RU2498298C1 - Apparatus for imaging biological objects with nano-labels - Google Patents

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: apparatus has a microscope attachment with an infinite optical system mounted on a support, an image recording unit, an illumination system and an image processing system, wherein the source for the illumination system is in form of a narrow-band light-emitting diode module; further, between the microscope attachment with an infinite optical system on the side of the optical output and the image recording unit there is a spectral filtration system, and between the illumination system and the image recording unit there is a signal time delay unit, the inputs of which are connected to outputs of the illumination system and the image processing system, and the outputs are connected to inputs of the illumination system, the image processing system and the image recording unit, wherein the spectral filtration system is provided with a set of variable band-pass optical filters with stepped variation of the transmission coefficient.

EFFECT: high sensitivity and information content of imaging.

3 cl, 4 dwg

Description

Изобретение относится к области люминесцентно-микроскопического анализа биологических объектов, визуализации и регистрации изображений в биологии и медицине и может быть использована в приборостроении для производства высокочувствительных и высокоинформативных приборов, позволяющих получать на основе люминесцентной микроскопии качественные изображения нанометок в биологических тканях.The invention relates to the field of luminescence-microscopic analysis of biological objects, visualization and registration of images in biology and medicine, and can be used in instrumentation for the production of highly sensitive and highly informative devices, allowing to obtain high-quality images of nanomets in biological tissues based on luminescent microscopy.

Известны устройства регистрации изображения биообъектов, которые основаны на различных принципах работы [1-3]. Эти устройства чаще всего реализуются с использованием оптического освещения и регистрации изображения биообъекта при помощи фото- либо видеокамеры. В качестве источников оптического излучения могут выступать лампы, светодиоды и лазеры. Чаще всего подобные устройства содержат оптическую систему для наблюдения и/или фиксирования изображения образца, держатель образца, расположенный напротив объектива оптической системы, источник возбуждения флуоресцентного излучения. Однако эти устройства не позволяют регистрировать изображения специфических областей биологической ткани на фоне ее аутолюминесценции с чувствительностью, необходимой для точного определения локализации этих специфических областей.Known devices for recording images of biological objects, which are based on various principles of operation [1-3]. These devices are most often implemented using optical lighting and recording the image of a biological object using a photo or video camera. As sources of optical radiation can be lamps, LEDs and lasers. Most often, such devices contain an optical system for observing and / or capturing an image of a sample, a sample holder located opposite the objective of the optical system, and a source of excitation of fluorescence radiation. However, these devices do not allow recording images of specific areas of biological tissue against the background of its autoluminescence with the sensitivity necessary to accurately determine the localization of these specific areas.

Одно из известных устройств визуализации объектов реализовано в виде люминесцентного микроскопа [4] и заключается в том, что при помощи коротковолнового спектрального диапазона широкополосного оптического излучения осуществляется возбуждение люминесценции образца, фоторегистрация которой позволяет получить искомое изображение. Разделение излучения накачки и люминесценции обеспечивается при помощи широкополосного фильтра, что приводит к низкой контрастности изображения нанокристаллических меток в биологических тканях.One of the known devices for visualizing objects is implemented in the form of a luminescent microscope [4] and consists in the fact that using the short-wavelength spectral range of broadband optical radiation, luminescence of the sample is excited, the photorecording of which allows obtaining the desired image. The separation of pump radiation and luminescence is ensured by a broadband filter, which leads to low contrast images of nanocrystalline labels in biological tissues.

Известно так же устройство [5], которое позволяет получить изображение с улучшенным контрастом по сравнению с аналогом [4]. При этом улучшение контраста достигается путем программной обработки изображений, полученных с различными временами задержки. К недостаткам этого устройства относится низкая информативность из-за отсутствия спектральной селективности при регистрации изображения.Also known device [5], which allows you to get an image with improved contrast compared to analog [4]. At the same time, improvement in contrast is achieved by software processing images obtained with different delay times. The disadvantages of this device include low information content due to the lack of spectral selectivity during image registration.

Известно устройство для определения локализации специфических областей биологической ткани [6], которое наиболее близко по решаемой технической задаче к заявляемому изобретению и принято в качестве прототипа. Общими признаками у известного устройства и заявляемого изобретения являются использование микроскопической приставки с инфинитной оптикой и системы регистрации изображения. Известное устройство позволяет получать изображения биологического объекта и определять локализацию специфической области по цветовому локусу. Определение локализации специфической области биологического объекта в известном устройстве осуществляется программной обработкой цветового изображения.A device for determining the localization of specific areas of biological tissue [6], which is closest in terms of the technical problem to be solved to the claimed invention and adopted as a prototype. Common features of the known device and the claimed invention are the use of a microscopic attachment with infinite optics and an image registration system. The known device allows you to obtain images of a biological object and determine the localization of a specific area by color locus. Determining the localization of a specific area of a biological object in a known device is carried out by software processing a color image.

Недостатками известного устройства являются невысокая информативность регистрируемого изображения биологической ткани, содержащей атипичные клетки, а также низкая чувствительность системы регистрации изображения люминесцирующих специфических областей на фоне аутолюминесценции биологической ткани, в частности, из-за низкой контрастности получаемых изображений. Кроме того, к недостаткам известного устройства относится ограниченная область исследуемых биологических объектов, что существенно ограничивает возможности его использования.The disadvantages of the known device are the low information content of the recorded image of biological tissue containing atypical cells, as well as the low sensitivity of the image registration system of luminescent specific areas against the background of autoluminescence of biological tissue, in particular, due to the low contrast of the resulting images. In addition, the disadvantages of the known device include a limited area of the studied biological objects, which significantly limits the possibilities of its use.

Заявляемое изобретение свободно от указанных недостатков.The claimed invention is free from these disadvantages.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение информативности получаемых изображений и чувствительности при определении специфических областей (локализации в биологических тканях атипических клеток, маркированных нанокристаллическими метками) за счет увеличения контраста изображения, а также существенное расширение круга исследуемых биологических объектов.The technical result of the invention is to increase the information content of the obtained images and sensitivity when determining specific areas (localization in biological tissues of atypical cells marked with nanocrystalline labels) by increasing the contrast of the image, as well as a significant expansion of the range of biological objects under study.

Указанный технический результат достигается тем, что в устройстве визуализации биологических объектов, содержащем установленную на штативе микроскопическую приставку с инфинитной оптикой, систему спектральной фильтрации, блок регистрации изображения, осветительную систему и систему обработки изображений, в соответствии с заявленным изобретением, источник осветительной системы выполнен в виде узкополосного светодиодного модуля, дополнительно между микроскопической приставкой с инфинитной оптикой и блоком регистрации изображения установлена система спектральной фильтрации, а между осветительной системой и блоком регистрации изображения установлен блок временной задержки сигналов, входы которого соединены с выходами осветительной системы и системы обработки изображения, а его выходы соединены со входами осветительной системой, системы обработки изображения и блока регистрации изображения, причем система спектральной фильтрации снабжена набором меняющихся полосовых оптических фильтров со ступенчатым изменением коэффициента пропускания.The specified technical result is achieved by the fact that in the device for visualizing biological objects containing a microscopic attachment with infinite optics mounted on a tripod, a spectral filtering system, an image registration unit, a lighting system and an image processing system, in accordance with the claimed invention, the source of the lighting system is made in the form a narrow-band LED module, additionally between a microscopic attachment with infinite optics and an image recording unit a spectral filtering system is installed, and a signal delay unit is installed between the lighting system and the image registration unit, the inputs of which are connected to the outputs of the lighting system and the image processing system, and its outputs are connected to the inputs of the lighting system, image processing system and the image registration unit, the system spectral filtering is equipped with a set of variable band-pass optical filters with stepwise change in transmittance.

Кроме того, указанный технический результат достигается тем, что светодиодный модуль имеет набор узкополосных источников в диапазоне 300 нм-650 нм.In addition, this technical result is achieved in that the LED module has a set of narrow-band sources in the range of 300 nm-650 nm.

Помимо этого, указанный технический результат достигается тем, что штатив снабжен крепежным приспособлением для поворота и фиксации микроскопической приставки с инфинитной оптикой в телесном угле 4π.In addition, this technical result is achieved by the fact that the tripod is equipped with a mounting device for turning and fixing the microscopic attachment with infinite optics in a solid angle of 4π.

Сущность заявляемого изобретения поясняется Фиг.1-4.The essence of the invention is illustrated in Fig.1-4.

На Фиг.1 представлена схема устройства визуализации биологических объектов.Figure 1 presents a diagram of a device for visualizing biological objects.

На Фиг.2, иллюстрирующей спектры пропускания, представлены спектральные характеристики набора отрезающих возбуждающий свет оптических фильтров со ступенчатым изменением коэффициента пропускания.Figure 2, illustrating the transmission spectra, presents the spectral characteristics of a set of cut-off exciting optical filters with a stepwise change in transmittance.

На Фиг.3 и Фиг.4 представлены визуальные изображения люминесцирующих различных нанокристаллических меток в биологической ткани, зарегистрированные при разных условиях освещения и регистрации изображений.Figure 3 and Figure 4 presents visual images of luminescent various nanocrystalline labels in biological tissue, recorded under different lighting conditions and image registration.

Как видно из Фиг.1 заявляемое изобретение содержит микроскопическую приставку с инфинитной оптикой (1), систему спектральной фильтрации (2), блок регистрации изображения (3), систему обработки изображения (4), блок временной задержки сигналов (5), осветительную систему (6) в составе со светодиодным источником оптического излучения (7), штангу штатива (8) с крепежным приспособлением (9) для поворота и фиксации микроскопической приставки, штатив (10) для фиксации осветительной системы и закрепления исследуемого объекта (11).As can be seen from Figure 1, the claimed invention contains a microscopic attachment with infinite optics (1), a spectral filtering system (2), an image registration unit (3), an image processing system (4), a signal delay unit (5), a lighting system ( 6) as a part with an LED optical radiation source (7), a tripod rod (8) with a mounting device (9) for turning and fixing the microscopic attachment, a tripod (10) for fixing the lighting system and fixing the object under study (11).

На Фиг.1 изображена схема устройства. Конструктивная компоновка устройства выполнена в двух модулях. Микроскопическая приставка с инфинитной оптикой (1) с системой спектральной фильтрации (2) и блок регистрации изображения (3) крепится на штанге штатива (8), предназначенном для работы с протяженными предметами и объектами, имеющими сложную форму. Штатив снабжен крепежным приспособлением (9), при помощи которого микроскопическая приставка устанавливается на нужную высоту, плавно перемещается в горизонтальной плоскости, поворачивается и фиксируется относительно наблюдаемого объекта в телесном угле 4π. Осветительная система (6) со светодиодным модулем (7) крепится на отдельном штативе (10), предназначенном для закрепления исследуемого объекта (11), что позволяет гибко изменять условия освещения и наблюдения протяженных объектов.Figure 1 shows a diagram of a device. The design layout of the device is made in two modules. A microscopic attachment with infinite optics (1) with a spectral filtering system (2) and an image recording unit (3) is mounted on a tripod rod (8), designed to work with extended objects and objects that have a complex shape. The tripod is equipped with a mounting device (9), with which the microscopic attachment is set to the desired height, moves smoothly in the horizontal plane, rotates and is fixed relative to the observed object in a solid angle of 4π. The lighting system (6) with an LED module (7) is mounted on a separate tripod (10), designed to fix the test object (11), which allows you to flexibly change the lighting conditions and observation of extended objects.

Работа заявляемого устройства определения локализации атипичных клеток по люминесценции нанокристаллических меток в биологических тканях осуществляется следующим образом. На оптическом выходе микроскопической приставки с инфинитной оптикой (1) формируется параллельный световой пучок, что позволяет избежать смещения спектральных характеристик оптических фильтров при косом падении лучей, смонтирована система спектральной фильтрации (2) сигнала люминесценции меток - набор отрезающих возбуждающий свет оптических фильтров со ступенчатым изменением коэффициента пропускания (Фиг.2). Спектры пропускания фильтров имеют резкую границу со стороны коротких длин волн, чтобы надежно отрезать рассеянное объектом излучение монохроматического источника возбуждения от сдвинутого в красную область спектра люминесценции нанокристаллических меток.The operation of the claimed device for determining the localization of atypical cells by luminescence of nanocrystalline labels in biological tissues is as follows. A parallel light beam is formed at the optical output of a microscopic set-top box with infinite optics (1), which avoids the shift of the spectral characteristics of optical filters with oblique incidence of rays, a spectral filtering system (2) of the luminescence signal is mounted - a set of optical filters that cut off exciting light with a stepwise change in coefficient transmission (Figure 2). The transmission spectra of the filters have a sharp boundary on the side of short wavelengths in order to reliably cut off the radiation of the monochromatic excitation source scattered by the object from the nanocrystalline labels shifted to the red region of the luminescence spectrum.

Блок временной задержки сигнала совместно с программным интерфейсом блока регистрации изображения позволяет гибко и оперативно производить регистрацию с селекцией по времени сигналов люминесцирующих меток, имеющих характерные времена высвечивания в диапазоне 0,1-10 мс, от быстрой аутолюминесценции биологических тканей (0,1-10 нс).The time delay block of the signal, together with the program interface of the image registration unit, allows flexible and efficient registration with time-based selection of luminescent label signals having characteristic luminescence times in the range of 0.1-10 ms from fast autoluminescence of biological tissues (0.1-10 ns )

Управление регистрацией сигналов люминесценции и отображением информации производится на основе системы обработки изображения с программными модулями управления осветительной системы и блока регистрации изображения, что обеспечивает управление приемом и обработки изображений с блока регистрации изображения с сохранением всех данных в памяти системы обработки изображения (4).The control of the registration of luminescence signals and the display of information is carried out on the basis of an image processing system with software control modules for the lighting system and an image registration unit, which provides control of the reception and processing of images from the image registration unit with all data stored in the memory of the image processing system (4).

Первоначально выбирается требуемый для возбуждения специфической метки источник светодиодного модуля (7), включается осветитель, на компьютере запускается программное обеспечение блока регистрации изображения (3), выбирается требуемое увеличение микроскопической приставки с инфинитной оптикой (1), по изображению на мониторе производится фокусировка микроскопической приставки на объект (11), выбирается требуемый светофильтр в системе спектральной фильтрации (2), выбирается требуемый уровень освещенности объекта, экспозиция, при работе в стробоскопическом импульсном режиме выбирается время задержки начала экспозиции. Производится наблюдение люминесценции и, при необходимости, регистрация изображений.Initially, the source of the LED module (7) required to excite the specific label is selected, the illuminator is turned on, the image registration unit software (3) is launched on the computer, the required increase in the microscopic extension with infinite optics (1) is selected, and the microscopic extension is focused on the image on the monitor object (11), selects the required filter in the spectral filtering system (2), selects the required level of illumination of the object, exposure, when working in the stroboscopic pulse mode selects the delay time for the start of exposure. Observation of luminescence and, if necessary, registration of images.

Заявленное изобретение было апробировано в лабораторных условиях Санкт-Петербургского государственного университета в режиме реального времени.The claimed invention was tested in laboratory conditions of St. Petersburg State University in real time.

В результате экспериментов было подтверждено достижение указанного технического результата: за счет получения высокой контрастности изображения и определения точной локализации атипичных клеток по люминесценции нанокристаллических меток на фоне свечения биологической ткани была получена высокая по сравнению с аналогами информативность и чувствительность.As a result of experiments, the achievement of the indicated technical result was confirmed: by obtaining high image contrast and determining the exact localization of atypical cells by luminescence of nanocrystalline tags against the background of biological tissue glow, a high information content and sensitivity were obtained compared to analogues.

Тестовые режимы работы заявляемого изобретения приведены в конкретных примерах ее апробации с тканью биологического объекта.Test modes of operation of the claimed invention are given in specific examples of its testing with the tissue of a biological object.

Пример 1. Ткань биологического объекта с нанокристаллическими метками на основе допированного неодимом граната. Освещение производилось в постоянном режиме светодиодом с длиной волны излучения 560 нм, попадающей в полосу поглощения данных меток. В системе фильтрации выбирался фильтр с границей пропускания 750 нм, пропускающий полосу люминесценции нанометок и отрезающий посторонний свет. Пример изображения люминесцирующих нанометок представлен на Фиг.3.Example 1. The tissue of a biological object with nanocrystalline labels based on doped neodymium garnet. Illumination was carried out in a constant mode by an LED with a radiation wavelength of 560 nm, falling into the absorption band of these labels. In the filtration system, a filter with a transmission limit of 750 nm was selected, which transmits the luminescence band of nanotags and cuts off extraneous light. An example of the image of luminescent nanometres is presented in Figure 3.

Пример 2. Ткань биологического объекта с нанокристаллическими метками на основе допированного европием ванадата иттрия. Освещение производилось в импульсном режиме светодиодом с длиной волны излучения 405 нм, попадающей в полосу поглощения данных нанометок. Частота импульсов - 12 Гц, скважность 23%. Задержка начала экспозиции относительно заднего фронта импульса возбуждения составляла 5 мс. В системе фильтрации выбирался фильтр с границей пропускания 650 нм, пропускающий полосу люминесценции нанометок. Пример изображения люминесцирующих нанометок в биологической ткани при регистрации изображения с временной задержкой представлен на Фиг.4.Example 2. Tissue of a biological object with nanocrystalline tags based on yttrium vanadate doped with europium. Illumination was carried out in a pulsed mode by an LED with a radiation wavelength of 405 nm, falling into the absorption band of these nanometer marks. Pulse frequency - 12 Hz, duty cycle 23%. The delay in the start of exposure relative to the trailing edge of the excitation pulse was 5 ms. In the filtration system, a filter with a transmission limit of 650 nm was selected, which passes the luminescence band of nanotags. An example of the image of luminescent nanomets in biological tissue during registration of an image with a time delay is presented in FIG. 4.

Как показали результаты апробации, заявляемое изобретение позволяет с высокой информативностью и высокой чувствительностью визуализировать в тканях биологических объектов локализацию атипичных клеток и регистрировать качественное контрастное изображение люминесценцентных нанокристаллических маркеров на основе оксидных нанокрсталлических частиц, допированных редкоземельными элементами, на фоне свечения биологической ткани. Наличие системы фильтрации регистрируемого излучения со сменными светофильтрами с разным спектральным положением края оптического пропускания и блока регистрации изображения с временной задержкой позволяет за счет существенного уменьшения фонового сигнала от рассеянного света источников возбуждения и от аутолюминесценции биологических тканей повысить не только визуализацию атипичных клеток в биологических тканях, но и диагностировать (в перспективе) по характеру их локализации распознаваемость конкретных заболеваний.As shown by the results of testing, the claimed invention allows to visualize the localization of atypical cells in the tissues of biological objects with high information content and to register a high-quality contrast image of luminescent nanocrystalline markers based on oxide nanocrystalline particles doped with rare earth elements against the background of the glow of biological tissue. The presence of a filtering system for detected radiation with interchangeable filters with different spectral positions of the optical transmission edge and a time-delayed image recording unit allows, due to a significant reduction in the background signal from the scattered light of the excitation sources and from the autoluminescence of biological tissues, to increase not only the visualization of atypical cells in biological tissues, but and diagnose (in the future) by the nature of their localization the recognition of specific diseases.

Заявленное изобретение имеет более высокие возможности по сравнению с аналогами по визуализации и изучению разнообразных видов биологических тканей, что существенно повышает ее информативность для создания целого комплекса по определению локализации атипичных клеток в биологических объектах, а в перспективе и их диагностирование.The claimed invention has higher capabilities compared with analogues in the visualization and study of various types of biological tissues, which significantly increases its information content to create a whole complex to determine the localization of atypical cells in biological objects, and in the future, their diagnosis.

Кроме того, появляется также возможность применения заявленного изобретения визуализировать локализацию атипичных клеток в тканях биологических объектов и в случае одновременного использования различных нанокристаллических маркеров, отличающихся по спектру люминесценции.In addition, it also becomes possible to use the claimed invention to visualize the localization of atypical cells in the tissues of biological objects and in the case of the simultaneous use of various nanocrystalline markers that differ in the luminescence spectrum.

Список использованной литературы:List of used literature:

1. Патент RU 21662011. Patent RU 2166201

2. Патент RU 856872. Patent RU 85687

3. Патент RU 991023493. Patent RU 99102349

4. P.M. Рагузин // Авторское свидетельство SU 678449, 1979.08.05 //4. P.M. Raguzin // Copyright certificate SU 678449, 1979.08.05 //

5. Munoz Leo, Jose // European Patent EP2144272 //5. Munoz Leo, Jose // European Patent EP2144272 //

6. CARL ZEISS MEDITEC AG, C. Hauger, R. Guckler, H. Jess, J. Stefen, W. Nahm // WO201297924 // - Прототип6. CARL ZEISS MEDITEC AG, C. Hauger, R. Guckler, H. Jess, J. Stefen, W. Nahm // WO201297924 // - Prototype

Claims (3)

1. Устройство визуализации биологических объектов с нанометками, содержащее установленную на штативе микроскопическую приставку с инфинитной оптикой, блок регистрации изображения, осветительную систему и систему обработки изображений, отличающееся тем, что источник осветительной системы выполнен в виде узкополосного светодиодного модуля, дополнительно между микроскопической приставкой с инфинитной оптикой со стороны оптического выхода и блоком регистрации изображения установлена система спектральной фильтрации, а между осветительной системой и блоком регистрации изображения установлен блок временной задержки сигналов, входы которого соединены с выходами осветительной системы и системы обработки изображения, а его выходы соединены со входами осветительной системы, системы обработки изображения и блока регистрации изображения, причем система спектральной фильтрации снабжена набором меняющихся полосовых оптических фильтров со ступенчатым изменением коэффициента пропускания.1. A device for visualizing biological objects with nanoscale, containing a microscopic attachment mounted on a tripod with infinite optics, an image recording unit, a lighting system and an image processing system, characterized in that the source of the lighting system is made in the form of a narrow-band LED module, in addition between a microscopic attachment with an infinite the optics on the optical output side and the image registration unit have a spectral filtering system installed, and in between The system and the image registration unit have a signal time delay unit, the inputs of which are connected to the outputs of the lighting system and the image processing system, and its outputs are connected to the inputs of the lighting system, the image processing system, and the image registration unit, and the spectral filtering system is equipped with a set of variable band-pass optical filters with stepwise change of transmittance. 2. Устройство по п.1, отличающееся тем, что светодиодный модуль имеет набор узкополосных источников в диапазоне 300 нм-650 нм.2. The device according to claim 1, characterized in that the LED module has a set of narrow-band sources in the range of 300 nm-650 nm. 3. Устройство по п.1, отличающееся тем, что штатив снабжен крепежным приспособлением для поворота и фиксации микроскопической приставки с инфинитной оптикой в телесном угле 4π. 3. The device according to claim 1, characterized in that the tripod is equipped with a mounting device for turning and fixing a microscopic attachment with infinite optics in a solid angle of 4π.

Images