RU2509157C2 - Detection method of specific sequences of nucleic acids (versions), and device for its implementation - Google Patents
Detection method of specific sequences of nucleic acids (versions), and device for its implementation Download PDFInfo
- Publication number
- RU2509157C2 RU2509157C2 RU2011143078/10A RU2011143078A RU2509157C2 RU 2509157 C2 RU2509157 C2 RU 2509157C2 RU 2011143078/10 A RU2011143078/10 A RU 2011143078/10A RU 2011143078 A RU2011143078 A RU 2011143078A RU 2509157 C2 RU2509157 C2 RU 2509157C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- oligonucleotide probe
- nucleic acid
- modified
- electrode
- rna
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к области молекулярной биологии и электрохимии и может быть использовано для детекции специфических последовательностей нуклеиновых кислот (НК) (ДНК или РНК) электрохимическим методом с использованием модифицированных электродов, в частности модифицированных углеродными наноматериалами.The invention relates to the field of molecular biology and electrochemistry and can be used to detect specific nucleic acid (NK) sequences (DNA or RNA) by the electrochemical method using modified electrodes, in particular modified carbon nanomaterials.
В последние годы большое внимание уделяется разработке диагностических ПК-сенсоров на основе углеродных нанотрубок (УНТ) [Wang, J,. Nanomaterial-based electrochemical biosensors // Analyst. 2005 V.130. P.421-426. Mercosi, A., Pumera, M., Llopis, X., Perez, В., Valle, M., Alegret, S. New materials for electrochemical sensing. // Trends Anal. Chem. 2005. V.24. P.836-838.], предназначенных для выявления инфекций и генетических нарушений, обуславливающих развитие заболеваний человека [Balasubramanian, K., Burghard, М. Biosensors based on carbon nariotubes // Anal. Bioanal. Chem. 2006. V.385. P.452-468; Pumera, M., Sanches, S., Ichinose, I., Tang, J. Electrochemical nanobiosensors // Sens. Actiators. 2007. V.123. P.1195-1205]. Система распознавания биосенсора основана на специфическом взаимодействии биомолекул либо биологических надмолекулярных структур. Для преобразования процесса распознавания биомолекулы в аналитический сигнал элемент биологического распознавания должен находиться в прямом пространственном контакте с преобразователем [Balasubramanian K., Burghart М. Biosensors based on carbon nanotubes // Anal. Bioanal Chem. 2006, V.385. P.452-468], при этом генерируемый биосенсором сигнал функционально связан с количеством определяемого компонента. Высокоорганизованная структура и разнообразные электронные свойства УНТ делают перспективным использование этого материала для создания подобных биосенсоров в качестве как структурного, так и преобразующего элементов [Mercosi, A., Pumera, М., Llopis. X:; Perez, В., Valle, М., Alegret, S. New materials for electrochemical sensing. // Trends Anal. Chem. 2005. V.24. Р.836-838].In recent years, much attention has been paid to the development of diagnostic PC sensors based on carbon nanotubes (CNTs) [Wang, J ,. Nanomaterial-based electrochemical biosensors // Analyst. 2005 V.130. P.421-426. Mercosi, A., Pumera, M., Llopis, X., Perez, B., Valle, M., Alegret, S. New materials for electrochemical sensing. // Trends Anal. Chem. 2005. V.24. P.836-838.], Designed to detect infections and genetic disorders causing the development of human diseases [Balasubramanian, K., Burghard, M. Biosensors based on carbon nariotubes // Anal. Bioanal. Chem. 2006. V.385. P.452-468; Pumera, M., Sanches, S., Ichinose, I., Tang, J. Electrochemical nanobiosensors // Sens. Actiators. 2007. V.123. P.1195-1205]. The biosensor recognition system is based on the specific interaction of biomolecules or biological supramolecular structures. To convert the recognition process of a biomolecule into an analytical signal, the biological recognition element must be in direct spatial contact with the transducer [Balasubramanian K., Burghart M. Biosensors based on carbon nanotubes // Anal. Bioanal Chem. 2006, V.385. P.452-468], while the signal generated by the biosensor is functionally related to the amount of the determined component. The highly organized structure and various electronic properties of CNTs make it promising to use this material to create similar biosensors as both structural and transforming elements [Mercosi, A., Pumera, M., Llopis. X :; Perez, B., Valle, M., Alegret, S. New materials for electrochemical sensing. // Trends Anal. Chem. 2005. V.24. P.836-838].
Перспективным направлением в создании биосенсоров является разработка электрохимических биосенсоров, отличающихся высокой селективностью и чувствительностью [Wang, J., Survey and Summary. From DNA biosensors to gene chip. // Nucleic Acids Res. 2000. V.28. P.3011-3016]. Известны способы электрохимической детекции биомолекул по изменению сопротивления электрода при специфическом связывании биомолекул НК-зондами (олигонуклеотидными зондами), иммобилизованными на поверхности углеродных нанотрубок (УНТ), входящих в состав электропроводящей системы [Carbon nanotube biosensors with aptamers as molecular recognition elements and method for sensing target material using the same. H.M. So, J.O. Lee, Y.H. Kim, K.H. Won, H.J. Chang, K.J. Kong, Y.M. Choi. US2008/0094078 A1. 2008. (US 7854826 B2, 2010); Sensors employing single-walled carbon nanotubes. M.S. Strano, S. Baik, P.Barone. US 2007/0292896 Al. 2007]. Описано использование композитов из массивов ориентированных углеродных нанотрубок (УНТ), химически присоединенных к подложке, выполненной из алюминия,; золота или оксида кремния, с ковалентно присоединенными олигонуклеотидными зондами для электрохимической детекции ПК [Berti F., Lozzi L., Palchetti I., Santucci S., Marrazza G. Electrochim. Acta. 2009, V.54. P.5035-5041; Arumugam P.U., Chen H., Siddiqui S., Weinrich J.A.P., Jejelowo A., Li J., Meyyappan M.. Biosens. Bioelectron. 2009, V.24. P.2818-2824; Pumera M., Sanchez S., Ichinose I., Tang J. Sens. Actuat. B. 2007, V.123. P.1195-1205]. В качестве сигнала о гибридизации олигонуклеотидного зонда и детектируемой нуклеиновой кислоты (НК) используют значения изменения тока.A promising direction in the creation of biosensors is the development of electrochemical biosensors with high selectivity and sensitivity [Wang, J., Survey and Summary. From DNA biosensors to gene chip. // Nucleic Acids Res. 2000. V.28. P.3011-3016]. Known methods for the electrochemical detection of biomolecules by changing the resistance of the electrode during specific binding of biomolecules to NK probes (oligonucleotide probes) immobilized on the surface of carbon nanotubes (CNTs) that are part of the electrically conductive system [Carbon nanotube biosensors with aptamers as molecular recognition elements and method for sensing target material using the same. H.M. So, J.O. Lee, Y.H. Kim, K.H. Won, H.J. Chang, K.J. Kong, Y.M. Choi. US2008 / 0094078 A1. 2008. (US 7854826 B2, 2010); Sensors employing single-walled carbon nanotubes. M.S. Strano, S. Baik, P. Barone. US 2007/0292896 Al. 2007]. The use of composites from oriented carbon nanotube (CNT) arrays chemically attached to a substrate made of aluminum is described; gold or silicon oxide, with covalently attached oligonucleotide probes for electrochemical detection of PK [Berti F., Lozzi L., Palchetti I., Santucci S., Marrazza G. Electrochim. Acta. 2009, V. 54. P.5035-5041; Arumugam P.U., Chen H., Siddiqui S., Weinrich J.A.P., Jejelowo A., Li J., Meyyappan M. .. Biosens. Bioelectron 2009, V.24. P.2818-2824; Pumera M., Sanchez S., Ichinose I., Tang J. Sens. Actuat. B. 2007, V.123. P.1195-1205]. As a signal of hybridization of the oligonucleotide probe and the detected nucleic acid (NK), the values of the current change are used.
Известен способ детекции ДНК - прототип изобретения [Wang S.G., Wang R., Sellin P.J., Zhang Q. DNA biosensors based on self-assembled carbon nanotubes // Biochem. Biophys/. Res. Commun. 2004. V.325, №4. P.1433-1437.], где для детекции 21-звенного фрагмента ДНК используют методы циклической вольтамперометрии и дифференциальной импульсной вольтамперометрии в электрохимическом анализаторе, представляющем собой трехэлектродную электрохимическую йчейку, электроды которой соединены с регистрирующим устройством. УНТ-содержащий рабочий электрод электрохимического анализатора получают путем выращивания вертикально ориентированных многостенных углеродных нанотрубок методом каталитического осаждения из газовой фазы на электроде, представляющем собой золотую фольгу-подложку, покрытую слоем каталитических частиц никеля. УНТ-содержащий электрод обрабатывают концентрированной азотной кислотой для удаления каталитических частиц никеля и окисления концов нанотрубок. К образовавшимся при окислении на концах нанотрубок карбоксильным группам ковалентно присоединяют 21-звенныйA known method of DNA detection is a prototype of the invention [Wang S.G., Wang R., Sellin P.J., Zhang Q. DNA biosensors based on self-assembled carbon nanotubes // Biochem. Biophys /. Res. Commun. 2004. V.325, No. 4. P.1433-1437.], Where cyclic voltammetry and differential pulse voltammetry methods are used to detect a 21-link DNA fragment in an electrochemical analyzer, which is a three-electrode electrochemical cell, the electrodes of which are connected to a recording device. A CNT-containing working electrode of an electrochemical analyzer is obtained by growing vertically oriented multi-walled carbon nanotubes by catalytic deposition from the gas phase on an electrode, which is a gold foil substrate coated with a layer of catalytic particles of nickel. A CNT-containing electrode is treated with concentrated nitric acid to remove nickel catalyst particles and oxidize the ends of the nanotubes. To the carboxyl groups formed during the oxidation at the ends of the nanotubes, a 21-unit
олигодезоксирибонуклеотидный зонд, содержащий на 5'-конце линкер с первичной аминогруппой. Измерение электрохимических свойств проводят, подавая линейную развертку потенциала на электроды. Детекцию проводят сравнением пиков, полученных на вольтамперограмме в области от 0 до - 0.5 В.oligodeoxyribonucleotide probe containing a linker with a primary amino group at the 5'-end. The measurement of electrochemical properties is carried out by applying a linear scan of the potential to the electrodes. Detection is carried out by comparing the peaks obtained on the voltammogram in the region from 0 to - 0.5 V.
Недостатками известного способа и устройства являются высокая стоимость и трудоемкость получения электродов. Такие модифицированные электроды имеют ряд недостатков: низкая стабильность, технические сложности введения олигонуклеотидного зонда на поверхность УНТ, низкое содержание молекул зонда в составе электрода, и, как следствие, относительно невысокая чувствительность, дороговизна золотой фольги-подложки.The disadvantages of this method and device are the high cost and the complexity of obtaining electrodes. Such modified electrodes have several disadvantages: low stability, technical difficulties in introducing an oligonucleotide probe onto a CNT surface, low content of probe molecules in the electrode composition, and, as a result, relatively low sensitivity and high cost of a gold foil substrate.
Задачей изобретения является упрощение, удешевление и ускорение процесса детекции специфических последовательностей НК (ДНК или РНК).The objective of the invention is to simplify, reduce the cost and speed up the process of detection of specific sequences of NK (DNA or RNA).
Поставленная задача решается двумя вариантами способа и устройством.The problem is solved in two versions of the method and device.
По первому варианту поставленная задача решается тем, что в способе детекции специфических последовательностей нуклеиновых кислот электрохимическим методом, детекцию осуществляют путем регистрации циклических вольтамперограмм рабочего электрода, модифицированного углеродными нанотрубками с нековалентно иммобилизованным на их поверхности олигонуклеотидным зондом, до и после внесения в исследуемый раствор образца нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК), по изменению емкостной характеристики, определяемой по площади циклических вольтамперограмм, делают вывод о наличии или отсутствии в исследуемом образце нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК) участка, комплементарного олигонуклеотидному зонду, при этом после регистрации циклических вольтамперограмм рабочего электрода до и после внесения в исследуемый раствор образца нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК) строят профиль изменения относительной емкости электрода от номера цикла.In the first embodiment, the problem is solved in that in the method for detecting specific nucleic acid sequences by the electrochemical method, the detection is carried out by recording cyclic voltammograms of the working electrode modified by carbon nanotubes with an oligonucleotide probe non-covalently immobilized on their surface before and after the nucleic acid is introduced into the test solution of the sample (RNA or DNA), by changing the capacitive characteristic, determined by the area of cyclic volts erogram, conclude that there is a presence or absence in the sample of nucleic acid (RNA or DNA) of the region complementary to the oligonucleotide probe, and after recording cyclic voltammograms of the working electrode, a change profile is constructed before and after the nucleic acid sample (RNA or DNA) is introduced into the test solution relative capacitance of the electrode from the cycle number.
По второму варианту способа задача решается тем, что в способе детекции специфических последовательностей нуклеиновых кислот электрохимическим методом, детекцию осуществляют путем регистрации циклических вольтамперограмм рабочего электрода, модифицированного углеродными нанотрубками с нековалентно иммобилизованным на поверхности углеродных нанотрубок олигонуклеотидным зондом, содержащим остаток полиароматического углеводорода в качестве якорной группы для иммобилизации зонда, до и после внесения в исследуемый раствор образца нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК), по изменению емкостной характеристики, определяемой по площади циклических вольтамперограмм, или по наличию или отсутствию пика на емкостной характеристике, делают вывод о наличии или отсутствии в исследуемом образце нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК) участка, комплементарного олигонуклеотидному зонду, а также определяют концентрацию детектируемой НК, при этом после регистрации циклических вольтамперограмм рабочего электрода до и после внесения в исследуемый раствор образца нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК) строят профиль изменения относительной емкости электрода от номера цикла, а олигонуклеотидный зонд модифицируют остатками пирена или других полиароматических углеводородов.According to the second variant of the method, the problem is solved in that in the method for detecting specific nucleic acid sequences by the electrochemical method, the detection is carried out by recording cyclic voltammograms of the working electrode modified by carbon nanotubes with an oligonucleotide probe non-covalently immobilized on the surface of carbon nanotubes containing the remainder of the polyaromatic hydrocarbon immobilization of the probe, before and after introducing the sample into the test solution nucleic acid (RNA or DNA), by changing the capacitive characteristic, determined by the area of cyclic voltammograms, or by the presence or absence of a peak in the capacitive characteristic, conclude that there is a presence or absence in the sample of nucleic acid (RNA or DNA) of a site complementary to the oligonucleotide probe , and also determine the concentration of the detected NK, while after recording cyclic voltammograms of the working electrode before and after introducing a sample of nucleic acid (RNA) into the test solution Whether DNA) build a profile of the relative capacity of the electrode on the cycle number, and the oligonucleotide probe is modified residues pyrene or other polyaromatic hydrocarbons.
Поставленная задача решается тем, что устройство для реализации способа детекции специфических последовательностей нуклеиновых кислот электрохимическим методом представляет собой электрохимический анализатор, состоящий из трехэлектродной электрохимической ячейки, электроды которой соединены с регистрирующим устройством, содержащим источник питания, например, потенциостат, а рабочий электрод выполнен из электропроводящей кремниевой или металлической подложки, с выращенными на ней вертикально ориентированными углеродными нанотрубками, по всей поверхности которых нековалентно иммобилизован олигонуклеотидный зонд, комплементарный участку определяемой НК, или модифицированный олигонуклеотидный зонд, комплементарный участку определяемой НК, между рабочим и вспомогательным электродом расположен сепаратор, при чем олигонуклеотидный зонд предварительно модифицируют полиароматическим углеводородом, который выступает в качестве якорной группы для нековалентной иммобилизации модифицированного олигонуклеотидного зонда на поверхности углеродных нанотрубок рабочего электрода, а также олигонуклеотидный зонд модифицируют остатками пирена или других полиароматических углеводородов.The problem is solved in that the device for implementing the method for detecting specific nucleic acid sequences by the electrochemical method is an electrochemical analyzer consisting of a three-electrode electrochemical cell, the electrodes of which are connected to a recording device containing a power source, for example, a potentiostat, and the working electrode is made of an electrically conductive silicon or a metal substrate with vertically oriented carbon nanots grown on it sponges on the entire surface of which an oligonucleotide probe complementary to the region of the determined NK is immobilized immobilized or a modified oligonucleotide probe complementary to the region of the determined NK, a separator is located between the working and auxiliary electrodes, and the oligonucleotide probe is preliminarily modified with a polyaromatic hydrocarbon which acts as non-covalent immobilization of a modified oligonucleotide probe on the surface of carbon nanotubes the working electrode, as well as the oligonucleotide probe, are modified with residues of pyrene or other polyaromatic hydrocarbons.
На фиг.1 представлено устройство для реализации способа. Все элементы трехэлектродной ячейки расположены на основании (1), например из фторопласта, на основание помещен токосъемник вспомогательного электрода (2), выполненный, например, из титана с иридиевым напылением, к нему подведен электрод сравнения (3J, например, хлорсеребряный, и рабочий электрод (4), нанотрубки на рабочем электроде ориентированы перпендикулярно плоскости кремниевой подложки рабочего электрода. Электрод сравнения и рабочий электрод касаются сепаратора (5), например, из нетканого полипропиленового волокна, покрывающегб вспомогательный электрод. Рабочий электрод и электрод сравнения фиксируются с помощью штатива (6). Токосъемники всех электродов подключены к регистрирующему устройству, например, потенциостату Elins P-30S (7).Figure 1 shows a device for implementing the method. All elements of the three-electrode cell are located on the base (1), for example, of fluoroplastic, the current collector of the auxiliary electrode (2), made, for example, of titanium with iridium sputtering, is placed on the base, a reference electrode (3J, for example, silver chloride, and a working electrode (4), the nanotubes on the working electrode are oriented perpendicular to the plane of the silicon substrate of the working electrode. The reference electrode and the working electrode touch the separator (5), for example, of a nonwoven polypropylene fiber covering ogatelny electrode. The working electrode and the reference electrode are fixed to a tripod (6). The current collectors of the electrodes are connected to a recording device such as potentiostat Elins P-30S (7).
Предварительно получают УНТ-модифицированный рабочий электрод, представляющий собой электропроводящуйэ кремниевую или металлическую подложку с выращенными на ней вертикально ориентированными многостенными углеродными нанотрубками. Далее в течение 18-24 ч проводят нековалентную, в отличие от прототипа, иммобилизацию специально синтезированного олигонуклеотидного зонда, комплементарного участку детектируемой НК, путем инкубации УНТ-модифицированного электрода в 200 мкл водного раствора зонда с концентрацией 1-5·10-5 М. В качестве олигонуклеотидного зонда, в отличие от прототипа, используют не только олигодезоксирибонуклеотиды, но и олигорибонуклеотиды и их синтетические модифицированные аналоги (олиго(2'-O-метилрибонуклеотиды), LNA-модифицированные олигонуклеотиды и др.), а также олигонуклеотидые зонды, содержащие остаток полиароматического углеводорода. Модифицированные электроды высушивают и используют в составе трехэлектродной электрохимической ячейки для специфической детекции НК.Preliminarily, a CNT-modified working electrode is obtained, which is an electrically conductive silicon or metal substrate with vertically oriented multi-walled carbon nanotubes grown on it. Then, for 18-24 hours, a non-covalent, in contrast to the prototype, immobilization of a specially synthesized oligonucleotide probe complementary to the area of the detected NK is carried out by incubation of a CNT-modified electrode in 200 μl of an aqueous solution of the probe with a concentration of 1-5 · 10 -5 M. В as an oligonucleotide probe, in contrast to the prototype, not only oligodeoxyribonucleotides are used, but also oligoribonucleotides and their synthetic modified analogues (oligo (2'-O-methylribonucleotides), LNA-modified oligonucleotides, etc.) as well as oligonucleotide probes containing the remainder of a polyaromatic hydrocarbon. Modified electrodes are dried and used as part of a three-electrode electrochemical cell for specific detection of nanocrystals.
Для измерения электрохимических характеристик полученных электродов методом циклической вольтамперометрии с линейной разверткой потенциала в трехэлектродной ячейке на основание (1) помещают токосъемник вспомогательного электрода (2), на вспомогательный электрод помещают два слоя сепаратора (5) из нетканого полипропиленового волокна. Сепаратор избыточно пропитывают раствором электролита, при этом электрод сравнения (3) и рабочий электрод (4) с массивом углеродных нанотрубок касаются сепаратора (5). Электроды подключают к регистрирующему устройству (7).To measure the electrochemical characteristics of the electrodes obtained by cyclic voltammetry with a linear potential sweep in a three-electrode cell, the auxiliary electrode collector (2) is placed on the base (1), two layers of a nonwoven polypropylene fiber separator (5) are placed on the auxiliary electrode. The separator is excessively impregnated with an electrolyte solution, while the reference electrode (3) and the working electrode (4) with an array of carbon nanotubes touch the separator (5). The electrodes are connected to a recording device (7).
Суть метода измерения заключается в подаче на УНТ-модифицированный рабочий электрод с иммобилизованным на нем олигонуклеотидным зондом напряжения, изменяющегося по заданному закону (линейная развертка потенциала), и регистрации тока в цепи. Циклические вольтамперограммы в области потенциального окна для проведения измерений [-0.2; 1] В регистрируют с использованием потенциостата Elms Р-30S, работающего в потенциодинамическом режиме. Потенциал измеряют относительно хлорсеребряного электрода сравнения. Скорость развертки потенциала составляет 20 мВ/с.Рабочий электрод циклируют при комнатной температуре в электролите следующего состава: 0.1 М NaCl, 10 мМ какодилат натрия, 1 мМ ИагЭДТА, pH 7.4. Через 3 цикла в электрохимическую ячейку добавляют раствор исследуемой НК в этом же буфере и продолжают циклирование. В качестве исследуемых НК использовали протяженные синтетические фрагменты РНК. После введения исследуемого образца наблюдают изменение циклической вольтамперограммы, а именно, изменение площади вольтамперограмм от цикла к циклу. Форма получаемых вольтамперограмм соответствует электрохимическим процессам в ячейке, а средний ток пропорционален площади поверхности материала электрода. По полученным данным строят циклические вольтамперограммы и рассчитывают емкость электрода на каждом цикле. При увеличении/уменьшении емкости в процессе циклирования можно сделать выводы о состоянии и активности поверхности электрода. На основе этих данных делают вывод о наличии или отсутствии в исследуемом образце НК участка, комплементарного олигонуклеотидному зонду. Кроме того, по изменению площади вольтамперограмм можно оценить концентрацию НК.The essence of the measurement method is to apply a voltage varying according to a given law (linear potential sweep) to the CNT-modified working electrode with an oligonucleotide probe immobilized on it and detecting the current in the circuit. Cyclic voltammograms in the potential window region for measurements [-0.2; 1] In register using a potentiostat Elms P-30S, operating in potentiodynamic mode. The potential is measured relative to a silver chloride reference electrode. The potential sweep rate is 20 mV / s. The working electrode is cycled at room temperature in an electrolyte of the following composition: 0.1 M NaCl, 10 mM sodium cacodylate, 1 mM IAGEDTA, pH 7.4. After 3 cycles, a solution of the investigated nanocomposite in the same buffer is added to the electrochemical cell and cycling is continued. As the studied NK, extended synthetic RNA fragments were used. After the introduction of the test sample, a change in the cyclic voltammogram is observed, namely, a change in the area of the voltammogram from cycle to cycle. The shape of the obtained voltammograms corresponds to the electrochemical processes in the cell, and the average current is proportional to the surface area of the electrode material. According to the data obtained, cyclic voltammograms are built and the capacitance of the electrode in each cycle is calculated. With an increase / decrease in capacitance during cycling, conclusions can be drawn about the state and activity of the electrode surface. On the basis of these data, a conclusion is drawn about the presence or absence in the sample of NK of a region complementary to the oligonucleotide probe. In addition, by changing the area of voltammograms, one can estimate the concentration of nanocrystals.
При нековалентной иммобилизации олигонуклеотидного зонда на поверхность вертикально ориентированных УНТ посредством якорной группы (по второму варианту) регистрируют не только изменение площади вольтамперограмм от цикла к циклу, но и появление специфического пика на циклической вольтамперограмме, связанного с фиксацией детектируемой НК в комплексе с модифицированным зондом на поверхности УНТ-электрода (фиг.2). Интенсивность пика на циклической вольтамперограмме пропорциональна концентрации определяемой НК, что позволяет проводить количественную оценку.In the non-covalent immobilization of an oligonucleotide probe onto the surface of vertically oriented CNTs by means of an anchor group (according to the second option), not only the change in the area of voltammograms from cycle to cycle is recorded, but also the appearance of a specific peak on the cyclic voltammogram associated with fixation of the detected NK in combination with the modified probe CNT electrode (figure 2). The peak intensity in the cyclic voltammogram is proportional to the concentration of the determined NC, which allows a quantitative assessment.
Отличительными признаками изобретения по первому варианту являются:Distinctive features of the invention in the first embodiment are:
- использование в качестве зондов олигодезоксирибонуклеотидов или олигорибонуклеотидов, а также их модифицированных аналогов (олиго(2'-O-метилрибонуклеотиды), LNA и др.);- use as probes oligodeoxyribonucleotides or oligoribonucleotides, as well as their modified analogues (oligo (2'-O-methylribonucleotides), LNA, etc.);
- регистрация циклических вольтамперограмм рабочего электрода до и после внесения в исследуемый раствор образца НК (РНК или ДНК), содержащей участок, комплементарный олигонуклеотидному зонду, нековалентно иммобилизованному на поверхности углеродных нанотрубок рабочего электрода;- registration of cyclic voltammograms of the working electrode before and after introducing a sample of NK (RNA or DNA) into the test solution containing a region complementary to the oligonucleotide probe immobilized on the surface of carbon nanotubes of the working electrode;
- регистрация наличия или отсутствия в исследуемом образце НК (РНК или ДНК) участка, комплементарного олигонуклеотидному зонду, по изменению емкостной характеристики, определяемой по площади циклических вольтамперограмм.- registration of the presence or absence in the test sample of NK (RNA or DNA) of a site complementary to the oligonucleotide probe by changing the capacitive characteristic determined by the area of cyclic voltammograms.
Отличительными признаками изобретения по второму варианту являются:Distinctive features of the invention according to the second embodiment are:
- использование в качестве зондов олигодезоксирибонуклеотидов или олигорибонуклеотидов, а также их модифицированных аналогов (олиго(2'-O-метилрибонуклеотиды), LNA и др.);- use as probes oligodeoxyribonucleotides or oligoribonucleotides, as well as their modified analogues (oligo (2'-O-methylribonucleotides), LNA, etc.);
- предварительная модификация олигонуклеотидного зонда полиароматическим углеводородом в качестве якорной группы для нековалентной иммобилизации олигонуклеотидного зонда на поверхности углеродных нанотрубок рабочего электрода;- preliminary modification of the oligonucleotide probe with a polyaromatic hydrocarbon as an anchor group for non-covalent immobilization of the oligonucleotide probe on the surface of the carbon nanotubes of the working electrode;
- модификация олигонуклеотидного зонда остатками пирена или других полиароматических углеводородов;- modification of the oligonucleotide probe with residues of pyrene or other polyaromatic hydrocarbons;
- регистрация циклических вольтамперограмм рабочего электрода, модифицированного углеродными нанотрубками с нековалентно иммобилизованным на поверхности углеродных нанотрубок олигонуклеотидным зондом, содержащим остаток полиароматического углеводорода в качестве якорной группы, до и после внесения в исследуемый раствор образца НК (РНК или ДНК), содержащей участок, комплементарный зонду;- registration of cyclic voltammograms of the working electrode modified by carbon nanotubes with an oligonucleotide probe non-covalently immobilized on the surface of carbon nanotubes containing the remainder of the polyaromatic hydrocarbon as an anchor group, before and after introducing an NC sample (RNA or DNA) containing a complementary region into the test solution;
- регистрация наличия или отсутствия в исследуемом образце НК (РНК или ДНК) участка, комплементарного олигонуклеотидному зонду, по изменению емкостной характеристики, определяемой по площади циклических вольтамперограмм, или по наличию или отсутствию пика на вольтамперограммах.- registration of the presence or absence in the test sample of NK (RNA or DNA) of a region complementary to the oligonucleotide probe by a change in capacitive characteristic determined by the area of cyclic voltammograms, or by the presence or absence of a peak in voltammograms.
- определение концентрации детектируемой НК по интенсивности пика на циклической вольтамперограмме.- determination of the concentration of detected NK by the peak intensity in a cyclic voltammogram.
Отличительные признаки по устройству:Distinctive features of the device:
- рабочий электрод представляет собой электропроводящую кремниевую или металлическую подложку, модифицированную вертикально ориентированными углеродными нанотрубками;- the working electrode is an electrically conductive silicon or metal substrate modified with vertically oriented carbon nanotubes;
- по всей поверхности углеродных нанотрубок нековалентно иммобилизованы молекулы олигонуклеотидного зонда, комплементарного определяемому участку детектируемой НК;- molecules of an oligonucleotide probe complementary to the detected region of the detected NK are non-covalently immobilized over the entire surface of carbon nanotubes;
- олигонуклеотидный зонд предварительно модифицирован полиароматическим углеводородом, который выступает в качестве якорной группы для иммобилизации олигонуклеотидного зонда на поверхности углеродных нанотрубок рабочего электрода;- the oligonucleotide probe is pre-modified with a polyaromatic hydrocarbon, which acts as an anchor group for immobilization of the oligonucleotide probe on the surface of the carbon nanotubes of the working electrode;
- олигонуклеотидный зонд модифицирован остатками пирена или других полиароматических углеводородов;- the oligonucleotide probe is modified by residues of pyrene or other polyaromatic hydrocarbons;
- между рабочим и вспомогательным электродом расположен сепаратор.- a separator is located between the working and auxiliary electrodes.
Типичный пример №1Typical example No. 1
1. Получение модифицированного рабочего электрода1. Obtaining a modified working electrode
Массивы ориентированных многостенных углеродных нанотрубок выращивают известным аэрозольным CVD методом на кремниевых подложках размером 5×5 мм путем разложения 2%-ного раствора ферроцена в толуоле при температуре 800°С [Кудашов А.Г., Куреня А.Г., Окотруб А.В., Гусельников А.В., Данилович B.C., Булушева Л.Г. Синтез и структура пленок углеродных нанотрубок, ориентированных перпендикулярно подложке // ЖТФ. 2007. Т.77, №12. С.96-100. Окотруб А.В., Булушева Л.Г., Кудашов А.Г., Белавин В.В., Комогорцев С.В. Массивы углеродных нанотруб, ориентированных перпендикулярно подложке: анизотропия структуры и свойств. // Российские нанотехнологии. 2008. Т.3. Вып.3-4. С.122-131.]. Одну из сторон кремниевой подложки и все боковые поверхности подложки тщательно очищают от углеродного материала, к чистой кремниевой поверхности прикрепляют контакт проводящим клеем.Arrays of oriented multi-walled carbon nanotubes are grown by the well-known aerosol CVD method on 5 × 5 mm silicon substrates by decomposition of a 2% solution of ferrocene in toluene at a temperature of 800 ° C [Kudashov AG, Kurenya AG, Okotrub A.V ., Guselnikov A.V., Danilovich VS, Bulusheva L.G. Synthesis and structure of films of carbon nanotubes oriented perpendicular to the substrate // Zh. 2007. T.77, No. 12. S.96-100. Okotrub A.V., Bulusheva L.G., Kudashov A.G., Belavin V.V., Komogortsev S.V. Arrays of carbon nanotubes oriented perpendicular to the substrate: anisotropy of structure and properties. // Russian nanotechnology. 2008.V.3. Issue 3-4. S.122-131.]. One of the sides of the silicon substrate and all the side surfaces of the substrate are thoroughly cleaned of carbon material, and a contact is applied to a clean silicon surface by a conductive adhesive.
2. Синтез олигонуклеотидного зонда ОНЗ I2. Synthesis of oligonucleotide probe ONZ I
Получение олигонуклеотидного зонда I (ОНЗ I) конструкции 5'-p-(HEG)-p-GGAAGTCCAGCCCCATGGATGATGG, где HEG-остаток гексаэтиленгликоля, проводят на автоматическом ДНК/РНК-синтезаторе ASM-800 с использованием стандартного твердофазного фосфитамидного метода.Obtaining the oligonucleotide probe I (OH I) of the construction of 5'-p- (HEG) -p-GGAAGTCCAGCCCCATGGATGATGG, where the HEG-residue of hexaethylene glycol, was carried out on an ASM-800 automated DNA / RNA synthesizer using the standard solid phase phosphitamide method.
3. Получение модифицированного электрода I3. Obtaining a modified electrode I
Проводят иммобилизацию зонда ОНЗ I на поверхности углеродных нанотрубок. Для этого рабочий электрод, модифицированный углеродными нанотрубками, помещают в 10-5 М водный раствор ОНЗ 1 так, чтобы массив углеродных нанотрубок был полностью погружен в раствор. Иммобилизацию олигонуклеотида на поверхность углеродных нанотрубок проводят при перемешивании (скорость 600 об/мин) при 37°C в течение 18 чр. Электрод высушивают в течение 2 ч при 1-2 мм. рт.ст. в эксикаторе с P2O5. Емкость нанотрубок на поверхности электрода по отношению к олигонуклеотидному зонду ОНЗ I составила 94 мкмоль/г.The probe ONZ I is immobilized on the surface of carbon nanotubes. For this, the working electrode modified with carbon nanotubes is placed in a 10 -5 M aqueous solution of
4. Детекция РНК с использованием модифицированного электрода I4. RNA detection using modified electrode I
Для измерения электрохимических характеристик полученного электрода методом циклической вольтамперометрии с линейнйй разверткой потенциала в трехэлектродной ячейке (фиг.1) на основание (1) помещают токосъемник вспомогательного электрода (2), на вспомогательный электрод помещают два слоя сепаратора (5) из нетканого полипропиленового волокна. Сепаратор избыточно пропитывают 50 мкл раствора электролита, при этом электрод сравнения (3) и рабочий электрод (4) с массивом углеродных нанотрубок касаются сепаратора (5). Состав электролита 0.1 М NaCl, 10 мМ какодилат натрия, 1 мМ Na2ЭДТА, pH 7.4. Электроды подключают к регистрирующему устройству (6). Циклические вольтамперограммы в области потенциального окна для проведения измерений [-0.2; 1] В регистрируют с использованием потенциостата Elins Р-30S, работающего в потенциодинамическом режиме. Потенциал измеряют относительно хлорсеребряного электрода сравнения. Скорость развертки потенциала составляет 20 мВ/с.Регистрируют емкость модифицированного электрода на каждом цикле работы электрода. После установления равновесия на сепаратор наносят 50 мкл раствора исследуемой РНК (5'-CUGCCAUCAUCCA0GGGGCUGGACUUCCUCU) в том же буфере. В таком же режиме регистрируют циклические вольтамперограммы и рассчитывают емкость электрода. После введения исследуемого образца наблюдают изменение формы циклических вольтамперограмм, соответствующее гибридизации зонда ОНЗ I и детектируемой РНК и делают вывод о наличии или отсутствии в исследуемом образце РНК участка, комплементарного олигонуклеотидному зонду, а также оценивают его концентрацию.To measure the electrochemical characteristics of the obtained electrode by cyclic voltammetry with a linear potential sweep in a three-electrode cell (Fig. 1), an auxiliary electrode collector (2) is placed on the base (1), two layers of a non-woven polypropylene fiber separator (5) are placed on the auxiliary electrode. The separator is excessively impregnated with 50 μl of the electrolyte solution, while the reference electrode (3) and the working electrode (4) with an array of carbon nanotubes touch the separator (5). The electrolyte composition is 0.1 M NaCl, 10 mM sodium cacodylate, 1 mM Na 2 EDTA, pH 7.4. The electrodes are connected to a recording device (6). Cyclic voltammograms in the potential window region for measurements [-0.2; 1] B is recorded using an Elins P-30S potentiostat operating in potentiodynamic mode. The potential is measured relative to a silver chloride reference electrode. The potential sweep speed is 20 mV / s. The capacitance of the modified electrode is recorded on each electrode cycle. After equilibration, 50 μl of the test RNA solution (5'-CUGCCAUCAUUCCA0GGGGCUGGACUUCCUCU) in the same buffer is applied to the separator. In the same mode, cyclic voltammograms are recorded and the capacitance of the electrode is calculated. After the introduction of the test sample, a change in the shape of cyclic voltammograms corresponding to the hybridization of the ONZ I probe and the detected RNA is observed, and it is concluded that the RNA sample contains or is absent in the region complementary to the oligonucleotide probe and its concentration is estimated.
Типичный пример №2.
1. Получение модифицированного рабочего электрода1. Obtaining a modified working electrode
Модифицированный рабочий электрод получают как описано в примере №1.A modified working electrode is obtained as described in example No. 1.
2. Синтез олигонуклеотидного зонда ОНЗ II2. Synthesis of oligonucleotide probe ONZ II
Получение олигонуклеотидного зонда II (ОНЗ II) конструкции 5'-Pyr-p-HEG-p-GGAAGTCCAGCCCCATGGATGATGG, где Pyr - остаток пирена, HEG - остаток гексаэтиленгликоля, проводят путем присоединения пиренилметиламина к 5'-концевой фосфатной группе ОНЗ I по методике, описанной в работе [Новопашина, Д.С, Тоцкая, О.С., Холодарь, С.А., Мещанинова, М.И., Веньяминова, А.Г. Биоорг. Химия. 2008. Т.34. №5. С.671-682].Obtaining an oligonucleotide probe II (ONS II) of the construction of 5'-Pyr-p-HEG-p-GGAAGTCCAGCCCCATGGATGATGG, where Pyr is the residue of pyrene, HEG is the residue of hexaethylene glycol, is carried out by adding pyrenylmethylamine to the 5'-terminal phosphate group of ONZ I according to the procedure described in work [Novopashina, D.S., Totskaya, O.S., Kholodar, S.A., Meshchaninov, M.I., Venyaminova, A.G. Bioorg. Chemistry. 2008.V. 34. No. 5. S.671-682].
3. Получение модифицированного электрода II3. Obtaining a modified electrode II
Проводят иммобилизацию зонда ОНЗ II на поверхности углеродных нанотрубок как описано в примере №1. Емкость нанотрубок на поверхности электрода по отношению к олигонуклеотидному зонду ОНЗ II составила 157 мкмоль/г.Immobilization of the probe ONZ II on the surface of carbon nanotubes is carried out as described in example No. 1. The capacity of the nanotubes on the electrode surface with respect to the OHZ II oligonucleotide probe was 157 μmol / g.
4. Детекция РНК с использованием модифицированного электрода4. Detection of RNA using a modified electrode
Проводят измерения электрохимических характеристик полученного электрода методом циклической вольтамперометрии с линейной разверткой потенциала в трехэлектродной ячейке как описано в примере №1. После введения раствора исследуемого образца РНК (5'-CUGCCAUCAUCCAUGGGGCUGGACUUCCUCU) наблюдают изменение формы циклических вольтамперограмм: изменение их площадей от цикла к циклу (фиг.3) и появление пика (фиг.4). Увеличение емкости после добавления раствора детектируемой РНК является сигналом того, что в исследуемом образце РНК содержится участок, комплементарный иммобилизованному олигонуклеотидному зонду. Интенсивность появляющегося на вольтамперограмме пика пропорциональна концентрации определяемой РНК и определяется по предварительно построенной калибровочной кривой.The electrochemical characteristics of the obtained electrode are measured by cyclic voltammetry with a linear potential sweep in a three-electrode cell as described in example No. 1. After the introduction of the solution of the test RNA sample (5'-CUGCCAUCAUCCAUGGGGCUGGACUUCCUCU), a change in the shape of cyclic voltammograms is observed: a change in their areas from cycle to cycle (Fig. 3) and the appearance of a peak (Fig. 4). An increase in capacity after adding a solution of detectable RNA is a signal that a portion complementary to the immobilized oligonucleotide probe is contained in the test RNA sample. The intensity of the peak appearing on the voltammogram is proportional to the concentration of the detected RNA and is determined by the previously constructed calibration curve.
Типичный пример №3Typical example No. 3
1. Получение модифицированного рабочего электрода1. Obtaining a modified working electrode
Модифицированный рабочий электрод получают как описано в примере №1.A modified working electrode is obtained as described in example No. 1.
2. Синтез олигонуклеотидного зонда ОНЗ III2. Synthesis of oligonucleotide probe ONZ III
Получение олигонуклеотидного зонда III (ОНЗ III) конструкции 5'-Pyr-pHEG-p-GmGmAmAmGmUmCmCmAmGmCmCmCmCmAmUmGmGmAmUmGmAmUmGmGm, где Pyr - остаток пирена, HEG - остаток гексаэтиленгликоля, Gm, Am, Um и Cm - 2'-O-метилрибонуклеотиды, проводят путем присоединения пиренилметиламина к концевой фосфатной группе 5'-pHEG-p-GmGmAmGmUmCmCmAmGmCmCmCmCmAmUmGmGmAmUmGmAmUmGmGm по методике, описанной в работе [Новопашина, Д.С., Тоцкая, О.С., Холодарь, С.А., Мещанинова, М.И., Веньяминова, А.Г. Биоорг. Химия. 2008. Т.34. №5. С.671-682]. Синтез исходного олигонуклеотида 5'-pHEG-p-Obtaining an oligonucleotide probe III (ONZ III) of the 5'-Pyr-pHEG-pG construct m G m A m A m G m U m C m C m A m G m C m C m C m C m A m U m G m G m A m U m G m A m U m G m G m , where Pyr is the residue of pyrene, HEG is the residue of hexaethylene glycol, G m , A m , U m and C m are 2'-O-methylribonucleotides, carried out by attaching pyrenylmethylamine to the terminal phosphate group 5'-pHEG-pG m G m A m G m U m C m C m A m G m C m C m C m C m A m U m G m G m A m U m G m A m U m G m G m according to the method described in [Novopashina, D.S., Totskaya, O.S., Kholodar, S.A., Meshchaninova, M.I., Venyaminova, A.G. Bioorg. Chemistry. 2008.V. 34. No. 5. S.671-682]. Synthesis of the starting oligonucleotide 5'-pHEG-p-
GmGmAmAmGmUmCmCmAmGmCmCmCmCmAmUmGmGmAmUmGmAmUmGmGm проводят на автоматическом ДНК/РНК-синтезаторе ASM-800 стандартным твердофазным фосфитамидным методом.G m G m A m A m G m U m C m C m A m G m C m C m C m C m A m U m G m G m A m U m G m A m U m G m G m carried out on an automatic DNA / RNA synthesizer ASM-800 standard solid-state phosphitamide method.
3. Получение модифицированного электрода III3. Obtaining a modified electrode III
Проводят иммобилизацию зонда ОНЗ III на поверхности углеродных нанотрубок как описано в примере №1. Емкость нанотрубок на поверхности электрода по отношению к олигонуклеотидному зонду составила 148 мкмоль/г.The probe ONZ III is immobilized on the surface of carbon nanotubes as described in example No. 1. The capacity of the nanotubes on the electrode surface with respect to the oligonucleotide probe was 148 μmol / g.
4. Детекция РНК с использованием модифицированного электрода III4. Detection of RNA using a modified electrode III
Проводят измерения электрохимических характеристик полученного электрода методом циклической вольтамперометрии с линейной разверткой потенциала в трехэлектродной ячейке как описано в примере №1. После введения раствора исследуемого образца РНК (5'-CUGCCAUCAUCCAUGGGGCUGGACUUCCUCU) наблюдают изменение формы циклических вольтамперограмм: изменение их площадей от цикла к циклу и появление пика, аналогично описанному в примере №2. Увеличение емкости после добавления раствора РНК является сигналом того, что в исследуемом образце РНК содержится участок, комплементарный иммобилизованному олигонуклеотидному зонду. Интенсивность появляющегося на вольтамперограмме пика пропорциональна концентрации определяемой РНК и определяется по предварительно построенной калибровочной кривой.The electrochemical characteristics of the obtained electrode are measured by cyclic voltammetry with a linear potential sweep in a three-electrode cell as described in example No. 1. After the introduction of a solution of the test RNA sample (5'-CUGCCAUCAUCCAUGGGGCUGGACUUCCUCU), a change in the shape of cyclic voltammograms is observed: a change in their areas from cycle to cycle and the appearance of a peak, similar to that described in example No. 2. An increase in capacitance after the addition of an RNA solution is a signal that a portion complementary to the immobilized oligonucleotide probe is contained in the test RNA sample. The intensity of the peak appearing on the voltammogram is proportional to the concentration of the detected RNA and is determined by the previously constructed calibration curve.
Типичный пример №4Typical example No. 4
1. Получение модифицированного рабочего электрода1. Obtaining a modified working electrode
Модифицированный рабочий электрод получают как описано в примере №1.A modified working electrode is obtained as described in example No. 1.
2. Синтез олигонуклеотидного зонда ОНЗ IV2. Synthesis of oligonucleotide probe ONZ IV
Получение олигонуклеотидного зонда IV (ОНЗ IV) конструкции 5-Pyr-р-АААААААААА, где Pyr - остаток пирена, проводят путем присоединения пиренилметиламина к концевой фосфатной группе 5'-р-AAAAAAAAAA по методике, описанной в работе [Новопашина, Д.С., Тоцкая, О.С, Холодарь, С.А., Мещанинова, М.И., Веньяминова, А.Г. Биоорг. Химия. 2008. Т.34. №5. С.671-682]. Синтез исходного олигорибонуклеотида 5'-р-AAAAAAAAAA проводят на автоматическом ДНК/РНК-синтезаторе ASM-800 стандартным твердофазным фосфитамидным методом.Obtaining an oligonucleotide probe IV (ONZ IV) of the construction 5-Pyr-p-AAAAAAAAAA, where Pyr is the remainder of the pyrene, is carried out by adding pyrenylmethylamine to the terminal phosphate group 5'-p-AAAAAAAAAAA according to the procedure described in [Novopashina, D.S. , Totskaya, O.S., Kholodar, S.A., Meshchaninova, M.I., Venyaminova, A.G. Bioorg. Chemistry. 2008.V. 34. No. 5. S.671-682]. The synthesis of the original 5'-p-AAAAAAAAAA oligoribonucleotide was carried out on an ASM-800 automated DNA / RNA synthesizer using the standard solid phase phosphitamide method.
3. Получение модифицированного электрода IV3. Obtaining a modified electrode IV
Проводят иммобилизацию зонда ОНЗ ГУ на поверхности углеродных нанотрубок как описано в примере №1. Емкость нанотрубок на поверхности электрода по отношению к олигонуклеотидному зонду составила 128* мкмоль/г.Immobilization of the probe ONZ GU on the surface of carbon nanotubes as described in example No. 1. The capacity of the nanotubes on the electrode surface with respect to the oligonucleotide probe was 128 * μmol / g.
4. Детекция РНК с использованием модифицированного электрода IV4. Detection of RNA using a modified electrode IV
Проводят измерения электрохимических характеристик полученного электродаMeasure the electrochemical characteristics of the obtained electrode
методом циклической вольтамперометрии с линейной разверткой потенциала в трехэлектродной ячейке как описано в примере №1. После введения раствора исследуемого образца РНК (5'-CCCCCCCC) наблюдают незначительные изменения формы циклических вольтамперограмм. Строят зависимость относительного изменения емкости от номера цикла (фиг.5). Наблюдают незначительные изменения (до 5%) емкости после добавления раствора. Делают вывод об отсутствии в исследуемом образце РНК участка, комплементарного олигонуклеотидному зондуby cyclic voltammetry with a linear scan of the potential in a three-electrode cell as described in example No. 1. After the introduction of the solution of the test RNA sample (5'-CCCCCCCC), slight changes in the shape of cyclic voltammograms are observed. The dependence of the relative change in capacity on the cycle number is built (Fig. 5). Observe minor changes (up to 5%) in capacity after addition of the solution. The conclusion is drawn that there is no region complementary to the oligonucleotide probe in the RNA sample under study.
Таким образом, заявляемый способ и устройство расширяют возможности способа детекции специфических последовательностей НК (РНК или ДНК) путем регистрации электрохимических характеристик электродов методом циклической вольтамперометрии, упрощают, удешевляют и ускоряют его, позволяют проводить детекцию исследуемых образцов в малых объемах, что весьма существенно при проведении исследований и разработке диагностических систем. Кроме того, способ позволяет не только обнаружить специфическую последовательность НК (РНК или ДНК), но и оценить ее концентрацию.Thus, the inventive method and device expand the capabilities of the method for detecting specific NK sequences (RNA or DNA) by registering the electrochemical characteristics of the electrodes by cyclic voltammetry, simplify, cheapen and accelerate it, allow the detection of the studied samples in small volumes, which is very important when conducting research and the development of diagnostic systems. In addition, the method allows not only to detect a specific sequence of NK (RNA or DNA), but also to evaluate its concentration.
Claims (8)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011143078/10A RU2509157C2 (en) | 2011-10-26 | 2011-10-26 | Detection method of specific sequences of nucleic acids (versions), and device for its implementation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011143078/10A RU2509157C2 (en) | 2011-10-26 | 2011-10-26 | Detection method of specific sequences of nucleic acids (versions), and device for its implementation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2011143078A RU2011143078A (en) | 2013-05-10 |
| RU2509157C2 true RU2509157C2 (en) | 2014-03-10 |
Family
ID=48788459
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011143078/10A RU2509157C2 (en) | 2011-10-26 | 2011-10-26 | Detection method of specific sequences of nucleic acids (versions), and device for its implementation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2509157C2 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2213393C2 (en) * | 1997-07-14 | 2003-09-27 | Текнион Рисерч Энд Дивелопмент Фаундейшн Лтд, Сиван Ури, Бен-Джозеф Гдальяху, Браун Эрез, Эйчен Йоав | Electronic net incorporating nucleotide fibers, its manufacturing process, and electronic circuit including this net |
| EP1784512A2 (en) * | 2004-08-06 | 2007-05-16 | The Trustees of Boston College | Electrocatalytic nucleic acid hybridization detection |
| US20080227651A1 (en) * | 2004-03-25 | 2008-09-18 | Yanxiu Zhou | Cyclic voltammetry (CV) for identifying genomic sequence variations and detecting mismatch base pairs, such as single nucleotide polymorphisms |
-
2011
- 2011-10-26 RU RU2011143078/10A patent/RU2509157C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2213393C2 (en) * | 1997-07-14 | 2003-09-27 | Текнион Рисерч Энд Дивелопмент Фаундейшн Лтд, Сиван Ури, Бен-Джозеф Гдальяху, Браун Эрез, Эйчен Йоав | Electronic net incorporating nucleotide fibers, its manufacturing process, and electronic circuit including this net |
| US20080227651A1 (en) * | 2004-03-25 | 2008-09-18 | Yanxiu Zhou | Cyclic voltammetry (CV) for identifying genomic sequence variations and detecting mismatch base pairs, such as single nucleotide polymorphisms |
| EP1784512A2 (en) * | 2004-08-06 | 2007-05-16 | The Trustees of Boston College | Electrocatalytic nucleic acid hybridization detection |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Zhang X et al. Readily reusable electrochemical DNA hybridization biosensor based on the interaction of DNA with single-walled carbon nanotubes// Anal Chem. - 2009, Aug, 1; 81(15):6006-12. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2011143078A (en) | 2013-05-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sassolas et al. | Electrochemical aptasensors | |
| Erdem et al. | Methylene blue as a novel electrochemical hybridization indicator | |
| Li et al. | Electrochemical impedance spectroscopy for study of aptamer–thrombin interfacial interactions | |
| Erdem et al. | Novel hybridization indicator methylene blue for the electrochemical detection of short DNA sequences related to the hepatitis B virus | |
| Siddiqui et al. | Characterization of carbon nanofiber electrode arrays using electrochemical impedance spectroscopy: effect of scaling down electrode size | |
| Zhou et al. | A simple label-free electrochemical aptasensor for dopamine detection | |
| Dauphin-Ducharme et al. | High-precision electrochemical measurements of the guanine-, mismatch-, and length-dependence of electron transfer from electrode-bound DNA are consistent with a contact-mediated mechanism | |
| Wu et al. | A label-free electrochemical DNA sensor based on exonuclease III-aided target recycling strategy for sequence-specific detection of femtomolar DNA | |
| Wu et al. | Label-free detection of DNA using a light-addressable potentiometric sensor modified with a positively charged polyelectrolyte layer | |
| EP2492674A1 (en) | Biosensor array formed by junctions of functionalized electrodes | |
| Zhang et al. | A label-free aptasensor for the sensitive and specific detection of ***e using supramolecular aptamer fragments/target complex by electrochemical impedance spectroscopy | |
| Bagheri et al. | Gold nanoparticles deposited on fluorine-doped tin oxide surface as an effective platform for fabricating a highly sensitive and specific digoxin aptasensor | |
| Dabrowski et al. | Early diagnosis of fungal infections using piezomicrogravimetric and electric chemosensors based on polymers molecularly imprinted with D-arabitol | |
| Ziółkowski et al. | Electrochemical uranyl biosensor with DNA oligonucleotides as receptor layer | |
| Liu et al. | Label-free and ultrasensitive electrochemiluminescence detection of microRNA based on long-range self-assembled DNA nanostructures | |
| Yu et al. | A ratiometric electrochemical aptasensor for sensitive detection of protein based on aptamer–target–aptamer sandwich structure | |
| Hashimoto et al. | DNA sensor: a novel electrochemical gene detection method using carbon electrode immobilized DNA probes | |
| Yoo et al. | Controlling inter-sheet-distance in reduced graphene oxide electrodes for highly sensitive electrochemical impedimetric sensing of myoglobin | |
| Mahadhy et al. | Use of a capacitive affinity biosensor for sensitive and selective detection and quantification of DNA—A model study | |
| Wu et al. | Direct electrochemical sensor for label-free DNA detection based on zero current potentiometry | |
| Asadi et al. | Graphene-based electrochemical biosensor for impedimetric detection of miRNAs as potential cancer biomarkers | |
| Caliskan et al. | Direct DNA hybridization on the single‐walled carbon nanotubes modified sensors detected by voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy | |
| Wang et al. | An electrochemical sensor of non-electroactive drug 6-thioguanine based on the dsDNA/AET/Au | |
| Liu et al. | A simple regenerable electrochemical aptasensor for the parallel and continuous detection of biomarkers | |
| Del Pozo et al. | Electrochemical DNA sensing using osmium complexes as hybridization indicators |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20131202 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20151127 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191027 |