RU2497116C1 - Method to determine atherogenicity of human blood - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnologies.

SUBSTANCE: invention describes the method to determine modified lipoproteins of low density (mLPLD) in serum (plasma) of human blood by means of treatment with a buffer, containing polyvinyl pyrrolidone (PVP) with the subsequent turbidimetric registration of the mixture, where treatment of the serum or human blood is carried out with the 10% solution of PVP-35000±5000 in 0.01 M Tris-HCl-buffer, pH 7.4, containing 0.15M NaCl, at the volume ratio of the serum (plasma):PVP from (1:2) to (1:10), incubated for 10 min. at room temperature, light absorption is measured in the experimental and control samples, the difference is calculated between them, and if the difference value is more than 15 units, the high level of atherogenic mLPLD in blood is ascertained, as well as availability of atherosclerotic process in an examined person.

EFFECT: using a simple, affordable and quick method to determine mLPLD in human blood makes it possible to perform screening examinations with the purpose to detect availability of atherosclerotic process at the pre-clinical stage and medical examination of population.

5 ex, 5 tbl

Description

Изобретение относится к клинической биохимии и может быть использовано в лабораторной диагностике для определения атерогенности крови по уровню содержания модифицированных липопротеинов низкой плотности (мЛПНП) в сыворотке или плазме крови человека.The invention relates to clinical biochemistry and can be used in laboratory diagnostics to determine the atherogenicity of the blood by the level of modified low density lipoproteins (mLDPE) in human serum or plasma.

Атеросклероз представляет собой хроническое заболевание, которое вызывает утолщение внутреннего слоя (интимы) крупных артерий и артерий среднего размера. Это снижает ток крови и может вызвать ишемию и разрушение ткани в органах, снабжающихся кровью через поврежденный сосуд. Атеросклероз является главной причиной сердечно-сосудистого заболевания, включая инфаркт миокарда, инсульт и заболевание периферических артерий. Он является основной причиной смерти на Западе и, как предсказывается, станет лидирующей причиной смерти во всем мире в пределах двух десятилетий.Atherosclerosis is a chronic disease that causes a thickening of the inner layer (intima) of large arteries and medium-sized arteries. This reduces blood flow and can cause ischemia and tissue destruction in organs that supply blood through a damaged vessel. Atherosclerosis is a major cause of cardiovascular disease, including myocardial infarction, stroke, and peripheral artery disease. It is the leading cause of death in the West and is predicted to become the leading cause of death worldwide within two decades.

Заболевание начинается с накопления липопротеинов, в первую очередь, липопротеина низкой плотности (ЛПНП), во внеклеточном матриксе сосуда. Данные частицы ЛПНП агрегируют и подвергаются модификации в результате окисления. мЛПНП является токсичным и вызывает повреждение сосудов. Во многих отношениях атеросклероз представляет собой ответ на повреждение, включающий воспаление и фиброз [12].The disease begins with the accumulation of lipoproteins, primarily low-density lipoprotein (LDL), in the extracellular matrix of the vessel. These LDL particles aggregate and undergo oxidation modification. mLDP is toxic and causes vascular damage. In many ways, atherosclerosis is a response to damage, including inflammation and fibrosis [12].

Наиболее убедительные доказательства участия мЛПНП в развитии атеросклероза подтверждаются следующими данными:The most convincing evidence of the involvement of mLCL in the development of atherosclerosis is supported by the following data:

1) мЛПНП обнаружены в атеросклеротической бляшке, но не в нормальных артериях [11];1) mLDPN was found in an atherosclerotic plaque, but not in normal arteries [11];

2) аутоантитела, образованные против неоэпитопов мЛПНП, присутствуют в крови и титр этих антител коррилирует с тяжестью атеросклероза, и является маркером заболевания [6, 14];2) autoantibodies formed against mNLP neoepitopes are present in the blood and the titer of these antibodies correlates with the severity of atherosclerosis and is a marker of the disease [6, 14];

3) исследования на животных моделях атеросклероза показали протективный эффект антиоксидантов (витамин Е, пробукол, аналоги пробукола и KoQ), хотя клинические испытания на людях с использованием витамина Е потерпели неудачу [17];3) studies in animal models of atherosclerosis have shown the protective effect of antioxidants (vitamin E, probucol, probucol analogues and KoQ), although clinical trials in humans using vitamin E have failed [17];

4) генетический нокаут различных скавенджер-рецепторов на мышах приводит к значительному подавлению развития атеросклероза [8-10, 16], подтверждая роль этих рецепторов и их лигандов (мЛПНП) в развитии повреждения артерий;4) genetic knockout of various scavenger receptors in mice leads to a significant suppression of the development of atherosclerosis [8-10, 16], confirming the role of these receptors and their ligands (mLDPE) in the development of damage to arteries;

5) истощение 12/15-липооксигеназы, который является физиологическим окисляющим агентом ЛПНП, замедляет развитие атеросклероза [4], в то время как его повышенная экспрессия ускоряет атеросклероз [3], показывая тем самым роль окислительной модификации ЛПНП;5) depletion of 12/15-lipoxygenase, which is a physiological oxidizing agent of LDL, slows the development of atherosclerosis [4], while its increased expression accelerates atherosclerosis [3], thereby showing the role of oxidative modification of LDL;

6) исследования Като и соавт. (2009) у апоЕ-дефицитных мышей показали, что повышение плазменного уровня окисленных ЛПНП наблюдается до развития повреждений артерий [7];6) research by Kato et al. (2009) in apoE-deficient mice showed that an increase in the plasma level of oxidized LDL is observed before the development of arterial damage [7];

7) показано, что специфическое снижение плазменного уровня мЛПНП путем экспрессии скавенджер-рецептора (LOX-1) в печени предотвращает прогрессирование атеросклеротического повреждения у апоЕ-дефицитных мышей даже при наличии тяжелой гиперхолестеролемии [5].7) it was shown that a specific decrease in the plasma level of mLDPE by expression of the scavenger receptor (LOX-1) in the liver prevents the progression of atherosclerotic damage in apoE-deficient mice even in the presence of severe hypercholesterolemia [5].

Таким образом, учитывая важную патогенетическую роль оЛПНП при атеросклерозе, остается актуальной разработка простых, доступных для клинических лабораторных исследований способов определения мЛПНП.Thus, given the important pathogenetic role of LDL in atherosclerosis, it remains relevant to develop simple methods for the determination of mLDP that are available for clinical laboratory research.

В настоящее время в клинической лабораторной практике отсутствуют доступные для рутинных исследований реагенты и методы определения содержания атерогенных, модифицированных липопротеинов низкой плотности в сыворотке крови человека.Currently, in clinical laboratory practice, reagents and methods for determining the content of atherogenic, modified low-density lipoproteins in human serum are not available for routine studies.

Известен способ определения атерогенности сыворотки крови по ее способности вызывать накопление холестерина в культивируемых клетках [13]. Недостатком этого способа являются трудоемкость, высокая себестоимость, сложность и длительность проведения исследования.A known method for determining the atherogenicity of blood serum by its ability to cause the accumulation of cholesterol in cultured cells [13]. The disadvantage of this method is the complexity, high cost, complexity and duration of the study.

Наиболее интенсивно разрабатываемыми методами определения мЛПНП являются иммуноферментные тесты с использованием моноклональных антител к in vitro модифицированным ЛПНП [15]. Многостадийность, трудоемкость и длительность иммуноферментного теста, выявление только эпитопов, характерных для искусственно модифицированных липопротеинах низкой плотности (неспецифичность), а также высокая себестоимость реагентов затрудняет использование их в рутинных исследованиях.Enzyme-linked immunosorbent assays using monoclonal antibodies to in vitro modified LDL are the most intensively developed methods for the determination of mLDPE [15]. The multi-stage, labor-intensive and duration of the enzyme-linked immunosorbent assay, the identification of only epitopes characteristic of artificially modified low-density lipoproteins (non-specificity), as well as the high cost of reagents makes it difficult to use them in routine studies.

Наиболее близким техническим решением является определение множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности (ммЛПНП) в плазме крови человека путем обработки ее буфером, содержащим поливинилпирролидон (ПВП) 12600±2700 (ООО АК «Синтвита», Россия), и последующей визуальной регистрацией помутнения по сравнению с контрольной пробой. Наличие помутнения, обусловленной агрегацией ммЛПНП, свидетельствует об атерогенности крови [2]. Для инструментального подтверждения наличия атеросклероза были проведены исследования импульсно-волновым доплеровским сканированием сонных артерий у относительно здоровых молодых людей с повышенным уровнем ммЛПНП в возрасте до 40 лет с нормальным уровнем холестерина и триглицеридов. В результате ультразвукового исследования у 57% было выявлено утолщение интимо-медиального слоя сонных артерий и подтвержден инструментально диагноз атеросклероз брахиоцефальных артерий. У остальных (43%) данные параметры оставались в пределах нормальных величин и свидетельствовали о том, что повышение уровня ммЛПНП предшествует морфологическим изменениям (утолщению) интимо-медиального слоя в обследованных артериях [1].The closest technical solution is the determination of multi-modified low-density lipoproteins (mm LDL) in human blood plasma by treating it with a buffer containing polyvinylpyrrolidone (PVP) 12600 ± 2700 (Sintvita LLC, Russia) and subsequent visual registration of turbidity compared to the control breakdown. The presence of turbidity due to the aggregation of mmDLP indicates blood atherogenicity [2]. For instrumental confirmation of the presence of atherosclerosis, studies were conducted by pulsed-wave Doppler scanning of the carotid arteries in relatively healthy young people with elevated LDL up to 40 years of age with normal cholesterol and triglycerides. As a result of ultrasound examination, 57% revealed a thickening of the intimal-medial layer of the carotid arteries and instrumental diagnosis of atherosclerosis of the brachiocephalic arteries was confirmed. For the rest (43%), these parameters remained within the normal range and indicated that an increase in the level of LDL was preceded by morphological changes (thickening) of the intimal-medial layer in the examined arteries [1].

Недостатком разработанного ранее метода является то, что способ выявляет только ммЛПНП, которые быстро элиминируются из кровотока при взаимодействии со скавенджер-рецепторами. А также ммЛПНП связываются с аутоантителами к ним с образованием иммунных комплексов, которые при условиях 8,9% ПВП не агрегируют и у некоторых больных с тяжелым атеросклерозом данный тест дает отрицательный результат.The disadvantage of the previously developed method is that the method detects only mmLDPE, which are rapidly eliminated from the bloodstream when interacting with scavenger receptors. As well, mmLDLs bind to autoantibodies to them with the formation of immune complexes, which under conditions of 8.9% PVP do not aggregate and in some patients with severe atherosclerosis this test gives a negative result.

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала реагентов для определения атерогенности крови по агрегации мЛПНП, маркера как раннего атеросклероза, так и атеросклероза, характеризующегося повышенным уровнем аутоантител к ммЛПНП и наличием клиники атеросклероза у больных, подтвержденых инструментальными методами исследования.The objective of the present invention is to expand the arsenal of reagents for determining blood atherogenicity by aggregation of mLDPE, a marker of both early atherosclerosis and atherosclerosis, characterized by an increased level of autoantibodies to mmLDL and the presence of an atherosclerosis clinic in patients confirmed by instrumental methods of research.

Поставленная задача решается путем добавления к сыворотке крови человека буферного раствора, содержащего поливинилпирролидон 35000±5000, определения степени помутнения турбидиметрическим методом и расчета содержания мЛПНП по приведенной ниже формуле.The problem is solved by adding to the human blood serum a buffer solution containing polyvinylpyrrolidone 35000 ± 5000, determining the degree of turbidity by the turbidimetric method and calculating the content of mLDPE according to the formula below.

Техническим результатом, получаемым при реализации изобретения, является расширение арсенала реагентов для определения атерогенности крови с целью ранней биохимической диагностики субклинического атеросклероза, а также контроля эффективности терапии клинического атеросклероза.The technical result obtained by the implementation of the invention is to expand the arsenal of reagents for determining blood atherogenicity with the aim of early biochemical diagnosis of subclinical atherosclerosis, as well as monitoring the effectiveness of treatment of clinical atherosclerosis.

Этот результат достигается тем, что определение атерогенности сыворотки или плазмы крови человека проводят путем обработки ее буфером, содержащим поливинилпирролидон (ПВП)-35000±5000, инкубирования пробы в течение 10 мин при комнатной температуре, измерения светопоглощения в опытной и контрольной пробах, вычисления разности между ними, при этом при величине разности более 15 ЕД, констатируют атерогенность крови за счет повышенного уровня мЛПНП.This result is achieved in that the determination of the atherogenicity of human serum or plasma is carried out by treating it with a buffer containing polyvinylpyrrolidone (PVP) -35000 ± 5000, incubating the sample for 10 min at room temperature, measuring light absorption in the experimental and control samples, calculating the difference between they, while with a difference of more than 15 PIECES, ascertain blood atherogenicity due to the increased level of mLPNP.

Определение атерогенности крови человека по агрегации модифицированных липопротеинов низкой плотности (мЛПНП) с использованием ПВП 35000±5000 (ООО «АК Синтвита», Россия).Determination of human blood atherogenicity by aggregation of modified low-density lipoproteins (mLDPN) using PVP 35000 ± 5000 (AK Syntvita LLC, Russia).

Буфер-1 для агрегации мЛПНП готовят растворением 10 г ПВП 35000 в 100 мл 0,01 М Трис-HCl-буфера, pH 7,4, содержащего 0,15 М NaCl. Буфер-К, в отличие от Буфера-1, не содержит ПВП. К Буферу-1 добавляют сыворотку или плазму крови, тщательно перемешивают, инкубируют, измеряют степень помутнения спектрофотометрически и рассчитывают уровень содержания [мЛПНП] по формуле:Buffer-1 for the aggregation of mLDPE is prepared by dissolving 10 g of PVP 35000 in 100 ml of 0.01 M Tris-HCl buffer, pH 7.4, containing 0.15 M NaCl. Buffer-K, unlike Buffer-1, does not contain PVP. To Buffer-1 add serum or blood plasma, mix thoroughly, incubate, measure the degree of turbidity spectrophotometrically and calculate the level of [mLDPE] according to the formula:

[мЛПНП], ЕД=[Е_О-Е_К]×100,[MLPN], ED = [E _O -E _K ] × 100,

где:Where:

[мЛПНП][MLPN] - уровень содержания модифицированных липопротеинов низкой плотности в опытной пробе в единицах (ЕД);- the level of modified low-density lipoproteins in the experimental sample in units (UNITS); Е_О E _O - оптическая плотность опытной пробы, сыворотки с соответствующим количеством Буфера-1, при длине волны 450 нм, ед. опт. пл.;- the optical density of the experimental sample, serum with the appropriate amount of Buffer-1, at a wavelength of 450 nm, units opt. pl .; Е_К E _K - оптическая плотность контрольной пробы при длине волны 450 нм, сыворотки с соответствующим количеством Буфера-К, ед. опт. пл.;- optical density of the control sample at a wavelength of 450 nm, serum with an appropriate amount of Buffer-K, units opt. pl .; 100one hundred - коэффициент перерасчета в единицы ЕД.- conversion factor to units of.

Пример 1. Определение оптимальной концентрации ПВП 35000±5000 (ООО «АК Синтвита», Россия) для агрегации мЛПНП в пулированной сыворотке крови больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. К 50 мкл пулированной сыворотки крови от 10 больных сердечно-сосудистыми заболеваниями добавляют 100-900 мкл Буфера-1, тщательно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин в 9 луночных кюветах биохимического анализатора FP-901 ("Labsystem", Финляндия). Степень помутнения определяют турбидиметрически при длине волны 450 нм. Полученные результаты приведены в таблице 1.Example 1. Determination of the optimal concentration of PVP 35000 ± 5000 (AK Syntvita LLC, Russia) for aggregation of mLDPN in the pulsed blood serum of patients with cardiovascular diseases. 100-900 μl of Buffer-1 is added to 50 μl of the pulled blood serum from 10 patients with cardiovascular diseases, thoroughly mixed and incubated at room temperature for 10 min in 9 well cuvettes of the FP-901 biochemistry analyzer (Labsystem, Finland). The degree of turbidity is determined turbidimetrically at a wavelength of 450 nm. The results are shown in table 1.

Как видно из данных, представленных в таблице 1, с увеличением концентрации ПВП 35000±5000 в инкубационной системе с 6,7% до 9,1% и при концентрации сыворотки от 33,3% до 9,1%, соответственно, наблюдается агрегация мЛПНП и помутнение раствора в пулированной сыворотке больных с атеросклерозом коронарных артерий. Максимальная агрегация мЛПНП достигается при концентрациях ПВП и сыворотки равной 9,1%, т.е. при объемном соотношении сыворотка : Буфер-1 (1:10). При дальнейшем увеличении концентрации ПВП свыше 9,1% наблюдается уменьшение агрегации мЛПНП из-за дефицита тестируемой сыворотки при избытке ПВП.As can be seen from the data presented in table 1, with an increase in the PVP concentration of 35000 ± 5000 in the incubation system from 6.7% to 9.1% and with a serum concentration of 33.3% to 9.1%, respectively, aggregation of mLDPE is observed and clouding of the solution in the pulsed serum of patients with coronary atherosclerosis. The maximum aggregation of mLDPL is achieved at a concentration of PVP and serum of 9.1%, i.e. with a volume ratio of serum: Buffer-1 (1:10). With a further increase in the concentration of PVP over 9.1%, there is a decrease in aggregation of mLDPE due to deficiency of the test serum with an excess of PVP.

Пример 2. Определение специфичности агрегации мЛПНП в зависимости от времени инкубации и концентрации ПВП 35000±5000 (ООО «АК Синтвита», Россия) в пулированной сыворотке крови больных с коронарным атеросклерозом, подтвержденным инструментальными методами. Для подтверждения специфической агрегации мЛПНП в пулированной сыворотке крови больных атеросклерозом коронарных артерий в зависимости от концентраций ПВП 35000 было исследовано агрегация мЛПНП во времени при условиях, описанных выше. Полученные результаты представлены в таблице 2.Example 2. Determination of the specificity of aggregation of mLDPE depending on the incubation time and the concentration of PVP 35000 ± 5000 (AK Syntvita LLC, Russia) in the pulled blood serum of patients with coronary atherosclerosis, confirmed by instrumental methods. In order to confirm the specific aggregation of mLDPE in pooled blood serum of patients with coronary artery atherosclerosis depending on the concentration of PVP 35000, the aggregation of mLDPE over time was studied under the conditions described above. The results are presented in table 2.

Как видно из данных, представленных в таблице 2, максимальная агрегация мЛПНП наблюдается в течение первой минуты и завершается к 10 мин инкубации. Максимальная агрегация наблюдается также при концентрациях ПВП и сыворотка в системе равной 9,1% в течение первой минуты инкубации. При концентрации ПВП 9,2% и выше в системе дальнейшая инкубация вызывает агрегацию нативных ЛПНП, которая продолжается в течение 60 мин. При концентрациях ПВП 9,1% и ниже в системе оптическая плотность раствора сыворотки практически не меняется. Полученные данные свидетельствуют о том, что при концентрации ПВП 35000±5000 9,1% и ниже в системе (от 6,7% до 9,1%) в пулированной сыворотке крови больных атеросклерозом коронарных артерий агрегации нативных липопротеинов низкой и очень низкой плотности практически не наблюдается (отсутствие изменения оптической плотности смеси ПВП-сыворотка после 10 мин инкубации).As can be seen from the data presented in table 2, the maximum aggregation of LDL is observed within the first minute and ends by 10 min of incubation. Maximum aggregation is also observed at PVP and serum concentrations in the system equal to 9.1% during the first minute of incubation. At a PVP concentration of 9.2% or higher in the system, further incubation causes aggregation of native LDL, which lasts for 60 minutes. At PVP concentrations of 9.1% or lower in the system, the optical density of the serum solution remains practically unchanged. The data obtained indicate that at a PVP concentration of 35,000 ± 5,000 9.1% and lower in the system (from 6.7% to 9.1%) in the pulsed blood serum of patients with coronary artery atherosclerosis, aggregation of native low and very low density native lipoproteins is practically not observed (no change in optical density of the PVP-serum mixture after 10 min of incubation).

Пример 3. Определение содержания холестерина, триацилглицеридов (ТАГ) и общих белков в ПВП-преципитатах. Для подтверждения наличия мЛПНП в ПВП-преципитатах были проведены следующие эксперименты. Из 0,5 мл пулированной сыворотки больных ИБС и контрольных здоровых доноров были приготовлены ПВП-преципитаты в условиях 9,1% ПВП 35000±5000. Агрегированные мЛПНП осаждали путем центрифугирования при 6000 об/мин в течение 10 мин при 23°C. Супернатант тщательно декантировали, ПВП-преципитат 2 раза отмывали 9,1% раствором ПВП и ресуспендировали в 0,5 мл 0,01 М Трис-HCl-буфера, pH 7,4, содержащего 0,15 М NaCl. В полученных ПВП-преципитатах определяли содержание холестерина, ТАГ и общих белков с использованием реактивов фирмы «ЭКОлаб», Россия. Полученные результаты представлены в таблице 3.Example 3. Determination of cholesterol, triacylglycerides (TAG) and total proteins in PVP precipitates. The following experiments were conducted to confirm the presence of mLDPE in PVP precipitates. From 0.5 ml of the pulled serum of patients with coronary artery disease and control healthy donors, PVP precipitates were prepared under conditions of 9.1% PVP 35000 ± 5000. Aggregated mLCLs were precipitated by centrifugation at 6000 rpm for 10 min at 23 ° C. The supernatant was carefully decanted, the PVP precipitate was washed 2 times with a 9.1% PVP solution and resuspended in 0.5 ml of 0.01 M Tris-HCl buffer, pH 7.4, containing 0.15 M NaCl. The obtained PVP precipitates were used to determine the content of cholesterol, TAG, and total proteins using reagents from EKOlab, Russia. The results are presented in table 3.

Как видно из данных, представленных в таблице 3, в ПВП-преципитате пулированной сыворотки больных ИБС содержание холестерина в 5,3 раз, а ТАГ - в 16 раз больше, чем в ПВП-преципитате из сыворотки здоровых доноров. Содержание общего белка в 1,3 раза выше в ПВП-преципитате больных.As can be seen from the data presented in table 3, the cholesterol content in the PVP-precipitate of the pulsed serum of patients with coronary heart disease is 5.3 times, and the TAG is 16 times higher than in the PVP-precipitate from the serum of healthy donors. The total protein content is 1.3 times higher in PVP-precipitate patients.

Таким образом, наличие холестерина, ТАГ и белка в ПВП-преципитатах из сывороток свидетельствует о липопротеиновой природе агрегатов, образующихся в присутствии 9,1% ПВП 35000±5000. Повышенный уровень ПВП-преципитата, содержащего мЛПНП у больных с ИБС, подтверждает патологическую роль мЛПНП при атеросклеротическом процессе.Thus, the presence of cholesterol, TAG, and protein in serum PVP precipitates indicates the lipoprotein nature of aggregates formed in the presence of 9.1% PVP 35000 ± 5000. An increased level of PVP-precipitate containing mLDPE in patients with coronary artery disease confirms the pathological role of mLCL in the atherosclerotic process.

Пример 4. Определение связывания комплемента морской свинки преципитатами мЛПНП в зависимости от концентрации. К 10-160 мкл раствора ПВП-преципитата (4,3 мг/мл по белку), приготовленного из пулированной сыворотки больных с ИБС и разбавленного в соотношении 1:99 буфером VBS²⁺, добавляли 20 мкл раствора, разбавленного 1:19, комплемента морской свинки. Общий объем доводили до 0,3 мл буфером VBS²⁺ и инкубировали 20 мин при 37°C. После предварительной инкубации добавляли 200 мкл эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами кролика (ЕА) и инкубировали 30 мин при 37°C. После инкубации в каждую пробу добавляли по 2,5 мл холодного раствора 0,15 М NaCl, центрифугировали и определяли величину А₄₀₅ супернатанта. Контрольная проба не содержала ПВП-преципитата. Пониженный гемолиз в опытных пробах по сравнению с контролем свидетельствовал о наличии связывания комплемента. Степень лизиса эритроцитов (У) определяли по формуле:EXAMPLE 4 Determination of Guinea Pig Complement Binding with MLCD Precipitation as a Concentration To 10-160 μl of a solution of PVP-precipitate (4.3 mg / ml protein) prepared from the pulsed serum of patients with coronary artery disease and diluted 1:99 with VBS ²⁺ buffer, 20 μl of a solution diluted 1:19, complement guinea pig. The total volume was adjusted to 0.3 ml with VBS ²⁺ buffer and incubated for 20 min at 37 ° C. After preliminary incubation, 200 μl of sheep erythrocytes sensitized with rabbit antibodies (EA) were added and incubated for 30 min at 37 ° C. After incubation, 2.5 ml of a cold 0.15 M NaCl solution was added to each sample, centrifuged, and the A ₄₀₅ supernatant value was determined. The control sample did not contain PVP precipitate. Reduced hemolysis in experimental samples compared with the control testified to the presence of complement binding. The degree of lysis of red blood cells (U) was determined by the formula:

У(%)=[(X-R)/(H-R)×100],Y (%) = [(X-R) / (H-R) × 100],

где Н, R и Х-величины оптической плотности A₄₁₂ в гемолитических системах контрольной пробы, в контроле спонтанного лизиса ЕА и в опытной пробе, соответственно. Степень связывания комплемента (ССК) определяли по формуле:where H, R and X-values of optical density A ₄₁₂ in hemolytic systems of the control sample, in the control of spontaneous lysis of EA and in the experimental sample, respectively. The degree of complement fixation (CCK) was determined by the formula:

ССК(%)=100-УSSK (%) = 100-U

Данные о степени связывания комплемента при разных концентрациях ПВП-преципитата приведены в таблице 4.Data on the degree of complement fixation at different concentrations of PVP precipitate are shown in table 4.

Как видно из данных, представленных в таблице 4, мЛПНП, преципитированные в растворе 9,1% ПВП 35000±5000, обладают комплемент-связывающей способностью, причем эффект является дозо-зависимым. При увеличении концентрации ПВП выше 9,1% в системе при увеличении количества преципитированного холестерина, ТАГ, белков, комплемент связывающая активность ПВП преципитатов не меняется (данные не приведены). Полученные результаты свидетельствуют о преципитации нативных ЛПНП при концентрации ПВП свыше 9,1%, которые не связывают и, соответственно, не активируют систему комплемента.As can be seen from the data presented in table 4, mLLP, precipitated in a solution of 9.1% PVP 35000 ± 5000, have complement-binding ability, and the effect is dose-dependent. With an increase in the concentration of PVP above 9.1% in the system with an increase in the amount of precipitated cholesterol, TAG, and proteins, the complement binding activity of PVP precipitates does not change (data not shown). The results obtained indicate the precipitation of native LDL at a PVP concentration of more than 9.1%, which do not bind and, accordingly, do not activate the complement system.

Пример 5. Определение уровня содержания мЛПНП в сыворотке крови у больных с атеросклерозом каротидных артерий, подтвержденных инструментальными методами. Проведены исследования содержания мЛПНП предлагаемым способом и прототипом в сыворотке 60 неврологических больных с атеросклерозом каротидных артерий, подтвержденных инструментальными методами. По предлагаемому способу к 50 мкл исследуемой сыворотки добавляли 500 мкл Буфера-1, тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин в 9-ти луночных кюветах биохимического анализатора FP-901 (Labsystem, Финляндия). В прототипе использовали 10% ПВП 12600±2700 (ООО «АК Синтвита», Россия) в 0,01 М Трис-HCl-буфере, содержащем 0,15 М NaCl, pH 7,4, как описано в работе [2]. Степень помутнения определяли турбидиметрически при длине волны 450 нм. В качестве бланка использовали пробы сыворотки с соответствующим количеством Буфера-К. Рассчитывали уровень содержания мЛПНП и ммЛПНП по формуле, приведенной выше. Полученные результаты по определению мЛПНП и ммЛПНП приведены в таблице 5.Example 5. Determining the level of mLDPE in serum in patients with atherosclerosis of the carotid arteries, confirmed by instrumental methods. Studies were conducted on the content of mLDPP by the proposed method and prototype in the serum of 60 neurological patients with atherosclerosis of the carotid arteries, confirmed by instrumental methods. According to the proposed method, 500 μl of Buffer-1 was added to 50 μl of the test serum, thoroughly mixed and incubated at room temperature for 10 min in 9-well cuvettes of the FP-901 biochemistry analyzer (Labsystem, Finland). The prototype used 10% PVP 12600 ± 2700 (AK Syntvita LLC, Russia) in 0.01 M Tris-HCl buffer containing 0.15 M NaCl, pH 7.4, as described in [2]. The degree of turbidity was determined turbidimetrically at a wavelength of 450 nm. Serum samples with the appropriate amount of Buffer-K were used as the blank. The mLDPE and mmLDPE levels were calculated using the formula above. The results obtained for the determination of mLDPE and mmLDPE are shown in table 5.

Таким образом, из приведенных в таблице 5 данных видно, что только у 43% обследованных больных с атеросклерозом каротидных артерий, подтвержденных инструментальными методами, выявлен повышенный уровень ммЛПНП с использованием ПВП 12600±2700. В то время как определение атерогенности крови путем агрегации мЛПНП в условиях 9,1% ПВП 35000±5000 у этих же больных в 100% случаев дает положительный результат. Сравнительное исследование содержания мЛПНП в сыворотке и в плазме крови показало, что мЛПНП агрегируют как из сыворотки, так и из плазмы больных, что свидетельствует о специфичности процесса агрегации мЛПНП. Причем процент выявления мЛПНП как в сыворотке, так и в плазме крови одинаков, соответственно по 100% (таблица 5).Thus, it can be seen from the data in Table 5 that only 43% of the examined patients with atherosclerosis of the carotid arteries, confirmed by instrumental methods, showed an increased level of LDL using PVP 12600 ± 2700. While the determination of blood atherogenicity by aggregation of mLDPN in the conditions of 9.1% PVP 35000 ± 5000 in the same patients in 100% of cases gives a positive result. A comparative study of the content of mLDPE in serum and plasma showed that mLDPE aggregates both from serum and from the plasma of patients, which indicates the specificity of the process of aggregation of mLDPE. Moreover, the percentage of detection of mLCL in both serum and plasma is the same, respectively, 100% (table 5).

Предлагаемый способ отличается простотой, включает всего 2 операции: смешивание сыворотки или плазмы крови человека с раствором ПВП и регистрацию мутности. Для приготовления среды необходимы широко распространенные реактивы: ПВП, NaCl и трис-HCl. Способ позволяет регистрировать наличие мЛПНП непосредственно как в сыворотке, так и в плазме крови без предварительного ее фракционирования. Способ быстр (10 мин на 1 анализ), легко может быть адаптирован для биохимических автоматических анализаторов. Использование простого и быстрого в осуществлении способа определения атерогенности крови позволяет проводить скрининговые обследования с целью выявления наличия атеросклеротического процесса на доклинической стадии и диспансеризации населения. Формирование группы риска по атеросклерозу (повышенный уровень атерогенных мЛПНП) позволит установить индивидуальную причину патологического процесса и проводить этиотропную терапию. Исследования уровня содержания мЛПНП в крови больных с атеросклерозом в условиях клиники позволит контролировать эффективность проводимой терапии.The proposed method is simple, includes only 2 operations: mixing human serum or plasma with a solution of PVP and registration of turbidity. To prepare the medium, widespread reagents are required: PVP, NaCl, and Tris-HCl. The method allows to detect the presence of mLDPL directly both in serum and in blood plasma without prior fractionation. The method is fast (10 min per 1 analysis), can easily be adapted for biochemical automatic analyzers. Using a simple and quick method for determining blood atherogenicity allows for screening to detect the presence of an atherosclerotic process at the preclinical stage and the medical examination of the population. The formation of a risk group for atherosclerosis (an elevated level of atherogenic MLPD) will allow us to establish an individual cause of the pathological process and conduct etiotropic therapy. Studies of the level of mLDPE in the blood of patients with atherosclerosis in a clinic will allow you to control the effectiveness of the therapy.

ЛитератураLiterature

1. Шойбонов Б.Б. Экспресс-определение модифицированных липопротеинов // Кардиология Беларуси. - 2011. - Т.5, №18. - С.49-50.1. Shoybonov B. B. Express determination of modified lipoproteins // Cardiology of Belarus. - 2011. - V. 5, No. 18. - S. 49-50.

2. Шойбонов Б.Б., Баронец В.Ю., Панченко Л.Ф., Кубатиев А.А. Способ экспресс-определения атерогенности крови // Патент РФ №2437098 от 20.12.2011 г. Бюл. №35.2. Shoybonov B.B., Baronets V.Yu., Panchenko L.F., Kubatiev A.A. The method of rapid determination of blood atherogenicity // RF Patent No. 2437098 from 12/20/2011 Bull. Number 35.

3. Harats D., Shaish A., Geoege J., at al. Overexpression of 15-lipooxygenase in vascular endothelium accelerates early atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2000. - V.20. - P.2100-2105.3. Harats D., Shaish A., Geoege J., at al. Overexpression of 15-lipooxygenase in vascular endothelium accelerates early atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2000. - V.20. - P.2100-2105.

4. Huo Y., Zhao L., Hyman M.C., at al. Critical role of macrophage 12/15-lipooxygenese for atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice // Circulation. - 2004. - V.110. - P.2024-2031.4. Huo Y., Zhao L., Hyman M.C., at al. Critical role of macrophage 12/15-lipooxygenese for atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice // Circulation. - 2004. - V.110. - P.2024-2031.

5. Ishigaki Y., Katagiri H., Gao J., at al. Impact of plasma oxidized low-density lipoprotein removal on atherosclerosis // Circulation. - 2008. - V.118. - P.75-83.5. Ishigaki Y., Katagiri H., Gao J., at al. Impact of plasma oxidized low density lipoprotein removal on atherosclerosis // Circulation. - 2008. - V.118. - P.75-83.

6. Itabe H., Mori M., Higashi Y., and Takano T. Minimally modified LDL is an oxidized LDL enriched with oxidized phosphatidylcholines // J Biochem. - 2003. - V.134. - P.459-465.6. Itabe H., Mori M., Higashi Y., and Takano T. Minimally modified LDL is an oxidized LDL enriched with oxidized phosphatidylcholines // J Biochem. - 2003. - V.134. - P.459-465.

7. Kato R., Mori C., Kitazato K., at al. Transient increase in plasma oxidized LDL during the progression of atherosclerosis in apolipoprotein E knockout mice // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2009. - V.29. - P.33-39.7. Kato R., Mori C., Kitazato K., at al. Transient increase in plasma oxidized LDL during the progression of atherosclerosis in apolipoprotein E knockout mice // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2009. - V.29. - P.33-39.

8. Kuchibhotia S., Vanegas D., Kennedy D.J., at al. Absence of CD36 protects against atherosclerosis in ApoE knock-aut mice with no additional protection provided by absence of scavenger receptor AI/II // Cardiovasc Res. - 2008. - V.78. - P.185-196.8. Kuchibhotia S., Vanegas D., Kennedy D.J., at al. Absence of CD36 protects against atherosclerosis in ApoE knock-aut mice with no additional protection provided by absence of scavenger receptor AI / II // Cardiovasc Res. - 2008 .-- V.78. - P.185-196.

9. Manning-Tobin J.J., Moore K.J., Seimon T.A., at al. Loss of SA-A and CD36 activity reduces atherosclerotic lesion complexity without abrogating foam cell formation in hyperlipidemic mice // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2009. - V.29. - P.19-26.9. Manning-Tobin J.J., Moore K.J., Seimon T.A., at al. Loss of SA-A and CD36 activity reduces atherosclerotic lesion complexity without abrogating foam cell formation in hyperlipidemic mice // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2009. - V.29. - P.19-26.

10. Mehta J.L., Sanada N., Hu C.P., at al. Deletion of LOX-1 reduces atherogenesis in LDLR knockout mice fed high cholesterol diet // Circ Res. - 2007. - V.100. - P.1634-1642.10. Mehta J. L., Sanada N., Hu C. P., at al. Deletion of LOX-1 reduces atherogenesis in LDLR knockout mice fed high cholesterol diet // Circ Res. - 2007. - V.100. - P.1634-1642.

11. Rosenfeld M.E., Palinski W., Yla-Herttuala S. et al. Distribution of oxidation specific lipid-protein adducts and apolipoprotein В in atherosclerotic lesions of varying severity from WHHL rabbits // Atherosclerosis. - 1990. - V.10. - P.336-349.11. Rosenfeld M.E., Palinski W., Yla-Herttuala S. et al. Distribution of oxidation specific lipid-protein adducts and apolipoprotein B in atherosclerotic lesions of varying severity from WHHL rabbits // Atherosclerosis. - 1990. - V.10. - P.336-349.

12. Steinberg D. The LDL modification hypothesis of atherogenesis: an update // J. Lipid Res. - 2009. - V.50. - P.S 376-S381.12. Steinberg D. The LDL modification hypothesis of atherogenesis: an update // J. Lipid Res. - 2009. - V.50. - P.S 376-S381.

13. Tertov V.V., Orekhov A.N., Nikitina N.A. et al. Peritoneal macrophages: a model for detecting atherogenic potential in patiens' blood serum // Ann. Med. - 1989. - V.21(6). - P.455-459.13. Tertov V.V., Orekhov A.N., Nikitina N.A. et al. Peritoneal macrophages: a model for detecting atherogenic potential in patiens' blood serum // Ann. Med. - 1989 .-- V.21 (6). - P.455-459.

14. Tsimikas S. Oxidative biomarkers in the diagnosis and prognosis of cardiovascular disease // Am J Cardiol. - 2006. - V.98. - P.9P-17P.14. Tsimikas S. Oxidative biomarkers in the diagnosis and prognosis of cardiovascular disease // Am J Cardiol. - 2006. - V.98. - P.9P-17P.

15. Virella G., Derrick M.B., Pate V. et al. Development of capture assay for different modification of human low-density lipoprotein // Clinical and Diagnostic Lab. Immunol. - 2005. - V.12, №1. - P.68-75.15. Virella G., Derrick M. B., Pate V. et al. Development of capture assay for different modification of human low-density lipoprotein // Clinical and Diagnostic Lab. Immunol. - 2005. - V.12, No. 1. - P.68-75.

16. de Winther M.P.J., van Dijk K.W., Havekes L.M., and Hofker M.H. Macrophage scavenger receptor Class A: A multifunctional receptor in a Atherosclerosis // Artherioscler Thromb Vase Biol. - 2000. - V.20. - P.290-297.16. de Winther M.P.J., van Dijk K.W., Havekes L.M., and Hofker M.H. Macrophage scavenger receptor Class A: A multifunctional receptor in a Atherosclerosis // Artherioscler Thromb Vase Biol. - 2000. - V.20. - P.290-297.

17. Witztum J.L. and Steinberg D. The oxidative modification hypothesis of atherosclerosis: Does it hold for humans? // Trends Cardiovasc Med. - 2001. - V.11. - P.93-102.17. Witztum J.L. and Steinberg D. The oxidative modification hypothesis of atherosclerosis: Does it hold for humans? // Trends Cardiovasc Med. - 2001. - V.11. - P.93-102.

Таблица 1Table 1 Влияние ПВП 35000±5000 на агрегацию мЛПНП в пулированной сыворотке крови больных с атеросклерозом коронарных сосудов в зависимости от концентрацииThe effect of PVP 35000 ± 5000 on the aggregation of mLDPN in the pulsed blood serum of patients with coronary atherosclerosis depending on the concentration №No. Сыв., мклSy., Μl 10% ПВП, мкл10% PVP, μl % ПВП в системе% PVP in the system % сыв. в системе% syv. in system А₄₅₀ A ₄₅₀ 1one 50fifty 100one hundred 6,76.7 33,333.3 0,1760.176 22 50fifty 200200 8,08.0 20,020,0 0,2980.298 33 50fifty 300300 8,68.6 14,314.3 0,4260.426 4four 50fifty 400400 8,98.9 11,111.1 0,5690.569 55 50fifty 500500 9,19.1 9,19.1 0,580.58 66 50fifty 600600 9,29.2 7,77.7 0,5130.513 77 50fifty 700700 9,39.3 6,76.7 0,5010,501 88 50fifty 800800 9,49,4 5,95.9 0,3560.356 99 50fifty 900900 9,59.5 5,35.3 0,3580,358

Таблица 2table 2 Агрегация мЛПНП в зависимости от времени инкубации и концентрации ПВП 35000±5000 в пулированной сыворотке крови больных с коронарным атеросклерозомAggregation of mLDPL depending on the incubation time and the concentration of PVP 35000 ± 5000 in the pulsed blood serum of patients with coronary atherosclerosis №No. Сыв., мклSy., Μl 10% ПВП, мкл10% PVP, μl % ПВП в системе% PVP in the system А₄₅₀ A ₄₅₀ 1 мин1 min 10 мин10 min 20 мин20 minutes 30 мин30 minutes 60 мин60 min 1one 50fifty 100one hundred 6,76.7 0,1330.133 0,1760.176 0,1700.170 0,1690.169 0,1700.170 22 50fifty 200200 8,08.0 0,1840.184 0,2980.298 0,220.22 0,2180.218 0,2140.214 33 50fifty 300300 8,68.6 0,2360.236 0,4260.426 0,2950.295 0,2850.285 0,2810.281 4four 50fifty 400400 8,98.9 0,3130.313 0,5690.569 0,4280.428 0,4110.411 0,4110.411 55 50fifty 500500 9,19.1 0,3860.386 0,580.58 0,5840.584 0,5790.579 0,5930.593 66 50fifty 600600 9,29.2 0,3690.369 0,5130.513 0,630.63 0,6380.638 0,680.68 77 50fifty 700700 9,39.3 0,2480.248 0,5010,501 0,7070.707 0,6870.687 0,830.83 88 50fifty 800800 9,49,4 0,2460.246 0,3560.356 0,6000,600 0,7300.730 0,8460.846 99 50fifty 900900 9,59.5 0,1800.180 0,3580,358 0,5750.575 0,6800.680 0,8160.816

Таблица 3Table 3 Содержание холестерина, ТАГ и общих белков в ПВП-преципитатах, приготовленных из сыворотки крови больных ИБС и здоровых доноровThe content of cholesterol, TAG and total proteins in PVP-precipitates prepared from the blood serum of patients with coronary artery disease and healthy donors   Холестерин, мг/длCholesterol, mg / dl ТАГ, мкМ/лTAG, μM / L Белок, мг/млProtein, mg / ml ПВП-преципитат из сыворотки больных ИБСPVP precipitate from the serum of patients with coronary heart disease 24,624.6 117117 4,34.3 25,125.1 117117 4,54,5 25,225,2 116116 4,24.2 M±mM ± m 25,0±0,325.0 ± 0.3 116,7±0,6116.7 ± 0.6 4,3±0,24.3 ± 0.2 ПВП-преципитат из сыворотки доноровDonor serum PVP precipitate 5,05,0 77 3,43.4 4,24.2 1010 2,92.9 4,54,5 55 3,23.2 M±mM ± m 4.7±0,44.7 ± 0.4 7,3±2,57.3 ± 2.5 3,2±0,33.2 ± 0.3 Таблица 4Table 4 Степень связывания комплемента мЛПНП в ПВП-преципитате в зависимости от концентрацииThe degree of complement binding of mLDPE in the PVP precipitate depending on the concentration ПВП-преципитат, мклPVP precipitate, μl 00 1010 20twenty 4040 8080 160160 сек, %sec,% 00 2727 5757 8383 9797 100one hundred

Таблица 5Table 5 Определение уровня ммЛПНП и мЛПНП в сыворотке или в плазме крови больных с инструментально подтвержденным атеросклерозом каротидных артерийDetermination of the level of mm LDL and mLDP in the serum or plasma of patients with instrumental confirmed atherosclerosis of the carotid arteries СывороткиSerum nn ммЛПНП (>10ЕД)mmLDPE (> 10ED) мЛПНП, (>15ЕД)MLPNP, (> 15ED) больных с атеросклерозом каротидных артерийpatients with atherosclerosis of carotid arteries 6060 2626 6060 Плазма крови больных с атеросклерозом каротидных артерийBlood plasma of patients with atherosclerosis of carotid arteries 20twenty 88 20twenty

Claims (1)

Способ определения модифицированных липопротеинов низкой плотности (мЛПНП) в сыворотке (плазме) крови человека путем обработки буфером, содержащим поливинилпирролидон (ПВП), с последующей турбидиметрической регистрацией смеси, отличающийся тем, что обработку сыворотки или плазмы крови человека ведут 10%-ным раствором ПВП-35000±5000 в 0,01 М Трис-HCl-буфере, рН 7,4, содержащем 0,15М NaCl, при объемном соотношении сыворотка (плазма) : ПВП от (1:2) до (1:10), инкубируют 10 мин при комнатной температуре, измеряют светопоглощение в опытной и контрольной пробах, вычисляют разность между ними и при величине разности более 15 ЕД. констатируют повышенный уровень атерогенных мЛПНП в крови и наличие атеросклеротического процесса у обследуемого человека. A method for determining modified low density lipoproteins (mLDPE) in human blood serum (plasma) by treatment with a buffer containing polyvinylpyrrolidone (PVP), followed by turbidimetric registration of the mixture, characterized in that the human serum or plasma is treated with a 10% solution of PVP- 35000 ± 5000 in 0.01 M Tris-HCl buffer, pH 7.4, containing 0.15 M NaCl, at a volume ratio of serum (plasma): PVP from (1: 2) to (1:10), incubated for 10 min at room temperature, measure light absorption in the experimental and control samples, subtracting lyayut difference therebetween, and when the difference value is higher than 15 units. ascertain an elevated level of atherogenic mLDPE in the blood and the presence of an atherosclerotic process in the person being examined.