RU2519765C1 - Method for preparing antithymus globulin for intravenous administration - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention concerns a method for preparing antithymus globulin for intravenous administration, involving immunising animals with human thymus cells, depleting the prepared immune plasma by processing with human AB(IV) plasma, performing the 3-staged plasma protein fractionation with polyethylene glycol 6000 (PEG-6000), removing the non-lymphoid antigen antibodies from the fractionated mixture by successive double treatment with mixture of washed donor erythrocytes and single treatment with thrombocyte concentrate of four blood types, purifying an end product by PEG-6000 deposition, dissolving the prepared immunoglobulins in a physiologic solution, adding glycine, and performing clarification and sterilisation filtration.

EFFECT: improving the end product quality ensured by the maximum reduction of the impurities of non-lymphoid blood elements, simplifying the technology ensured by eliminating a cycle of additional centrifugation.

3 cl, 3 ex

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к получению иммунобиологических лекарственных препаратов, используемых для внутривенного введения при коррекции иммунодефицитных состояний различного генеза.The invention relates to medicine, namely to the production of immunobiological drugs used for intravenous administration in the correction of immunodeficiency states of various origins.

Известен способ извлечения иммуноглобулинов из биологических жидкостей путем их пропускания через макропористый сополимер стирола и дивинилбензола, содержащий группы несимметричных диметилэтилен-бис-аммониевых оснований /SU 1121619, G01N 33/50, 1984/.A known method for the extraction of immunoglobulins from biological fluids by passing them through a macroporous copolymer of styrene and divinylbenzene containing groups of asymmetric dimethylene-bis-ammonium bases / SU 1121619, G01N 33/50, 1984 /.

Недостатками указанного способа являются его трудоемкость и невысокая степень очистки конечного продукта.The disadvantages of this method are its complexity and the low degree of purification of the final product.

Запатентованы способы получения антитимоцитарного иммуноглобулина из сыворотки крови иммунизированный животных, включающие анионообменную и аффинную хроматографию, осаждение сульфатом натрия, обессоливание и концентрирование с помощью диализа и диафильтрации /US 4541953, C07K 16/28, 1985/, /WO 2006/064373, A C07K 16/00, 2010/, /US 7528240, C07K 1/18, 2009/. При всех достоинствах методов они не лишены недостатков в виде необходимости приобретения дорогостоящего оборудования, введения дополнительных стадий (хроматография, диализ, диафильтрация), приводящих к значительному увеличению продолжительности производственного цикла, что может негативно влиять на сохранность специфической активности конечного продукта, и к существенным дополнительным финансовым затратам.Patented methods for producing anti-thymocyte immunoglobulin from blood serum of immunized animals, including anion exchange and affinity chromatography, precipitation with sodium sulfate, desalination and concentration using dialysis and diafiltration / US 4541953, C07K 16/28, 1985 /, / WO 2006/064373, A C07 2006/064373, A C07 2006/064373, A C07K 16/28, 1985; / 00, 2010 /, / US 7528240, C07K 1/18, 2009 /. With all the advantages of the methods, they are not without drawbacks in the form of the need to purchase expensive equipment, the introduction of additional stages (chromatography, dialysis, diafiltration), which lead to a significant increase in the duration of the production cycle, which can negatively affect the safety of the specific activity of the final product, and significant additional financial the cost.

Известен способ приготовления антитимоцитарного глобулина, основанный на получении препарата из плазмы крови иммунизированных животных (коз, кроликов, лошадей) путем фракционирования ее риванолом (для освобождения от балластных белков) с последующей адсорбцией гетероагглютининов плазмы на эритроцитах человека и доочисткой полупродукта с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ) 6000 /RU 2178309, A61K 39/395, 2002/. Главными недостатками этого метода являются трудоемкость процесса фракционирования риванолом и необходимость дальнейшей очистки полупродукта от этого реагента. Кроме того, производство риванола в России прекращено, стоимость зарубежного реактива очень высока.A known method for the preparation of anti-thymocyte globulin, based on the preparation of the drug from the blood plasma of immunized animals (goats, rabbits, horses) by fractionating it with rivanol (to release from ballast proteins), followed by adsorption of plasma heteroagglutinins on human red blood cells and post-treatment of the intermediate using polyethylene glycol (PEG) 6000 / RU 2178309, A61K 39/395, 2002 /. The main disadvantages of this method are the complexity of the rivanol fractionation process and the need for further purification of the intermediate from this reagent. In addition, the production of rivanol in Russia has been discontinued, the cost of a foreign reagent is very high.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ получения антитимоцитарного глобулина для внутривенного введения из иммунной плазмы крови животных (например, коз, кроликов, лошадей) после иммунизации их клетками вилочковой железы эмбрионов человека /RU 2264826, A61K 39/395, 2005/. Метод основан на истощении иммунной плазмы белками плазмы АВ (1У) группы крови человека, последующем фракционировании с использованием ПЭГ-6000 и -20000, истощении полупродукта клеточными компонентами смеси всех четырех групп крови человека и очистки целевого продукта с помощью ПЭГ-6000.Closest to the claimed invention is a method for producing antithymocytic globulin for intravenous administration from the blood plasma of animals (for example, goats, rabbits, horses) after immunization with thymus cells of human embryos / RU 2264826, A61K 39/395, 2005 /. The method is based on the depletion of immune plasma by plasma proteins AB (1U) of a human blood group, subsequent fractionation using PEG-6000 and -20000, depletion of the intermediate product by the cell components of a mixture of all four human blood groups and purification of the target product using PEG-6000.

Основными недостатками этого метода являются:The main disadvantages of this method are:

1) трудоемкость приготовления и нетехнологичность использования рабочих растворов ПЭГ-20000 ввиду их высокой вязкости и, следовательно, плохой текучести;1) the complexity of the preparation and low-tech use of working solutions of PEG-20000 due to their high viscosity and, consequently, poor fluidity;

2) длительность фракционирования на этапе осаждения высокомолекулярных белков;2) the duration of fractionation at the stage of precipitation of high molecular weight proteins;

3) отсутствие коммерческого реагента ПЭГ-20000 в больших дозировках, необходимых для промышленного использования.3) the lack of commercial reagent PEG-20000 in large dosages necessary for industrial use.

Задачей данного изобретения является получение высокоочищенного ареактогенного препарата антитимоцитарного иммуноглобулина (АТГ) для внутривенного введения лишенного указанных недостатков.The objective of the invention is to obtain a highly purified areactogenic preparation of antithymocytic immunoglobulin (ATG) for intravenous administration devoid of these disadvantages.

Технический результат заключается в улучшении качества готового продукта за счет максимального снижения примесей антител к нелимфоидным элементам крови, а также в упрощении технологии за счет исключения дополнительного центрифугирования.The technical result consists in improving the quality of the finished product due to the maximum reduction of impurities of antibodies to non-lymphoid blood elements, as well as to simplify the technology by eliminating additional centrifugation.

Для решения поставленной задачи, а также для достижения заявленного технического результата предлагается способ получения антитимоцитарного глобулина для внутривенного введения, включающий иммунизацию животных клетками вилочковой железы человека, истощение полученной иммунной плазмы обработкой ее человеческой плазмой АВ (1У) группы, 3-этапное фракционирование белков плазмы полиэтиленгликолем-6000 (ПЭГ-6000), удаление из фракционированной смеси антител к нелимфоидным антигенам последовательной двукратной обработкой смесью отмытых донорских эритроцитов и однократной обработкой концентратом тромбоцитов всех четырех групп крови, очистку целевого продукта путем осаждения ПЭГ-6000, растворение полученных иммуноглобулинов в физиологическом растворе, добавление глицина и осветляющую и стерилизующую фильтрацию. Отличительной особенностью предлагаемого способа является то, что на втором этапе фракционирования удаление высокомолекулярных белков производят осаждением их ПЭГ-6000, а на стадии удаления антител к нелимфоидным элементам крови производят двухкратную абсорбцию полупродукта отмытыми эритроцитами в соотношении 1:0,125-0,15 с первой экспозицией 18-23 минуты и второй экспозицией 28-33 минуты с последующей абсорбцией тромбоцитами в соотношении 2,5-3,0 мл на 1 литр исходной плазмы.To solve this problem, as well as to achieve the claimed technical result, a method for producing antithymocyte globulin for intravenous administration is proposed, which includes immunizing animals with human thymus gland cells, depleting the resulting immune plasma by treating it with human plasma of the AB (1U) group, 3-stage fractionation of plasma proteins with polyethylene glycol -6000 (PEG-6000), removal from a fractionated mixture of antibodies to non-lymphoid antigens by sequential double treatment with a mixture of washed dono erythrocytes and a single treatment with a platelet concentrate of all four blood groups, purification of the target product by precipitation of PEG-6000, dissolution of the obtained immunoglobulins in physiological solution, addition of glycine and clarifying and sterilizing filtration. A distinctive feature of the proposed method is that at the second stage of fractionation, the removal of high molecular weight proteins is carried out by precipitation with PEG-6000, and at the stage of removal of antibodies to non-lymphoid blood elements, the intermediate is double-absorbed by washed red blood cells in a ratio of 1: 0.125-0.15 with a first exposure of 18 -23 minutes and a second exposure of 28-33 minutes, followed by absorption by platelets in the ratio of 2.5-3.0 ml per 1 liter of initial plasma.

Дополнительно предлагается удаление высокомолекулярных белков плазмы проводить при рН 5,4-5,6.Additionally, the proposed removal of high molecular weight plasma proteins is carried out at a pH of 5.4-5.6.

Также дополнительно предлагается на стадии удаления высокомолекулярных белков использовать ПЭГ-6000 в конечной концентрации 2,5-2,6 об/об.It is also additionally proposed to use PEG-6000 at a final concentration of 2.5-2.6 v / v at the stage of removal of high molecular weight proteins.

Применение ПЭГ-6000 для удаления высокомолекулярных белков, наряду с использованием двухкратной абсорбции полупродукта отмытыми эритроцитами в соотношении 1:0,125-0,15 с первой экспозицией 18-23 минуты и второй экспозицией 28-33 минуты с последующей абсорбцией тромбоцитами в соотношении 2,5-3,0 мл на 1 литр исходной плазмы позволяет, с одной стороны, практически полностью исключить примеси антител к нелимфоидным элементам крови, а с другой стороны, упростить технологию получения готового продукта за счет исключения дополнительного центрифугирования. Таким образом, достигается основной технический результат. В качестве дополнительного технического результата можно указать на то, что предлагаемый способ позволяет получить АТГ, полностью соответствующий требованиям, предъявляемым к аналогичным препаратам для внутривенного введения в промышленных масштабах для последующего применения при предупреждении и лечении кризов отторжения трансплантатов органов, в частности почек, печени, для лечения апластической анемии, аутоиммунных заболеваний, а также в качестве иммуномодулятора (в ультранизких дозах) для лечения гнойно-воспалительных состояний.The use of PEG-6000 to remove high molecular weight proteins, along with the double absorption of the intermediate by washed red blood cells in a ratio of 1: 0.125-0.15 with a first exposure of 18-23 minutes and a second exposure of 28-33 minutes, followed by platelet absorption in a ratio of 2.5- 3.0 ml per 1 liter of the initial plasma allows, on the one hand, to almost completely eliminate the impurities of antibodies to non-lymphoid blood elements, and on the other hand, to simplify the technology of obtaining the finished product by eliminating additional centrifugation I am. Thus, the main technical result is achieved. As an additional technical result, we can indicate that the proposed method allows to obtain an ATG that fully complies with the requirements for similar drugs for intravenous administration on an industrial scale for subsequent use in the prevention and treatment of rejection crises of organ transplants, in particular, kidneys, liver, for the treatment of aplastic anemia, autoimmune diseases, and also as an immunomodulator (in ultra-low doses) for the treatment of purulent-inflammatory conditions s.

Способ осуществляется следующим образом. Многократно иммунизируют животных, например коз, кроликов, лошадей, взвесью клетками вилочковой железы человека, взятой от плода человека, погибшего в результате асфиксии или родовой травмы. При первой иммунизации используют полный адъювант Фрейнда. Спустя 2 недели после последней иммунизации, проводят эксфузию крови животных-продуцентов в контейнеры с гемоконсервантом для предотвращения гемолиза эритроцитов и последующее отделение иммунной плазмы, содержащей антитимоцитарный иммуноглобулин, центрифугированием. Плазму хранят при температуре -20°С и ниже до дальнейшего использования. На стадии фракционирования замороженную плазму оттаивают и добавляют к ней плазму донорской крови человека АВ (IV) группы в соотношении 20-25:1-1,5, соответственно. Затем проводят 3-этапное фракционирование плазмы крови ПЭГ-6000 в следующих условиях:The method is as follows. Immunize animals, for example, goats, rabbits, horses, with a suspension of cells of the thymus gland of a person taken from the fetus of a person who died as a result of asphyxiation or birth injury. At the first immunization, Freund's complete adjuvant is used. 2 weeks after the last immunization, the blood of animal producers is exfused into containers with a blood preservative to prevent erythrocyte hemolysis and subsequent separation of the immune plasma containing antithymocytic immunoglobulin by centrifugation. Plasma is stored at a temperature of -20 ° C and below until further use. At the fractionation stage, the frozen plasma is thawed and the blood plasma of human blood of the AB (IV) group is added to it in a ratio of 20-25: 1-1.5, respectively. Then spend 3-stage fractionation of blood plasma PEG-6000 under the following conditions:

- на 1 этапе осаждают целевой продукт с помощью ПЭГ-6000, вносимого до конечной концентрации 10-12% (вес/об) при рН 7,0-7,2, с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут на центрифуге;- at the 1st stage, the target product is precipitated using PEG-6000, introduced to a final concentration of 10-12% (w / v) at pH 7.0-7.2, followed by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes in a centrifuge ;

- на 11 этапе осадок, полученный на первом этапе, суспендируют в дистиллированной воде, доводят рН взвеси до 5,4-5,6, добавляют ПЭГ-6000 до концентрации 2,5-2,6% и отделяют осадок высокомолекулярных белков центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут, осадок выбрасывают;- at stage 11, the precipitate obtained in the first stage is suspended in distilled water, the suspension pH is adjusted to 5.4-5.6, PEG-6000 is added to a concentration of 2.5-2.6%, and the high molecular weight protein precipitate is separated by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes, the precipitate is discarded;

- на 111 этапе к надосадочной жидкости при рН в 7,0-7,2 добавляют ПЭГ-6000 до 10-12%, центрифугируют, растворяют осадок иммуноглобулинов в физиологическом растворе.- at the 111 stage, PEG-6000 up to 10-12% is added to the supernatant at a pH of 7.0-7.2, centrifuged, the immunoglobulin precipitate is dissolved in physiological saline.

На IV этапе проводят сорбцию - антитела к эритроцитам и тромбоцитам в полупродукте удаляют двукратно смесью эритроцитов (в соотношении 1:0,125-0,15 об/об) и однократно смесью тромбоцитов (в соотношении 2,5-3,0 мл/л полупродукта) четырех групп крови человека и центрифугируют.At the IV stage, sorption is carried out - antibodies to red blood cells and platelets in the intermediate are removed twice with a mixture of red blood cells (in the ratio of 1: 0.125-0.15 vol / vol) and once with a mixture of platelets (in the ratio of 2.5-3.0 ml / l of the intermediate) four human blood types and centrifuged.

На V этапе окончательную очистку целевого продукта производят с помощью ПЭГ-6000, добавляя его до конечной концентрации 10-12% (вес/об) при рН 7,0-7,2. Взвесь центрифугируют при 3000-3500 об/мин в течение 10-15 минут.At the V stage, the final purification of the target product is carried out using PEG-6000, adding it to a final concentration of 10-12% (weight / vol) at a pH of 7.0-7.2. The suspension is centrifuged at 3000-3500 rpm for 10-15 minutes.

На VI этапе осадок белков, представляющий собой иммуноглобулины (не менее 90%) класса G и М, растворяют в физиологическом растворе и добавляют в качестве стабилизатора глицин (15-25 г/л растворенного белка), затем проводят осветляющую и стерилизующую фильтрацию, разлив и последующую лиофилизацию. Целевой продукт перед использованием растворяют в физиологическом растворе.At stage VI, a protein precipitate, which is an immunoglobulin (at least 90%) of class G and M, is dissolved in physiological saline and glycine (15-25 g / l of dissolved protein) is added as a stabilizer, then clarifying and sterilizing filtration, spilling and subsequent lyophilization. The target product is dissolved in physiological saline before use.

Пример 1. Здоровых коз обоего пола в возрасте 1-3 года весом 18-30 кг 6-кратно иммунизируют взвесью клеток, полученных из вилочковых желез трупов новорожденных детей, погибших в результате асфиксии или родовой травмы. При первой иммунизации животных антиген вводят одновременно с полным адьювантом Фрейнда. Смесь, состоящую из 2 мл взвеси клеток вилочковой железы человека в концентрации 3×10⁸ и 2 мл адьюванта, вводят козам внутримышечно по 1 мл в четыре точки. Через две недели проводят 5 последующих иммунизаций с интервалом в 3-5 дней. Каждому животному вводят по 2 мл антигена. Через две недели после последней иммунизации производят заготовку крови в контейнеры с гемоконсервантом, что исключает гемолиз эритроцитов. Иммунную плазму отделяют от клеток крови центрифугированием и хранят в морозильнике при -20°С и ниже до использования. Перед стадией фракционирования размороженную плазму обрабатывают плазмой крови человека АВ (IV) группы, добавляя последнюю в соотношении 25:1,5. Смесь непрерывно перемешивают в течение не менее 30 минут.Example 1. Healthy goats of both sexes aged 1-3 years weighing 18-30 kg are immunized 6 times with a suspension of cells obtained from the thymus glands of the corpses of newborn children who died as a result of asphyxiation or birth injury. At the first immunization of animals, the antigen is administered simultaneously with Freund's complete adjuvant. A mixture consisting of 2 ml of suspension of human thymus gland cells at a concentration of 3 × 10 ⁸ and 2 ml of adjuvant is administered intramuscularly to goats 1 ml at four points. After two weeks, 5 subsequent immunizations are carried out with an interval of 3-5 days. Each animal is injected with 2 ml of antigen. Two weeks after the last immunization, blood is harvested in containers with a blood preservative, which eliminates erythrocyte hemolysis. Immune plasma is separated from blood cells by centrifugation and stored in a freezer at -20 ° C and below until use. Before the fractionation stage, thawed plasma is treated with human blood plasma of the AB (IV) group, adding the latter in a ratio of 25: 1.5. The mixture is continuously stirred for at least 30 minutes.

Затем проводят фракционирование иммунной козьей плазмы с применением ПЭГ-6000 в следующих условиях:Then fractionation of the immune goat plasma is carried out using PEG-6000 under the following conditions:

- доведение рН смеси до 7,0-7,2, осаждение полупродукта с помощью ПЭГ-6000, вносимого до конечной концентрации 10-12%, с последующим центрифугированием при 3000 об/мин;- adjusting the pH of the mixture to 7.0-7.2, precipitation of the intermediate with PEG-6000, introduced to a final concentration of 10-12%, followed by centrifugation at 3000 rpm;

- суспендирование осадка в дистиллированной воде;- suspension of sediment in distilled water;

- снижение рН до 5,5, добавление ПЭГ-6000 до конечной концентрации 2,6%, центрифугирование при тех же условиях для удаления высокомолекулярных белков;- a decrease in pH to 5.5, the addition of PEG-6000 to a final concentration of 2.6%, centrifugation under the same conditions to remove high molecular weight proteins;

- доведение в надосадочной жидкости рН до 7,0-7,2, добавление ПЭГ-6000 до 10-12%, центрифугирование, удаление надосадочной жидкости с полиэтиленгликолем, растворение осадка иммуноглобулинов в физиологическом растворе, доведение рН до 7,2-7,4.- adjusting the pH in the supernatant to 7.0-7.2, adding PEG-6000 to 10-12%, centrifuging, removing the supernatant with polyethylene glycol, dissolving the precipitate of immunoglobulins in physiological saline, adjusting the pH to 7.2-7.4 .

Проводят сорбцию полупродукта для освобождения от антител к нелимфоидным антигенам. В полупродукт вносят смесь донорских отмытых эритроцитов четырех групп крови человека. Суспензию отмытых эритроцитов добавляют к полупродукту в соотношении 0,125:1 (об/об), непрерывно перемешивают в течение 20 минут при комнатной температуре, смесь полупродукта с клеточной суспензией центрифугируют 10 мин при 2500 об/мин при 10°С, осадок клеточной суспензии выбрасывают, затем повторно к надосадочному раствору добавляют отмытые эритроциты в том же соотношении, в течение 30 минут производят тщательное непрерывное перемешивание и центрифугируют при тех же условиях. К раствору полупродукта добавляют тромбоциты человека из расчета 2,5 мл/л исходной плазмы, оставляют на 45-минутный контакт при комнатной температуре и периодическом перемешивании, после чего центрифугируют 20 мин при 3900 об/мин при температуре 7±3°С. Надосадочную жидкость собирают в стерильную посуду и проводят очистку и выделение целевого продукта с помощью ПЭГ-6000, который вносят до конечной концентрации 11% при непрерывном перемешивании в течение 30 мин. Потом смесь центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин, надосадочный раствор удаляют, а к осадку белка добавляют при перемешивании физиологический раствор хлористого натрия до полного растворения осадка. Содержание общего белка в полупродукте, определяемое, например, биуретовым методом, составляет 15-50 мг/мл. На следующем этапе добавляют в качестве стабилизатора глицин из расчета 25 г/л растворенного белка, доводят рН до 7,3-7,5, а затем проводят осветляющую и стерилизующую фильтрацию препарата через мембранные фильтры типа "Миллипор" с соответствующими размерами пор, разлив препарата в ампулы или флаконы, его лиофилизацию и последующую укупорку.The sorption of the intermediate is carried out to release antibodies to non-lymphoid antigens. A mixture of donated washed red blood cells of four human blood groups is introduced into the intermediate. The suspension of washed red blood cells is added to the intermediate in a ratio of 0.125: 1 (v / v), continuously stirred for 20 minutes at room temperature, the mixture of the intermediate with the cell suspension is centrifuged for 10 minutes at 2500 rpm at 10 ° C, the cell suspension is discarded, then washed erythrocytes are added to the supernatant again in the same ratio, thorough continuous mixing is performed for 30 minutes and centrifuged under the same conditions. Human platelets were added to the intermediate solution at the rate of 2.5 ml / L of the initial plasma, left for 45 minutes at room temperature and periodically stirred, after which they were centrifuged at 3900 rpm for 7 minutes at a temperature of 7 ± 3 ° С. The supernatant is collected in a sterile dish and the target product is purified and isolated using PEG-6000, which is added to a final concentration of 11% with continuous stirring for 30 minutes. Then the mixture is centrifuged for 10 min at 3000 rpm, the supernatant is removed, and physiological sodium chloride solution is added to the protein precipitate with stirring until the precipitate is completely dissolved. The total protein content in the intermediate, determined, for example, by the biuret method, is 15-50 mg / ml. At the next stage, glycine is added as a stabilizer at the rate of 25 g / l of dissolved protein, the pH is adjusted to 7.3-7.5, and then the clarifying and sterilizing filtration of the preparation is carried out through membrane filters of the Millipor type with the corresponding pore sizes, spilling of the preparation into ampoules or vials, its lyophilization and subsequent capping.

В одной ампуле целевого продукта объемом 3-5 мл содержится 50-250 мг белка, который при контроле методом электрофореза на ацетатцеллюлозных пленках на 90% и более состоит из иммуноглобулинов (преимущественно IgG и IgM). Такая степень очистки соответствует национальным и международным требованиям, предъявляемым к иммуноглобулинам для внутривенного введения. Препарат не содержит консервантов и антибиотиков, его активность в лимфоцитотоксическом тесте составляет не менее 1:1024.In one ampoule of the target product with a volume of 3-5 ml contains 50-250 mg of protein, which when controlled by electrophoresis on cellulose acetate films for 90% or more consists of immunoglobulins (mainly IgG and IgM). This degree of purification complies with national and international requirements for immunoglobulins for intravenous administration. The drug does not contain preservatives and antibiotics, its activity in the lymphocytotoxic test is at least 1: 1024.

Пример 2. Кроликов весом 2,5-3 кг иммунизируют 6-кратно взвесью клеток вилочковой железы человека в концентрации 1,5×10⁸, как описано в примере 1. Через две недели после первой иммунизаций проводят 5 последующих иммунизации с интервалом в 3-5 дней. Каждому животному внутримышечно вводят по 2 мл антигена. Через две недели после последней иммунизации производят заготовку крови с гемоконсервантом. Иммунную плазму отделяют от клеток крови центрифугированием в условиях стерильного бокса. Затем полученную плазму обрабатывают плазмой крови человека в соотношении 20:1. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 30 минут для контакта. Затем проводят фракционирование плазмы крови ПЭГ-6000 в следующих условиях:Example 2. Rabbits weighing 2.5-3 kg are immunized 6 times with a suspension of human thymus gland cells at a concentration of 1.5 × 10 ⁸ , as described in example 1. Two weeks after the first immunization, 5 subsequent immunizations are carried out with an interval of 3- 5 days. Each animal is injected intramuscularly with 2 ml of antigen. Two weeks after the last immunization, a blood preparation with a blood preservative is performed. Immune plasma is separated from blood cells by centrifugation under sterile box conditions. Then the obtained plasma is treated with human blood plasma in a ratio of 20: 1. The mixture is thoroughly mixed and left to contact for 30 minutes. Then, fractionation of blood plasma PEG-6000 is carried out under the following conditions:

- рН 7,0-7,2, осаждение полупродукта с помощью ПЭГ-6000, вносимого в объемном соотношении до конечной концентрации 10-12%, с последующим центрифугированием;- pH 7.0-7.2, precipitation of the intermediate with PEG-6000, introduced in a volume ratio to a final concentration of 10-12%, followed by centrifugation;

- суспендирование осадка в дистиллированной воде;- suspension of sediment in distilled water;

- снижение рН до 5,6, добавление ПЭГ-6000 до объемной концентрации 2,5%, центрифугирование и отделение осадка высокомолекулярных белков;- lowering the pH to 5.6, adding PEG-6000 to a volume concentration of 2.5%, centrifuging and separating the precipitate of high molecular weight proteins;

- доведение в надосадочной жидкости рН до 7,0-7,2, добавление ПЭГ-6000 до 10-12%, центрифугирование, удаление надосадочной жидкости с полиэтиленгликолем, растворение осадка иммуноглобулинов в физиологическом растворе. Для освобождения полупродукта от антител к нелимфоидным антигенам вносят донорскую эритроцитарную массу и концентраты тромбоцитов четырех групп крови человека. Смесь отмытых эритроцитов добавляют к полупродукту в соотношении 0,15:1 (об/об). После непрерывного перемешивания в течение 20 мин при комнатной температуре смесь полупродукта с клеточной суспензией центрифугируют 10 мин при 2500 об/мин при 10°С, осадок выбрасывают. Проводят повторную сорбцию полупродукта смесью эритроцитов в таком же соотношении с экспозицией 30 мин. Затем к надосадочному раствору добавляют смесь тромбоцитов четырех групп крови человека из расчета 3 мл на 1 л исходной иммунной плазмы. Смесь инкубируют при периодическом перемешивании и комнатной температуре в течение 45 мин, после чего центрифугируют. Надосадочный раствор собирают в стерильную посуду, производят очистку и выделение целевого продукта с помощью ПЭГ-6000, который вносят до конечной концентрации 11% (вес/об), проводят непрерывное перемешивание в течение 30 мин и потом центрифугируют. Надосадочный раствор удаляют, а к осадку белка при непрерывном перемешивании добавляют физиологический раствор хлористого натрия до полного растворения осадка. На следующем этапе к растворенному осадку добавляют в качестве стабилизатора глицин из расчета 20 г/л растворенного осадка и доводят рН до 7,3-7,5, а затем проводят операции, как описано в примере 1. Активность целевого продукта в ЛЦТТ составляет не менее 1:1024.- adjusting the pH in the supernatant to 7.0-7.2, adding PEG-6000 to 10-12%, centrifuging, removing the supernatant with polyethylene glycol, dissolving the precipitate of immunoglobulins in physiological saline. To release the intermediate from antibodies to non-lymphoid antigens, donor erythrocyte mass and platelet concentrates of four human blood groups are introduced. A mixture of washed red blood cells is added to the intermediate in a ratio of 0.15: 1 (v / v). After continuous stirring for 20 minutes at room temperature, the intermediate mixture with the cell suspension is centrifuged for 10 minutes at 2500 rpm at 10 ° C, and the precipitate is discarded. Repeated sorption of the intermediate is carried out with a mixture of red blood cells in the same ratio with an exposure of 30 minutes. Then, a platelet mixture of four human blood groups is added to the supernatant solution at a rate of 3 ml per 1 liter of the original immune plasma. The mixture was incubated with periodic stirring at room temperature for 45 minutes, after which it was centrifuged. The supernatant is collected in a sterile dish, the target product is purified and isolated using PEG-6000, which is added to a final concentration of 11% (w / v), continuously mixed for 30 minutes and then centrifuged. The supernatant is removed, and physiological sodium chloride solution is added to the protein precipitate with continuous stirring until the precipitate is completely dissolved. In the next step, glycine is added to the dissolved precipitate as a stabilizer at the rate of 20 g / l of the dissolved precipitate and the pH is adjusted to 7.3-7.5, and then the operations are carried out as described in Example 1. The activity of the target product in LCTT is 1: 1024.

Пример 3. Лошадей в возрасте 1-2 лет иммунизируют 6-кратно взвесью клеток вилочковой железы человека в концентрации 1×10¹⁰, как описано в примере 1. Иммунную плазму заготавливают, как описано в примерах 1, 2, и истощают плазмой крови человека в соотношении 20:1. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 30 минут для контакта.Example 3. Horses aged 1-2 years old are immunized 6 times with a suspension of human thymus gland cells at a concentration of 1 × 10 ¹⁰ , as described in Example 1. Immune plasma is harvested as described in examples 1, 2, and depleted in human blood plasma 20: 1 ratio. The mixture is thoroughly mixed and left to contact for 30 minutes.

Затем проводят фракционирование плазмы крови ПЭГ-6000 в следующих условиях:Then, fractionation of blood plasma PEG-6000 is carried out under the following conditions:

- рН 7,0-7,2, осаждение полупродукта с помощью ПЭГ-6000, вносимого в объемном соотношении до конечной концентрации 10-12%, с последующим центрифугированием;- pH 7.0-7.2, precipitation of the intermediate with PEG-6000, introduced in a volume ratio to a final concentration of 10-12%, followed by centrifugation;

- растворение осадка в дистиллированной воде;- dissolution of the precipitate in distilled water;

- снижение рН до 5,4, добавление ПЭГ-6000 до объемной концентрации 2,5%, центрифугирование и отделение осадка высокомолекулярных белков;- lowering the pH to 5.4, adding PEG-6000 to a volume concentration of 2.5%, centrifuging and separating the precipitate of high molecular weight proteins;

- доведение в надосадочной жидкости рН до 7,0-7,2, добавление ПЭГ-6000 до 10-12%, центрифугирование, удаление надосадочной жидкости с полиэтиленгликолем, растворение осадка иммуноглобулинов в физиологическом растворе.- adjusting the pH in the supernatant to 7.0-7.2, adding PEG-6000 to 10-12%, centrifuging, removing the supernatant with polyethylene glycol, dissolving the precipitate of immunoglobulins in physiological saline.

Для освобождения полученного полупродукта от антител к нелимфоидным антигенам вносят последовательно донорские отмытые эритроциты и затем концентраты тромбоцитов смеси четырех групп крови человека. Проводят двухкратную абсорбцию полупродукта отмытыми эритроцитами в соотношении 1:0,15 (об/об) при условиях, указанных в примерах 1 и 2. К полученному после второй абсорбции надосадочному раствору добавляют тромбоциты человека из расчета 3,5 мл на 1 л исходной плазмы. Смесь инкубируют при комнатной температуре 45 мин, после чего проводят центрифугирование в течение 10 мин при 3900 об/мин при 10°С. Надосадочный раствор собирают в стерильную посуду и затем проводят выделение целевого продукта с помощью ПЭГ-6000, который вносят до конечной концентрации 12%. После непрерывного перемешивания в течение 30 мин проводят центрифугирование в течение 10 мин при 3000 об/мин. К осадку белка добавляют физиологический раствор и перемешивают до полного растворения осадка. На следующем этапе к растворенному белку добавляют в качестве стабилизатора глицин из расчета 25 г/л и доводят рН до 7,3-7,5. Все последующие операции проводят, как описано в примерах 1 и 2. Активность целевого продукта в ЛЦТТ составляет не менее 1:1024.To free the resulting intermediate from antibodies to non-lymphoid antigens, donor washed red blood cells and then platelet concentrates of a mixture of four human blood groups are added sequentially. Twice absorption of the intermediate is carried out with washed red blood cells in a ratio of 1: 0.15 (v / v) under the conditions specified in examples 1 and 2. To the supernatant obtained after the second absorption, human platelets are added at the rate of 3.5 ml per 1 liter of initial plasma. The mixture was incubated at room temperature for 45 minutes, after which centrifugation was carried out for 10 minutes at 3900 rpm at 10 ° C. The supernatant is collected in a sterile dish and then the desired product is isolated using PEG-6000, which is added to a final concentration of 12%. After continuous stirring for 30 minutes, centrifugation is carried out for 10 minutes at 3000 rpm. Saline is added to the protein pellet and mixed until the pellet is completely dissolved. In the next step, glycine is added to the dissolved protein as a stabilizer at a rate of 25 g / l and the pH is adjusted to 7.3-7.5. All subsequent operations are carried out as described in examples 1 and 2. The activity of the target product in LCTT is at least 1: 1024.

Claims (3)

1. Способ получения антитимоцитарного глобулина для внутривенного введения, включающий иммунизацию животных клетками вилочковой железы человека, истощение полученной иммунной плазмы обработкой ее человеческой плазмой АВ(IV) группы, 3-этапное фракционирование белков плазмы полиэтиленгликолем-6000 (ПЭГ-6000), удаление из фракционированной смеси антител к нелимфоидным антигенам последовательной двукратной обработкой смесью отмытых донорских эритроцитов и однократной обработкой концентратом тромбоцитов всех четырех групп крови, очистку целевого продукта путем осаждения ПЭГ-6000, растворение полученных иммуноглобулинов в физиологическом растворе, добавление глицина и осветляющую и стерилизующую фильтрацию, отличающийся тем, что на втором этапе фракционирования удаление высокомолекулярных белков производят осаждением их ПЭГ-6000, а на стадии удаления антител к нелимфоидным элементам крови производят двухкратную абсорбцию полупродукта отмытыми эритроцитами в соотношении 1 : 0,125 - 0,15 с первой экспозицией 18-23 минуты и второй экспозицией 28-33 минуты с последующей абсорбцией тромбоцитами в соотношении 2,5-3,0 мл на 1 литр исходной плазмы.1. A method for producing anti-thymocyte globulin for intravenous administration, comprising immunizing animals with human thymus cells, depleting the resulting immune plasma by treating it with human plasma of group AB (IV), 3-stage fractionation of plasma proteins with polyethylene glycol-6000 (PEG-6000), removal from fractionated a mixture of antibodies to non-lymphoid antigens by sequential double treatment with a mixture of washed donor red blood cells and a single treatment with a platelet concentrate of all four blood groups, of the left product by precipitation of PEG-6000, dissolving the obtained immunoglobulins in physiological saline, adding glycine and clarifying and sterilizing filtration, characterized in that in the second fractionation step the removal of high molecular weight proteins is performed by precipitation of their PEG-6000, and at the stage of removing antibodies to non-lymphoid blood elements produce double absorption of the intermediate with washed red blood cells in a ratio of 1: 0.125 - 0.15 with a first exposure of 18-23 minutes and a second exposure of 28-33 minutes followed by absorption of tro botsitami in a ratio of 2.5-3.0 ml per 1 liter of initial plasma. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что удаление высокомолекулярных белков плазмы проводят при рН 5,4-5,6.2. The method according to claim 1, characterized in that the removal of high molecular weight plasma proteins is carried out at a pH of 5.4-5.6. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии удаления высокомолекулярных белков используют ПЭГ 6000 в конечной концентрации 2,5-2,6 об/об. 3. The method according to claim 1, characterized in that at the stage of removal of high molecular weight proteins, PEG 6000 is used in a final concentration of 2.5-2.6 v / v.