RU2507262C1 - Mutant oxidase of d-amino acids (versions) - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnologies.

SUBSTANCE: invention may be used for detection of D-amino acids in complex specimen and in processes of fermentative synthesis of optically active substances, alpha-keto acids, cephalosporin antibiotics and other organic compounds using oxidases. New mutant forms of oxidase of D-amino acids from Trigonopsis variabilis yeast were obtained. As initial ferment, mutant oxidase of D-amino acids from Trigonopsis variabilis yeast was used with replacement of Cys108Phe. Proposed new mutant forms differ by the fact, that amino-acid residue of phenylalanine in position corresponding to position 54 in sequence of abovementioned oxidase of D-amino acids is replaced by one of the following residues - tyrosine or serine.

EFFECT: invention allows obtaining mutant oxidases of D-amino acids, characterised by better catalytic properties as compared to initial mutant and corresponding wild-type enzyme.

2 cl, 1 dwg, 2 tbl, 4 ex

Description

Изобретение относится к области генной и белковой инженерии и может быть использовано для детекции D-аминокислот в сложных образцах и в процессах ферментативного синтеза оптически активных веществ, альфа-кетокислот, цефалоспориновых антибиотиков и других органических соединений с использованием оксидаз.The invention relates to the field of genetic and protein engineering and can be used for the detection of D-amino acids in complex samples and in the processes of enzymatic synthesis of optically active substances, alpha-keto acids, cephalosporin antibiotics and other organic compounds using oxidases.

Получены новые мутантные формы оксидазы D-аминокислот (DAAO), характеризующиеся субстратной специфичностью по отношению к ряду D-аминокислот и их производных, отличной от субстратной специфичности фермента дикого типа из дрожжей Trigonopsis variabilis и от исходного фермента TvDAAO_C108F, использованного для их получения новых мутантных DAAO. В качестве основы для получения новых мутантных DAAO использовали последовательность кДНК, кодирующую аминокислотную последовательность мутантной оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis, содержащую аминокислотную замену CyslOSPhe (TvDAAO_C108F). Предложенные мутантные формы характеризуются тем, что в исходном мутанте TvDAAO_C108F аминокислотный остаток фенилаланина в положении, соответствующем положению 54 в аминокислотной последовательности оксидазы D-аминокислот из Trigonopsis variabilis, заменен на остаток тирозина (замена F54Y) или на остаток серина (замена F54S). Любая из этих замен может быть использована в комбинации с другими мутациями, обеспечивающими приобретение оксидазами D-аминокислот новых или улучшенных свойств.New mutant forms of D-amino acid oxidase (DAAO) were obtained, characterized by substrate specificity for a number of D-amino acids and their derivatives, different from the substrate specificity of the wild-type enzyme from the yeast Trigonopsis variabilis and from the original TvDAAO_C108F enzyme used to obtain new mutant DAAO . A cDNA sequence encoding the amino acid sequence of mutant D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis yeast containing the CyslOSPhe amino acid substitution (TvDAAO_C108F) was used as the basis for the preparation of new mutant DAAOs. The proposed mutant forms are characterized in that in the original TvDAAO_C108F mutant, the amino acid residue of phenylalanine at the position corresponding to position 54 in the amino acid sequence of D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis is replaced by a tyrosine residue (F54Y substitution) or a serine residue (F54S substitution). Any of these substitutions can be used in combination with other mutations providing the acquisition of new or improved properties by D-amino acid oxidases.

Настоящее изобретение относится к новым белкам, в частности мутантным оксидазам из дрожжей, которые обладают субстратной специфичностью, отличной от субстратной специфичности фермента дикого типа и исходного мутанта TvDAAO C108F по отношению к ряду D-аминокислот и их производных, к кДНК, кодирующей мутантные оксидазы D-аминокислот, к применению данных ферментов в аналитических тестах на содержание D-аминокислот в биологических и иных образцах, к наборам, включающим их, и в процессах биокаталитического получения оптически активных веществ, альфа-кетокислот и других органических соединений, окисления цефалоспорина С и его производных с использованием оксидаз.The present invention relates to new proteins, in particular mutant oxidases from yeast, which have substrate specificity different from the substrate specificity of the wild-type enzyme and the original TvDAAO C108F mutant with respect to a number of D-amino acids and their derivatives, to cDNA encoding mutant D-oxidases amino acids, to the use of these enzymes in analytical tests for the content of D-amino acids in biological and other samples, to kits including them, and in the processes of biocatalytic production of optically active substances, al pha-keto acids and other organic compounds; oxidation of cephalosporin C and its derivatives using oxidases.

ФАД-зависимая оксидаза D-аминокислот катализирует окислительное дезаминирование D-аминокислот до соответствующих α-кетокислот с образованием иона аммония и пероксида водорода:FAD-dependent oxidase of D-amino acids catalyzes the oxidative deamination of D-amino acids to the corresponding α-keto acids with the formation of ammonium ion and hydrogen peroxide:

Исключительно высокую специфичность оксидазы D-амикокислот к D-формам аминокислот применяют для выделения L-изомеров и ферментативного синтеза α-кетокислот из дешевых рацемических смесей аминокислот. Это используют, в частности, при синтезе синтонов - исходных соединений для получения оптически чистых лекарственных препаратов. В качестве примера можно привести процесс получения омапатрилата - ингибитора ангеотензинпревращающего фермента из рацемической смеси 6-гидроксинорлейцина с использованием оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabihs (Patei R.N, Enzvmatic synthesis of chiral intermediates for Omapatrilat, an antihypertensive drug. Biomol. Eng., 2001, v. 17, №6, p.167-182). Также фермент активно использован в аналитической биотехнологии для детекции D-аминокислот в биологических жидкостях, например, спинномозговой жидкости человека (Sacchi, S., Rosini, E., Caldinelli, L., Pollegioni, L. Biosensors for D-amino acid detection. Methods Mol. Biol, 2012, v.794, pp.313-324.). Помимо этого, необратимость реакции, катализируемой этим ферментом, и специфическая активность оксидазы D-аминокислот позволяют ее использовать для превращения цефалоспорина С в глутарил-7-аминоцефалоспорановую кислоту (гл-7-АЦК). Далее из гл-7-АЦК получают 7-аминоцефалоспорановую кислоту, которая является исходным соединением при синтезе полусинтетических цефалоспориновых антибиотиков различных поколений (Pilone M.S., Buto S., Pollegioni L. A process for bioconversion of cephalosporin С by Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase. Biotechnol. Lett., 1995, V.17, №2, p.199-204).The extremely high specificity of D-amino acid oxidase for D-forms of amino acids is used to isolate L-isomers and enzymatic synthesis of α-keto acids from cheap racemic mixtures of amino acids. This is used, in particular, in the synthesis of synthons - the starting compounds for the preparation of optically pure drugs. An example is the process of producing omapatrilate, an angiotensin converting enzyme inhibitor from a racemic mixture of 6-hydroxyinorleucin using D-amino acid oxidase from the yeast Trigonopsis variabihs (Patei RN, Enzvmatic synthesis of chiral intermediates for Omapatrilat, an antihypertensive intensive drug Biomol. 2001. , v. 17, No. 6, p. 167-182). The enzyme is also actively used in analytical biotechnology for the detection of D-amino acids in biological fluids, for example, human cerebrospinal fluid (Sacchi, S., Rosini, E., Caldinelli, L., Pollegioni, L. Biosensors for D-amino acid detection. Methods Mol. Biol, 2012, v. 794, pp. 313-324.). In addition, the irreversibility of the reaction catalyzed by this enzyme and the specific activity of the D-amino acid oxidase allow it to be used to convert cephalosporin C to glutaryl-7-aminocephalosporanic acid (hl-7-ACA). Then, 7-aminocephalosporanoic acid is obtained from hl-7-ACA, which is the starting compound for the synthesis of semisynthetic cephalosporin antibiotics of various generations (Pilone MS, Buto S., Pollegioni L. A process for bioconversion of cephalosporin C by Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase Biotechnol. Lett., 1995, V.17, No. 2, p. 199-204).

Оксидазы D-аминокислот широко распространены в природе и могут быть выделены из разнообразных микроорганизмов (бактерий, дрожжей, микроскопических грибов, водорослей), а также моллюсков, рыб, рептилий, птиц и млекопитающих. Подробный список известных источников оксидаз D-аминокислот можно найти в обзорах (Тишков В.И., Хороненкова С.В. Оксидаза D-аминокислот: структура, механизм действия и практическое применение. Биохимия, 2005, т.70, №1, с.51-67; Pollegioni, L. Molla, G. New biotech applications from evolved D-amino acid oxidases. Trends Biotechnol., 2011, v.29, p.276-283). Многие из генов, кодирующих данные ферменты, были клонированы и секвенированы, поэтому их можно получать с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Последовательность кДНК, кодирующую оксидазу D-аминокислот, встраивают в генно-инженерный вектор (плазмида, фаг и т.д.), который используют для трансформации микроорганизмов, например, бактерии E.coli или метилотрофные дрожжи Hansenida polymorpha, затем экспрессирующие желаемый ферментный продукт.D-amino acid oxidases are widespread in nature and can be isolated from a variety of microorganisms (bacteria, yeast, microscopic fungi, algae), as well as mollusks, fish, reptiles, birds and mammals. A detailed list of known sources of D-amino acid oxidases can be found in the reviews (Tishkov V.I., Khoronenkova S.V. D-amino acid oxidase: structure, mechanism of action and practical application. Biochemistry, 2005, vol. 70, No. 1, p. 51-67; Pollegioni, L. Molla, G. New biotech applications from evolved D-amino acid oxidases. Trends Biotechnol., 2011, v.29, p. 276-283). Many of the genes encoding these enzymes were cloned and sequenced, so they can be obtained using recombinant DNA technology. The cDNA sequence encoding D-amino acid oxidase is inserted into a genetic engineering vector (plasmid, phage, etc.), which is used to transform microorganisms, for example, E. coli bacteria or Hansenida polymorpha methylotrophic yeast, which then express the desired enzyme product.

Основными недостатками известных природных и рекомбинантных оксидаз D-аминокислот дикого типа и их мутантных форм являются:The main disadvantages of the known natural and recombinant wild-type D-amino acid oxidases and their mutant forms are:

1) во-первых, неоптимальный спектр субстратной специфичности, что проявляется или в низкой каталитической активности с рядом природных и неприродных субстратов, или в неоптимальном соотношении активностей между различными D-аминокислотами. Например, с D-аланином большинство оксидаз D-аминокислот проявляют очень близкую или даже более высокую каталитическую активность, чем с D-серином. Поэтому такие ферменты не могут быть использованы в биосенсорах для селективного определения D-серина в сложных биологических объектах (например, в спинномозговой жидкости) в присутствии сравнимых концентраций D-аланина. В случае с цефалоспорином С каталитической активностью обладают только ферменты из дрожжей T.variabilis и Rhodotorula gracilis, причем в случае последнего фермента эта активность не очень высока (Pollegioni L., Caldinelli L., Molla G. et al. Catalytic properties of D-amino acid oxidase in cephalosporin С bioconversion: a comparison between proteins from different sources. Biotechnol. Prog., 2004, v.20, №2, p.467-473).1) firstly, a non-optimal spectrum of substrate specificity, which is manifested either in low catalytic activity with a number of natural and non-natural substrates, or in a non-optimal ratio of activities between different D-amino acids. For example, with D-alanine, most D-amino acid oxidases exhibit very close or even higher catalytic activity than with D-serine. Therefore, such enzymes cannot be used in biosensors for the selective determination of D-serine in complex biological objects (for example, cerebrospinal fluid) in the presence of comparable concentrations of D-alanine. In the case of cephalosporin C, only enzymes from the yeast T. variabilis and Rhodotorula gracilis have catalytic activity, and in the case of the latter enzyme this activity is not very high (Pollegioni L., Caldinelli L., Molla G. et al. Catalytic properties of D-amino acid oxidase in cephalosporin C bioconversion: a comparison between proteins from different sources. Biotechnol. Prog., 2004, v.20, No. 2, p.467-473).

2) вторым важным недостатком является невысокая температурная и операционная стабильность ферментов. Среди известных оксидаз D-аминокислот наиболее стабильным при высоких температурах является фермент из дрожжей T.variabilis (TvDAAO) (Тишков В.И., Хороненкова С.В. Оксидаза D-аминокислот: структура, механизм действия и практическое применение. Биохимия, 2005, т.70, №1, с.51-67).2) the second important disadvantage is the low temperature and operational stability of the enzymes. Among the known D-amino acid oxidases, the enzyme from T.variabilis yeast (TvDAAO) is the most stable at high temperatures (Tishkov V.I., Khoronenkova S.V. D-amino acid oxidase: structure, mechanism of action and practical application. Biochemistry, 2005, t.70, No. 1, p. 51-67).

Благодаря наилучшей среди оксидаз D-аминокислот каталитической активности с цефалоспорином С наиболее перспективной для практического применения в процессах синтеза цефалоспориновых антибиотиков в настоящее время является оксидаза D-аминокислот из T.variabilis. Однако для практического применения фермента необходимо улучшать его каталитические характеристики с цефалоспорином С и стабильность. Одним из подходов для решения поставленной задачи является мутагенез аминокислотных остатков целевого белка.Due to the best catalytic activity among cephalosporin C among D-amino acid oxidases, D-amino acid oxidase from T. variabilis is currently the most promising for practical use in the synthesis of cephalosporin antibiotics. However, for practical use of the enzyme, it is necessary to improve its catalytic performance with cephalosporin C and stability. One approach to solving this problem is the mutagenesis of the amino acid residues of the target protein.

В настоящее время наибольшее количество экпериментов по мутагенезу оксидазы D-аминокислот выполнено для рекомбинантного фермента из дрожжей R.gracilis (см. обзор Pollegioni, L., Sacchi, S., Caldinelli, L., Boselli, A., Pilone, M.S., Piubelli, L., Molla, G. Engineering the properties of D-amino acid oxidases by a rational and a directed evolution approach. Curr. Protein Pept. Sci., 2007, v.8, p.600-618.). Для фермента из T.variabilis подобных работ опубликовано немного. В двух работах с использованием метода направленного мутагенеза изучали роль консервативных остатков His324 и Asp206 в катализе и связывании FAD (Lin L.L., Wang W.C., Ju S.S. The role of a conserved histidine residue, His324, in Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase. FEMS Microbiol. Lett., 1999, v.176, №2, p.443-448; Ju S.S., Lin L.L., Wang W.C., Hsu W.H. A conserved aspartate is essential for FAD binding and catalysis in the D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis. FEBS Lett, 1998, v.436, №1, p.119-122). Замены по остаткам His324 и Asp206 сильно ухудшали кинетические свойства или приводили к полной потере активности. В третьей работе направленный мутагенез в молекуле TvDAAO шести остатков метионина на остаток лейцина показал, что эти замены повышают стабильность фермента против инактивации пероксидом водорода (Ju S.S., Lin L.L., Chien H.R., Hsu W.H. Substitution of the critical methionine residues in Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase with leucine enhances its resistance to hydrogen peroxide. FEMS Microbiol. Lett., 2000, v.186, №2, p.215-219). Однако четыре мутации (Met104Leu, Met226Leu, Met245Leu и Met339Leu) приводили к резкому ухудшению кинетических свойств с D-аланином в качестве субстрата. В случае мутации Met209Leu ухудшилась константа Михаэлиса К_М (увеличение в 3,3 раза). Currently, the largest number of experiments on the mutagenesis of D-amino acid oxidase was performed for the recombinant enzyme from the yeast R.gracilis (see the review of Pollegioni, L., Sacchi, S., Caldinelli, L., Boselli, A., Pilone, MS, Piubelli , L., Molla, G. Engineering the properties of D-amino acid oxidases by a rational and a directed evolutionary approach, Curr. Protein Pept. Sci., 2007, v. 8, p. 600-618.). There are few published works on the T.variabilis enzyme. Two studies using the directed mutagenesis method examined the role of conserved His324 and Asp206 residues in catalysis and FAD binding (Lin LL, Wang WC, Ju SS. The role of a conserved histidine residue, His324, in Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase. FEMS Microbiol . Lett., 1999, v.176, No. 2, p.443-448; Ju SS, Lin LL, Wang WC, Hsu WH A conserved aspartate is essential for FAD binding and catalysis in the D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis FEBS Lett, 1998, v. 436, No. 1, p. 119-122). Substitutions at His324 and Asp206 residues severely worsened kinetic properties or led to a complete loss of activity. In a third work, directed mutagenesis in the TvDAAO molecule of six methionine residues per leucine residue showed that these substitutions increase the stability of the enzyme against inactivation by hydrogen peroxide (Ju SS, Lin LL, Chien HR, Hsu WH Substitution of the critical methionine residues in Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase with leucine enhances its resistance to hydrogen peroxide. FEMS Microbiol. Lett., 2000, v.186, No. 2, p. 215-219). However, four mutations (Met104Leu, Met226Leu, Met245Leu and Met339Leu) led to a sharp deterioration in the kinetic properties with D-alanine as a substrate. In the case of the Met209Leu mutation, the Michaelis constant K _M deteriorated (a 3.3-fold increase).

В результате замены Met156Leu значение К_М возросло в 1,5 раза, однако за счет увеличения каталитической константы k_cat в 3 раза общая каталитическая эффективность (отношение k_cat/К_М) повысилась в два раза. Влияние замен в TvDAAO остатка Phe258 на остатки Tyr, Ser и Ala на свойства фермента недавно были изучены в работе (Комарова Н.В., Голубев И.В., Хороненкова С.В., Чубарь Т.А., Тишков В.И. Инженерия субстратной специфичности оксидазы D-аминокислот Trigonopsis variabilis: направленный мутагенез остатка Phe258. Биохимия, 2012, т.77, N10, с.1424-1433). Введение вышеуказанных аминокислотных замен приводит как к небольшой стабилизации (Phe258Tyr), так и дестабилизации фермента (Phe258Ser), причем изменение величины периода полуинактивации составляет не более 2 раз. В то же время эти замены привели к резкому изменению спектра субстратной специфичности. Увеличение размера боковой группы за счет замены Phe258Tyr приводит к ухудшению каталитической эффективности практически со всеми изученными D аминокислотами.As a result of the replacement of Met156Leu, the value of K _M increased by 1.5 times, however, due to an increase in the catalytic constant k _{cat by} 3 times, the total catalytic efficiency (ratio k _cat / K _M ) doubled. The effect of substitutions in TvDAAO of the Phe258 residue on Tyr, Ser, and Ala residues on the enzyme properties was recently studied in the work (Komarova N.V., Golubev I.V., Khoronenkova S.V., Chubar T.A., Tishkov V.I. Engineering of substrate specificity of D-amino acid oxidase of Trigonopsis variabilis: targeted mutagenesis of the Phe258 residue. Biochemistry, 2012, v. 77, N10, p. 1424-1433). The introduction of the above amino acid substitutions leads to both small stabilization (Phe258Tyr) and destabilization of the enzyme (Phe258Ser), with the change in the half-inactivation period not exceeding 2 times. At the same time, these substitutions led to a sharp change in the spectrum of substrate specificity. An increase in the size of the side group due to the replacement of Phe258Tyr leads to a deterioration in catalytic efficiency with almost all the studied D amino acids.

Наиболее значимые результаты были получены при замене остатка Cys108 на остатки Phe, Ser и А1а (Тишков В.И., Хороненкова С.В., Савина Л.И. Мутантные оксидазы D аминокислот. Патент РФ RU 2362806 от 23.07.2007, опубликовано 27.07.2009, Бюллетень "Изобретения. Полезные модели", 2009, №21). В результате введенных замен произошло изменение спектра субстратной специфичности, причем с рядом D-аминокислот наблюдалось улучшение каталитической эффективности по сравнению с ферментом дикого типа до 279%. Мутантные TvDAAO с заменами Cys108Phe и Cys108SAla были более чем в 3 раза эффективны в реакции окисления цефалоспорина С по сравнению с ферментом дикого. Среди трех полученных мутантов наиболее перспективным был фермент с заменой Cys108Phe, поскольку эта мутация также приводила и к повышению температурной стабильности. Поэтому для получения новых мутантных оксидаз D-аминокислот с измененной субстратной специфичностью в качестве исходного фермента была использована мутантная TvDAAO с заменой Cys108Phe, которая в дальнейшем будет обозначаться как TvDAAO_C108F.The most significant results were obtained when replacing the residue Cys108 with the residues Phe, Ser, and A1a (Tishkov V.I., Khoronenkova S.V., Savina L.I. Mutant oxidase D amino acids. Patent RF RU 2362806 of July 23, 2007, published July 27, 2007 .2009, Bulletin "Inventions. Utility Models", 2009, No. 21). As a result of the introduced substitutions, a change in the spectrum of substrate specificity occurred, and with a number of D-amino acids, an improvement in catalytic efficiency was observed compared with the wild-type enzyme to 279%. Mutant TvDAAOs with substitutions of Cys108Phe and Cys108SAla were more than 3 times effective in the oxidation of cephalosporin C compared with the wild enzyme. Among the three obtained mutants, the most promising was the enzyme with the replacement of Cys108Phe, since this mutation also led to an increase in temperature stability. Therefore, to obtain new mutant D-amino acid oxidases with altered substrate specificity, the mutant TvDAAO with the substitution Cys108Phe, which will be referred to as TvDAAO_C108F in the future, was used as the starting enzyme.

Техническая задача, решаемая посредством предлагаемого технического решения, состоит в получении новых мутантных форм оксидазы D-аминокислот из T.variabilis с субстратной специфичностью, отличной от субстратной специфичности фермента дикого или его мутанта DAAO_C108F.The technical problem solved by the proposed technical solution is to obtain new mutant forms of D-amino acid oxidase from T. variabilis with substrate specificity different from the substrate specificity of the wild enzyme or its mutant DAAO_C108F.

Технический результат, получаемый при реализации предлагаемого технического решения, состоит в изменении субстратной специфичности полученной формы оксидазы D-аминокислот по отношению к ряду D-аминокислот и их производных.The technical result obtained by the implementation of the proposed technical solution consists in changing the substrate specificity of the obtained form of oxidase of D-amino acids with respect to a number of D-amino acids and their derivatives.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать мутантную оксидазу D-аминокислот из T.variabilis, характеризующуюся аминокислотной последовательностью, которая соответствует аминокислотной последовательности мутантной оксидазы D-аминокислот из T.variabilis TvDAAO_C108F с заменой природного остатка фенилаланина в положении 54 или остатком тирозина, или остатком серина. Введение в 54-е положение мутантной TvDAAO_C108F вышеперечисленных остатков обеспечивает изменение субстратной специфичности модифицированного фермента по отношению к ряду D-аминокислот и их производных. Кроме того, помимо вышеуказанных замен аминокислотная последовательность мутантной оксидазы D-аминокислот из T.variabilis может содержать, по меньшей мере, одну дополнительную замену, обеспечивающую улучшение термостабильности, химической стабильности, изменение кинетических свойств, попарное или одновременное улучшение всех вышеуказанных свойств по сравнению с аминокислотной последовательностью оксидазы D-аминокислот из T.variabilis дикого типа.To achieve the technical result, it is proposed to use a mutant D-amino acid oxidase from T.variabilis, characterized by an amino acid sequence that corresponds to the amino acid sequence of a mutant D-amino acid oxidase from T.variabilis TvDAAO_C108F with the substitution of the natural phenylalanine residue at position 54 or the tyrosine residue or serine residue . Introduction to the 54th position of the mutant TvDAAO_C108F of the above residues provides a change in the substrate specificity of the modified enzyme with respect to a number of D-amino acids and their derivatives. In addition, in addition to the above substitutions, the amino acid sequence of the mutant D-amino acid oxidase from T. variabilis may contain at least one additional substitution, providing improved thermal stability, chemical stability, change in kinetic properties, pairwise or simultaneous improvement of all the above properties compared to amino acid D-amino acid oxidase sequence from wild-type T. variabilis.

В дальнейшем способ получения и преимущества полученных новых модифицированных оксидаз D-аминокислот будут рассмотрены с использованием примеров его реализации.In the future, the method of obtaining and advantages of the obtained new modified oxidases of D-amino acids will be considered using examples of its implementation.

Пример 1.Example 1

Получение новой мутантной оксидазы D-аминокислот Trigonopsis variabilis за счет введения в исходный фермент TvDAAO_C108F замены Phe54Tyr методом направленного мутагенеза.Obtaining a new mutant D-amino acid oxidase of Trigonopsis variabilis by introducing into the original TvDAAO_C108F enzyme the replacement of Phe54Tyr by directed mutagenesis.

Все генно-инженерные манипуляции, если не оговорено особо, осуществлены в соответствии с Манниатис Е., Фрич. Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М.: Мир, 1984 или в соответствии с инструкциями фирм-производителей приборов, наборов и других реагентов. Все эти методы хорошо известны специалистам в данной области.All genetic engineering manipulations, unless otherwise specified, are carried out in accordance with Manniatis E., Fritsch. E., Sambrook J. Molecular Cloning, M .: Mir, 1984 or in accordance with the instructions of manufacturers of devices, kits and other reagents. All of these methods are well known to those skilled in the art.

Направленный мутагенез в гене daao из T.variabilis проводили с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). В качестве матрицы для проведения направленного мутагенеза использовали плазмиду pKanDAAO_C108F, в которой под контролем сильного промотора РНК-полимеразы фага Т7 находится ген исходной мутантной оксидазы D-аминокислот с заменой Cys108Phe. Плазмида pKanDAAO_C108F получена из коммерчески доступной плазмиды pET33b (Novagen, США), в которую по сайтам рестрикции NcoI и BamHI встроен ген daao из T.variabilis с мутацией Cys108Phe (подробно получение этой плазмиды описано в примере 2 патента RU 2362806). Плазмида была выделена из клеток E.coli с использованием набора для выделения плазмид NucleoSpin® Plus согласно инструкции фирмы-производителя (Macherey-Nagel GmbH & Со. KG).Targeted mutagenesis in the daao gene from T. variabilis was performed using polymerase chain reaction (PCR). Plasmid pKanDAAO_C108F was used as a matrix for targeted mutagenesis, in which, under the control of a strong promoter of RNA polymerase of phage T7, the gene of the original mutant oxidase D-amino acid with the replacement of Cys108Phe is located. The plasmid pKanDAAO_C108F was obtained from the commercially available plasmid pET33b (Novagen, USA), into which the daao gene from T. variabilis with the Cys108Phe mutation was inserted at the NcoI and BamHI restriction sites (the preparation of this plasmid is described in detail in Example 2 of RU 2362806). The plasmid was isolated from E. coli cells using the NucleoSpin® Plus plasmid isolation kit according to the manufacturer's instructions (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG).

Для введения мутации в ген daao из T.variabilis с применением ПЦР использовали праймеры на начало и конец гена:To introduce the mutation into the daao gene from T.variabilis using PCR, primers were used at the beginning and end of the gene:

DAOFor1DAOFor1

5'-ata tac cat ggc taa aat cgt tgt tat tgg tgc-3'5'-ata tac cat ggc taa aat cgt tgt tat tgg tgc-3 '

DAORev4DAORev4

5'-gga aga gag ttt cga аса agg acg ac-3',5'-gga aga gag ttt cga asa agg acg ac-3 ',

а также прямой и обратный праймеры, несущие требуемую замену в триплете, кодирующем в гене daao остаток Phe в положении 54:as well as forward and reverse primers carrying the required substitution in a triplet encoding in the daao gene the residue Phe at position 54:

DAO_F54YforDAO_F54Yfor

5'-gcc aac tgg etc аса t a t tac gat gga ggca agt tag cc-3'5'-gcc aac tgg etc asa t a t tac gat gga ggca agt tag cc-3 '

DAO_F54YrevDAO_F54Yrev

5'-ctt gcc tec ate gta a t a tgt gag cca gtt ggc ace t-3'.5'-ctt gcc tec ate gta a t a tgt gag cca gtt ggc ace t-3 '.

Подчеркиванием и жирным шрифтом выделен нуклеотид, обеспечивающий мутацию Phe54Tyr.Underlined and in bold the nucleotide that provides the mutation Phe54Tyr.

Реакцию ПЦР проводили в тонкостенной пластиковой пробирке объемом 0,5 мл (Eppendorf, Германия). Для предотвращения испарения реакционной смеси и ее конденсации на крышке в пробирку добавляли 30 мкл минерального масла. Пробирку прогревали 5 мин при 95°C и затем проводили реакцию ПЦР по следующей программе: 1-я стадия - 95°C, 60 с; 2-стадия - 56°C, 60 с и 3-я стадия - 72°C, 2 мин, всего 25-35 циклов. После этого реакционную смесь выдерживали еще 10 мин при 72°C. Температуру на второй стадии выбирали на 3-5 градусов ниже T_m температуры плавления дуплексов, образуемых праймерами.The PCR reaction was carried out in a 0.5 ml thin-walled plastic tube (Eppendorf, Germany). To prevent evaporation of the reaction mixture and its condensation on the lid, 30 μl of mineral oil was added to the tube. The tube was heated for 5 min at 95 ° C and then the PCR reaction was carried out according to the following program: 1st stage - 95 ° C, 60 s; Stage 2 - 56 ° C, 60 s and Stage 3 - 72 ° C, 2 min, 25-35 cycles in total. After that, the reaction mixture was kept for another 10 min at 72 ° C. The temperature in the second stage was chosen 3-5 degrees below T _{m the} melting point of the duplexes formed by the primers.

Реакционная смесь для проведения ПЦР имела следующий состав (таблица 1):The reaction mixture for PCR had the following composition (table 1):

Таблица 1Table 1 Условия проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР).The conditions for the polymerase chain reaction (PCR). Количествоamount КомпонентComponent 2,5 мкл2.5 μl 10-кратный буфер для PFU Turbo ДНК-полимеразы (Stratagene, США)10x PFU Turbo DNA Polymerase Buffer (Stratagene, USA) 2,5 мкл2.5 μl смесь dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), концентрация 2,5 мМdNTP mixture (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), concentration 2.5 mM 1 мкл1 μl ДНК-матрица, концентрация ~10 нг/мклDNA matrix, concentration ~ 10 ng / μl 2 мкл2 μl праймер 1, концентрация 5 нмоль/мл (Синтол, Россия)primer 1, concentration 5 nmol / ml (Synthol, Russia) 2 мкл2 μl праймер 2, концентрация 5 нмоль/мл (Синтол, Россия)primer 2, concentration 5 nmol / ml (Synthol, Russia) 1 мкл1 μl PFU Turbo ДНК-полимераза (2,5 Ед/мкл) (Stratagene, США)PFU Turbo DNA Polymerase (2.5 U / μl) (Stratagene, USA) до 25 мклup to 25 μl деионизованная вода, очищенная с использованием системы MilliQ (Millipore, США)deionized water purified using the MilliQ system (Millipore, USA)

На первом этапе проводили две полимеразные цепные реакции с использованием следующих пар праймеров: 1) DAOFor1 + DAO_F54Yrev и 2) DAO_F54Yfor + DAORev4. В качестве матрицы использовали плазмиду pKanDAAO_C108F. Полученные продукты ПЦР, фрагмент 1 и фрагмент 2 очищали с использованием предназначенного для этого набора, например, QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN). Затем проводили третью объединяющую ПЦР с праймерами DAOFor1 и DAORev4, где в качестве ДНК-матрицы использовали полученные ранее фрагменты 1 и 2.At the first stage, two polymerase chain reactions were carried out using the following primer pairs: 1) DAOFor1 + DAO_F54Yrev and 2) DAO_F54Yfor + DAORev4. The plasmid pKanDAAO_C108F was used as a matrix. The resulting PCR products, fragment 1 and fragment 2 were purified using a kit designed for this, for example, QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN). Then, the third combining PCR was performed with primers DAOFor1 and DAORev4, where previously obtained fragments 1 and 2 were used as the DNA template.

Продукт третьей ПЦР очищали с использованием препаративного электрофореза в агарозном геле с использованием предназначенных для этого наборов (например, NucleoSpin Extract (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG)). Очищенный ПЦР-продукт обрабатывали рестриктазой Bsp19 в течение 2 часов при 37°C, затем инкубировали рестрикционную смесь для инактивации рестриктазы в течение 20 минут при 65°C и обрабатывали рестриктазой Bso31 в течение 2 часов при 55°C. В эксперименте были использованы рестриктазы и буфера фирмы Сибэнзим (Россия). Затем полученные фрагменты ДНК очищали от коротких фрагментов препаративным электрофорезом в агарозном геле с последующей экстракцией нужной полосы из агарозы с использованием предназначенного для этого набора, например, NucleoSpin Extract (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG) и лигировали с фрагментом исходной плазмиды pKanDAAO_C 108F, из которой расщеплением по тем же сайтам рестрикции Bspl9 и Bso31 был удален фрагмент гена daao из T.variabilis дикого типа. Полученной после лигирования реакционной смесью трансформировали клетки E.coli TG1 (генотип supE hsdΔ5 thi Δ (lac-proAB) F'[traD36 proAB⁺ lacI^q lacZΔM15]} и выращивали в течение ночи при 37°С на твердой агаризованной среде LB, содержащей канамицин в концентрации 30 мкг/мл (плазмида pKanDAAO содержит ген устойчивости к канамицину).The third PCR product was purified using preparative agarose gel electrophoresis using appropriate kits (e.g., NucleoSpin Extract (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG)). The purified PCR product was treated with restriction enzyme Bsp19 for 2 hours at 37 ° C, then the restriction mixture was inactivated to inactivate restriction enzyme for 20 minutes at 65 ° C and treated with restriction enzyme Bso31 for 2 hours at 55 ° C. In the experiment, restriction enzymes and buffers from Sibenzym (Russia) were used. Then, the obtained DNA fragments were purified from short fragments by preparative agarose gel electrophoresis followed by extraction of the desired strip from agarose using the kit intended for this, for example, NucleoSpin Extract (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG) and ligated with the fragment of the original plasmid pKanDAAO_C 108F, from which a fragment of the daao gene from wild-type T. variabilis was removed by digestion at the same restriction sites Bspl9 and Bso31. The ligation reaction mixture transformed E. coli TG1 cells (genotype supE hsdΔ5 thi Δ (lac-proAB) F '[traD36 proAB ⁺ lacI ^q lacZΔM15]} and grown overnight at 37 ° C on solid agarized LB medium containing kanamycin at a concentration of 30 μg / ml (plasmid pKanDAAO contains the kanamycin resistance gene).

Выросшие колонии инокулировали в 6-8 мл среды 2YT, содержащей 30 мкг/мл канамицина, и растили при 37°C в течение 8-10 часов при аэрировании. Плазмидную ДНК выделяли из полученной культуры клеток с использованием предназначенного для этого набора, например, QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN). Для контроля введения требуемых мутаций проводили секвенирование плазмидной ДНК с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v.3.1 (Perkin Elmer Applied Biosystems), который основан на дидезокситерминационном методе [Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, v.74, №12, pp.5463-5467], с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant. В результате из 5 выделенных плазмид все 5 содержали только требуемую замену Phe54Tyr. Таким образом, был получен новый мутант TvDAAOC108F Phe54Tyr (плазмида pKanDAAO_C 108FJF54Y).The grown colonies were inoculated in 6-8 ml of 2YT medium containing 30 μg / ml kanamycin and grown at 37 ° C for 8-10 hours with aeration. Plasmid DNA was isolated from the obtained cell culture using a kit designed for this, for example, QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN). To control the introduction of the required mutations, plasmid DNA was sequenced using the ABI PRISM® BigDye ™ Terminator v.3.1 reagent kit (Perkin Elmer Applied Biosystems), which is based on the dideoxy determination method [Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, v. 74, No. 12, pp. 5463-5467], followed by analysis of the reaction products on an ABI PRISM 3100-Avant automated DNA sequencer. As a result, of the 5 isolated plasmids, all 5 contained only the required Phe54Tyr replacement. Thus, a new mutant TvDAAOC108F Phe54Tyr (plasmid pKanDAAO_C 108FJF54Y) was obtained.

Для получения мутантного фермента клетки E.coli BL21 (DE3) pLysS Codon Plus (генотип E.coli В F^- ompT hsdS{rW nuT) dcm Tef gal 'k(DE3)pLysS endA Hte [argU proL Cam^r]) трансформировали плазмидой pKanDAAO_C108A и проводили их культивирование (см. ниже).For mutant enzyme E.coli BL21 cells (DE3) pLysS Codon Plus (genotype of E.coli B ^{F - ompT hsdS {rW nuT)} dcm Tef gal 'k (DE3) pLysS endA Hte [argU proL Cam r]) was transformed with plasmid pKanDAAO_C108A and they were cultured (see below).

Пример 2. Получение новой мутантной оксидазы D-аминокислот Trigonopsis variabilis за счет введения в исходный фермент TvDAAO_C108F замены Phe54Ser методом направленного мутагенеза.Example 2. Obtaining a new mutant D-amino acid oxidase of Trigonopsis variabilis by introducing into the original TvDAAO_C108F enzyme the replacement of Phe54Ser by directed mutagenesis.

Данный пример идентичен примеру 1 за исключением того, что в качестве прямого и обратного праймеров, несущих требуемую замену в положении 108 гена daao, использовали следующие дезоксирибоолигонуклеотиды:This example is identical to example 1 except that the following deoxyribo oligonucleotides were used as the forward and reverse primers carrying the desired substitution at position 108 of the daao gene:

DAO_F54SforDAO_F54Sfor

5'- ggc ggt tgt t ct caa ccc aac aac tgg tea tc -3'5'- ggc ggt tgt t ct caa ccc aac aac tgg tea tc -3 '

DAO_F54SFrevDAO_F54SFrev

5'- gtt gtt ggg ttg ag a аса асе gcc aat gat aga agt ac -3'. Подчеркиванием и жирным шрифтом выделен азотистые основания, обеспечивающий мутацию Phe548Ser.5'- gtt gtt ggg ttg ag a asa ase gcc aat gat aga agt ac -3 '. Underlining and in bold highlight nitrogen bases providing the Phe548Ser mutation.

Плазмида pKanDAAO_C108F с нуклеотидными заменами, обеспечивающими в гене фермента мутацию Phe54Ser, получила название pKanDAAO_C 108F_F54S.The plasmid pKanDAAO_C108F with nucleotide substitutions providing the Phe54Ser mutation in the enzyme gene was called pKanDAAO_C 108F_F54S.

Для получения мутантного фермента клетки E.coli BL21 (DE3) pLysS Codon Plus (генотип E.coli В F^- ompT hsdS(rB^- mB^-) dcm⁺ Tet⁺ gal λ(DE3)pLysS endA Hte [argU proL Cam^r]) трансформировали плазмидой pKanDAAO_C108F и проводили их культивирование (см. ниже).To obtain the mutant enzyme of the E. coli BL21 (DE3) pLysS Codon Plus cell (E. coli B genotype F ^- ompT hsdS (rB ^- mB ^- ) dcm ⁺ Tet ⁺ gal λ (DE3) pLysS endA Hte [argU proL Cam ^r ]) transformed with plasmid pKanDAAO_C108F and cultured (see below).

Пример 3. Изучение субстратной специфичности мутантных оксидаз D-аминокислот и фермента дикого типа.Example 3. The study of the substrate specificity of mutant oxidases of D-amino acids and the wild-type enzyme.

Для точной оценки эффекта изменения субстратной специфичности оксидаз D-аминокислот за счет введения точечных замен Phe548Tyr и Phe548Ser новые мутантные ферменты, исходный мутант и оксидазу D-аминокислот дикого типа выделяли в высокоочищенном состоянии и определяли константы Михаэлиса и максимальные скорости взаимодействия ферментов с различными субстратами.To accurately assess the effect of changes in the substrate specificity of D-amino acid oxidases due to the introduction of point substitutions Phe548Tyr and Phe548Ser, new mutant enzymes, the initial mutant, and wild-type D-amino acid oxidase were isolated in a highly purified state and the Michaelis constants and maximum enzyme interaction rates with various substrates were determined.

Методика получения и очистки была одинакова как для мутантных TvDAAO, так и для фермента дикого типа. Клетки E.coli BL21 (DE3) pLysS Codon Plus, содержащие одну из плазмид (pKanDAAO, или pKanDAAO_C108F, или pKanDAAO_C108F_F54Y, или pKanDAAO_C108F_F54S) и синтезирующие целевой фермент, получали культивированием единичной колонии в колбах объемом 1 л, содержащих 150 мл среды 2YT и 30 мкг/мл канамицина при 37°C при непрерывном перемешивании (140 об/мин). По достижении поглощения среды на 600 нм величины А₆₀₀ 0,6-0,9 в колбы добавляли изопропил-бета-D-тиогалактозид (ИПТГ) до концентрации 0,1 мМ и культивировали в течение 24 часов при 25°C. Клетки собирали центрифугированием (7000 об/мин, 20 мин, 4°C) и ресуспендировали в 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5 для получения 20% суспензии. Для предварительного разрушения клетки подвергали замораживанию-размораживанию и далее обрабатывали ультразвуком при охлаждении льдом, каждые 5 минут отбирая пробы для измерения активности фермента. По достижении постоянного значения активности полученный раствор центрифугировали (18000 об/мин, 30 мин, 4°C) для удаления осадка. Полученный супернатант нагревали в течение 10 мин при 45°C для инактивации каталазы и некоторых других белков, осадок удаляли центрифугированием (18000 об/мин, 30 мин, 4°C).The preparation and purification procedure was the same for both mutant TvDAAO and the wild-type enzyme. E. coli BL21 (DE3) pLysS Codon Plus cells containing one of the plasmids (pKanDAAO, or pKanDAAO_C108F, or pKanDAAO_C108F_F54Y, or pKanDAAO_C108F_F54S) and synthesizing the target enzyme were obtained by culturing a single colony in 150 ml flasks with 2 ml volumetric tubes and μg / ml kanamycin at 37 ° C with continuous stirring (140 rpm). Upon reaching 600 nm absorbance of the medium, A ₆₀₀ values of 0.6-0.9 were added to the flasks. Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) was added to a concentration of 0.1 mM and cultured for 24 hours at 25 ° C. Cells were harvested by centrifugation (7000 rpm, 20 min, 4 ° C) and resuspended in 20 mM Tris-HCl, pH 7.5 to obtain a 20% suspension. For preliminary disruption, the cells were subjected to freezing and thawing and then sonicated with ice cooling, taking samples every 5 minutes to measure enzyme activity. Upon reaching a constant activity value, the resulting solution was centrifuged (18000 rpm, 30 min, 4 ° C) to remove the precipitate. The obtained supernatant was heated for 10 min at 45 ° C to inactivate catalase and some other proteins, the precipitate was removed by centrifugation (18000 rpm, 30 min, 4 ° C).

Ионообменную FPLC хроматографию проводили на установке фирмы Pharmacia (Швеция). Раствор фермента наносили на колонку Source 15Q объемом 40 мл (Pharmacia Biotech, Швеция), уравновешенную 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5 (буфер А). После нанесения образца колонку промывали тем же буфером до нулевого поглощения на 280 нм выходящего из колонки раствора. Фермент элюировали с колонки со скоростью 10 мл/мин линейным градиентом 0-1 М NaCl в буфере А. Собирали фракции, обладающие оксидазной активностью, объединяли их и концентрировали на мембране РМ10 в ячейке для концентрирования объемом 50 мл (мембрана и ячейка производства Amicon, США) до объема 5 мл. Полученный фермент наносили на колонку 2,5×100 см с Sephacryl S-200 (Pharmacia Biotech, Германия), уравновешенную 0,1 М фосфатным буфером, рН 8,0. Собирали фракции по 5 мл, определяли их поглощение на длине волны 280 нм А₂₈₀ на спектрофотометре Shimadzu 1800PC (Shimadzu GmBH, Германия) и измеряли величину ферментативной активности с использованием пероксидазной реакции (методику см. ниже). Отбирали фракции, имеющие постоянное отношение (активность/А₂₈₀). Чистота полученных препаратов составляла не менее 95% согласно данным аналитического электрофореза в 12% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Электрофорез проводили на приборе BioRad (Англия) согласно инструкции фирмы-производителя.Ion-exchange FPLC chromatography was performed using a Pharmacia installation (Sweden). The enzyme solution was applied to a Source 15Q column with a volume of 40 ml (Pharmacia Biotech, Sweden), balanced with 20 mM Tris-HCl, pH 7.5 (buffer A). After applying the sample, the column was washed with the same buffer until zero absorbance at 280 nm of the solution leaving the column. The enzyme was eluted from the column at a rate of 10 ml / min with a linear gradient of 0-1 M NaCl in buffer A. Fractions with oxidase activity were collected, pooled and concentrated on a PM10 membrane in a 50 ml concentration cell (Amicon membrane and cell, USA ) to a volume of 5 ml. The resulting enzyme was applied to a 2.5 × 100 cm column with Sephacryl S-200 (Pharmacia Biotech, Germany), equilibrated with 0.1 M phosphate buffer, pH 8.0. Fractions of 5 ml were collected, their absorption at a wavelength of 280 nm A _{280 was} determined on a Shimadzu 1800PC spectrophotometer (Shimadzu GmBH, Germany), and the enzymatic activity was measured using a peroxidase reaction (see the procedure below). Fractions having a constant ratio (activity / A ₂₈₀ ) were selected. The purity of the obtained preparations was at least 95% according to analytical electrophoresis in 12% polyacrylamide gel in the presence of sodium dodecyl sulfate. Electrophoresis was performed on a BioRad device (England) according to the manufacturer's instructions.

Активность ферментов определяли по образованию пероксида водорода, для чего использовали пероксидазу из корней хрена (ПХ) фирмы Reanal (Венгрия) и ее субстрат АБТС (2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат)) фирмы Sigma (США). В качестве субстратов для мутантной DAAO и фермента дикого типа использовали различные D-аминокислоты. В кювету спектрофотометра (рабочий объем 1 мл, оптический путь 1 см) добавляли раствор D-аминокислоты в 50 мМ натрий- или калий-фосфатном буфере (ФБ), 20 мкл раствора АБТС (16 мг/мл) в воде, 10 мкл раствора пероксидазы в 50 мМ ФБ (1000 Ед/мл) и насыщенный кислородом 50 мМ ФБ (рН 8,0) до общего объема 980 мкл. После термостатирования в течение 10 мин при 30°C в реакционную смесь добавляли 20 мкл фермента. Накопление продукта окисления АБТС регистрировали на длине волны 414 нм (ε₄₁₄=36000 М^-1 см^-1).The enzyme activity was determined by the formation of hydrogen peroxide, for which we used peroxidase from horseradish roots (HRP) from Reanal (Hungary) and its substrate ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonate)) from Sigma (USA) ) As substrates for mutant DAAO and wild-type enzyme, various D-amino acids were used. A solution of D-amino acid in 50 mM sodium or potassium phosphate buffer (FB), 20 μl of ABTS solution (16 mg / ml) in water, 10 μl of peroxidase solution were added to the spectrophotometer cuvette (working volume 1 ml, optical path 1 cm) in 50 mM FB (1000 U / ml) and oxygenated 50 mM FB (pH 8.0) to a total volume of 980 μl. After incubation for 10 min at 30 ° C, 20 μl of the enzyme was added to the reaction mixture. The accumulation of the ABTS oxidation product was recorded at a wavelength of 414 nm (ε ₄₁₄ = 36000 M ^-1 cm ^-1 ).

Для определения величин максимальной скорости реакции и константы Михаэлиса оксидазы D-аминокислот дикого типа и мутантных ферментов концентрацию соответствующей D-аминокислоты варьировали в диапазоне 0,5-5 К_М. Приблизительное значение К_М определяли в отдельном эксперименте, измеряя скорость реакции при концентрациях D-аминокислоты 0,1, 0,5, 1,0, 5,0, 10 мМ. Значения активности при каждой концентрации измеряли не менее 3 раз, а на границах и в середине диапазона определение проводили 5 раз. Величины V_m и Км определяли из зависимости скорости реакции от концентрации D-аминокислоты с использованием нелинейной регрессии, используя программу "Origin Pro 7.0". Программа также позволяет оценить ошибки расчета параметров.To determine the maximum reaction rate and the Michaelis constant of the oxidase of wild-type D-amino acids and mutant enzymes, the concentration of the corresponding D-amino acid was varied in the range of 0.5-5 K _M. The approximate value of K _{M was} determined in a separate experiment, measuring the reaction rate at concentrations of D-amino acids of 0.1, 0.5, 1.0, 5.0, 10 mm. The activity values at each concentration were measured at least 3 times, and at the borders and in the middle of the range, the determination was carried out 5 times. The values of V _m and Km were determined from the dependence of the reaction rate on the concentration of D-amino acid using nonlinear regression using the program "Origin Pro 7.0". The program also allows you to evaluate the calculation errors of the parameters.

В таблице 2 приведены относительные значения констант Михаэлиса ((Км)мут/(Км)^дт* 100%), максимальных скоростей ((k_cat)^мут/(k_ct)^дт*100%) и общей каталитической эффективности ((k_cat/К_М)^мут/(k_cat/К_М)^дт*100%) с различными субстратами для новых мутантных TvDAAO_C108F Phe54Tyr и TvDAAO-_C108F Phe54Ser, исходного мутанта TvDAAO_C108F относительно таковых для оксидазы D-аминокислот дикого типа. В случае константы Михаэлиса, уменьшение Км соответствует относительным величинам менее 100%, а увеличение k_cat и k_cat/К_М соответствует относительным величинам более 100%.Table 2 shows the relative values of Michaelis constants ((Km) mut / (Km) ^dt * 100%), maximum speeds ((k _cat ) ^mut / (k _ct ) ^dt * 100%) and total catalytic efficiency ((k _cat / K _M ) ^mut / (k _cat / K _M ) ^dt * 100%) with various substrates for the new mutant TvDAAO_C108F Phe54Tyr and TvDAAO-_C108F Phe54Ser, the original mutant TvDAAO_C108F relative to those for the wild-type D-amino acid oxidase. In the case of the Michaelis constant, a decrease in Km corresponds to relative values of less than 100%, and an increase in k _cat and k _cat / K _M corresponds to relative values of more than 100%.

Таблица 2table 2 Кинетические параметры новых мутантных оксидаз D-аминокислот и исходного мутантного фермента относительно таковых для фермента дикого типа*Kinetic parameters of the new mutant oxidases of D-amino acids and the initial mutant enzyme relative to those for the wild-type enzyme * Форма ферментаEnzyme form Новые мутантные TvDAAONew Mutant TvDAAO Исходный мутант TvDAAO_C108FSource Mutant TvDAAO_C108F TvDAAO_C108F Phe54TyrTvDAAO_C108F Phe54Tyr TvDAAO_C108F Phe54SerTvDAAO_C108F Phe54Ser D-аминокислотаD-amino acid k_cat, %k _cat ,% K_M %K _M % k_cat/К_М, %k _cat / K _M ,% k_cat, %k _cat ,% K_M, %K _M ,% k_cat/К_М, %k _cat / K _M ,% k_cat, %k _cat ,% K_M, %K _M ,% k_cat/К_М, %k _cat / K _M ,% D-метионинD-methionine 6060 11101110 55 4040 309309 1313 151151 10601060 14fourteen D-аланинD-alanine 33 138138 33 22 5656 4four НЕТ РЕАКЦИИNO REACTION D-серинD-serine НЕТ РЕАКЦИИNO REACTION НЕТ РЕАКЦИИNO REACTION 3636 149149 2121 D-валинD-valine 55 271271 22 33 3535 88 5858 207207 2828 D-тирозинD-tyrosine 3131 118118 4242 156156 30thirty 528528 5959 2727 214214 D-триптофанD-tryptophan 7171 50825082 1one 6161 218218 2828 8181 5959 136136 D-лейцинD-leucine 2727 8282 3232 5555 15fifteen 360360 295295 108108 274274 D-фенилаланинD-phenylalanine 9393 10591059 99 247247 178178 137137 312312 135135 231231 D-аспарагинD-asparagine 4242 159159 2626 139139 3434 407407 249249 114114 218218 D-треонинD-threonine НЕТ РЕАКЦИИNO REACTION НЕТ РЕАКЦИИNO REACTION 160160 6464 254254 D-лизинD-lysine НЕТ РЕАКЦИИNO REACTION НЕТ РЕАКЦИИNO REACTION НЕТ РЕАКЦИИNO REACTION * Кинетические параметры для мутантных ферментов (мут) выражены в процентах относительно соответствующих значений для TvDAAO дикого типа (дт), т.е. в случае Км, k_cat и k_cat/КМ - это будут соответственно отношения (Км)^мут/(Км)^дт*100%, (k_cat)^мут/(k_cat/K_M)^мут/(kcat/K_M)^дт*100% и (k_cat/К_М)^мут/(k_cat/KM)^дт*100%.
Погрешности измерения констант не превышали 10%.* Kinetic parameters for mutant enzymes (mut) are expressed as a percentage relative to the corresponding values for wild-type TvDAAO (dt), i.e. in the case of Km, k _cat and k _cat / KM - these will be the ratios (Km) ^mut / (Km) ^dt * 100%, (k _cat ) ^mut / (k _cat / K _M ) ^mut / (kcat / K _M ), respectively ^dt * 100% and (k _cat / K _M ) ^mut / (k _cat / KM) ^dt * 100%.
The errors in the measurement of constants did not exceed 10%.

Из таблицы следует, что введение замены Phe54Tyr и особенно Phe54Ser существенно изменило профиль субстратной специфичности полученной мутантной формы оксидазы D-аминокислот по сравнению с профилем субстратной специфичности как фермента дикого типа, так и исходного мутанта TvDAAO_C108F. Например, новые мутантные оксидазы D-аминокислот перестала катализировать окисление D-серина, который являлся "хорошим субстратом" (высокое значение отношения k_cat/К_М) для фермента дикого типа и исходного мутанта TvDAAO_C108F, т.е. полученные мутанты являются идеальным для использования в биосенсорах для селективного определения в клетках нервной системы D-аланина в присутствии высоких концентраций эндогенного D-серина. Природные оксидазы D-аминокислот с таким соотношением активностей с D-серин - D-аланин в литературе не описаны. В плане улучшения каталитических свойств с природными D-аминокислотами наиболее эффективной оказалась замена Phe54Ser. Для сравнения каталитических свойств ферментов используют величину каталитической эффективности (отношение k_cat/К_М). The table shows that the introduction of the substitution Phe54Tyr and especially Phe54Ser significantly changed the substrate specificity profile of the obtained mutant form of D-amino acid oxidase compared to the substrate specificity profile of both the wild-type enzyme and the original TvDAAO_C108F mutant. For example, new mutant D-amino acid oxidases ceased to catalyze the oxidation of D-serine, which was a “good substrate” (high k _cat / K _M ratio) for the wild-type enzyme and the original TvDAAO_C108F mutant, i.e. The obtained mutants are ideal for use in biosensors for the selective determination of D-alanine in the cells of the nervous system in the presence of high concentrations of endogenous D-serine. Natural oxidase D-amino acids with such a ratio of activities with D-serine - D-alanine are not described in the literature. In terms of improving the catalytic properties with natural D-amino acids, the replacement of Phe54Ser was most effective. To compare the catalytic properties of enzymes, the value of catalytic efficiency (ratio k _cat / K _M ) is used.

Как следует из таблицы 2, максимальное увеличение величины каталитической эффективности с рядом D-аминокислот по сравнению с ферментом дикого типа в случае исходного мутанта TvDAAO_C108F Phe54Ser no сравнению с ферментом дикого типа с тремя аминокислотами составляет максимум 360-528%.As follows from table 2, the maximum increase in the catalytic efficiency with a number of D-amino acids compared with the wild-type enzyme in the case of the initial mutant TvDAAO_C108F Phe54Ser no compared with the wild-type enzyme with three amino acids is a maximum of 360-528%.

Таким образом, полученные мутантные формы оксидазы D-аминокислот обладают субстратной специфичностью, отличной от субстратной специфичности, как фермента дикого типа, так и исходного мутанта TvDAAO_C108F по отношению к ряду D-аминокислот и их производных.Thus, the obtained mutant forms of D-amino acid oxidase possess substrate specificity different from the substrate specificity of both the wild-type enzyme and the original TvDAAO_C108F mutant with respect to a number of D-amino acids and their derivatives.

Пример 4. Каталитическая активность новой и исходной мутантных оксидаз D-аминокислот и фермента дикого типа с цефалоспорином С.Example 4. The catalytic activity of the new and original mutant oxidases of D-amino acids and the wild-type enzyme with cephalosporin C.

Для определения эффективности взаимодействия TvDAAO дикого типа, исходного мутанта и новых мутантных форм с цефалоспорином С в пробирке объемом 2,0 мл (Eppendorf, Германия) смешивали 20 мМ цефалоспорина С и предварительно насыщенный кислородом 0,1 М ФБ, рН 8,0.To determine the effectiveness of the interaction of wild-type TvDAAO, the original mutant, and new mutant forms with cephalosporin C in a 2.0 ml tube (Eppendorf, Germany), 20 mM cephalosporin C and 0.1 M pre-saturated with oxygen, pH 8.0 were mixed.

Для определения эффективности взаимодействия TvDAAO дикого типа, исходного мутанта и новых мутантных форм с цефалоспорином С в качестве субстрата ферментативную реакцию проводили в открытой 2 мл пластиковой пробирке при перемешивании (1000 об/мин, 30°C). Реакционная смесь (общий объем 500 мкл) содержала 20 мМ цефалоспорин С в 0,1 М КФБ, рН 8,0, насыщенном кислородом. Реакцию запускали добавлением одинаковых количеств мутантных TvDAAO или фермента дикого типа (5 мкг). Через определенные промежутки времени из реакционной смеси отбирали пробы объемом 50 мкл, останавливали реакцию 50 мкл 0,1 М HCl и анализировали их состав с использованием ВЭЖХ на колонке Силасорб С-18 (125 мм × 4,0 мкм; "ХроМасс", Россия). В качестве элюента использовали 20 мМ CH₃COONa, 2 об.% ацетонитрил, рН 4,9. Уменьшение концентрации субстрата цефалоспорина С в ходе реакции регистрировали спектрофотометрически по поглощению раствора на выходе из колонки на длине волны 260 нм. Содержание цефалоспорина С в реакционной смеси определяли из полученных хроматограмм по величине площади пика, отвечающего исходному субстрату.To determine the effectiveness of the interaction of wild-type TvDAAO, the initial mutant, and new mutant forms with cephalosporin C as an substrate, the enzymatic reaction was carried out in an open 2 ml plastic tube with stirring (1000 rpm, 30 ° C). The reaction mixture (total volume 500 μl) contained 20 mM cephalosporin C in 0.1 M KPB, pH 8.0, saturated with oxygen. The reaction was started by the addition of equal amounts of mutant TvDAAO or a wild-type enzyme (5 μg). At certain time intervals, samples with a volume of 50 μl were taken from the reaction mixture, the reaction was stopped with 50 μl of 0.1 M HCl and their composition was analyzed using HPLC on a Silabsorb C-18 column (125 mm × 4.0 μm; Khromass, Russia) . As an eluent, 20 mM CH ₃ COONa, 2 vol% acetonitrile, pH 4.9 were used. The decrease in the concentration of cephalosporin C substrate during the reaction was recorded spectrophotometrically by the absorption of the solution at the column exit at a wavelength of 260 nm. The content of cephalosporin C in the reaction mixture was determined from the obtained chromatograms according to the peak area corresponding to the initial substrate.

Кинетика окисления цефалоспорина С с использованием полученных мутантных TvDAAO и исходного мутанта и фермента дикого типа представлена на чертеже. Во всех случаях в реакцию вводили одинаковые по массе количества фермента. Из приведенного чертежа хорошо видно, что новые мутантные TvDAAO_C108FPhe54Tyr и TvDAAO C108F Phe54Ser проявляют гораздо более высокую каталитическую активность в реакции окисления цефалоспорина С по сравнению с исходным мутантом TvDAAO_C108F и особенно по сравнению с ферментом дикого типа. В случае новых мутантов 100% конверсия субстрата происходит за 26-30 мин, в то время как через 30 мин после начала реакции конверсия субстрата в случае исходного мутанта и фермента дикого типа составляет 14 и 49% соответственно. Следует отметить, что в реакции окисления цефалоспорина С мутант TvDAAO_C108F Phe54Tyr немного более эффективен, чем второй новый мутант TvDAAO C108F Phe54Ser.The kinetics of the oxidation of cephalosporin C using the obtained mutant TvDAAO and the original mutant and wild-type enzyme are presented in the drawing. In all cases, the same amount of enzyme was introduced into the reaction. It can be clearly seen from the drawing that the new mutant TvDAAO_C108FPhe54Tyr and TvDAAO C108F Phe54Ser exhibit much higher catalytic activity in the oxidation reaction of cephalosporin C compared to the original mutant TvDAAO_C108F and especially compared to the wild-type enzyme. In the case of new mutants, 100% conversion of the substrate occurs in 26-30 minutes, while 30 minutes after the start of the reaction, the conversion of the substrate in the case of the original mutant and wild-type enzyme is 14 and 49%, respectively. It should be noted that in the oxidation reaction of cephalosporin C, the TvDAAO_C108F Phe54Tyr mutant is slightly more effective than the second new TvDAAO C108F Phe54Ser mutant.

Claims (2)

1. Мутантная оксидаза D-аминокислот с измененной субстратной специфичностью по отношению к ряду D-аминокислот и их производных, характеризующаяся аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности мутантной оксидазы D-аминокислот из Trigonopsis variabilis с остатком фенилаланина в 108 положении, отличающаяся тем, что в ней дополнительно остаток фенилаланина в положении 54 замещен остатком тирозина.1. Mutant D-amino acid oxidase with altered substrate specificity with respect to a series of D-amino acids and their derivatives, characterized by the amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence of the mutant D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis with a phenylalanine residue in position 108, characterized in that additionally, the phenylalanine residue at position 54 is substituted with a tyrosine residue. 2. Мутантная оксидаза D-аминокислот с измененной субстратной специфичностью по отношению к ряду D-аминокислот и их производных, характеризующаяся аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности мутантной оксидазы D-аминокислот из Trigonopsis variabilis с остатком фенилаланина в 108 положении, отличающаяся тем, что в ней дополнительно остаток фенилаланина в положении 54 замещен остатком серина. 2. Mutant D-amino acid oxidase with altered substrate specificity with respect to a series of D-amino acids and their derivatives, characterized by the amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence of the mutant D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis with a phenylalanine residue in position 108, characterized in that additionally, the phenylalanine residue at position 54 is substituted with a serine residue.

Images