RU2514001C2 - Use of 1,3-benzodioxole derivatives as bacterial collective behaviour (quorum sensing) regulators - Google Patents

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: invention relates to microbiology, biotechnology and pharmaceutics, and specifically to use of 1,3-benzodioxole derivatives of formula

(1) as collective behaviour (quorum sensing) regulators in bacteria, particularly for regulating homoserine lactone-mediated quorum sensing in violacein-producing biotechnologically useful, putrefactive and pathogenic bacteria.

EFFECT: controlling biotechnological processes, preventing spoilage of agricultural products and controlling bacterial infections in plants, animals and humans.

2 dwg, 2 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и фармацевтике и касается малых регуляторных молекул, способных направленно изменять (ослаблять или усиливать) плотностно-зависимую коммуникацию и регулируемое ей коллективное поведение (чувство кворума) у бактерий. Изобретение может найти применение при контроле биотехнологических процессов, производстве средств для предупреждения порчи сельскохозяйственной продукции, а также создании новых лекарственных препаратов, предназначенных для контроля и управления бактериальными инфекциями растений, животных и человека.The invention relates to microbiology, biotechnology and pharmaceuticals and relates to small regulatory molecules capable of directionally changing (weakening or enhancing) density-dependent communication and the collective behavior regulated by it (sense of quorum) in bacteria. The invention can find application in the control of biotechnological processes, the production of means to prevent spoilage of agricultural products, as well as the creation of new drugs designed to control and manage bacterial infections of plants, animals and humans.

Обнаружение плотностно-зависимой коммуникации у бактерий с характеристикой лежащих в ее основе молекулярно-генетических механизмов стало одним из наиболее ярких открытий в микробиологии конца XX века [1 - Greenberg Е.Р., Winans S., Fuqua С.Quorum sensing by bacteria. Ann. Rev. Microbiol, 1996, V.50, P.727-751]. При этом данный феномен коллективного поведения бактерий, обозначенный понятием «чувство кворума» (англ. - quorum sensing), позволил принципиально по-новому оценить целый ряд примеров функциональной и морфологической дифференцировки прокариот, включая развитие биолюминесценции, синтез пигментов и антибиотиков, образование экзоферментов и факторов вирулентности, формирование биопленок, конъюгацию и спорообразование [2 - Waters С.М., Bassler B.L. Quorum-sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Ann. Rev. Cell and Developmental Biol, 2005, V.21, P.319-346].The discovery of density-dependent communication in bacteria with a characteristic of the underlying molecular genetic mechanisms has become one of the most striking discoveries in microbiology of the late 20th century [1 - Greenberg E.R., Winans S., Fuqua C. Quorum sensing by bacteria. Ann. Rev. Microbiol, 1996, V.50, P.727-751]. At the same time, this phenomenon of collective behavior of bacteria, designated by the concept of “quorum sensing”, made it possible to fundamentally re-evaluate a number of examples of functional and morphological differentiation of prokaryotes, including the development of bioluminescence, the synthesis of pigments and antibiotics, the formation of exoenzymes and factors virulence, biofilm formation, conjugation and spore formation [2 - Waters S.M., Bassler BL Quorum-sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Ann. Rev. Cell and Developmental Biol, 2005, V.21, P.319-346].

Первым из описанных и наиболее распространенным среди микроорганизмов вариантом чувства кворума являются luxI/luxR-подобные системы, в которых синтезируемая под контролем гена luxI сигнальная молекула - автоиндуктор диффундирует во внешнюю среду, а при достижении критической плотности популяции и определяемой этим собственной пороговой концентрации совершает обратное движение внутрь бактериальной клетки, где связываясь с регуляторным белком LuxR, запускает транскрипцию целевых генов [3 - Fuqua W.C., Winans S.C., Greenberg Е.Р. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators. J. Bacteriol, 1994, V.176 (2). Р.269-275]. При этом анализ химической природы подобных автоиндукторов позволил охарактеризовать их как разнообразные варианты ацилированных гомосеринлактонов (ГСЛ) [4 - Fuqua С., The first of the described and the most common among microorganisms variant of the quorum feeling are luxI / luxR-like systems in which the signal molecule synthesized under the control of the luxI gene diffuses into the external environment, and when the critical density of the population is reached and its own threshold concentration is determined, it reverses inside the bacterial cell, where by binding to the regulatory protein LuxR, it triggers the transcription of target genes [3 - Fuqua WC, Winans SC, Greenberg E.R. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators. J. Bacteriol, 1994, V.176 (2). R.269-275]. Moreover, an analysis of the chemical nature of such autoinductors made it possible to characterize them as various variants of acylated homoseryl lactones (HFS) [4 - Fuqua S.,

Parsek R.M., Greenberg E.P. Regulation of gene expression by cell-to-cell communication: acyl-homoserine lactone quorum sensing. Annu. Rev. Genet, 2001, V.35, P.439 - 468].Parsek R.M., Greenberg E.P. Regulation of gene expression by cell-to-cell communication: acyl-homoserine lactone quorum sensing. Annu. Rev. Genet, 2001, V.35, P.439-468].

Расшифровка молекулярно-генетических механизмов коллективного поведения, а также выявление важной биологической роли систем плотностно-зависимой коммуникации определили актуальность поиска подходов к управлению чувством кворума. Предложенными решениями стали: 1) подавление синтеза автоиндуктора; 2) его деградация специфическими ферментами (лактоназами или ацилазами); 3) использование агонистов и антагонистов ГСЛ, способных прямо интерферировать с естественным сигналом за связывание с luхR-подобными белками [5 - Грузина В.Д. Коммуникативные сигналы бактерий. Антибиотики и химиотерапия, 2003, Т.48(10), С.32-39]. Именно последний подход, наиболее интенсивно разрабатываемый во многих лабораториях по всему миру и к настоящему моменту приведший созданию уже нескольких сотен активных соединений [6 - Galloway W.R.J.D., Hodgkinson J.Т., Bowden S.D., Welch M., Spring D.R. Quorum sensing in gram-negative bacteria: small-molecule modulation of AHL and AI-2 Quorum sensing pathways. Chem. Rev. 2011, V.lll, P.28-67], является наиболее близким к настоящему изобретению.Deciphering the molecular genetic mechanisms of collective behavior, as well as identifying the important biological role of density-dependent communication systems, have determined the relevance of the search for approaches to controlling the sense of quorum. The proposed solutions were: 1) suppression of the synthesis of auto-inductor; 2) its degradation by specific enzymes (lactonases or acylases); 3) the use of GSL agonists and antagonists that can directly interfere with the natural signal for binding to luhR-like proteins [5 - V. D. Gruzina Communicative signals of bacteria. Antibiotics and chemotherapy, 2003, T. 48 (10), S.32-39]. It is the latter approach, the most intensively developed in many laboratories around the world and to date which has led to the creation of several hundred active compounds [6 - Galloway W.R.J.D., Hodgkinson J.T., Bowden S.D., Welch M., Spring D.R. Quorum sensing in gram-negative bacteria: small-molecule modulation of AHL and AI-2 Quorum sensing pathways. Chem. Rev. 2011, V.lll, P.28-67], is closest to the present invention.

Анализ открытых патентных источников позволяет констатировать, что на основе данного подхода предложена целая серия изобретений, с 1996 по 2006 гг. нашедших отражение в международных охранных документах WO 96/29392; WO 99/27786; WO 99/53915; WO 01/43739; WO 01/68090; WO 01/68091; WO 01/76594; WO 01/85664; WO 02/00639; WO 02/18342; WO 02/47681; WO 02/102370; WO 03/039529; WO 03/106445; WO 2004/016588; WO 2006/079015; WO 2006/084056; WO 2006/125262. В частности, одним из последних и наиболее системных технических решений, сформированных по «зонтичному» принципу, является патент [7 - Blackwell Н.Е., Geske G.D., Campbell J.C. Modulation of bacterial quorum sensing with synthetic ligands. US patent 7910622, 2011], содержащий сведения о многочисленных синтетических лигандах и способах их использования для модуляции опосредуемого гомосеринлактонами чувства кворума у определенных видов бактерий. При этом в основу подобных веществ заявителями положено аналогичное природным ГСЛ лактонное кольцо, для придания которому дополнительных модулирующих активностей осуществлена ковалентная модификация ацильными группами различного строения и состава.Analysis of open patent sources allows us to state that on the basis of this approach a whole series of inventions was proposed, from 1996 to 2006. found in the international conservation documents WO 96/29392; WO 99/27786; WO 99/53915; WO 01/43739; WO 01/68090; WO 01/68091; WO 01/76594; WO 01/85664; WO 02/00639; WO 02/18342; WO 02/47681; WO 02/102370; WO 03/039529; WO 03/106445; WO 2004/016588; WO 2006/079015; WO 2006/084056; WO 2006/125262. In particular, one of the latest and most systemic technical solutions formed by the “umbrella” principle is the patent [7 - Blackwell N.E., Geske G. D., Campbell J.C. Modulation of bacterial quorum sensing with synthetic ligands. US patent 7910622, 2011], which contains information on numerous synthetic ligands and methods for their use to modulate homoserinlactone-mediated feelings of quorum in certain types of bacteria. Moreover, the applicants based on such substances a natural lactone ring similar to natural GSL, to give it additional modulating activities, covalent modification by acyl groups of various structures and compositions was carried out.

В то же время значительное структурное сходство предложенной группы молекул с естественными сигналами не только обеспечивает обозначенную заявителями возможность интерференции между ними, но и потенциальное развитие неучтенных эффектов в отношении других микроорганизмов, плотностно-зависимая коммуникация между которыми опосредуется структурно схожими ГСЛ.At the same time, the significant structural similarity of the proposed group of molecules with natural signals not only provides the possibility of interference between them indicated by the applicants, but also the potential development of unaccounted effects in relation to other microorganisms, density-dependent communication between which is mediated by structurally similar GSLs.

В этой связи задачей данного изобретения является разработка структурно отличных от гомосеринлактонов соединений, обладающих избирательной и выраженной способностью к регуляции (усилению или ослаблению) опосредуемого ГСЛ коллективного поведения (чувства кворума) у определенного круга биотехнологически полезных, гнилостных и патогенных бактерий.In this regard, the objective of this invention is the development of compounds structurally different from homoserinlactones, which have a selective and pronounced ability to regulate (enhance or weaken) the GSL-mediated collective behavior (quorum feelings) in a certain circle of biotechnologically useful, putrefactive and pathogenic bacteria.

В настоящем изобретении эта задача решается применением соединений на основе 1,3-бензодиоксола общей формулы (1)In the present invention, this problem is solved by the use of compounds based on 1,3-benzodioxol of the general formula (1)

где в общей формуле 1 X означает, но не ограничивается:where in the General formula 1 X means, but is not limited to:

- линейный или разветвленный алкильный (C_nH_2n+1; n=1-12), алкенильный (C_mH_2m-1; n=1-12) или алкинильный (C_mH_2m-3; n=1-12) радикал;- linear or branched alkyl (C _n H _{2n + 1} ; n = 1-12), alkenyl (C _m H _2m-1 ; n = 1-12) or alkynyl (C _m H _2m-3 ; n = 1-12 ) radical;

- произвольным образом замещенный линейный углеводородный (C_nH_2n+1; n=1-12) радикал с включением атомов кислорода (n=1-4) или азота (n=1-4);- an arbitrarily substituted linear hydrocarbon (C _n H _{2n + 1} ; n = 1-12) radical with the inclusion of oxygen atoms (n = 1-4) or nitrogen (n = 1-4);

- фрагмент на основе циклопентана общей формулы Iа- a fragment based on cyclopentane of the general formula Ia

где Z - линейный алкильный (С_nН_2n; n=0-11) радикал;where Z is a linear alkyl (C _n H _2n ; n = 0-11) radical;

- фрагмент на основе циклогексана общей формулы Ib- a fragment based on cyclohexane of the general formula Ib

где Y₁ и Y₂ - линейные алкильные (C_nH_2n; n=0-11) радикалы, a R′₁ и R′₂ - атомы Н, Сl, Br, I или F.where Y ₁ and Y ₂ are linear alkyl (C _n H _2n ; n = 0-11) radicals, and R ′ ₁ and R ′ ₂ are H, Cl, Br, I, or F.

В данном изобретении раскрываются структурные формулы соединений общей формулы 1 и способ их практического применения для регуляции коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий.The present invention discloses the structural formulas of the compounds of general formula 1 and a method for their practical application for regulating collective behavior (“quorum feelings”) in bacteria.

В соответствии с настоящим изобретением регуляторный препарат (композиция) на основе производных 1,3-бензодиоксола содержит по весу от 0.0001 до 100% соединений общей формулы 1, остальное - нейтральные компоненты или вещества, позитивно модифицирующие (повышающие биодоступность, увеличивающие сроки действия и т.д.) свойства данной композиции.In accordance with the present invention, a regulatory preparation (composition) based on 1,3-benzodioxole derivatives contains by weight from 0.0001 to 100% of the compounds of general formula 1, the rest are neutral components or substances that positively modify (increase bioavailability, increase the duration of action, etc.) d.) the properties of this composition.

Наиболее близким известным аналогом изобретения является упомянутый выше патент US 7910622 [7], оговаривающий структуру, синтез и использование регуляторов «чувства кворума» общей формулы 2:The closest known analogue of the invention is the aforementioned patent US 7910622 [7], stipulating the structure, synthesis and use of the regulators of the “quorum feelings" of General formula 2:

По сравнению с соединениями формулы 2 заявляемые соединения общей формулы 1 имеют ряд существенных отличий, отвечающих требованию новизны.Compared with compounds of formula 2, the claimed compounds of general formula 1 have a number of significant differences that meet the requirement of novelty.

Во-первых, в отличие от известных соединений, созданных на основе лактонного кольца и, в этой связи, являющихся близкими структурными аналогами природных авторегуляторных молекул - гомосеринлактонов, заявляемые соединения созданы на основе 1,3-бензодиоксола и, в этой связи, представляют собой структурно неидентичные ГСЛ регуляторные молекулы. Из доступной научной и патентной литературы регуляторы «чувства кворума» на основе 1,3-бензодиоксола не известны.Firstly, in contrast to the known compounds created on the basis of the lactone ring and, in this regard, which are close structural analogues of natural autoregulatory molecules - homoseryl lactones, the claimed compounds are created on the basis of 1,3-benzodioxol and, in this regard, are structurally non-identical GSL regulatory molecules. Of the available scientific and patent literature, the regulators of the “quorum feeling" based on 1,3-benzodioxol are not known.

Во-вторых, благодаря структурным отличиям от природных авторегуляторньгх молекул, проявляющих активность во многих luxI/luxR-подобных системах, заявляемые соединения общей формулы 1 обладают значительно более избирательной (селективной) регуляторной активностью, реализуя ее в отношении cviI/cviR-регулируемой системы биосинтеза виолацеина Chromobacterium violaceum (см. пример 1), а также других биотехнологически полезных, гнилостных и патогенных виолацеин-продуцирующих бактерий. При этом вероятной причиной селективного действия соединений общей формулы 1 в названных системах «чувства кворума» является их избирательное взаимодействие с регуляторным белком CviR и его близкими гомологами, но не другими LuxR-подобными белками. В свою очередь наиболее тонкие механизмы подобной селективности предположительно определяются конформационным соответствием 1,3-бензодиоксола участку регуляторного белка, в естественных условиях ответственного за связывание лактонного кольца в молекуле ГСЛ. Для понимания сути изобретения также необходимо указать, что достигаемая применением соединений общей формулы 1 регуляция чувства кворума включает, но не исчерпывается только воздействием на продукцию виолацеина, т.к. под контролем регуляторного белка CviR находится ряд целевых генов (оперонов), в том числе ответственных за продукцию экзоферментов и образование биопленок. Использование же теста индукции или ингибирования биосинтеза виолацеина в настоящем изобретении определяется простотой и информативностью регистрируемого проявления регуляторной активности соединений общей формулы 1.Secondly, due to structural differences from natural autoregulatory molecules, which are active in many luxI / luxR-like systems, the claimed compounds of general formula 1 have significantly more selective (selective) regulatory activity, realizing it with respect to the cviI / cviR-regulated violacein biosynthesis system Chromobacterium violaceum (see example 1), as well as other biotechnologically useful, putrefactive and pathogenic violacein-producing bacteria. In this case, the probable reason for the selective action of compounds of the general formula 1 in the aforementioned “quorum sense” systems is their selective interaction with the regulatory protein CviR and its close homologs, but not other LuxR-like proteins. In turn, the most subtle mechanisms of this selectivity are presumably determined by the conformational correspondence of 1,3-benzodioxole to the regulatory protein site, which in vivo is responsible for the binding of the lactone ring in the GSL molecule. To understand the essence of the invention, it is also necessary to indicate that the regulation of the quorum feeling achieved by the use of compounds of the general formula 1 includes, but is not limited to, the effect on the production of violacein, as Under the control of the regulatory protein CviR, there are a number of target genes (operons), including those responsible for the production of exoenzymes and the formation of biofilms. The use of the test of induction or inhibition of violacein biosynthesis in the present invention is determined by the simplicity and informativeness of the registered manifestation of the regulatory activity of compounds of the general formula 1.

В-третьих, варьирование структуры радикала X в соединениях общей формулы 1 позволяет обеспечить им выраженную способность к усилению или ослаблению коллективного поведения (чувства кворума) у бактерий. Для соединений, структура радикала которых имеет сходство с аналогичным фрагментом в молекуле естественного сигнала - гомосеринлактона, типичной оказывается стимулирующая регуляторная активность (см. пример 1), а для соединений общей формулы 1 с радикалом X, по своей структуре отклоняющимся от естественного сигнала, напротив, ингибирующая активность (см. пример 2). При этом вероятной причиной альтернативного действия соединений общей формулы 1 с различным по структуре радикалом X является формирование геометрически различных конформаций димера из двух регуляторных белков CviR или их гомологов, предшествующего связыванию с ДНК как условия инициации транскрипции целевых генов. Соответственно, наиболее выраженной стимулирующей регуляторной активностью при этом обладают соединения общей формулы 1, при взаимодействии с белками семейства CviR обеспечивающие их взаимную ориентацию с формированием «правильной» конформации, а ингибирующая активность, напротив, достигается формированием «ошибочной» геометрически измененной и потому неспособной к взаимодействию с ДНК конформации димера из двух CviR-подобных белков.Thirdly, varying the structure of radical X in the compounds of general formula 1 allows them to have a pronounced ability to enhance or weaken collective behavior (quorum feelings) in bacteria. For compounds whose radical structure resembles a similar fragment in the molecule of the natural signal, homoserinlactone, stimulating regulatory activity is typical (see Example 1), and for compounds of general formula 1 with radical X deviating from the natural signal in structure, inhibitory activity (see example 2). In this case, the probable reason for the alternative action of compounds of the general formula 1 with a radical X different in structure is the formation of geometrically different conformations of the dimer from two regulatory CviR proteins or their homologs, which precedes binding to DNA as a condition for the initiation of transcription of target genes. Accordingly, the compounds of the general formula 1 possess the most pronounced stimulating regulatory activity when interacting with CviR family proteins ensuring their mutual orientation with the formation of the “correct” conformation, and the inhibitory activity, on the contrary, is achieved by the formation of an “erroneous” geometrically altered and therefore incapable of interaction with DNA conformation of a dimer of two CviR-like proteins.

Таким образом, результатом действия соединений общей формулы 1 является специфическая регуляция определенной системы «чувства кворума», направленность которой (усиление или ослабление) может целенаправленно изменяться путем введения в структуру действующего вещества различных по строению радикалов X. Сказанное является важным преимуществом указанных производных по сравнению с большинством ранее описанных соединений (например, общей формулы 2), имитирующих эффект природных авторегуляторов - гомосеринлактонов и потому не обладающих высокой специфичностью.Thus, the result of the action of the compounds of general formula 1 is the specific regulation of a certain system of “quorum feelings”, the direction of which (strengthening or weakening) can be purposefully changed by introducing radicals X of different structure into the structure of the active substance. This is an important advantage of these derivatives compared to most of the previously described compounds (for example, general formula 2) that mimic the effect of natural autoregulators - homoseryl lactones and therefore do not possess high specificity.

Защищаемое применение соединений общей формулы 1 подразумевает, в том числе, их использование для управления биотехнологическими процессами, реализуемыми с использованием виолацеин-продуцирующих микроорганизмов (справочно: виолацеин - производное индола, образующееся при окислении триптофана, сине-фиолетовый пигмент с антибактериальной, протистоцидной, противовирусной и другими биотехнологически и фармакологически полезными активностями). В этом случае соединения общей формулы 1 могут вводиться в плотные или жидкие питательные среды в виде растворов, а также применяться в виде чистых веществ или иммобилизованными на различных носителях.The protected use of the compounds of the general formula 1 implies, among other things, their use for controlling biotechnological processes realized using violacein-producing microorganisms (for example: violacein is an indole derivative formed during the tryptophan oxidation, a blue-violet pigment with antibacterial, protistocidal, antiviral and other biotechnological and pharmacologically useful activities). In this case, the compounds of general formula 1 can be introduced into solid or liquid nutrient media in the form of solutions, and also used in the form of pure substances or immobilized on various carriers.

В состав патентуемого изобретения входит также применение соединений общей формулы 1 для регуляции активности других целевых генов (оперонов), в том числе вовлеченных в процессы порчи сельскохозяйственной продукции, а также развитие инфекционных заболеваний растений, животных и человека. С этой целью данные соединения могут вводиться в организм для обеспечения системного эффекта, а также применяться местно для воздействия на определенные области (например, в составе перевязочных материалов для обработки ран, при обработке операционного поля и т.д.). Соединения могут использоваться в виде твердых веществ, растворов или суспензий в воде или других растворителях, а также нанесенными на различные носители. Возможно также использование соединений общей формулы 1 в составе композиций с другими веществами, в том числе позитивно модифицирующими (повышающими биодоступность, увеличивающими сроки действия и т.д.) проявления их биологической активности.The patented invention also includes the use of compounds of general formula 1 for regulating the activity of other target genes (operons), including those involved in the spoilage of agricultural products, as well as the development of infectious diseases of plants, animals and humans. For this purpose, these compounds can be introduced into the body to provide a systemic effect, and also be applied topically to affect certain areas (for example, as part of dressings for treating wounds, when treating an operative field, etc.). The compounds can be used in the form of solids, solutions or suspensions in water or other solvents, as well as applied to various carriers. It is also possible to use compounds of the general formula 1 as part of compositions with other substances, including positively modifying (increasing bioavailability, prolonging the action, etc.) manifestations of their biological activity.

Заявляемое изобретение иллюстрируется, но никак не ограничивается следующими примерами.The invention is illustrated, but not limited to the following examples.

Пример 1. Стимуляция коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий.Example 1. Stimulation of collective behavior ("feelings of quorum") in bacteria.

В качестве регуляторов коллективного поведения бактерий, соответствующих общей формуле 1, были использованы соединения 1а-б.Compounds 1a-b were used as regulators of the collective behavior of bacteria corresponding to general formula 1.

Определение способности данных соединений к регуляции «чувства кворума» проводилось с использованием двух бактериальных тест-систем, в присутствии гексаноил-гомосеринлактона (С₆-ГСЛ), отвечающих синтезом пигмента виолацеина (Chromobacterium violaceum NCTC 13274) или развитием биолюминесценции {Escherichia coli рАЫОЗ). При этом особенностью первого являлась инсерция транспозона Тп5 в ген evil, ответственного за синтез собственного С₆-ГСЛ, с сохранением функционально активного гена cviR и кодируемого им регуляторного белка, ответственного за восприятие автоиндуктора [8 - McClean К.Н., et al. Quorum sensing and Chromobacterium violaceum: exploitation of violacein production and inhibition for the detection of N-acyl homoserine lactones. Microbiology, 1997, V.143, Р.3703-3711]. В свою очередь особенностью второго штамма являлось наличие генетической конструкции IwcR+luxI_luxCDABE, кодирующей рецепторный белок LuxR Vibrio fischeri и в присутствии экзогенно вносимого С₆-ГСЛ или С₆-оксо-ГСЛ отвечающей развитием свечения (биолюминесценции) [9 - Lindsay A., Ahmer В.М. Effect of sdiA on biosensors of N-acylhomoserine lactones. J.Bacteriol, 2005, V187(14), Р.5054-5058].The ability of these compounds to regulate the “quorum feeling” was determined using two bacterial test systems, in the presence of hexanoyl-homoserinlactone (C ₆ -GSL), corresponding to the synthesis of violacein pigment (Chromobacterium violaceum NCTC 13274) or the development of bioluminescence (Escherichia coli pАЗОЗ). When this feature was first insertion of transposon Tn5 into evil gene responsible for synthesis of C ₆ -GSL own, retaining functionally active gene encoded by them and cviR regulatory protein responsible for perception avtoinduktora [8 - McClean KN, et al. Quorum sensing and Chromobacterium violaceum: exploitation of violacein production and inhibition for the detection of N-acyl homoserine lactones. Microbiology, 1997, V.143, P.3703-3711]. In turn, a feature of the second strain was the presence of the genetic construct IwcR + luxI_luxCDABE encoding the receptor protein LuxR Vibrio fischeri and in the presence of exogenously introduced C ₆ -GSL or C ₆ -oxo-GSL corresponding to the development of luminescence (bioluminescence) [9 - Lindsay A., Ahmer V.M. Effect of sdiA on biosensors of N-acylhomoserine lactones. J. Bacteriol, 2005, V187 (14), P. 5054-5058].

Подобное тестирование проводилось на плотных питательных средах (для получения качественного результата с использованием С. violaceum NCTC 13274), а также жидких питательных средах (для получения количественного результата с использованием С. violaceum NCTC 13274 и Е. coli рАL03). В последнем случае характеристикой регуляторного действия служила величина ЕС50 - концентрация исследованных соединений общей формулы 1, вызывающих индукцию «чувства кворума» на 50% от максимально выраженного эффекта в присутствии естественного авторегулятора С₆-ГСЛ.Similar testing was carried out on solid nutrient media (to obtain a qualitative result using C. violaceum NCTC 13274), as well as liquid nutrient media (to obtain a quantitative result using C. violaceum NCTC 13274 and E. coli pAL03). In the latter case, the characteristic of the regulatory action was the EC50 value — the concentration of the studied compounds of the general formula 1, which induce the “quorum feeling” by 50% of the maximum pronounced effect in the presence of the natural C ₆ -GSL autoregulator.

Результаты определения регуляторных эффектов соединений 1а-б на синтез пигмента виолацеина культурой С. violaceum NCTC 13274 при проведении тестирования на плотной питательной среде иллюстрируются Фиг.1, где в центре обозначен естественный авторегулятор С₆-ГСЛ. В обобщенном виде результаты приведены в таблице 1.The results of the determination of the regulatory effects of compounds 1a-b on the synthesis of violacein pigment by C. violaceum NCTC 13274 culture when tested on a solid nutrient medium are illustrated in Fig. 1, where the natural C ₆ -GSL autoregulator is indicated in the center. In a generalized form, the results are shown in table 1.

Из приведенных значений активности видно, что оба использованных микроорганизма интенсивно реагируют кворум-зависимым синтезом виолацеина (С.violaceum NCTC) или развитием биолюминесценции (Е. coli рАL03) в присутствии естественного авторегулятора С₆-ГСЛ. В свою очередь тестируемые соединения общей формулы 1 действуют менее активно, но более специфично, вызывая индукцию синтеза виолацеина, но не развитие биолюминесценции. При этом в основе подобных различий предположительно лежит избирательное сродство соединений la-б к воспринимающему регуляторный сигнал белку CviR при отсутствии такового к LuxR.From the given activity values, it can be seen that both microorganisms used react intensively with quorum-dependent synthesis of violacein (C. violaceum NCTC) or the development of bioluminescence (E. coli pAL03) in the presence of a natural C ₆ -GSL autoregulator. In turn, the tested compounds of general formula 1 act less actively, but more specifically, causing induction of the synthesis of violacein, but not the development of bioluminescence. Moreover, these differences are presumably based on the selective affinity of la-b compounds for the CviR protein that receives the regulatory signal in the absence of one for LuxR.

Таблица 1Table 1 Оценка влияния соединений 1а-б на коллективное поведение («чувство кворума») у бактерий в тестах на С.violaceum NCTC 13274 и Е. coli рАL03Evaluation of the effect of compounds 1a-b on collective behavior (“quorum feeling”) in bacteria in tests for C. violaceum NCTC 13274 and E. coli pAL03 СоединениеCompound Концентрации ЕС50,
характеризующие индукцию «чувства кворума» у бактерийEC50 concentrations,
characterizing the induction of a “quorum feeling” in bacteria   Синтез пигмента виолацеина С.violaceum NCTCSynthesis of C. violaceum NCTC Violacein Pigment Биолюминесценция Escherichia coli рL03Bioluminescence of Escherichia coli pL03 С₆-ГСЛC _6- GSL 0,5 наноМ0.5 nanoM 60 наноМ60 nanoM 1а1a 46,9 мкМ46.9 μM 0 (нет активности)0 (no activity) 1б1b 250 мкМ250 μM 0 (нет активности)0 (no activity)

Положительным результатом подобного использования заявляемого изобретения является возможность избирательной индукции «чувства кворума» определенных видов бактерий, входящих в состав полимикробных ассоциаций.A positive result of this use of the claimed invention is the ability to selectively induce a “quorum feeling” of certain types of bacteria that make up the polymicrobial associations.

Пример 2. Подавление коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий.Example 2. Suppression of collective behavior (“quorum feelings") in bacteria.

В качестве регуляторов коллективного поведения бактерий, соответствующих общей формуле 1, были использованы соединения 1в-е.Compounds 1c-e were used as regulators of the collective behavior of bacteria corresponding to general formula 1.

Определение способности данных соединений к регуляции «чувства кворума» проводилось с использованием штамма Jantinobacterium lividum, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под №В-10136. Данный штамм представляет собой природный изолят, характеризующийся способностью к синтезу пигмента виолацеина под контролем автоиндуктора неидентифицированной природы.The ability of these compounds to regulate “quorum feelings” was determined using the Jantinobacterium lividum strain deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) under No. B-10136. This strain is a natural isolate, characterized by the ability to synthesize violacein pigment under the control of an auto-inductor of an unidentified nature.

При проведении тестирования J. lividum В-10136 выращивался на жидких питательных средах в отсутствие (контроль) и в присутствии соединений 1в-е (опыт), использованных в диапазоне концентраций от 2 до 1000 мкМ. Характеристикой регуляторного действия служила величина ЕС50 - концентрация исследованных соединений общей формулы 1, вызывающих подавление продукции виолацеина на 50% от максимально выраженного эффекта в контроле.During testing, J. lividum B-10136 was grown on liquid nutrient media in the absence (control) and in the presence of compounds 1b-e (experiment) used in the concentration range from 2 to 1000 μM. A characteristic of the regulatory action was the EC50 value - the concentration of the studied compounds of the general formula 1, which suppress the production of violacein by 50% of the maximum pronounced effect in the control.

Результаты определения регуляторных эффектов соединений 1в-е на синтез пигмента виолацеина культурой J. lividum В-10136 при проведении тестирования на жидкой питательной среде иллюстрируются фиг.2, где справа обозначены действующие концентрации соединений общей формулы 1 в среде культивирования; К - контроль. В обобщенном виде результаты приведены в таблице 2.The results of determining the regulatory effects of compounds 1c-e on the synthesis of violacein pigment by J. lividum B-10136 culture when tested on a liquid nutrient medium are illustrated in FIG. 2, where the active concentrations of the compounds of general formula 1 in the cultivation medium are indicated on the right; To - control. In a generalized form, the results are shown in table 2.

Таблица 2table 2 Оценка влияния соединений 1в-е на коллективное поведение («чувство кворума») у бактерий в тесте на J. lividum В-10136Evaluation of the effect of compounds 1b-e on collective behavior (“quorum feeling”) in bacteria in the test for J. lividum B-10136 СоединениеCompound Концентрации ЕС50, характеризующие подавление «чувства кворума» у бактерийEC50 concentrations characterizing the suppression of the “quorum feeling” in bacteria 1в1c 175 мкМ175 μm 1 г1 g 112,5 мкМ112.5 μM 1д1d 87,5 мкМ87.5 μM 1е1st 100 мкМ100 μM

Из приведенных значений активности видно, что все четыре тестированных соединения общей формулы 1 подавляют продукцию виолацеина, что характеризует их как игибиторы коллективного поведения («чувства кворума») J. lividum В-10136. При этом наиболее активным в данном тесте являлось соединение 1д, характеризуемое величиной ЕС50=87,5 мкМ.From the given activity values it is seen that all four tested compounds of the general formula 1 suppress violacein production, which characterizes them as inhibitors of collective behavior (“quorum feelings”) J. lividum B-10136. In this case, compound 1e was the most active in this test, characterized by an EC50 value of 87.5 μM.

Положительным результатом подобного использования заявляемого изобретения является возможность подавления «чувства кворума» определенных видов бактерий, для предупреждения вызываемой ими порчи продукции.A positive result of this use of the claimed invention is the possibility of suppressing the "quorum" of certain types of bacteria to prevent product damage caused by them.

Способность соединений общей формулы 1 к подавлению коллективного поведения у бактерий также может быть использована при лечении и профилактике инфекционных заболеваний растений, животных и человека, в том числе вызываемых виолацеин-продуцирующими микроорганизмами видов С.violaceum и J. lividum.The ability of the compounds of general formula 1 to suppress collective behavior in bacteria can also be used in the treatment and prevention of infectious diseases of plants, animals, and humans, including those caused by violacein-producing microorganisms of the species C. violaceum and J. lividum.

Claims (1)

1 Применение производных 1,3-бензодиоксола общей формулы 1 в качестве регуляторов коллективного поведения (чувства кворума) у бактерий:

где в общей формуле 1 Х означает:
- линейный алкильный (С₅Н₁₁) радикал;
- линейный бутоксипропиламиновый (C₇H₁₆NO) радикал;
- фрагмент на основе циклопентана общей формулы Iа

где Y - алкильный (C_nH_2n; n=0 или 1) радикал;
- фрагмент на основе циклогексана общей формулы Ib

где Z - алкильный (С_nН_2n; n=0 или 2) радикал. 1 The use of 1,3-benzodioxole derivatives of the general formula 1 as regulators of collective behavior (quorum feelings) in bacteria:

where in the General formula 1 X means:
- linear alkyl (C ₅ H ₁₁ ) radical;
- linear butoxypropylamine (C ₇ H ₁₆ NO) radical;
- a fragment based on cyclopentane of the general formula Ia

where Y is an alkyl (C _n H _2n ; n = 0 or 1) radical;
- a fragment based on cyclohexane of the general formula Ib

where Z is an alkyl (C _n H _2n ; n = 0 or 2) radical.

Images