RU2509805C2 - METHOD OF OBTAINING RECOMBINANT ANTIGEN G2 OF DOBRAVA HANTAVIRUS IN E.coli CELLS - Google Patents
METHOD OF OBTAINING RECOMBINANT ANTIGEN G2 OF DOBRAVA HANTAVIRUS IN E.coli CELLS Download PDFInfo
- Publication number
- RU2509805C2 RU2509805C2 RU2012114473/10A RU2012114473A RU2509805C2 RU 2509805 C2 RU2509805 C2 RU 2509805C2 RU 2012114473/10 A RU2012114473/10 A RU 2012114473/10A RU 2012114473 A RU2012114473 A RU 2012114473A RU 2509805 C2 RU2509805 C2 RU 2509805C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- occupied
- dobrava
- hantavirus
- cells
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретение: Изобретение относится к области биотехнологии, в частности, к получению рекомбинантного антигена G2 хантавирусов с характеристиками, позволяющими улучшить воспроизводимость и чувствительность иммуноферментного анализа при диагностике ГЛПС.The technical field to which the invention relates: The invention relates to the field of biotechnology, in particular, to the production of recombinant hantavirus G2 antigen with characteristics that improve the reproducibility and sensitivity of enzyme-linked immunosorbent assay in the diagnosis of HFRS.
Уровень техники: геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) - вирусный нетрансмиссивный зооноз, занимает в России ведущее место по числу заболевших среди природно-очаговых инфекций.BACKGROUND OF THE INVENTION Hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS), a non-transmissible viral zoonosis, occupies a leading place in Russia in the number of cases among natural focal infections.
Наиболее эффективным методом борьбы с ГЛПС является специфическая профилактика, то есть вакцинация населения эндемичных регионов [1-3]. В настоящее время коммерческие вакцины против ГЛПС производятся только в Китае, однако ни одна из этих вакцин не может применяться в европейских регионах России, так как не обеспечивает защиты от вирусов Пуумала и Добрава - возбудителей ГЛПС в этих регионах [4-7].The most effective method of fighting HFRS is specific prophylaxis, that is, vaccination of the population of endemic regions [1-3]. Currently, commercial HFRS vaccines are produced only in China, however, none of these vaccines can be used in European regions of Russia, since it does not provide protection against the Puumala and Dobrava viruses, the causative agents of HFRS in these regions [4-7].
Для изготовления и контроля вакцины против вирусов Пуумала и Добрава необходимо решить проблему разработки эффективных серологических методов на основе белков внешней оболочки - энвелопа хантавирусов. Однако до настоящего времени задача получения полноразмерных коммерческих препаратов белков энвелопа G1 и G2 хантавирусов не решена нигде в мире, что обусловлено их токсичностью по отношению к бактериальным клеткам.To manufacture and control the vaccine against the viruses of Puumala and Dobrava, it is necessary to solve the problem of developing effective serological methods based on proteins of the outer shell - the envelop of hantaviruses. However, to date, the task of obtaining full-sized commercial preparations of the envelope proteins G1 and G2 of hantaviruses has not been solved anywhere in the world, due to their toxicity to bacterial cells.
Недавно был получен рекомбинантный антиген НТ-Δ12, представляющий собой фрагмент белка G2 хантавируса Добрава, сохраняющий иммуногенность полноразмерного продукта, но не проявляющий токсичности по отношению к клеткам продуцента (пат. заявка RU №2010141819 от 13.10.2010). При этом данный белок накапливался в клетках E.coli в виде телец включения [8-10]. Вследствие этого, при использовании антигена НТ-Δ12 в иммунологических тестах, необходимо проводить предварительную ренатурацию продукта, что в свою очередь негативно сказывается на чувствительности и воспроизводимости иммунологического теста.Recently, a recombinant NT-Δ12 antigen was obtained, which is a fragment of the Dobrava hantavirus G2 protein that preserves the immunogenicity of a full-sized product, but does not show toxicity to producer cells (US Patent Application RU No. 201041819 from 13.10.2010). Moreover, this protein accumulated in E. coli cells in the form of inclusion bodies [8-10]. As a result, when using the NT-Δ12 antigen in immunological tests, it is necessary to conduct preliminary renaturation of the product, which in turn negatively affects the sensitivity and reproducibility of the immunological test.
Целью нашей работы является разработка способа повышения качественных характеристик антигена НТ-Δ12 за счет изменения его структуры.The aim of our work is to develop a method for improving the qualitative characteristics of the NT-Δ12 antigen by changing its structure.
Раскрытие изобретения: сущностью изобретения является способ повышения качественных характеристик рекомбинантного антигена G2 (НТ-Δ12) для его использования в иммунологических тестах при диагностике ГЛПС благодаря улучшению растворимости целевого белка-антигена G2 хантавируса Добрава за счет стабилизации его глобулярной структуры бета-структурным мини-доменом фолдона фибритина колифага JS98C3. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения белка-антигена G2 хантавируса Добрава с заданными качественными характеристиками (белок GHF) для повышения воспроизводимости и чувствительности иммуноферментного анализа при диагностике ГЛПС. Способ предусматривает следующие стадии:SUMMARY OF THE INVENTION: The invention is a method for improving the qualitative characteristics of the recombinant G2 antigen (HT-Δ12) for use in immunological tests for the diagnosis of HFRS by improving the solubility of the target G2 antigen of the hantavirus Dobrava by stabilizing its globular structure with a fold-structure mini-domain of foldon coliphage fibritin JS98C3. Thus, the present invention relates to a method for producing Dobrava hantavirus G2 protein antigen with desired qualitative characteristics (GHF protein) to increase the reproducibility and sensitivity of enzyme-linked immunosorbent assay in the diagnosis of HFRS. The method comprises the following steps:
1) получение плазмидной конструкции pGHF, несущей трифункциональный слитой ген;1) obtaining a plasmid construct pGHF carrying a trifunctional fusion gene;
2) экспрессия и анализ выхода белка GHF;2) expression and analysis of the yield of GHF protein;
3) хроматография белка GHF на колонке Sepharose 6 FF;3) GHF protein chromatography on a Sepharose 6 FF column;
4) проведение иммунохимических тестов.4) conducting immunochemical tests.
Краткое описание графических изображений:Brief description of graphic images:
Фиг.1. Плазмидная конструкция pGHF принципиальная схема.Figure 1. Plasmid construction pGHF concept.
Фиг.2. Последовательность трифункционального слитого гена, кодирующего производное пептида НТ, в составе конструкции pGHF.Figure 2. The sequence of the trifunctional fusion gene encoding a derivative of the HT peptide in the pGHF construct.
- Последовательность гена GFP подчеркнута волнистой линией;- The sequence of the GFP gene is underlined by a wavy line;
- Последовательность гена пептида НТ из состава кДНК вируса Добрава закрашена серым;- The sequence of the HT peptide gene from the cDNA of the Dobrava virus is grayed out;
- Последовательность гена фолдона фибритина подчеркнута пунктиром;- The sequence of the gene for foldon fibritin is underlined by a dotted line;
Фиг.3. Электрофоретический анализ продуктов экспрессии конструкции pGHF в растворимой (1) и нерастворимой (2) фракции лизата клеток Е.coli JM109, затрансформированных конструкцией pGHF. Белки разделены в денатурирующем 15% ПААГ. На рисунке (а) показан общий белок (гель окрашен Coomassie Blue R-250), на рисунке (б) представлено свечение белка в геле под УФ-излучением.Figure 3. Electrophoretic analysis of the expression products of the pGHF construct in the soluble (1) and insoluble (2) fractions of the E. coli JM109 cell lysate transformed with the pGHF construct. Proteins are separated in denaturing 15% PAGE. Figure (a) shows the total protein (the gel is painted with Coomassie Blue R-250), figure (b) shows the luminescence of the protein in the gel under UV radiation.
Фиг.4. Хроматография белка GHF на колонке Sepharose 6 FF. Оптическая плотность при λ=280 нм представлена на графике (1).Figure 4. Chromatography of a GHF protein on a Sepharose 6 FF column. The optical density at λ = 280 nm is shown in the graph (1).
Пунктирными линиями обозначен диапазон фракций, содержащих белок GHF (В1-В8).Dotted lines indicate the range of fractions containing the GHF protein (B1-B8).
Фиг.5. Изучение антигенной активности белка GHF методом твердофазного иммуноферментного анализа. Планшеты активированы белками-антигенами GHF (а) и НК6 (б). Пулы сывороток крови больных ГЛПС (вирусы Добрава, Пуумала, Хантаан) и здоровых доноров использовали в разведении от 50 до 3200 раз с шагом 2 раза. На оси ординат указана величина А450 каждой точки за вычетом фона (контроль без добавления сыворотки человека). На графиках представлены реакции белков-антигенов с сыворотками крови больных ГЛПС (1) и с сыворотками крови здоровых доноров (2).Figure 5. The study of the antigenic activity of the GHF protein by enzyme-linked immunosorbent assay. Plates are activated by GHF (a) and HK6 (b) antigen proteins. The blood serum pools of patients with HFRS (Dobrava, Puumala, Khantaan viruses) and healthy donors were used in dilution from 50 to 3200 times in 2-step increments. On the ordinate axis, A 450 is indicated for each point minus the background (control without adding human serum). The graphs show the reactions of antigen proteins with the blood serum of patients with HFRS (1) and with the blood serum of healthy donors (2).
Осуществление изобретения:The implementation of the invention:
Методология исследования:Research Methodology:
1) получение конструкции pGHF,1) obtaining the pGHF construct,
2) экспрессия и анализ выхода белка GHF,2) expression and analysis of the yield of GHF protein,
3) хроматография белка GHF,3) GHF protein chromatography,
4) проведение иммунохимических тестов.4) conducting immunochemical tests.
1) Получение конструкции1) Obtaining the design
Получение конструкции проводили по следующей схеме:The construction was carried out according to the following scheme:
В ранее описанную конструкцию рЕТ-НТ-Δ12 (пат. заявка RU №2010141819 от 13.10.2010), несущую ген пептида НТ, клонировали ген фолдона фибритина из конструкции pET-cd-32a [11]. При этом и векторную конструкцию рЕТ-НТ-Δ12 расщепляли по сайтам SpeI и, XhoI, а вставку из конструкции pET-cd-32a извлекали рестрикцией по сайтам XbaI и XhoI.The pET-HT-Δ12 construct previously described (Pat. Application RU No. 201041819 dated October 13, 2010) carrying the HT peptide gene cloned the fibritin fold gene from the pET-cd-32a construct [11]. In this case, the pET-HT-Δ12 vector construct was also digested at the SpeI and, XhoI sites, and the insert from the pET-cd-32a construct was extracted by restriction at the XbaI and XhoI sites.
Далее в уникальный сайт XbaI полученной конструкции на базе вектора рЕТ23а вводили синтетический ДНК-дуплекс, составленный из заранее фосфорилированных олигонуклеотидов:Next, a synthetic DNA duplex composed of pre-phosphorylated oligonucleotides was introduced into the unique XbaI site of the obtained construct based on the pET23a vector:
5' CTAGCGGGGGCGCCGGAGGA 3',5 'CTAGCGGGGGCGCCGGAGGA 3',
5' CTAGTCCTCCGGCGCCCCCG 3'.5 'CTAGTCCTCCGGCGCCCCCG 3'.
Далее полученную конструкцию на основе рЕТ23а использовали в качестве матрицы для ПЦР с уникальным праймеромNext, the resulting design based on pET23a was used as a template for PCR with a unique primer
5' ggagatctGCTAGCGGGGGCGCCGGAGGAATTAATTCgag 3'5 'ggagatctGCTAGCGGGGGCCCCGGAGAGATTAATTCgag 3'
и со стандартным праймером T7terminator.and with the standard T7terminator primer.
Полученный продукт ПЦР длиной 600 п.н. расщепляли рестриктазами BglII и XholI и клонировали в вектор pGem3z, расщепленный по сайтам BamHI и SalI.The resulting PCR product with a length of 600 bp digested with restriction enzymes BglII and XholI and cloned into the pGem3z vector digested at the BamHI and SalI sites.
Вставку «НТ+ фолдон фибритина» из конструкции pGem3z извлекали рестрикцией по сайтам SacI и PstI и клонировали в экспрессионный вектор pQE30-GFP, содержащий ген зеленого флуоресцентного белка GFP на базе вектора pQE30 (Qiagen) [12] по тем же сайтам.The NT + foldon fibritin insert from the pGem3z construct was extracted by restriction at the SacI and PstI sites and cloned into the pQE30-GFP expression vector containing the green fluorescent protein GFP gene based on the pQE30 vector (Qiagen) [12] at the same sites.
В составе конструкции (фиг.1 и 2) можно выделить следующие элементы:In the structure of the structure (figures 1 and 2), the following elements can be distinguished:
- экспрессионный вектор pQE30 (Qiagen);- expression vector pQE30 (Qiagen);
- ген зеленого флуоресцентного белка GFP (Evrogen);- gene of green fluorescent protein GFP (Evrogen);
- фрагмент полилинкера вектора pGem-3z (Promega);- fragment polylinker vector pGem-3z (Promega);
- ген Ht из конструкции рЕТ-НТ-12;- Ht gene from the construction of pET-NT-12;
- фрагмент полилинкера вектора pGem-3z (Promega);- fragment polylinker vector pGem-3z (Promega);
- ген фолдона фибритина фага JS98C3 [11].- gene of foldon fibritin of phage JS98C3 [11].
2) Экспрессия и анализ выхода белка2) Expression and analysis of protein yield
Конструкцию pGHF вводили в клетки штамма Е.coli JM109. Селекцию колоний осуществляли по двум параметрам: по ампицилиноустойчивости и по наличию зеленой флуоресцентной окраски колоний. Полученный продуцент культивировали при 30°С в жидкой среде (0,5% дрожжевой экстракт, 1% пептон, 0,5% NaCl) с добавлением 100 мкг/мл ампициллина в колбах Эрленмейера объемом 750 мл (30 мл среды на колбу) в течение 14-18 часов. Посевной материал представлял собой смыв культуры клеток с чашек с агаризованной средой (0,5% дрожжевой экстракт, 1% пептон, 1,5% агар, 0,5% NaCl), полученных высевом первичных трансформантов. Возраст трансформантов - около 40 часов с момента окончания трансформации, температура культивирования - 30°С. Доза засева - 5×108 клеток на колбу. Индукцию промотора в клетках продуцента проводили IPTG.The pGHF construct was introduced into the cells of E. coli strain JM109. Colony selection was carried out according to two parameters: ampicillin resistance and the presence of green fluorescence colony coloration. The resulting producer was cultured at 30 ° C in a liquid medium (0.5% yeast extract, 1% peptone, 0.5% NaCl) with the addition of 100 μg / ml ampicillin in 750 ml Erlenmeyer flasks (30 ml of medium per flask) for 14-18 hours. The seed was a flush of cell culture from plates with agar medium (0.5% yeast extract, 1% peptone, 1.5% agar, 0.5% NaCl) obtained by plating the primary transformants. The age of the transformants is about 40 hours from the end of the transformation, the cultivation temperature is 30 ° C. Seeding dose is 5 × 10 8 cells per flask. Induction of the promoter in producer cells was carried out by IPTG.
Оценку накопления целевого продукта в клетках Е.coli осуществляли с помощью электрофоретического анализа суммарных белков рекомбинантного продуцента по Лэммли. Для этого из грубого клеточного лизата каждой культуры отбирали по 100 мкл. Лизат подвергали центрифугированию при 14000 G. в течение 15 мин и разделяли растворимую и нерастворимую клеточную фракции. Белки солюбилизировали в 30 мкл буфере Лэммли и анализировали состав белков с помощью денатурирующего SDS-электрофореза в 15% ПААГ (фиг.3). Флуоресцентное свечение белков растворимой фракции в геле наблюдали в районе 47 кДа, что соответствует расчетной массе белка GHF. Белки нерастворимой фракции флуоресцентного свечения не имели.The accumulation of the target product in E. coli cells was assessed using electrophoretic analysis of the total proteins of the recombinant producer according to Laemmli. For this, 100 μl were taken from the gross cell lysate of each culture. The lysate was centrifuged at 14,000 g for 15 minutes and the soluble and insoluble cell fractions were separated. Proteins were solubilized in 30 μl Laemmli buffer and the protein composition was analyzed by denaturing SDS electrophoresis in 15% SDS page (Fig. 3). Fluorescent luminescence of soluble fraction proteins in the gel was observed in the region of 47 kDa, which corresponds to the calculated mass of the GHF protein. Proteins of insoluble fraction of a fluorescent luminescence did not have.
3) Хроматография белка3) Protein chromatography
Грубый клеточный лизат культуры JM109 (GHF) подвергали центрифугированию при 8000 G. в течение 1 часа и разделяли растворимую и нерастворимую клеточную фракции. Белок из растворимой фракции подвергали первоначальной очистке путем двойного высаливания сульфатом аммония. Первый осадок, полученный путем осаждения 1,2% раствором (NH)4SO2, удаляли из фракции, последующий второй осадок (после осаждения 2% раствором (NH)4SO2), содержащий целевой белок GHF, собирали центрифугированием при 8000 G в течение 1 часа. Осадок суспендировали в 8 мл буфера (10 мМ Tris-HCl, 130 мМ NaCl, pH=7,8).The coarse cell lysate of the JM109 culture (GHF) was centrifuged at 8000 G. for 1 hour and the soluble and insoluble cell fractions were separated. Protein from the soluble fraction was subjected to initial purification by double salting out with ammonium sulfate. The first precipitate obtained by precipitation with a 1.2% solution of (NH) 4 SO 2 was removed from the fraction, the second precipitate (after precipitation with a 2% solution of (NH) 4 SO 2 ) containing the target GHF protein was collected by centrifugation at 8000 G in within 1 hour. The precipitate was suspended in 8 ml of buffer (10 mm Tris-HCl, 130 mm NaCl, pH = 7.8).
Основной целью хроматографии белка - производного пептида НТ в денатурирующих условиях являлось удаление примесей нуклеиновых кислот, формирующих коллоид с участием белков и препятствующих эффективному применению других методов хроматографии. При этом удаление из препарата примесей клеточных белков Е.coli рассматривалась лишь как побочная задача.The main goal of chromatography of a protein - a derivative of the NT peptide under denaturing conditions was to remove impurities of nucleic acids that form a colloid with the participation of proteins and impede the effective use of other chromatography methods. Moreover, the removal of impurities of E. coli cell proteins from the preparation was considered only as a side task.
Полученный раствор белка GHF в объеме 15 мл наносили на колонку Sepharos 6 FF (GE Healthcare, США, высота 24 см, объем 48 мл), уравновешенную буфером А. Элюцию проводили линейным градиентом NaCl от 0 до 0,5 М в хроматографическом буфере В (Tris-HCl, 100 мМ) со скоростью 8 мл/мин (фиг.4).The resulting solution of GHF protein in a volume of 15 ml was applied onto a
Фракции для дальнейшей работы, содержащие целевой белок GHF, отбирали, оценивая присутствие флюоресцентной зеленой окраски в растворе. Отобранные фракции по 10 мл объемом каждая объединяли и подвергали концентрированию и очистке на HisLink Protein Purification Resin (Promega). Материал фракций белка GHF, полученный в результате, оказался иммунохимически чистым и электрофоретически гомогенным, что позволило непосредственно использовать его для проведения иммунохимических тестов.Fractions for further work containing the target GHF protein were selected by evaluating the presence of a fluorescent green color in the solution. Selected fractions of 10 ml each were combined and concentrated and purified on HisLink Protein Purification Resin (Promega). The material of the fractions of the GHF protein obtained as a result turned out to be immunochemically pure and electrophoretically homogeneous, which made it possible to directly use it for immunochemical tests.
4) Проведение иммунохимических тестов4) Conducting immunochemical tests
В качестве формата проведения анализа был выбран вариант тИФА с непосредственной сорбцией рекомбинантного белка-антигена GHF на поверхность иммунологического планшета. Препаратом для сравнения служил белок-антиген НК6. В процессе сорбции белковые препараты GHF и НК6 разводили в 20-50 раз карбонат-бикарбонатным буфером (КГБ), доводя концентрацию общего белка в растворе до 10 мкг/мл. Полученный раствор вносили в иммунологические планшеты на 1 сутки, после чего проводили блокирование неспецифического связывания на подложке с помощью 1% БСА в буфере КГБ. На следующей стадии проведения анализа проводилось серийное титрование пулов сывороток крови больных ГЛПС и, в качестве сравнения, здоровых доноров. При этом пул сывороток крови включал больных ГЛПС, инфицированных вирусом Добрава, Пуумала и Хаантан. Сыворотки крови брали в разведении от 50 до 3200 раз с шагом 2 раза. В качестве контрольного образца использовали лунки планшета, в которые вместо разведенной сыворотки человека вносили буфер PBS («конъюгатный контроль»).As the format of the analysis, a variant of ELISA was selected with direct sorption of the recombinant protein-antigen GHF on the surface of the immunological tablet. The drug for comparison was the HK6 protein antigen. During sorption, the protein preparations GHF and NK6 were diluted 20-50 times with carbonate-bicarbonate buffer (KGB), bringing the concentration of total protein in solution to 10 μg / ml. The resulting solution was introduced into immunological plates for 1 day, after which blocking of non-specific binding on the substrate was carried out using 1% BSA in KGB buffer. At the next stage of the analysis, serial titration of blood serum pools of patients with HFRS and, as a comparison, healthy donors was performed. In this case, the pool of blood serum included HFRS patients infected with the Dobrava, Puumala and Haantan viruses. Blood serum was taken at a dilution of 50 to 3200 times in increments of 2 times. As a control sample, plate wells were used in which PBS buffer (“conjugate control”) was added instead of diluted human serum.
В заключение все лунки планшета обрабатывали антивидовым конюгатом против IgG человека, меченным пероксидазой, и субстратом ТМВ в присутствии пероксида водорода. Сигнал мерили на планшетном сканере-спектрофотометре при λ=450 нм. Результаты определений представлены на фиг.5.In conclusion, all wells of the plate were treated with anti-human IgG conjugate labeled with peroxidase and TMB substrate in the presence of hydrogen peroxide. The signal was measured on a flatbed spectrophotometer scanner at λ = 450 nm. The results of the determination are presented in figure 5.
Полученные результаты доказывают, что повышение растворимости рекомбинантного антигена за счет изменения его структуры приводит к увеличению разрешающей способности иммунологического анализа для диагностики ГЛПС.The obtained results prove that an increase in the solubility of the recombinant antigen due to a change in its structure leads to an increase in the resolution of the immunological analysis for the diagnosis of HFRS.
Список использованных источниковList of sources used
1. Maes P., Clement J., Van Ranst M. Recent approaches in hantavirus vaccine development. - Expert Rev Vaccines. - 2009 - V.8, №1, P.67-76.1. Maes P., Clement J., Van Ranst M. Recent approaches in hantavirus vaccine development. - Expert Rev Vaccines. - 2009 - V.8, No. 1, P.67-76.
2. Cho H.W., Howard C.R., Lee H.W. Review of an inactivated vaccine against hantaviruses. - Intervirology. - 2002 - V.45, №4-6, P.328-333.2. Cho H.W., Howard C.R., Lee H.W. Review of an inactivated vaccine against hantaviruses. - Intervirology. - 2002 - V.45, No. 4-6, P.328-333.
3. Song G. Epidemiological progresses of hemorrhagic fever with renal syndrome in China. - Chin Med J (Engl). - 1999 - V.112, №5, P.472-477.3. Song G. Epidemiological progresses of hemorrhagic fever with renal syndrome in China. - Chin Med J (Engl). - 1999 - V.112, No. 5, P.472-477.
4. Oya A. Japanese encephalitis vaccine. - Acta Paediatr Jpn. - 1988 - V.30, №2, Р.175-184.4. Oya A. Japanese encephalitis vaccine. - Acta Paediatr Jpn. - 1988 - V.30, No. 2, P.175-184.
5. Choi Y. Ahn C.J., Seong K.M., Jung M.Y., Ahn B.Y. Inactivated Hantaan virus vaccine derived from suspension culture of Vero cells. - Vaccine. - 2003 - V.21, №17-18, P.1867-1873.5. Choi Y. Ahn C.J., Seong K.M., Jung M.Y., Ahn B.Y. Inactivated Hantaan virus vaccine derived from suspension culture of Vero cells. - Vaccine. - 2003 - V.21, No. 17-18, P.1867-1873.
6. Lee H.W., Chu Y. K., Woo Y.D. Immune responses after two or three doses of Hantavax vaccination against Hantaan virus // Proc. fifth international conference on hemorrhagic fever with renal syndrome, hantavirus pulmonary syndrome and hantaviruses. Lion, Franch - 2001. - P.234-242.6. Lee H.W., Chu Y. K., Woo Y.D. Immune responses after two or three doses of Hantavax vaccination against Hantaan virus // Proc. fifth international conference on hemorrhagic fever with renal syndrome, hantavirus pulmonary syndrome and hantaviruses. Lion, Franch - 2001 .-- P.234-242.
7. Ruan Y., Xu X., Liu W„ Deng X, Weng S, Zhou W, Wang Q, Chen L, Fang L, Xu Z, Yan Q, Liu W, Dong G, Gu H, Yu Y, Xu Z. A study on immunogenicity and safety of bivalent inactivated vaccine against hemorrhagic fever with renal syndrome. - Zhonghua Yu Fang Yi Xue Za Zhi. - 1999 - V.33, №6, P.340-342.7. Ruan Y., Xu X., Liu W „Deng X, Weng S, Zhou W, Wang Q, Chen L, Fang L, Xu Z, Yan Q, Liu W, Dong G, Gu H, Yu Y, Xu Z. A study on immunogenicity and safety of bivalent inactivated vaccine against hemorrhagic fever with renal syndrome. - Zhonghua Yu Fang Yi Xue Za Zhi. - 1999 - V.33, No. 6, P.340-342.
8. Hooper J.W., Kamrud K.I., Elgh F., Custer D., Schmaljohn C.S. DNA vaccination with hantavirus M segment elicits neutralizing antibodies and protects against seoul virus infection. - Virology. - 1999 - V.255, №2, P.269-278.8. Hooper J.W., Kamrud K.I., Elgh F., Custer D., Schmaljohn C.S. DNA vaccination with hantavirus M segment elicits neutralizing antibodies and protects against seoul virus infection. - Virology. - 1999 - V.255, No. 2, P.269-278.
9. Kallio-Kokko H., Leveelahti R., Brummer-Korvenkontio M., Lundkvist A., Vaheri A., Vapalahti O. Human immune response to Puumala virus glycoproteins and nucleocapsid protein expressed in mammalian cells. - J Med Virol. - 2001 - V.65, №3, P.605-6139. Kallio-Kokko H., Leveelahti R., Brummer-Korvenkontio M., Lundkvist A., Vaheri A., Vapalahti O. Human immune response to Puumala virus glycoproteins and nucleocapsid protein expressed in mammalian cells. - J Med Virol. - 2001 - V.65, No. 3, P.605-613
10. Huang H., Li X., Zehua Z. Genetic immunization with Hantavirus vaccine combining expression of G2 glycoprotein and fused interleukin-2. - Genetic Vaccines and Therapy. - 2008 - V.6. - P.15-21.10. Huang H., Li X., Zehua Z. Genetic immunization with Hantavirus vaccine combining expression of G2 glycoprotein and fused interleukin-2. - Genetic Vaccines and Therapy. - 2008 - V.6. - P.15-21.
11. Латыпов О.Р., Голомидова А.К., Летаров А.В. Характеристика продукта гена wac бактериофага JS98C3, близкородственного фагу JS98 // Вестник КГУ. 2007. Т.149. С.112-122.11. Latypov O.R., Golomidova A.K., Letarov A.V. Product characterization of the wac gene of the bacteriophage JS98C3, closely related to the phage JS98 // Bulletin of KSU. 2007.V. 149. S.112-122.
12. Шевелев А.Б., Хоменков В.Г., Кузнецова Т.В., Ковалев Л.И., Лагодная Н.В. Создание продуцента миостатина в виде слитого белка с 6His-GFP на основе Е.coli и изучение его иммуногенности. Сборник статей «Медико-биологические технологии повышения работоспособности в условиях напряженных физических нагрузок». Министерство образования и науки Российской Федерации, Москва, 2004, С.140-150.12. Shevelev A.B., Khomenkov V.G., Kuznetsova T.V., Kovalev L.I., Lagodnaya N.V. Creation of myostatin producer in the form of a fusion protein with 6His-GFP based on E. coli and study of its immunogenicity. Collection of articles "Biomedical technologies to improve performance in conditions of intense physical exertion." Ministry of Education and Science of the Russian Federation, Moscow, 2004, S.140-150.
Фиг. 2FIG. 2
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012114473/10A RU2509805C2 (en) | 2012-04-12 | 2012-04-12 | METHOD OF OBTAINING RECOMBINANT ANTIGEN G2 OF DOBRAVA HANTAVIRUS IN E.coli CELLS |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012114473/10A RU2509805C2 (en) | 2012-04-12 | 2012-04-12 | METHOD OF OBTAINING RECOMBINANT ANTIGEN G2 OF DOBRAVA HANTAVIRUS IN E.coli CELLS |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012114473A RU2012114473A (en) | 2013-10-20 |
| RU2509805C2 true RU2509805C2 (en) | 2014-03-20 |
Family
ID=49356957
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012114473/10A RU2509805C2 (en) | 2012-04-12 | 2012-04-12 | METHOD OF OBTAINING RECOMBINANT ANTIGEN G2 OF DOBRAVA HANTAVIRUS IN E.coli CELLS |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2509805C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2807520C1 (en) * | 2023-03-21 | 2023-11-15 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | RECOMBINANT PLASMID pET21-GST-CD WHICH ENSURES THE SYNTHESIS AND SECRETION OF Gc ECTODOMAIN OF HANTAAN VIRUS GLYCOPROTEIN, AND THE RECOMBINANT ESCHERICHIA COLI STRAIN BL21(DE3)pLysE pET21-GST-CD, A PRODUCER OF THE Gc PROTEIN, THE ECTODOMAIN OF HANTAAN VIRUS GLYCOPROTEIN |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100204120A1 (en) * | 2009-02-09 | 2010-08-12 | Shibo Jiang | Trimeric hiv fusion inhibitors for treating or preventing hiv infection |
| RU2445117C2 (en) * | 2009-12-30 | 2012-03-20 | Евгений Александрович Ткаченко | Method for preparing combined bivalent, tissue-culture, inactivated, concentrated, purified vaccine for preventing hemorrhagic fever and renal syndrome |
-
2012
- 2012-04-12 RU RU2012114473/10A patent/RU2509805C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100204120A1 (en) * | 2009-02-09 | 2010-08-12 | Shibo Jiang | Trimeric hiv fusion inhibitors for treating or preventing hiv infection |
| RU2445117C2 (en) * | 2009-12-30 | 2012-03-20 | Евгений Александрович Ткаченко | Method for preparing combined bivalent, tissue-culture, inactivated, concentrated, purified vaccine for preventing hemorrhagic fever and renal syndrome |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| ENGEL J et al., What are oligomerization domains good for, Matrix Biol., 2000 Aug, Vol.19, No.4, p.p.283-8. * |
| LUDMILLA SISSOEFF et al., Stable trimerization of recombinant rabies virus glycoprotein ectodomain is required for interaction with the p75NTR receptor, Journal of General Virology, 2005, Vol.86, p.p.2543-2552. * |
| ЛАТЫПОВ О.Р. Характеристика новых бета-пропеллерных белковых доменов, гомологичных фолдону фибритина бактериофага Т4: автореферат диссертации по ВАК 03.00.04. Казань, 2008, 84 с. * |
| ЛАТЫПОВ О.Р. Характеристика новых бета-пропеллерных белковых доменов, гомологичных фолдону фибритина бактериофага Т4: автореферат диссертации по ВАК 03.00.04. Казань, 2008, 84 с. LUDMILLA SISSOEFF et al., Stable trimerization of recombinant rabies virus glycoprotein ectodomain is required for interaction with the p75NTR receptor, Journal of General Virology, 2005, Vol.86, p.p.2543-2552. СЕРНОВА Н.В. Физико-химические свойства фибритина бактериофага Т4 и применение его карбоксиконцевого домена в белковой инженерии, Автореферат диссертации по ВАК 03.00.02. Долгопрудный, 2004, 107 с. ENGEL J et al., What are oligomerization domains good for, Matrix Biol., 2000 Aug, Vol.19, No.4, p.p.283-8. * |
| СЕРНОВА Н.В. Физико-химические свойства фибритина бактериофага Т4 и применение его карбоксиконцевого домена в белковой инженерии, Автореферат диссертации по ВАК 03.00.02. Долгопрудный, 2004, 107 с. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2807520C1 (en) * | 2023-03-21 | 2023-11-15 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | RECOMBINANT PLASMID pET21-GST-CD WHICH ENSURES THE SYNTHESIS AND SECRETION OF Gc ECTODOMAIN OF HANTAAN VIRUS GLYCOPROTEIN, AND THE RECOMBINANT ESCHERICHIA COLI STRAIN BL21(DE3)pLysE pET21-GST-CD, A PRODUCER OF THE Gc PROTEIN, THE ECTODOMAIN OF HANTAAN VIRUS GLYCOPROTEIN |
| RU2809199C1 (en) * | 2023-03-21 | 2023-12-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | pET21-GST-CD RECOMBINANT PLASMID WHICH ENSURES SYNTHESIS AND SECRETION OF Gn ECTODOMAIN OF HANTAAN VIRUS GLYCOPROTEIN, AND BL21(DE3)PLYSE pET21-GST-CD RECOMBINANT ESCHERICHIA COLI STRAIN, PRODUCER OF Gn PROTEIN, ECTODOMAIN OF HANTAAN VIRUS GLYCOPROTEIN |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2012114473A (en) | 2013-10-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113230395B (en) | Beta coronavirus antigen, beta coronavirus bivalent vaccine, preparation methods and applications thereof | |
| WO2022184027A1 (en) | Novel coronavirus multivalent antigen, and preparation method therefor and application thereof | |
| Flyak et al. | Broadly neutralizing antibodies from human survivors target a conserved site in the Ebola virus glycoprotein HR2–MPER region | |
| US11185580B2 (en) | Compositions, methods and uses for improved human papilloma virus constructs | |
| Arora et al. | Chimeric Hepatitis B core antigen virus-like particles displaying the envelope domain III of dengue virus type 2 | |
| WO2022089471A1 (en) | β-CORONAVIRUS MULTIMERIC ANTIGEN, PREPARATION METHOD THEREFOR AND APPLICATION THEREOF | |
| Hofmann et al. | Expression of the human cytomegalovirus pentamer complex for vaccine use in a CHO system | |
| CN102517302A (en) | Method for recombinant expression of varicella-zoster virus truncation type glycoprotein E and application thereof | |
| AU2020102599A4 (en) | Indirect ELISA Detection Method and Application of DHAV-3 Antibody Based on VP2 or VP4 Recombinant Protein Antigen | |
| Dalvie et al. | Engineered SARS-CoV-2 receptor binding domain improves immunogenicity in mice and elicits protective immunity in hamsters | |
| Liu et al. | Expression, purification and characterization of two truncated peste des petits ruminants virus matrix proteins in Escherichia coli, and production of polyclonal antibodies against this protein | |
| WO2021035325A1 (en) | Protein receptacle, polynucleotide, vector, expression cassette, cell, method for producing the receptacle, method of identifying pathogens or diagnosing diseases, use of the receptacle and diagnostic kit | |
| Isaacs et al. | Nucleocapsid specific diagnostics for the detection of divergent SARS-CoV-2 variants | |
| EP4313138A1 (en) | Sars-cov-2 subunit vaccine | |
| Zhao et al. | Novel strategy for expression and characterization of rabies virus glycoprotein | |
| CN104610443B (en) | A kind of high stability restructuring Procalcitonin, Preparation method and use | |
| KR20210123234A (en) | Recombinant nucleocapsid protein for diagnosis and vaccine of COVID-19 and use thereof | |
| KR102100813B1 (en) | Fusion protein from hepatitis C virus and diagnosing kit comprising the same | |
| CN109111507B (en) | Virus recombinant glycoprotein and eukaryotic cell high-efficiency expression method and application thereof | |
| RU2509805C2 (en) | METHOD OF OBTAINING RECOMBINANT ANTIGEN G2 OF DOBRAVA HANTAVIRUS IN E.coli CELLS | |
| Yan et al. | Preparation of a new monoclonal antibody against subgroup A of avian leukosis virus and identifying its antigenic epitope | |
| CN113549634B (en) | Gene for coding soluble HPV58L1 protein and construction and application of recombinant plasmid thereof | |
| Chen et al. | Small P particles formed by the Taiwan-native norovirus P domain overexpressed in Komagataella pastoris | |
| EP4196589A1 (en) | Fusion proteins comprising sars-cov-2 receptor binding domain | |
| Raoufi et al. | Designing and developing a sensitive and specific SARS-CoV-2 RBD IgG detection kit for identifying positive human samples |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140413 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20160220 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20190301 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190413 |