RU2484460C2

RU2484460C2 - METHOD OF DETECTING LYSINE IN MIXTURE OF α-AMINO ACIDS

Info

Publication number: RU2484460C2
Application number: RU2011137840/15A
Authority: RU
Inventors: Римма Кузьминична Чернова; Мария Валерьевна Пысина; Юлия Юрьевна Гаврилова
Priority date: 2011-09-15
Filing date: 2011-09-15
Publication date: 2013-06-10
Also published as: RU2011137840A

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: method of detecting lysine in a mixture of α-amino acids, except a mixture containing cysteine and proline, involves preparation of an acetate-ammonia buffer solution with pH 3.06 to which is added 0.1% lysine solution in such an amount that its content in the final solution ranges from 0.0004 to 0.008%; 0.2% aqueous ninhydrin solution in such an amount that content of ninhydrin in the final solution ranges from 0.01 to 0.03%; heating the obtained solution on a water bath at 95-105°C for 15-25 minutes; adding cetylpyridinium chloride in an amount which ensures its content in the solution in a concentration after critical micelle concentration of 0.1-0.4%; measuring the absorption spectrum of the obtained solution; detecting lysine in the solution based on the presence of a maximum at wavelength λ_max=480 nm.

EFFECT: simpler, faster and cheaper procedure of determining lysine while maintaining high metrological parameters of the determining method.

1 tbl, 11 dwg

Description

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам обнаружения биологически активного соединения - лизина, в сложных смесях. L-Лизин - незаменимая аминокислота, которую живой организм может получить только с пищей. Лизин является основой для построения белков живых организмов. При недостатке лизина расстраивается весь белковый обмен. Лизин влияет на прочность и эластичность связок и сухожилий, способствует усвоению кальция и его встраиванию в костную ткань, участвует в синтезе антител, гормонов, ферментов. Препараты, содержащие лизин, применяют для обогащения кормов и пищевых продуктов, парентерального питания больных. В связи с этим востребованы избирательные доступные методы экспресс-диагностики лизина в смесях аминокислот, для подтверждения подлинности препаратов. Для 20 незаменимых α-аминокислот известно немного таких реакций (таблица). Как следует из таблицы, высокоизбирательные реакции на лизин, позволяющие идентифицировать эту аминокислоту в смеси других α-аминокислот, не известны. Идентификацию лизина, наряду с другими α-аминокислотами можно провести методом высокоэффективной жидкостной хроматографии или капиллярного электрофореза, что требует дорогостоящего оборудования, высококвалифицированных специалистов, предварительной стадии дериватизации аминокислот и в связи с этим практически недоступно для рядовых клинических и химико-аналитических лабораторий, а также экономически не выгодно в том случае, если требуется подтвердить наличие в смеси лишь одной аминокислоты - лизина. В связи с этим актуально изыскание простого, дешевого, высокоизбирательного и надежного теста на лизин.The invention relates to analytical chemistry, and in particular to methods for detecting a biologically active compound - lysine, in complex mixtures. L-Lysine is an essential amino acid that a living organism can get only with food. Lysine is the basis for the construction of proteins of living organisms. With a lack of lysine, all protein metabolism is upset. Lysine affects the strength and elasticity of ligaments and tendons, promotes the absorption of calcium and its integration into bone tissue, is involved in the synthesis of antibodies, hormones, enzymes. Preparations containing lysine are used to enrich feed and food products, parenteral nutrition of patients. In this regard, selective available methods of express diagnostics of lysine in mixtures of amino acids are required to confirm the authenticity of the drugs. For 20 essential α-amino acids, few such reactions are known (table). As follows from the table, highly selective reactions to lysine, allowing the identification of this amino acid in a mixture of other α-amino acids, are not known. The identification of lysine, along with other α-amino acids, can be carried out by high-performance liquid chromatography or capillary electrophoresis, which requires expensive equipment, highly qualified specialists, a preliminary stage of derivatization of amino acids and therefore is practically inaccessible to ordinary clinical and chemical-analytical laboratories, as well as economically not beneficial if it is required to confirm the presence of only one amino acid in the mixture - lysine. In this regard, the search for a simple, cheap, highly selective and reliable lysine test is relevant.

Реакции, используемые для идентификации α-аминокислотReactions Used to Identify α-Amino Acids РеакцияReaction РеактивыReagents Определяемая аминокислотаDetermined Amino Acid ОкраскаColoring ЭрлихаErlich Диазотированная сульфаниловая кислота в щелочном раствореDiazotized sulfanilic acid in alkaline solution Гистидин, тирозинHistidine, tyrosine КраснаяRed Адамкевича-ГопкинсаAdamkevich-Hopkins Глиоксиловая кислота в конц. H₂SO₄ Glyoxylic acid in conc. H ₂ SO ₄ ТриптофанTryptophan Сине-фиолетоваяBlue violet СакагучиSakaguchi α-нафтол и гипобромит натрияα-naphthol and sodium hypobromite АргининArginine КраснаяRed НитропруссиднаяNitroprusside Щелочь и нитропруссид натрияAlkali and sodium nitroprusside Цистеин, метионинCysteine, methionine КраснаяRed СалливанаSullivan 1,2-Нафтохинон-4-сульфонат натрия и бисульфит натрияSodium 1,2-naphthoquinone-4-sulfonate and sodium bisulfite ЦистеинCysteine КраснаяRed Ксантопротеиновая (Мульдера)Xantoprotein (Mulder) Кипящая конц. HNO₃ Boiling Conc. HNO ₃ Фенилаланин, тирозинPhenylalanine, tyrosine ЖелтаяYellow ФолинаFolina Фосфомолибденово-вольфрамовая кислотаPhosphomolybdenum-Tungsten Acid Тирозин, триптофанTyrosine, tryptophan СиняяBlue ФоляFoley Кипячение с NaOH и CH₃COONaBoiling with NaOH and CH ₃ COONa Цистеин, цистинCysteine, cystine ЧернаяBlack Шульце-РаспайляSchulze Raspail Фруктоза в сильнокислой средеFructose in a strongly acidic environment ТриптофанTryptophan Вишнево-краснаяCherry red МиллонаMillona Раствор нитратов ртути (I) и (II) в HNO₃ с примесью HNO₂ A solution of mercury (I) and (II) nitrates in HNO ₃ mixed with HNO ₂ ТирозинTyrosine КраснаяRed МульдераMulder Кипящая конц. HNO₃ и 30%-ный NaOHBoiling Conc. HNO ₃ and 30% NaOH Тирозин (мешает триптофан)Tyrosine (interferes with tryptophan) ОранжеваяOrange

Известен способ определения лизина в водном растворе (см. патент на изобретение RU 2299433, G01N 31/16, G01N 27/48). Способ характеризуется тем, что готовят водный раствор лизина с концентрацией 0,01-0,1 мг/мл, добавляют к нему высаливатель - кристаллический сульфат лития в количестве 25 мас.%, раствор перемешивают, затем добавляют смесь гидрофильных растворителей, которую готовят из 50-60 мас.% изопропилового спирта и 40-50 мас.% этилацетата, экстракт отделяют, определяют в нем содержание лизина путем потенциометрического титрования экстракта, строят дифференциальную кривую зависимости потенциала среды от объема титранта, степень извлечения (R, %) лизина рассчитывают по формуле: R=D100/D+r, где D - коэффициент распределения лизина между смесью растворителей и водно-солевым раствором, r - соотношение равновесных объемов водной и органической фаз. Достигается возможность определения лизина в водном растворе с применением высаливателя и смеси гидрофильных растворителей.A known method for the determination of lysine in aqueous solution (see patent for invention RU 2299433, G01N 31/16, G01N 27/48). The method is characterized in that an aqueous solution of lysine with a concentration of 0.01-0.1 mg / ml is prepared, a salting out agent — crystalline lithium sulfate in the amount of 25 wt.% Is added to it, the solution is mixed, then a mixture of hydrophilic solvents is prepared, which is prepared from 50 -60 wt.% Isopropyl alcohol and 40-50 wt.% Ethyl acetate, the extract is separated, the lysine content is determined in it by potentiometric titration of the extract, a differential curve of the medium potential versus titrant volume is built, the degree of extraction (R,%) of lysine is calculated are specified with the formula: R = D100 / D + r, where D - lysine distribution ratio between the mixture of solvents and water-brine, r - the ratio of the equilibrium amounts of the aqueous and organic phases. It is possible to determine lysine in an aqueous solution using a salting out agent and a mixture of hydrophilic solvents.

Однако способ относится к водному раствору одного лизина при отсутствии других аминокислот и таким образом не является избирательным. Приводимый патент ориентирован не на избирательную идентификацию лизина в смеси аминокислот, а на возможность выделения из водного раствора путем экстракции лизина, как и других α-аминокислот, гидрофильными растворителями. Таким образом, поставленная задача в данном патенте не решается.However, the method relates to an aqueous solution of one lysine in the absence of other amino acids and thus is not selective. The cited patent is not focused on the selective identification of lysine in a mixture of amino acids, but on the possibility of isolation from an aqueous solution by extraction of lysine, like other α-amino acids, with hydrophilic solvents. Thus, the task in this patent is not solved.

Известен способ определения содержания свободных аминокислот - лизина и/или метионина в кормовых средствах (см. патент на изобретение RU 2263307, МПК G01N 33/02, С12Р 13/08, С12Р 13/12). Способ определения содержания свободных аминокислот в кормовых средствах заключается в отборе пробы анализируемого кормового средства, приготовлении ее раствора, определении содержания аминокислот в приготовленном анализируемом растворе, расчете содержания аминокислоты в анализируемом кормовом средстве по полученным данным. Аминокислоту в приготовленном растворе превращают в ее дансильное производное путем взаимодействия с раствором дансилхлорида, а содержание аминокислоты в анализируемом растворе определяют методом капиллярного электрофореза по содержанию в нем ее дансильного производного.A known method for determining the content of free amino acids - lysine and / or methionine in feed products (see patent for invention RU 2263307, IPC G01N 33/02, С12Р 13/08, С12Р 13/12). The method for determining the content of free amino acids in feed means is to take a sample of the analyzed feed, prepare its solution, determine the content of amino acids in the prepared test solution, calculate the amino acid content in the analyzed feed according to the data obtained. The amino acid in the prepared solution is converted into its dansyl derivative by reaction with a dansyl chloride solution, and the amino acid content in the analyzed solution is determined by capillary electrophoresis according to the content of its dansyl derivative.

Однако метод сложен, малодоступен в силу дороговизны, требует высокой квалификации специалиста, его использование экономически неоправданно для серийных анализов объектов на содержание лизина.However, the method is complex, inaccessible due to high cost, requires highly qualified specialist, its use is economically unjustified for serial analysis of objects for the content of lysine.

Наиболее близким к заявленному является колориметрический способ определения доступного лизина в пищевых продуктах (см. заявку на изобретение RU 2009112437, C12Q 1/04). Способ включает приготовление навесок проб исследуемого пищевого продукта, причем первая проба содержит гистидин + аргинин + лизин, а вторая - гистидин + аргинин. Навески проб продукта помещают в конические колбы, приливают в каждую колбу дистиллированную воду и оставляют на 9-10 мин, проводят блокирование свободных С-аминогрупп лизина, добавляют в обе пробы раствор красителя «Оранж-Ж» с последующим вычислением содержания доступного лизина в продукте. Блокирование свободных С-аминогрупп лизина проводят уксусным ангидридом. Навеску первой пробы берут в количестве 15 мг гистидин + аргинин + лизин, а второй 15 мг гистидин + аргинин, во вторую колбу вносят 0,4 см³ уксусного ангидрида и помещают ее на лабораторный встряхиватель на 14-15 мин. Обработку первой и второй пробы проводят одновременно, добавляют по 40 см³ раствора красителя «Оранж-Ж», встряхивают в течение 85-90 мин, затем содержимое колб фильтруют через стеклянные фильтры, отбирают пипеткой по 1 см³ каждого фильтрата и вносят в мерные цилиндры, доводят объем в цилиндрах по 75 см³ дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Затем растворы проб колориметрируют, обрабатывают данные результатов, находящиеся в пределах от 0,2 до 0,6 единицы оптической плотности, на основании которых по градуировочному графику устанавливают количество несвязанного красителя в ммолях при рН 2,2 и вычисляют массовую долю доступного лизина в мг/100 г продукта.Closest to the claimed is a colorimetric method for determining the available lysine in food products (see patent application RU 2009112437, C12Q 1/04). The method includes preparing a sample of the test food product, the first sample containing histidine + arginine + lysine, and the second - histidine + arginine. Samples of product samples are placed in conical flasks, distilled water is poured into each flask and left for 9-10 minutes, the free C-amino groups of lysine are blocked, the Orange-G dye solution is added to both samples, followed by calculation of the content of available lysine in the product. Blocking the free C-amino groups of lysine is carried out with acetic anhydride. A portion of the first sample is taken in the amount of 15 mg histidine + arginine + lysine, and the second 15 mg of histidine + arginine, 0.4 cm ^{3 of} acetic anhydride is introduced into the second flask and placed on a laboratory shaker for 14-15 minutes. The processing of the first and second samples is carried out simultaneously, 40 cm ³ of Orange-Zh dye solution is added, shaken for 85-90 minutes, then the contents of the flasks are filtered through glass filters, 1 cm ^{3 of} each filtrate is pipetted and introduced into graduated cylinders , bring the volume in cylinders of 75 cm ^{3 with} distilled water and mix thoroughly. Then, the sample solutions are colorimetered, the results are processed, which are in the range from 0.2 to 0.6 units of optical density, on the basis of which, according to the calibration curve, the amount of unbound dye in mmoles at pH 2.2 is established and the mass fraction of available lysine in mg / is calculated 100 g of product.

Однако данный способ также не решает поставленную задачу избирательного обнаружения лизина в неизвестном растворе, содержащем наряду с лизином и другие аминокислоты. В данном способе содержание лизина должно быть заранее известно, что является весьма частной задачей и не предполагается в заявленном способе.However, this method also does not solve the problem of selective detection of lysine in an unknown solution containing, along with lysine, other amino acids. In this method, the lysine content must be known in advance, which is a very particular task and is not expected in the claimed method.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка доступного клиническим и производственным лабораториям простого, экспрессного, дешевого и экологически чистого способа идентификации и определения содержания лизина в смесях α-аминокислот, основанного на особых условиях лизина с нингидрином в присутствии ПАВ.The objective of the invention is the development of accessible to clinical and industrial laboratories a simple, express, cheap and environmentally friendly method for identifying and determining the lysine content in mixtures of α-amino acids, based on the special conditions of lysine with ninhydrin in the presence of surfactants.

Технический результат заключается в упрощении, ускорении и удешевлении процедуры определения лизина при сохранении высоких метрологических параметров методики определения.The technical result consists in simplifying, accelerating and cheapening the procedure for determining lysine while maintaining high metrological parameters of the determination method.

Для решения поставленной задачи использовали специфику взаимодействия лизина с нингидрином, при определенных условиях. Данный подход основан на специфике взаимодействия лизина с нингидрином в кислой среде, отмеченной авторами данного изобретения. Поставленная задача решается тем, что для избирательного обнаружения лизина применяют композицию, состоящую из буферного ацетатно-аммиачного раствора рН 3,06, 0,2% водного раствора нингидрина и 0,01М цетилпиридиния хлорид (ЦПХ), а также подбора определенных условий: t° нагревания = 100°С, время нагрева, равное 20 мин.To solve this problem, we used the specifics of the interaction of lysine with ninhydrin, under certain conditions. This approach is based on the specifics of the interaction of lysine with ninhydrin in an acidic environment, noted by the authors of this invention. The problem is solved in that for the selective detection of lysine, a composition is used consisting of a buffer acetate-ammonia solution of pH 3.06, a 0.2% aqueous solution of ninhydrin and 0.01 M cetylpyridinium chloride (CPC), as well as the selection of certain conditions: t ° heating = 100 ° C; heating time equal to 20 minutes

Указанный технический результат достигается тем, что вначале готовят раствор, содержащий:The specified technical result is achieved by first preparing a solution containing:

CH₃COOH - от 0,6 до 0,9%,CH ₃ COOH - from 0.6 to 0.9%,

NH₃·H₂O - от 0,002 до 0,004%,NH ₃ · H ₂ O - from 0.002 to 0.004%,

исследуемый лизинсодержащий раствор - от 0,0004 до 0,008%,test lysine-containing solution - from 0.0004 to 0.008%,

нингидрин - от 0,01 до 0,03%,ninhydrin - from 0.01 to 0.03%,

вода - остальное.water is the rest.

Затем нагревают полученный раствор на водяной бане при 95-105°С в течение 15-25 мин. В результате нагревания происходит химическая реакция, приводящая к образованию оранжевого окрашивания выпадению осадка. Для растворения осадка добавляют ЦПХ в количестве, обеспечивающем его содержание в растворе в концентрации после ККМ (критической концентрации мицелообразования) - 0,1-0,4%. После этого измеряют спектр поглощения полученного раствора и по наличию максимума на длине волны λ_max=480 нм делают вывод о присутствии лизина в растворе.Then the resulting solution is heated in a water bath at 95-105 ° C for 15-25 minutes. As a result of heating, a chemical reaction occurs, leading to the formation of an orange color precipitation. To dissolve the precipitate, CPC is added in an amount that ensures its content in the solution in a concentration after CMC (critical concentration of micelle formation) - 0.1-0.4%. After that, the absorption spectrum of the resulting solution is measured and, by the presence of a maximum at a wavelength of λ _max = 480 nm, a conclusion is made about the presence of lysine in the solution.

Изобретение иллюстрируется чертежами, где на фиг.1 приведен электронный спектр поглощения системы ацетатно-аммиачный буферный раствор (рН 3,06) - лизин-нингидрин-ЦПХ, на фиг.2 показан электронный спектр поглощения системы ацетатно-аммиачный буферный раствор (рН 3,06) - лизин (свежеприготовленный) - нингидрин - ЦПХ: 1-1 мл лизина, 2-0,5 мл лизина, 3-0,1 мл лизина, на фиг.3 представлен электронный спектр поглощения системы ацетатно-аммиачный буферный раствор (рН 3,06) - лизин-нингидрин-ЦПХ: 1-4,2 мл нингидрина (0,2%), 2-1,4 мл нингидрина (0,2%), на фиг.4 изображен электронный спектр поглощения системы ацетатно-аммиачный буферный раствор (рН 4,75) - лизин - нингидрин, на фиг.5 приведен электронный спектр поглощения системы ацетатно-аммиачный буферный раствор (рН 3,06) - гистидин-нингидрин, на фиг.6 показан электронный спектр поглощения системы ацетатно-аммиачный буферный раствор (рН 3,06) - аргинин-нингидрин, на фиг.7 изображен продукт реакции смеси ацетатно-аммиачный буферный раствор (рН 3,06) - лизин-гистидин-аргинин-нингидрин - ЦПХ, на фиг.8 представлен электронный спектр поглощения продукта реакции смеси ацетатно-аммиачный буферный раствор (рН 3,06) - лизин-гистидин-аргинин-нингидрин-ЦПХ, на фиг.9 приведен электронный спектр поглощения продукта реакции смеси ацетатно-аммиачный буферный раствор (рН 3,06) - цистеин-нингидрин-ЦПХ и электронный спектр поглощения продукта реакции смеси ацетатно-аммиачный буферный раствор (рН 3,06) - пролин-нингидрин-ЦПХ, на фиг.10 показан электронный спектр поглощения продукта реакции смеси ацетатно-аммиачный буферный раствор (рН 3,06) - лизин-гистидин-аргинин-нингидрин-ЦПХ: 1-19,86 мкг/л; 2-29,84 мкг/л; 3-39,71 мкг/л; 4-49,64 мкг/л; 5-59,57 мкг/л, на фиг.11 представлен градуировочный график смеси ацетатно-аммиачный буферный раствор (рН 3,06) - лизин-гистидин-аргинин-нингидрин-ЦПХ.The invention is illustrated by drawings, in which Fig. 1 shows the electronic absorption spectrum of an acetate-ammonia buffer solution system (pH 3.06) - lysine-ninhydrin-CPC, Fig. 2 shows the electronic absorption spectrum of an acetate-ammonia buffer solution system (pH 3, 06) - lysine (freshly prepared) - ninhydrin - CPC: 1-1 ml of lysine, 2-0.5 ml of lysine, 3-0.1 ml of lysine, figure 3 shows the electronic absorption spectrum of the acetate-ammonia buffer solution (pH 3.06) - lysine-ninhydrin-CPC: 1-4.2 ml of ninhydrin (0.2%), 2-1.4 ml of ninhydrin (0.2%), figure 4 shows the electron the absorption spectrum of the system of acetate-ammonia buffer solution (pH 4.75) - lysine - ninhydrin, figure 5 shows the electronic absorption spectrum of the system of acetate-ammonia buffer solution (pH 3.06) - histidine-ninhydrin, figure 6 shows electronic absorption spectrum of the system of acetate-ammonia buffer solution (pH 3.06) - arginine-ninhydrin, Fig.7 shows the reaction product of a mixture of acetate-ammonia buffer solution (pH 3.06) - lysine-histidine-arginine-ninhydrin - CPC, on Fig presents the electronic absorption spectrum of the reaction product of a mixture of acetate-ammonium egg buffer solution (pH 3.06) - lysine-histidine-arginine-ninhydrin-CPC, Fig. 9 shows the electronic absorption spectrum of the reaction product of a mixture of acetate-ammonia buffer solution (pH 3.06) - cysteine-ninhydrin-CPC and electronic the absorption spectrum of the reaction product of a mixture of acetate-ammonia buffer solution (pH 3.06) - proline-ninhydrin-CPC, figure 10 shows the electronic absorption spectrum of the reaction product of a mixture of acetate-ammonium buffer solution (pH 3.06) - lysine-histidine - arginine-ninhydrin-CPC: 1-19.86 μg / l; 2-29.84 mcg / l; 3-39.71 μg / L; 4-49.64 μg / l; 5-59.57 μg / l, Fig.11 shows a calibration graph of a mixture of acetate-ammonia buffer solution (pH 3.06) - lysine-histidine-arginine-ninhydrin-CPC.

Реакцию проводили следующим образом: к 15 мл ацетатно-аммиачного буферного раствора рН 3,06 добавляли 1,25 мл 0,1% раствора лизина и 2,8 мл 0,2% водного раствора нингидрина. Нагревали на водяной бане при температуре 100°С в течение 20 минут. В ходе этой реакции образовался осадок. С целью растворения осадка, добавляли 2,5 мл 0,1М ЦПХ. Раствор после нагревания становился оранжевым. Затем раствор охлаждали, разбавляли в мерной колбе ацетатно-аммиачным буферным раствором до 25 мл и регистрировали спектр поглощения. Буферный раствор, для идентификации лизина, готовится следующим образом: 99,3 мл 2Н раствора СН₃СООН смешивается с 59,7 мл 2Н раствора NH₃·H₂O и доводится в мерной колбе дистиллированной водой до 1 литра. Буферный раствор имеет рН 3,06. В качестве реагента применяется специально приготовленный раствор нингидрина:The reaction was carried out as follows: 1.25 ml of a 0.1% lysine solution and 2.8 ml of a 0.2% aqueous ninhydrin solution were added to 15 ml of an ammonium acetate buffer solution of pH 3.06. Heated in a water bath at a temperature of 100 ° C for 20 minutes. A precipitate formed during this reaction. In order to dissolve the precipitate, 2.5 ml of 0.1 M CPC was added. The solution turned orange after heating. Then the solution was cooled, diluted in a volumetric flask with ammonia acetate buffer solution to 25 ml, and the absorption spectrum was recorded. A buffer solution, for identification of lysine, is prepared as follows: 99.3 ml of a 2N solution of CH ₃ COOH is mixed with 59.7 ml of a 2N solution of NH ₃ · H ₂ O and adjusted to 1 liter in a volumetric flask with distilled water. The buffer solution has a pH of 3.06. As a reagent, a specially prepared ninhydrin solution is used:

Исследовалось также взаимодействие других α-аминокислот, гистидина и аргинина в ацетатно-аммиачном буферном растворе (рН 3,06), они не дают окрашивания, следовательно, не реагируют в данных условиях.The interaction of other α-amino acids, histidine, and arginine in an acetate-ammonia buffer solution (pH 3.06) was also studied; they do not stain, therefore, do not react under these conditions.

Пример 1. Была установлена минимально фиксируемая концентрация лизина. Для этого поочередно в систему ацетатно-аммиачный буферный раствор (рН 3,06) - лизин-нингидрин-ЦПХ, добавляли 1 мл, 0,5 мл и 0,1 мл 0,1% раствора лизина (фиг.2).Example 1. The minimum fixed concentration of lysine was established. For this, alternately in the system of acetate-ammonia buffer solution (pH 3.06) - lysine-ninhydrin-CPC, was added 1 ml, 0.5 ml and 0.1 ml of a 0.1% lysine solution (figure 2).

Как следует из фиг.2, интенсивность снижается по мере уменьшения концентрации лизина. При добавлении 0,1 мл лизина поглощение продукта реакции обнаружить не удается. Предел обнаружения составил 3,94 мкг/л.As follows from figure 2, the intensity decreases with decreasing lysine concentration. When 0.1 ml of lysine was added, absorption of the reaction product could not be detected. The detection limit was 3.94 μg / L.

Пример 2. Исследовалось влияние концентрации нингидрина в системе на аналитический эффект. Для этого в систему ацетатно-аммичный буферный раствор (рН 3,06) - лизин-нингидрин-ЦПХ поочередно прибавляли 4,2 мл и 1,4 мл 0,2% водного раствора нингидрина (фиг.3).Example 2. The effect of the concentration of ninhydrin in the system on the analytical effect was investigated. To do this, in the system of acetate-ammonium buffer solution (pH 3.06) - lysine-ninhydrin-CPC, 4.2 ml and 1.4 ml of a 0.2% aqueous solution of ninhydrin were successively added (Fig. 3).

Как следует из фиг.3, увеличение концентрации нингидрина приводит к увеличению оптической плотности от 0,15 до 0,38, что повышает чувствительность реакции.As follows from figure 3, an increase in the concentration of ninhydrin leads to an increase in optical density from 0.15 to 0.38, which increases the sensitivity of the reaction.

Пример 3. Система лизин-нингидрин-ацетатно-аммиачный буферный раствор исследовалась нами также и при рН 4,75. Реакцию проводили аналогично: к 15 мл ацетатно-аммиачного буферного раствора рН 4,75 добавляли 1,25 мл 0,1% раствора лизина и 2,8 мл 0,2% водного раствора нингидрина. Нагревали на водяной бане при температуре 100°С в течение 20 минут. Раствор после нагревания становился красно-оранжевым. Затем раствор охлаждали, разбавляли в мерной колбе ацетатно-аммиачным буферным раствором до 25 мл и регистрировали спектр поглощения (фиг.4).Example 3. The lysine-ninhydrin-acetate-ammonia buffer solution system was also studied by us at pH 4.75. The reaction was carried out similarly: 1.25 ml of a 0.1% lysine solution and 2.8 ml of a 0.2% aqueous ninhydrin solution were added to 15 ml of an ammonium acetate buffer solution of pH 4.75. Heated in a water bath at a temperature of 100 ° C for 20 minutes. The solution turned red-orange after heating. Then the solution was cooled, diluted in a volumetric flask with an acetate-ammonia buffer solution of up to 25 ml, and the absorption spectrum was recorded (Fig. 4).

Как следует из фиг.4, в спектре наблюдается наличие трех полос поглощения с λ=400 нм, 563 нм и ранее наблюдаемой полосой с λ_max=480 нм. Отсюда следует вывод: лизин образует с нигидрином при рН 4,75 два окрашенных продукта (λ_max=480 нм и λ_max=563 нм). Наличие второго продукта мешает количественному определению лизина, однако качественная идентификация еще возможна.As follows from figure 4, in the spectrum there are three absorption bands with λ = 400 nm, 563 nm and the previously observed band with λ _max = 480 nm. The conclusion follows: lysine forms two colored products with nigidrin at pH 4.75 (λ _max = 480 nm and λ _max = 563 nm). The presence of a second product interferes with the quantitative determination of lysine, however, qualitative identification is still possible.

Пример 4. Исследовалось взаимодействие другой основной α-аминокислоты, гистидина в ацетатно-аммиачном буферном растворе (рН 3,06), согласно следующей методике: к 15 мл ацетатно-аммиачного буферного раствора рН 3,06 добавляли 1,25 мл 0,1% раствора гистидина и 2,8 мл 0,2% водного раствора нингидрина. Нагревали на кипящей водяной бане в течение 20 мин. Раствор после нагревания становился бледно-желтым. Затем раствор охлаждали, разбавляли в мерной колбе ацетатно-аммиачным буферным раствором до 25 мл и регистрировали спектр поглощения (фиг.5).Example 4. We studied the interaction of another basic α-amino acid, histidine in an acetate-ammonia buffer solution (pH 3.06), according to the following method: 1.25 ml of 0.1% was added to 15 ml of acetate-ammonia buffer solution of pH 3.06 a solution of histidine and 2.8 ml of a 0.2% aqueous solution of ninhydrin. Heated in a boiling water bath for 20 minutes. The solution turned pale yellow after heating. Then the solution was cooled, diluted in a volumetric flask with acetate-ammonia buffer solution to 25 ml and the absorption spectrum was recorded (Fig. 5).

Как следует из фиг.5, спектр поглощения системы ацетатно-аммиачный буферный раствор (рН 3,06) - гистидин-нингидрин не обнаруживает заметного поглощения в области 400-700 нм и, следовательно, не мешает обнаружению лизина.As follows from figure 5, the absorption spectrum of the system of acetate-ammonia buffer solution (pH 3.06) - histidine ninhydrin does not detect appreciable absorption in the region of 400-700 nm and, therefore, does not interfere with the detection of lysine.

Пример 5. Исследовалась возможность протекания реакции аргинина в ацетатно-аммиачном буферном растворе (рН 3,06) согласно следующей методике: к 15 мл ацетатно-аммиачного буферного раствора рН 3,06 добавляли 1,25 мл 0,1% раствора аргинина и 2,8 мл 0,2% водного раствора нингидрина (водяная баня, 20 мин). Раствор после нагревания оставался бесцветным (фиг.6).Example 5. The possibility of the reaction of arginine in an acetate-ammonia buffer solution (pH 3.06) was studied according to the following procedure: 1.25 ml of 0.1% arginine solution was added to 15 ml of ammonia acetate buffer solution of pH 3.06 and 2, 8 ml of a 0.2% aqueous solution of ninhydrin (water bath, 20 min). The solution after heating remained colorless (Fig.6).

Из полученных данных следует, что при данных условиях аргинин не мешает обнаружению лизина.From the data obtained it follows that under these conditions arginine does not interfere with the detection of lysine.

Пример 6. Избирательное определение лизина и его идентификация в смеси с двумя другими основными аминокислотами: к 13 мл ацетатно-аммиачного буферного раствора рН 3,06 прибавляли 1,25 мл 0,1% раствора аргинина, 1,25 мл 0,1% раствора лизина, 1,25 мл 0,1% раствора гистидина и 2,8 мл 0,2% нингидрина. Нагревали на водяной бане в течение 20 минут при температуре 100°С. Затем раствор охлаждали и добавляли 2,5 мл 0,1 М ЦПХ, доводили в мерной колбе ацетатно-аммиачным буферным раствором до 25 мл и регистрировали спектр поглощения. Образующийся оранжевый продукт реакции с λ_max=480 нм свидетельствует о присутствии лизина в смеси (фиг.7).Example 6. Selective determination of lysine and its identification in a mixture with two other basic amino acids: 1.25 ml of a 0.1% solution of arginine, 1.25 ml of a 0.1% solution were added to 13 ml of acetate-ammonia buffer solution pH 3.06 lysine, 1.25 ml of a 0.1% histidine solution and 2.8 ml of 0.2% ninhydrin. Heated in a water bath for 20 minutes at a temperature of 100 ° C. Then the solution was cooled and 2.5 ml of 0.1 M CPC was added, the ammonia acetate buffer solution was adjusted to 25 ml in a volumetric flask, and the absorption spectrum was recorded. The resulting orange reaction product with λ _max = 480 nm indicates the presence of lysine in the mixture (Fig. 7).

Как следует из фиг.8, спектр поглощения состоит из одной полосы с λ=480 нм, что является характерной полосой поглощения для лизина.As follows from Fig. 8, the absorption spectrum consists of one band with λ = 480 nm, which is a characteristic absorption band for lysine.

Пример 7. Исследовалась возможность протекания реакции остальных из 20 аминокислот в ацетатно-аммиачном буферном растворе (рН 3,06) согласно следующей методике: к 15 мл ацетатно-аммиачного буферного раствора рН 3,06 добавляли 1,25 мл 0,1% раствора аминокислоты (пролин, цистеин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, аспарагин, метионин, глутамин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, серин, треонин, тирозин, триптофан, глицин, аланин, валин) и 2,8 мл 0,2% водного раствора нингидрина (водяная баня, 20 мин). Растворы после нагревания оставались бесцветными. Исключение составили пролин и цистеин, образовывалось оранжевое окрашивание (фиг.9).Example 7. We investigated the possibility of a reaction of the remaining 20 amino acids in an acetate-ammonia buffer solution (pH 3.06) according to the following procedure: 1.25 ml of a 0.1% amino acid solution was added to 15 ml of acetate-ammonia buffer solution of pH 3.06 (proline, cysteine, glutamic acid, aspartic acid, asparagine, methionine, glutamine, leucine, isoleucine, phenylalanine, serine, threonine, tyrosine, tryptophan, glycine, alanine, valine) and 2.8 ml of a 0.2% aqueous solution of ninhydrin ( water bath, 20 min). The solutions remained colorless after heating. The exception was proline and cysteine, an orange stain was formed (Fig. 9).

Данные две аминокислоты являются мешающими.These two amino acids are interfering.

Пример 8. Для построения градуировочного графика в систему ацетатно-аммиачный буферный раствор (рН 3,06) - лизин-нингидрин-ЦПХ, раствор лизина поочередно добавляли 0,5 мл (19,86 мкг/л), 0,75 мл (29,84 мкг/л), 1 мл (39,71 мкг/л), 1,25 мл (49,64 мкг/л), 1,5 мл (59,57 мкг/л) и регистрировали спектры поглощения (фиг.11).Example 8. To build a calibration graph in the system of acetate-ammonia buffer solution (pH 3.06) - lysine-ninhydrin-CPC, a lysine solution was added alternately 0.5 ml (19.86 μg / l), 0.75 ml (29 , 84 μg / L), 1 ml (39.71 μg / L), 1.25 ml (49.64 μg / L), 1.5 ml (59.57 μg / L) and absorption spectra were recorded (Fig. eleven).

Наличие линейной зависимости и ее повторяемость свидетельствуют о стабильности данных, полученных с помощью предлагаемого способа идентификации, а также свидетельствует о пригодности применения полученной линейной зависимости максимума в спектре поглощения от концентрации лизина для количественного определения лизина.The presence of a linear dependence and its repeatability indicate the stability of the data obtained using the proposed identification method, and also indicates the suitability of using the obtained linear dependence of the maximum in the absorption spectrum on the concentration of lysine for the quantitative determination of lysine.

Claims

Способ обнаружения лизина в смеси α-аминокислот, за исключением смеси, содержащей цистеин и пролин, включающий приготовление ацетатно-аммиачного буферного раствора с рН=3,06, к которому добавляют 0,1%-ный раствор лизина в таком количестве, чтобы в конечном готовом растворе его содержание было от 0,0004 до 0,008%; 0,2%-ный водный раствор нингидрина в таком количестве, чтобы содержание нингидрина в конечном готовом растворе было от 0,01 до 0,03%; последующий нагрев полученного раствора на водяной бане при 95-105°С в течение 15-25 мин; добавление цетилпиридиния хлорида в количестве, обеспечивающем его содержание в растворе в концентрации после критической концентрации мицеллообразования, 0,1-0,4%; последующее измерение спектра поглощения полученного раствора; обнаружение лизина в растворе по наличию максимума на длине волны λ_max=480 нм. A method for detecting lysine in a mixture of α-amino acids, with the exception of a mixture containing cysteine and proline, comprising preparing an acetate-ammonia buffer solution with pH = 3.06, to which a 0.1% lysine solution is added in such an amount that the final the finished solution, its content was from 0.0004 to 0.008%; 0.2% aqueous ninhydrin solution in such an amount that the content of ninhydrin in the final solution is from 0.01 to 0.03%; subsequent heating of the resulting solution in a water bath at 95-105 ° C for 15-25 minutes; the addition of cetylpyridinium chloride in an amount ensuring its content in solution in a concentration after a critical micelle concentration, 0.1-0.4%; subsequent measurement of the absorption spectrum of the resulting solution; detection of lysine in solution by the presence of a maximum at a wavelength of λ _max = 480 nm.