RU2500817C1 - RECOMBINANT PLASMID DNA pBK415 CODING POLYPEPTIDE OF RECOMBINANT TISSULAR ACTIVATOR OF PLASMINOGEN OF HUMAN BEING, CELL LINE Cricetulus griseus CHO 1F8-PRODUCER OF RECOMBINANT TISSULAR ACTIVATOR OF PLASMINOGEN OF HUMAN BEING, AND METHOD FOR OBTAINING AND SEPARATION OF POLYPEPTIDE HAVING ACTIVITY OF TISSULAR ACTIVATOR OF PLASMINOGEN - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnologies.

SUBSTANCE: recombinant plasmid DNA pBK415 coding polypeptide with sequence of tissular activator of human plasminogen, also including MAR - binding area to nuclear matrix of lysozyme gene of birds, virus transmission enhancer CMV, internal translation initiation site IRES of encephalomyocarditis virus, gene DHFR of a mouse, a polyadenylation signal of virus SV40, gene of aminoglycoside-3'-phosphotransferase providing stability to geneticin (Neo) and a cassette for expression in bacteria cells of gene of β-lactamase providing stability to ampicillin, cells of line Cricetulus griseus CHO DHFR(-) are obtained so that there produced is cell line Cricetulus griseus CHO 1F8 producing recombinant protein of tissular activator of plasminogen with highly stable yield at the level of up to 190 mg/l. Cultivation of cells-producers is performed under perfusion conditions in presence of a mixture consisting of additive CHO Bioreactor supplement and sodium butyrate or dimethylsulphoxide with further separation of a target product.

EFFECT: improvement of the method.

5 cl, 5 dwg, 3 tbl, 8 ex

Description

Область техникиTechnical field

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, и может быть использовано для получения рекомбинантного тканевого активатора плазминогена человека (rtPA). Изобретение представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК рВК415, кодирующую полипептид с последовательностью рекомбинантного тканевого активатора плазминогена (rtPA), и продуцент на основе линии клеток Cricetulus griseus CHO 1F8, содержащей указанную плазмидную ДНК, синтезирующий рекомбинантный тканевый активатор плазминогена.The invention relates to biotechnology, in particular to genetic engineering, and can be used to obtain recombinant tissue plasminogen activator human (rtPA). The invention is a recombinant plasmid DNA rBK415 encoding a polypeptide with a sequence of recombinant tissue plasminogen activator (rtPA), and a producer based on the Cricetulus griseus CHO 1F8 cell line containing said plasmid DNA synthesizing a recombinant tissue plasminogen activator.

Предшествующий уровень техникиState of the art

Тканевый активатор плазминогена (tPA) представляет собой белок, состоящий из 527 аминокислот, с весом около 72 кДа. Он обладает способностью вызывать каталитическую деградацию фибрина (основного компонента тромбов), и используется при лечении острых инфарктов миокарда, легочной эмболии, тромбоза вен. Выполняя функции сериновой протеазы, tPA связывается с фибрином, приобретает протеолитическую активность и способствует превращению плазминогена в плазмин, в результате чего происходит лизис тромба и реперфузия кровяного русла (Cell Mol Life Sci. 2011 Mar;68(5):785-801. Epub 2010 Dec 7). Уникальным свойством tPA является его крайне высокая избирательность в отношении связанного с фибрином плазминогена, что обеспечивает его преимущественную активацию на поверхности фибринового тромба, а не в системном кровотоке.Tissue plasminogen activator (tPA) is a protein consisting of 527 amino acids, with a weight of about 72 kDa. It has the ability to cause catalytic degradation of fibrin (the main component of blood clots), and is used in the treatment of acute myocardial infarction, pulmonary embolism, venous thrombosis. Acting as a serine protease, tPA binds to fibrin, acquires proteolytic activity and promotes the conversion of plasminogen to plasmin, resulting in thrombus lysis and reperfusion of the bloodstream (Cell Mol Life Sci. 2011 Mar; 68 (5): 785-801. Epub 2010 Dec 7). A unique property of tPA is its extremely high selectivity for fibrin-bound plasminogen, which ensures its preferential activation on the surface of the fibrin thrombus, and not in the systemic circulation.

В сравнении с тромболитическими средствами предыдущего поколения, такими как урокиназа и стрептокиназа, тканевые активаторы плазминогена действуют более эффективно. Это выражается в том, что последние напрямую связываются с фибрином и таким образом направленно действуют на основную мишень - тромб, в отличие от стрептокиназы и урокиназы, которые менее специфичны и активируют помимо плазминогена, связанного с фибриновым тромбом, и свободные молекулы плазминогена (Baillieres Clin Haematol. 1995 Jun;8(2):277-90). Кроме того, tPA обладает большим временем жизни в организме пациента.Compared with previous generation thrombolytic agents, such as urokinase and streptokinase, tissue plasminogen activators act more efficiently. This is expressed in the fact that the latter directly bind to fibrin and thus act directly on the main target - a thrombus, in contrast to streptokinase and urokinase, which are less specific and activate, in addition to the plasminogen associated with the fibrin thrombus, and free plasminogen molecules (Baillieres Clin Haematolol 1995 Jun; 8 (2): 277-90). In addition, tPA has a long lifetime in the patient.

Природная последовательность тканевого активатора плазминогена была идентифицирована в 1982 году (Nature, 1983, Jan 20; 301(5897):214-21). На его основе был создан лекарственный препарат альтеплаза (торговое название «Актилизе»), содержащий белок, полностью соответствующий человеческому tPA, а также несколько мутантных форм tPA: тенектеплаза (торговое название «Метализе», отличается от природного белка заменой трех аминокислот) и ретеплаза (торговое название «Retavase», характеризуется делецией трех из пяти доменов тканевого активатора плазминогена). Многочисленные исследования («Тромболитическая терапия инфаркта миокарда», РМЖ, Том 6 №3, 1998; Am Heart J. 2004 Jun; 147(6):993-8 и др.) показали, что эффективность перечисленных препаратов довольно сходна. При этом наиболее оптимальным профилем безопасности обладает альтеплаза. Ретеплаза несколько уступает альтеплазе по эффективности (особенно, если задержка с введением препарата составляет более 4 часов с момента появления первых симптомов инфаркта миокарда). В случае тенектеплазы наблюдается повышенный риск внутричерепных кровотечений (Куликов А.Н. Фармакотерапия острых коронарных синдромов (ii), "ФАРМиндекс-Практик" выпуск 9, 2005 г., стр.1-16). Кроме того, два последних препарата содержат мутантные формы белка, что может провоцировать иммунный ответ у пациента, который отсутствует в случае альтеплазы.The natural sequence of tissue plasminogen activator was identified in 1982 (Nature, 1983, Jan 20; 301 (5897): 214-21). Based on it, the drug alteplase (trade name "Aktilize") was created, containing a protein that fully corresponds to human tPA, as well as several mutant forms of tPA: tenecteplase (trade name "Metalize", differs from the natural protein by replacing three amino acids) and reteplase ( trade name "Retavase", characterized by a deletion of three of the five domains of tissue plasminogen activator). Numerous studies ("Thrombolytic therapy of myocardial infarction", breast cancer, Volume 6 No. 3, 1998; Am Heart J. 2004 Jun; 147 (6): 993-8 and others) showed that the effectiveness of these drugs is quite similar. At the same time, alteplase has the most optimal safety profile. Reteplase is somewhat inferior to alteplase in effectiveness (especially if the delay in administering the drug is more than 4 hours from the onset of the first symptoms of myocardial infarction). In the case of tenecteplase, there is an increased risk of intracranial bleeding (Kulikov A.N. Pharmacotherapy of acute coronary syndromes (ii), PHARMindex-Practik, Issue 9, 2005, pp. 1-16). In addition, the last two drugs contain mutant forms of protein, which can provoke an immune response in a patient that is absent in the case of alteplase.

В настоящее время инфаркт миокарда является причиной примерно 9% смертей в экономически развитых странах. Только в 1990 г., по данным ВОЗ, из 10912 больных от инфаркта миокарда погибли 1001 человек, что составило 9,2% (Алперт Дж., Френсис Г. Лечение инфаркта миокарда. Практическое руководство. Пер. с англ. М., 1994. С.468). К сожалению, в РФ высокая стоимость рекомбинантных активаторов плазминогена служит сдерживающим фактором в вопросе их широкого применения. Поэтому создание эффективного продуцента tPA, а также разработка метода его получения для производства отечественного препарата является весьма актуальной и важной задачей, решение которой позволит расширить арсенал отечественных лекарственных средств для лечения острых инфарктов миокарда.Myocardial infarction is currently responsible for approximately 9% of deaths in economically developed countries. Only in 1990, according to the WHO, out of 10,912 patients from myocardial infarction, 1,001 people died, which amounted to 9.2% (Alpert J., Francis G. Treatment of myocardial infarction. A practical guide. Transl. From English M., 1994 P.468). Unfortunately, in Russia, the high cost of recombinant plasminogen activators serves as a deterrent to their widespread use. Therefore, the creation of an effective producer of tPA, as well as the development of a method for its production for the production of a domestic drug, is a very urgent and important task, the solution of which will expand the arsenal of domestic drugs for the treatment of acute myocardial infarction.

Евразийский патент ЕА5163 раскрывает систему экспрессии tPA в прокариотических клетках. Для этой цели ген tPA вставляют в вектор, содержащий также промотор CMV, последовательность сигнального пептида ОтрА и ген протеина III (gp), причем tPA функционально связан с последовательностью ОтрА против хода транскрипции, и по ходу транскрипции с последовательностью гена gpIII. Авторы указывают, что наличие сигнального пептида позволяет белку приобрести правильную конформацию до выхода из клетки, причем эффективность отщепления сигнального пептида очень высока. Однако широко известно, что экспрессия белков млекопитающих (в том числе и человека) сопряжена с гликозилированием, которое невозможно осуществить в бактериальных клетках.The Eurasian patent EA5163 discloses a system for the expression of tPA in prokaryotic cells. For this purpose, the tPA gene is inserted into a vector that also contains the CMV promoter, the OTPA signal peptide sequence and the protein III (gp) gene, and the tPA is functionally linked to the OTPA sequence against the course of transcription, and along the transcription with the gpIII gene sequence. The authors indicate that the presence of a signal peptide allows the protein to acquire the correct conformation before leaving the cell, and the efficiency of cleavage of the signal peptide is very high. However, it is widely known that the expression of mammalian proteins (including humans) is associated with glycosylation, which is not possible in bacterial cells.

Новые вектора экспрессии для tPA предлагаются в ЕР0260148. Вектор pCIHtPA содержит последовательности tPA и DHFR (дигидрофолатредуктазы) под контролем CMV-промотора, а также последовательность гена SVE. Вектор pCIStPA дополнительно содержит участок полиаденилирования SV40, что позволило повысить уровень экспрессии примерно в три раза по сравнению с вектором pCIHtPA. В публикации также сравниваются уровни экспрессии белка в клетках СНО и клетках 293, трансфицированных соответствующими векторами: для вектора pCIHtPA удалось достичь значений 15 и 1300 нг/мл, для вектора pCIStPA - 55 и 3000 нг/мл соответственно.New expression vectors for tPA are proposed in EP0260148. The pCIHtPA vector contains the sequences of tPA and DHFR (dihydrofolate reductase) under the control of the CMV promoter, as well as the sequence of the SVE gene. The pCIStPA vector additionally contains the SV40 polyadenylation site, which made it possible to increase the expression level by about three times as compared with the pCIHtPA vector. The publication also compares protein expression levels in CHO cells and 293 cells transfected with the corresponding vectors: for the pCIHtPA vector, 15 and 1300 ng / ml were achieved, for the pCIStPA vector, 55 and 3000 ng / ml, respectively.

Системы экспрессии tPA в клетках млекопитающих (СНО) также достаточно подробно описаны в целом ряде патентов компании Genentech (например, см. ЕР 093619, ЕР 0117059, US 5728565, US 5849574, US 6284247). Все они раскрывают вектор, содержащий последовательность tPA и ген DHFR, что позволяет в дальнейшем, проводя амплификацию гена DHFR, вызывать амплификацию ассоциированной с ним последовательности гена tPA.Mammalian cell tPA expression systems (CHO) are also described in sufficient detail in a number of Genentech patents (for example, see EP 093619, EP 0117059, US 5728565, US 5849574, US 6284247). All of them disclose a vector containing the tPA sequence and the DHFR gene, which subsequently allows amplification of the DHFR gene to cause amplification of the associated tPA gene sequence.

Аналогичная система экспрессии природного tPA в клетках СНО, дефицитных по DHFR, являющаяся наиболее близким аналогом настоящего изобретения, описана в патенте RU 2046827. Как и в предыдущих случаях, авторы клонируют последовательность tPA, собранную из трех фрагментов различной длины в плазмиду pBR322, дополнительно содержащую ген DHFR. Затем полученной плазмидой трансформируют клетки СНО и проводят ряд последовательных амплификаций с использованием метотрексата. В результате выход секретируемого продукта достигает значений до 50 пг/клетку/день. Недостатком использованной системы является функционально независимая экспрессия генов DHFR и tPA благодаря использованию двух отдельных SV40-промоторов для каждого из синтезируемых белков. Первоначально высокие выходы трансгена, наблюдаемые при использованных концентрациях метотрексата (до 10 мкМ), обычно связаны со значительным уровнем хромосомной нестабильности штамма-продуцента и при отсутствии селективного агента, являющегося весьма токсичным и потому не использующемся в промышленном фармацевтическом производстве, неизбежно приводит к существенному падению уровня продукции при длительном культивировании клеточной линии. Соответственно, использование данного подхода делает невозможным применение данного метода в процессе производства терапевтических рекомбинантных белков.A similar system for the expression of natural tPA in CHF cells deficient in DHFR, which is the closest analogue of the present invention, is described in patent RU 2046827. As in previous cases, the authors clone the tPA sequence, assembled from three fragments of different lengths into plasmid pBR322, additionally containing the gene DHFR. Then the obtained plasmid transform CHO cells and carry out a series of successive amplifications using methotrexate. As a result, the yield of secreted product reaches values up to 50 pg / cell / day. The disadvantage of the system used is the functionally independent expression of DHFR and tPA genes due to the use of two separate SV40 promoters for each of the synthesized proteins. Initially, the high transgene yields observed at methotrexate concentrations used (up to 10 μM) are usually associated with a significant level of chromosomal instability of the producer strain and, in the absence of a selective agent, which is very toxic and therefore not used in industrial pharmaceutical production, inevitably leads to a significant drop in the level products during prolonged cultivation of the cell line. Accordingly, the use of this approach makes it impossible to use this method in the production of therapeutic recombinant proteins.

В данном контексте очень важно отметить, что ни в одном из приведенных выше патентов не приводятся данные о стабильности системы экспрессии (числе пассажей, генераций), что является одним из важнейших факторов для промышленного производства белка, наряду с высоким уровнем экспрессии.In this context, it is very important to note that none of the above patents provides data on the stability of the expression system (number of passages, generations), which is one of the most important factors for the industrial production of protein, along with a high level of expression.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Настоящее изобретение решает задачу конструирования плазмидной ДНК, содержащей последовательность тканевого активатора плазминогена (tPA), и создания линии клеток, позволяющей получать рекомбинантный тканевый активатор плазминогена (rtPA) с высоким выходом на постоянном уровне до 190 мг/л и сохраняющим свою производительность на протяжении большого числа пассажей (не менее 50), что является критическим параметром возможности применения штамма-продуцента для промышленного производства белка.The present invention solves the problem of constructing plasmid DNA containing a sequence of tissue plasminogen activator (tPA), and creating a cell line that allows to obtain recombinant tissue plasminogen activator (rtPA) with a high yield at a constant level of 190 mg / l and maintaining its performance over a large number passages (at least 50), which is a critical parameter of the possibility of using a producer strain for industrial protein production.

Поставленная задача решается за счет конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК рВК415, состоящей из 11383 п.о., и линии клеток Cricetulus griseus CHO 1F8.The problem is solved by constructing a recombinant plasmid DNA rVK415, consisting of 11383 bp, and the cell line Cricetulus griseus CHO 1F8.

Введение различных генетических элементов генома эукариот в состав рекомбинантных конструкций, используемых для последующей трансфекции клеток млекопитающих, может оказывать положительное влияние на стабильность трансгена в геноме клетки-реципиента, существенно улучшая ростовые характеристики культуры (S.C. Makrides Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, (2003) Elsevier Science, chapters 10-12). Подобные элементы, в частности MAR, используются для создания промышленных штаммов-продуцентов, для которых критическим параметром, определяющим возможность его использования в производстве, является стабильность уровня продукции и скорости роста культуры.The introduction of various genetic elements of the eukaryotic genome into the composition of recombinant constructs used for subsequent transfection of mammalian cells can have a positive effect on the stability of the transgene in the genome of the recipient cell, significantly improving the growth characteristics of the culture (SC Makrides Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, (2003) Elsevier Science, chapters 10-12). Similar elements, in particular MAR, are used to create industrial producer strains for which the critical parameter determining the possibility of its use in production is the stability of the level of production and the growth rate of the culture.

Элементы прикрепления к ядерному матриксу MAR (Matrix Attachment Regions) представляют собой фрагменты ДНК эукариот длиной 300-3000 п.о. и играют ключевую роль в организации ядерной и хромосомной архитектуры. В интерфазе они фиксируют хроматин с белками, формирующими ядерный матрикс, разделяя геном эукариот на независимые хроматиновые петли (Mirkovitch, J., Mirault, M.E., and Laemmli, U.K. (1984) Cell 39, 223-232.). Благодаря колокализации MAR-элементов с участками активной транскрипции и регуляторных элементов в геноме, первые положительно влияют на уровень транскрипции трансгена, привлекая активаторы транскрипции и контролируя доступность ДНК в составе хроматина. Помимо указанных свойств MAR-элементы, например MAR гена лизоцима птиц, могут предотвращать постепенное снижение активности трансгенного промотера, что существенно повышает стабильность уровня экспрессии трансгена (Alien, G.C., Spiker, S., and Thompson, W.F. (2000) Plant Mol. Biol. 43, 361-376).Elements of attachment to the nuclear matrix MAR (Matrix Attachment Regions) are fragments of eukaryotic DNA with a length of 300-3000 bp and play a key role in organizing nuclear and chromosomal architecture. At interphase, they fix chromatin with proteins that form the nuclear matrix, separating the eukaryotic genome into independent chromatin loops (Mirkovitch, J., Mirault, M.E., and Laemmli, U.K. (1984) Cell 39, 223-232.). Due to the colocalization of MAR elements with regions of active transcription and regulatory elements in the genome, the former positively affect the transgene transcription level by attracting transcription activators and controlling the availability of DNA in chromatin. In addition to these properties, MAR elements, such as the MAR lysozyme gene of birds, can prevent a gradual decrease in the activity of the transgenic promoter, which significantly increases the stability of the level of transgene expression (Alien, GC, Spiker, S., and Thompson, WF (2000) Plant Mol. Biol. 43, 361-376).

В процессе конструирования плазмиды мы обнаружили, что использование MAR в плазмиде, включающей ген rtPA, позволяет поддерживать уровень экспрессии данного белка с наибольшей стабильностью. Преимущества предлагаемого изобретения также заключаются в использовании химико-ферментативного метода синтеза гена rtPA, что позволяет подобрать оптимальный кодонный состав гена, избежать наличия в последовательности структур ДНК, препятствующих процессу трансляции, криптических сайтов сплайсинга, полиаденилирования. Оптимизация первичной структуры гена и использование энхансера транскрипции цитомегаловируса CMV, а также фрагмента ДНК, обеспечивающего прикрепление к ядерному матриксу MAR, позволяют существенно увеличить уровень секреции rtPA в питательную среду и, соответственно, финальный выход целевого продукта.In the process of constructing the plasmid, we found that the use of MAR in a plasmid containing the rtPA gene allows us to maintain the expression level of this protein with the greatest stability. The advantages of the present invention also lie in the use of a chemical-enzymatic method of rtPA gene synthesis, which allows one to select the optimal codon composition of the gene, to avoid the presence of DNA structures in the sequence that impede the translation process, cryptic splicing sites, and polyadenylation. Optimization of the primary gene structure and the use of CMV cytomegalovirus transcription enhancer, as well as a DNA fragment that secures attachment to the MAR nuclear matrix, can significantly increase the level of rtPA secretion into the nutrient medium and, accordingly, the final yield of the target product.

Рекомбинантная плазмидная ДНК рВК415 содержит следующие последовательности: MAR - района прикрепления к ядерному матриксу гена лизоцима птиц, промотора вируса CMV, энхансера транскрипции вируса CMV, кДНК гена rtPA, внутреннего сайта инициации трансляции IRES, гена DHFR, сигнала полиаденилирования вируса SV40, кассеты, экспрессирующей ген аминогликозид-3'-фосфотрансферазы, обеспечивающего устойчивость штамма клеток-продуцента к генетицину (Neo), и кассеты для экспрессии в клетках бактерий гена Р-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к ампицилину. Плазмида рВК415 (фиг.4), кодирующая полипептид rtPA, характеризуется следующими признаками:The recombinant plasmid DNA rBK415 contains the following sequences: MAR - the region of attachment to the nuclear matrix of the bird lysozyme gene, CMV virus promoter, CMV virus transcription enhancer, rtPA cDNA, internal IRES translation site, DHFR gene, SV40 gene polyadenylation signal, cassette, aminoglycoside-3'-phosphotransferase, which ensures the resistance of the producer cell strain to geneticin (Neo), and cassettes for expression of the P-lactamase gene in bacterial cells, which provides resistance to ampicillin. The plasmid rVK415 (figure 4) encoding the rtPA polypeptide is characterized by the following features:

- состоит из 11383 п.о.,- consists of 11383 bp

- имеет молекулярную массу 7,4 МДа,- has a molecular weight of 7.4 MDa,

- кодирует полипептид тканевого активатора плазминогена,- encodes a polypeptide of tissue plasminogen activator,

- обеспечивает устойчивость бактериальных клеток, трансформированных данной плазмидой, к ампицилину и клеток млекопитающих, трансфицированных указанной плазмидой, к генетицину,- ensures the resistance of bacterial cells transformed with this plasmid to ampicillin and mammalian cells transfected with the indicated plasmid to geneticin,

- содержит уникальные участки узнавания следующих эндонуклеаз рестрикции:- contains unique recognition sites for the following restriction endonucleases:

AhdI (7352 п.о.), AsiSI (508 п.о.), BglII (2649 п.о.), BipI (2079 п.о.), BmtI (654 п.о.), BssHII (5778 п.о.), BstBI (6062 п.о.), BstEII (2388 п.о.), Bsu36I (2245 п.о.), EcoRI (10035 n.o.), EcoRV (10969 n.o.), FspAI (2020 n.o.), MluI (2433 n.o.), MreI (2220 n.o.), NheI (654 n.o.), NotI (3918 n.o.), PspXI (3342 n.o.), RsrII (5896 n.o.), SfiI (5133 n.o.), SgrAI (2220 n.o.), StuI (5184 n.o.), Tth111I (5496 n.o.), XhoI (3343 n.o.).AhdI (7352 bp), AsiSI (508 bp), BglII (2649 bp), BipI (2079 bp), BmtI (654 bp), BssHII (5778 bp) o.), BstBI (6062 bp), BstEII (2388 bp), Bsu36I (2245 bp), EcoRI (10035 no), EcoRV (10969 no), FspAI (2020 no), MluI (2433 no), MreI (2220 no), NheI (654 no), NotI (3918 no), PspXI (3342 no), RsrII (5896 no), SfiI (5133 no), SgrAI (2220 no), StuI (5184 no), Tth111I (5496 no), XhoI (3343 no).

Для производства белка была выбрана линия клеток Cricetulus griseus СНО DHFR-. Исходная линия приобретена в Американской коллекции клеточных культур (АТСС), CRL 9096. Выбор линии клеток обусловлен наличием оптимального профиля гликозилирования для синтеза человеческих белков, а также стабильностью и безопасностью данной линии клеток, что является важнейшим параметром для производства терапевтических белков. На основе этой линии клеток была получена линия клеток Cricetulus griseus СНО 1F8 - продуцент рекомбинантного активатора плазминогена человека, являющаяся производным яичников взрослого китайского хомяка.For protein production, the Cricetulus griseus CHO DHFR- cell line was selected. The baseline was purchased from the American Cell Culture Collection (ATCC), CRL 9096. The choice of cell line is due to the optimal glycosylation profile for the synthesis of human proteins, as well as the stability and safety of this cell line, which is an important parameter for the production of therapeutic proteins. Based on this cell line, the Cricetulus griseus CHO 1F8 cell line, a producer of the recombinant human plasminogen activator, which is a derivative of the ovaries of an adult Chinese hamster, was obtained.

Линия клеток Cricetulus griseus СНО 1F8 характеризуется следующими признаками.The cell line Cricetulus griseus CHO 1F8 is characterized by the following features.

Морфологические признаки: Клетки имеют типичные морфологические признаки эпителиальной культуры, и, исходно, представляют собой адгерантную культуру. Линия является гиподиплоидной (2n=22), модальное число хромосом 20.Morphological features: Cells have typical morphological features of an epithelial culture, and, initially, are an adherent culture. The line is hypodiploid (2n = 22), the modal number of chromosomes is 20.

Культуральные признаки: Клетки культивируются в монослое на простых питательных средах, например, на среде ДМЕМ в присутствии 2-10% фетальной сыворотки.Cultural traits: Cells are cultured in a monolayer on simple nutrient media, for example, DMEM in the presence of 2-10% fetal serum.

Физиолого-биохимические признаки: Клетки растут при температуре 37°С, pH 6.7-7.3.Physiological and biochemical characteristics: Cells grow at a temperature of 37 ° C, pH 6.7-7.3.

Устойчивость к антибиотикам: Клетки обладают устойчивостью к генетицину в концентрации 1 мг/мл.Antibiotic Resistance: Cells are resistant to geneticin at a concentration of 1 mg / ml.

Штамм клеточной линии Cricetulus griseus СНО 1F8 был депонирован во Всероссийскую Коллекцию промышленных микроорганизмов в ГНИЙ Генетика-ВКПМ под номером Н-127, дата депонирования 20.06. 2012 г.The strain of the cell line Cricetulus griseus CHO 1F8 was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms in the GNII Genetika-VKPM under the number H-127, date of deposit 20.06. 2012 year

Заявленное изобретение поясняется на следующих фигурах:The claimed invention is illustrated in the following figures:

На фиг.1 представлена аминокислотная последовательность белка tPA, SEQ ID NO:1.Figure 1 presents the amino acid sequence of the protein tPA, SEQ ID NO: 1.

На фиг.2. представлена оптимизированная нуклеотидная последовательность гена tPA, SEQ ID NO:2.In figure 2. presents the optimized nucleotide sequence of the tPA gene, SEQ ID NO: 2.

На фиг.3 а) и б) представлена схема получения векторной конструкции pBK415 для экспрессии рекомбинантного tPAFigure 3 a) and b) presents the scheme for obtaining the vector construct pBK415 for expression of recombinant tPA

На фиг.4 представлена карта рекомбинантной плазмидной ДНК pBK-415, использованной для создания продуцента рекомбинантного tPA.Figure 4 presents a map of recombinant plasmid DNA pBK-415 used to create a producer of recombinant tPA.

На фиг.5 представлена схема выделения рекомбинантного tPA.Figure 5 presents the allocation scheme of recombinant tPA.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pBK415.Example 1. Construction of recombinant plasmid DNA pBK415.

Нуклеотидную последовательность, соответствующую кДНК гена тканевого активатора плазминогена человека, получают химико-ферментативным синтезом. Для этого оптимизированную последовательность гена разбивают на перекрывающиеся фрагменты размером около 50 п.о. Химический синтез олигонуклеотидов, соответствующих этим фрагментам, проводят с помощью твердофазного фосфамидитного метода, например, с использованием синтезатора ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск). Полученные олигонуклеотиды подвергают 5'-концевому фосфорилированию с использованием Т4 полинуклеотидкиназы (NEB, США). Фосфорилированные олигонуклеотиды смешивают в эквимолярном соотношении в 50 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-HCl, pH 7,56, 10 мМ MgCl₂, 0,2 мМ rATP, 10 мМ дитиотреита, прогревают до 65°С, медленно охлаждают до 37°С в течение часа и добавляют Т4-ДНК-лигазу. Реакцию лигирования ДНК проводят 12 ч при 37°С, 0,1 мкл полученного раствора используют в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПНР) в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы Pfu и специфических праймеров:The nucleotide sequence corresponding to the cDNA of the human tissue plasminogen activator gene is obtained by chemical-enzymatic synthesis. To do this, the optimized gene sequence is divided into overlapping fragments of about 50 bp in size. The chemical synthesis of oligonucleotides corresponding to these fragments is carried out using the solid-phase phosphamidite method, for example, using the ASM-102U synthesizer (BIOSSET, Novosibirsk). The resulting oligonucleotides are subjected to 5'-terminal phosphorylation using T4 polynucleotide kinase (NEB, USA). Phosphorylated oligonucleotides are mixed in an equimolar ratio in 50 μl of a buffer containing 20 mM Tris-HCl, pH 7.56, 10 mM MgCl ₂ , 0.2 mM rATP, 10 mM dithiotreite, heated to 65 ° C, slowly cooled to 37 ° C for an hour and add T4 DNA ligase. The DNA ligation reaction is carried out for 12 hours at 37 ° C, 0.1 μl of the resulting solution is used as a matrix in the polymerase chain reaction (NDP) in the presence of thermostable Pfu DNA polymerase and specific primers:

F7_fwdF7_fwd

5'-TAGGCTAGCCGCCACCATGGACGCCATGAAGCGCGGCCT-3' и5'-TAGGCTAGCCGCCACCATGGACGCCATGAAGCGCGGCCT-3 'and

F7_rev 5'-CGACGCGTTAGGGGCGCATGTTGTCGCGGATCCA-3'.F7_rev 5'-CGACGCGTTAGGGGCGCATGTTGTCGCGGATCCA-3 '.

Синтезированный таким образом фрагмент ДНК содержит последовательность кДНК гена тканевого активатора плазминогена человека, фланкированную сайтами узнавания рестриктаз NheI и MluI - SEQ ID N2 (фиг.2). Продукт амплификации гидролизуют рестриктазами NheI и MluI, очищают электрофорезом в 1% агарозном геле, полосу ДНК величиной около 1700 п.о. выделяют из геля методом электроэлюции и осаждают ДНК из раствора этанолом.The DNA fragment synthesized in this way contains the cDNA sequence of the human tissue plasminogen activator gene flanked by the restriction enzyme recognition sites NheI and MluI — SEQ ID N2 (FIG. 2). The amplification product is hydrolyzed with restriction enzymes NheI and MluI, purified by electrophoresis on a 1% agarose gel, a DNA strip of about 1700 bp. isolated from the gel by electroelution and precipitated DNA from the solution with ethanol.

Для получения векторной ДНК pBK415 использовали серию последовательных этапов клонирования (Фиг.3 а) и б)).To obtain vector DNA pBK415 used a series of successive stages of cloning (Figure 3 a) and b)).

В качестве исходной плазмиды был выбран вектор pIRES (Clontech, США). Используя сайты рестрикции XbaI и NotI, в указанный вектор клонировали ген дигидрофолатредуктазы мыши, полученный методом ПЦР с использованием геномной ДНК, выделенной из клеток миеломы мыши SP2/0, и специфических праймеровThe pIRES vector (Clontech, USA) was selected as the initial plasmid. Using the XbaI and NotI restriction sites, the mouse dihydrofolate reductase gene, obtained by PCR using genomic DNA isolated from SP2 / 0 mouse myeloma cells and specific primers, was cloned into the indicated vector

DHFR_fwdDHFR_fwd

5'-CCTCTAGATGGTTGTGGCCATATTATCATCGTGTTTTTCAAAG-3'5'-CCTCTAGATGGTTGTGGCCATATTATCATCGTGTTTTTTCAAAG-3 '

и DHFR_revand DHFR_rev

5'- GGAAGCGGCCGCTTAGTCTTTCTTCTCGTAGACTTCA-3'5'- GGAAGCGGCCGCTTAGTCTTTCTTCTCGTAGACTTCA-3 '

с последующим проведением сайт-направленного мутагенеза для оптимизации консенсусной последовательности в окружении инициаторного кодона IRES-элемента с помощью набора QuikChange® II XL (Stratagene, США) и следующих олигонуклеотидов:followed by site-directed mutagenesis to optimize the consensus sequence surrounded by the initiator codon of the IRES element using the QuikChange® II XL kit (Stratagene, USA) and the following oligonucleotides:

D3_fwdD3_fwd

5' - CCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGTTCGACCATTGAAC5 '- CCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGTTCGACCATTGAAC

TGCATC-3'TGCATC-3 '

и D3_revand D3_rev

5' - GATGCAGTTCAATGGTCGAACCATGGTTGTGGCCATATTATCATCGTGTTTTT CAAAGG-3'.5 '- GATGCAGTTCAATGGTCGAACCATGGTTGTGGCCATATTATCATCGTGTTTTT CAAAGG-3'.

В полученную плазмиду рАР225 по сайтам рестрикции NheI и MluI клонировали синтезированную ранее последовательность кДНК гена тканевого активатора плазминогена. Отбор полученных после трансформации лигазной смеси бактериальных клеток XL-10 Gold проводили таким образом, чтобы выявить плазмидную ДНК pBK413, содержащую последовательность кДНК тканевого активатора плазминогена человека.The previously synthesized cDNA sequence of the tissue plasminogen activator gene was cloned into the obtained plasmid pAP225 at the NheI and MluI restriction sites. The selection of the bacterial cells XL-10 Gold obtained after transformation of the ligase mixture was carried out in such a way as to reveal the plasmid pBK413 DNA containing the human plasminogen activator cDNA sequence.

Плазмиду pBK413 далее последовательно обрабатывали эндонуклеазой рестрикции Bglil и Т4-ДНК полимеразой, и образовавшийся вектор использовали в реакции лигирования с ПЦР-продуктом, полученным с использованием MAR-специфических праймеровPlasmid pBK413 was further sequentially treated with Bglil restriction endonuclease and T4 DNA polymerase, and the resulting vector was used in the ligation reaction with the PCR product obtained using MAR-specific primers

MAR_fwd 5'-GGGGATCCGTAATACAATTGTACCAGGTTTTGGTTTATTAC-3' иMAR_fwd 5'-GGGGATCCGTAATACAATTGTACCAGGTTTTGGTTTATTAC-3 'and

MAR_rev 5' -GAAAACAATATATTTCCAAATGAAAAAAAAATCTGATAAAAAG-3'.MAR_rev 5 '-GAAAACAATATATTTCCAAATGAAAAAAAAATCTGATAAAAAG-3'.

Отбор полученных после трансформации лигазной смеси бактериальных клеток XL-10 Gold проводили таким образом, чтобы выявить плазмидную ДНК рВК415, содержащую последовательность MAR в геномной ориентации по отношению к промотору.The selection of bacterial cells XL-10 Gold obtained after transformation of the ligase mixture was carried out in such a way as to reveal plasmid DNA pBK415 containing the MAR sequence in the genomic orientation with respect to the promoter.

В дальнейшем первичная последовательность полученной плазмидной ДНК была подтверждена методом сиквенирования по Сэнгеру. По данным секвенирования отобрали плазмиду, нуклеотидная и соответствующая ей аминокислотная последовательности NheI-MluI фрагмента которой полностью идентичны последовательности кДНК гена тканевого активатора плазминогена человека, которую использовали в дальнейшей работе.Subsequently, the primary sequence of the obtained plasmid DNA was confirmed by the Sanger sequencing method. According to sequencing data, a plasmid was selected, the nucleotide and its corresponding amino acid sequence of the NheI-MluI fragment of which are completely identical to the cDNA sequence of the human tissue plasminogen activator gene, which was used in further work.

Пример 2. Получение линии клеток Cricetulus griseus CHO 1F8, стабильно продуцирующих рекомбинантный активатор плазминогена человека.Example 2. Obtaining a cell line of Cricetulus griseus CHO 1F8 stably producing recombinant human plasminogen activator.

Для получения клеточной линии, стабильно продуцирующей рекомбинантный активатор плазминогена человека (rtPA), клетки линии Cricetulus griseus CHO DHFR-(ATCC CRL 9096), трансфицируют плазмидной ДНК рВК415, линеаризованной по сайту рестрикции BspHI, например методом липофекции при помощи реагента jetPEl™ (Polyplus Transfection Inc., США).To obtain a cell line stably producing a recombinant human plasminogen activator (rtPA), cells of the Cricetulus griseus CHO DHFR- line (ATCC CRL 9096) are transfected with plasmid DNA pBK415 linearized at the BspHI restriction site, for example, by lipofection using jetuspl Trans ™ Poly Inc., USA).

Клетки Cricetulus griseus CHO DHFR высевают в лунки шестилуночного планшета (например Costar) с плотностью 250×10³ клеток/лунка в 3 мл среды DMEM/F12 содержащей 10% сыворотки, и инкубируют 24 часа при 37°С в СО₂ инкубаторе.Cricetulus griseus CHO DHFR cells are seeded in wells of a six-well plate (e.g. Costar) with a density of 250 × 10 ³ cells / well in 3 ml of DMEM / F12 medium containing 10% serum and incubated for 24 hours at 37 ° C in a CO ₂ incubator.

Далее проводят трансфекцию, используя 2 мкг линеаризованной по сайту рестрикции BspHI плазмиды рВК415 и 4 мкл реагента jetPEl™ на лунку согласно рекомендациям производителя (соотношение N/P=5). Через 48 часов после трансфекции начинают селекцию культуры с целью получения стабильных трансфектантов путем смены среды на селективную: среда MEM с добавлением 10% диализованной сыворотки в присутствии антибиотика генетицина в концентрации 1 мг/мл. Смену селективной среды проводят регулярно каждые 3-4 дня. Начиная с 7-го дня, лунки анализируют на наличие клонов активно делящихся клеток. По окончании процедуры селекции (окончание селекции определялось по полной гибели не трансфицированной популяции клеток, также находящихся под давлением антибиотика) и восстановления жизнеспособности пула стабильных трансфектантов была определена его продуктивность.Next, transfection is performed using 2 μg of linearized at the BspHI restriction site plasmid pBK415 and 4 μl of jetPEl ™ reagent per well according to the manufacturer's recommendations (N / P ratio = 5). 48 hours after transfection, culture selection is started in order to obtain stable transfectants by changing the medium to selective: MEM medium supplemented with 10% dialyzed serum in the presence of 1 mg / ml geneticin antibiotic. The change of selective medium is carried out regularly every 3-4 days. Starting from the 7th day, the wells are analyzed for clones of actively dividing cells. At the end of the selection procedure (the end of the selection was determined by the complete death of the non-transfected population of cells also under antibiotic pressure) and the viability of the pool of stable transfectants was restored, its productivity was determined.

Продуктивность клонов оценивают методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя, например, набор Assay Max (AssayPro, США). Для этого в лунках, в которых клетки достигли 80-90% конфлюентности, заменяют среду на свежую, и инкубируют 24, 48 и 72 часа при 37°С в СО₂-инкубаторе. Супернатант используют в ELISA тесте. Продуктивность пула стабильных трансфектантов составляла 25 мкг/л.Clone productivity was evaluated by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using, for example, the Assay Max kit (AssayPro, USA). To do this, in the wells in which the cells have reached 80-90% confluency, the medium is replaced with fresh and incubated for 24, 48 and 72 hours at 37 ° C in a CO ₂ incubator. The supernatant is used in an ELISA test. The productivity of the stable transfectant pool was 25 μg / L.

Для увеличения уровня экспрессии рекомбинантного активатора плазминогена человека пул стабильных трансфектантов был подвергнут процедуре амплификации метотрексатом (МТХ).To increase the expression level of the recombinant human plasminogen activator, the pool of stable transfectants was subjected to methotrexate amplification (MTX).

Для биотехнологических целей в системе амплификации рекомбинантных генов в качестве селектируемого маркера часто используют ген дигидрофолатредуктазы (DHFR), интегрированный в экспрессирующий вектор. DHFR катализирует превращение фолиевой кислоты в тетрагидрофолат, необходимый для синтеза эукариотическими клетками глицина, тимидинмонофосфата и пуриновых оснований. В этой связи клетки СНО, в которых ген DHFR инактивирован под действием мутации (СНО DHFR-), не растут на средах без нуклеозидов и приобретают эту способность после трансфекции геном DHFR.For biotechnological purposes, the dihydrofolate reductase gene (DHFR) integrated into the expression vector is often used as a selectable marker in the recombinant gene amplification system. DHFR catalyzes the conversion of folic acid to tetrahydrofolate, which is necessary for eukaryotic cells to synthesize glycine, thymidine monophosphate and purine bases. In this regard, CHO cells in which the DHFR gene is inactivated by mutation (CHO DHFR-) do not grow on nucleoside-free media and acquire this ability after transfection with the DHFR gene.

Растущие трансфектанты далее отбираются по признаку амплификации гена DHFR на фоне увеличивающихся концентраций метотрексата - ингибитора DHFR, в питательной среде, так как увеличение числа копий гена будет придавать клеткам устойчивость к ингибитору в больших концентрациях. После проведения множественных раундов селекции получают популяцию клеток, содержащих до нескольких сотен копий гена DHFR.Growing transfectants are further selected on the basis of amplification of the DHFR gene against the background of increasing concentrations of methotrexate, a DHFR inhibitor, in a nutrient medium, since an increase in the number of copies of the gene will give cells resistance to the inhibitor in high concentrations. After conducting multiple rounds of selection, a population of cells containing up to several hundred copies of the DHFR gene is obtained.

Для данного стабильно трансфицированного пула было проведено 4 последовательных раунда амплификации метотрексатом. Для этой цели клетки культивируются на среде MEM, не содержащей глицин, гипоксантин и тимидин, в присутствии 10% диализованной фетальной сыворотки с добавлением увеличивающихся количеств метотрексата (таблица 1). Продолжительность каждого раунда составляла примерно 10-14 дней.For this stably transfected pool, 4 consecutive rounds of amplification with methotrexate were performed. For this purpose, the cells are cultured in MEM medium free of glycine, hypoxanthine and thymidine in the presence of 10% dialyzed fetal serum with the addition of increasing amounts of methotrexate (table 1). The duration of each round was approximately 10-14 days.

Таблица 1Table 1 Концентрация МТХMTX Concentration Продуктивность, пкг/кл/деньProductivity, PCG / CL / Day Продуктивность, мг/лProductivity, mg / L Без МТХWithout MTX 0,0090.009 0,0250,025 200 нМ200 nM 0,120.12 0,150.15 400 нМ400 nM 0,140.14 1,01,0 600 нМ600 nM 3,63.6 8,08.0 800 нМ800 nM 15,015.0 9,99.9

Далее амплифицированный пул стабильных трансфекантов субклонируют методом предельного разведения. Для субклонирования культура рассевается с плотностью 0,5 клетки/лунку в 96-луночные планшеты. Всего зарегистрировано и проанализировано 130 клонов.Next, the amplified pool of stable transfectants is subcloned by the limiting dilution method. For subcloning, the culture is seeded at a density of 0.5 cells / well in 96-well plates. A total of 130 clones were recorded and analyzed.

Таблица 2table 2 КлоныClones Продуктивность: монослойная культура, среда МЕМ+10% сывороткиProductivity: monolayer culture, MEM medium + 10% serum пкг/кл/деньpkg / cells / day мг/лmg / l 1В11B1 4,54,5 15,815.8 1F81F8 3,53,5 9,89.8 1G41g4 4,64.6 12,012.0 3В33B3 3,03.0 6,46.4 3В43B4 6,86.8 19,019.0 3G93G9 2,52,5 10,410,4 2D112D11 1,71.7 8,88.8 1D71D7 4,44.4 8,38.3

Линия клеток Cricetulus griseus CHO IF 8 - продуцент рекомбинантного активатора плазминогена человека, была успешно адаптирована к суспензионным бессывороточным условиям культивирования.The cell line Cricetulus griseus CHO IF 8, a producer of the recombinant human plasminogen activator, has been successfully adapted to suspension serum-free culture conditions.

Для процедуры адаптации был использован протокол постепенного снижения содержания питательной среды с сывороткой в пользу бессывороточной среды. Снижение проводили по следующей схеме:For the adaptation procedure, a protocol was used to gradually decrease the content of nutrient medium with serum in favor of serum-free medium. The reduction was carried out according to the following scheme:

соотношение среды с сывороткой и бессывороточной среды 50/50, далее, после стабилизации жизнеспособности культуры на уровне не менее 80% снижение содержания сывороточной среды до 25%, культивирование до стабилизации жизнеспособности и, далее, переход к соотношению 10/90 и, наконец, к 100% бессывороточной среде. Культивирование на шейкере в 100% бессывороточной среде проводили до стабилизации жизнеспособности культуры на уровне 90-95% и времени удвоения.the ratio of the medium with serum and serum-free medium is 50/50, then, after stabilization of the culture viability at a level of not less than 80%, a decrease in the content of serum medium to 25%, cultivation until stabilization of viability, and then transition to a ratio of 10/90 and, finally, 100% serum free medium. Cultivation on a shaker in 100% serum-free medium was carried out until stabilization of the culture viability at the level of 90-95% and doubling time.

Характеристики данной линии представлены в Таблице 3:The characteristics of this line are presented in Table 3:

Таблица 3Table 3 Культуральная среда: SFM4CHO (Hyclone), суспензионное культивированиеCulture medium: SFM4CHO (Hyclone), suspension culture Продуктивность, мг/л/деньProductivity, mg / l / day 14-1914-19 Удельная продукция, пкг/клетка/деньSpecific production, PCG / cell / day 13,513.5 Время удвоения, чDoubling time, h 28-3028-30

Для данного клона была проанализирована стабильность продуцирующей способности и ростовых характеристик. Для этой цели клетки культивируют на протяжении 50-100 генераций, периодически оценивая как уровень экспрессии rhtPA, так и ростовые характеристики клонов.For this clone, stability of the producing ability and growth characteristics were analyzed. For this purpose, cells are cultured for 50-100 generations, periodically evaluating both the level of rhtPA expression and the growth characteristics of the clones.

Оптимизация состава питательной среды привела к увеличению уровня экспрессии целевого белка примерно до 50 мг/л/24 ч. Так, культивирование данного клона в присутствии специфической питательной добавки СНО Bioreactor supplement (SAFC Biosc.) приводит к увеличению удельной продукции в 1,5 раза, а в сочетании с бутиратом натрия (0,5-1 мМ) или диметиосульфоксидом (1% V/V) увеличение удельной продукции составляет 2-2,5 раза.Optimization of the composition of the nutrient medium led to an increase in the expression level of the target protein to about 50 mg / l / 24 h. Thus, cultivation of this clone in the presence of a specific nutritional supplement CHO Bioreactor supplement (SAFC Biosc.) Leads to an increase in specific production by 1.5 times, and in combination with sodium butyrate (0.5-1 mM) or dimethiosulfoxide (1% V / V), the increase in specific production is 2-2.5 times.

Таким образом, был получен один из наиболее производительных и стабильных клонов Cricetulus griseus CHO 1F8, который был далее использован для создания мастер-банка и последующего производства рекомбинантного активатора плазминогена человека.Thus, one of the most productive and stable clones of Cricetulus griseus CHO 1F8 was obtained, which was then used to create a master bank and subsequent production of a recombinant human plasminogen activator.

Пример 3. Культивирование клеток-продуцентов rhtPA в биореакторе с перфузией питательной среды.Example 3. Cultivation of rhtPA producing cells in a bioreactor with perfusion of culture medium.

Клетки культивируют суспензионным способом в биореакторе с перфузией питательной средой в объеме 0,2-1 объем биореактора/сутки, как правило 0,25-0,5 объема биореактора/сутки, при 37°С, pH 7,0±0,2, с содержанием растворенного кислорода в пределах от 20 до 50% от насыщения, с 5% СО₂ в газовой фазе.Cells are cultured in a suspension method in a bioreactor with perfusion of nutrient medium in a volume of 0.2-1 volume of a bioreactor / day, usually 0.25-0.5 volume of a bioreactor / day, at 37 ° C, pH 7.0 ± 0.2, with dissolved oxygen in the range from 20 to 50% of saturation, with 5% CO ₂ in the gas phase.

Для выращивания клеток-продуцентов в фазе логарифмического роста используют питательную среду SFM4CHO; в продуктивный период в стационарной фазе роста в питательную среду вносят добавки: СНО Bioreactor supplement (SAFC Biose) 5 мл/1 л питательной среды в сутки, диметилсульфоксид 1%V/V, глюкозу до уровня не менее 3 г/л.SFM4CHO nutrient medium is used to grow producer cells in a logarithmic growth phase; In the productive period in the stationary phase of growth, additives are added to the nutrient medium: CHO Bioreactor supplement (SAFC Biose) 5 ml / 1 L of nutrient medium per day, dimethyl sulfoxide 1% V / V, glucose to a level of at least 3 g / L.

При концентрации клеток в стационарной фазе роста в пределах 5-15 млн/мл, как правило 10 млн/мл, экспрессия целевого белка tPA составляет 70-190 мг/л среды в сутки, как правило 150 мг/л/сутки.When the concentration of cells in the stationary phase of growth is in the range of 5-15 million / ml, usually 10 million / ml, the expression of the target tPA protein is 70-190 mg / l of medium per day, usually 150 mg / l / day.

Пример 4. Выделение tPA с использованием металло-хелатной хроматографии на IMAC Sepharose.Example 4. Isolation of tPA using metal chelate chromatography on an IMAC Sepharose.

IMAC-сефароза, насыщенная ионами переходного металла, является псевдоаффинным сорбентом для белков, имеющих специфический центр связывания соответствующего металла. Молекула tPA содержит центр связывания цинка, что позволяет специфически сорбировать белок на Zn-IMAC сефарозе. Поэтому выделение на IMAC-сефарозе использовали для захвата фракции tPA из культуральной жидкости и ее очистки от посторонних белков, не обладающих аффинитетом к переходным металлам и не связывающихся с сорбентом. Этот способ также позволяет сконцентрировать белок перед нанесением на следующую хроматографическую стадию.IMAC-sepharose, saturated with transition metal ions, is a pseudo-affinity sorbent for proteins having a specific binding site for the corresponding metal. The tPA molecule contains a zinc binding center, which allows specific sorption of the protein on Zn-IMAC sepharose. Therefore, isolation on IMAC-sepharose was used to capture the tPA fraction from the culture fluid and to purify it from extraneous proteins that do not have an affinity for transition metals and do not bind to the sorbent. This method also allows you to concentrate the protein before applying to the next chromatographic step.

Все хроматографические стадии выделения проводили при температуре +4-10°С, буферные растворы предварительно охлаждали. Перед нанесением культуральной жидкости сорбент насыщали ионами цинка путем пропускания через слой сорбента 0.2 М раствора ацетата цинка с последующей промывкой водой и уравновешивали стартовым буфером (20 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCl, 0.05% полисорбат 80, 5% спирт (изопропиловый или этиловый), pH 8.0).All chromatographic stages of isolation were carried out at a temperature of + 4-10 ° C, buffer solutions were pre-cooled. Before applying the culture fluid, the sorbent was saturated with zinc ions by passing a 0.2 M zinc acetate solution through a sorbent layer, followed by washing with water and equilibrated with start buffer (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 0.05% polysorbate 80, 5% alcohol (isopropyl or ethyl) pH 8.0).

После нанесения культуральной жидкости сорбент промывали от несвязавшихся примесей стартовым буфером, затем последовательно промывали высокосолевым буфером (содержащим 1М NaCl), имидазольным буфером (содержащим 0,1М имидазол) и низкосолевым буфером (включающим 50 мМ ацетат натрия). Указанные промывки позволяют отделить tPA от неспецифически и слабо связанных примесных белков и нуклеиновых кислот штамма-продуцента, а также подготовить продукт к элюции.After applying the culture fluid, the sorbent was washed from unbound contaminants with a start buffer, then it was washed successively with a high salt buffer (containing 1 M NaCl), an imidazole buffer (containing 0.1 M imidazole) and a low salt buffer (containing 50 mM sodium acetate). These washes allow the separation of tPA from nonspecific and weakly bound impurity proteins and nucleic acids of the producer strain, as well as preparing the product for elution.

Фракцию tPA элюировали кислым буфером, содержащим 50 мМ ЭДТА, и разбавляли в 5 раз кислым низкосолевым буфером, содержащим 50 мМ ацетат натрия (pH 4.5). Полученный раствор использовали для нанесения на следующую стадию выделения.The tPA fraction was eluted with acidic buffer containing 50 mM EDTA and diluted 5 times with acidic low-salt buffer containing 50 mM sodium acetate (pH 4.5). The resulting solution was used for application to the next isolation step.

Пример 5. Выделение tPA с использованием катионо-обменной хроматографии на SP Sepharose с предколонкой Q SepharoseExample 5. Isolation of tPA using cation exchange chromatography on SP Sepharose with a column of Q Sepharose

При выделении tPA на данной стадии использовали последовательно подключенные колонки с Q Sepharose и SP Sepharose (соотношение объемов сорбентов примерно 1:10). Q и SP сефарозы являются, соответственно, сильными анионо- и катионо-обменными сорбентами, позволяющими разделение биомолекул с разными поверхностными зарядами; при этом Q сефароза обладает высокими ДНК-связывающими свойствами. Таким образом, одновременное применение этих сорбентов при низком значении pH в процессе выделения tPA позволяет эффективно удалить остаточную ДНК штамма-продуцента и белки, обладающие отрицательным зарядом при рабочем pH, без потери целевого белка (на Q сефарозе) и количественно сорбировать tPA (на SP сефарозе), дополнительно очищая белок от примесей и переводя его в подходящий буферный раствор для последующей хроматографической стадии.When tPA was isolated at this stage, series-connected columns with Q Sepharose and SP Sepharose were used (sorbent volume ratio of about 1:10). Q and SP sepharoses are, respectively, strong anionic and cationic exchange sorbents, allowing the separation of biomolecules with different surface charges; while Q sepharose has high DNA-binding properties. Thus, the simultaneous use of these sorbents at a low pH during the process of tPA isolation allows one to effectively remove the residual DNA of the producer strain and proteins that have a negative charge at the working pH without loss of the target protein (on Q Sepharose) and quantitatively sorb tPA (on SP Sepharose ), further purifying the protein from impurities and transferring it to a suitable buffer solution for the subsequent chromatographic step.

Колонки с сорбентами предварительно уравновешивали стартовым буфером (50 мМ ацетат натрия, 100 мМ NaCl, 0.05% полисорбат 80, pH 5.0), после чего наносили разбавленный элюат с IMAC сефарозы. Фракцию tPA элюировали щелочным буфером, содержащим 1М изотиоцианат калия, и разбавляли в 10 раз низкосолевым щелочным буфером (содержащим 100 мМ Na-СО₃, pH 10.0). Полученный раствор использовали для нанесения на следующую стадию выделения.Columns with sorbents were preliminarily balanced with a start buffer (50 mM sodium acetate, 100 mM NaCl, 0.05% polysorbate 80, pH 5.0), after which a diluted eluate with IMAC sepharose was applied. The tPA fraction was eluted with an alkaline buffer containing 1 M potassium isothiocyanate and diluted 10 times with a low salt alkaline buffer (containing 100 mM Na-CO ₃ , pH 10.0). The resulting solution was used for application to the next isolation step.

Пример 6. Выделение tPA с использованием псевдоаффинной хроматографии на Lysine Sepharose Lysine сефароза является псевдоаффинным сорбентом для белков, имеющих область связывания (биоспецифическую или по локальному заряду) с лизином. Мономерная молекула tPA специфично сорбируется на Lys сефарозу, в то время как олигомерные формы не связываются с носителем, что позволяет эффективно отделить олигомерные формы от мономерной и получить концентрированную фракцию белка в лизин-содержащем буферном растворе, стабилизирующем продукт в мономерной форме.Example 6. Isolation of tPA using pseudo-affinity chromatography on Lysine Sepharose Lysine sepharose is a pseudo-affinity sorbent for proteins having a binding region (biospecific or local charge) with lysine. The monomer molecule tPA is specifically adsorbed on Lys sepharose, while the oligomeric forms do not bind to the carrier, which allows one to efficiently separate the oligomeric forms from the monomeric one and to obtain a concentrated protein fraction in a lysine-containing buffer solution that stabilizes the product in monomeric form.

Колонку с Lysine сефарозой предварительно уравновешивали стартовым буфером (20 мМ Na-СО₂, 0.1 М NaCl, 0.05% полисорбат 80, pH 10.0), после чего наносили разбавленный элюат, полученный в предыдущем примере. Фракцию tPA элюировали буфером, содержащим 50 мМ лизин.The Lysine Sepharose column was pre-equilibrated with start buffer (20 mM Na-CO ₂ , 0.1 M NaCl, 0.05% polysorbate 80, pH 10.0), after which the diluted eluate obtained in the previous example was applied. The tPA fraction was eluted with a buffer containing 50 mM lysine.

Пример 7. Концентрирование и диафильтрация tPA в буфер готовой формы.Example 7. Concentration and diafiltration of tPA into a finished buffer.

Для диафильтрации применяли полиэфирсульфоновый фильтр, непроницаемый для частиц весом более 30 кДа, который предварительно уравновешивали буфером готовой формы следующего состава: 400 мМ аргинин-фосфата, 0.02% полисорбат 80, pH 7.3. В элюат, полученный в Примере 6, вносили сухой L-аргинин гидрохлорид до концентрации 400 мМ. После полного растворения полученный раствор концентрировали на системе для диафильтрации до концентрации 4-5 мг tPA/мл, затем диафильтровали в буфер готовой формы, путем пропускания через систему 8-10 объемов. Полученную субстанцию замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С.For diafiltration, a polyethersulfone filter was used, impermeable to particles weighing more than 30 kDa, which were previously balanced with a buffer of the following form: 400 mM arginine phosphate, 0.02% polysorbate 80, pH 7.3. Dry L-arginine hydrochloride was added to the eluate obtained in Example 6 to a concentration of 400 mM. After complete dissolution, the resulting solution was concentrated on a diafiltration system to a concentration of 4-5 mg tPA / ml, then diafiltered into a finished buffer by passing 8-10 volumes through the system. The resulting substance was frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C.

Пример 8. Измерение биологической активности субстанции tPA.Example 8. Measurement of the biological activity of the substance tPA.

Определение активности tPA проводили тремя методами - с использованием прямого хромогенного субстрата tPA; с использованием хромогенного субстрата плазмина (непрямого субстрата) и методом лизиса фибриновых сгустков (ЛФС). В каждом из методов в качестве стандарта использовали международный стандарт активности tPA и составляли калибровочную шкалу для определения активности.The determination of tPA activity was carried out by three methods — using a direct chromogenic tPA substrate; using a chromogenic plasmin substrate (indirect substrate) and fibrin clot lysis (LFS). In each of the methods, the international standard for tPA activity was used as a standard and a calibration scale was drawn up to determine activity.

В первом методе к tPA добавляли прямой синтетический пептидный субстрат, соединенный с хромофором, что приводило к расщеплению субстрата. В результате этого реакционная смесь приобретала желтую окраску. Измеряли поглощение реакционной смеси при 405 нм, которое прямо пропорционально активности tPA.In the first method, a direct synthetic peptide substrate coupled to a chromophore was added to tPA, resulting in cleavage of the substrate. As a result, the reaction mixture turned yellow. The absorbance of the reaction mixture was measured at 405 nm, which is directly proportional to the tPA activity.

При использовании второго метода в реакционную смесь добавлялись tPA, природный субстрат tPA, плазминоген, и субстрат плазмина (продукта расщепления плазминогена), соединенный с хромофором. В результате активации плазминогена полученный плазмин расщеплял субстрат, и освободившийся хромофор приводил к окрашиванию раствора в желтый цвет, интенсивность которого прямо пропорциональна активности tPA.Using the second method, tPA, a natural substrate of tPA, plasminogen, and a substrate of plasmin (a product of plasminogen cleavage) combined with a chromophore were added to the reaction mixture. As a result of plasminogen activation, the obtained plasmin cleaved the substrate, and the released chromophore led to the staining of the solution yellow, the intensity of which is directly proportional to the tPA activity.

При использовании третьего метода в реакционную смесь добавляли компоненты, необходимые для образования фибринового сгустка (нормальная плазма и каолин), и компоненты, необходимые для лизиса (плазминоген и tPA), и измеряли время лизиса, которое пропорционально активности tPA. В данном случае измерение активности tPA основано на способности tPA активировать плазминоген до плазмина в фибриновом сгустке, что приводит к его лизису.Using the third method, the components necessary for the formation of a fibrin clot (normal plasma and kaolin) and the components necessary for lysis (plasminogen and tPA) were added to the reaction mixture, and the lysis time, which is proportional to the tPA activity, was measured. In this case, the measurement of tPA activity is based on the ability of tPA to activate plasminogen to plasmin in a fibrin clot, which leads to its lysis.

Удельная активность субстанции tPA, определенная при помощи перечисленных методов, составила 580000 МЕ/мг.The specific activity of the substance tPA, determined using the above methods, amounted to 580,000 IU / mg.

Таким образом, настоящее изобретение позволяет получить рекомбинантный активатор плазминогена человека со свойствами, идентичными свойствам природного полипептида. Полученный rtPA в дальнейшем может быть использован для изготовления лекарственных препаратов и в фармацевтической промышленности.Thus, the present invention allows to obtain a recombinant activator of human plasminogen with properties identical to those of a natural polypeptide. The resulting rtPA can then be used for the manufacture of drugs and in the pharmaceutical industry.

Claims (5)

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК рВК415, кодирующая полипептид с последовательностью тканевого активатора плазминогена человека, имеющая размер 11383 п.о., с физической картой, представленной на фиг.4, и состоящая из следующих элементов:
- оптимизированной последовательности, кодирующей полипептид тканевого активатора плазминогена человека, SEQ ID NO: 2,
- MAR - области прикрепления к ядерному матриксу гена лизоцима птиц,
- усилителя транскрипции вируса CMV,
- внутреннего сайта инициации трансляции IRES вируса энцефаломиокардита,
- гена DHFR мыши,
- сигнала полиаденилирования вируса SV40,
- аминогликозид-3'-фосфотрансферазы, обеспечивающего устойчивость штамма клеток-продуцента к генетицину (Neo),
- кассеты для экспрессии в клетках бактерий гена β-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к ампицилину,
- уникальных участков узнавания следующих эндонуклеаз рестрикции: AhdI (7352 п.о.), AsiSI (508 п.о.), BglII (2649 п.о.), BipI (2079 п.о.), BmtI (654 п.о.), BssHII (5778 п.о.), BstBI (6062 п.о.), BstEII (2388 п.о.), Bsu36I (2245 п.о.), EcoRI (10035 п.о.), EcoRV (10969 п.о.), FspAI (2020 п.о.), МluI (2433 п.о.), MreI (2220 п.о.), NheI (654 п.о.), NotI (3918 п.о.), PspXI (3342 п.о.), RsrII (5896 п.o.), SfiI (5133 п.o.), SgrAI (2220 п.o.), StuI (5184 п.о.), Tth111I (5496 п.о.), XhoI (3343 п.о.).1. Recombinant plasmid DNA rVK415 encoding a polypeptide with a sequence of tissue plasminogen activator of a person, having a size of 11383 bp, with a physical map shown in figure 4, and consisting of the following elements:
- optimized sequence encoding a polypeptide of a tissue plasminogen activator of a person, SEQ ID NO: 2,
- MAR - areas of attachment to the nuclear matrix of the lysozyme gene of birds,
- CMV virus transcription enhancer,
- internal site of initiation of translation of the IRES of the encephalomyocarditis virus,
- mouse DHFR gene,
- SV40 polyadenylation signal,
- aminoglycoside-3'-phosphotransferase, which ensures the resistance of the producer cell strain to geneticin (Neo),
- cassettes for the expression in bacteria cells of the β-lactamase gene, which provides resistance to ampicillin,
- unique recognition sites for the following restriction endonucleases: AhdI (7352 bp), AsiSI (508 bp), BglII (2649 bp), BipI (2079 bp), BmtI (654 bp .), BssHII (5778 bp), BstBI (6062 bp), BstEII (2388 bp), Bsu36I (2245 bp), EcoRI (10035 bp), EcoRV ( 10969 bp), FspAI (2020 bp), MluI (2433 bp), MreI (2220 bp), NheI (654 bp), NotI (3918 bp ), PspXI (3342 bp), RsrII (5896 bp), SfiI (5133 bp), SgrAI (2220 bp), StuI (5184 bp), Tth111I (5496 bp), XhoI (3343 bp). 2. Линия клеток Cricetulus griseus CHO 1F8 - продуцент рекомбинантного тканевого активатора плазминогена человека, полученная путем трансформации линии клеток Cricetulus griseus CHO DHFR - рекомбинантной плазмидной ДНК рВК415 по п.1.2. The cell line Cricetulus griseus CHO 1F8 is the producer of the recombinant tissue plasminogen activator human obtained by transforming the cell line Cricetulus griseus CHO DHFR - recombinant plasmid DNA rVK415 according to claim 1. 3. Способ получения и выделения полипептида, обладающего активностью тканевого активатора плазминогена, включающий культивирование линии клеток по п.2, где для экспрессии указанного полипептида культивирование проводится в перфузионных условиях в присутствии смеси, состоящей из добавки CHO Bioreactor supplement и бутирата натрия или диметилсульфоксида, и выделение полипептида, обладающего активностью тканевого активатора плазминогена.3. A method for producing and isolating a polypeptide having tissue plasminogen activator activity, comprising culturing the cell line according to claim 2, wherein culturing the expression of said polypeptide is carried out under perfusion conditions in the presence of a mixture consisting of CHO Bioreactor supplement and sodium butyrate or dimethyl sulfoxide, and isolation of a polypeptide having tissue plasminogen activator activity. 4. Способ по п.3, где в составе смеси используется 0,5-1,5 мМ бутират натрия или 1% (V/V) диметилсульфоксид.4. The method according to claim 3, where 0.5-1.5 mM sodium butyrate or 1% (V / V) dimethyl sulfoxide is used in the mixture. 5. Способ по любому из пп.3 или 4, где линия клеток адаптирована к бессывороточной среде. 5. The method according to any one of claims 3 or 4, wherein the cell line is adapted to a serum-free medium.

Images