульфатные соли, чей средний моль добавленного этиленоксида составляет от двух до четырех, и число атомов углерода в алкильной группе составляет от 10 до 18, такие как полиоксиэтиленлаурилсульфат натрия; солей алкилсульфосукцинатных эфиров с числом атомов углерода в алкильной группе от 8 до 18, как, например, натриевая соль лаурилсульфосукцинатного эфира; природные сурфактанты, такие как лецитин или глицерофосфолипид; сфингофосфолипиды, такие как сфингомиелин; и сахарозные эфиры жирных кислот с числом атомов углерода в жирной кислоте от 12 до 18.As surfactants, anionic surfactants can also be listed. Typical examples of anionic surfactants may include alkyl sulfate salts having an alkyl group of 10 to 18 carbon atoms, such as sodium cetyl sulfate, sodium lauryl sulfate or sodium oleyl sulfate; polyoxyethylene alkyl ether sulfate salts whose average mole of added ethylene oxide is from two to four and the number of carbon atoms in the alkyl group is from 10 to 18, such as sodium polyoxyethylene lauryl sulfate; salts of alkyl sulfosuccinate esters with the number of carbon atoms in the alkyl group from 8 to 18, such as, for example, the sodium salt of lauryl sulfosuccinate ester; natural surfactants such as lecithin or glycerophospholipid; sphingophospholipids, such as sphingomyelin; and sucrose fatty acid esters with the number of carbon atoms in the fatty acid from 12 to 18.

Один или комбинацию из двух или нескольких из этих сурфактантов можно добавлять в лекарственные средства по настоящему изобретению. Предпочтительным сурфактантом для использования в препаратах по настоящему изобретению является полиоксиэтиленсорбитановый эфир жирных кислот, как например, Полисорбат 20, 40, 60, 80 или подобные, где особенно предпочтительными являются Полисорбат 20 и 80. Также является предпочтительным полиоксиэтиленполиоксипропиленгликоль, представленный Poloxamer (например, Pluronic F-68®).One or a combination of two or more of these surfactants can be added to the drugs of the present invention. A preferred surfactant for use in the preparations of the present invention is a polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, such as Polysorbate 20, 40, 60, 80 or the like, where Polysorbate 20 and 80 are particularly preferred. The polyoxyethylene polyoxypropylene glycol represented by Poloxamer (for example, Pluronic F is also preferred). -68®).

Количество добавляемого сурфактанта различается в зависимости от типа используемого сурфактанта, но для Полисорбата 20, Полисорбата 80 или Полоксамера 188 составляет, как правило, 0,0001-10% (масса/объем), предпочтительно 0,001-5% и более предпочтительно 0,005-3%.The amount of surfactant added varies depending on the type of surfactant used, but for Polysorbate 20, Polysorbate 80 or Poloxamer 188, it is usually 0.0001-10% (mass / volume), preferably 0.001-5% and more preferably 0.005-3% .

Буферы по настоящему изобретению включают такие, как буферы на основе фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты, яблочной кислоты, винной кислоты, янтарной кислоты, молочной кислоты, фосфата калия, глюконовой кислоты, каприловой кислоты, дезоксихолевой кислоты, салициловой кислоты, триэтаноламина, фумаровой кислоты, других органических кислот, буфер на основе угольной кислоты, трис-буфер, гистидиновый буфер, имидазольный буфер и т.п.The buffers of the present invention include buffers based on phosphoric acid, citric acid, acetic acid, malic acid, tartaric acid, succinic acid, lactic acid, potassium phosphate, gluconic acid, caprylic acid, deoxycholic acid, salicylic acid, triethanolamine, fumaric acids, other organic acids, carbonic acid based buffer, Tris buffer, histidine buffer, imidazole buffer and the like.

Растворенные составы можно подготовить путем растворения в водных буферах, известных в области растворенных составов. Концентрация буфера, как правило, составляет 1-500 мМ, предпочтительно 5-100 мМ и даже более предпочтительно 10-20 мМ.Dissolved formulations can be prepared by dissolving in aqueous buffers known in the art of dissolved formulations. The concentration of the buffer is typically 1-500 mM, preferably 5-100 mM, and even more preferably 10-20 mM.

Лекарственные средства по настоящему изобретению могут дополнительно включать другие низкомолекулярные полипептиды, белки, такие как сывороточный альбумин, желатин и иммуноглобулин, аминокислоты, сахара и углеводы, такие как полисахариды и моносахариды, и сахарные спирты.The drugs of the present invention may further include other low molecular weight polypeptides, proteins, such as serum albumin, gelatin and immunoglobulin, amino acids, sugars and carbohydrates, such as polysaccharides and monosaccharides, and sugar alcohols.

Примеры аминокислот по настоящему изобретению включают основные аминокислоты, такие как аргинин, лизин, гистидин и орнитин, и неорганические соли этих аминокислот (предпочтительно в форме хлоридных солей и фосфатных солей, или конкретнее, фосфаты аминокислот). В случае использования свободных аминокислот, рН доводят до предпочтительного значения путем добавления подходящего физиологически приемлемого буфера, как, например, неорганических кислот, в частности, соляной кислоты, фосфорной кислоты, серной кислоты, азотной кислоты, муравьиной кислоты или их солей. В таких случаях, использование соли фосфорной кислоты является особенно полезным, поскольку можно получить особенно стабильный лиофилизированный продукт. Это особенно полезно, когда препарат в существенной степени не содержат органические кислоты, такие как яблочная кислота, винная кислота, лимонная кислота, янтарная кислота или фумаровая кислота, или когда соответствующий анион (ион малата, ион тартрата, ион цитрата, ион сукцината, ион фумарата или подобные) не присутствуют. Предпочтительными аминокислотами являются аргинин, лизин, гистидин или орнитин. Кроме того, можно использовать кислые аминокислоты, такие как глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота и соли этого (предпочтительно натриевые соли); нейтральные аминокислоты, такие как изолейцин, лейцин, глицин, серин, треонин, валин, метионин, цистеин, или аланин; или ароматические аминокислоты, такие как фенилаланин, тирозин, триптофан или его производное N-ацетилтриптофан.Examples of the amino acids of the present invention include basic amino acids such as arginine, lysine, histidine and ornithine, and inorganic salts of these amino acids (preferably in the form of chloride salts and phosphate salts, or more specifically, amino acid phosphates). When using free amino acids, the pH is adjusted to a preferred value by adding a suitable physiologically acceptable buffer, such as, for example, inorganic acids, in particular hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, formic acid or their salts. In such cases, the use of the phosphoric acid salt is particularly useful since a particularly stable lyophilized product can be obtained. This is especially useful when the preparation is substantially free of organic acids such as malic acid, tartaric acid, citric acid, succinic acid or fumaric acid, or when the corresponding anion (malate ion, tartrate ion, citrate ion, succinate ion, fumarate ion or the like) are not present. Preferred amino acids are arginine, lysine, histidine or ornithine. In addition, acidic amino acids such as glutamic acid and aspartic acid and salts thereof (preferably sodium salts) can be used; neutral amino acids such as isoleucine, leucine, glycine, serine, threonine, valine, methionine, cysteine, or alanine; or aromatic amino acids such as phenylalanine, tyrosine, tryptophan or its derivative N-acetyl tryptophan.

Примеры сахаров и углеводов, таких как полисахариды и моносахариды, по настоящему изобретению включают декстран, глюкозу, фруктозу, лактозу, ксилозу, маннозу, мальтозу, сахарозу, трегалозу и раффинозу.Examples of sugars and carbohydrates, such as polysaccharides and monosaccharides of the present invention include dextran, glucose, fructose, lactose, xylose, mannose, maltose, sucrose, trehalose and raffinose.

Примеры сахарных спиртов по настоящему изобретению включают маннитол, сорбитол, инозитол и подобные.Examples of sugar alcohols of the present invention include mannitol, sorbitol, inositol and the like.

В случае, когда фармацевтическое средство по настоящему изобретению используется в виде водного раствора, применяемого для инъекций, раствор можно смешивать с, например, физиологическим раствором и изотоническими растворами, которые содержат глюкозу или другие дополнительные вещества, такие как D-сорбитол, D-маннозу, D-маннитол и хлорид натрия. Раствор можно также комбинировать с соответствующими солюбилизирующими веществами, такими как алкоголь (например, этанол), полиалкоголь (например, пропиленгликоль или ПЭГ), или неионные сурфактанты (например, полисорбат 80 или HCO-50).When the pharmaceutical agent of the present invention is used as an aqueous solution for injection, the solution can be mixed with, for example, saline and isotonic solutions that contain glucose or other additional substances, such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol and sodium chloride. The solution can also be combined with appropriate solubilizing agents, such as alcohol (e.g., ethanol), polyalcohol (e.g., propylene glycol or PEG), or non-ionic surfactants (e.g., Polysorbate 80 or HCO-50).

При желании можно включать разбавители, солюбилизирующие вещества, средства для поддержания pH, успокаивающие средства, серосодержащие восстановители и антиоксиданты.If desired, diluents, solubilizing agents, pH preservatives, sedatives, sulfur-containing reducing agents and antioxidants can be included.

Примеры серосодержащих восстановителей по настоящему изобретению включают N-ацетилцистеин, N-ацетилгомоцистеин, тиоктовую кислоту, тиодигликоль, тиоэтаноламин, тиоглицерол, тиосорбитол, тиогликолевую кислоту и соли этого, тиосульфат натрия, глутатион и соединения, несущие сульфгидрильные группы, такие как тиоалканоидные кислоты с числом атомов углерода от одного до семи.Examples of sulfur-containing reducing agents of the present invention include N- acetylcysteine, N- acetyl homocysteine, thioctic acid, thiodiglycol, thioethanolamine, thioglycerol, thiosorbitol, thioglycolic acid and salts thereof, sodium thiosulfate, glutathione and compounds containing sulfhydric acid groups such as carbon from one to seven.

Примеры антиоксидантов по настоящему изобретению включают эриторбовую кислоту, дибутилгидрокситолуол, бутилгидроксианизол, α-токоферол, токоферолацетат, L-аскорбиновую кислоту и ее соли, L-аскорбилпальмитат, L-аскорбилстеарат, бисульфит натрия, сульфит натрия, триамилгаллат, пропилгаллат и комплексообразующие вещества, такие динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК), пирофосфат натрия и метафосфат натрия.Examples of the antioxidants of the present invention include erythorbic acid, dibutylhydroxytoluene, butylhydroxyanisole, α-tocopherol, tocopherol acetate, L-ascorbic acid and its salts, L-ascorbyl palmitate, L-ascorbyl stearate, sodium bisulfite, sodium sulfate, sulfate trigate, sodium sulfite ethylenediaminetetraacetic acid salt (EDTA), sodium pyrophosphate and sodium metaphosphate.

Если необходимо, фармацевтические препараты можно заключать в микрокапсулы (микрокапсулы, изготовленные из гидроксиметилцеллюлозы, желатина, поли[метилметакрилата] или подобных), или помещать в коллоидные системы доставки лекарственных средств (как, например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсия, наночастицы и нанокапсулы) (смотри, например, «Remington's Pharmaceutical Science 16th edition», Осло, Ed., 1980). Способы подготовки фармацевтических средств как фармацевтических средств с контролируемым высвобождением, также хорошо известны, и такие способы можно примененять в настоящем изобретении (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982) 12: 98-105; Патент США No. 3773919; Европейская (EP) заявка на патент No. 58481; Sidman et al., Biopolymers (1983) 22: 547-556; EP 133988). Кроме того, объем жидкости для подкожного введения может быть увеличен путем добавления или смешивания гиалуронидазы к средству (например, смотри WO 2004/078140).If necessary, pharmaceutical preparations can be enclosed in microcapsules (microcapsules made of hydroxymethyl cellulose, gelatin, poly [methyl methacrylate] or the like), or placed in colloidal drug delivery systems (such as liposomes, albumin microspheres, microemulsion, nanoparticles and nanocapsules) (see, for example, "Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo, Ed., 1980). Methods for preparing pharmaceuticals as controlled release pharmaceuticals are also well known, and such methods can be used in the present invention (Langer et al. , J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982) 12: 98-105; U.S. Patent No. 3773919; European (EP) Patent Application No. 58481; Sidman et al. , Biopolymers (1983) 22: 547-556; EP 133988). In addition, the volume of fluid for subcutaneous administration can be increased by adding or mixing hyaluronidase to the agent (for example, see WO 2004/078140).

Используемые фармацевтически приемлемые носители должным образом выбираются из числа упомянутых выше или их комбинаций, в соответствии с лекарственной формой, но не ограничиваются этим.Used pharmaceutically acceptable carriers are duly selected from among those mentioned above or combinations thereof, in accordance with the dosage form, but are not limited to this.

Настоящее изобретение относится к способам лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которые включают стадию введения субъекту лекарственного средства по настоящему изобретению. Здесь, «субъект» относится к организму или части тела организма, в который вводится лекарственные средства по настоящему изобретению. Организмы включают в себя животных (например, человека, разновидности домашних животных и диких животных), но не ограничиваются специфически этим. Описанные выше «части тела организма» не особенно ограничены.The present invention relates to methods for treating rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children, or Castleman's disease, which comprise the step of administering to a subject a medicament of the present invention. Here, “subject” refers to an organism or body part of an organism into which the drugs of the present invention are administered. Organisms include animals (e.g., humans, species of domestic animals, and wild animals), but are not limited specifically to this. The “body parts” described above are not particularly limited.

В настоящем изобретении, выражение «вводить» включает в себя пероральное или парентеральное введение. Пероральное введение включает введение в форме пероральных средств, и лекарственные формы для пероральных средств можно выбрать из гранул, порошков, таблеток, капсул, растворенных средств, эмульсий, суспензий и подобных.In the present invention, the term “administer” includes oral or parenteral administration. Oral administration includes administration in the form of oral agents, and dosage forms for oral agents may be selected from granules, powders, tablets, capsules, dissolved agents, emulsions, suspensions, and the like.

Парентеральное введение включает введение впрыскиваемой формы, примеры которой включают внутривенное введение, подкожное введение, внутримышечное введение и внутрибрюшинное введение. Кроме того, эффектов способов по настоящему изобретению можно достичь путем введения, составленного из олигонуклеотидов гена, предназначенного для введения в живой организм с помощью способов генной терапии. Фармацевтические средства по настоящему изобретению можно применять местно в подвергаемом лечению участке. Например, средства можно вводить путем местных инфузий или с помощью катетера во время операции, или путем целевой генной доставки ДНК, кодирующей пептид по настоящему изобретению.Parenteral administration includes the administration of an injectable form, examples of which include intravenous administration, subcutaneous administration, intramuscular administration and intraperitoneal administration. In addition, the effects of the methods of the present invention can be achieved by introducing a gene composed of oligonucleotides intended for introduction into a living organism using gene therapy methods. The pharmaceutical agents of the present invention can be applied topically in the area to be treated. For example, agents can be administered by local infusion, or by catheter during surgery, or by targeted gene delivery of DNA encoding a peptide of the present invention.

Лекарственные средства по настоящему изобретению можно вводить субъекту после развития симптома заболевания, или профилактически до его развития.The medicaments of the present invention can be administered to a subject after the development of a symptom of a disease, or prophylactically before its development.

Настоящее изобретение также относится к использованию антител по настоящему изобретению при производстве средств для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена. Кроме того, настоящее изобретение относится к антителам по настоящему изобретению для применения в способах лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена.The present invention also relates to the use of the antibodies of the present invention in the manufacture of agents for the treatment of rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children or Castleman's disease. In addition, the present invention relates to antibodies of the present invention for use in methods of treating rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children, or Castleman disease.

Аминокислоты, содержащиеся в аминокислотных последовательностях по настоящему изобретению, можно посттрансляционно модифицировать (например, модификация N-концевого глютамина на пироглютаминовую кислоту путем пироглютамизации хорошо известна специалистам в данной области). Естественно, такие посттрансляционно модифицированные аминокислоты включены в аминокислотные последовательности по настоящему изобретению.The amino acids contained in the amino acid sequences of the present invention can be post-translationally modified (for example, the modification of the N-terminal glutamine to pyroglutamic acid by pyroglutamation is well known to those skilled in the art). Naturally, such post-translationally modified amino acids are included in the amino acid sequences of the present invention.

Далее, цепи сахаров, которые связаны с антителами по настоящему изобретению, могут быть любой структуры. Цепь сахаров в положении 297 (нумерация ЕС) может представлять собой цепь сахаров любой структуры (предпочтительно фукозилированная сахарная цепь), или в этом положении может отсутствовать присоединение какой-либо цепи сахаров (например, этого можно достичь путем продуцирования антител в Escherichia coli или путем внесения изменений таким образом, чтобы в позиции 297, по нумерации ЕС, не присоединялась никакая цепь сахаров).Further, the sugar chains that are associated with the antibodies of the present invention can be of any structure. The sugar chain at position 297 (EU numbering) can be a sugar chain of any structure (preferably a fucosylated sugar chain), or no sugar chain can be attached at this position (for example, this can be achieved by producing antibodies in Escherichia coli or by introducing changes so that in position 297, according to the EU numbering, no sugar chain is attached).

Все цитируемые здесь ссылки прототипов включены в этом описании в качестве ссылки.All prototype references cited herein are incorporated by reference.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Ниже в данном документе, настоящее изобретение будет конкретно описано со ссылкой на Примеры, однако их не следует рассматривать в качестве ограничения этого.Below in this document, the present invention will be specifically described with reference to Examples, however, they should not be construed as limiting this.

[ПРИМЕР 1] РК/PD-тест антител к рецептору IL-6 человека на макаках[EXAMPLE 1] PK / PD test of antibodies to human IL-6 receptor in macaques

TOCILIZUMAB (H-цепь WT-IgG1/SEQ ID NO: 13; L-цепь WT-kappa/SEQ ID NO: 14), а также Fv4-M73 (H-цепь VH3-M73/SEQ ID NO: 9; L-цепь VL3-kappa/SEQ ID NO: 10), в которое была введена аминокислотная замена или подобное, для улучшения антиген-нейтрализующей способности, кинетики в крови, иммуногенности, безопасности и физико-химических свойств TOCILIZUMAB, экспрессировали и очищали при помощи способов, известных специалистам в рассматриваемой области (смотри справочный пример для способов). Эти антитела оценивались по их эффекту в качестве лекарственного средства для лечения ревматоидного артрита, по следующей методике.TOCILIZUMAB (H chain WT-IgG1 / SEQ ID NO: 13; L chain WT-kappa / SEQ ID NO: 14), as well as Fv4-M73 (H chain VH3-M73 / SEQ ID NO: 9; L- the VL3-kappa chain (SEQ ID NO: 10), into which an amino acid substitution or the like was introduced, to improve the antigen-neutralizing ability, blood kinetics, immunogenicity, safety and physicochemical properties of TOCILIZUMAB, was expressed and purified using methods known specialists in this field (see reference example for the methods). These antibodies were evaluated by their effect as a medicine for the treatment of rheumatoid arthritis, according to the following method.

Каждое из TOCILIZUMAB и Fv4-M73 внутривенно вводили однократно в дозе 1 мг/кг яванским макакам, чтобы оценить их временную кривую концентрации в плазме крови (смотри справочный пример для способа). Временные кривые концентрации в плазме для TOCILIZUMAB и Fv4-M73 после внутривенного введения продемонстрированы на Фиг. 1. Результат показал, что Fv4-M73 обнаружил значительное улучшение фармакокинетики у яванских макак по сравнению с TOCILIZUMAB.Each of TOCILIZUMAB and Fv4-M73 was administered intravenously once at a dose of 1 mg / kg to cynomolgus monkeys to evaluate their temporal plasma concentration curve (see the reference example for the method). Temporal plasma concentration curves for TOCILIZUMAB and Fv4-M73 after intravenous administration are shown in FIG. 1. The result showed that Fv4-M73 showed a significant improvement in pharmacokinetics in cynomolgus monkeys compared with TOCILIZUMAB.

Оценивалась эффективность каждого из антител по нейтрализации рецептора IL-6 мембранного типа яванского макака. IL-6 яванского макака подкожно вводили в область поясницы в количестве 5 мкг/кг ежедневно с Дня 6 по День 18 после введения антител (с Дня 3 по День 10 для TOCILIZUMAB), и концентрацию СРБ для каждого животного определяли через 24 часа (смотри справочный пример для способа). Временная кривая концентрации СРБ после введения каждого антитела показана на Фиг.2. Для оценки эффективности каждого антитела по нейтрализации растворимого рецептора IL-6 яванского макака, определяли концентрацию несвязанного растворимого рецептора IL-6 яванского макака в плазме крови яванских макак и рассчитывали долю несвязанного растворимого рецептора IL-6 (смотри справочный пример для способа). Временная кривая процентного содержания несвязанного растворимого рецептора IL-6 после введения каждого антитела показана на Фиг. 3.The effectiveness of each of the antibodies for neutralizing the receptor for membrane type IL-6 of the cynomolgus monkey was evaluated. Cynomolgus IL-6 was subcutaneously injected into the lumbar region in an amount of 5 μg / kg daily from Day 6 to Day 18 after administration of antibodies (Day 3 to Day 10 for TOCILIZUMAB), and the CRP concentration for each animal was determined after 24 hours (see reference example for the method). A temporal curve of CRP concentration after administration of each antibody is shown in FIG. 2. To evaluate the effectiveness of each antibody in neutralizing the soluble receptor for cynomolgus IL-6, the concentration of unbound soluble receptor for cynomolgus monkey IL-6 in the plasma of cynomolgus monkeys was calculated and the proportion of unbound soluble receptor for IL-6 was calculated (see the reference example for the method). A temporal curve of the percentage of unbound soluble IL-6 receptor after administration of each antibody is shown in FIG. 3.

Fv4-M73 нейтрализовало рецептор IL-6 мембранного типа яванского макака более устойчивым образом и подавляло повышение СРБ в течение более длительного периода, по сравнению с TOCILIZUMAB. Кроме того, Fv4-M73 нейтрализовало растворимый рецептор IL-6 яванского макака более устойчивым образом и подавляло повышение несвязанного растворимого рецептора IL-6 яванского макака в течение более длительного периода по сравнению с TOCILIZUMAB. Эти результаты показывают, что Fv4-M73 превосходит TOCILIZUMAB в поддержании нейтрализации рецептора IL-6 мембранного типа и растворимого рецептора IL-6.Fv4-M73 neutralized the membrane receptor type IL-6 of cynomolgus macaque in a more stable manner and suppressed the increase in CRP over a longer period compared to TOCILIZUMAB. In addition, Fv4-M73 neutralized the soluble cynomolgus IL-6 receptor in a more stable manner and inhibited the increase in the unbound soluble cynomolgus IL-6 receptor for a longer period compared to TOCILIZUMAB. These results show that Fv4-M73 is superior to TOCILIZUMAB in maintaining the neutralization of membrane-type IL-6 receptor and soluble IL-6 receptor.

[ПРИМЕР 2][EXAMPLE 2]

Известно, что хемоатрактантный белок моноцитов (MCP)-1 вовлечен в клеточную инвазию моноцитов, T-клеток, NK-клеток и базофилов. Сообщалось, что MCP-1 сильно экспрессируется в синовиальной ткани/синовиальной жидкости больных РА (J. Clin. Invest., Sep 1992; 90(3): 772-9) и, как считается, вовлечен в патологическое состояние РА (Inflamm Allergy Drug Targets, Mar 2008; 7(1): 53-66).The chemoattractant monocyte protein (MCP) -1 is known to be involved in cell invasion of monocytes, T cells, NK cells and basophils. MCP-1 has been reported to be highly expressed in the synovial tissue / synovial fluid of patients with RA (J. Clin. Invest., Sep 1992; 90 (3): 772-9) and is believed to be involved in the pathological state of RA (Inflamm Allergy Drug Targets, Mar 2008; 7 (1): 53-66).

VEGF является мощным ангиогенным фактором и, как известно, продуцируется, например, макрофагами, фибробластами и синовиальными клетками в синовиальной мембране больных РА (J. Rheumatol., Sep 1995; 22(9): 1624-30). Кроме того, уровень VEGF в сыворотке крови больных РА коррелирует с активизацией болезни и рентгенографическим прогрессированием заболевания (Arthritis Rheum., Jun 2003; 48(6): 1521-1529; и Arthritis Rheum., Sep 2001; 44(9): 2055-64), и уровень VEGF в сыворотке крови снижается при лечении больных РА антителом против IL-6R TOCILIZUMAB; поэтому VEGF, как считается, также играет важную роль в патологическом состоянии РА (Mod. Rheumatol. 2009; 19(1): 12-9; and Mediators Inflamm. 2008; 2008: 129873).VEGF is a potent angiogenic factor and is known to be produced, for example, by macrophages, fibroblasts and synovial cells in the synovial membrane of patients with RA (J. Rheumatol., Sep 1995; 22 (9): 1624-30). In addition, serum VEGF levels in patients with RA correlate with disease activation and radiographic progression of the disease (Arthritis Rheum., Jun 2003; 48 (6): 1521-1529; and Arthritis Rheum., Sep 2001; 44 (9): 2055- 64), and the level of VEGF in the blood serum decreases when treating patients with RA with the anti-IL-6R antibody TOCILIZUMAB; therefore, VEGF is also believed to play an important role in the pathological state of RA (Mod. Rheumatol. 2009; 19 (1): 12-9; and Mediators Inflamm. 2008; 2008: 129873).

Таким образом, проверялось, могут ли TOCILIZUMAB и Fv4-M73 ингибировать продуцирование MCP-1 и VEGF синовиальными клетками, полученными от РА-пациентов человека, которое происходит от стимулирования sIL-6R и IL-6.Thus, it was tested whether TOCILIZUMAB and Fv4-M73 can inhibit the production of MCP-1 and VEGF by synovial cells obtained from human RA patients, which comes from stimulation of sIL-6R and IL-6.

Синовиальные клетки, полученные от РА-пациентов человека (TOYOBO), засевали в 96-луночные планшеты в среду IMDM, содержащую 5% FCS, в концентрации 2×10⁴ клеток/0,05 мл/лунку и помещали на 90 минут в СО₂-инкубатор (37°C, 5% СО₂). Добавляли 0,05 мл TOCILIZUMAB и Fv4-M73, разведенных до соответствующих концентраций, планшеты оставляли еще на 15 минут, затем добавляли 0,05 мл растворимого рецептора IL-6 (SR344: подготовленного в соответствии со способом, описанным в справочном примере). Планшеты оставляли еще на 30 минут, а затем добавляли 0,05 мл IL-6 (TORAY) (конечные концентрации растворимого рецептора IL-6 и IL-6 составляли 50 нг/мл для каждого). После двух дней культивирования собирали культуральные супернатанты, и концентрации MCP-1 и VEGF в культуральных супернатантах определяли с помощью ELISA kit (Biosource and Pierce Biotechnology). Результаты показаны на Фиг. 4 и 5. TOCILIZUMAB и Fv4-M73 ингибировали продуцирование MCP-1 и VEGF синовиальными клетками, полученными от РА-пациента человека, после стимулирования растворимым рецептором IL-6 и IL-6 зависящим от концентрации образом.Synovial cells obtained from human RA patients (TOYOBO) were seeded in 96-well plates in IMDM medium containing 5% FCS at a concentration of 2 × 10 ⁴ cells / 0.05 ml / well and placed for 90 minutes in CO ₂ incubator (37 ° C, 5% CO ₂ ). 0.05 ml of TOCILIZUMAB and Fv4-M73 diluted to the appropriate concentrations were added, the plates were left for another 15 minutes, then 0.05 ml of soluble IL-6 receptor (SR344: prepared according to the method described in the reference example) was added. The plates were left for another 30 minutes, and then 0.05 ml of IL-6 (TORAY) was added (final concentrations of soluble IL-6 and IL-6 receptor were 50 ng / ml for each). After two days of cultivation, culture supernatants were collected and the concentrations of MCP-1 and VEGF in the culture supernatants were determined using an ELISA kit (Biosource and Pierce Biotechnology). The results are shown in FIG. 4 and 5. TOCILIZUMAB and Fv4-M73 inhibited the production of MCP-1 and VEGF by synovial cells obtained from a human RA patient after stimulation with a soluble IL-6 and IL-6 receptor in a concentration-dependent manner.

Соответственно, сохранение эффекта для Fv4-M73 как антитела, нейтрализующего рецептор IL-6 (эффект связывания с рецептором IL-6 и блокирование сигналов рецептора IL-6 мембранного типа и растворимого рецептора IL-6), значительно превосходит таковое для TOCILIZUMAB, частота введения и дозы могут быть значительно сокращены по сравнению с TOCILIZUMAB, и, кроме того, Fv4-M73 ингибирует продуцирование MCP-1 и VEGF синовиальными клетками, полученными от РА-пациента человека. Таким образом, было показано, что Fv4-M73 представляет собой очень эффективное лекарственное средство против РА.Accordingly, the preservation of the effect for Fv4-M73 as an antibody that neutralizes the IL-6 receptor (the effect of binding to the IL-6 receptor and blocking signals of the membrane-type IL-6 receptor and soluble IL-6 receptor) significantly exceeds that for TOCILIZUMAB, the frequency of administration and doses can be significantly reduced compared to TOCILIZUMAB, and in addition, Fv4-M73 inhibits the production of MCP-1 and VEGF by synovial cells obtained from a human RA patient. Thus, Fv4-M73 has been shown to be a very effective anti-RA drug.

Справочные примерыReference examples

Подготовка растворимого рекомбинантного рецептора IL-6 человекаPreparation of Soluble Recombinant Human IL-6 Receptor

Растворимый рекомбинантный рецептор IL-6 человека рецептора IL-6 человека, который является антигеном, получали, как описано ниже. Была образована клеточная линия СНО, стабильно экспрессирующая растворимый рецептор IL-6 человека, содержащий последовательность от N-концевой 1-й до 344-й аминокислоты, опубликованной в J. Biochem. (1990) 108: 673-676 (Yamasaki et al., Science (1988) 241: 825-828 (GenBank #X12830)). Растворимый рецептор IL-6 человека очищали из культурального супернатанта экспрессирующих SR344 клеток СНО при помощи трех хроматографий на колонках: хроматографии на колонке с Blue Sepharose 6 FF, аффинной хроматографии с использованием колонки с иммобилизованным антителом, специфическим для SR344, и гель-фильтрационной колоночной хроматографии. Фракцию, элюированную в качестве основного пика, использовали как окончательно очищенный образец.A soluble recombinant human IL-6 receptor of the human IL-6 receptor, which is an antigen, was prepared as described below. A CHO cell line was formed stably expressing a soluble human IL-6 receptor containing the sequence from the N-terminal 1st to 344th amino acids published in J. Biochem. (1990) 108: 673-676 (Yamasaki et al ., Science (1988) 241: 825-828 (GenBank # X12830)). The soluble human IL-6 receptor was purified from the culture supernatant of SRO4 expressing CHO cells using three column chromatography: column chromatography with Blue Sepharose 6 FF, affinity chromatography using an SR344-specific immobilized antibody column chromatography, and gel filtration column chromatography. The fraction eluted as the main peak was used as a finally purified sample.

Подготовка рекомбинантного растворимого рецептора IL-6 (cIL-6R) яванского макакаPreparation of Recombinant Soluble IL-6 Receptor (cIL-6R) of Cynomolgus Macaque

Олиго-ДНК праймеры подготавливали на основе раскрытой последовательности гена рецептора IL-6 макака-резуса (Birney et al., Ensembl 2006, Nucleic Acids Res. 2006 Jan 1; 34 (Database issue): D556-61). Фрагмент ДНК, кодирующий полный ген рецептора IL-6 яванского макака, подготавливали при помощи ПЦР с использованием праймеров и, в качестве матрицы, кДНК, полученной из поджелудочной железы яванского макака. Полученный в результате фрагмент ДНК был встроен в вектор для экспрессии в животной клетке, и с использованием вектора подготавливали линию СНО с устойчивой экспрессией (продуцирующая cyno.sIL-6R клеточная линия СНО). Культуральную среду продуцирующей cyno.sIL-6R линии СНО очищали с помощью колонки HisTrap (GE Healthcare Bioscience), а затем концентрировали при помощи Amicon Ultra-15 Ultracel-10k (Millipore). Окончательно очищенный образец растворимого рецептора IL-6 яванского макака (в дальнейшем cIL-6R) получали путем дальнейшей очистки на гель-фильтрационной колонке Superde×200pg16/60 (GE Healthcare Bioscience).Oligo DNA primers were prepared based on the disclosed rhesus monkey IL-6 receptor gene sequence (Birney et al. , Ensembl 2006, Nucleic Acids Res. 2006 Jan 1; 34 (Database issue): D556-61). A DNA fragment encoding the complete cynomolgus IL-6 receptor gene was prepared using PCR using primers and, as a template, cDNA obtained from the pancreas of cynomolgus macaque. The resulting DNA fragment was inserted into the vector for expression in an animal cell, and a CHO line with stable expression (cyno.sIL-6R producing CHO cell line) was prepared using the vector. The culture medium of the cyno.sIL-6R producing CHO line was purified using a HisTrap column (GE Healthcare Bioscience), and then concentrated using Amicon Ultra-15 Ultracel-10k (Millipore). A finally purified sample of the soluble cynomolgus IL-6 receptor (hereinafter cIL-6R) was obtained by further purification on a Superde × 200pg16 / 60 gel filtration column (GE Healthcare Bioscience).

Подготовка рекомбинантного IL-6 (cIL-6) яванского макакаPreparation of Recombinant IL-6 (cIL-6) Cynomolgus Macaque

IL-6 яванского макака подготавливали в соответствии с методикой, описанной ниже. Подготавливали нуклеотидную последовательность, кодирующую 212 аминокислот, депонированную под SWISSPROT Accession No. P79341, и клонировали в вектор для экспрессии в клетках животных. Полученный в результате вектор вводили в клетки СНО для подготовки линии СНО с устойчивой экспрессией (продуцирующей cyno.IL-6R клеточной линии СНО). Культуральную среду продуцирующей cyno.IL-6R линии СНО очищали при помощи колонки SP-Sepharose/FF (GE Healthcare Bioscience) и затем концентрировали при помощи Amicon Ultra-15 Ultracel-5k (Millipore). Окончательно очищенный образец IL-6 яванского макака (в дальнейшем cIL-6) получали путем дальнейшей очистки на гель-фильтрационной колонке Superde×75pg26/60 (GE Healthcare Bioscience), а затем концентрировали при помощи Amicon Ultra-15 Ultracel-5k (Millipore).Cynomolgus IL-6 was prepared in accordance with the procedure described below. A nucleotide sequence encoding 212 amino acids was prepared, deposited under SWISSPROT Accession No. P79341, and cloned into an expression vector in animal cells. The resulting vector was introduced into CHO cells to prepare a stable expression CHO line (producing cyno.IL-6R CHO cell line). The cyno.IL-6R producing CHO culture medium was purified using a SP-Sepharose / FF column (GE Healthcare Bioscience) and then concentrated using Amicon Ultra-15 Ultracel-5k (Millipore). A final purified sample of cynomolgus IL-6 (hereinafter cIL-6) was obtained by further purification on a Superde × 75pg26 / 60 gel filtration column (GE Healthcare Bioscience), and then concentrated using Amicon Ultra-15 Ultracel-5k (Millipore) .

Подготовка, экспрессия и очистка вариантов TOCILIZUMABPreparation, expression and purification of TOCILIZUMAB variants

Плазмидные фрагменты, кодирующие нужные последовательности антител, встраивали в вектор для экспрессии в клетках животных, чтобы сконструировать экспрессионные векторы для представляющих интерес H-цепей и L-цепей. Нуклеотидные последовательности полученных экспрессионных векторов определяли способом, известным специалистам в рассматриваемой области. Антитела экспрессировали при помощи способа, описанного ниже. Клеточную линию HEK293H (Invitrogen), полученную из эмбрионального рака почек человека, суспендировали в DMEM (Invitrogen) с добавлением 10% фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота (Invitrogen). Клетки засевали в чашки, в количестве 10 мл/чашка в чашки для приросших клеток (10 см в диаметре; CORNING) с плотностью клеток от 5 до 6×10⁵ клеток/мл и культивировали в СО₂-инкубаторе (37°C, 5% СО₂) в течение одного полного дня и ночи. Затем среду удаляли отсасыванием и добавляли 6,9 мл среды CHO-S-SFM-II (Invitrogen). Подготовленную плазмиду вводили в клетки при помощи способа липофекции. Полученные в результате культуральные супернатанты собирали, центрифугировали (приблизительно 2000 g, 5 минут, комнатная температура) для удаления клеток и стерилизовали путем фильтрации через 0,22-мкм фильтр MILLEX(R)-GV (Millipore) для получения супернатантов. Антитела очищали из полученных культуральных супернатантов способом, известным специалистам в рассматриваемой области, с использованием rProtein A Sepharose^TM Fast Flow (Amersham Biosciences). Для определения концентрации очищенного антитела измеряли оптическую плотность при 280 нм с использованием спектрофотометра. Концентрации антител рассчитывали по определенным значениям при помощи коэффициента поглощения, рассчитанного способом PACE (Protein Science (1995) 4: 2411-2423).Plasmid fragments encoding the desired antibody sequences were inserted into an expression vector in animal cells to construct expression vectors for the H chains and L chains of interest. The nucleotide sequences of the resulting expression vectors were determined by a method known to specialists in this field. Antibodies were expressed using the method described below. The HEK293H cell line (Invitrogen) derived from human embryonic kidney cancer was suspended in DMEM (Invitrogen) supplemented with 10% fetal bovine serum (Invitrogen). Cells were seeded in plates in an amount of 10 ml / cup in cups for grown cells (10 cm in diameter; CORNING) with a cell density of 5 to 6 × 10 ⁵ cells / ml and cultured in a CO ₂ incubator (37 ° C, 5 % CO ₂ ) for one full day and night. Then the medium was removed by suction and 6.9 ml of CHO-S-SFM-II medium (Invitrogen) was added. The prepared plasmid was introduced into the cells using the lipofection method. The resulting culture supernatants were collected, centrifuged (approximately 2000 g, 5 minutes, room temperature) to remove cells and sterilized by filtration through a 0.22 μm MILLEX (R) -GV (Millipore) filter to obtain supernatants. Antibodies were purified from the obtained culture supernatants by a method known to those skilled in the art using rProtein A Sepharose ^™ Fast Flow (Amersham Biosciences). To determine the concentration of purified antibodies, the absorbance was measured at 280 nm using a spectrophotometer. Antibody concentrations were calculated from the determined values using the absorption coefficient calculated by the PACE method (Protein Science (1995) 4: 2411-2423).

РК/PD-тест для определения концентрации антител в плазме концентрации СРБ и несвязанного растворимого рецептора IL-6 у макаковPK / PD test to determine the concentration of antibodies in the plasma of the concentration of CRP and unbound soluble IL-6 receptor in macaques

Концентрации в плазме яванских макак определяли путем ELISA с помощью способа, известного специалистам. Концентрацию СРБ определяли при помощи автоматизированного анализатора (TBA-120FR; Toshiba Medical Systems Co.) с использованием Cias R СРБ (KANTO CHEMICAL CO., INC.). Концентрацию в плазме несвязанного растворимого рецептора IL-6 яванского макака у яванских макак определяли в соответствии с методикой, описанной ниже. Все антитела типа IgG (IgG яванского макака, антитело против рецептора IL-6 человека и комплекса антитела против рецептора IL-6 человека с растворимым рецептором IL-6 яванского макака) в плазме адсорбировали на протеин A путем нагружения плазмы крови яванского макака на соответствующее количество rProtein A Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare), высушенной в 0,22-мкм фильтрационной ячейке (Millipore). Затем, раствор в ячейке сливали с помощью высокоскоростной центрифуги для сбора раствора, который просочился. Раствор, который просочился, не содержит связанного с протеином А комплекса антитела против рецептора IL-6 человека с растворимым рецептором IL-6 яванского макака. Таким образом, концентрацию несвязанного растворимого рецептора IL-6 можно определять путем измерения концентрации растворимого рецептора IL-6 яванского макака в растворе, который просочился через протеин А. Концентрацию растворимого рецептора IL-6 яванского макака определяли при помощи способа, известного специалистам, для измерения концентрации рецептора IL-6 человека. Растворимый рецептор IL-6 яванского макака (cIL-6R), подготовленный, как описано выше, использовали в качестве стандарта. Процентное содержание несвязанного растворимого рецептора IL-6 рассчитывали по следующей формуле.Plasma concentrations of cynomolgus monkeys were determined by ELISA using a method known in the art. CRP concentration was determined using an automated analyzer (TBA-120FR; Toshiba Medical Systems Co.) using Cias R CRP (KANTO CHEMICAL CO., INC.). The plasma concentration of the unbound soluble receptor of cynomolgus monkey IL-6 in cynomolgus monkeys was determined in accordance with the procedure described below. All IgG type antibodies (cynomolgus IgG, anti-human IL-6 receptor antibody and complex of human anti-human IL-6 receptor antibody with soluble cynomolgus IL-6 receptor) in plasma were adsorbed onto protein A by loading the plasma of cynomolgus macaque with an appropriate amount of rProtein A Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare), dried in a 0.22-micron filtration cell (Millipore). Then, the solution in the cell was drained using a high speed centrifuge to collect the solution that had leaked. The leaked solution does not contain protein A-bound antibody complex against human IL-6 receptor with soluble cynomolgus monkey IL-6 receptor. Thus, the concentration of the unbound soluble IL-6 receptor can be determined by measuring the concentration of the soluble IL-6 receptor of cynomolgus macaque in a solution that has leaked through protein A. The concentration of the soluble IL-6 receptor of cynomolgus macaque was determined using a method known to those skilled in the art for measuring concentration human IL-6 receptor. The soluble cynomolgus IL-6 receptor (cIL-6R) prepared as described above was used as a standard. The percentage of unbound soluble IL-6 receptor was calculated by the following formula.

Claims

1. Лекарственное средство для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которое представляет собой антитело, содержащее тяжелую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73),
и легкую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3).1. A drug for the treatment of rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children or Castlemen's disease, which is an antibody containing a heavy chain, including:
CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),
CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), and
CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73),
and a light chain including:
CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),
CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), and
CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3).

2. Лекарственное средство для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которое представляет собой антитело, содержащее тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73), и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3).2. A medicament for treating rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children, or Castlemen’s disease, which is an antibody containing a heavy chain comprising the variable region of the heavy chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (variable region VH3-M73) and light a chain comprising the variable region of the light chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (variable region VL3).

3. Лекарственное средство для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которое представляет собой антитело, содержащее тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73), и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3).3. A medicament for treating rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children, or Castleman’s disease, which is an antibody containing a heavy chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (VH3-M73) and a light chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO : 10 (VL3).

4. Способ лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, который включает стадию введения антитела, которое содержит тяжелую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73),
и легкую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3).4. A method of treating rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children, or Castleman’s disease, which comprises the step of administering an antibody that contains a heavy chain, including:
CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),
CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), and
CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73),
and a light chain including:
CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),
CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), and
CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3).

5. Способ лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, который включает стадию введения антитела, которое содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73), и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3).5. A method of treating rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children, or Castleman’s disease, which comprises the step of administering an antibody that contains a heavy chain comprising a variable region of a heavy chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (variable region VH3-M73) and a light a chain comprising the variable region of the light chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (variable region VL3).

6. Способ лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, который включает стадию введения антитела, которое содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73), и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3).6. A method of treating rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children, or Castleman disease, which comprises the step of administering an antibody that contains a heavy chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (VH3-M73) and a light chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO : 10 (VL3).

7. Применение антитела, которое содержит тяжелую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73),
и легкую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3),
при производстве средства для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена.7. The use of antibodies, which contains a heavy chain, including:
CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),
CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), and
CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73),
and a light chain including:
CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),
CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), and
CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3),
in the manufacture of a medicament for the treatment of rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children or Castleman's disease.

8. Применение антитела, которое содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73), и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3), при производстве средства для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена.8. The use of an antibody that contains a heavy chain comprising the variable region of the heavy chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (variable region VH3-M73), and a light chain comprising the variable region of the light chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (variable region VL3), in the manufacture of an agent for the treatment of rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children or Castlemen’s disease.

9. Применение антитела, которое содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73), и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3), при производстве средства для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена.9. The use of an antibody that contains a heavy chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (VH3-M73) and a light chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 (VL3) in the manufacture of an agent for treating rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children or Castlemen's disease.

10. Применение антитела в способе лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, где указанное антитело содержит тяжелую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73),
и легкую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3).10. The use of antibodies in a method of treating rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children or Castlemen's disease, where the specified antibody contains a heavy chain, including:
CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),
CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), and
CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73),
and a light chain including:
CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),
CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), and
CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3).

11. Применение антитела в способе лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, где указанное антитело содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73), и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3).11. The use of antibodies in the method of treating rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children or Castleman’s disease, where the specified antibody contains a heavy chain including the variable region of the heavy chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (variable region VH3-M73), and light chain comprising the variable region of the light chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (variable region VL3).

12. Применение антитела в способе лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, где указанное антитело содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73), и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3). 12. The use of antibodies in a method for the treatment of rheumatoid arthritis, chronic arthritis in children or Castleman disease, where the specified antibody contains a heavy chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (VH3-M73), and a light chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 (VL3).