RU2507266C2 - ANTITEMPLATE PLASMID VECTOR pBL-T FOR CLONING OF COMPLEX GENOME SEQUENCES AND MULTIMODULE ASSEMBLY OF GENETICALLY ENGINEERED CONSTRUCTS (VERSIONS), AND SET CONTAINING THIS VECTOR - Google Patents
ANTITEMPLATE PLASMID VECTOR pBL-T FOR CLONING OF COMPLEX GENOME SEQUENCES AND MULTIMODULE ASSEMBLY OF GENETICALLY ENGINEERED CONSTRUCTS (VERSIONS), AND SET CONTAINING THIS VECTOR Download PDFInfo
- Publication number
- RU2507266C2 RU2507266C2 RU2011146242/10A RU2011146242A RU2507266C2 RU 2507266 C2 RU2507266 C2 RU 2507266C2 RU 2011146242/10 A RU2011146242/10 A RU 2011146242/10A RU 2011146242 A RU2011146242 A RU 2011146242A RU 2507266 C2 RU2507266 C2 RU 2507266C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- vector
- cloning
- pbl
- dna
- plasmid
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии, а именно к технологии молекулярного клонирования фрагментов ДНК, точнее к методам получения транскрипционно неактивных плазмидных векторов и их производных.The invention relates to the field of biotechnology and genetic engineering, in particular to the technology of molecular cloning of DNA fragments, more specifically to methods for producing transcriptionally inactive plasmid vectors and their derivatives.
Предшествующий уровень техникиState of the art
Впервые гибридная (вариант - рекомбинантная) ДНК была получена в 1972 году [Jackson, D.A., R.H. Symons, et al. (1972). "Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40: circular SV40 DNA molecules containing lambda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli." Proc Natl Acad Sci USA 69(10):2904-2909.], векторные плазмиды с селективным маркером (геном устойчивости к антибиотику) применены в 1973 [Cohen, S. N. and А. С.Chang (1973). "Recircularization and autonomous replication of a sheared R-factor DNA segment in Escherichia coli transformants." Proc Natl Acad Sci USA 70(5):1293-1297; Cohen, S. N., A.C. Chang, et al. (1973). "Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro." Proc Natl Acad Sci USA 70(11):3240-3244].For the first time, hybrid (recombinant variant) DNA was obtained in 1972 [Jackson, D.A., R.H. Symons, et al. (1972). "Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40: circular SV40 DNA molecules containing lambda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli." Proc Natl Acad Sci USA 69 (10): 2904-2909.], Vector plasmids with a selective marker (antibiotic resistance gene) were used in 1973 [Cohen, S. N. and A. C. Chang (1973). "Recircularization and autonomous replication of a sheared R-factor DNA segment in Escherichia coli transformants." Proc Natl Acad Sci USA 70 (5): 1293-1297; Cohen, S. N., A.C. Chang, et al. (1973). "Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro." Proc Natl Acad Sci USA 70 (11): 3240-3244].
Первый многофункциональный вектор, несущий гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину, область инициации репликации, (ориджин) и генетический элемент ограничения копийности (ROP) получен в 1977 [Bolivar, F., R.L. Rodriguez, et al. (1977). "Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system." Gene 2(2):95-113].The first multifunctional vector carrying the genes for resistance to ampicillin and tetracycline, the region of replication initiation, (origin) and the genetic element of copy limitation (ROP) was obtained in 1977 [Bolivar, F., R.L. Rodriguez, et al. (1977). "Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system." Gene 2 (2): 95-113].
Векторные системы на основе бактериофага М13 и плазмиды pBR322 (система pUC18/19) [Messing, J., В. Gronenbom, et al. (1977). "Filamentous coliphage М13 as a cloning vehicle: insertion of a HindII fragment of the lac regulatory region in М13 replicative form in vitro." Proc Natl Acad Sci USA 74(9):3642-3646.; Norrander, J., T. Kempe, et al. (1983). "Construction of improved М13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis." Gene 26(1):101-106.; Yanisch-Perron, С., J. Vieira, et al. (1985). "Improved М13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors." Gene 33(1):103-119.] получили широкое распространение с начала 80-х гг. Свойства плазмидных и линейных фаговых векторов сочетают гибридные конструкции - фагмиды, содержащие, кроме плазмидных последовательностей, межгенный участок одноцепочечного нитевидного фага f1, ответственный за репликацию фага. Среди них pD4 [Dotto GP, Horiuchi K, Replication of a plasmid containing two origins of bacteriophage f1, Journal of Molecular Biology, Volume 153, Issue 1, 25 November 1981, Pages 169-176], pEMBL [L Dente, G Cesareni, and R Cortese. pEMBL: a new family of single stranded plasmids. Nucleic Acids Res. 1983 March 25; 11(6):1645-1655], pKUN9, pKUN19 [Peeters BP, Schoenmakers JG, Konings RN. Plasmid pKUN9, a versatile vector for the selective packaging of both DNA strands into single-stranded DNA-containing phage-like particles. Gene. 1986; 41(1):39-46]. Наибольшее распространение получили серия фагмидных векторов pGEM-Zf ("Promega") и серия векторов pBluescript ("Stratagene"), характеризующиеся стандартными чертами фагмидных векторов, отличающиеся организацией полилинкера и генами устойчивости к антибиотикам. Общим ограничением использования векторов на основе плазмид, бактериофага М13 и фагмид является их емкость - предельный размер клонируемой вставки, поэтому для клонирования крупных (свыше 20 т.п.н.) фрагментов ДНК используются другие системы. Однако клонирование столь протяженных фрагментов ДНК требуется для решения узкой задачи - создания геномных библиотек, в остальных приложениях (работы с библиотеками кДНК, создания конструкций для экспрессии чужеродных генов и т.д.) преимущественно работа ведется с фрагментами ДНК, не превышающими 15 т.п.н.Vector systems based on bacteriophage M13 and plasmid pBR322 (pUC18 / 19 system) [Messing, J., B. Gronenbom, et al. (1977). "Filamentous coliphage M13 as a cloning vehicle: insertion of a HindII fragment of the lac regulatory region in M13 replicative form in vitro." Proc Natl Acad Sci USA 74 (9): 3642-3646 .; Norrander, J., T. Kempe, et al. (1983). "Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis." Gene 26 (1): 101-106 .; Yanisch-Perron, C., J. Vieira, et al. (1985). "Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors." Gene 33 (1): 103-119.] Have been widely used since the beginning of the 80s. The properties of plasmid and linear phage vectors combine hybrid constructs - phagemids containing, in addition to plasmid sequences, the intergenic region of the single-stranded filiform phage f1 responsible for phage replication. Among them are pD4 [Dotto GP, Horiuchi K, Replication of a plasmid containing two origins of bacteriophage f1, Journal of Molecular Biology, Volume 153,
Высококопийные векторы небольшого размера часто используются для прямого клонирования продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР) для целей последующего секвенирования. Большинство современных систем быстрого клонирования продуктов полимеразной цепной реакции основаны на лигировании ПНР-продуктов с выступающим непарным 3' дезоксиаденозиновым остатком, образующимся у большинства молекул ДНК в ходе ПЦР, и линеаризованного вектора с непарными выступающими нуклеотидными остатками 3'Т, реже 3'U и 3'I. Примерами таких систем являются pCR2001, pCR.II, рТОРО ТА (Invitrogen, США); pKRX (ATCC, США); pSC-A (Stratagene, США); рТА12 (Invitrogen, США), pGEM-T (Promega, США), pT7Blue (Novagen, США). Наибольшее распространение получили системы pGEM-T и pGEM-T Easy (Promega, США), в России также доступен функциональный аналог pGEM-T Easy - PAL-TA (Евроген, Россия).Small copy vectors are often used for direct cloning of polymerase chain reaction (PCR) products for subsequent sequencing. Most modern systems for the fast cloning of polymerase chain reaction products are based on the ligation of PNR products with a protruding unpaired 3 'deoxyadenosine residue formed in most DNA molecules during PCR, and a linearized vector with unpaired protruding 3'T nucleotide residues, less often 3'U and 3 'I. Examples of such systems are pCR2001, pCR.II, rTORO TA (Invitrogen, USA); pKRX (ATCC, USA); pSC-A (Stratagene, USA); pTA12 (Invitrogen, USA), pGEM-T (Promega, USA), pT7Blue (Novagen, USA). The most widely used systems are pGEM-T and pGEM-T Easy (Promega, USA); in Russia, a functional analogue of pGEM-T Easy is also available - PAL-TA (Eurogen, Russia).
Перечисленные векторы, являясь производными векторов PUC18/19 и фагмид семейства pGEM, обладают следующими особенностями: содержат системы транскрипции селективного маркера LacZ для проведения бело-голубого скрининга, а также в ряде случаев регуляторные последовательности бактериофагов для получения одноцепочечной ДНК и/или регуляторные последовательности для бесклеточной транскрипции и трансляции. Эти особенности, удобные для большинства приложений, ограничивают их применение для клонирования "сложных" последовательностей ДНК.The above vectors, being derivatives of the vectors PUC18 / 19 and the phGmid of the pGEM family, have the following features: they contain transcription systems of the LacZ selective marker for white-blue screening, as well as in some cases regulatory sequences of bacteriophages to obtain single-stranded DNA and / or regulatory sequences for cell-free transcription and translation. These features, convenient for most applications, limit their use for cloning "complex" DNA sequences.
Так, стандартные векторы принципиально не подходят для клонирования некоторых участков геномной ДНК высших эукариот. В частности, проблемными для клонирования в традиционных системах являются последовательности со сложной структурой - содержащие протяженные GC или AT тракты, повторяющиеся или палиндромные последовательности, а также последовательности с выраженными функциональными особенностями - регуляторные участки и токсичные для Е.coli открытые рамки считывания (ОРС) белков.Thus, standard vectors are fundamentally unsuitable for cloning certain sections of genomic DNA of higher eukaryotes. In particular, sequences with a complex structure — containing extended GC or AT tracts, repeating or palindromic sequences, as well as sequences with pronounced functional features — regulatory regions and open reading frames (OPC) of proteins toxic to E. coli are problematic for cloning in traditional systems. .
Наличие негативной селекции сложных последовательностей иллюстрируется проблемами при клонировании библиотек ДНК некоторых патогенов с высоким содержанием AT [Gardner, M.J. (2001). "A status report on the sequencing and annotation of the P.falciparum genome." Mol Biochem Parasitol 118(2):133-138; Gardner, M.J., N. Hall, et al. (2002). "Genome sequence of the human malaria parasite Plasmodium falciparum" Nature 419(6906):498-511; Rocha, Е. P. and A. Danchin (2002). "Base composition bias might result from competition for metabolic resources." Trends Genet 18(6):291-294; Vaughan, A., S. Y. Chiu, et al. (2008). "Assessment and improvement of the Plasmodium yoelii yoelii genome annotation through comparative analysis." Bioinformatics 24(13):i383-389] и выбыванием значительного количества (1600 ОРС) длинных и содержащих много повторов ОРС из масштабного протеомного исследования библиотеки MGS (Mammalian Gene Collection NIH) [Temple, G., D. S. Gerhard, et al. (2009). "The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC)." Genome Res 19(12):2324-2333]. При применении типичных векторных систем для клонирования описана негативная селекция против ОРС, а также регуляторных элементов [Adhya, S. and M. Gottesman (1982). "Promoter occlusion: transcription through a promoter may inhibit its activity." Cell 29(3):939-944], повторов [Bowater, R.P. and R.D. Wells (2001). "The intrinsically unstable life of DNA triplet repeats associated with human hereditary disorders." Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 66:159-202], поли-Т трактов [Kiyama, R. and M. Oishi (1994). "Instability of plasmid DNA maintenance caused by transcription of poly(dT)-containing sequences in Escherichia coli." Gene 150(1):57-61.], показано, что активные промоторные последовательности во вставке могут запускать транскрипцию структурных областей вектора и интерферировать как с репликацией плазмиды [Stueber, D. and H. Bujard (1982). "Transcription from efficient promoters can interfere with plasmid replication and diminish expression of plasmid specified genes." EMBO J 1(11):1399-1404], так и с экспрессией селективного маркера [Adhya, S. and M. Gottesman (1982). "Promoter occlusion: transcription through a promoter may inhibit its activity." Cell 29(3):939-944].The presence of negative selection of complex sequences is illustrated by problems in cloning DNA libraries of certain high AT pathogens [Gardner, M.J. (2001). "A status report on the sequencing and annotation of the P.falciparum genome." Mol Biochem Parasitol 118 (2): 133-138; Gardner, M.J., N. Hall, et al. (2002). "Genome sequence of the human malaria parasite Plasmodium falciparum" Nature 419 (6906): 498-511; Rocha, E. P. and A. Danchin (2002). "Base composition bias might result from competition for metabolic resources." Trends Genet 18 (6): 291-294; Vaughan, A., S. Y. Chiu, et al. (2008). "Assessment and improvement of the Plasmodium yoelii yoelii genome annotation through comparative analysis." Bioinformatics 24 (13): i383-389] and dropping a significant amount (1,600 OPCs) of long and many repeating OPCs from a large-scale proteomic study of the MGS library (Mammalian Gene Collection NIH) [Temple, G., D. S. Gerhard, et al. (2009). "The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC)." Genome Res 19 (12): 2324-2333]. Using typical vector systems for cloning, negative selection against ORS as well as regulatory elements has been described [Adhya, S. and M. Gottesman (1982). "Promoter occlusion: transcription through a promoter may inhibit its activity." Cell 29 (3): 939-944], repetitions [Bowater, R.P. and R.D. Wells (2001). "The intrinsically unstable life of DNA triplet repeats associated with human hereditary disorders." Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 66: 159-202], poly-T tracts [Kiyama, R. and M. Oishi (1994). "Instability of plasmid DNA maintenance caused by transcription of poly (dT) -containing sequences in Escherichia coli." Gene 150 (1): 57-61.], It has been shown that the active promoter sequences in the insert can trigger transcription of the structural regions of the vector and interfere as with plasmid replication [Stueber, D. and H. Bujard (1982). "Transcription from efficient promoters can interfere with plasmid replication and diminish expression of plasmid specified genes." EMBO J 1 (11): 1399-1404], and with the expression of a selective marker [Adhya, S. and M. Gottesman (1982). "Promoter occlusion: transcription through a promoter may inhibit its activity." Cell 29 (3): 939-944].
Распространенная система селекции трансформантов по нарушению рамки считывания гена LacZ, известная как "бело-голубой скрининг" [Gronenbom, В. and J. Messing (1978). "Methylation of single-stranded DNA in vitro introduces new restriction endonuclease cleavage sites." Nature 272(5651):375-377], обладает рядом неустранимых недостатков, среди которых:A common selection system for transformants that violates the reading frame of the LacZ gene, known as "white-blue screening" [Gronenbom, B. and J. Messing (1978). "Methylation of single-stranded DNA in vitro introduces new restriction endonuclease cleavage sites." Nature 272 (5651): 375-377], has a number of fatal flaws, including:
1. высокая частота ложнопозитивных клонов с нарушением рамки считывания гена LacZ вследствие спонтанных точечных мутаций,1. high frequency of false positive clones with violation of the reading frame of the LacZ gene due to spontaneous point mutations,
2. высокая стоимость и нестабильность субстрата (X-Gal),2. high cost and instability of the substrate (X-Gal),
3. избирательность ориентации (не выживают трансформанты с токсичным продуктом экспрессии клонируемой последовательности, направленным по ходу гена LacZ, т.е. при клонировании ПЦР-продуктов вероятность получения позитивного клона снижается вдвое).3. selectivity of orientation (transformants with a toxic expression product of the cloned sequence directed along the LacZ gene do not survive, i.e., when cloning PCR products, the probability of obtaining a positive clone is halved).
Наличие системы бело-голубого скрининга вызывает высокий уровень транскрипции/трансляции области вставки, что ведет к отрицательной селекции вставок с ОРС, транскрибирующиеся вставки с тандемными тринуклеотидными повторами и полиТ-тракты также подвергаются отрицательной селекции. Для того чтобы уйти от недостатков системы бело-голубой селекции при клонировании «сложных» последовательностей, разработан ряд «transcription free» систем, лишенных транскрипции (LacZ, Т7), что увеличивает стабильность вставки. Например, коммерчески доступные вектора pSMART (Lucigen Corporation, США, US7723103) и pSPARK (Canvax Biotech, Испания).The presence of a blue-white screening system causes a high level of transcription / translation of the insertion region, which leads to negative selection of OPC inserts, transcribed inserts with tandem trinucleotide repeats, and polyT tracts also undergo negative selection. In order to get away from the shortcomings of the white-blue selection system when cloning “complex” sequences, a number of “transcription free” systems without transcription (LacZ, T7) have been developed, which increases insert stability. For example, commercially available vectors pSMART (Lucigen Corporation, USA, US7723103) and pSPARK (Canvax Biotech, Spain).
Распространенные векторные системы для прямого клонирования ПЦР-продуктов, такие как pCR2001, pCR.II, рТОРО ТА (Invitrogen, Carlsbad, Calif.); pKRX (ATCC, Rockville, Md.); pSC-A (Stratagene, La Jolla, Calif.); pTA12 vector (Invitrogen), pGEM-T (Promega, Madison, Wis.), pT7Blue (Novagen, Madison, Wis.) не применимы для клонирования «сложных» и токсичных последовательностей и модульной сборки генетических конструкций.Common vector systems for direct cloning of PCR products, such as pCR2001, pCR.II, pTORO TA (Invitrogen, Carlsbad, Calif.); pKRX (ATCC, Rockville, Md.); pSC-A (Stratagene, La Jolla, Calif.); pTA12 vector (Invitrogen), pGEM-T (Promega, Madison, Wis.), pT7Blue (Novagen, Madison, Wis.) are not applicable for cloning complex and toxic sequences and modular assembly of genetic constructs.
Ближайшие аналоги настоящего изобретения - «нетранскрибируемые» векторы pSMART (Lucigen Corporation, США) и pSPARK (Canvax Biotech, Испания) имеют ряд существенных недостатков. Так, векторы семейства pSMART содержат выступающие 3'G нуклеотиды, что делает невозможным прямое клонирование продуктов ПЦР. При использовании этих векторов необходимо проводить ПЦР при помощи специальных дорогостоящих и низкопроцессивных полимераз с корректирующей активностью, а затем проводить стадию нематричного присоединения 3' нуклеотида («тейлинга») с добавлением стандартной полимеразы и избытка dCTP.The closest analogues of the present invention are the "non-transcribed" vectors pSMART (Lucigen Corporation, USA) and pSPARK (Canvax Biotech, Spain) have a number of significant drawbacks. Thus, the pSMART family vectors contain prominent 3'G nucleotides, which makes direct cloning of PCR products impossible. When using these vectors, it is necessary to carry out PCR using special expensive and low-throughput polymerases with corrective activity, and then carry out the stage of non-matrix addition of 3 'nucleotide ("tiling") with the addition of standard polymerase and excess dCTP.
Другой важный недостаток векторов pSMART и pSPARK - малый размер и неудачный дизайн полилинкера (MCS, multiple cloning site), что делает практически невозможной сборку модульных генетических конструкций (длинных ОРС, ОРС гибридных белков, кассет с регуляторными элементами). MCS существующих "нетранскрибируемых" векторов и большинства стандартных векторов содержат не более 15 сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции II типа, преимущественно узнающих гексануклеотидные палиндромные последовательности.Another important drawback of the pSMART and pSPARK vectors is the small size and poor design of the polylinker (MCS, multiple cloning site), which makes it almost impossible to assemble modular genetic constructs (long OPC, OPC hybrid proteins, cassettes with regulatory elements). The MCSs of existing "non-transcribed" vectors and most standard vectors contain no more than 15 recognition sites of type II restriction endonucleases, predominantly recognizing hexanucleotide palindromic sequences.
Необходимым условием для возможности использования в молекулярном клонировании закодированных в MCS сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции является их уникальность, т.е. эти сайты не должны встречаться в остальной последовательности вектора, а также (при сборке модульных конструкций) в последовательности вставки (модуля). Чем больше длина соединяемых модулей ДНК, тем выше вероятность того, что в последовательности будет содержаться палиндром, узнающийся эндонуклеазой рестрикции. Так, при случайном распределении сайтов определенный тетрануклеотид будет встречаться 1 раз на каждые 44 (256) нуклеотидов, гексануклеотид - 1 раз на 46 нуклеотидов (4096), октануклеотид - 1 раз на 48 (114688). Таким образом, наличие нескольких октануклеотидных сайтов в MCS вектора позволяет практически гарантировать возможность сборки модульной конструкции по уникальным сайтам узнавания рестриктаз.A necessary condition for the possibility of using restriction endonuclease recognition sites in MCS encoded in MCS is their uniqueness, i.e. these sites should not occur in the rest of the sequence of the vector, and also (when assembling modular structures) in the sequence of the insert (module). The longer the DNA modules to be joined, the greater the likelihood that a palindrome recognized by a restriction endonuclease will be contained in the sequence. So, with a random distribution of sites, a certain tetranucleotide will occur 1 time for every 4 4 (256) nucleotides, a hexanucleotide - 1 time for 4 6 nucleotides (4096), an octanucleotide - 1 time for 4 8 (114688). Thus, the presence of several octanucleotide sites in the MCS of the vector allows us to practically guarantee the possibility of assembling a modular design for unique restriction enzyme recognition sites.
В полилинкерах вышеперечисленных векторов октануклеотидные сайты узнавания либо вовсе не представлены, либо представлено не более двух октануклеотидных сайтов (pGEM - NotI, SbfI; pSMART - SwaI, pSPARK - PmeI, NotI, причем содержащиеся в MCS transcription-free векторов сайты эндонуклеаз, расщепляющих ДНК с образованием «тупых» концов, SwaI и PmeI, неудобны для клонирования).In the polylinkers of the above vectors, the octanucleotide recognition sites are either not represented at all, or no more than two octanucleotide sites are represented (pGEM - NotI, SbfI; pSMART - SwaI, pSPARK - PmeI, NotI, and the endonucleases that cleave DNA contained in MCS transcription-free vectors the formation of blunt ends, SwaI and PmeI, are inconvenient for cloning).
Для сборки модульных конструкций описан ряд специализированных систем, требующих либо проведения мультиплексного дотирования (Interxon Corporation, US 20090226976 A1, US 20090170727 A1), либо последовательной сборки без возможности извлечения модуля и инсерции дополнительного модуля между ранее вставленными (US 20090123973 A1), либо система в целом предназначена для решения узкой задачи и требует последовательного применения нескольких векторов (например, трансфер-векторы и вектор для экспрессии антител US 20050176099 A1, Schering Corporation).For the assembly of modular structures, a number of specialized systems have been described that require either multiplex subsidization (Interxon Corporation, US 20090226976 A1, US 20090170727 A1), or sequential assembly without the possibility of removing the module and inserting an additional module between the previously inserted ones (US 20090123973 A1), or the system in generally designed to solve a narrow problem and requires the sequential use of several vectors (for example, transfer vectors and a vector for expression of antibodies US 20050176099 A1, Schering Corporation).
Для быстрого клонирования продуктов полимеразной цепной реакции за счет выступающих на 5' концах амплифицированных фрагментов ДНК дезоксиаденозиновых остатков широко применяются так называемые Т-векторы - линеаризованные плазмидные векторы с выступающими 3' дезокситимидиновыми остатками [Zhou MY, Gomez-Sanchez CE. Universal ТА cloning. Curr Issues Mol Biol. 2000; Jan; 2(1):1-7. Review. PubMed PMID: 11464915]. Существует два метода их получения: 1). первый основан на расщеплении эндонуклеазой рестрикции с образованием ровных («тупых») концов с последующим присоединением 3'Т при помощи ДНК полимеразы [Holton ТА, Graham MW. A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors. Nucleic Acids Res. 1991 Mar 11; 19(5):1156; Marchuk D, Drumm M, Saulino A, Collins FS. Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products. Nucleic Acids Res. 1991 Mar 11; 19(5):1154; Papp T, Kirchner S, Diener U, Jafari M, Golka A, Schiffman D. Cloning of PCR fragments with a modified M13mp18 T-vector. Trends Genet. 1995 May; 11(5):169), 2). Второй метод основан на обработке плазмидного вектора ступенчато щепящей эндонуклеазой с образованием 3'Т концов, например, описано использование ферментов XcmI [Cha J, Bishai W, Chandrasegaran S. New vectors for direct cloning of PCR products. Gene. 1993 Dec 22; 136(1-2):369-70; Kwak JH, Kim MY. Construction of T-vector for direct cloning and expression of cloned genes in Escherichia coli. Anal Biochem. 1995 Jun 10; 228(1):178-80; Borovkov AY, Rivkin MI. XcmI-containing vector for direct cloning of PCR products. Biotechniques. 1997 May; 22(5):812-4; de Vries E. pUCPCR1. A vector for direct cloning of PCR products in a double XcmI restriction site offering compatible single 3'-overhanging T residues. Mol Biotechnol. 1998 Dec; 10(3):273-4], а также ферментов AspEI/Eam1105I/AhdI [Ichihara Y, Kurosawa Y. Construction of new T vectors for direct cloning of PCR products. Gene. 1993 Aug 16; 130(1):153-4; Ido E, Hayami M. Construction of T-tailed vectors derived from a pUC plasmid: a rapid system for direct cloning of unmodified PCR products. Biosci Biotechnol Biochem. 1997 Oct; 61(10):1766-7; Jeung JU, Cho SK, Shim KS, Ok SH, Lim DS, Shin JS. Construction of two pGEM-7Zf(+) phagemid T-tail vectors using AhdI-restriction endonuclease sites for direct cloning of PCR products. Plasmid. 2002 Sep; 48(2):160-3].For the fast cloning of polymerase chain reaction products due to the deoxyadenosine residues protruding at the 5 'ends of the amplified DNA fragments, the so-called T-vectors are widely used — linearized plasmid vectors with prominent 3' deoxythymidine residues [Zhou MY, Gomez-Sanchez CE. Universal TA cloning. Curr Issues Mol Biol. 2000; Jan; 2 (1): 1-7. Review PubMed PMID: 11464915]. There are two methods for their preparation: 1). the first is based on cleavage by restriction endonuclease with the formation of smooth ("blunt") ends, followed by addition of 3'T using DNA polymerase [Holton TA, Graham MW. A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors. Nucleic Acids Res. 1991
Технической задачей, решаемой авторами настоящего изобретения, являлась разработка эффективных «нетранскрибируемых» векторов, обеспечивающих возможность:The technical problem solved by the authors of the present invention was the development of effective "non-transcribed" vectors, providing the ability to:
1. прямого клонирования ПЦР-продуктов;1. direct cloning of PCR products;
2. клонирования «сложных» GC- AT- богатых последовательностей (часто встречающихся в геномах патогенных микроорганизмов или в регуляторных областях генома эукариот), а также токсичных для бактерий открытых рамок считывания полипептидов;2. cloning of “complex” GC-AT-rich sequences (often found in the genomes of pathogenic microorganisms or in regulatory regions of the eukaryotic genome), as well as open reading frames of polypeptides toxic to bacteria;
3. модульной сборки генетических конструкций (в частности, сборки кассет для экспрессии эукариотических генов, сборки ДНК-конструкций для генной терапии).3. modular assembly of genetic constructs (in particular, assembly of cassettes for the expression of eukaryotic genes, assembly of DNA constructs for gene therapy).
Технический результат достигался созданием нетранскрибируемого линейного вектора малого размера (т.е. менее 4 т.п.о.), содержащего ген маркера селекции с промотором и терминатором, область инициации репликации, полилинкер, содержащий 15 или более уникальных гексануклеотидных сайтов расщепления эндонуклеазами рестрикции, 3 или более октануклеотидных сайтов и непарные выступающие одиночные остатки дезокситимидина на 3'-концах цепей ДНК для клонирования продуктов ПЦР.The technical result was achieved by creating a non-transcribed linear small vector (i.e., less than 4 kb) containing a selection marker gene with a promoter and terminator, a replication initiation region, a polylinker containing 15 or more unique hexanucleotide restriction endonuclease cleavage sites, 3 or more octanucleotide sites and unpaired protruding single deoxythymidine residues at the 3'-ends of the DNA chains for cloning PCR products.
Термин «линейный Т-вектор» означает линеаризованную плазмидную ДНК с выступающими 3' дезокситимидиновыми остатками, образующую после лигирования вставки кольцевую плазмиду, содержащую все необходимые генетические элементы для репликации в бактериальной клетке и экспрессии гена селективного маркера, например, такие, как ориджин репликации и ген устойчивости к антибиотику с промотором, соответственно, а также протяженный полилинкер, содержащий уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, при этом указанный полилинкер содержит сайты узнавания октануклеотидных эндонуклеаз рестрикции, расщепляющих ДНК с образованием «липких» концов.The term "linear T-vector" means a linearized plasmid DNA with protruding 3 'deoxythymidine residues, forming after ligation of the insert a circular plasmid containing all the necessary genetic elements for replication in the bacterial cell and expression of a selectable marker gene, for example, such as the origin of replication and the gene antibiotic resistance with a promoter, respectively, as well as an extended polylinker containing unique recognition sites of restriction endonucleases, wherein said polylinker contains it recognition sites of restriction restriction octanucleotide endonucleases that cleave DNA to form “sticky” ends.
Конкретными примерами генетических элементов, необходимых для репликации в бактериальной клетке согласно настоящему изобретению, являются ориджины репликации высококойпийных плазмид pUC, pBR и подобные им. Использование ориджина pUC является наиболее предпочтительным.Specific examples of the genetic elements necessary for replication in a bacterial cell according to the present invention are the origin of replication of high-cc plasmids pUC, pBR and the like. The use of the origin of pUC is most preferred.
Конкретными примерами генетических элементов, необходимых для экспрессии гена селективного маркера согласно настоящему изобретению, являются ген бета-лактамазы (amp), обеспечивающий усточивость к ампилиллину, ген хлорамфениколацетилтрансферазы (cat), обеспечивающий усточивость к хлорамфениколу, гены монооксигеназ (tet), обеспечивающие усточивость к тетрациклину, ген неомицинфосфотрансферазы II (kan), обеспечивающий усточивость к канамицину, но не ограничиваются ими.Specific examples of the genetic elements necessary for the expression of the selectable marker gene according to the present invention are the beta-lactamase (amp) gene, which provides ampillillin resistance, the chloramphenicolacetyltransferase (cat) gene, and chloramphenicol resistance, monooxygenase (tet) genes that provide resistance to tetracycle , the neomycin phosphotransferase II (kan) gene, which provides resistance to kanamycin, but is not limited to.
Конкретными примерами гексануклеотидных эндонуклеаз рестрикции, сайты узнавания которых присутствуют в полилинкере, являются XhoI, PstI, EcoRI, NcoI, SacI, BspEI, SalI, AatII, NdeI, XbaI, XmaI, PvuI, PsiI, BamHI, NheI, но не ограничиваются ими. Конкретными примерами октануклеотидных эндонуклеаз рестрикции, сайты узнавания которых присутствуют в полилинкере, являются AbsI, AscI и NotI, но не ограничиваются ими.Specific examples of restriction hexanucleotide endonucleases whose recognition sites are present in the polylinker are XhoI, PstI, EcoRI, NcoI, SacI, BspEI, SalI, AatII, NdeI, XbaI, XmaI, PvuI, PsiI, BamHI, NheI, but not limited to. Specific examples of octanucleotide restriction endonucleases, recognition sites of which are present in the polylinker, are, but are not limited to, AbsI, AscI, and NotI.
Предпочтительным вариантом реализации настоящего изобретения является Т-вектор pBL-T, представляющей собой линеаризованную плазмиду, размером 2032 п.о. с выступающими 3' дезокситимидиновыми остатками, который соедржит фрагмент длиной 100 п.о., представляющий собой протяженный полилинкер, фрагмент плазмиды pUC18 (+) длиной 1932 п.о., содержащийо область инициации репликации плазмиды, и ген бета-лактамазы с промотором и терминатором. Схема вектора с указанием координат функциональных элементов представлена на Фиг.2.A preferred embodiment of the present invention is the T-vector pBL-T, which is a linearized plasmid with a size of 2032 bp with protruding 3 'deoxythymidine residues, which contains a 100 bp fragment, which is an extended polylinker, a 1932 bp fragment of pUC18 (+) plasmid containing the plasmid replication initiation region, and a beta-lactamase gene with a promoter and terminator . A vector diagram indicating the coordinates of the functional elements is presented in figure 2.
Полная нуклеотидная последовательность линейного Т-вектора (pBL-T) представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1.The complete nucleotide sequence of the linear T-vector (pBL-T) is presented in the List of sequences under the number SEQ ID NO: 1.
Вектор может быть получен с использованием стандартных методов генной инженерии, плазмиды pUC18 (ЕР 0316378) и химически синтезированных олигонуклеотидов [Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989]. Например, линейный Т-вектор может быть получен методом ПЦР, а также рестрикцией плазмиды-предшественника, несущей кассету, состоящую из тандема расположенных на обеих комплементарных цепях ДНК сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции, расщепляющих ДНК с образованием неспаренных 3' дезокситимидиновых нуклеотидов. Согласно данному изобретению конкретным примером такой эндонуклеазы является, но не ограничивается им, эндонуклеаза XcmI. Схема получения линейного Т-вектора (pBL-T) согласно настоящему изобретению представлена на Фиг.1. Схема соответствующей кольцевой плазмиды-предшественника pBL-1 представлена на Фиг.5. Полная нуклеотидная последовательность плазмиды предшественника (pBL-1), содержащей два сайта узнавания XcmI, расположенные в центре области полилинкера в противоположной ориентации и образующие при расщеплении указанной рестриктазой непарные выступающие одиночные остатки дезокситимидина на 3'-концах цепей ДНК, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2.The vector can be obtained using standard genetic engineering methods, plasmid pUC18 (EP 0316378) and chemically synthesized oligonucleotides [Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989]. For example, a linear T-vector can be obtained by PCR, as well as by restriction of a precursor plasmid carrying a cassette consisting of a tandem of restriction endonuclease recognition sites located on both complementary DNA strands that cleave DNA to form unpaired 3 'deoxythymidine nucleotides. According to the present invention, a specific example of such an endonuclease is, but is not limited to, XcmI endonuclease. The scheme for obtaining a linear T-vector (pBL-T) according to the present invention is presented in Fig.1. A schematic diagram of the corresponding circular pBL-1 precursor plasmid is shown in FIG. 5. The complete nucleotide sequence of the precursor plasmid (pBL-1), containing two XcmI recognition sites, located in the center of the polylinker region in the opposite orientation and forming unpaired protruding single deoxythymidine residues at the 3'-ends of the DNA chains upon cleavage by the specified restriction enzyme, is presented in the sequence listing under number SEQ ID NO: 2.
Разработанное семейство векторов pBL-T сочетает полезные свойства «нетранскрибируемых» векторов для клонирования сложных GC- и AT- богатых последовательностей, позволяет вести прямое клонирование ПЦР продуктов и обладает удобным протяженным полилинкером для обеспечения удобства сборки модульных конструкций. Векторы pBL могут применяться для рутинного клонирования при отсутствии необходимости в проведении бело-голубого скрининга в виду очень высокой эффективности клонирования.The developed family of pBL-T vectors combines the useful properties of “non-transcribed” vectors for cloning complex GC- and AT-rich sequences, allows direct cloning of PCR products and has a convenient extended polylinker to ensure the convenience of assembly of modular structures. PBL vectors can be used for routine cloning when there is no need for blue-white screening due to the very high cloning efficiency.
Данный Т-вектор пригоден для лигирования с ПЦР-продуктами, полученными с помощью методов, хорошо известных специалисту в данной области техники с использованием термостабильной ДНК-полимеразы Taq или смесей полимераз, в состав которых входит ДНК-полимераза Taq.This T-vector is suitable for ligation with PCR products obtained using methods well known to a person skilled in the art using thermostable Taq DNA polymerase or polymerase mixtures, which include Taq DNA polymerase.
Лигирование вставки и Т-вектора проводят широко известными методами, например, с использованием фермента ДНК-лигазы фага Т4. Полученной смесью продуктов лигирования можно трансформировать бактериальную клетку, предпочтительно бактерию, принадлежащей к роду Escherichia, восприимчивую к подобной трансформации указанной плазмидой. Выбор конкретной клетки не является критическим, поскольку методология и приемы трансформации хорошо известны специалисту в данной области техники.Ligation of the insert and T-vector is carried out by well-known methods, for example, using the enzyme of the T4 phage DNA ligase. The resulting mixture of ligation products can transform a bacterial cell, preferably a bacterium belonging to the genus Escherichia, susceptible to such transformation by the indicated plasmid. The choice of a particular cell is not critical, since the methodology and methods of transformation are well known to those skilled in the art.
Основные свойства pBL-1 в сравнении с ближайшими аналогами суммированы в Таблице 1.The main properties of pBL-1 in comparison with the closest analogues are summarized in Table 1.
Один из вариантов воплощения настоящего изобретения обеспечивает набор для клонирования одного или нескольких полинуклеотидов. В дополнение к вектору согласно настоящего изобретения указанный набор содержит инструкцию, информирующую пользователя о том, каким образом используется указанный набор. Также дополнительными компонентами, обычно присутствющими в указанном наборе, являются ДНК полимераза без корректирующей активности, недискриминирующая ДНК полимераза или терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза и один или несколько компонентов, выбранных их лигазы, киназы, ДНК полимеразы с корректирующей активностью, одна или несколько пар праймеров для секвенирования, одна или несколько пар праймеров для амплификации, компетентные клетки, дезоксинуклеотидтрифосфаты, дидезоксинуклеотидтрифосфаты, аналоги нуклеотидов и реакционные буферы, пригодные для осуществления любой из стадий модификации и клонирования полинуклеотидов.One embodiment of the present invention provides a kit for cloning one or more polynucleotides. In addition to the vector according to the present invention, said kit contains instructions informing the user about how the kit is used. Also additional components that are usually present in this set are DNA polymerase without corrective activity, non-discriminatory DNA polymerase or terminal deoxynucleotidyl transferase and one or more components of their chosen ligase, kinase, DNA polymerase with corrective activity, one or more pairs of sequencing primers, one or several pairs of amplification primers, competent cells, deoxynucleotide triphosphates, dideoxynucleotide triphosphates, nucleotide analogs and reaction nnye buffers suitable for carrying out any of the steps of modifying and cloning polynucleotides.
Особенности полученного Т-вектора и результаты его практического применения приведены на следующих Фигурах.Features of the obtained T-vector and the results of its practical application are shown in the following Figures.
Краткое описание Фигур:Brief Description of Figures:
На Фигуре 1 показана схема последовательного получения плазмид pBL-3, PEL-2, pBL-1 и Т-вектора pBL-T. Обозначения:The Figure 1 shows the sequence diagram for obtaining plasmids pBL-3, PEL-2, pBL-1 and T-vector pBL-T. Designations:
LacZ - ген N-концевого фрагмента бета-галактозидазы Е.coli. Стрелкой обозначен промотер гена LacZ; (XcmI)х2 - блок сайтов узнавания эндонуклеазы рестрикции XcmI; пунктирной линией обозначены стадии ПЦР, под линией указаны названия праймеров для инвертированного ПЦР.LacZ - gene of the N-terminal fragment of beta-galactosidase E. coli. The arrow indicates the promoter of the LacZ gene; (XcmI) x2 is a block of XcmI restriction endonuclease recognition sites; the dashed line indicates the PCR stage; under the line, the names of the primers for inverted PCR are indicated.
На Фигуре 2 показана карта линейного вектора pBL-T. Используются следующие обозначения: Amp (bla) - ген β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину; bla promoter - промотер гена β-лактамазы; pUC ori - участок инициации репликации; SQ Blanf primer, SQ primer - сайты отжига праймеров для секвенирования области вставки и полилинкера. Стрелками указаны направления транскрипции генов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания. Звездочками обозначены неспаренные 3'Т нуклеотиды.Figure 2 shows a map of the linear vector pBL-T. The following notation is used: Amp (bla) - β-lactamase gene that provides resistance to ampicillin; bla promoter - promoter of the β-lactamase gene; pUC ori — replication initiation site; SQ Blanf primer, SQ primer - primer annealing sites for sequencing the insertion area and polylinker. Arrows indicate the direction of gene transcription. The recognition sites of restriction endonucleases are in italics, and the numbers of nucleotides at the cutting points are indicated in parentheses. Asterisks indicate unpaired 3'T nucleotides.
На Фигуре 3 показана карта плазмиды pBL-3. Используются следующие обозначения: Amp (bla) - ген β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину; bla promoter - промотер гена β-лактамазы; pUC ori - участок инициации репликации; SQ Blanf primer, SQ primer - сайты отжига праймеров для секвенирования области вставки и полилинкера. Стрелками указаны направления транскрипции генов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.Figure 3 shows a map of plasmid pBL-3. The following notation is used: Amp (bla) - β-lactamase gene that provides resistance to ampicillin; bla promoter - promoter of the β-lactamase gene; pUC ori — replication initiation site; SQ Blanf primer, SQ primer - primer annealing sites for sequencing the insertion area and polylinker. Arrows indicate the direction of gene transcription. The recognition sites of restriction endonucleases are in italics, and the numbers of nucleotides at the cutting points are indicated in parentheses.
На Фигуре 4 показана карта плазмиды pBL-2. Используются следующие обозначения: Amp (bla) - ген β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину; bla promoter - промотер гена β-лактамазы; pUC ori - участок инициации репликации; SQ Blanf primer, SQ primer - сайты отжига праймеров для секвенирования области вставки и полилинкера. Стрелками указаны направления транскрипции генов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.Figure 4 shows a map of plasmid pBL-2. The following notation is used: Amp (bla) - β-lactamase gene that provides resistance to ampicillin; bla promoter - promoter of the β-lactamase gene; pUC ori — replication initiation site; SQ Blanf primer, SQ primer - primer annealing sites for sequencing the insertion area and polylinker. Arrows indicate the direction of gene transcription. The recognition sites of restriction endonucleases are in italics, and the numbers of nucleotides at the cutting points are indicated in parentheses.
На Фигуре 5 показана карта плазмиды pBL-1. Используются следующие обозначения: Amp (bla) - ген β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину; bla promoter - промотер гена β-лактамазы; pUC ori - участок инициации репликации; MCS - полилинкер; pUC18 fragment - фрагмент гомологичный pUC18; SQ Blanf primer, SQ primer - сайты отжига праймеров для секвенирования области вставки полилинкера. Стрелками указаны направления транскрипции генов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.Figure 5 shows a map of plasmid pBL-1. The following notation is used: Amp (bla) - β-lactamase gene that provides resistance to ampicillin; bla promoter - promoter of the β-lactamase gene; pUC ori — replication initiation site; MCS - polylinker; pUC18 fragment — fragment homologous to pUC18; SQ Blanf primer, SQ primer — primer annealing sites for sequencing the polylinker insertion region. Arrows indicate the direction of gene transcription. The recognition sites of restriction endonucleases are in italics, and the numbers of nucleotides at the cutting points are indicated in parentheses.
На Фигуре 6 показана электрофореграмма вектора pBL-1, линеаризованного эндонуклеазой рестрикции XcmI с образованием pBL-T. Разделение проведено в 1%-ном агарозном геле, визуализация окрашиванием бромистым этидием (цвета инвертированы).Figure 6 shows the electrophoregram of the vector pBL-1 linearized with the restriction endonuclease XcmI to form pBL-T. Separation was carried out on a 1% agarose gel, visualization by staining with ethidium bromide (colors inverted).
Обозначения: 2U; 0,3U; 0,09U; 0,03U - продукты рестрикции 1 мкг плазмиды pBL-1 2U; 0,3U; 0,09U и 0,03U единицами активности XcmI, соответственно. Pink - контрольная рестрикционная смесь, в которую не вносили фермент. Объем реакции 50 мкл, инкубация 16 ч. при 37°С. Pk - не инкубировавшаяся при при 37°С плазмида. М - маркер размера. Размер полос маркера указан в п.о. Положение pBL-T и pBL-1 указано стрелкой.Designations: 2U; 0.3U; 0.09U; 0.03U - restriction products of 1 μg of plasmid pBL-1 2U; 0.3U; 0.09U and 0.03U units of activity XcmI, respectively. Pink is a control restriction mixture in which the enzyme was not added. The reaction volume is 50 μl, incubation for 16 hours at 37 ° C. Pk is a non-incubated plasmid at 37 ° C. M is the size marker. The size of the marker strips is indicated in bp. The positions of pBL-T and pBL-1 are indicated by the arrow.
Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.The present invention will be described in more detail below with reference to the following non-limiting Examples.
Пример 1 Получение плазмиды pBL-3Example 1 Obtaining plasmids pBL-3
Для изменения участка клонирования и удаления ОРС бета-галактозидазы был проведен сайт-направленный мутагенез плазмиды pUC18 методом инвертированной ПЦР с использованием праймеров IP-PL-F (SEQ ID NO:3) и IP-PL-R (SEQ ID NO:4).To change the site of cloning and removal of ORS beta-galactosidase, site-directed mutagenesis of plasmid pUC18 was performed by inverted PCR using primers IP-PL-F (SEQ ID NO: 3) and IP-PL-R (SEQ ID NO: 4).
Сайт-направленный мутагенез методом инвертированной ПЦР проводили по [Michael P. Weiner, Tim Gackstetter, Gina L. Costa, John C. Bauer, and Keith A. Kretz. Site-directed Mutagenesis using PCR in Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends. Eds. A.M. Griffin and H.G.Griffin. ISBN 1-898486-01-8 1995 Horizon Scientific Press, PO Box 1, Wymondham, Norfolk, U.K.] с модификациямиInverted PCR site-directed mutagenesis was performed according to [Michael P. Weiner, Tim Gackstetter, Gina L. Costa, John C. Bauer, and Keith A. Kretz. Site-directed Mutagenesis using PCR in Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends. Eds. A.M. Griffin and H. G. Griffin. ISBN 1-898486-01-8 1995 Horizon Scientific Press,
Каждый праймерный олигонуклеотид фосфорилировали отдельно. Реакцию проводили в буфере Трис-HCl, рН 7,5, содержащем 10 мМ MgCl2, 50 мМ дитиотреитола, 1 мМ АТФ и 100 пМ олигонуклеотида, 1 ед. полинуклеотидкиназы фага Т4 (Сибэнзим, Россия) в течение 30 минут при 37°С. После окончания реакции фермент инактивировали при 65°С 10 мин. Затем реакционную смесь использовали для проведения инвертированной ПЦР в количестве 20 пМ на реакцию. ПЦР проводили с использованием набора реактивов "Encyclo PCR kit" (ЗАО Евроген, Россия) по инструкции производителя. ПЦР проводили по следующей схеме: 1 цикл: 4 мин. 94°С, 2 мин. 50°С, 2 мин. 72°С; затем 11 циклов 1 мин. - 94°С, 1 мин. - 55°С, 2 мин. 72°С. После чего разводили вдвое однократным буфером эндонуклеазы DpnI добавляли эндонуклеазу DpnI (10 U) и инкубировали при 37°С 30 мин., затем вносили полимеразу Pfu (2.5U) и переносили на 72°С и инкубировали еще 30 мин. Полученную смесь очищали, используя набор "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System" («Promega», CHIA) по протоколу производителя. После чего проводили лидирование очищенного продукта инвертированной ПЦР с использованием ДНК-лигазы фага Т4 и стандартного буферного раствора (Fermentas, Литва) в течение 1 часа при комнатной температуре. Полученной лигазной смесью трансформировали клетки Е.coli штамма ТОР10 (Invitrogen, США), с генотипом: F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 nupG recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endA1. Для этого к 100 мкл замороженной суспензии клеток Е.coli добавляли 5 мкл лигазной смеси, инкубировали на льду 30 минут для сорбции плазмидной ДНК, нагревали до 42 С на 60 секунд и инкубировали на льду 5 минут. После чего добавляли 800 мкл питательного бульона SOC и инкубировали при 37°С 60 минут. После инкубации переносили суспензию на чашку Петри с твердой агаризованной средой, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл агара, и помещали в термостат на 37 С 18 часов.Each primer oligonucleotide was phosphorylated separately. The reaction was carried out in Tris-HCl buffer, pH 7.5, containing 10 mM MgCl 2 , 50 mM dithiothreitol, 1 mM ATP and 100 pM oligonucleotide, 1 unit. polynucleotide kinase of phage T4 (Sibenzym, Russia) for 30 minutes at 37 ° C. After the reaction, the enzyme was inactivated at 65 ° C for 10 min. Then the reaction mixture was used to conduct inverted PCR in an amount of 20 pM per reaction. PCR was performed using the Encyclo PCR kit reagent kit (ZAO Evrogen, Russia) according to the manufacturer's instructions. PCR was performed as follows: 1 cycle: 4 min. 94 ° C, 2 min. 50 ° C, 2 min. 72 ° C; then 11
Колонии Е.coli, отобранные в результате бело-голубого скрининга (целевые клоны были лишены гена галактозидазы и поэтому давали белые колонии), анализировали методом ПЦР с клонов, с использованием праймерных олигонуклеотидов к конститутивным элементам последовательностей исходной и мутантной плазмид олигонуклеотидов SQ-BlaN-F (SEQ ID NO:5) и M13Rev (SEQ ID NO:6).E. coli colonies selected as a result of blue-white screening (target clones were devoid of the galactosidase gene and therefore gave white colonies) were analyzed by PCR from the clones using primer oligonucleotides to constitutive elements of the sequences of the original and mutant SQ-BlaN-F oligonucleotide plasmids (SEQ ID NO: 5) and M13Rev (SEQ ID NO: 6).
4 клона наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Amp и выделяли плазмидную ДНК при помощи набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва) по протоколу производителя. Для полученных генетических конструкций определяли нуклеотидную последовательность методом ПЦР-секвенирования с использованием олигонуклеотидов SQ-BlaN-F (SEQ ID NO:5) и M13Rev (SEQ ID NO:6). Последовательность полученной плазмиды pBL-3 представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:7.4 clones were grown in 5 ml of 2xYT-Amp nutrient broth and plasmid DNA was isolated using the GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Lithuania) according to the manufacturer's protocol. For the obtained genetic constructs, the nucleotide sequence was determined by PCR sequencing using SQ-BlaN-F oligonucleotides (SEQ ID NO: 5) and M13Rev (SEQ ID NO: 6). The sequence of the obtained plasmid pBL-3 is presented in the sequence Listing under the number SEQ ID NO: 7.
Пример 2 Получение «нетранскрибируемой» плазмиды pBL-2Example 2 Obtaining a "Non-Transcribed" Plasmid pBL-2
Для удаления pLac промотора был проведен сайт-направленный мутагенез плазмиды pBL-3 методом инвертированной ПЦР с использованием праймеров IP-TFpBL-F (SEQ ID NO:8) и IP-TFpBL-R (SEQ ID NO:9).To remove the pLac promoter, site-directed mutagenesis of the pBL-3 plasmid was performed by inverted PCR using IP-TFpBL-F primers (SEQ ID NO: 8) and IP-TFpBL-R (SEQ ID NO: 9).
Сайт-направленный мутагенез методом инвертированной ПЦР проводили как написано в примере 1. Для полученных генетических конструкций определяли нуклеотидную последовательность методом ПЦР-секвенирования с использованием олигонуклеотидов SQ-BlaN-F (SEQ ID NO:5) и SQprimer (SEQ ID NO:10). Последовательность полученной плазмиды pBL-2 представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:11.Site-directed mutagenesis by inverted PCR was performed as described in Example 1. For the obtained genetic constructs, the nucleotide sequence was determined by PCR sequencing using SQ-BlaN-F oligonucleotides (SEQ ID NO: 5) and SQprimer (SEQ ID NO: 10). The sequence of the obtained plasmid pBL-2 is presented in the sequence Listing under the number SEQ ID NO: 11.
Пример 3 Получение плазмиды pBL-1Example 3 Obtaining plasmids pBL-1
Для введения кассеты, содержащей два сайта узнавания эндонуклеазы XcmI, расположенные в противоположной ориентации, провели сайт-направленный мутагенез плазмиды pBL-2 методом инвертированной ПЦР с использованием праймеров IP-XpBL-F (SEQ ID NO:12) и IP-XpBL-R (SEQ ID NO:13). Сайт-направленный мутагенез методом инвертированной ПЦР проводили как написано в примере 1. Для полученных генетических конструкций определяли нуклеотидную последовательность методом ПЦР-секвенирования с использованием олигонуклеотидов SQ-BlaN-F (SEQ ID NO:5) и SQprimer (SEQ ID NO:10). Последовательность полученной плазмиды pBL-1 представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2To insert a cassette containing two XcmI endonuclease recognition sites located in the opposite orientation, the site-directed mutagenesis of plasmid pBL-2 was performed by inverted PCR using primers IP-XpBL-F (SEQ ID NO: 12) and IP-XpBL-R ( SEQ ID NO: 13). Site-directed mutagenesis by inverted PCR was performed as described in Example 1. For the obtained genetic constructs, the nucleotide sequence was determined by PCR sequencing using SQ-BlaN-F oligonucleotides (SEQ ID NO: 5) and SQprimer (SEQ ID NO: 10). The sequence of the obtained plasmid pBL-1 is presented in the sequence Listing under the number SEQ ID NO: 2
Пример 4. Препаративпое получение линейного вектора PBL-TExample 4. Preparative preparation of the linear vector PBL-T
Аликвоту компетентных клеток (100 мкл) Е.coli штамма ТОРЮ (Invitrogen, США), трансформировали 50 пг плазмидной ДНК pBL-1, как описано в примере 1, и высевали на 2xYT-агар с ампициллином (50 мкг/мл). Отбирали колонии Е.coli с типичным фенотипом штамма ТОР10 и подращивали в течение 18 часов в 5 мл среды 2xYT с ампициллином (50 мкг/мл), проверяли наличие плазмиды минипрепаративным выделением пДНК (как описано в Примере 1 и создавали музей штамма E.coli ТОР10/pBL-1, добавляя к 1 мл аликвотам культуры глицерин до 15% с последующей заморозкой пробирок в жидком азоте. Для препаративного получения pBL-1 в две пробирки, содержащие по 5 мл среды 2xYT с ампициллином бактериологической петлей сеяли колонии штамма Е.coli TOP10/pBL-1, выращенные на агаризованной среде из музея штамма Е.coli TOP10/pBL-1. Пробирки помещали в термостат и инкубировали в течение 14-16 ч. при 37°С при перемешивании 260 об/мин. Затем выращенный посевной материал пересевали в соотношении 1:250 в две колбы, содержащие по 250 мл среды Terrific Broth (12 г/л триптона, 24 г/л дрожжевого экстракта, 4 мл/л глицерина, 0,017 М калия дигидрофосфата, 0,072 М калия гидрофосфата) и 50 мкг/мл ампициллина. Колбы помещали в термостат и инкубировали 48 ч. при 37°С при перемешивании 260 об/мин. Отделение биомассы от культуральной жидкости проводили центрифугированием, среднее количество биомассы составляло 10 г/л, содержание плазмиды - 30,5 мг/л.An aliquot of competent cells (100 μl) of E. coli TORU strain (Invitrogen, USA) was transformed with 50 pg of pBL-1 plasmid DNA as described in Example 1, and seeded on 2xYT agar with ampicillin (50 μg / ml). E. coli colonies with a typical phenotype of the
Выделяли сверхскрученную плазмидную ДНК щелочным лизисом, для этого осадок биомассы ресуспендировали в буферном растворе (0,05 М Трис-HCl, 0,01 М ЭДТА-Na, 0,05 М глюкозы, рН 8,0) в соотношении 10 мл раствора на 1 г биомассы, затем производили лизис клеток путем добавления равного объема раствора 1% додецилсульфата натрия и 0,2 М NaOH, и перемешивали суспензию покачиванием в течение 5 мин. Добавляли половинный объем нейтрализующего раствора, содержащего 3 М ацетата калия в 11% уксусной кислоте, и перемешивали суспензию покачиванием до получения равномерной взвеси белых хлопьев. Образовавшийся осадок отделяли фильтрованием через полиамидную ткань с ячейками 100 мкм и последующим центрифугированием в течение 10 мин при ускорении 12000 м/с2. Производили концентрирование неочищенного раствора плазмидной ДНК pBL-1 до объема 15 мл ультрафильтрацией с использованием картриджа с кассетой VIVAFLOW (размер пор 500 кДа, Sartorius Stedim, Германия).Supercoiled plasmid DNA was isolated by alkaline lysis; for this, the biomass pellet was resuspended in a buffer solution (0.05 M Tris-HCl, 0.01 M EDTA-Na, 0.05 M glucose, pH 8.0) in a ratio of 10 ml of solution per 1 g of biomass, then the cells were lysed by adding an equal volume of a solution of 1% sodium dodecyl sulfate and 0.2 M NaOH, and the suspension was stirred by shaking for 5 min. A half volume of a neutralizing solution containing 3 M potassium acetate in 11% acetic acid was added, and the suspension was stirred by swaying until a uniform suspension of white flakes was obtained. The resulting precipitate was separated by filtration through a polyamide tissue with 100 μm cells and subsequent centrifugation for 10 min with an acceleration of 12000 m / s 2 . The crude solution of plasmid DNA pBL-1 was concentrated to a volume of 15 ml by ultrafiltration using a cartridge with a VIVAFLOW cartridge (pore
Хроматографическую очистку сверхскрученной плазмидной ДНК проводили с использованием жидкостного хроматографа AKTApurifier (GE Healthcare), длина волны - 254 нм.Chromatographic purification of supercoiled plasmid DNA was performed using an AKTApurifier (GE Healthcare) liquid chromatograph with a wavelength of 254 nm.
Для отделения примесей РНК от плазмидной ДНК проводили гель-фильтрацию с использованием сорбента Sepharose 6 Fast flow (GE Healthcare). На колонку, предварительно уравновешенную буфером А (2,1 М (NH4)2SO4, 10 мМ ЭДТА, 100 мМ Трис-HCl, рН 7,5) наносили пробу ДНК, собирали фракцию, соответствующую первому пику, поглощающему на 254 нм (эта фракция содержит кольцевую ДНК).To separate RNA impurities from plasmid DNA, gel filtration was performed using a
Для отделения открытой кольцевой и линейной форм плазмидной ДНК проводили псевдоаффинную хроматографию с использованием сорбента PlasmidSelect Xtra (GE Healthcare). На колонку, уравновешенную буфером В (2 М (NH4)2SO4, 10 мМ ЭДТА, 100 мМ Трис-HCl, рН 7,5) наносили пробу ДНК после гель-фильтрации, затем, изменив направление потока через колонку, производили десорбцию суперспирализованной кольцевой ДНК буфером С (0,3 М NaCl, 1,7 М (NH4)2SO4, 10 мМ ЭДТА, 100 мМ Трис-HCl, рН 7,5), собирали фракцию, соответствующую первому пику, поглощающему на 254 нм (эта фракция содержит суперспирализованную кольцевую ДНК).To separate the open circular and linear forms of plasmid DNA, pseudo-affinity chromatography was performed using the PlasmidSelect Xtra sorbent (GE Healthcare). A DNA sample was applied to the column equilibrated with buffer B (2 M (NH 4 ) 2 SO 4 , 10 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, pH 7.5) after gel filtration, then, changing the flow direction through the column, desorption was performed supercoiled circular DNA with buffer C (0.3 M NaCl, 1.7 M (NH 4 ) 2 SO 4 , 10 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, pH 7.5), the fraction corresponding to the first absorbing peak at 254 was collected nm (this fraction contains supercoiled circular DNA).
Для окончательной очистки и концентрирования сверхскрученной плазмидной ДНК производили анионообменную хроматографию с использованием сорбента SOURCE 30 Q (GE Healthcare). Перед нанесением на колонку раствор пДНК после псевдоаффинной хроматографии разбавляли двумя объемами воды очищенной, затем наносили на колонку, уравновешенную буфером D (0,4 М NaCl, 10 мМ ЭДТА, 100 мМ Трис-HCl, рН 7,5), изменив направление потока через колонку, производили десорбцию очищенной кольцевой ДНК буфером Е (1,0 М NaCl, 10 мМ ЭДТА, 100 мМ Трис-HCl, рН 7,5), собирали фракцию, соответствующую первому пику, поглощающему на 254.For final purification and concentration of supercoiled plasmid DNA, anion exchange chromatography was performed using the SOURCE 30 Q sorbent (GE Healthcare). Before applying to the column, the pDNA solution after pseudo-affinity chromatography was diluted with two volumes of purified water, then applied to a column equilibrated with buffer D (0.4 M NaCl, 10 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, pH 7.5), changing the flow direction through column, the purified ring DNA was desorbed with buffer E (1.0 M NaCl, 10 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, pH 7.5), the fraction corresponding to the first absorbing peak at 254 was collected.
Полученный раствор сверхскрученной пДНК pBL-1 обессоливали ультрафильтрацией с помощью одноразовых ультрафильтрационных пробирок VIVASPIN 6 (размер пор 5 кДа, Sartorius Stedim, Германия). Измеряли концентрацию пДНК в полученном растворе при помощи спектрофотометрии, раствор разделяли на аликвоты по 5 мг пДНК и хранили при -20°С.The resulting solution of supercoiled pBL-1 pDNA was desalted by
Линеаризацию плазмиды pBL-1 проводили при помощи эндонуклеазы ферментом XcmI (New England Biolabs) по методике производителя. Экспериментально на небольших аликвотах плазмиды pBL-1 подбирали оптимальное соотношение фермента и субстрата, приводящее к распаду более 95% плазмиды. Результаты определения соотношения приведены на Фиг.6, видимое отсутствие сверхскрученной пДНК зафиксировано для соотношения составившее 0,3 ЕД фермента XcmI на 1 мкг плазмиды.The linearization of plasmid pBL-1 was performed using endonuclease enzyme XcmI (New England Biolabs) according to the manufacturer's method. Experimentally, in small aliquots of plasmids pBL-1, the optimal ratio of enzyme and substrate was selected, leading to the decay of more than 95% of the plasmid. The results of determining the ratio are shown in Fig.6, the apparent absence of supercoiled pDNA was fixed for a ratio of 0.3 PIECES of XcmI enzyme per 1 μg of plasmid.
Очистку полученного линейного вектора pBL-T проводили анионообменной хроматографией. Образец расщепленной рестриктазой XcmI ДНК (50 мкг) был нанесен без разбавления на колонку MonoQ (GE Healthcare), уравновешенную раствором А (0,1 М Трис-HCl, 0,4 М натрия хлорида, 10 мМ ЭДТА). После промывки колонки 10 мл раствора А, вели градиентную элюцию ДНК концентрацией хлорида натрия, профиль градиента 0-100% буфера В (0,1 М Трис-HCl, 1 М натрия хлорида, 10 мМ ЭДТА) за 60 мин при скорости потока 0,5 мл/мин. Основной пик, соответствующий линейной пДНК, элюировали при концентрации хлорида натрия около 760 мМ. Собранный основной пик обессоливали ультрафильтрацией, как указано выше, определяли концентрацию пДНК спектрофотометрически, разделяли раствор на аликвоты, содержащие по 100 нг пДНК, высушивали в вакуумной центрифуге и хранили закрытые пробирки при -20°С.The obtained linear vector pBL-T was purified by anion exchange chromatography. An XcmI restriction enzyme digested DNA sample (50 μg) was applied without dilution to a MonoQ column (GE Healthcare) equilibrated with solution A (0.1 M Tris-HCl, 0.4 M sodium chloride, 10 mM EDTA). After washing the column with 10 ml of solution A, a gradient elution of DNA was carried out with a concentration of sodium chloride, a gradient profile of 0-100% buffer B (0.1 M Tris-HCl, 1 M sodium chloride, 10 mm EDTA) for 60 min at a flow rate of 0, 5 ml / min. The main peak corresponding to linear pDNA was eluted at a sodium chloride concentration of about 760 mM. The collected main peak was desalted by ultrafiltration, as described above, the concentration of pDNA was determined spectrophotometrically, the solution was divided into aliquots containing 100 ng of pDNA, dried in a vacuum centrifuge, and closed tubes were stored at -20 ° С.
Пример 5 Эффективность клонирования открытых рамок считывания в нетранскрибируемый Т-вектор pBL-TExample 5 Cloning Efficiency of Open Reading Frames in the Non-Transcribed T-Vector pBL-T
Для определения эффективности клонирования открытых рамок считывания (ОРС) использовали ОРС кДНК гена дигидрофолатредуктазы мыши (DHFR, NM_000791.3), полученную методом ПЦР с праймеров AD-DHFR-F (SEQ ID NO:14) и AD-DHFR-R (SEQ ID NO:15) при использовании в качестве матрицы плазмиды pOptiVec (Invitrogen, США).Mouse dihydrofolate reductase gene (DHFR, NM_000791.3) obtained by PCR from primers AD-DHFR-F (SEQ ID NO: 14) and AD-DHFR-R (SEQ ID NO: 15) when using the plasmid pOptiVec as the template (Invitrogen, USA).
Продукт ПЦР, соответствующий полной ОРС DHFR, очищали из агарозного геля как описано в примере 1. Очищенный продукт лигировали с 50 нг линейного Т-вектора pBL-T, или 50 нг коммерчески доступного транскрибируемого Т-вектора с системой бело-голубой селекции pAL-TA (Евроген) (Т-1) или с 50 нг стандартного плазмидного вектора pUC18, линеаризованного эндонуклеазой рестрикции SmaI с образованием "тупых" концов молекулы. Во всех случаях использовали молярное соотношение вставки и вектора 3:1, объем лигирования 30 мкл, фермент для лигирования - ДНК-лигаза фага Т4 (Fermentas, Литва). Лигирование вели в течение 16 часов при температуре 14°С.The PCR product corresponding to the total ORF of DHFR was purified from an agarose gel as described in Example 1. The purified product was ligated with 50 ng of the linear T-vector pBL-T, or 50 ng of a commercially available transcribed T-vector with a white-blue selection system pAL-TA (Eurogen) (T-1) or with 50 ng of the standard plasmid vector pUC18 linearized by the restriction endonuclease SmaI with the formation of the "blunt" ends of the molecule. In all cases, the molar ratio of insert and vector was 3: 1, the ligation volume was 30 μl, and the ligation enzyme was DNA phage T4 phage ligase (Fermentas, Lithuania). Ligation was carried out for 16 hours at a temperature of 14 ° C.
Полученные смеси добавляли к компетентным клеткам штамма ТОР10 и вели трансформацию, как описано в Примере 1, после чего переносили суспензию трансформированных бактерий на две чашки Петри (100 мкл и 900 мкл) с агаризованной средой 2xYT, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, ИПТГ и X-Gal и помещали чашки в термостат на 37 С 18 часов.The resulting mixtures were added to the competent cells of the
Полученные данные о числе клонов представлены в Таблице 2.The obtained data on the number of clones are presented in Table 2.
Для 4-х колоний трансформантов, полученных при помощи вектора pBL-T, нарастили и выделили плазмиды и провели секвенирование области вставки. Установили, что все плазмиды содержат вставку; ориентация вставки в двух случаях была "прямой" и в двух случаях "обратной". Вектор pBL-T обеспечивал наибольшее число позитивных клонов, содержащих вставку ОРС, среди всех исследованных.For 4 colonies of transformants obtained using the pBL-T vector, plasmids were grown and isolated, and the insertion region was sequenced. It was found that all plasmids contain an insert; the insert orientation in two cases was “direct” and in two cases “reverse”. The pBL-T vector provided the largest number of positive clones containing an OPC insert among all studied.
Пример 6. Эффективность клонирования в нетранскрибируемый Т-вектор pBL-T GC-богатых фрагментов ДНК.Example 6. The efficiency of cloning into a non-transcribed T vector of pBL-T GC-rich DNA fragments.
Для определения эффективности клонирования GC богатых фрагментов использовали fr5EF - участок промоторной области фактора элонгации трансляции 1 китайского хомяка и frEBVTR - участок терминального повтора вируса Эппштейн-Барр.To determine the cloning efficiency of GC rich fragments, fr5EF, the region of the promoter region of
Участок промоторной области фактора элонгации трансляции 1 китайского. хомяка - fr5EF - получали методом ПЦР при помощи набора Encyclo (Евроген, Россия) по инструкции производителя. Использовали синтетические олигонуклеотиды AD-5CH-5F (SEQ ID NO:16) и AD-5CH-5R (SEQ ID NO:17), в качестве матрицы использовали с геномную ДНК, выделенную из культуры клеток СНО DG-44 (Invitrogen, США) при помощи набора Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, США) по инструкции производителя.The plot of the promoter region of the Chinese
Последовательность ПЦР-продукта fr5EF (1290 п.о.) представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:18, содержание GC - 70.34%. Последовательность ПЦР-продукта содержит сигнальные области эукариотического промотора, а также области прямых и обратных повторов.The sequence of the PCR product fr5EF (1290 bp) is presented in the List of sequences under the number SEQ ID NO: 18, the content of GC is 70.34%. The sequence of the PCR product contains the signal region of the eukaryotic promoter, as well as the region of direct and reverse repeats.
Участок концевого повтора вируса Эпштейн-Барр - frEBVTR - получали отжигом комплементарных олигонуклеотидов. Последовательность frEBVTR представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:19, содержание GC - 73.8%.The Epstein-Barr virus terminal repeat section, frEBVTR, was obtained by annealing complementary oligonucleotides. The sequence frEBVTR is presented in the List of sequences under the number SEQ ID NO: 19, the content of GC is 73.8%.
ПЦР, очистку продуктов ПЦР, дотирование и трансформацию проводили как описано в примерах 1 и 5. Дополнительно был использован коммерчески доступный транскрибируемый Т-вектор с системой бело-голубой селекции с повышенной стабильностью при хранении в растворе pGEM-T (Promega) (T-2). Полученные данные представлены в Таблице 3.PCR, purification of PCR products, subsidy and transformation were performed as described in examples 1 and 5. Additionally, a commercially available transcribed T-vector with a blue-and-white selection system with increased storage stability in pGEM-T (Promega) (T-2) solution was used. ) The data obtained are presented in Table 3.
Вектор pBL-T обеспечивал большее число позитивных клонов для обеих вставок, чем контрольный Т-вектор "Т-1", и лучшее отношения числа позитивных клонов к числу негативных клонов, чем контрольный Т-вектор "T-2" при сходном или большем числе позитивных клонов.The pBL-T vector provided a greater number of positive clones for both inserts than the control T-vector "T-1", and a better ratio of the number of positive clones to the number of negative clones than the control T-vector "T-2" with a similar or greater number positive clones.
Пример 7. Эффективность клонирования в нетранскрибируемый Т-вектор pBL-T АТ-богатых фрагментов ДНК.Example 7. The efficiency of cloning into a non-transcribed T-vector of pBL-T AT-rich DNA fragments.
Для определения эффективности клонирования АТ-богатых фрагментов использовали fr3EF - участок 3' нетранскрибируемой области гена фактора элонгации трансляции 1 китайского.To determine the cloning efficiency of AT-rich fragments, we used fr3EF, a portion of the 3 'non-transcribed region of the Chinese translational elongation factor gene.
Участок 3' нетранскрибируемой области фактора элонгации трансляции 1 китайского хомячка получали, как указано в Примере 6. Использовали синтетические олигонуклеотиды AD-3CH-1F (SEQ ID NO:20) и AD-3CH-1R (SEQ ID NO:21). Последовательность fr3EF (622 п.о.) представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:22, содержание AT 60,8%.A plot of the 3 ′ non-transcribed region of the Chinese hamster
ПЦР, очистку продуктов ПЦР, лигирование и трансформацию проводили как описано в Примере 6.PCR, purification of PCR products, ligation and transformation was performed as described in Example 6.
Измерения проводили в 3 параллелях и определяли среднее значение и стандартное отклонение. Полученные данные представлены в Таблице 4.The measurements were carried out in 3 parallels and the mean value and standard deviation were determined. The data obtained are presented in Table 4.
Вектор pBL-T обеспечивал большее число позитивных клонов для АТ-богатой вставки, чем "транскрибируемые" Т-вектора.The pBL-T vector provided a greater number of positive clones for the AT-rich insertion than the "transcribed" T-vectors.
Пример 10. Увеличение скорости рутинного молекулярного клонирования при использовании нетранскрибируемого Т-вектора pBL-T.Example 10. The increase in the speed of routine molecular cloning using the non-transcribed T-vector pBL-T.
Существенное ускорение рутинных процедур клонирования, включающее получение препарата очищенной плазмидной ДНК на следующий день после запуска реакции лигирования вектора pBL-T и вставки достигается применением нижеследующего протокола.A significant acceleration of the routine cloning procedures, including the preparation of purified plasmid DNA the day after the start of the ligation reaction of the pBL-T vector and insertion, is achieved using the following protocol.
После проведения ПЦР в стандартных условиях, очищенный ПЦР продукт лигируют с нетранскрибируемым Т-вектором pBL-T при помощи Т4-ДНК лигазы I час (Fermentas, Литва), трансформируют химически компетентные клетки Е.coli TOP10, подращивают трансформированные клетки 1 час в среде SOC и высевают 100-500 мкл культуры на чашку Петри, содержащую агаризованную среду 2xYT и 50 мкг/мл ампициллина. Чашку Петри инкубируют в течение ночи (14-16 ч) при +37°С и переносят несколько колоний в пробирки с 5 мл жидкой среды 2xYT и 50 мкг/мл ампициллина. Культуру растят 6 ч при перемешивании со скоростью 260 об/мин и температуре +37°С. Проводят выделение плазмид при помощи набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва) по протоколу производителя (20 мин) и определяют концентрацию пДНК при помощи набора Quant-iT dsDNA Broad-Range Assay Kit (Invitrogen, США) (5 мин). Выход пДНК при использовании нетранскрибируемого Т-вектора pBL-T с различными вставками находился в диапазоне 1,5-7,5 мкг с 5 мл культуры. Получаемые количества пДНК достаточны для проведения рестрикционного картирования или нескольких реакций секвенирования ДНК. Проведение вышеуказанной процедуры с использованием коммерчески доступного транскрибируемого Т-вектора Т-2 приводило к выходу пДНК в диапазоне 0,25-1,0 мкг с 5 мл бактериальной культуры. Такое количество пДНК недостаточно для проведения рестрикционного картирования или секвенирования области вставки и последующего получения рестрикционного фрагмента вставки для последующего субклонирования. Таким образом, увеличение копийности плазмид на основе нетранскрибируемого Т-вектора pBL-T по сравнению с плазмидами па основе распространенных Т-векторов позволяет существенно увеличить скорость рутинного молекулярного клонирования.After PCR under standard conditions, the purified PCR product is ligated to the non-transcribed TBL vector pBL-T using T4 DNA ligase I hour (Fermentas, Lithuania), chemically competent E. coli TOP10 cells are transformed, transformed cells are cultured for 1 hour in SOC medium and 100-500 μl of culture is plated on a Petri dish containing 2xYT agar medium and 50 μg / ml ampicillin. The Petri dish is incubated overnight (14-16 hours) at + 37 ° C and several colonies are transferred into tubes with 5 ml of 2xYT liquid medium and 50 μg / ml ampicillin. The culture is grown for 6 hours with stirring at a speed of 260 rpm and a temperature of + 37 ° C. Plasmids were isolated using the GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Lithuania) according to the manufacturer's protocol (20 min) and the concentration of pDNA was determined using the Quant-iT dsDNA Broad-Range Assay Kit (Invitrogen, United States) (5 min). The yield of pDNA using the non-transcribed TBL vector pBL-T with various inserts was in the range of 1.5-7.5 μg with 5 ml of culture. The resulting amounts of pDNA are sufficient for restriction mapping or several DNA sequencing reactions. Carrying out the above procedure using a commercially available transcribed T-vector T-2 led to the release of pDNA in the range of 0.25-1.0 μg with 5 ml of bacterial culture. Such an amount of pDNA is not sufficient for restriction mapping or sequencing of the insertion region and subsequent production of the restriction fragment of the insert for subsequent subcloning. Thus, an increase in the copy number of plasmids based on the non-transcribed T-vector pBL-T compared to plasmids based on the common T-vectors allows one to significantly increase the rate of routine molecular cloning.
Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.Although the invention has been described in detail with reference to Examples, it will be apparent to those skilled in the art that various changes can be made and equivalent replacements made, and such changes and replacements are not outside the scope of the present invention.
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011146242/10A RU2507266C2 (en) | 2011-11-16 | 2011-11-16 | ANTITEMPLATE PLASMID VECTOR pBL-T FOR CLONING OF COMPLEX GENOME SEQUENCES AND MULTIMODULE ASSEMBLY OF GENETICALLY ENGINEERED CONSTRUCTS (VERSIONS), AND SET CONTAINING THIS VECTOR |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011146242/10A RU2507266C2 (en) | 2011-11-16 | 2011-11-16 | ANTITEMPLATE PLASMID VECTOR pBL-T FOR CLONING OF COMPLEX GENOME SEQUENCES AND MULTIMODULE ASSEMBLY OF GENETICALLY ENGINEERED CONSTRUCTS (VERSIONS), AND SET CONTAINING THIS VECTOR |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2011146242A RU2011146242A (en) | 2013-05-27 |
| RU2507266C2 true RU2507266C2 (en) | 2014-02-20 |
Family
ID=48788971
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011146242/10A RU2507266C2 (en) | 2011-11-16 | 2011-11-16 | ANTITEMPLATE PLASMID VECTOR pBL-T FOR CLONING OF COMPLEX GENOME SEQUENCES AND MULTIMODULE ASSEMBLY OF GENETICALLY ENGINEERED CONSTRUCTS (VERSIONS), AND SET CONTAINING THIS VECTOR |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2507266C2 (en) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0738779A2 (en) * | 1990-09-27 | 1996-10-23 | Invitrogen Corporation | Direct cloning of PCR amplified nucleic acids |
| US20080166773A1 (en) * | 2007-01-08 | 2008-07-10 | Lucigen Corporation | Vectors, kits and methods for cloning dna |
| RU2008144131A (en) * | 2006-04-07 | 2010-05-20 | Георг-Аугуст-Универзитет Геттинген Штифтунг Эффентлихен Рехтс (De) | MESP2 SYNTHETIC SEQUENCE FOR PROTEIN SUBSTITUTION THERAPY |
| CN101948862A (en) * | 2010-09-13 | 2011-01-19 | 原平皓(天津)生物技术有限公司 | T vector construction method |
-
2011
- 2011-11-16 RU RU2011146242/10A patent/RU2507266C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0738779A2 (en) * | 1990-09-27 | 1996-10-23 | Invitrogen Corporation | Direct cloning of PCR amplified nucleic acids |
| RU2008144131A (en) * | 2006-04-07 | 2010-05-20 | Георг-Аугуст-Универзитет Геттинген Штифтунг Эффентлихен Рехтс (De) | MESP2 SYNTHETIC SEQUENCE FOR PROTEIN SUBSTITUTION THERAPY |
| US20080166773A1 (en) * | 2007-01-08 | 2008-07-10 | Lucigen Corporation | Vectors, kits and methods for cloning dna |
| CN101948862A (en) * | 2010-09-13 | 2011-01-19 | 原平皓(天津)生物技术有限公司 | T vector construction method |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 2009. Newsletter Techniques, September 2011: How to Create Your Perfect MCS, Addgene, (найдено он-лайн 31.07.2012) (найдено по адресу http://www.addgene.org/static/cms/files/How-to-create-a-perfect-MCS.pdf). * |
| HOHEISEL J.D. A cassette with seven unique restriction sites, including octanucleotide sequences: extension of multiple-cloning-site plasmids // Gene. 1989 Aug 1; 80(1):151-4. * |
| HOHEISEL J.D. A cassette with seven unique restriction sites, including octanucleotide sequences: extension of multiple-cloning-site plasmids // Gene. 1989 Aug 1; 80(1):151-4. JURGEN BROSIUS Superpolylinkers in Cloning and Expression Vectors", DNA. DECEMBER 1989, 8(10):759-777. HOHEISEL J.D. Extension of a pUC18-like polylinker by the octanucleotide recognition sites of NotI, Fsel, Sfil and Pad // Trends Genet. 1990 Nov; 6(11):346. Cloning vector pcDNA3.1+PA, complete sequence, * |
| HOHEISEL J.D. Extension of a pUC18-like polylinker by the octanucleotide recognition sites of NotI, Fsel, Sfil and Pad // Trends Genet. 1990 Nov; 6(11):346. Cloning vector pcDNA3.1+PA, complete sequence, Newsletter Techniques, September 2011: How to Create Your Perfect MCS, Addgene, (найдено он-лайн 31.07.2012) (найдено по адресу http://www.addgene.org/static/cms/files/How-to-create-a-perfect-MCS.pdf). * |
| JURGEN BROSIUS Superpolylinkers in Cloning and Expression Vectors", DNA. DECEMBER 1989, 8(10):759-777. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2011146242A (en) | 2013-05-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7244609B2 (en) | Synthetic genes and bacterial plasmids devoid of CpG | |
| Matsumoto et al. | Autogenous regulation of the gene for transcription termination factor rho in Escherichia coli: localization and function of its attenuators | |
| CA2542053C (en) | Dna cloning vector plasmids and methods for their use | |
| Hofer et al. | The superinfection exclusion gene (sieA) of bacteriophage P22: identification and overexpression of the gene and localization of the gene product | |
| EP2009102A2 (en) | Random mutagenesis and amplification of nucleic acid | |
| CA2073630C (en) | Method for synthesizing single-stranded stem-loop dnas, the products and uses therefor | |
| EP3733851A1 (en) | Improved promoter and carrier composed of same and application thereof | |
| JP2017537647A (en) | Fungal genome modification system and method of use | |
| US20210032636A1 (en) | Promoter and use thereof | |
| WO2021184766A1 (en) | Gene expression component, cloning vector constructed thereby and application | |
| JP2009523428A (en) | Linear vectors, host cells and cloning methods | |
| CN110499274B (en) | Genetic engineering rhodococcus and construction method and application thereof | |
| EP4399305A1 (en) | Class ii, type v crispr systems | |
| US20240200047A1 (en) | Enzymes with ruvc domains | |
| CN116917485A (en) | Recombinant microorganism expressing fucosyltransferase and method for producing 2' -fucosyllactose using the same | |
| CN116286931B (en) | Double-plasmid system for rapid gene editing of Ralstonia eutropha and application thereof | |
| RU2507266C2 (en) | ANTITEMPLATE PLASMID VECTOR pBL-T FOR CLONING OF COMPLEX GENOME SEQUENCES AND MULTIMODULE ASSEMBLY OF GENETICALLY ENGINEERED CONSTRUCTS (VERSIONS), AND SET CONTAINING THIS VECTOR | |
| Rogulin et al. | Plasmid pRARE as a Vector for Cloning to Construct a Superproducer of the Site-Specific Nickase N. Bsp D6I | |
| CN116200353A (en) | Carbonyl reductase mutant, recombinant bacterium and application thereof | |
| US20220081692A1 (en) | Combinatorial Assembly of Composite Arrays of Site-Specific Synthetic Transposons Inserted Into Sequences Comprising Novel Target Sites in Modular Prokaryotic and Eukaryotic Vectors | |
| EP3981879A1 (en) | Method of producing a recombinant protein in a host cell which has a disabled rhamnose metabolism as well as expression vectors, host cells and recombinant proteins thereof | |
| CN110878293B (en) | Application of bacillus licheniformis with deletion of yceD gene in production of heterologous protein | |
| CN108728457B (en) | Trehalose synthase gene optimization sequence and application thereof | |
| WO2021046486A1 (en) | Combinatorial assembly of composite arrays of site-specific synthetic transposons inserted into sequences comprising novel target sites in modular prokaryotic and eukaryotic vectors | |
| CA2156260A1 (en) | Bi-functional expression system |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20161117 |