RU2486195C2 - Пептид cdca1 и включающее его фармацевтическое средство - Google Patents
Пептид cdca1 и включающее его фармацевтическое средство Download PDFInfo
- Publication number
- RU2486195C2 RU2486195C2 RU2010110564/10A RU2010110564A RU2486195C2 RU 2486195 C2 RU2486195 C2 RU 2486195C2 RU 2010110564/10 A RU2010110564/10 A RU 2010110564/10A RU 2010110564 A RU2010110564 A RU 2010110564A RU 2486195 C2 RU2486195 C2 RU 2486195C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- peptide
- peptides
- cdca1
- cancer
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 354
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title abstract description 4
- 101150033450 NUF2 gene Proteins 0.000 title description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 206
- 101000590482 Homo sapiens Kinetochore protein Nuf2 Proteins 0.000 claims abstract description 158
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 154
- 102100032431 Kinetochore protein Nuf2 Human genes 0.000 claims abstract description 149
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 129
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 64
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 60
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims abstract description 34
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 32
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 23
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims abstract description 22
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 14
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims abstract description 11
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims abstract description 6
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims abstract description 6
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 claims abstract 7
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 claims abstract 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 180
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 85
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 63
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 37
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 25
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 22
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 17
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 14
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 14
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 13
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 claims description 2
- 210000001239 CD8-positive, alpha-beta cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 93
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 19
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 abstract description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 3
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 abstract description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 abstract 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 48
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 48
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 47
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 41
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 37
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 32
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 29
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 29
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 29
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 26
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 21
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 21
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 19
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 18
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 16
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 description 14
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 13
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 13
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 13
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 11
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 10
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 10
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 10
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 9
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 9
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 8
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 8
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 8
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 7
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 7
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 7
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 7
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 7
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 7
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 7
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 7
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 7
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 7
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 7
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 7
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 7
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 7
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 206010004593 Bile duct cancer Diseases 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 208000021712 Soft tissue sarcoma Diseases 0.000 description 5
- 208000026900 bile duct neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 5
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 5
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 210000002415 kinetochore Anatomy 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 5
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 5
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 4
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 4
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 4
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 4
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 4
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 4
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 230000010349 pulsation Effects 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 3
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 3
- 239000000306 component Substances 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 102000053687 human NUF2 Human genes 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000010039 intracellular degradation Effects 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 3
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 3
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 230000009258 tissue cross reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 101710108441 Kinetochore protein NDC80 homolog Proteins 0.000 description 2
- 102100023890 Kinetochore protein NDC80 homolog Human genes 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 2
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 2
- 101100349600 Mus musculus Nuf2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010046117 N-palmitoyl-5,6-dipalmitoyl-S-glycerylcysteinyl-seryl-serine Proteins 0.000 description 2
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 2
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 210000002433 mononuclear leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- XETCRXVKJHBPMK-MJSODCSWSA-N trehalose 6,6'-dimycolate Chemical compound C([C@@H]1[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COC(=O)C(CCCCCCCCCCC3C(C3)CCCCCCCCCCCCCCCCCC)C(O)CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC)O2)O)O1)O)OC(=O)C(C(O)CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC)CCCCCCCCCCC1CC1CCCCCCCCCCCCCCCCCC XETCRXVKJHBPMK-MJSODCSWSA-N 0.000 description 2
- XVQKZSLOGHBCET-INVHGPFASA-N tripalmitoyl-S-glyceryl-cysteinyl-seryl-serine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CSCC(OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC XVQKZSLOGHBCET-INVHGPFASA-N 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- VQFKFAKEUMHBLV-BYSUZVQFSA-N 1-O-(alpha-D-galactosyl)-N-hexacosanoylphytosphingosine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@H]([C@H](O)[C@H](O)CCCCCCCCCCCCCC)CO[C@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O VQFKFAKEUMHBLV-BYSUZVQFSA-N 0.000 description 1
- 238000010600 3H thymidine incorporation assay Methods 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 102100025832 Centromere-associated protein E Human genes 0.000 description 1
- 101710105881 Centromere-associated protein E Proteins 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-BJUDXGSMSA-N Chromium-51 Chemical compound [51Cr] VYZAMTAEIAYCRO-BJUDXGSMSA-N 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010088729 HLA-A*02:01 antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001043807 Homo sapiens Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 229920001491 Lentinan Polymers 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 1
- 241000551546 Minerva Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 101001044384 Mus musculus Interferon gamma Proteins 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 101100533701 Rattus norvegicus Smad1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000032383 Soft tissue cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000003915 air pollution Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H aluminium sulfate (anhydrous) Chemical compound [Al+3].[Al+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000010425 asbestos Substances 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000015097 attachment of spindle microtubules to kinetochore Effects 0.000 description 1
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009036 biliary tract cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020790 biliary tract neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 238000003163 cell fusion method Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000005770 chromosome separation Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 230000002281 colonystimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000008358 core component Substances 0.000 description 1
- 201000003740 cowpox Diseases 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000001159 endocytotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000031376 exit from mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 125000005519 fluorenylmethyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000011331 genomic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000052622 human IL7 Human genes 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 229940115286 lentinan Drugs 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000004758 lung carcinogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000004199 lung function Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000021587 mitotic sister chromatid separation Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N palmitic acid group Chemical group C(CCCCCCCCCCCCCCC)(=O)O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012514 protein characterization Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052895 riebeckite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 208000000649 small cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940126622 therapeutic monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4615—Dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4622—Antigen presenting cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к области биохимии и иммунологии и может быть использовано в фармакологии для получения лекарственных средств с противораковым действием. Описан пептид, представляющий собой фрагмент (351-359) полипептида 1, связанного с циклом деления клетки (CDCA1), и обладающий способностью индуцировать цитотоксические (киллерные) Т-клетки, а также его аналоги, включающие замену второй от N-конца аминокислоты метионином и/или С-концевой аминокислоты валином или лейцином и сохраняющие индуцирующее действие в отношении киллерных Т-клеток. Предлагается использовать пептиды по изобретению как непосредственно, так и в составе иммуногенных композиций (вакцин), для профилактики и/или лечения раковых заболеваний, связанных с экспрессией HLA-A2 и CDCA1. 18 н. и 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 ил., 2 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к новым пептидам, которые эффективны в качестве вакцин против типов рака, в высокой степени экспрессирующих пептид 1, связанный с циклом деления клетки (CDCA1), таких как рак легких и холангиоцеллюлярная карцинома, и к фармацевтическим средствам, которые включают эти пептиды, для лечения и профилактики опухолей.
Известный уровень техники
В последние годы количество больных раком легких продолжает расти по всему миру и в настоящее время в мире приблизительно один миллион человек умирает от рака легких ежегодно. Также и в Японии смертность от рака легких увеличивается и по оценке достигнет 123000 в 2015 г. Рак легких более характерен для мужчин и отношение мужчин к женщинам составляет три к одному. Рак легких в 1993 г. опередил рак желудка, являясь лидирующей причиной смерти от рака у мужчин. Более того, с ростом количества курящих женщин число больных женского пола, как ожидается, возрастет. Рак легких является лидирующей причиной смерти от рака с 2000 г. и при старении общества количество больных, как предполагается, будет дополнительно расти в будущем. Курение рассматривается как главная причина развития рака легких, а другие причины представляют собой вдыхание асбеста, загрязнение воздуха и тому подобное. Раннее выявление и срочное лечение важны для лечения рака легких. Однако недавно отмечалось, что простой рентген грудной клетки и тестирование мокроты, выполняемые при медицинском обследовании, не эффективны для раннего выявления рака легких, и они не ведут к снижению смертности от рака. Так как количество смертей от рака легких, как предполагается, будет продолжать расти в будущем, неотложной задачей является разработка новых терапевтических стратегий.
В Японии количество смертей от рака желчевыводящих путей возрастает и в 2005 г. 16586 человек умерли от рака желчевыводящих путей. В большинстве случаев рака желчевыводящих путей никаких субъективных симптомов на ранних стадиях не выявляется. По сравнению с типами рака, которые возникают в полости пищеварительного тракта, такими как рак желудка и рак ободочной кишки, рак желчевыводящих путей трудно выявить и диагностировать на ранних стадиях. Следовательно, во многих случаях рак уже прогрессировал и является неоперабельным при выявлении. В дополнение к хирургическому вмешательству при раке желчевыводящих путей проводят лучевую терапию и химиотерапию, но они не являются терапевтически эффективными и необходимо создание нового терапевтического метода.
С другой стороны, последние разработки в молекулярной биологии и иммунологии опухолей показали, что цитотоксические Т-клетки (киллеры) и хелперные Т-клетки узнают пептиды, образованные при деградации белков, которые специфически и в высокой степени экспрессируются в раковых клетках и которые презентируются на поверхности раковых клеток или антигенпрезентирующих клеток с помощью молекул HLA, и вызывают иммунологическую реакцию с разрушением раковых клеток. Более того, многие опухолевые белки-антигены и производные от них пептиды, которые стимулируют такую иммунологическую реакцию для борьбы с раком, идентифицированы, и антигенспецифическая терапия опухолей применяется клинически.
Молекула класса I HLA экспрессируется на поверхности всех имеющих ядро клеток организма. Она связывается с пептидом, появляющимся в результате внутриклеточной деградации белков, продуцируемых в цитоплазме или ядре, и экспрессирует пептид на клеточной поверхности. На поверхности нормальной клетки с молекулами класса I HLA связаны пептиды, происходящие от нормальных аутологичных белков, и они не узнаются и не разрушаются Т-клетками иммунной системы. С другой стороны, в процессе превращения в рак раковые клетки иногда экспрессируют большое количество белков, которые почти не экспрессируются или незначительно экспрессируются в нормальных клетках. Когда молекулы класса I HLA связываются с пептидами, возникшими в результате внутриклеточной деградации белков, специфически и в высокой степени экспрессирующихся в раковых клетках, и затем экспонируют пептиды на поверхности раковых клеток, цитотоксические Т-клетки (киллеры) узнают и разрушают только раковые клетки. С помощью введения таких специфичных для рака антигенов или пептидов индивидууму раковые клетки могут быть разрушены, и рост раковой опухоли может быть подавлен без вреда для нормальных клеток. Это называется иммунотерапией рака с использованием канцероспецифичных антигенов. Молекулы класса II HLA экспрессируются главным образом на поверхности антигенпрезентирующих клеток. Молекулы связываются с пептидами, происходящими от канцероспецифичных антигенов, которые возникают в результате внутриклеточной деградации канцероспецифических антигенов, включенных в антигенпрезентирующие клетки после поступления из внеклеточного окружения, и затем экспонируют пептиды на поверхности клеток. Хелперные Т-клетки, которые их узнают, активируются и индуцируют или усиливают иммунную реакцию против опухолей с помощью продукции различных цитокинов, которые активируют другие иммунокомпетентные клетки.
Соответственно, если разрабатывается иммунотерапия, которая направлена на антигены, специфически и в высокой степени экспрессирующиеся при типах рака, такая терапия может эффективно уничтожать только типы рака, не вызывая какого-либо вредного эффекта в нормальных аутологичных органах. Предполагается также, что терапия может быть полезна для любых больных с терминальной стадией рака, к которым не могут быть применены другие способы лечения. Кроме того, с помощью введения канцероспецифического антигена и пептида в виде вакцины заранее индивидуумам с высоким риском развития рака развитие рака может быть предотвращено.
Хотя существуют различные терапевтические методы лечения рака легких, рак легких имеет плохой прогноз по сравнению с другими типами рака и он является одним из неподатливых типов рака. Причина заключается, например, в быстрой прогрессии и во многих случаях рак находится в прогрессирующей форме к моменту обнаружения. Более того, так как хирургическое вмешательство является высоко инвазивным, количество больных, которым показано хирургическое вмешательство, является ограниченным и полное лечение с помощью лучевой терапии или химиотерапии затруднено. Если разрабатывается иммунотерапия, направленная на антигены, которые в высокой степени и специфически экспрессируются в клетках рака легких, то только рак может быть эффективно уничтожен с помощью такого терапевтического метода без какого-либо повреждения нормальных аутологичных органов. Более того, такой терапевтический метод, как ожидается, применим для любого больного с терминальной стадией рака и для больных, для которых не применимы другие методы лечения из-за крайне плохой функции легких. Кроме того, так как риск развития рака легких высок среди курильщиков, иммунотерапия может быть применима для профилактики рака легких у группы с высоким риском развития рака легких.
С помощью широкого геномного анализа экспрессии генов с использованием микроматриц кДНК авторы настоящего изобретения проанализировали экспрессионный профиль 27648 генов человека в 37 клинических случаях немелкоклеточного рака легких и в эмбриональных органах, и в различных нормальных органах взрослого человека. В результате авторы обнаружили, что CDCA1 (пептид 1, связанный с циклом деления клетки, также известный как гомологи человека Nuf2 (hNuf2)) (GenBank No. поступления NM_145697) в высокой степени экспрессируется во многих случаях рака легких, в то время как он едва экспрессируется в эмбриональной печени или нормальных органах взрослого человека, за исключением семенников, недоступных для иммунной системы. Более того, CDCA1 в высокой степени экспрессируется во всех случаях холангиоцеллюлярной карциномы, раке мочевого пузыря и почечно-клеточной карциноме. Высокая экспрессия CDCA1 обнаружена также в раковых тканях в 40% или более случаев рака простаты, хронического миелогенного лейкоза, злокачественной лимфомы, рака шейки матки, остеосаркомы, рака молочной железы, саркомы мягких тканей и рака ободочной кишки. Этот факт предполагает, что CDCA1 может служить в качестве канцероспецифического антигена при многих карциномах.
HLA-A2 часто наблюдается в популяциях людей независимо от расы и имеется у приблизительно 30% японцев. Следовательно, если можно было бы идентифицировать пептид-антиген рака, который презентируется цитотоксическим Т-клеткам (киллерам) с помощью HLA-A2, он мог бы широко применяться не только у японцев, но и у белой расы и других. Соответственно, важной задачей является идентификация пептидов-антигенов рака, которые презентируются Т-клеткам-киллерам с помощью HLA-A2. Было бы крайне удачно, если бы такие пептиды-антигены рака применялись для иммунотерапии рака легких, который характеризуется высокой заболеваемостью и смертностью по всему миру.
Документы предшествующего уровня техники, относящиеся к настоящему изобретению, представлены ниже.
[Непатентный документ 1] DeLuca J.G., Moree, B., Hickey, J.M., Kilmartin, J.V., and Salmon, E.D., hNuf2 inhibition blocks stable kinetochore-microtubule attachment and induces mitotic cell death in HeLa cells J. Cell Biol. 159: 549-555, 2002.
[Непатентный документ 2] DeLuca, J.G., Dong, Y., Hergert, P, Strauss, J., Hickey, J.M., Salmon, E.D., McEwen, B.F., Hec1 and Nuf2 Are Core Components of the Kinetochore Outer Plate Essential for Organizing Microtubule Attachment Sites., Mol. Biol. Cell 16: 519-531, 2005.
[Непатентный документ 3] Hayama, S., Daigo, Y., Kato, T., Ishikawa, N., Yamabuki, T., Miyamoto, M., Ito, T., Tsuchiya, E., Kondo, S., and Nakamura, Y., Activation of CDCA1-KNTC2, Members of Centromere Protein Complex, Involved in Pulmonary Carcinogenesis., Cancer Res. 66: 10339-10348, 2006.
[Непатентный документ 4] Liu, S.T., Rattner, J.B., Jablonski, S.A., and Yen, T.J., Mapping the assembly pathways that specify formation of the trilaminar kinetochore plates in human cells., J. Cell Biol. 175: 41-53, 2006.
[Непатентный документ 5] DeLuca, J.G., Howell, B.J., Canman, J.C., Hickey, J.M., Fang, G., and Salmon, E.D., et al. Nuf2 and Hec1 Are Required for Retention of the Checkpoint Proteins Mad1 and Mad2 to Kinetochores., Current Biology 13: 2103-2109, 2003.
[Непатентный документ 6] Liu, D., Ding, D., Du, J., Cai, Xin., Huang, Y., Ward, T., Shaw, A., Yang, Y., Hu, R., Jin, C., and Yao, X., Human NUF2 Interacts with Centromere-associated Protein E and Is Essential for a Stable Spindle Microtubule-Kinetochore Attachment. J.Biol.Chem.282: 21415-21424, 2007.
Раскрытие изобретения
[Задачи, решаемые изобретением]
Целью, достигаемой настоящем изобретением, является разработка средств для осуществления иммунотерапии, которая подавляет рост рака посредством стимуляции иммунитета раковых больных против рака, как терапевтического метода для метастазирующего или трудноизлечимого типов рака, которые трудно лечить путем хирургического вмешательства, химиотерапии и лучевой терапии, для лечения рака легких, рака желчевыводящих путей и т.д. Авторы настоящего изобретения идентифицировали пептиды, которые происходят от белков, специфически и в высокой степени экспрессируемых при раке, и которые презентируются Т-клеткам-киллерам с помощью HLA-A2, тем самым обеспечивая возможность применения иммунотерапии у 30% японцев, больных различными типами рака, которые в высокой степени экспрессируют CDCA1.
[Способы осуществления]
Авторы настоящего изобретения при анализе тканей рака легких с использованием микроматриц кДНК идентифицировали ген CDCA1 (GenBank No. поступления NM_145697), который в высокой степени экспрессируется в раке легких. В нормальных тканях экспрессия CDCA1 обнаружена только в семенниках, недоступных для иммунной системы. Для проверки того, будет или нет противоопухолевый иммунитет индуцироваться Т-клетками-киллерами, специфичными по отношению к CDCA1, использовали HLA-A2 трансгенных мышей, экспрессирующих HLA-A2, который имеется у приблизительно 30% японцев. Конкретно в настоящем изобретении авторы проверили, будут индуцироваться или нет ограниченные HLA-A2 Т-клетки-киллеры, специфичные по отношению к пептиду, когда HLA-A2 трансгенных мышей иммунизируют дендритными клетками, происходящими из костного мозга мыши, пульсированными пептидами CDCA1 человека, обладающими мотивом связывания HLA-A2. Будут Т-клетки-киллеры, специфичные по отношению к пептиду CDCA1, индуцироваться в клетках селезенки иммунизированных мышей или нет, проверяли с использованием теста ELISPOT с определением интерферона-γ (IFN-γ), продуцируемого Т-клетками-киллерами, активированными распознаваемыми пептидами, презентируемыми с помощью HLA-A2. В результате идентифицировано два типа новых пептидов CDCA1, которые могут быть применены для иммунотерапии, направленной на HLA-A2-позитивный рак у больных. Более того, было подтверждено, что CTL, происходящие от больных раком и от здоровых доноров, активированные этими пептидами, проявляют цитолитическую активность против клеток, экспрессирующих CDCA1. Это значит, что пептиды, как ожидалось, узнаются ограниченными HLA-A2 Т-клетками-киллерами человека и применимы для иммунотерапии рака у больных с HLA-A2 позитивным раком.
Более конкретно, в настоящем изобретении предлагается следующее:
[1] пептид (A) или (B) ниже:
(A) пептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2;
(B) пептид, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, где одна, две или несколько аминокислот заменены, удалены, вставлены и/или добавлены и где пептид проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки;
[2] пептид по [1], где вторая аминокислота с N-конца представляет собой лейцин или метионин;
[3] пептид по [1], где C-концевая аминокислота представляет собой валин или лейцин;
[4] средство для индукции иммунитета против рака, которое содержит один или более пептидов по [1] в качестве активного ингредиента;
[5] средство для лечения и/или профилактики рака, которое содержит один или более пептидов по [1] в качестве активного ингредиента;
[6] средство для индукции антигенпрезентирующей клетки, которое проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки, где указанное средство включает один или более пептидов по [1] в качестве активного ингредиента;
[7] средство для индукции антигенпрезентирующей клетки, которое проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки, где указанное средство включает в качестве активного ингредиента один или более полинуклеотидов, кодирующих пептиды по [1];
[8] средство для индукции цитотоксической (киллерной) Т-клетки, где указанное средство включает один или более пептидов по [1] в качестве активного ингредиента;
[9] антитело против пептида по [1];
[10] хелперная Т-клетка, цитотоксическая (киллерная) Т-клетка или включающая их популяция иммуноцитов, которые индуцируются с использованием пептида по [1];
[11] антигенпрезентирующая клетка, которая презентирует комплекс, включающий пептид по [1] и антиген HLA;
[12] антигенпрезентирующая клетка по [11], которая индуцируется средством по [6] или [7];
[13] экзосома, которая презентирует комплекс, включающий пептид по [1] и антиген HLA;
[14] экзосома по [13], где антиген HLA представляет собой HLA-A2 (HLA-A2*0201);
[15] способ индукции антигенпрезентирующей клетки, которая проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки, который включает стадию контактирования антигенпрезентирующей клетки с пептидом по [1];
[16] способ индукции антигенпрезентирующей клетки, которая проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки, который включает стадию введения полинуклеотида, кодирующего пептид по [1], в антигенпрезентирующую клетку;
[17] способ индукции цитотоксической (киллерной) Т-клетки, который включает стадию контактирования Т-клетки с пептидом по [1];
[18] способ индукции иммунитета против рака, который включает стадию введения пептида по [1] индивидууму;
[19] способ лечения и/или профилактики рака, который включает стадию введения пептида по [1] индивидууму;
[20] применение пептида по [1] для получения средства для индукции иммунитета против рака;
[21] применение пептида по [1] для получения средства для лечения и/или профилактики рака;
[22] пептид по [1] для индукции иммунитета против рака;
[23] пептид по [1] для лечения и/или профилактики рака.
Краткое описание фигур
На фиг. 1A представлен протокол идентификации пептидов CDCA1, узнаваемых ограниченными HLA-A2 киллерными Т-клетками. День, когда клетки селезенки отбирали у иммунизированных мышей, обозначен как «день 0». На фиг. 1B представлены результаты теста ELISPOT. Тест ELISPOT использовали для проверки того, будут или нет киллерные Т-клетки, полученные от иммунизированных мышей, специфически отвечать на пульсированные пептидом CDCA1 клетки и продуцировать IFN-γ. В результате киллерные Т-клетки, индуцированные пептидом CDCA1-1 или CDCA1-4, специфически узнавали клетки T2A2, пульсированные пептидом CDCA1, и продуцировали IFN-γ. Однако никакого специфичного для CDCA1 иммунного ответа киллерных Т-клеток не наблюдалось у киллерных Т-клеток, индуцируемых другими пептидами. Следовательно, установлено, что пептиды CDCA1-1 и CDCA1-4 являются эпитопными пептидами, способными индуцировать специфичные для CDCA1 ограниченные HLA-A2 Т-клетки-киллеры. Номера пептидов CDCA1, представленных на фигуре 1B, соответствуют номерам пептидов, представленным в графе «ПОЛОЖЕНИЕ ПЕПТИДА» таблицы 1, но не номерам последовательностей ID, описанным в настоящем документе.
На фиг. 2 представлен результат теста ELISPOT по определению IFN-γ, продуцируемому Т-клетками-киллерами, активированными в результате специфического узнавания пептидов CDCA1. На фиг. 2A представлен результат индукции Т-клеток-киллеров путем стимуляции пульсированных пептидом CDCA165-73 (No. 1) (SEQ ID NO:1) дендритных клеток, происходящих из костного мозга HLA-A2 трансгенных мышей. Когда в качестве стимулированных клеток использовали пульсированные пептидом CDCA1 клетки T2A2, количество в пятне и суммарная область пятна были значительно больше, чем таковые когда в качестве стимулированных клеток использовали HLA-A2 позитивные пульсированные не CDCA1 клетки T2A2. Таким образом, установлено, что пептид CDCA1-1 представляет собой эпитопный пептид, способный индуцировать ограниченные HLA-A2 Т-клетки-киллеры. На фиг. 2B представлен результат индукции Т-клеток-киллеров путем стимуляции пульсированных пептидом CDCA1351-359 (No. 4) (SEQ ID NО:2) дендритных клеток, происходящих из костного мозга HLA-A2 трансгенных мышей. Когда в качестве стимулированных клеток использовали пульсированные пептидом CDCA1 клетки T2A2, количество в пятне и суммарная область пятна были значительно больше, чем таковые, когда в качестве стимулированных клеток использовали HLA-A2 позитивные пульсированные не CDCA1 клетки T2A2. Таким образом, установлено, что пептид CDCA1351-359 (No. 4) представляет собой эпитопный пептид, способный индуцировать ограниченные HLA-A2 Т-клетки-киллеры.
На фиг. 3 представлен специфический иммунный ответ CDCA1 индуцированных CTL от здорового донора. На фиг. 3A представлен протокол индукции специфических для CDCA1 CTL из PBMC. PBMC получали от здорового донора и CD8+ Т-клетки и CD14+ клетки отделяли с использованием микрошариков. Затем продуцировали взаимодействующие с пептидом CD8+ CTL, и DC получали из CD14-позитивных клеток путем культивирования в течение пяти дней в присутствии GM-CSF и ИЛ-4. DC культивировали в присутствии β2 микроглобина при 37°С в течение четырех часов и пульсировали HLA-A2 связывающими пептидами. Пульсированные пептидом DC затем облучали и смешивали с аутологичными CD8-позитивными Т-клетками в отношении 1:20. Клетки культивировали в содержащей AIM-V 2% аутосыворотке, снабженной ИЛ-7. Через три дня в культуральную среду добавляли ИЛ-2. На 12 и 19 дни Т-клетки повторно стимулировали пульсированными пептидом аутологичными DC. DC получали по использованию. Тест ELISPOT на IFN-γ и тест высвобождения Cr выполняли через пять и шесть дней после третьей пептидной стимуляции. На фиг. 3B и C представлены результаты теста ELISPOT, выполненного после совместного культивирования клеток-мишеней с CTL, от донора, индуцированных с использованием пептида CDCA165-73 (No. 1) и пептида CDCA1351-359 (No. 4), соответственно. Продукция IFN-γ против пульсированных пептидом T2 клеток была существенно выше, чем против пульсированных не пептидом T2 клеток. На фиг.3D представлена индуцированная цитотоксичность CTL от PBMC донора 1, больного раком и здорового донора 1 против пульсированных пептидом CDCA1 клеток Т2. На фиг. 3E представлен дозозависимый ответ CTL, происходящих от здорового донора 1, индуцированный пептидом CDCA1351-359. CTL продуцировали большое количество IFN-γ в ответ на T2 клетки, пульсированные пептидом в концентрации 0,2 мкг/мл или боле при отношении E/T равном 5.
На фиг. 4 представлена индуцированная цитотоксическая активность CTL от здорового донора против CDCA1-позитивных раковых клеток. На фиг. 4A представлена экспрессия в клетках COLO201, когда экспрессионный вектор гена CDCA1 введен в клетки. Лентивирус, в котором индуцируется экспрессия CDCA1-HA под контролем промотора EF-1α и промотора CMV, использовали для инфицирования линии раковых клеток (COLO201), которые экспрессируют HLA-A2, но не CDCA1, три раза. Лизат клеток подвергали анализу вестерн-блоттингом с использованием антитела против HA (в середине) или антитела против CDCA1 (вверху). На фиг. 4B, C и D представлена продукция IFN-γ против COLO201/CDCA1. Продукция IFN-γ была значительно выше в трансформированной линии раковых клеток COLO201, чем в нетрансформированной COLO201. Более того, продукция IFN-γ против PANC1, эндогенно экспрессирующих как CDCA1, так и HLA-A2, была существенно выше, чем продукция против A549, не экспрессирующих ни CDCA1, ни HLA-A2. На фиг. 4E и F представлены результаты теста высвобождения 51Cr, когда индуцированные CTL донора и клетки-мишени культивировали совместно. Цитотоксичность была обнаружена для PANC1 (CDCA1+, HLA-A2+), но не для A549 (CDCA1+, HLA-A2-) и COLO201 (CDCA1-, HLA-A2+). На фиг. 4G представлена корреляция между реагирующими на пептид CDCA1 CTL и позитивными по тетрамеру HLA-A2-CDCA1 CTL среди CD8-позитивных клеток. На левой диаграмме представлен тест ELISPOT с использованием пульсированных пептидом клеток T2 в качестве клеток-мишеней и отношение E/T составляло 5. На правой диаграмме представлен результат анализа FACS. Клетки, проанализированные на левой диаграмме, представляют собой происходящие от здорового донора 1 CTL из PBMC три раза подвергавшихся стимуляции пульсированными пептидом DC. Клетки, проанализированные на правой диаграмме, представляют собой наивные CD8-позитивные клетки, выделенные из PBMC здорового донора 1.
Способ осуществления изобретения
Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют такое же значение, что и обычно понимаемое специалистом в той области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение.
Пептиды по настоящему изобретению представляют собой эпитопы, ограниченные HLA-A2, который является аллелем HLA, часто обнаруживаемым в популяциях японцев и людей белой расы. Конкретно, используя связывающее сродство к HLA-A2 в качестве показателя, отбирали кандидатные пептиды, связывающие HLA-A2, происходящие от CDCA1. У отобранных пептидов оценивали, будут или нет индуцироваться Т-клетки-киллеры в организме HLA-A2-трансгенных мышей под действием дендритных клеток, происходящих из клеток костного мозга HLA-A2-трансгенной мыши (BM-DC), пульсированных отобранными пептидами. Цитотоксические (киллерные) Т-клетки индуцировали in vivo у HLA-A2-трансгенных мышей под действием CDCA1-1 (YMMPVNSEV (SEQ ID NO:1)) и CDCA1-4 (KLATAQFKI (SEQ ID NO:2)). Т-клетки-киллеры, индуцированные этими пептидами, проявляли реакцию иммунного ответа на T2A2 клетки, пульсированные этими пептидами. Однако эти Т-клетки-киллеры не демонстрировали реакцию иммунного ответа на T2A2 клетки, не пульсированные пептидом. Более того, CTL, происходящие от больного раком и происходящие от здорового донора, которые были индуцированы с использованием CDCA1-1 и CDCA1-4, проявляли цитолитическую активность против клеточных линий, экспрессирующих CDCA1. Эти результаты демонстрируют, что пептиды, происходящие от CDCA1, пригодны в качестве пептидов, индуцирующих иммунную реакцию против CDCA1-презентирующих клеток, и что пептиды, происходящие от CDCA1, представляют собой ограниченные HLA-A2 эпитопные пептиды. Показано, что CDCA1 в высокой степени экспрессируется в канцерогенных тканях в большинстве случаев рака легких, холангиоцеллюлярной карциномы, рака мочевого пузыря, почечно-клеточной карциномы, рака простаты, хронического миелогенного лейкоза, злокачественной лимфомы, рака шейки матки, остеосаркомы, рака молочной железы, саркомы мягких тканей и рака ободочной кишки. На основе этих фактов CDCA1 рассматривается как пригодный в качестве иммунотерапевтической мишени для различных типов рака.
(1) Пептиды по настоящему изобретению и средства для индукции иммунитета против рака, которые содержат пептиды
Пептид по настоящему изобретению является любым из от (A) до (D) ниже.
(A) Пептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2.
(B) Пептид, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, где одна, две или несколько аминокислот заменены, удалены, вставлены и/или добавлены и где пептид проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки.
(C) Пептид по (B), где вторая аминокислота с N-конца представляет собой лейцин или метионин.
(D) Пептид по (B), где C-концевая аминокислота представляет собой валин или лейцин.
В настоящем документе «пептид, который проявляет активность, индуцирующую Т-клетки-киллеры», означает «пептид, обладающий индуцирующей Т-клетки активностью, который стимулирует Т-клетки-киллеры (цитотоксические Т-клетки/CTL)».
Пептид по настоящему изобретению является эпитопным пептидом, содержащим менее приблизительно 40 аминокислот, предпочтительно менее приблизительно 20 аминокислот, более предпочтительно менее приблизительно 15 аминокислот, и включающим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2 и проявляющим активность в виде индукции Т-клеток-киллеров. Более того, пептиды по настоящему изобретению (эпитопные пептиды) могут включать пептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, где одна, две или несколько аминокислот заменены, удалены, вставлены и/или добавлены до тех пор, пока сохраняется способность индуцировать Т-клетки-киллеры. Количество замененных, удаленных, вставленных и/или добавленных остатков обычно составляет пять аминокислот или менее, предпочтительно четыре аминокислоты или менее, более предпочтительно три аминокислоты или менее, даже более предпочтительно одну аминокислоту или две аминокислоты.
Варианты пептидов (т.е. пептиды, включающие аминокислотные последовательности, полученные в результате модификации исходных аминокислотных последовательностей путем замены, делеции, вставки и/или добавления одного, двух или нескольких аминокислотных остатков), как известно, сохраняют исходную биологическую активность (Mark DF et al., (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:5662-6; Zoller MJ and Smith M, (1982) Nucleic Acids Res 10:6487-500; Dalbadie-McFarland G et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:6409-13). Аминокислотная модификация предпочтительно сохраняет свойства исходных аминокислотных боковых цепей. Примеры свойств аминокислотных боковых цепей включают: гидрофобную аминокислоту (A, I, L, M, F, P, W, Y, V); гидрофильную аминокислоту (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T); и боковые цепи, обладающие следующими функциональными группами или свойствами в целом: алифатические боковые цепи (G, A, V, L, I, P); боковые цепи, содержащие гидроксильные группы (S, T, Y); боковые цепи, содержащие атом серы (C, M); боковые цепи, содержащие карбоновые кислоты и амиды (D, N, E, Q); боковые цепи, содержащие основания (R, K, H); и боковые цепи, содержащие ароматические кольца (H, F, Y, W). Буквы в скобках представляют собой однобуквенные коды аминокислот.
В предпочтительном варианте осуществления пептиды по настоящему изобретению (иммуногенные пептиды) представляют собой нонапептиды (9-членные) или декапептиды (10-членные).
Для получения пептидов с высоким связывающим сродством и активностью, индуцирующей Т-клетки-киллеры, аминокислотная последовательность пептида - части природного CDCA1 может быть модифицирована путем замены, делеции, вставки и/или добавления одной, двух или нескольких аминокислот. В настоящем документе термин «несколько» относится к пяти или менее, предпочтительно к трем или менее, более предпочтительно к двум или менее. Более того, так как известна упорядоченность пептидных последовательностей, которые обладают высоким сродством к антигенам HLA, (Kubo RT, et al., (1994) J. Immunol., 152, 3913-24; Rammensee HG, et al., (1995) Immunogenetics. 41:178-228; Kondo A, et al. (1995) J. Immunol. 155:4307-12), пептиды по настоящему изобретению (эпитопные пептиды) могут быть модифицированы на основе упорядоченности для того, чтобы повысить их сродство к антигенам HLA. Например, пептиды с высоким связывающим сродством к HLA-A2 могут быть получены путем замены второй аминокислоты с N-конца на лейцин или метионин. Сходно, пептиды с высоким связывающим сродством к HLA-A2 могут быть также получены путем замены C-концевой аминокислоты на валин или лейцин.
Когда последовательность эпитопного пептида идентична части аминокислотной последовательности эндогенного или экзогенного белка, обладающего отличной функцией, могут вызываться побочные эффекты, такие как аутоиммунные нарушения или аллергические симптомы против конкретного вещества. Для того, чтобы избежать таких побочных эффектов модифицированный эпитопный пептид не должен быть идентичным аминокислотным последовательностям известных белков. Для этой цели необходимо осуществить поиск гомологии с использованием доступных баз данных для подтверждения того, что не существует эндогенного или экзогенного белка с отличной функцией, который имеет 100% гомологию с модифицированным эпитопным пептидом. С помощью этой процедуры можно избежать рисков, обусловленных указанной выше модификацией аминокислотной последовательности для повышения связывающего сродства к антигенам HLA и/или повышения активности, индуцирующей Т-клетки-киллеры.
Хотя указанные выше пептиды, обладающие высоким связывающим сродством к антигенам HLA, как предполагается, являются высокоэффективными в качестве вакцин против рака, кандидатные пептиды, отобранные с использованием в качестве показателя высокое связывающее сродство, необходимо проверить, обладают ли они действительно активностью, индуцирующей Т-клетки-киллеры. Активность, индуцирующая Т-клетки-киллеры, может быть подтверждена с помощью: индукции антигенпрезентирующих клеток, обладающих антигеном MHC человека (например, В-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток), более конкретно индукции дендритных клеток, происходящих от мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека; стимуляции их интересующим пептидом; затем смешивания их с CD8-позитивными клетками; и измерения цитотоксической активности в отношении клеток-мишеней. В качестве реакционной системы могут быть использованы трансгенные животные, которые экспрессируют антиген HLA человека (как описано, например, в BenMohamed L, et al. (2000) Hum. Immunol. 61(8):764-79, относящихся к этому статьях, книгах и адресах связи). Например, для измерения цитотоксической активности клетки-мишени метят радиоактивным изотопом 51Cr или тому подобным. Цитотоксическая активность на клетках-мишенях может быть проверена с помощью измерения IFN-γ, продуцируемого и секретируемого Т-клетками-киллерами в присутствии антигенпрезентирующих клеток, обладающих иммобилизованным пептидом; и визуализации зоны продукции IFN-γ в культуральной среде с использованием моноклонального антитела против IFN-γ.
Как показано в примерах, данные по тестированию активности пептидов, индуцирующей Т-клетки-киллеры, продемонстрировали, что пептиды, обладающие высоким связывающим сродством к антигену HLA не обязательно обладают высокой активностью, индуцирующей Т-клетки-киллеры. Однако пептиды, содержащие аминокислотные последовательности CDCA1-1 (YMMPVNSEV (SEQ ID NO:1)) и CDCA1-4 (KLATAQFKI (SEQ ID NO:2)) проявили особенно высокую активность, индуцирующую Т-клетки-киллеры.
Как описано выше, в настоящем изобретении предлагаются пептиды, проявляющие активность, индуцирующую Т-клетки-киллеры, более конкретно, пептиды, включающие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2 и их варианты (т.е. аминокислотные последовательности, в которых одна, две или несколько аминокислот заменены, удалены, вставлены и/или добавлены). Предпочтительно, аминокислотные последовательности пептидов, включающие девять аминокислот SEQ ID NO: 1 или 2, или их варианты не идентичны последовательностям других эндогенных белков. Особенно пептиды с высоким связывающим сродством к HLA-A2 могут быть получены путем замены второй аминокислоты с N-конца на лейцин или метионин и/или путем замены C-концевой аминокислоты на валин или лейцин.
Пептиды по настоящему изобретению могут включать модификации, такие как гликозилирование, окисление боковой цепи и фосфорилирование, до тех пор, пока пептиды не потеряют свою активность, индуцирующую Т-клетки-киллеры. Другие модификации включают, например, D-аминокислоты и другие аминокислотные аналоги, которые могут быть использованы для повышения периода полужизни пептидов в сыворотке.
Методы получения и продукции пептидов по настоящему изобретению особенно не ограничены. Пригодны химически синтезированные пептиды или рекомбинантные пептиды, продуцируемые с помощью методов рекомбинации генов.
Химически синтезированные пептиды по настоящему изобретению могут быть синтезированы в соответствии с методами химического синтеза, такими как метод Fmoc (флуоренилметилоксикарбонильный метод) и метод t-Boc (трет-бутилоксикарбонильный метод). Пептиды по настоящему изобретению могут быть также синтезированы с использованием различных имеющихся в продаже пептидных синтезаторов.
Пептиды по настоящему изобретению могут быть получены в виде рекомбинантных белков с помощью получения ДНК, обладающих нуклеотидными последовательностями, кодирующими пептиды или их варианты или гомологи, и введения их в подходящую экспрессионную систему.
Используемые экспрессионные векторы могут быть предпочтительно любыми векторами, которые могут автономно дуплицироваться в клетках-хозяевах или могут быть включены в хромосому клеток-хозяев и содержат промотор в положении, подходящем для разрешения экспрессии гена, кодирующего пептид. Трансформированные клетки, обладающие геном, кодирующим пептид по настоящему изобретению, могут быть получены путем введения указанного выше экспрессионного вектора хозяину. Хозяин может представлять собой любое из бактерий, дрожжей, животных клеток и клеток насекомых, и экспрессионный вектор может быть введен хозяину с использованием известных способов в зависимости от хозяина.
В настоящем изобретении рекомбинантные пептиды могут быть выделены путем культивирования трансформированных клеток, полученных, как описано выше, продукции и накопления пептидов в культуре и получения пептидов по настоящему изобретению из культуры.
Когда трансформированной клеткой является прокариот, такой как E. coli, или эукариот, такой как дрожжи, культуральная среда для этих микроорганизмов может быть либо природной, либо синтетической средой, до тех пор, пока она содержит источник углерода, источник азота, неорганические соединения и тому подобное, что может быть использовано микроорганизмами и позволяет эффективно культивировать трансформированную клетку. Условия культивирования могут быть условиями, традиционно используемыми для культивирования микроорганизмов. После культивирования пептиды по настоящему изобретению могут быть выделены из культуры трансформированных клеток и очищены с использованием общепринятых методов выделения и очистки пептидов.
Пептиды, включающие аминокислотную последовательность, в которой одна, две или несколько аминокислот заменены, удалены, вставлены или добавлены в аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2 могут быть подходящим образом продуцированы или получены специалистом в данной области техники на основе информации о последовательности нуклеотидов в ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2. Конкретно, ген, который кодирует пептид, включающий аминокислотную последовательность, в которой одна, две или несколько аминокислот заменены, удалены, вставлены и/или добавлены в аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, и проявляющий активность, индуцирующую Т-клетки-киллеры, может быть получен с помощью любых методов, известных специалистам в данной области техники, таких как химический синтез, методы генной инженерии и мутагенез. Например, пригоден метод сайт-направленного мутагенеза, который является одним из методов генной инженерии, так как с его помощью можно вводить конкретную мутацию в конкретное положение. Он может быть осуществлен в соответствии с методами, описанными в руководствах Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989 (обозначаемом в настоящем документе далее как Molecular Cloning, 2nd Ed.) и Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997) (обозначаемом в настоящем документе далее как Current Protocols in Molecular Biology) и т.д.
Описанные выше пептиды по настоящему изобретению могут индуцировать иммунитет против рака, как показано в примерах ниже. Следовательно, в настоящем изобретении предлагаются средства для индукции иммунитета против рака, включающие пептиды по настоящему изобретению.
Индуцирующие иммунитет средства по настоящему изобретению могут быть получены в виде смешанного состава, объединенного с двумя или более эпитопными пептидами. Индуцирующие иммунитет средства, приготовленные путем объединения множественных типов пептидов, могут представлять собой коктейль или могут быть совместно связаны с использованием стандартных методов. Эпитопные пептиды, предназначенные для объединения, могут представлять собой пептиды, обладающие различными аминокислотными последовательностями, происходящими от одного и того же гена, или могут представлять собой пептиды, обладающие различными аминокислотными последовательностями, происходящими от разных генов. Когда вводят пептиды по настоящему изобретению, вводимые пептиды презентируются на антигенах HLA антигенпрезентирующих клеток с высокой плотностью, и затем индуцируются Т-клетки-киллеры, которые специфически взаимодействуют с комплексами, образованными вводимыми пептидами и антигенами HLA. Альтернативно, путем контактирования дендритных клеток, отобранных у индивидуума, с пептидами по настоящему изобретению (т.е. путем пульсирования дендритных клеток, отобранных у индивидуума, пептидами по настоящему изобретению) могут быть получены антигенпрезентирующие клетки, которые презентируют пептиды по настоящему изобретению на своей клеточной поверхности. С помощью введения этих антигенпрезентирующих клеток обратно индивидууму в организме индивидуума могут быть индуцированы Т-клетки-киллеры и в результате иммунный ответ на клетки-мишени, презентирующие пептиды по настоящему изобретению, может быть увеличен.
При использовании in vitro или in vivo, предпочтительно in vitro, средства для индукции иммунитета против рака по настоящему изобретению могут индуцировать Т-клетки-хелперы, Т-клетки-киллеры или популяции иммуноцитов, включающие эти клетки, тем самым обеспечивая иммунитет против рака.
(2) Средства по настоящему изобретению для лечения и/или профилактики рака (вакцины против рака)
В примерах показано, что пептиды по настоящему изобретению могут индуцировать in vivo Т-клетки-киллеры, специфичные в отношении раковых клеток. С другой стороны, в предшествующем изобретении было показано, что CDCA1 в высокой степени экспрессировался в большинстве случаев рака легких, холангиоцеллюлярной карциномы, рака мочевого пузыря, почечно-клеточной карциномы, рака простаты, хронического миелогенного лейкоза, злокачественной лимфомы, рака шейки матки, остеосаркомы, рака молочной железы, саркомы мягких тканей, рака ободочной кишки и тому подобное. Соответственно, индуцирующие иммунитет средства, включающие один или более пептидов по настоящему изобретению, как ожидается, являются эффективными в качестве активного ингредиента как средства для лечения и/или профилактики рака. Это значит, что можно ожидать индукцию и активацию Т-клеток-киллеров, атакующих опухоль, в результате введения в организм пептидов по настоящему изобретению совместно с подходящим адъювантом или в результате пульсирования антигенпрезентирующих клеток, таких как дендритные клетки, пептидами и затем их введения в организм. Таким образом, в конечном итоге могут ожидаться противоопухолевые эффекты. Более того, ген, кодирующий пептид по настоящему изобретению, может быть введен в подходящий вектор. Антигенпрезентирующие клетки человека (дендритные клетки и т.д.) и бактерии, такие как BCG, Mycobacterium tuberculosis, которые трансформированы рекомбинантной ДНК или вирусами, такими как вирусы коровьей оспы, которые содержат ДНК, кодирующую пептид по настоящему изобретению, включенную в их геном, можно эффективно использовать в качестве живых вакцин для лечения и/или профилактики рака человека. Дозировки и методы введения вакцин против рака являются такими же, что и для обычных вакцин против оспы и вакцин BCG.
В настоящем изобретении термин «вакцина» (также называемая «иммуногенной композицией») относится к веществу, которое индуцирует противоопухолевый иммунитет или подавляет различные типы рака при инокуляции животному. По настоящему изобретению предполагается, что пептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, представляет собой ограниченный HLA-A2 эпитопный пептид, который может индуцировать сильный и специфичный иммунный ответ против клеток, презентирующих CDCA1. Соответственно, настоящее изобретение также включает способы индукции противоопухолевого иммунитета с помощью использования пептидов, включающих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2 или ее варианты, которые включают замену, делецию или добавление одной, двух или нескольких аминокислот. В целом, противоопухолевый иммунитет включает следующие иммунные ответы:
(1) индукцию Т-клеток-киллеров против опухолей, содержащих клетки, экспрессирующие CDCA1,
(2) индукцию антител, которые узнают опухоли, содержащие клетки, экспрессирующие CDCA1, и
(3) индукцию продукции противоопухолевых цитокинов.
Когда конкретный пептид индуцирует любой из этих иммунных ответов при инокуляции животному, пептид определяется как обладающий эффектом, индуцирующим противоопухолевый иммунитет. Индукция пептидом противоопухолевого иммунитета может быть определена по обнаружению in vivo или in vitro ответа иммунной системы хозяина на пептид.
Например, хорошо известны методы определения индукции Т-клеток-киллеров. Чужеродное вещество, которое вторгается в живой организм, представляется Т-клеткам и В-клеткам под действием антигенпрезентирующих клеток (APC). Т-клетки, которые отвечают на антигены, презентируемые антигенпрезентирующими клетками специфическим для антигена образом, дифференцируются в Т-клетки-киллеры (также называемые цитотоксическими Т-лимфоцитами или CTL) путем стимуляции антигенами и последующей пролиферации. В настоящем документе этот процесс называется «активацией» Т-клеток. Индукция Т-клеток-киллеров специфическим пептидом может быть оценена путем презентации пептида Т-клеткам с использованием пульсированных пептидом антигенпрезентирующих клеток и последующего определения индукции Т-клеток-киллеров. Более того, антигенпрезентирующие клетки обладают эффектом в отношении активации CD4+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток, макрофагов, эозинофилов и NK-клеток. Так как CD4+ Т-клетки также важны для противоопухолевого иммунитета, действие пептида, индуцирующее противоопухолевый иммунитет, может быть оценено при использовании в качестве показателя действия на активацию этих клеток.
Метод оценки эффекта индукции Т-клеток-киллеров, которые индуцируются с использованием в качестве антигенпрезентирующих клеток дендритных клеток (DC), хорошо известен в данной области техники. Среди антигенпрезентирующих клеток DC обладают наиболее сильным эффектом на индукцию Т-клеток-киллеров. При этом методе первоначально тестируемый пептид вводят в контакт с DC и затем DC вводят в контакт с Т-клетками. В Т-клетках, контактировавших с DC, определяют Т-клетки, которые обладают цитотоксическим эффектом на клетки-мишени. Если Т-клетки проявляют цитотоксическую активность против клеток-мишеней, это означает, что тестируемый пептид обладает активностью, индуцирующей Т-клетки-киллеры. Активность Т-клеток-киллеров против клеток-мишеней, таких как клетки опухолей, может быть определена, например, с использованием в качестве показателя лизиса клеток опухолей, меченных 51Cr. Альтернативно, степень повреждения опухолевых клеток может быть оценена с использованием в качестве показателя активность включения 3H-тимидина или секрецию LDH (лактатдегидрогеназы).
Тестируемые пептиды, для которых этими методами подтверждена активность, индуцирующая Т-клетки-киллеры, представляют собой пептиды, которые обладают эффектом активации DC и последующей активностью в отношении индукции Т-клеток-киллеров. Следовательно, пептиды, которые индуцируют Т-клетки-киллеры против опухолевых клеток, пригодны в качестве вакцин против типов рака, презентирующих CDCA1. Более того, антигенпрезентирующие клетки, которые приобрели способность индуцировать Т-клетки-киллеры против типов рака в результате контакта с пептидами, пригодны в качестве вакцин против типов рака. Кроме того, Т-клетки-киллеры, которые приобрели цитотоксичность в результате презентации пептидов антигенпрезентирующими клетками, также могут быть использованы в качестве вакцин против типов рака, презентирующих CDCA1. Методы лечения рака с использованием противоопухолевого иммунитета, вызываемого антигенпрезентирующими клетками и Т-клетками-киллерами, называются цитоиммунотерапией.
В целом, при использовании пептидов для цитоиммунотерапии эффективность индукции Т-клеток-киллеров может быть повышена путем объединения многих пептидов, имеющих различную структуру. Следовательно, при стимуляции DC фрагментами белка выгодно использовать смесь многих типов пептидных фрагментов.
Индукция противоопухолевого иммунитета пептидами может быть также оценена с помощью выявления индукции продукции антител против опухолей. Например, когда индуцируются антитела против пептидов путем иммунизации лабораторных животных пептидами, и они подавляют рост, пролиферацию и/или метастазирование опухолевых клеток, это свидетельствует о том, что пептиды индуцируют противоопухолевый иммунитет.
Противоопухолевый иммунитет может быть индуцирован путем введения вакцины по настоящему изобретению, и индукция противоопухолевого иммунитета дает возможность лечить и/или предотвращать типы рака. Эффекты лечения рака и/или профилактики развития рака могут включать ингибирование роста раковых клеток, регрессию раковых клеток и подавление развития раковых клеток. Снижение степени смертности индивидуумов от рака, снижение маркеров опухоли в крови и снижение определяемых симптомов, связанных с раком, также включаются в эффекты лечения и/или профилактики рака. Терапевтические или профилактические эффекты вакцины против рака являются предпочтительно статистически значимыми по сравнению с эффектами в контроле без введения вакцины. Например, наблюдаются эффекты предпочтительно с уровнем значимости 5% или менее. Для определения статистической значимости могут быть использованы статистические методы, такие как t-критерий Стьюдента, U-критерий Манна-Уитни и ANOVA.
В настоящем изобретении индивидуум представляет собой предпочтительно млекопитающее. Примеры млекопитающих включают людей, нечеловекообразных приматов, мышей, крыс, собак, кошек, лошадей и крупный рогатый скот, но не ограничиваются этим.
Пептиды по настоящему изобретению можно вводить индивидууму in vivo или ex vivo. Более того, для получения иммуногенной композиции для лечения и/или профилактики рака могут быть использованы иммуногенные пептиды по настоящему изобретению, которые представляют собой нонапептиды, выбранные из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1 и 2 и их мутантные пептиды.
Более конкретно, в настоящем изобретении предлагаются фармацевтические средства для лечения опухоли и/или профилактики опухолевого роста, метастазирования и тому подобное, которые включают в качестве активного ингредиента один или более пептидов по настоящему изобретению. Пептиды по настоящему изобретению особенно пригодны для лечения опухолей, таких как рак легких, холангиоцеллюлярная карцинома, рак мочевого пузыря, почечно-клеточная карцинома, рак простаты, хронический миелогенный лейкоз, злокачественная лимфома, рак шейки матки, остеосаркома, рак молочной железы, саркома мягких тканей и рак ободочной кишки.
Пептиды по настоящему изобретению можно вводить непосредственно индивидууму в качестве фармацевтических средств, приготовленных с помощью традиционных методов составления. Такие составы могут при необходимости содержать в дополнение к пептидам по настоящему изобретению фармацевтически приемлемые носители, наполнители и тому подобное. Фармацевтические средства по настоящему изобретению можно использовать для лечения и/или профилактики различных опухолей.
Более того, для установления эффективного клеточного иммунитета можно смешивать адъюванты с иммуногенными композициями для лечения и/или профилактики опухолей, включающими один или более пептидов по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента. Средства можно вводить совместно с другими активными ингредиентами, такими как противоопухолевые средства. Подходящие составы включают также гранулы. Подходящие адъюванты описаны в литературе (Johnson AG. (1994) Clin. Microbiol. Rev., 7:277-89). Примеры адъювантов включают неполный адъювант Фрейнда, BCG, трегалозы димиколат (TDM), липополисахарид (LPS), адъювант квасцовой муки, адъювант диоксида кремния, фосфат алюминия, гидроксид алюминия и квасцы, но не ограничиваются этим. Кроме того, можно легко использовать липосомные составы, гранулярные составы, в которых лекарство связано с шариками, имеющими диаметр несколько микрометров, и составы, в которых липиды связаны с упомянутыми выше пептидами. Методами введения могут быть пероральное введение, внутрикожная инъекция, подкожная инъекция, внутривенная инъекция или тому подобное и могут включать системное введение и местное введение рядом с опухолью-мишенью.
Доза пептидов по настоящему изобретению может быть приведена в соответствие с подлежащим лечению заболеванием, возрастом и массой тела больного, методом введения и тому подобным. Доза обычно составляет от 0,001 мг до 1000 мг, предпочтительно от 0,01 мг до 100 мг и наиболее предпочтительно от 0,1 мг до 10 мг. Предпочтительно введение производят от одного раза в несколько дней до одного раза в несколько месяцев, но специалисты в данной области техники могут легко выбрать подходящую дозу и метод введения; выбор и оптимизация этих параметров полностью входят в объем традиционных методов. Форма составов не является особенно ограниченной, и они могут быть высушенными замораживанием или гранулированными путем добавления наполнителей, таких как сахар.
К фармацевтическим средствам по настоящему изобретению могут быть добавлены вспомогательные средства для повышения индуцирующей киллерную T-клеточную активность, которые включают бактериальные компоненты бактерий BCG и тому подобного, включающие мурамиловый дипептид (MDP), ISCOM, описанный в Nature, vol. 344, p873 (1990), QS-21 ряда сапонина, описанный в J. Immunol. vol. 148, p1438 (1992), липосому и гидроксид алюминия. Более того, в качестве вспомогательных средств также могут быть использованы иммуностимуляторы, такие как лентинан, сизофиран и пицибанил. В качестве вспомогательных средств также могут быть использованы цитокины и им подобное, которые повышают рост и дифференцировку T-клеток, такие как ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-12, ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО, а также α-галактозилцерамид, который активирует NK T-клетки, и CpG и липополисахариды (LPS), которые активируют систему врожденного иммунитета путем связывания с Toll-подобными рецепторами, и тому подобное.
Композиции вакцины по настоящему изобретению содержат компонент, который примирует киллерные T-клетки. В качестве веществ, которые примируют против вирусных антигенов in vivo, были идентифицированы липиды. Например, остатки пальмитиновой кислоты могут связываться с ε-аминогруппой и α-аминогруппой остатка лизина и затем присоединяться к иммуногенному пептиду по настоящему изобретению. Содержащие липиды пептиды можно прямо вводить путем их включения в мицеллу или частичку или их инкапсулирования в липосому или их эмульгирования в адъюванте. Другим примером примирования липидом является примирование липопротеидом E. coli, таким как трипальмитоил-S-глицерил-цистеинилсерил-серин (P3CSS), ковалентно связанным с подходящим пептидом (Deres K., et al., (1989) Nature 342:561-4).
Иммуногенные пептиды по настоящему изобретению могут быть экспрессированы с помощью вирусных векторов или бактериальных векторов. Примеры подходящих экспрессионных векторов включают авирулентные вирусы-хозяева, такие как вирус коровьей оспы и птичьей оспы. Например, в качестве вектора для экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей пептид, может быть использован вирус коровьей оспы. Путем введения рекомбинантного вируса коровьей оспы в клетки-хозяева осуществляется экспрессия иммуногенных пептидов, вызывающих иммунный ответ. Метод иммунизации с использованием векторов коровьей оспы описан, например, в патенте США No. 4722848. Можно также использовать бациллу Кальметта-Герина (BCG). Векторы BCG описаны в Stover CK, et al., (1991) Nature 31:456-60. В данной области техники известно множество других векторов, пригодных для терапевтического введения или иммунизации, включая аденовирусные векторы и аденоассоциированные вирусные векторы, ретровирусные векторы, векторы бациллы тифа (Salmonella typhi) и детоксифицированные токсиновые векторы сибирской язвы. См., например, Shata MT, et al., (2000) Mol. Med. Today 6:66-71; Shedlock DJ and Weiner DB., et al., (2000) J. Leukoc. Biol. 68:793-806; и Hipp JD, et al., (2000) In Vivo 14:571-85.
Киллерные T-клетки можно эффективно индуцировать в организме больного путем добавления in vitro антигенного пептида к клеткам, выделенным из больного, или клеткам от другого индивидуума, имеющим некоторые общие аллели HLA (аллогенным клеткам) и презентирующим антиген, с последующим введением клеток больному в сосуды, местно в опухоль или тому подобное. Альтернативно, после индукции in vitro киллерных T-клеток добавлением пептида к лимфоцитам периферической крови больного и их культивирования in vitro клетки можно вводить больному в сосуды, местно в опухоль или тому подобное. Такое лечение переносом клеток уже проводилось в качестве противораковой терапии и является хорошо известным для специалистов в данной области техники методом.
Тип рака в настоящем изобретении не является особо ограниченным, и конкретные примеры включают рак легких, холангиоцеллюлярную карциному, рак мочевого пузыря, карциному клеток почки, рак простаты, хронический миелогенный лейкоз, злокачественную лимфому, рак шейки матки, остеосаркому, рак молочной железы, саркому мягких тканей, рак прямой кишки и т.д. Примеры рака, к которому применимо настоящее изобретение, включают рак легких.
(3) Антитела по настоящему изобретению
Настоящее изобретение также относится к антителам, которые узнают упомянутый выше полноразмерный пептид по настоящему изобретению или его часть в качестве эпитопа (антигена), и относится к киллерным T-клеткам, которые индуцируются путем стимуляции in vitro белками или пептидами. В целом, киллерные T-клетки проявляют большую противоопухолевую активность по сравнению с антителами.
Более того, подобно пептидам по настоящему изобретению, антитела по настоящему изобретению пригодны в качестве профилактических и/или терапевтических средств против типов рака, экспрессирующих CDCA1, поскольку они могут ингибировать активность ракового антигена CDCA1. При практическом использовании пептиды или антитела по настоящему изобретению можно вводить в том виде, в котором они находятся, или путем инъекции с фармацевтически приемлемым носителем и/или разбавителем вместе с адъювантом, если это необходимо. Альтернативно, их можно вводить путем чрескожного всасывания через мембраны слизистой с помощью метода распыления или тому подобного. Конкретнее, в настоящем описании примером носителей является человеческий сывороточный альбумин; и PBS, дистиллированная вода и тому подобное служат примерами разбавителей.
Антителами по настоящему изобретению могут быть поликлональные антитела или моноклональные антитела и их можно получать с помощью методов, известных специалистам в данной области техники.
Например, поликлональные антитела могут быть получены путем иммунизации видов млекопитающих или птиц пептидом по настоящему изобретению в качестве антигена, отбора крови от видов млекопитающих или птиц и отделения и очистки антител из собранной крови. Например, можно иммунизировать млекопитающих, таких как мышь, хомячок, морская свинка, цыпленок, крыса, кролик, собака, коза, овца и корова, или виды птиц. Методы иммунизации известны специалистам в данной области техники, и антиген можно вводить, например, два или три раза с интервалом от 7 до 30 дней. Доза может составлять, например, приблизительно от 0,05 мг до 2 мг антигена на введение. Путь введения не является особо ограниченным и может быть подходящим образом выбран из подкожного введения, внутрикожного введения, внутрибрюшинного введения, внутривенного введения, внутримышечного введения и тому подобного. Более того, антиген можно использовать после растворения в подходящем буфере, например, буфере, содержащем традиционный адъювант, такой как полный адъювант Фрейнда и гидроксид алюминия.
Иммунизированные виды млекопитающих или птиц можно растить в течение определенного периода времени, и после увеличения титра антитела их можно дополнительно иммунизировать, например, от 100 мкг до 1000 мкг антигена. Кровь у иммунизированных видов млекопитающих или птиц можно отбирать на протяжении от одного до двух месяцев после последнего введения, и кровь может быть отделена и очищена традиционными методами, такими как центрифугирование, осаждение сульфатом аммония или полиэтиленгликолем, хроматография, такая как хроматография гельфильтрацией, ионообменная хроматография, аффинная хроматография и тому подобное, для получения поликлональных антител, которые узнают пептиды по настоящему изобретению, в виде поликлональной антисыворотки.
С другой стороны, могут быть получены моноклональные антитела путем получения гибридом. Например, гибридомы могут быть получены слиянием клеток, продуцирующих антитело, с клеточными линиями миеломы. Гибридомы, которые продуцируют моноклональные антитела по настоящему изобретению, могут быть получены методами слияния клеток, такими, как указанные ниже.
В качестве продуцирующих антитело клеток используют клетки селезенки, клетки лимфатического узла, B-лимфоциты и тому подобное от иммунизированных животных. В качестве антигенов используют пептиды по настоящему изобретению. В качестве иммунизируемых животных можно использовать таких животных, как мышь и крыса, а введение антигенов этим животным производят традиционными методами. Например, животных иммунизируют введением суспензии или эмульсии пептида по настоящему изобретению, являющегося антигеном, с адъювантом, таким как полный адъювант Фрейнда и неполный адъювант Фрейнда, животным несколько раз внутривенно, подкожно, внутрикожно, внутрибрюшинно или тому подобное. Продуцирующие антитело клетки, такие как клетки селезенки, получают от иммунизированных животных, и они могут быть слиты с миеломными клетками с помощью известных методов (G. Kohler et al., Nature, 256, 495 (1975)) с образованием гибридом.
В случае мышей примеры линий клеток миелом, используемых для слияния клеток, включают, например, линии P3X63Ag8, P3U1, Sp2/0 и т.д. Для слияния клеток используют стимулирующее слияние средство, такое как полиэтиленгликоль и вирус Сендай, а для селекции гибридом с помощью традиционного метода после слияния клеток используют среду гипоксантин/аминоптерин/тимидин (HAT). Гибридомы, полученные слиянием клеток, клонируют методом серийных разведений или тому подобное. При необходимости клеточные линии, продуцирующие моноклональные антитела, которые специфически узнают пептиды по настоящему изобретению, могут быть получены с использованием пептидов по настоящему изобретению для скрининга с помощью иммуноферментного метода.
В дополнение к указанным выше методам иммунизированные клетки можно модулировать стимулирующими лимфоцитами человека, такими как инфицированные вирусом EB лимфоциты, in vitro с использованием пептидов по настоящему изобретению, клеток, экспрессирующих пептиды, или их лизатов. Человеческие антитела, которые связывают пептиды по настоящему изобретению, могут быть получены слиянием иммунизированных лимфоцитов с клетками костного мозга от человека, такими как U266 (патентная заявка Японии, публикация Kokai No. (JP-A) S63-17688 (нерассмотренная опубликованная Японская патентная заявка)).
Для получения представляющих интерес моноклональных антител из полученных таким образом гибридом гибридомы можно культивировать с помощью традиционных методов культивирования или методов образования асцитов, и моноклональные антитела могут быть очищены из культурального супернатанта или асцитов. Очистка моноклональных антител из культуральных супернатантов или асцитов может быть осуществлена традиционными методами. Например, могут быть подходящим образом объединены и использованы фракционирование сульфатом аммония, гель-фильтрация, ионообменная хроматография, аффинная хроматография и тому подобное.
Трансгенных животных, содержащих группу генов человеческих антител, можно иммунизировать с использованием пептидов по настоящему изобретению, экспрессирующих пептиды клеток или их лизатов. Продуцирующие антитело клетки можно собрать из иммунизированных трансгенных животных и слить с описанными выше миеломными клеточными линиями для получения гибридом. Затем из гибридом можно получить интересующие моноклональные антитела (WO92/03918; WO94/02602; WO94/25585; WO94/33735; WO96/34096).
Более того, продуцирующим антитело иммунным клеткам, таким как иммунизированные лимфоциты, может быть придано бессмертие с помощью онкогенов, и их можно использовать для получения моноклональных антител.
Полученные таким образом моноклональные антитела можно также модулировать с помощью методов генной манипуляции (Borrbaeck and Larrick, (1990) Therapeutic Monoclonal Antibodies). Например, рекомбинантные антитела могут быть получены клонированием ДНК, кодирующей антитело из продуцирующих антитело клеток, таких как гибридомы и иммунизированные лимфоциты, ее вставкой в подходящий вектор и его введением в клетки-хозяева.
Антителами по настоящему изобретению могут быть фрагменты антител или модифицированные антитела, если они связывают пептиды по настоящему изобретению. Фрагментами антител могут быть Fab, F(ab')2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv), где фрагменты Fv, берущие начало от H и L цепей, соединены друг с другом с помощью походящего линкера (Huston et al., (1998) Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83). Конкретнее, фрагменты антител могут быть получены обработкой антител ферментом, таким как папаин и пепсин (Co et al., (1994) J Immunol 152:2968-76; Better and Horwitz, (1989) Methods Enzymol 178: 476-96; Pluckthun and Skerra, (1989) Methods Emzymol 178:497-515; Lamoyi (1986) Methods Enzymol 121:652-63; Rousseaux et al., (1986) Methods Enzymol 121:663-9; Bird and Walker, (1991) Trends Biotech 9:132-7).
Антитела по настоящему изобретению включают модифицированные антитела, полученные путем присоединения антител к различным молекулам, таким как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Антитела могут быть модифицированы традиционными методами химической модификации, известными в данной области техники.
Антитела по настоящему изобретению включают химерные антитела, включающие вариабельную область, берущую начало от антитела, отличного от человеческого, и константную область из антитела человека, и гуманизированные антитела, включающие область, определяющую комплементарность (CDR), берущую начало от антитела, отличного от человеческого, каркасную область (FR) из человеческого антитела и константную область из антитела человека. Такие антитела могут быть получены традиционными методами, известными в данной области техники. Гуманизированные антитела могут быть получены заменой области последовательности CDR антитела человека областью CDR грызуна, обладающей желаемой связывающей активностью (Verhoeyen et al., (1988) Science 239:1534-6). Соответственно, по сравнению с химерными антителами гуманизированные антитела представляют собой антитела, в которых меньшая область человеческого антитела заменена соответствующей областью с происхождением, отличным от человеческого.
Может быть также получено полностью человеческое антитело, содержащее человеческую вариабельную область в дополнение к человеческим каркасным и константным областям. Например, в методе in vitro может быть проведен скрининг с помощью рекомбинантной библиотеки бактериофагов, в которой представлены фрагменты человеческих антител (Hoogenboom and Winter, (1992) J Mol Biol 227:381-8). Сходным образом человеческие антитела могут быть получены введением иммуноглобулиновых локусов человека трансгенным животным, у которых эндогенные иммуноглобулиновые гены были частично или полностью инактивированы (патенты США No. 6150584, 5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425 и 5661016).
Полученные как описано выше антитела могут быть очищены до гомогенности традиционными для данной области техники методами. Например, могут быть использованы общие методы выделения и очистки белков. Антитела могут быть выделены и очищены с помощью сочетания колоночной хроматографии, такой как аффинная хроматография, фильтрации, ультрафильтрации, высаливания, диализа, электрофореза в полиакриламидном геле с SDS, электрофокусирования и тому подобного; однако методы выделения и очистки этим не ограничиваются (Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, (1988) Cold Spring Harbor Laboratory). В качестве аффинных колонок могут быть использованы колонки протеина A и колонки протеина G. Примеры колонок протеина A включают HyperD, POROS, и сефарозу F.F (Pharmacia).
Примеры хроматографии, отличной от аффинной хроматографии, включают ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гельфильтрацию, хроматографию с обращенной фазой, адсорбционную хроматографию и тому подобное (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. et al.). Для хроматографии может быть также использована жидкостная хроматография, такая как ВЭЖХ и FPLC.
Сродство связывания антигена антителами по настоящему изобретению может быть измерено с помощью, например, измерения поглощения, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), иммуноферментного анализа (EIA), радиоиммунологического анализа (RIA) и иммунофлуоресцентного анализа; однако, методы этим не ограничиваются. В ELISA антитела по настоящему изобретению иммобилизуют на планшете и добавляют пептиды по настоящему изобретению, после чего добавляют образец, содержащий культуральный супернатант продуцирующих антитело клеток или очищенные антитела. Затем добавляют вторые антитела, которые содержат выявляемую метку и узнают антитело, сродство которого к связываемому антигену измеряют. После промывки планшета добавляют реагенты для выявления метки второго антитела и измеряют поглощение или тому подобное. Например, в качестве метки для второго антитела могут быть использованы ферменты, такие как щелочная фосфатаза, а в качестве реагентов для выявления могут быть использованы субстраты ферментов, такие как п-нитрофенилфосфат. Для оценки активности антител может быть также использован BIAcore (Pharmacia).
Антитела по настоящему изобретению могут определять пептиды по настоящему изобретению, содержащиеся в образцах. Конкретно, наличие пептидов по настоящему изобретению в раковых тканях может быть подтверждено, например, введением в контакт биоптатов раковых тканей с антителами по настоящему изобретению.
Перед использованием пептидов по настоящему изобретению в терапии для лечения и/или профилактики рака возможно предсказание перспективности действия для тестируемого индивидуума до начала лечения путем оценки экспрессии пептидов по настоящему изобретению в раковой ткани, подлежащей лечению с помощью антител по настоящему изобретению.
Более того, поскольку антитела по настоящему изобретению узнают пептидные фрагменты CDCA1, экспрессия которого усилена в различных раковых клетках, ожидается, что их использование применимо не только для диагностики, но и для лечения.
(4) Хелперные T-клетки, киллерные T-клетки или включающие их популяции иммуноцитов
Настоящее изобретение также относится к хелперным T-клеткам и киллерным T-клеткам, индуцированным путем стимуляции in vitro с помощью пептидов по настоящему изобретению, а также к популяциям иммуноцитов, включающим хелперные T-клетки и киллерные T-клетки. Например, T-клетки с активированным ответом на опухоль индуцируются, когда лимфоциты периферической крови или инфильтрованные в опухоль лимфоциты стимулируют in vitro с помощью пептидов по настоящему изобретению, и эти активированные T-клетки могут быть эффективно использованы для адоптивной иммунотерапии. Альтернативно, дендритные клетки, которые являются эффективными антигенпрезентирующими клетками, могут быть пульсированы пептидами по настоящему изобретению или генетически трансформированы для экспрессии пептидов, и противоопухолевый иммунный ответ может быть индуцирован стимуляцией T-клеток in vivo или in vitro с использованием дендритных клеток.
Хелперные T-клетки, киллерные T-клетки или включающие их популяции иммуноцитов могут быть предпочтительно индуцированы стимуляцией in vitro с помощью пептидов по настоящему изобретению и адъюванта. Используемые в настоящем описании адъюванты включают факторы роста клеток и цитокины.
Опухоли могут быть подавлены и рак может быть предотвращен и/или излечен путем трансфузии полученных таким образом хелперных T-клеток, киллерных T-клеток или включающих их популяций иммуноцитов больному раком внутрь сосудов, местно в опухоль или тому подобного.
Хелперные T-клетки, киллерные T-клетки или включающие их популяции иммуноцитов, которые способны подавлять опухоли, как описано выше, могут быть получены с помощью пептидов по настоящему изобретению. Таким образом, в настоящем изобретении предлагаются среды клеточных культур, содержащие пептиды по настоящему изобретению. Хелперные T-клетки, киллерные T-клетки или включающие их популяции иммуноцитов, способные подавлять опухоли, могут быть получены с помощью сред клеточных культур. Более того, в настоящем изобретении предлагается набор для клеточной культуры, включающий упомянутую выше среду для клеточной культуры и сосуд для клеточной культуры, для получения хелперных T-клеток, киллерных T-клеток или включающих их популяций иммуноцитов.
(5) Антигенпрезентирующие экзосомы
В настоящем изобретении дополнительно предлагается эндоцитозная везикула, называемая «экзосомой», которая презентирует на своей поверхности комплекс, образованный из пептида по настоящему изобретению и антигена HLA. Экзосомы могут быть получены, например, с помощью методов, подробно описанных в Японских переводах патентных заявок Японии, публикации Kokai No. (JP-A) H11-510507 (нерассмотренной публикации национальной фазы, соответствующей отличной от Японской международной публикации) и JP-A (Kohyo) 2000-512161. Предпочтительно экзосомы получают с использованием антигенпрезентирующих клеток, полученных от индивидуума, подлежащего лечению и/или профилактике. Экзосомы по настоящему изобретению можно инъецировать в качестве противораковой вакцины способом, сходным с введением пептидов по настоящему изобретению.
Антигенный тип HLA, используемый в настоящем изобретении, должен совпадать с антигенным типом HLA индивидуума, нуждающегося в лечении и/или профилактике. Например, антигенный тип HLA представляет собой HLA-A02 и, предпочтительно, HLA-A2 (HLA-A*0201). “HLA-A2” означает белок, тогда как “(HLA-A*0201)” означает ген, соответствующий сегменту белка, из-за отсутствия в настоящее время терминологии для экспрессии сегментов белка.
(6) Методы индукции антигенпрезентирующих клеток и киллерных T-клеток
В настоящем изобретении предлагаются способы индукции антигенпрезентирующих клеток с использованием одного или более пептидов по настоящему изобретению. Антигенпрезентирующие клетки могут быть индуцированы путем введения в контакт дендритных клеток, индуцированных из моноцитов периферической крови, с одним или более пептидами по настоящему изобретению для стимуляции дендритных клеток. Когда пептиды по настоящему изобретению вводят индивидууму, антигенпрезентирующие клетки, презентирующие пептиды по настоящему изобретению на своей поверхности, могут быть индуцированы в организме индивидуума. Альтернативно, может быть использован метод ex vivo, в котором антигенпрезентирующие клетки пульсируют пептидами по настоящему изобретению, после чего клетки вводят индивидууму в качестве вакцины. Например, введение ex vivo может включать стадии:
(1) сбора антигенпрезентирующих клеток от индивидуума; и
(2) введения в контакт антигенпрезентирующих клеток со стадии (1) с пептидом по настоящему изобретению (пульсирования антигенпрезентирующих клеток со стадии (1) пептидом по настоящему изобретению).
Антигенпрезентирующие клетки, полученные на стадии (2), можно вводить индивидууму в качестве вакцины.
В настоящем изобретении также предлагаются способы индукции антигенпрезентирующих клеток, которые проявляют высокий уровень индуцирующей активности киллерных T-клеток. Методы включают стадию трансфекции антигенпрезентирующих клеток in vitro геном, включающим полинуклеотид, кодирующий один или более пептидов по настоящему изобретению. Предназначенный для трансфекции ген может представлять собой ДНК или РНК. Для трансфекции могут быть соответствующим образом использованы различные методы, традиционно применяемые в данной области техники, такие как липофекция, электропорация и метод фосфата кальция, но этим методы не ограничиваются. Конкретнее, трансфекцию можно произвести, как описано в Reeves ME, et al., (1996) Cancer Res., 56:5672-7; Butterfield LH, et al., (1998) J. Immunol., 161:5607-13; Boczkowski D, et al., (1996) J Exp. Med., 184:465-72; и WO99/08521. Когда гены трансфицируют в антигенпрезентирующие клетки, они транскрибируются и транслируются в клетках. Полученные белки затем подвергаются процессингу через пути MHC класса I и класса II и презентируются на поверхности антигенпрезентирующих клеток в виде частичных пептидов посредством пути презентации антигена.
В настоящем изобретении также предлагаются способы индукции киллерных T-клеток с использованием одного или более пептидов по настоящему изобретению. Путем введения одного или более пептидов по настоящему изобретению индивидууму киллерные T-клетки могут быть индуцированы в организме индивидуума, что тем самым усиливает иммунную систему против раковых клеток, презентирующих CDCA1 в опухолевых тканях. Альтернативно, активированные киллерные T-клетки могут быть индуцированы путем введения в контакт антигенпрезентирующих клеток и CD8-позитивных клеток от индивидуума с одним или более пептидами по настоящему изобретению in vitro и путем введения в контакт мононуклеарных лейкоцитов периферической крови с антигенпрезентирующими клетками in vitro для стимуляции клеток. В терапевтических методах ex vivo иммунная система, которая направлена против раковых клеток, презентирующих CDCA1 в опухолевых тканях у индивидуума, может быть усилена возвращением активированных киллерных T-клеток в организм индивидуума. Например, методы включают стадии:
(1) сбора антигенпрезентирующих клеток от индивидуума;
(2) введения в контакт антигенпрезентирующих клеток со стадии (1) с пептидом по настоящему изобретению (пульсирования антигенпрезентирующих клеток со стадии (1) пептидом по настоящему изобретению);
(3) смешивания и совместного культивирования антигенпрезентирующих клеток со стадии (2) с CD8+ T-клетками для индукции цитотоксических T-клеток; и
(4) сбора CD8+ T-клеток из совместной культуры стадии (3).
CD8+ T-клетки с цитотоксической активностью, полученные на стадии (4), могут быть введены индивидууму в качестве вакцины.
В настоящем изобретении также предлагаются выделенные киллерные T-клетки, индуцированные с использованием одного или более пептидов по настоящему изобретению. Предпочтительно киллерные T-клетки, индуцированные методом по настоящему изобретению, получают от индивидуума, который подвергается лечению и/или профилактике. Клетки можно вводить в сочетании с другими средствами, содержащими антигенпрезентирующие клетки или экзосомы, презентирующие один или более пептидов по настоящему изобретению. Полученные киллерные T-клетки специфичны в отношении клеток-мишеней, презентирующих тот же пептид, который использовался для индукции. Клетками-мишенями являются клетки, эндогенно экспрессирующие CDCA1, или клетки, трансфицированные геном CDCA1. Путем стимуляции пептидом по настоящему изобретению клетки, презентирующие пептид по настоящему изобретению на своей поверхности, такие как раковые клетки из рака легких, холангиоцеллюлярной карциномы, рака мочевого пузыря, карциномы клеток почки, рака простаты, хронического миелогенного лейкоза, злокачественной лимфомы, рака шейки матки, остеосаркомы, рака молочной железы, саркомы мягких тканей, рака прямой кишки и тому подобного, могут стать мишенью для атаки.
(7) Рецепторы T-клеток (TCR)
В настоящем изобретении дополнительно предлагаются нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, которые формируют субъединицы рецепторов T-клеток (TCR), узнающих CDCA1-1 и CDCA1-4, и методы их использования. TCR содержит, по меньшей мере, семь трансмембранных белков. Связанный дисульфидной связью (α, β) гетеродимер формирует клонотипичную узнающую антиген единицу, тогда как инвариантные цепи CD3, которые состоят из цепей ε, γ, δ, ζ и η, сопрягают связывание лиганда с путем сигнализации, что тем самым вызывает активацию T-клеток и клеточный иммунный ответ. Субъединицы α и β, которые отвечают за узнавание антигена, как упомянуто выше, необходимы T-клеткам для приобретения специфичности в узнавании конкретной мишени. Следовательно, для синтеза TCR, которые специфически узнают пептиды по настоящему изобретению, последовательности нуклеиновых кислот α и β, являющихся субъединицами TCR, которые берут начало от CTL, индуцируемых с помощью пептидов по настоящему изобретению, могут быть идентифицированы с помощью методов, известных специалистам в данной области техники (WO2007/032255; и Morgan et al., J. Immunol., 171, 3288 (2003)). Поскольку TCR, образуемые из идентифицированных субъединиц TCR, могут связываться с презентирующими пептид CDCA1 клетками-мишенями, TCR полезны при их введении в клетки, обладающие вызывающим гибель клеток действием.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие субъединицы TCR, могут быть включены в подходящие векторы (например, ретровирусные векторы). Векторы могут быть получены методами, известными специалистам в данной области техники. Векторы, включающие субъединицы TCR, могут быть использованы для введения в T-клетки. В частности, путем трансформации T-клеток от больного могут быть получены T-клетки (CTL), которые специфически узнают и атакуют экспрессирующие CDCA1 клетки. Полученные таким образом CTL с введенным TCR можно культивировать и выращивать с помощью общепринятых методов (Kawakami et al., J. Immunol., 142, 3452-3461 (1989)). CTL, полученные упомянутым выше методом, можно использовать для клеточной иммунотерапии.
В настоящем изобретении также предлагаются антигенпрезентирующие клетки, презентирующие комплекс, образованный из антигена HLA и одного или более пептидов по настоящему изобретению. Антигенпрезентирующие клетки, с которыми контактируют один или более пептидов по настоящему изобретению или нуклеотиды, кодирующие такие пептиды, предпочтительно получают от индивидуума, подлежащего лечению и/или профилактике. Пептиды по настоящему изобретению, антигенпрезентирующие клетки, презентирующие пептиды, экзосомы или активированные киллерные T-клетки можно вводить в качестве вакцины в сочетании с другими лекарствами.
Все ссылки на предшествующий уровень техники, цитированные в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок.
Настоящее изобретение будет дополнительно описано со ссылкой на примеры ниже; однако их не следует рассматривать ограничивающие его.
Примеры
[Пример 1]
(1) Отбор репертуара пептидов CDCA1, которые проявляют сродство к HLA-A2
Аминокислотную последовательность CDCA1 человека исследовали с помощью системы BIMAS, и был отобран 41 тип пептидов в порядке снижения оцененного сродства связывания с HLA-A2 (таблица 1).
Подчеркнуты выявленные в настоящем изобретении ограниченные HLA-A2 эпитопы киллерных T-клеток.
[Пример 2]
Во-первых, из клеток костного мозга трансгенных HLA-A2 мышей индуцировали дендритные клетки (DC) с помощью ранее описанного метода (Komori H et al. Clinical Cancer Research 12: 2689-2697, 2006). Полученные таким образом BM-DC пульсировали пептидом CDCA1 (10 мкМ) и затем вводили внутрибрюшинно трансгенным HLA-A2 мышам в количестве 5×105 клеток на мышь. Мышей иммунизировали дважды с однонедельным интервалом с использованием того же метода введения, и клетки их селезенки собирали и использовали для выявления киллерных T-клеток. Для тщательной проверки индукции киллерных T-клеток, берущих начало от CD8+ T-клеток, CD4+ T-клетки удаляли из клеток селезенки с помощью шариков MACS после выделения селезенки, и использовали оставшиеся клетки.
На фиг. 1 показан протокол определения пептидов CDCA1, узнаваемых ограниченными HLA-A2 киллерными T-клетками у трансгенных HLA-A2 мышей. День, когда были собраны клетки селезенки от иммунизированных мышей, обозначен как «день 0».
День -21: (1) Индукцию дендритных клеток из костного мозга (в настоящем описании ниже обозначаемых как BM-DC) инициировали добавлением GM-CSF к клетками костного мозга HLA-A2 трансгенных мышей.
День -14: (2) К индуцированным BM-DC добавляли смесь четырех типов пептидов CDCA1, и через два часа их вводили внутрибрюшинно в количестве 5×105 клеток на мышь.
(1) и (2) повторяли дважды с однонедельным интервалом.
День 0: Клетки селезенки от иммунизированных HLA-A2 трансгенных мышей и культивировали совместно с BM-DC, которые ранее были инкубированы с пептидами CDCA1 в течение двух часов. Их затем культивировали в течение шести дней.
День 6: Для выявления киллерных T-клеток, которые специфически узнают пептиды CDCA1, T-клетки, продуцирующие интерферон гамма после антигенной стимуляции, количественно определяли с помощью анализа ELISPOT. В качестве клеток-мишеней использовали BM-DC, пульсированные каждым отдельным пептидом CDCA1, и BM-DC без пульсирования.
Оценка активности специфичных в отношении CDCA1 киллерных клеток с помощью анализа ELISPOT:
С помощью анализа ELISPOT было определено, действительно ли среди индуцированных киллерных T-клеток имеются киллерные T-клетки, которые специфически реагируют на CDCA1 продукцией IFN-γ. IFN-γ определяли с помощью набора ELISPOT для IFN-γ мыши (BD Biosciences). Когда киллерные T-клетки (эффекторы) отвечают на стимулирующие клетки (мишени) и продуцируют IFN-γ, они выявляются в виде красных точек. В качестве клеток-мишеней использовали HLA-A2 позитивные клетки T2A2, которые не экспрессируют CDCA1, и клетки T2A2, пульсированные пептидом CDCA1. Клетки T2A2 клеточной линии, полученной введением гена HLA-A2 в мышиную клеточную линию T2, дефектную по экспрессии гена TAP, были получены от RIKEN Cell Bank. Из-за недостаточности TAP в этих клетках комплексы, образованные между молекулами HLA-A2 и экзогенно добавленными пептидами, экспрессируются на клеточной поверхности только тогда, когда пептиды обладают способностью связываться с молекулами HLA-A2. Сначала планшеты ELISPOT (BD Biosciences) покрывали антителом против IFN-γ мыши в течение 18 часов. Затем планшеты блокировали 10% FCS/RPMI в течение двух часов. Эффекторные клетки (100 мкл/лунку) и клетки-мишени (100 мкл/лунку) смешивали и культивировали в течение 22 часов при 37°С. Эксперимент проводили при соотношении эффектор/мишень (отношение E/T) 5:1. Планшеты затем промывали стерилизованной водой и вводили во взаимодействие с биотинилированным антителом против IFN-γ мыши в течение двух часов и дополнительное взаимодействие со стрептавидин-HRP в течение одного часа. Позитивные в отношении IFN-γ точки выявляли с помощью раствора субстрата. Для подсчета точек использовали программу автоматизированного анализа от MINERVA TECH. Результаты для пептидов с номерами с 1 по 20 показаны на фиг. 1B. По данным сходных экспериментов специфичный в отношении CDCA1 иммунный ответ киллерных T-клеток наблюдался у киллерных T-клеток, индуцированных пептидом CDCA165-73 (No. 1) (SEQ ID NO:1) или CDCA1351-359 (No. 4) (SEQ ID NO:2) из 41 пептида (фиг. 2).
Анализ результатов с киллерными T-клетками, индуцированными пептидом CDCA165-73 (No. 1) (SEQ ID NO:1) или CDCA1351-359 (No. 4) (SEQ ID NO:2), показаны на фиг. 2A и 2B, соответственно.
[Пример 3]
Больные, образцы крови и клеточные линии:
Образцы крови от больных NSCLC были получены во время обычных диагностических обследований по информированному согласию. Негативная в отношении CDCA1 клеточная линия рака ободочной кишки человека COLO201 была предоставлена Health Science Research Resources Bank. Экспрессия HLA-A2 в этих образцах была подтверждена проточной цитометрией с использованием моноклонального антитела BB7.2 против HLA-A2 (One Lambda Inc., Canoga Park, CA).
Лентивирусный перенос генов:
Опосредованный лентивирусным вектором перенос генов проводили с использованием метода, описанного в Tahara-Hanaoka S, et al. Exp. Hematol. 2002;30:11-17. Вкратце, 17 мкг несущих кДНК CDCA1 самоинактивирующих векторов CSII-CMV-RfA и CSIIEF-RfA (Miyoshi H, et al. J. Virol. 1998;72:8150-8157) и 10 мкг pCMV-VSV-G-RSV-Rev и pHIVgp трансфицировали в клетки 293T в 10-см культуральной чашке с помощью липофектамина 2000 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA). Через 60 часов культуральную среду собирали, и вирусные частицы осаждали ультрацентрифугированием (50000×g, два часа). Осадок суспендировали в 50 мкл раствора RPMI 1640, и 10 мкл вирусной суспензии добавляли в каждую лунку круглодонного 96-луночного планшета, содержащего 5×104 клеток COLO201 на лунку. Экспрессия трансфицированного гена CDCA1 была подтверждена с помощью иммуноблоттинга.
Индукция реактивных в отношении CDCA1 человеческих CTL:
В качестве антигенпрезентирующих клеток для индукции CTL в ответ на презентируемые HLA пептиды использовали DC клетки, берущие начало от моноцитов. DC получали с помощью ранее сообщавшихся методов in vitro (Suda T, et al. Cancer Sci. 2007; Nakahara S, et al. Cancer Res. 2003;63:4112-8). Вкратце, моноциты периферической крови (PBMC), выделенные из позитивных по HLA-A*0201 здоровых добровольцев и больных NSCLC с помощью раствора Ficoll-Paque (GE Healthcare UK, Ltd., Buckinghamshire, UK), подвергали скринингу на CD8 позитивные CD14 позитивные популяции с использованием MicroBeads (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Германия). Для получения DC позитивную по CD14 популяцию культивировали в AIM-V (Invitrogen), содержащей 2% аутологичную плазму в присутствии 100 нг/мл колоние-стимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF) и 10 нг/мл интерлейкина (ИЛ)-4 (PeproTec Inc., New Jersey, USA). Через четыре дня после инкубации в чашку добавляли OK-432 для получения зрелых DC. Через пять дней после начала культивирования индуцированных цитокинами DC клетки пульсировали 20 мкг/мл связываемого HLA-A2 пептида в течение двух часов при 37°С в AMI-V в присутствии 4 мкг/мл β2-микроглобулина (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Эти пульсированные пептидом DC облучали (3500 cGy (сантигрей) (=3500 рад=35 дж/кг) и смешивали в соотношении 1:50 с аутологичными CD8-позитивными T-клетками, полученными из PBMC с помощью MicroBeads (Miltenyi Biotec) против CD8. Инкубацию проводили с использованием 48-луночных планшет, которые получали таким образом, чтобы они содержали в каждой лунке 0,5 мл AMI-V, содержащей 2% аутологичной плазмы, 1×104 пульсированных пептидом DC, 5×105 CD8-позитивных T-клеток и 10 нг/мл ИЛ-7 человека (Wako, Osaka, Япония). Через три дня после инкубации добавляли ИЛ-2 человека (PeproTec Inc.) в концентрации 20 МЕ/мл. Кроме того, T-клетки повторно стимулировали пульсированными пептидом аутологичными DC на 12 и 19 дни. DC получали соответствующим образом с помощью упомянутого выше метода. Через шесть дней после третьей стимуляции пептидом, на 25 день специфичный для антигена ответ CTL оценивали с помощью теста выделения хрома (Cr) и анализа IFN-γ с помощью ELISPOT.
Ответ CTL против клеток-мишеней:
CTL совместно культивировали при различных соотношениях эффекторные клетки/клетки-мишени при использовании клеток-мишеней, представленных разными линиями раковых клеток, и клеток T2, пульсированных и непульсированных пептидом, и производили анализ высвобождения 51Cr и анализ IFN-γ с помощью ELISPOT с использованием традиционных методов (Komori H, et al., Clin. Cancer Res. 2006;12:2689-2697; Makita M, et al. Clin. Cancer Res. 2002;8:2626-31; Yokomine K, et al. Cancer Sci. 2007;98:1930-5). Вкратце, клетки-мишени метили 3,7 кБк Na2 51Cr4 (Perkin Elmer Life Sciences) при 37ºС в течение одного часа в CO2-инкубаторе. Меченые клетки-мишени промывали три раза, и готовили пульсированные пептидом клетки путем инкубации клеток с 20 мкг/мл пептида в течение трех часов при 37ºС. Клетки-мишени смешивали с эффекторными клетками в конечном объеме 200 мкл в планшете для микротитрования с плоским дном, после чего инкубировали. Через шесть часов инкубации из каждой лунки отбирали 50 мкл супернатанта и измеряли радиоактивность с помощью гамма-счетчика. Специфическую цитотоксическую активность оценивали путем расчета скорости специфического высвобождения 51Cr в соответствии с имеющимся методом (Suda T, et al. Cancer Sci. 2007;98:1803-8). Анализ ELISPOT также проводили в соответствии с имеющимся методом (Komori H, et al. Clin. Cancer Res. 2006;12:2689-97).
Индукция реагирующих на CDCA1 CTL из PBMC, полученных от позитивных в отношении HLA-A2 здоровых доноров:
PBMC выделяли из позитивных в отношении HLA-A2 (A*0201) здоровых доноров. CD8+ T-клетки совместно культивировали с DC из моноцитов, пульсированными пептидом CDCA165-73 (No. 1) (SEQ ID NO:1) или CDCA1351-359 (No. 4) (SEQ ID NO:2), и CD8+ T-клетки стимулировали три раза в неделю (фиг. 3A).
Индуцированные CTL от раковых больных или здоровых доноров совместно культивировали с клетками-мишенями. В качестве мишени использовали T2 клетки, пульсированные пептидом CDCA165-73 (No. 1) (SEQ ID NO:1) или CDCA1351-359 (No. 4) (SEQ ID NO:2), и производили анализ ELISPOT и анализ высвобождения 51Cr. Как показано на фиг. 3B для донора-больного раком 1, продукция IFN-γ CTL была значительно выше, когда клетки стимулировали пульсированными пептидом CDCA165-73 (No. 1) (SEQ ID NO:1) T2 по сравнению с непульсированными T2. Индуцированные CTL от здорового донора 1 продуцировали большое количество IFN-γ в ответ на пульсированные пептидом CDCA1351-359 (No. 4) (SEQ ID NO:2) T2 клетки (более 300 точек на лунку) (фиг. 3C). Более того, CTL от донора-ракового больного 1 и здорового донора 1 проявили цитотоксическую активность против T2 клеток, пульсированных пептидом CDCA165-73 (No. 1) (SEQ ID NO:1) или CDCA1351-359 (No. 4) (SEQ ID NO:2) в тесте высвобождения 51Cr (фиг. 3D). Как показано на фиг. 3E, когда CTL стимулировали T2 клетками, пульсированными пептидом CDCA1 при различных концентрациях, CTL отвечали на пульсированные пептидом CDCA1 T2 клетки дозозависимо. По сравнению с ответом на непульсированные T2 клетки или на T2 клетки, пульсированные связываемым HLA-A2 пептидом из ВИЧ, CTL, как было обнаружено, продуцируют большее количество IFN-γ в ответ на T2 клетки, пульсированные пептидом в концентрации 0,2 мкг/мл или более. Упомянутые выше результаты показывают, что эти CTL обладают специфичной для пептида цитотоксичностью.
Для оценки специфичного в отношении CDCA1 иммунного ответа CTL в качестве клеток-мишеней использовали COLO201, в которые был введен CDCA1 (COLO201/CDCA1, CDCA1+, HLA-A2+; фиг. 4A). Как показано на фиг. 4B, CTL от здорового донора, стимулированные пептидом CDCA165-73 (No. 1) (SEQ ID NO:1), продуцировали большее количество IFN-γ в ответ на COLO201/CDCA1 по сравнению с трансфицированными пустым вектором COLO201, которые не экспрессируют CDCA1. CTL от здорового донора 2, стимулированные пептидом CDCA1351-359 (No. 4) (SEQ ID NO:2), также проявляли специфический иммунный ответ против COLO201/CDCA1 (фиг. 4C). Более того, эти CTL проявляли иммунный ответ против клеток PANC1 (CDCA1+, HLA-A2+), но не против клеток A549 (CDCA1+, HLA-2-) (фиг. 4D).
Для использования пептидов из CDCA1 в противораковой терапии важнее всего, чтобы отвечающие на пептид CDCA1 CTL были способны проявлять специфическую цитотоксичность в отношении опухолевых клеток, которые эндогенно экспрессируют CDCA1. Как показано на фиг. 4E для донора 1, больного раком, реагирующие на CDCA1 CTL, полученные с использованием пептида CDCA165-73 (No. 1) (SEQ ID NO:1), проявляли цитотоксическую активность против клеток PANC1 (CDCA1+, HLA-A2+), но не против клеток A549 (CDCA1+, HLA-2-) или клеток COLO201 (CDCA1-, HLA-A2+). Сходным образом, CTL от здорового донора 1, стимулированные пептидом CDCA1351-359 (No. 4) (SEQ ID NO:2), проявляли цитотоксическую активность против клеток PANC1 (CDCA1+, HLA-A2+), но не против клеток A549 (CDCA1+, HLA-2-). Эти результаты показывают, что эти пептиды подвергаются естественному процессингу в раковых клетках, презентируются на поверхности раковых клеток вместе с HLA-A2 и могут узнаваться CTL.
Для выявления ограниченных HLA-A2, специфичных в отношении CDCA1 CTL был приобретен тетрамер, связанный с пептидом CDCA1351-359 меченный PE HLA-A*0201 от Medical & Biological Laboratories Co. Ltd. (Nagoya, Япония). Как показано на фиг. 4G, среди CD8-позитивных клеток наблюдалась сильная корреляция между реагирующими на пептид CDCA1351-359 CTL и позитивными в отношении тетрамера CTL. Этот результат подтверждает, что среди CD8-позитивных T-клеток, использованных в этом исследовании, имелись ограниченные HLA-A2, специфичные в отношении CDCA1 CTL.
Обсуждение:
Идентификация пептидов, берущих начало от TAA, которые подвергаются естественному процессингу и презентируются на опухолевых клетках, важна для создания противораковой терапии на основе пептидов. CDCA1, который является новым антигеном рака/семенников, был идентифицирован с помощью анализа кДНК микроматрицами с использованием NSCLC и нормальных тканей. CDCA1 сильно экспрессируется в NSCLC и нормальных семенниках, но его мРНК или белок не экспрессировалась в других исследованных нормальных тканях. Поскольку семенник представляет собой ткань, изолированную от иммунной системы, отвечающие на CDCA1 CTL должны атаковать только NSCLC. Поэтому CDCA1 был выбран в качестве TAA для иммунотерапии больных NSCLC.
Для сведения к минимуму риска делеции, мутации или сниженной экспрессии TAA в качестве способов уклонения раковых клеток от иммунной защиты в результате терапии с индукцией иммунитета было желательно идентифицировать TAA, существенные для пролиферации или выживания NSCLC, которые могут быть использованы в качестве мишеней для иммунотерапии (Yoshitake Y, et al. Clin. Cancer Res. 2004;10:6437-48). Сообщалось, что CDCA1 действует, оказывая влияние на присоединение веретенообразных микротрубочек к кинетохорам, и играет важную роль в поддержании клеточного цикла (DeLuca JG, et al. J. Cell Biol. 2002;159:549-55). Более того, CDCA1 является компонентом комплекса цикла деления ядра (NDC), который играет важную роль в правильном расхождении хромосом во время митоза, и является чрезвычайно консервативным в видовом плане (DeLuca JG, et al. Curr. Biol. 2003;13:2103-9). CDCA1 существенен для кинетохорной локализации центромерного белка E (CENP-E) в клетках HeLa. Подавление экспрессии CDCA1 с помощью siRNA приводит к аномальному расхождению хромосом путем блокирования митоза и последующей индукции гибели клеток (Liu D, et al. J. Biol. Chem. 2007;282:21415-24). Этот аберрантный выход из митоза обладает признаками и апоптоза, и катастрофы (DeLuca JG, et al. J. Cell Biol. 2002;159:549-55). То есть, CDCA1 существенен для функционирования клетки и играет важную роль в пролиферации и выживании раковых клеток.
CDCA1 и белок 2, ассоциированный с кинетохором (KNTC2), являются членами эволюционно консервативного белкового комплекса центромеры (Hayama S, et al. Cancer Res 2006;66:10339-48). Иммуноокрашивание показывает, что их повышенная экспрессия связана с плохим прогнозом для больных NSCLC (Hayama S, et al. Cancer Res 2006;66:10339-48). Поэтому уровень экспрессии CDCA1 в тканях NSCLC является хорошим маркером для вынесения прогноза для больных после хирургической операции. Предполагается участие CDCA1 в прогрессии NSCLC. Таким образом, иммунотерапия, которая направлена против CDCA1, может быть эффективной для больных NSCLC с плохим прогнозом.
В настоящем изобретении с помощью трансгенных HLA-A2 мышей были идентифицированы два ограниченных HLA-A2 эпитопных пептида CDCA1, которые способствуют образованию ограниченных HLA-A2 мышиных CTL. Кроме того, из PBMC от здорового донора, стимулированных этими пептидами, можно было получить CTL человека, реагирующие на CDCA1. Эти линии CTL, специфичные в отношении пептидов CDCA1, уничтожали раковые клетки, которые экспрессируют CDCA1, ограниченным HLA-A2 образом (фиг. 4).
Пептиды из CDCA1 с предсказанным высоким связывающим сродством к молекуле HLA-A0201 были отобраны с помощью программы BIMAS; однако некоторые из аминокислотных последовательностей не являются консервативными для CDCA1 человека и мыши. Имеются различия в двух аминокислотах между последовательностями пептида CDCA165-73 (No. 1) человека и мыши (человек: YMMPVNSEV/мышь: YMMPMNIEV), и различие в одной аминокислоте в пептиде CDCA1351-359 (No. 4) (человек KLATAQFKI/мышь KLATARFKI). Однако в настоящем изобретении была подтверждена индукция реагирующих на упомянутые выше эпитопные пептиды CTL от здоровых доноров.
CTL, реагирующие на CDCA1, индуцировали из PBMC от здорового донора путем стимуляции in vitro с использованием пептидов CDCA1. CTL, индуцированные презентирующими пептид DC, проявляли цитотоксическую активность в отношении экспрессирующих CDCA1 раковых клеток ограниченным HLA-A2 образом. Индукция специфических в отношении CDCA1 CTL от здорового донора указывает на необходимость продолжения дальнейшего поиска TAA. Более того, в настоящее время предпринимаются попытки индукции реагирующих на CDCA1 CTL из PBMC, выделенных от больных NSCLC, мелкоклеточным раком, холангиоцеллюлярной карциномой, раком мочевого пузыря и раком клеток почки. Существует несколько опосредуемых клетками методов иммунотерапии рака, включая вакцинацию пептидом или белком (Rosenberg SA, et al. Nat Med 1998;4:321-7), иммунизацию дендритными клетками, пульсированными пептидами, белками или лизатами опухоли (Kugler A, et al. Nat Med 2000;6:332-6), и ex vivo адоптивный перенос с использованием специфичных в отношении опухоли линий CTL (Falkenburg JH, et al. Blood 1999;94:1201-8). Пептиды CDCA1, идентифицированные в настоящем изобретении, могли бы быть применены в этих методах иммунотерапии.
Если исследовательской медицине удастся показать безопасность и эффективность раковой иммунотерапии с использованием пептидов, идентифицированных в настоящем изобретении, которые презентируются киллерным T-клеткам посредством HLA-A2, то станет возможным клиническое применение в отношении европейцев. Более того, путем идентификации пептидов, презентируемых киллерным T-клеткам посредством HLA-A2, которые часто имеются не только у Японцев, но и у европейцев, можно было бы с высокой вероятностью создать противораковые иммунотерапевтические средства, применимые в отношении 30% Японских и европейских больных раком легких.
Промышленная применимость
HLA-A2 представляет собой аллель HLA класса I, имеющийся у приблизительно 30% населения Японии. Пептиды CDCA1 по настоящему изобретению могут индуцировать цитотоксические T-клетки человека, которые разрушают раковые клетки, экспрессирующие комплексы пептидов и молекул HLA-A2. Поэтому пептиды по настоящему изобретению могут быть применены для иммунотерапии рака легких, холангиоцеллюлярной карциномы, рака мочевого пузыря, карциномы клеток почки, рака простаты, хронического миелогенного лейкоза, злокачественной лимфомы, рака шейки матки, остеосаркомы, рака молочной железы, саркомы мягких тканей и рака ободочной кишки у позитивных по HLA-A2 больных. Таким образом, пептиды пригодны для создания терапевтических средств для подавления пролиферации и прогрессии этих типов рака.
Claims (21)
1. Пептид (А) или (В), представленный ниже:
(A) - пептид, характеризующийся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2,
где пептид проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки;
(B) - пептид, характеризующийся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, в котором одна или две аминокислоты заменены по меньшей мере одной заменой, выбранной из группы, состоящей из замены, в результате которой:
(a) вторая аминокислота с N-конца представляет собой лейцин или метионин, и
(b) С-концевая аминокислота представляет собой валин или лейцин,
где пептид проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки.
(A) - пептид, характеризующийся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2,
где пептид проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки;
(B) - пептид, характеризующийся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, в котором одна или две аминокислоты заменены по меньшей мере одной заменой, выбранной из группы, состоящей из замены, в результате которой:
(a) вторая аминокислота с N-конца представляет собой лейцин или метионин, и
(b) С-концевая аминокислота представляет собой валин или лейцин,
где пептид проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки.
2. Пептид по п.1, предназначенный для индукции иммунитета против рака.
3. Пептид по п.1, предназначенный для лечения и/или профилактики рака.
4. Иммуногенная композиция для индукции иммунитета против рака, экспрессирующего HLA-A2 и CDCA1, которая содержит один или более пептидов по п.1 в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый носитель.
5. Иммуногенная композиция для лечения и/или профилактики рака, экспрессирующего HLA-A2 и CDCA1, которая содержит один или более пептидов по п.1 в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый носитель.
6. Иммуногенная композиция для индукции антигенпрезентирующей клетки, которая проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки, где указанная композиция включает один или более пептидов по п.1 в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый носитель.
7. Иммуногенная композиция для индукции антигенпрезентирующей клетки, которая проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки, где указанная композиция содержит один или более полинуклеотидов, кодирующих пептиды по п.1, в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый носитель.
8. Иммуногенная композиция для индукции цитотоксической (киллерной) Т-клетки, содержащая один или более пептидов по п.1 в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый носитель.
9. Антитело против пептида по п.1, которое получают иммунизацией пептидом по п.1, и которое специфически узнает пептид по п.1.
10. Выделенная цитотоксическая (киллерная) Т-клетка, которая индуцируется посредством совместного культивирования CD8+Т-клеток с антигенпрезентирующими клетками, инкубированными с пептидом по п.1, и специфически проявляет цитотоксическую активность против клеток, презентирующих пептид по п.1.
11. Антигенпрезентирующая клетка, которая презентирует комплекс, включающий пептид по п.1 и HLA-A2.
12. Антигенпрезентирующая клетка по п.11, которая индуцируется композицией по п.6 или 7.
13. Экзосома, которая презентирует комплекс, включающий пептид по п.1 и HLA-A2.
14. Способ индукции антигенпрезентирующей клетки in vitro, которая проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки, который включает стадию контактирования антигенпрезентирующей клетки с пептидом по п.1.
15. Способ индукции антигенпрезентирующей клетки in vitro, которая проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки, который включает стадию введения полинуклеотида, кодирующего пептид по п.1, в антигенпрезентирующую клетку.
16. Способ индукции цитотоксической (киллерной) Т-клетки in vitro, который включает стадию контактирования Т-клетки с пептидом по п.1.
17. Способ индукции иммунитета против рака, экспрессирующего HLA-A2 и CDCA1, который включает стадию введения пептида по п.1 индивидууму.
18. Способ лечения и/или профилактики рака, экспрессирующего HLA-A2 и CDCA1, который включает стадию введения пептида по п.1 индивидууму.
19. Применение пептида по п.1 для получения средства для индукции иммунитета против рака.
20. Применение пептида по п.1 для получения средства для лечения и/или профилактики рака.
21. Способ индукции цитотоксической (киллерной) Т-клетки in vitro, который включает стадию совместного культивирования антигенпрезентирующей клетки, подвергшейся контактированию с пептидом по п.1, и CD8+ Т-клетки.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007214000 | 2007-08-20 | ||
JP2007-214000 | 2007-08-20 | ||
PCT/JP2008/060837 WO2009025117A1 (ja) | 2007-08-20 | 2008-06-13 | Cdca1ペプチド及びこれを含む薬剤 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013112616/10A Division RU2013112616A (ru) | 2007-08-20 | 2013-03-20 | Пептид cdca1 и включающее его фармацевтическое средство |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2010110564A RU2010110564A (ru) | 2011-09-27 |
RU2486195C2 true RU2486195C2 (ru) | 2013-06-27 |
Family
ID=40378024
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2010110564/10A RU2486195C2 (ru) | 2007-08-20 | 2008-06-13 | Пептид cdca1 и включающее его фармацевтическое средство |
RU2013112616/10A RU2013112616A (ru) | 2007-08-20 | 2013-03-20 | Пептид cdca1 и включающее его фармацевтическое средство |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013112616/10A RU2013112616A (ru) | 2007-08-20 | 2013-03-20 | Пептид cdca1 и включающее его фармацевтическое средство |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8598125B2 (ru) |
EP (1) | EP2186889B1 (ru) |
JP (1) | JP5493076B2 (ru) |
KR (1) | KR101610353B1 (ru) |
CN (1) | CN101835892B (ru) |
AU (1) | AU2008290061B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0815578B8 (ru) |
CA (1) | CA2696701C (ru) |
DK (1) | DK2186889T3 (ru) |
ES (1) | ES2537323T3 (ru) |
HK (1) | HK1141312A1 (ru) |
IL (1) | IL203898A (ru) |
MX (1) | MX2010002001A (ru) |
PL (1) | PL2186889T3 (ru) |
PT (1) | PT2186889E (ru) |
RU (2) | RU2486195C2 (ru) |
SG (1) | SG183698A1 (ru) |
TW (1) | TWI523660B (ru) |
WO (1) | WO2009025117A1 (ru) |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007013480A2 (en) | 2005-07-29 | 2007-02-01 | Oncotherapy Science, Inc. | Screening and therapeutic method for nsclc targeting cdca1-kntc2 complex |
BRPI0815578B8 (pt) | 2007-08-20 | 2021-05-25 | Oncotherapy Science Inc | peptídeos, agentes farmacêuticos compreendendo os mesmos, métodos in vitro para induzir uma célula apresentadora de antígeno, usos dos referidos peptídeos, e vacina |
MX2010002002A (es) * | 2007-08-20 | 2010-03-11 | Oncotherapy Science Inc | Peptido foxm1 y agente medicinal que lo contiene. |
TWI526219B (zh) * | 2008-06-19 | 2016-03-21 | 腫瘤療法 科學股份有限公司 | Cdca1抗原決定位胜肽及含此胜肽的疫苗 |
TWI469791B (zh) | 2009-02-18 | 2015-01-21 | Oncotherapy Science Inc | Foxm1胜肽以及含此胜肽之疫苗 |
US9115402B2 (en) * | 2010-05-14 | 2015-08-25 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods of identifying tumor specific neoantigens |
SG11201405578TA (en) | 2012-03-09 | 2014-11-27 | Oncotherapy Science Inc | Pharmaceutical composition containing peptide |
EP2872532A4 (en) * | 2012-07-10 | 2016-04-13 | Oncotherapy Science Inc | CDCA1-EPITOPPEPTIDES FOR TH1 CELLS AND VACCINES THEREWITH |
WO2015077717A1 (en) | 2013-11-25 | 2015-05-28 | The Broad Institute Inc. | Compositions and methods for diagnosing, evaluating and treating cancer by means of the dna methylation status |
WO2015085147A1 (en) | 2013-12-05 | 2015-06-11 | The Broad Institute Inc. | Polymorphic gene typing and somatic change detection using sequencing data |
JP7060324B2 (ja) | 2013-12-20 | 2022-04-26 | ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド | ネオ抗原ワクチンによる併用療法 |
SG11201700839SA (en) * | 2014-08-04 | 2017-03-30 | Oncotherapy Science Inc | Cdca1-derived peptide and vaccine containing same |
WO2016100975A1 (en) | 2014-12-19 | 2016-06-23 | Massachsetts Institute Ot Technology | Molecular biomarkers for cancer immunotherapy |
GB201505305D0 (en) | 2015-03-27 | 2015-05-13 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against various tumors |
IL254129B2 (en) | 2015-03-27 | 2023-10-01 | Immatics Biotechnologies Gmbh | New peptides and a combination of peptides for use in immunotherapy against various tumors |
DK3573600T3 (da) | 2017-01-25 | 2022-05-09 | Ose Immunotherapeutics | Fremgangsmåde til fremstilling af en stabil emulsion til peptidlevering |
TW202023581A (zh) | 2018-08-02 | 2020-07-01 | 日商腫瘤療法 科學股份有限公司 | 來自cdca1的胜肽及含有此的疫苗 |
Family Cites Families (46)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4722848A (en) | 1982-12-08 | 1988-02-02 | Health Research, Incorporated | Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus |
GB8823869D0 (en) | 1988-10-12 | 1988-11-16 | Medical Res Council | Production of antibodies |
US6150584A (en) | 1990-01-12 | 2000-11-21 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US5633425A (en) | 1990-08-29 | 1997-05-27 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
DE69127627T2 (de) | 1990-08-29 | 1998-02-19 | Genpharm Int | Produktion und Nützung nicht-menschliche transgentiere zur Produktion heterologe Antikörper |
US5625126A (en) | 1990-08-29 | 1997-04-29 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5545806A (en) | 1990-08-29 | 1996-08-13 | Genpharm International, Inc. | Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5661016A (en) | 1990-08-29 | 1997-08-26 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
WO1994002602A1 (en) | 1992-07-24 | 1994-02-03 | Cell Genesys, Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
US5285485A (en) | 1993-02-01 | 1994-02-08 | General Electric Company | Composite nuclear fuel container and method for producing same |
CA2161351C (en) | 1993-04-26 | 2010-12-21 | Nils Lonberg | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
EP1978033A3 (en) | 1995-04-27 | 2008-12-24 | Amgen Fremont Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
AU2466895A (en) | 1995-04-28 | 1996-11-18 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US20030198642A1 (en) | 1995-08-03 | 2003-10-23 | Johannes J. Geuze | Cell derived antigen presenting vesicles |
JP2002516572A (ja) | 1997-05-23 | 2002-06-04 | バイオジェン,インコーポレイテッド | 組織の再生の調節 |
US6800744B1 (en) * | 1997-07-02 | 2004-10-05 | Genome Therapeutics Corporation | Nucleic acid and amino acid sequences relating to Streptococcus pneumoniae for diagnostics and therapeutics |
FR2766205B1 (fr) | 1997-07-16 | 2002-08-30 | Inst Nat Sante Rech Med | Nouveau procede de sensibilisation de cellules presentatrices d'antigene et nouveaux moyens pour la mise en oeuvre du procede |
US6159958A (en) | 1997-08-14 | 2000-12-12 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Treatment or prophylaxis of retinal pathology and spinal cord injury |
US6858204B2 (en) * | 1999-06-30 | 2005-02-22 | Corxia Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer |
BR0012069A (pt) | 1999-06-30 | 2002-08-27 | Corixa Corp | Composições e métodos para a terapia e diagnóstico de câncer pulmonar |
US20020172952A1 (en) * | 1999-06-30 | 2002-11-21 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer |
US20030211510A1 (en) * | 1999-06-30 | 2003-11-13 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer |
AU7721500A (en) * | 1999-09-29 | 2001-04-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Colon and colon cancer associated polynucleotides and polypeptides |
AU2002218770A1 (en) | 2000-07-11 | 2002-01-21 | Corixa Corporaton | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer |
US7214786B2 (en) * | 2000-12-14 | 2007-05-08 | Kovalic David K | Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement |
US6867283B2 (en) * | 2001-05-16 | 2005-03-15 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Peptides capable of binding to MHC molecules, cells presenting such peptides, and pharmaceutical compositions comprising such peptides and/or cells |
AU2002327945A1 (en) * | 2001-09-17 | 2003-04-01 | Eirx Therapeutics Limited | Human delta-n p73 molecules and uses thereof |
WO2003105891A2 (en) | 2002-06-12 | 2003-12-24 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Use of hec1 antagonists in the treatment of proliferative disorders and cancer |
CN103073620B (zh) | 2002-09-12 | 2014-12-10 | 肿瘤疗法科学股份有限公司 | Kdr肽和包括该肽的疫苗 |
TW200413725A (en) * | 2002-09-30 | 2004-08-01 | Oncotherapy Science Inc | Method for diagnosing non-small cell lung cancers |
US20060024692A1 (en) * | 2002-09-30 | 2006-02-02 | Oncotherapy Science, Inc. | Method for diagnosing non-small cell lung cancers |
JP2006500946A (ja) | 2002-09-30 | 2006-01-12 | オンコセラピー・サイエンス株式会社 | 精巣精上皮腫の診断方法 |
WO2004080148A2 (en) | 2002-10-02 | 2004-09-23 | Nuvelo, Inc. | Novel nucleic acids and polypeptides |
CA2507924A1 (en) | 2002-12-10 | 2004-07-01 | Endocube Sas | Thap proteins as nuclear receptors for chemokines and roles in transcriptional regulation, cell proliferation and cell differentiation |
EP1615658A1 (en) * | 2003-03-25 | 2006-01-18 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Inhibition of tumor cell proliferation by foxm1b inhibitors |
WO2005029067A2 (en) * | 2003-09-24 | 2005-03-31 | Oncotherapy Science, Inc. | Method of diagnosing breast cancer |
EP2184609A3 (en) * | 2004-03-24 | 2010-08-04 | Oncotherapy Science, Inc. | Compositions and methods for treating lung cancer |
EP2295601A1 (en) * | 2005-02-10 | 2011-03-16 | Oncotherapy Science, Inc. | Method of diagnosing bladder cancer |
EP2298895A1 (en) | 2005-07-27 | 2011-03-23 | Oncotherapy Science, Inc. | Method of diagnosing small cell lung cancer |
EP2311986B1 (en) * | 2005-07-27 | 2015-04-15 | Oncotherapy Science, Inc. | Method of diagnosing esophageal cancer |
WO2007013480A2 (en) | 2005-07-29 | 2007-02-01 | Oncotherapy Science, Inc. | Screening and therapeutic method for nsclc targeting cdca1-kntc2 complex |
JP5276846B2 (ja) | 2005-09-13 | 2013-08-28 | 国立大学法人三重大学 | T細胞レセプターをコードする核酸が挿入されてなるベクター及び該レセプターを発現する細胞 |
US7776341B2 (en) * | 2006-08-10 | 2010-08-17 | Colorado State University Research Foundation | Biomarkers of tuberculosis that distinguish disease categories: use as serodiagnostic antigens |
BRPI0815578B8 (pt) | 2007-08-20 | 2021-05-25 | Oncotherapy Science Inc | peptídeos, agentes farmacêuticos compreendendo os mesmos, métodos in vitro para induzir uma célula apresentadora de antígeno, usos dos referidos peptídeos, e vacina |
TWI526219B (zh) | 2008-06-19 | 2016-03-21 | 腫瘤療法 科學股份有限公司 | Cdca1抗原決定位胜肽及含此胜肽的疫苗 |
US20120171213A1 (en) | 2009-09-10 | 2012-07-05 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Method of treating tumors |
-
2008
- 2008-06-13 BR BRPI0815578A patent/BRPI0815578B8/pt active IP Right Grant
- 2008-06-13 DK DK08777198.6T patent/DK2186889T3/en active
- 2008-06-13 KR KR1020107005388A patent/KR101610353B1/ko active IP Right Grant
- 2008-06-13 AU AU2008290061A patent/AU2008290061B2/en active Active
- 2008-06-13 JP JP2009528970A patent/JP5493076B2/ja active Active
- 2008-06-13 RU RU2010110564/10A patent/RU2486195C2/ru active
- 2008-06-13 ES ES08777198.6T patent/ES2537323T3/es active Active
- 2008-06-13 CN CN2008801123961A patent/CN101835892B/zh active Active
- 2008-06-13 SG SG2012058327A patent/SG183698A1/en unknown
- 2008-06-13 WO PCT/JP2008/060837 patent/WO2009025117A1/ja active Application Filing
- 2008-06-13 MX MX2010002001A patent/MX2010002001A/es active IP Right Grant
- 2008-06-13 US US12/673,434 patent/US8598125B2/en active Active
- 2008-06-13 CA CA2696701A patent/CA2696701C/en active Active
- 2008-06-13 PT PT87771986T patent/PT2186889E/pt unknown
- 2008-06-13 EP EP08777198.6A patent/EP2186889B1/en active Active
- 2008-06-13 PL PL08777198T patent/PL2186889T3/pl unknown
- 2008-06-16 TW TW097122386A patent/TWI523660B/zh active
-
2010
- 2010-02-11 IL IL203898A patent/IL203898A/en active IP Right Grant
- 2010-08-13 HK HK10107732.6A patent/HK1141312A1/xx unknown
-
2013
- 2013-03-20 RU RU2013112616/10A patent/RU2013112616A/ru not_active Application Discontinuation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
WIGGE et al, J. Cell Biol, v.152, no.2, 349-369. DATABASE GenBank, Ac. no. AAY 06266. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2186889A1 (en) | 2010-05-19 |
US20110152199A1 (en) | 2011-06-23 |
PL2186889T3 (pl) | 2015-09-30 |
BRPI0815578A2 (pt) | 2015-02-18 |
DK2186889T3 (en) | 2015-06-08 |
SG183698A1 (en) | 2012-09-27 |
KR20100063060A (ko) | 2010-06-10 |
RU2013112616A (ru) | 2014-09-27 |
JP5493076B2 (ja) | 2014-05-14 |
BRPI0815578B8 (pt) | 2021-05-25 |
MX2010002001A (es) | 2010-03-11 |
IL203898A0 (en) | 2011-07-31 |
AU2008290061A1 (en) | 2009-02-26 |
KR101610353B1 (ko) | 2016-04-07 |
CA2696701A1 (en) | 2009-02-26 |
ES2537323T3 (es) | 2015-06-05 |
US8598125B2 (en) | 2013-12-03 |
EP2186889B1 (en) | 2015-04-01 |
WO2009025117A1 (ja) | 2009-02-26 |
HK1141312A1 (en) | 2010-11-05 |
CN101835892B (zh) | 2013-11-06 |
JPWO2009025117A1 (ja) | 2010-11-18 |
CA2696701C (en) | 2017-01-24 |
BRPI0815578B1 (pt) | 2020-04-07 |
AU2008290061B2 (en) | 2014-01-30 |
TWI523660B (zh) | 2016-03-01 |
IL203898A (en) | 2013-11-28 |
RU2010110564A (ru) | 2011-09-27 |
PT2186889E (pt) | 2015-06-17 |
CN101835892A (zh) | 2010-09-15 |
EP2186889A4 (en) | 2010-11-10 |
TW200916114A (en) | 2009-04-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2486195C2 (ru) | Пептид cdca1 и включающее его фармацевтическое средство | |
US9415096B2 (en) | FOXM1 peptide and medicinal agent comprising the same | |
KR101561175B1 (ko) | Cdh3 펩티드 및 이를 포함하는 의약제 |