RU2484096C1 - SINGLE-DOMAIN ANTIBODY aMts1 SPECIFICALLY BINDING PROTEIN S100A4/Mts1, METHOD FOR PREPARING AND USING FOR DETECTION OF THIS PROTEIN - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: what is presented is a single-domain nanoantibody aMTS1 specifically binding the human and mice proteins S100A4/Mts1 with the characterised amino acid and nucleotide sequences, as well as using it for the purpose of detection of the protein S100A4/Mts1 in human and mice biological fluids.

EFFECT: invention can find further application in therapy of the S100-mediated diseases.

2 cl, 4 dwg, 4 ex

Description

Область техники настоящего изобретенияThe technical field of the present invention

Настоящее изобретение относится к области молекулярной иммунологии, биотехнологии и медицины.The present invention relates to the field of molecular immunology, biotechnology and medicine.

Предшествующий уровень техникиState of the art

Белок S100A4, также известный как mts1, p9Ka, CAPL, calvasculin, pEL98, metastasin, 18A2, 4А2, был идентифицирован в конце 1980-х - начале 1990-х годов в различных клеточных системах. Он принадлежит семейству, состоящему из примерно 21 различных белков небольшого размера (10-12 кДа), связывающих Ca²⁺ и обычно существующих в клетке в виде гомо- или гетеродимеров. Предполагают также существование этих белков в виде мультимерных форм, что может быть важно для их некоторых внеклеточных функций. S100-белки не обладают энзиматической активностью, и их функции обусловлены взаимодействиями с другими белками, ведущими к модулированию активности этих белков. Выраженные измененные экспрессионные уровни S100-белков были выявлены в случае ряда заболеваний человека, таких как различные типы рака, воспалительные нарушения, кардиомиопатии, нейродегенеративные нарушения. Белок S100A4 привлекает в последние годы особое внимание, в первую очередь, в связи с его свойством способствовать процессу метастазирования [Boye and Maelandsmo. S100A4 and metastasis (review). Am. J. Pathol. (2010) 178: 528-535]. Этот белок локализуется в ядре, цитоплазме и внеклеточном пространстве во многих типах клеток и участвует в большом разнообразии биологических процессов, таких как регуляция ангиогенеза (за счет превращения плазминогена в плазмин), процессах заживления и выживания, а также мобильности и инвазивности клеток, путем индукции ЕМТ-тирозин киназы и в регуляции апоптоза.Protein S100A4, also known as mts1, p9Ka, CAPL, calvasculin, pEL98, metastasin, 18A2, 4A2, was identified in the late 1980s and early 1990s in various cellular systems. It belongs to a family of approximately 21 different small-sized proteins (10-12 kDa) that bind Ca ²⁺ and usually exist in the cell as homo- or heterodimers. They also suggest the existence of these proteins in the form of multimeric forms, which may be important for some of their extracellular functions. S100 proteins do not have enzymatic activity, and their functions are due to interactions with other proteins leading to modulation of the activity of these proteins. Pronounced altered expression levels of S100 proteins were detected in the case of a number of human diseases, such as various types of cancer, inflammatory disorders, cardiomyopathies, and neurodegenerative disorders. Protein S100A4 has attracted special attention in recent years, primarily in connection with its property to contribute to the process of metastasis [Boye and Maelandsmo. S100A4 and metastasis (review). Am. J. Pathol. (2010) 178: 528-535]. This protein is localized in the nucleus, cytoplasm and extracellular space in many types of cells and is involved in a wide variety of biological processes, such as regulation of angiogenesis (due to the conversion of plasminogen to plasmin), healing and survival, as well as cell mobility and invasiveness, by inducing EMT -tyrosine kinase and in the regulation of apoptosis.

Одним из возможных механизмов стимулирования развития опухоли и ее метастазирования белком S100A4 может быть его взаимодействие с лигандами рецепторов эпидермальных факторов роста, такими как амфирегулин. Было продемонстрировано, что S100A4 специфически связывается с амфирегулином и образовавшийся гетеродимер связывается с EGFR/ErbB2-рецепторами, что приводит к активизации соответствующего опосредованного этими рецепторами сигнального каскада и усиливает амфирегулин-зависимую пролиферацию мышиных эмбриональных фибробластов [Klingelhofer et al. Epidermal growth factor receptor ligands as new extracellular targets for the metastasis-promoting S100A4 protein. FEBS J. (2009) 276: 5936-5948]. Уже имеются многочисленные экспериментальные данные, с участием S100A4. Очевидно, что S100A4 является одним из важнейших факторов, стимулирующих метастазирование опухолей, что является следствием его суммарного стимулирующего действия на процессы повышения мобильности и инвазивности клеток, а также на процесс ангиогенеза. Многочисленные исследования последних лет убедительно продемонстрировали, что белок S100A4 является важным диагностическим маркером и важной мишенью для разработки новых терапевтических препаратов.One of the possible mechanisms for stimulating the development of a tumor and its metastasis with the S100A4 protein may be its interaction with epidermal growth factor receptor ligands such as amphiregulin. It was demonstrated that S100A4 specifically binds to amphiregulin and the resulting heterodimer binds to EGFR / ErbB2 receptors, which activates the corresponding mediated signaling cascade of these receptors and enhances the amphiregulin-dependent proliferation of mouse embryonic fibroblasts [Klingelhofer et al. Epidermal growth factor receptor ligands as new extracellular targets for the metastasis-promoting S100A4 protein. FEBS J. (2009) 276: 5936-5948]. Numerous experimental data are already available involving S100A4. Obviously, S100A4 is one of the most important factors stimulating tumor metastasis, which is a consequence of its total stimulating effect on the processes of increasing cell mobility and invasiveness, as well as on the process of angiogenesis. Numerous studies in recent years have convincingly demonstrated that S100A4 protein is an important diagnostic marker and an important target for the development of new therapeutic drugs.

В последние годы все большее внимание при создании новых диагностических и терапевтических препаратов для выявления и лечения многих болезней уделяется препаратам на основе антител, как правило, моноклональных классических антител. Антитело способно специфически связывать определенный антиген/белок, как свободный или находящийся в комплексе с другими молекулами, так и белок, оверэкспрессированный и локализующийся на поверхности клетки определенного типа. Такое связывание может блокировать важный биологический процесс, каскад, а также стимулировать иммунную систему пациента атаковать клетки, с которыми связалось антитело. Антитело может быть также средством специфической доставки других терапевтических молекул, субстанций или радиоизотопов. Наконец, возможно использование ди- и полифункциональных и многокомпонентных конструкций на основе получаемых антител или их производных. Ранее неоднократно уже предпринимались попытки получить антитела, связывающиеся с белком S100A4. В качестве ближайших аналогов технического решения, составляющих основу настоящего изобретения, можно привести следующие два примера.In recent years, more and more attention when creating new diagnostic and therapeutic drugs for the detection and treatment of many diseases has been given to drugs based on antibodies, usually monoclonal classical antibodies. An antibody is capable of specifically binding a specific antigen / protein, both free or complexed with other molecules, and a protein that is overexpressed and localized on the surface of a cell of a certain type. Such binding can block an important biological process, a cascade, and also stimulate the patient’s immune system to attack the cells that the antibody has bound to. An antibody may also be a specific delivery vehicle for other therapeutic molecules, substances or radioisotopes. Finally, it is possible to use di- and multifunctional and multicomponent constructs based on the resulting antibodies or their derivatives. Attempts have repeatedly been made to obtain antibodies that bind to S100A4 protein. As the closest analogues of the technical solutions that form the basis of the present invention, the following two examples can be given.

Патент WO 2000064475 («Treatment of metastatic cancer through mts-1 gene», 23.04.1999 г.). В данном патенте заявлено получение моноклональных и поликлональных антител, связывающих белок mts-1 (он же - S100A4), с целью как диагностики злокачественных опухолей, так и воздействия на опухоль через связывание с mts-1 антитела, конъюгированного с токсином.Patent WO 2000064475 ("Treatment of metastatic cancer through mts-1 gene", 04/23/1999). This patent claims the production of monoclonal and polyclonal antibodies that bind the mts-1 protein (aka S100A4), for the purpose of both diagnosing malignant tumors and affecting the tumor through binding of a toxin conjugated antibody to mts-1.

Патент WO 2011157724 («S100A4 Antibodies and therapeutic uses thereof», 14.06.2011 г.). В данном патенте заявлено получение моноклональных антител к двум определенным пептидным участкам белка S100A4, а также использование этих антител, их фрагментов и конъюгатов с различными веществами как для диагностики, так и для лечения болезней, ассоциированных с метастазированием, нежелательным ангиогенезом и болезней, ассоциированных с воспалением.Patent WO 2011157724 ("S100A4 Antibodies and therapeutic uses thereof", 06/14/2011). This patent claims the production of monoclonal antibodies to two specific peptide regions of the S100A4 protein, as well as the use of these antibodies, their fragments and conjugates with various substances both for the diagnosis and treatment of diseases associated with metastasis, unwanted angiogenesis and diseases associated with inflammation .

Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по составу действующего вещества и способу его использования выбрано авторами настоящего изобретения за прототип.This technical solution as the closest to the claimed by the composition of the active substance and the method of its use is selected by the authors of the present invention for the prototype.

Недостатками прототипа являются:The disadvantages of the prototype are:

- Относительно дорогостоящее производство антител, сложность поддержания и хранения продуцента, очень высокие требования к качеству используемых реактивов и условий культивирования.- Relatively expensive production of antibodies, the difficulty of maintaining and storing the producer, very high requirements for the quality of the reagents used and the cultivation conditions.

- Относительно большой размер получаемых антител, что влечет за собой пониженную проницаемость тканей.- The relatively large size of the resulting antibodies, which entails reduced tissue permeability.

- Структурные особенности накладывают ограничение на узнавание некоторых «скрытых» эпитопов, находящихся, например, в углублениях, щелях малого размера в структуре белков.- Structural features impose a restriction on the recognition of some "hidden" epitopes located, for example, in recesses, small gaps in the structure of proteins.

- Ограниченность и относительная трудоемкость генно-инженерных манипуляций, адаптации для конкретных задач, сложность создания многовалентных и многофункциональных производных заявленных антител.- The limited and relative complexity of genetic engineering manipulations, adaptation for specific tasks, the complexity of creating multivalent and multifunctional derivatives of the claimed antibodies.

Таким образом, в уровне техники существует потребность в разработке новых антител (антиген-узнающих молекул), лишенных указанных выше недостатков и специфически узнающих белок S100A4.Thus, in the prior art there is a need for the development of new antibodies (antigen-recognizing molecules), devoid of the above disadvantages and specifically recognizing S100A4 protein.

Задачей настоящего изобретения является создание новых антител, способных эффективно связывать белок S100A4, получение этих антител, производство и хранение которых должно быть экономичным. Новые антитела должны быть эффективны и относительно просты; их размер должен быть в несколько раз меньше, чем у классических антител.The present invention is the creation of new antibodies that can efficiently bind the S100A4 protein, the production of these antibodies, the production and storage of which should be economical. New antibodies must be effective and relatively simple; their size should be several times smaller than that of classical antibodies.

Техническая задача решается за счет того, что получено однодоменное антитело, специфически связывающее белки S100A4/Mts1 человека и мыши и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.The technical problem is solved due to the fact that a single-domain antibody is obtained that specifically binds human and mouse S100A4 / Mts1 proteins and has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

Заявленное однодоменное антитело применяют для детекции белка S100A4/Mts1 в биологических жидкостях человека и мыши.The claimed single domain antibody is used to detect S100A4 / Mts1 protein in human and mouse biological fluids.

В основе настоящего изобретения находятся не классические бивалентные антитела, которые рассматриваются в качестве прототипа, а малые однодоменные наноантитела, которые имеют ряд преимуществ по сравнению с классическими моноклональными антителами для практического применения в области терапии заболеваний. Поскольку наноантитела (молекулярная масса около 12-15 кДа) на порядок меньше по размеру традиционных классических антител, они приобретают ряд новых положительных качеств, имеющих практическую значимость. Наноантитела могут обладать новыми структурными особенностями, в принципе позволяющими им узнавать некоторые «скрытые» для обычных антител эпитопы. Существуют эффективные способы получения (и селекции) таких антител в отношении различных (в том числе низкоиммуногенных) антигенов.The basis of the present invention are not classical bivalent antibodies, which are considered as a prototype, but small single-domain nanoantibodies, which have several advantages compared to classical monoclonal antibodies for practical use in the treatment of diseases. Since nanoantibodies (molecular weight of about 12-15 kDa) are an order of magnitude smaller in size of traditional classical antibodies, they acquire a number of new positive qualities of practical importance. Nanoantibodies may possess new structural features that, in principle, allow them to recognize some epitopes that are “hidden” for ordinary antibodies. There are effective ways to obtain (and select) such antibodies against various (including low immunogenic) antigens.

Полным эквивалентом термина "однодоменные наноантитела" для целей настоящего изобретения является вошедшее в широкое употребление обозначение «нанотело», введенное фирмой ABLYNX, а также «однодоменное мини-антитело».The full equivalent of the term "single-domain nanoantibodies" for the purposes of the present invention is the widely used designation "nano-body", introduced by ABLYNX, as well as "single-domain mini-antibody".

Рекомбинантные однодоменные наноантитела получают на основе особых неканонических одноцепочечных антител, существующих в норме наряду с классическими антителами у животных семейства Верблюдовых (и у некоторых видов хрящевых рыб). Эти особые антитела состоят из димера только одной укороченной (без первого константного района СН1) тяжелой цепи иммуноглобулина и полнофункциональны в отсутствие легкой цепи иммуноглобулина. Для собственно специфического узнавания и связывания антигена при этом необходим и достаточен лишь один вариабельный домен (VHH, «наноантитело», «nanobody» или однодоменное наноантитело) этого антитела. Организация вариабельных доменов (VHH) неканонических антител в значительной степени подобна той, что у вариабельных доменов (VH) классических антител (у человека VH-домены иммуноглобулинов подкласса lgG3 имеют особо выраженную гомологию с VH и VHH верблюдовых). В обоих случаях V-домены состоят из четырех консервативных каркасных участков (FR, «framework regions»), окружающих три гипервариабельных участка (определяющие комплементарность, CDR, от «complementarity determining regions»). В обоих случаях домены формируют типичную для V-домена иммуноглобулина пространственную структуру из двух бета-слоев (-листов), один - из четырех аминокислотных цепочек и второй - из пяти [Padlan Е.А. X-Ray crystallography of antibodies. Adv. Protein Chem. 1996; 49: 57-133. Muyldermans S., Cambillau C., Wyns L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains/ «Узнавание антигенов фрагментами однодоменных антител: избыточная роскошь спаренных доменов». TIBS 2001; 26: 230-235]. В этой структуре все три гипервариабельных участка кластеризуются с одной стороны V-домена (где они участвуют в узнавании антигена) и располагаются в петлях, соединяющих бета-структуры. Однако имеются и важные отличия, связанные с функционированием VHH в формате одного домена. Так, гипервариабельные участки CDR1 и CDR3 заметно увеличены в случае VHH. Часто в гипервариабельных участках VHH обнаруживаются цистеиновые остатки, причем присутствующие сразу в двух участках (чаще всего в CDR1 и CDR3, реже - в CDR2 и CDR3). При исследовании кристаллических структур VHH было показано, что эти цистеиновые остатки формируют дисульфидные связи, что приводит к дополнительной стабилизации структуры петель данного антигена. Наиболее явным и воспроизводимым отличительным признаком VHH являются четыре замены гидрофобных аминокислотных остатков на гидрофильные во втором каркасном участке (Val37Phe, Gly44Glu, Leu45Arg, Trp47Gly, согласно нумерации Кабат). Этот каркасный участок в случае VH домена является высоко консервативным, обогащен гидрофобными аминокислотными остатками и особо важен для образования связи с вариабельным доменом VL легкой цепи. VHH-домен в этом плане сильно отличается: указанные замены гидрофобных аминокислот на гидрофильные делают невозможной ассоциацию VHH и VL. Эти замены также объясняют высокую растворимость VHH, наноантитела, когда его получают в виде рекомбинантного белка [Тиллиб С.В. «Верблюжьи наноантитела» - эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. Молекулярная биология 2011; 45(1): 77-85.].Recombinant single-domain nanoantibodies are obtained on the basis of special non-canonical single-chain antibodies that exist normally along with classical antibodies in animals of the Camelidae family (and in some species of cartilaginous fish). These specific antibodies consist of a dimer of only one shortened (without the first constant region CH1) immunoglobulin heavy chain and are fully functional in the absence of an immunoglobulin light chain. For the specific recognition and binding of antigen proper, only one variable domain (VHH, "nanoantibody", "nanobody" or single domain nanoantibody) of this antibody is necessary and sufficient. The organization of the variable domains (VHH) of noncanonical antibodies is substantially similar to that of the variable domains (VH) of classical antibodies (in humans, the VH domains of immunoglobulins of the IgG3 subclass have a particularly pronounced homology with camelid VH and VHH). In both cases, V-domains consist of four conservative framework regions (FR, “framework regions”) surrounding three hypervariable regions (determining complementarity, CDR, from “complementarity determining regions”). In both cases, the domains form a spatial structure typical of the immunoglobulin V domain of two beta layers (sheets), one of four amino acid chains and the second of five [Padlan E.A. X-Ray crystallography of antibodies. Adv. Protein Chem. 1996; 49: 57-133. Muyldermans S., Cambillau C., Wyns L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains / "Recognition of antigens by fragments of single-domain antibodies: excessive luxury of paired domains." TIBS 2001; 26: 230-235]. In this structure, all three hypervariable regions are clustered on one side of the V domain (where they are involved in antigen recognition) and are located in loops connecting the beta structures. However, there are important differences associated with the functioning of VHH in a single domain format. Thus, the hypervariable regions of CDR1 and CDR3 are markedly increased in the case of VHH. Often, cysteine residues are found in the hypervariable regions of VHH, moreover, they are present in two regions at once (most often in CDR1 and CDR3, less often in CDR2 and CDR3). When studying the crystal structures of VHH, it was shown that these cysteine residues form disulfide bonds, which leads to additional stabilization of the loop structure of this antigen. The most obvious and reproducible hallmark of VHH are four hydrophobic amino acid residues replaced by hydrophilic ones in the second frame region (Val37Phe, Gly44Glu, Leu45Arg, Trp47Gly, according to Kabat numbering). In the case of the VH domain, this framework region is highly conserved, enriched in hydrophobic amino acid residues, and is especially important for linking with the variable domain of the VL light chain. The VHH domain in this regard is very different: the indicated substitutions of hydrophobic amino acids for hydrophilic ones make the association of VHH and VL impossible. These substitutions also explain the high solubility of VHH, a nanoantibody, when it is obtained as a recombinant protein [Tillib S.V. “Camel Nanoantibodies” is an effective tool for research, diagnosis and therapy. Molecular Biology 2011; 45 (1): 77-85.].

По сравнению с традиционными и чисто рекомбинантными антителами верблюжьи наноантитела обладают рядом преимуществ, что позволяет предполагать большой потенциал их будущего использования в различных исследованиях и при создании новых биотехнологических устройств, а также в клинических целях для диагностики и лечения заболеваний.In comparison with traditional and purely recombinant antibodies, camel nanoantibodies have several advantages, which suggests a great potential for their future use in various studies and in the creation of new biotechnological devices, as well as for clinical purposes for the diagnosis and treatment of diseases.

Характерными особенностями однодоменных наноантител, определяющими большой потенциал их использования для самых разнообразных практических приложений в иммунобиотехнологии, являются следующие [см. обзор; Тиллиб С.В. «Верблюжьи наноантитела» - эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. Молекулярная биология 2011; 45(1): 77-85.].The characteristic features of single-domain nanoantibodies that determine the great potential for their use for a wide variety of practical applications in immunobiotechnology are the following [see overview; Tillib S.V. “Camel Nanoantibodies” is an effective tool for research, diagnosis and therapy. Molecular Biology 2011; 45 (1): 77-85.].

- Наличие высокоэффективного способа генерирования и селекции наноантител.- The presence of a highly efficient method for the generation and selection of nanoantibodies.

- Малый размер, ~2×4 нм, 13-15 кДа (улучшенная проницаемость клеток).- Small size, ~ 2 × 4 nm, 13-15 kDa (improved cell permeability).

- Структурные особенности (способность образовывать необычные для классических антител паратопы, позволяющие связываться с углублениями и активными центрами белков); могут использоваться для выявления «скрытых» эпитопов или эпитопов, которые не могут быть узнаны существенно более крупными обычными антителами.- Structural features (the ability to form paratopes unusual for classical antibodies, allowing them to bind to recesses and active centers of proteins); can be used to identify “hidden” epitopes or epitopes that cannot be recognized by significantly larger conventional antibodies.

- Высокий экспрессионный выход, экономичность наработки в больших количествах. Обычно наноантитела нарабатывают в периплазме бактерий E.coli (в количестве 1-10 мг из 1 литра культуры). Продемонстрирована возможность их эффективной наработки в дрожжах, растениях и клетках млекопитающих.- High expression yield, cost-effective production in large quantities. Typically, nanoantibodies are produced in the periplasm of E. coli bacteria (in an amount of 1-10 mg from 1 liter of culture). The possibility of their effective production in yeast, plants and mammalian cells is demonstrated.

- Простота всевозможных генно-инженерных манипуляций, адаптации для конкретных задач, возможность создания многовалентных и многофункциональных производных.- The simplicity of all kinds of genetic engineering manipulations, adaptation for specific tasks, the ability to create multivalent and multifunctional derivatives.

- Низкая иммуногенность; возможность экономично «гуманизировать» антитела без заметной потери их специфической активности.- Low immunogenicity; the ability to economically "humanize" antibodies without a noticeable loss of their specific activity.

Возможность получения рекомбинантных однодоменных наноантител с заданной специфичностью определяется существованием у представителей семейства Camelidae функциональных и обладающих достаточно широким спектром узнавания неканонических антител. Неканонические антитела состоят из димера только одной укороченной тяжелой цепи иммуноглобулина (без легких цепей), специфичность узнавания которых определяется лишь одним вариабельным доменом [Hamers-Casterman С, Atarhouch Т, Muyldermans S, et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains./ «Существующие в природе антитела без легких цепей». Nature 1993; 363:446-448]. Техническая реализация отбора однодоменных наноантител, являющихся генно-инженерными производными антиген-распознающих доменов одноцепочечных антител верблюда, основана на высокоэффективной процедуре селекции антиген-узнающих полипептидов, экспонированных на поверхности частицы нитчатого фага («фаговый дисплей»).The possibility of obtaining recombinant single-domain nanoantibodies with a given specificity is determined by the existence of functional and possessing a fairly wide recognition spectrum of noncanonical antibodies in representatives of the Camelidae family. Noncanonical antibodies consist of a dimer of only one shortened immunoglobulin heavy chain (without light chains), the recognition specificity of which is determined by only one variable domain [Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains./ "Existing antibodies without light chains." Nature 1993; 363: 446-448]. The technical implementation of the selection of single-domain nanoantibodies, which are genetically engineered derivatives of antigen-recognizing domains of single-chain camel antibodies, is based on a highly efficient selection procedure for antigen-recognizing polypeptides exposed on the surface of a filamentous phage particle (“phage display”).

Метод фагового дисплея является весьма эффективной и широко используемой технологией для функционального отбора из больших рекомбинантных библиотек последовательностей ДНК, кодирующих пептиды и белки, обладающие заданными свойствами и экспрессирующиеся в составе поверхностного белка нитчатых фагов [Brissette R & Goldstein Nl. The use of phage display peptide libraries for basic and translational research. / «Использование пептидных фагово-дисплейных библиотек для фундаметальных исследований и исследований трансляции». Methods Mol Biol. 2007; 383:203-13; Sidhu SS & Koide S. Phage display for engineering and analyzing protein interaction interfaces./ «Фаговый дисплей для конструирования и анализа взаимодействий белковых доменов». Curr Opin Struct Biol. 2007; 17:481-7]. Одно из особо важных приложений этой технологии - генерирование специфических рекомбинантных антител для самых различных антигенов [Hoogenboom HR. Selecting and screening recombinant antibody libraries./ «Селекция и анализ библиотек рекомбинантных антител». Nat Biotechnol. 2005; 23:1105-16]. Обычно, вместо больших целых молекул классических антител для экспонирования на поверхности фага используют гибридные рекомбинантные одноцепочечные белки, представляющие собой случайные комбинации клонированных последовательностей вариабельных районов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, соединенные короткой серин/глицин-богатой линкерной последовательностью. Такая химерная молекула, в случае правильного сочетания доменов, способна сохранять специфичность исходного иммуноглобулина, несмотря на введенные по сравнению с нативной молекулой антител изменениями. Одной из проблем традиционных рекомбинантных технологий является необходимость работы с очень большими библиотеками рекомбинантных антител, в которых должны быть представлены всевозможные комбинации двух случайных вариабельных районов (тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов), соединенных линкерной последовательностью. Помимо проблемы представленности здесь также очевидна и проблема формирования правильной относительной конформации этих двух доменов, а также проблема растворимости индивидуальных вариабельных доменов, которые часто имеют тенденцию к аггрегации. Упомянутые проблемы возможно избежать при использовании однодоменных наноантител, так как практически каждый клонированный вариабельный домен одноцепочечных антител будет в этом случае обладать определенной антиген-узнающей специфичностью, соответствующей одному из антител иммунизированного животного, и можно эффективно проводить селекцию из относительно небольших библиотек таких доменов.The phage display method is a very effective and widely used technology for the functional selection from large recombinant libraries of DNA sequences encoding peptides and proteins that have desired properties and are expressed as part of the surface protein of filamentous phages [Brissette R & Goldstein Nl. The use of phage display peptide libraries for basic and translational research. / "The use of peptide phage-display libraries for basic research and translation research." Methods Mol Biol. 2007; 383: 203-13; Sidhu SS & Koide S. Phage display for engineering and analyzing protein interaction interfaces./ "Phage display for the construction and analysis of protein domain interactions." Curr Opin Struct Biol. 2007; 17: 481-7]. One of the most important applications of this technology is the generation of specific recombinant antibodies for a wide variety of antigens [Hoogenboom HR. Selecting and screening recombinant antibody libraries./ "Selection and analysis of recombinant antibody libraries." Nat Biotechnol. 2005; 23: 1105-16]. Usually, instead of large whole molecules of classical antibodies, hybrid recombinant single-stranded proteins are used to display on the phage surface, which are random combinations of cloned sequences of the variable regions of the heavy and light chains of immunoglobulins connected by a short serine / glycine-rich linker sequence. Such a chimeric molecule, in the case of a correct combination of domains, is able to maintain the specificity of the initial immunoglobulin, despite changes introduced in comparison with the native antibody molecule. One of the problems of traditional recombinant technologies is the need to work with very large libraries of recombinant antibodies, in which all possible combinations of two random variable regions (heavy and light chains of immunoglobulins) connected by a linker sequence should be presented. In addition to the problem of representation, the problem of the formation of the correct relative conformation of these two domains is also obvious, as well as the solubility of individual variable domains, which often tend to aggregate. The mentioned problems can be avoided by using single-domain nanoantibodies, since almost every cloned variable domain of single-chain antibodies in this case will have a certain antigen-recognizing specificity corresponding to one of the antibodies of the immunized animal, and selection from relatively small libraries of such domains can be effectively performed.

Однодоменные наноантитела с заданной специфичностью или их производные могут использоваться, как и классические антитела, в различных приложениях, включающих в себя, но не ограниченных, детекцией антигенов (как в исследовательских, так и в диагностических целях), блокированием активности белка-антигена, специфической доставкой за счет связывания с антигеном желаемых молекул, конъюгированных с антителом. Также, однодоменные наноантитела могут быть исходными модулями (блоками) более сложных многомодульных препаратов. Возможно объединение в одном мультивалентном производном двух, трех и более моновалентных первичных однодоменных наноантител. Эти объединяемые в одну конструкцию однодоменные наноантитела могут связываться как с одним и тем же эпитопом антигена-мишени, так и с его разными эпитопами, или даже с различными антигенами-мишенями. Возможно также: комбинированное объединение в одну конструкцию однодоменных наноантител и других молекул или лекарств с получением многофункциональных препаратов [Conrath КЕ, Lauwereys M, Wyns L, Muyldermans S. Camel single-domain antibodies as modular building units in bispecific and bivalent antibody constructs./ «Верблюжьи однодоменные антитела в качестве модулярных строительных единиц в биспецифичных и бивалентных конструкциях антител». J Biol Chem. 2001 Mar 9; 276 (10): 7346-50; Zhang J, Tanha J, Hirama T, Khieu NH, To R, Tong-Sevinc H, Stone E, Brisson JR, MacKenzie CR. Pentamerization of single-domain antibodies from phage libraries: a novel strategy for the rapid generation of high-avidity antibody reagents. / «Пентамеризация однодоменных антител из фаговых библиотек: новая стратегия быстрого получения реагентов антител с высокой авидностью». J Mol Biol. 2004 Jan 2; 335 (1): 49-56; Cortez-Retamozo V, Backmann N, Senter PD, Wernery U, De Baetselier P, Muyldermans S, Revets H. Efficient cancer therapy with a nanobody-based conjugate. / «Эффективная раковая терапия конъюгатами на основе нанотел». Cancer Res. 2004 Apr 15; 64 (8): 2853-7; Baral TN, Magez S, Stijlemans B, Conrath K, Vanhollebeke B, Pays E, Muyldermans S, De Baetselier P. Experimental therapy of African trypanosomiasis with a nanobody-conjugated human trypanolytic factor./ «Экспериментальная терапия африканской трипаносомии с помощью человеческого трипанолитического фактора, конъюгированного с нанотелом». Nat. Med. 2006 May; 12 (5): 580-4; Coppieters К, Dreier Т, Silence К, Haard HD, Lauwereys M, Casteels P, Beirnaert E, Jonckheere H, Wiele CV, Staelens L, Hostens J, Revets H, Remaut E, Elewaut D, Rottiers P. Formatted anti-tumor necrosis factor alpha VHH proteins derived from camelids show superior potency and targeting to inflamed joints in a murine model of collagen-induced arthritis. / «Форматированные анти-TNFalpha VHH-белков, выделенные из верблюдовых, демонстрируют высокое сродство к воспаленным суставам в мышиной модели коллаген-индуцированного артрита». Arthritis Rheum. 2006 Jun; 54 (6): 1856-66]; мультимеризация с помощью введения дополнительных аминокислотных последовательностей взаимодействующих белковых доменов, таких как лейциновые зипперы [Harbury P.В., Zhang T., Kim P.S., et al. A switch between two-, three- and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants. / «Переключение между двух-, трех- и четырех-цепочечными спиральными структурами в мутантах GCN4-«лейциновой молнии»». Science, 1993, 262:1401-1407; Shirashi Т., Suzuyama K., Okamoto H. et al. Increased cytotoxicity of soluble Fas ligand by fusing isoleucine zipper motif. / «Усиленная цитотоксичность растворимого Fas-лиганда вследствие его соединения с мотивом «изолейциновой молнии». Biochem. Biophys. Res. Communic. 2004, 322: 197-202; Chenchik A., Gudkov A., Komarov A., Natarajan V. Reagents and methods for producing bioactive secreted peptides. / «Реагенты и методы для получения биоактивных секретируемых пептидов». 2010. US Patent Application 20100305002], или последовательностей небольших белков, образующих стабильные комплексы [Deyev SM, Waibel R, Lebedenko EN, Schubiger AP, Plückthun A. Design of multivalent complexes using the barnase*barstar module./ «Дизайн мультивалентных комплексов используя модуль барназа-барстар». Nat Biotechnol. 2003, 21(12):1486-92.].Single-domain nanoantibodies with a given specificity or their derivatives can be used, like classical antibodies, in various applications, including, but not limited to, the detection of antigens (both for research and diagnostic purposes), blocking the activity of antigen protein, specific delivery by binding to the antigen of the desired molecules conjugated to the antibody. Also, single-domain nanoantibodies can be the original modules (blocks) of more complex multimodule preparations. It is possible to combine in one multivalent derivative two, three or more monovalent primary single-domain nanoantibodies. These single domain nanoantibodies combined into a single construction can bind both to the same epitope of the target antigen and to its different epitopes, or even to different target antigens. It is also possible: combining single domain nanoantibodies and other molecules or drugs into one design to produce multifunctional drugs [Conrath KE, Lauwereys M, Wyns L, Muyldermans S. Camel single-domain antibodies as modular building units in bispecific and bivalent antibody constructs./ " "Camel single-domain antibodies as modular building units in bispecific and bivalent antibody constructs." J Biol Chem. 2001 Mar 9; 276 (10): 7346-50; Zhang J, Tanha J, Hirama T, Khieu NH, To R, Tong-Sevinc H, Stone E, Brisson JR, MacKenzie CR. Pentamerization of single-domain antibodies from phage libraries: a novel strategy for the rapid generation of high-avidity antibody reagents. / "Pentamerization of single-domain antibodies from phage libraries: a new strategy for the rapid production of antibody reagents with high avidity." J Mol Biol. 2004 Jan 2; 335 (1): 49-56; Cortez-Retamozo V, Backmann N, Senter PD, Wernery U, De Baetselier P, Muyldermans S, Revets H. Efficient cancer therapy with a nanobody-based conjugate. / "Effective Cancer Therapy with Nanobody Conjugates." Cancer Res. 2004 Apr 15; 64 (8): 2853-7; Baral TN, Magez S, Stijlemans B, Conrath K, Vanhollebeke B, Pays E, Muyldermans S, De Baetselier P. Experimental therapy of African trypanosomiasis with a nanobody-conjugated human trypanolytic factor./ "Experimental therapy of African trypanosomy using human trypanolytic factor conjugated to a nanobody. " Nat. Med. 2006 May; 12 (5): 580-4; Coppieters K, Dreier T, Silence K, Haard HD, Lauwereys M, Casteels P, Beirnaert E, Jonckheere H, Wiele CV, Staelens L, Hostens J, Revets H, Remaut E, Elewaut D, Rottiers P. Formatted anti-tumor necrosis factor alpha VHH proteins derived from camelids show superior potency and targeting to inflamed joints in a murine model of collagen-induced arthritis. / "Formatted anti-TNFalpha VHH proteins isolated from camelids show a high affinity for sore joints in a mouse model of collagen-induced arthritis." Arthritis Rheum. 2006 Jun; 54 (6): 1856-66]; multimerization by introducing additional amino acid sequences of interacting protein domains, such as leucine zippers [Harbury P.V., Zhang T., Kim P.S., et al. A switch between two-, three- and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants. / "Switching between two-, three- and four-chain helical structures in mutants of GCN4-" leucine zipper "." Science, 1993, 262: 1401-1407; Shirashi T., Suzuyama K., Okamoto H. et al. Increased cytotoxicity of soluble Fas ligand by fusing isoleucine zipper motif. / “Enhanced cytotoxicity of soluble Fas ligand due to its combination with the“ isoleucine zipper ”motif. Biochem. Biophys. Res. Communic. 2004, 322: 197-202; Chenchik A., Gudkov A., Komarov A., Natarajan V. Reagents and methods for producing bioactive secreted peptides. / "Reagents and methods for producing bioactive secreted peptides." 2010. US Patent Application 20100305002], or sequences of small proteins forming stable complexes [Deyev SM, Waibel R, Lebedenko EN, Schubiger AP, Plückthun A. Design of multivalent complexes using the barnase * barstar module./ "Design of multivalent complexes using the module Barnase-barstar. " Nat Biotechnol. 2003, 21 (12): 1486-92.].

Также было показано [Vincke С., Loris R., Saerens D., et al. // J.Biol. Chem. 2009. V.284. №5. P.3273-3284], что можно «гуманизировать» такие верблюжьи наноантитела без заметной потери их специфической активности, проведя небольшое число точечных замен аминокислот. Это открывает потенциальную возможность широкого использования наноантител в качестве средств пассивной иммунизации для предотвращения развития различных опасных инфекционных заболеваний [Wesolowski J., Alzogaray V., Reyelt J. et al. Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. / «Однодоменные антитела; многообещающие экспериментльные и терапевтические инструменты в области инфекции и иммунитета». Med. Microbiol. Immunol. 2009; 198, 157-174.].It was also shown [Vincke C., Loris R., Saerens D., et al. // J. Biol. Chem. 2009. V.284. No. 5. P.3273-3284] that it is possible to “humanize” such camel nanoantibodies without a noticeable loss of their specific activity by making a small number of point substitutions of amino acids. This opens up the potential for widespread use of nanoantibodies as passive immunization agents to prevent the development of various dangerous infectious diseases [Wesolowski J., Alzogaray V., Reyelt J. et al. Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. / "Single domain antibodies; promising experimental and therapeutic tools in the field of infection and immunity. " Med. Microbiol. Immunol. 2009; 198, 157-174.].

Раскрытие настоящего изобретенияDisclosure of the present invention

Способ получения наноантител, связывающих антигенные эпитопы белка S100A4, включает следующие принципиальные этапы:The method for producing nanoantibodies binding antigenic epitopes of S100A4 protein includes the following principal steps:

1) индукция образования специфических антител в результате иммунизации представителя семейства Верблюдовых (в частности, двугорбого верблюда) рекомбинантными белками, полностью соответствующими по аминокислотной последовательности белкам S100A4 человека и мыши;1) the induction of the formation of specific antibodies as a result of immunization of a member of the Camelidae family (in particular, the two-humped camel) with recombinant proteins that are fully consistent in amino acid sequence with human and mouse S100A4 proteins;

2) клонирование последовательностей антиген-узнающих доменов (наноантител) особых одноцепочечных антител, синтезирующихся в лимфоцитах иммунизированного животного, в фагмидном векторе (использующемся в последующей процедуре фагового дисплея), получение специфически обогащенной библиотеки последовательностей, кодирующих наноантитела;2) cloning the sequences of antigen-recognizing domains (nanoantibodies) of specific single-chain antibodies synthesized in the lymphocytes of the immunized animal in the phagemid vector (used in the subsequent phage display procedure), obtaining a specifically enriched library of sequences encoding nanoantibodies;

3) селекция методом фагового дисплея (функционального отбора фаговых частиц, несущих на поверхности экспрессируемое наноантитело, а внутри - ДНК, кодурующую это наноантитело) клонов наноантител, связывающихся с заданным антигеном, белком S100A4, из полученной библиотеки наноантител;3) selection by the phage display method (functional selection of phage particles carrying the expressed nanoantibody on the surface, and inside the DNA that encodes this nanoantibody) of nanoantibody clones that bind to a given antigen, protein S100A4, from the obtained nanoantibody library;

4) проведение переклонирования и генно-инженерных модификаций кодирующих последовательностей отобранных наноантител с целью их эффективной наработки в бактериальной системе экспрессии и последующей эффективной очистки (в качестве продуцента действующего вещества используются бактерии E.coli).4) carrying out the cloning and genetic engineering modifications of the coding sequences of the selected nanoantibodies with the aim of their effective production in the bacterial expression system and subsequent effective purification (E. coli bacteria are used as the producer of the active substance).

В качестве антигена для иммунизации и селекции использовали рекомбинантные белки, наработанные в бактериях Е.coli. Для этого нуклеотидные последовательности, идентичные тем, что кодируют белки S100A4/Mts1 человека и мыши, были получены с помощью ПЦР-амплификации соответствующих препаратов кДНК и встроены в пламидную ДНК - экспрессионный вектор. Полученные рекомбинантные плазмидные ДНК были просеквенированы в области встроенной последовательности, что подтвердило правильность клонирования. Дополнительно был проведен масс-спектрометрический анализ наработанных рекомбинантных белков, подтвердивший то, что полученные белки полностью соответствовали по аминокислотной последовательности белкам S100A4/Mts1 человека и мыши (Описанные рекомбинантные белки были любезно предоставлены Луканидиным Е.М., Institute of Cancer Biology, Copenhagen, Denmark).Recombinant proteins produced in E. coli bacteria were used as an antigen for immunization and selection. For this, nucleotide sequences identical to those encoding human and mouse S100A4 / Mts1 proteins were obtained by PCR amplification of the corresponding cDNA preparations and inserted into the plasmid DNA expression vector. The resulting recombinant plasmid DNA was sequenced in the region of the inserted sequence, which confirmed the correct cloning. Additionally, a mass spectrometric analysis of the produced recombinant proteins was carried out, confirming that the obtained proteins completely corresponded in amino acid sequence to human and mouse S100A4 / Mts1 proteins (The described recombinant proteins were kindly provided by E. Lukanidin, Institute of Cancer Biology, Copenhagen, Denmark )

Способ получения однодоменных наноантител описан в примерах 1 и 2.A method of obtaining single-domain nanoantibodies is described in examples 1 and 2.

Наноантитела (молекулярная масса около 12-15 кДа) на порядок меньше по размеру традиционных антител и являются полнофункциональными антиген-узнающими единицами, обладающими рядом новых положительных качеств практической значимости. Наноантитело представляет собой однодоменный белок, который хорошо растворим и обладает повышенной стабильностью (в широком диапазоне температур и рН). Это позволяет избегать проблем с растворимостью и правильным сворачиванием молекул антител при продукции прокариотическими клетками и ведет к существенному снижению затрат на их производство по сравнению с традиционными способами получения терапевтических моноклональных антител в эукариотических системах экспрессии. Существенно облегчается также процедура сохранения и транспортировки антител по сравнению с заметно менее стабильными традиционными антителами. В силу меньшего размера наноантитела характеризуются лучшей способностью проникать в ткани. Наконец, наноантитела позволяют легко проводить генно-инженерные манипуляции с целью последующей продукции биспецифических наноантител или химер, в состав которых помимо наноантитела входит другой белок с желаемыми свойствами.Nanoantibodies (molecular weight of about 12-15 kDa) are an order of magnitude smaller in size of traditional antibodies and are fully functional antigen-recognizing units with a number of new positive qualities of practical importance. Nanoantibody is a single domain protein that is highly soluble and has increased stability (over a wide range of temperatures and pH). This avoids problems with the solubility and correct folding of antibody molecules during production by prokaryotic cells and leads to a significant reduction in the cost of their production compared to traditional methods for producing therapeutic monoclonal antibodies in eukaryotic expression systems. The procedure for storing and transporting antibodies is also significantly facilitated compared to markedly less stable traditional antibodies. Due to their smaller size, nanoantibodies are characterized by better ability to penetrate tissues. Finally, nanoantibodies make it easy to carry out genetic engineering manipulations for the purpose of subsequent production of bispecific nanoantibodies or chimeras, which in addition to the nanoantibodies include another protein with the desired properties.

Несмотря на то, что, главным образом, в иллюстративных целях авторами настоящего изобретения делается акцент на продукции антител с использованием бактерии E.coli, среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что под объем настоящего изобретения подпадают и другие варианты систем реализации настоящего изобретения, прямо не заявленные в настоящем документе. Например, в качестве эукариотического продуцента могут быть использованы дрожжевые культуры или любые другие системы, очевидные в данной области техники.Despite the fact that mainly for illustrative purposes, the authors of the present invention focuses on the production of antibodies using the E.coli bacterium, it will be obvious to a person skilled in the art that other embodiments of the present invention fall within the scope of the present invention, Not expressly stated herein. For example, yeast cultures or any other systems obvious in the art can be used as a eukaryotic producer.

Выбор путей реализации с целью получения наноантител с заявляемыми свойствами из прокариотической системы экспрессии в соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения обусловлен следующими факторами:The choice of implementation paths in order to obtain nanoantibodies with the claimed properties from a prokaryotic expression system in accordance with one of the preferred embodiments of the present invention is due to the following factors:

1) Высокий экспрессионный выход, экономичность наработки в больших количествах, обеспечивающийся экспрессией наноантител в периплазму бактерий E.coli (в количестве 1-10 мг из 1 литра культуры).1) High expression yield, cost-effective production in large quantities, provided by the expression of nanoantibodies in the periplasm of E. coli bacteria (in an amount of 1-10 mg from 1 liter of culture).

2) Простота всевозможных генно-инженерных манипуляций, адаптации для конкретных задач, возможность создания многовалентных и многофункциональных производных.2) The simplicity of all kinds of genetic engineering manipulations, adaptation for specific tasks, the ability to create multivalent and multifunctional derivatives.

3) Высокая экономическая рентабельность производства. Автор настоящего изобретения исходит из того, что, как известно среднему специалисту в данной области техники, первичные, исходно получаемые последовательности однодоменных наноантител могут быть затем адаптированы или «форматированы» различным образом для последующего практического использования.3) High economic profitability of production. The author of the present invention proceeds from the fact that, as is well known to the average person skilled in the art, the primary, initially obtained sequences of single-domain nanoantibodies can then be adapted or “formatted” in various ways for subsequent practical use.

Так, однодоменные наноантитела могут быть исходными модулями (блоками) более сложных многомодульных препаратов. Возможно объединение в одном мультивалентном производном двух, трех и более моновалентных первичных однодоменных наноантител. Эти объединяемые в одну конструкцию однодоменные наноантитела могут связываться как с одним и тем же эпитопом антигена-мишени, так и с его разными эпитопами, или даже с различными антигенами-мишенями. Возможно также комбинированное объединение в одну конструкцию однодоменных наноантител и других молекул или лекарств с получением многофункциональных препаратов; мультимеризация с помощью введения дополнительных аминокислотных последовательностей, взаимодействующих белковых доменов, таких как лейциновые зипперы, или последовательностей небольших белков, образующих стабильные комплексы. Для модулирования свойств препарата однодоменного наноантитела, например увеличения времени жизни или совершенствования способа очистки, в состав конечного соединения могут быть введены дополнительные аминокислотные последовательности. Среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что такие модификации и прочие варианты антител, лежащих в основе настоящего изобретения, подпадают под объем настоящего изобретения, поскольку являются структурными и функциональными вариантами однодоменных наноантител. Таким образом, авторы настоящего изобретения понимают под термином "однодоменные наноантитела" как первичные, исходно получаемые, "минимальные" аминокислотные последовательности однодоменных наноантител, так и их модификации, полученные в результате упомянутых адаптаций или «форматирования» и их варианты. Термин «вариант антитела» для целей настоящего изобретения означает полипептид, который содержит изменения в аминокислотной последовательности, а именно делеции, вставки, добавления или замены аминокислот, при условии, что при этом сохраняется необходимый уровень активности белка, например, как минимум 10% от активности исходного однодоменного наноантитела. Ряд изменений в варианте белка зависит от положения или от типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Количество изменений может составлять, например, от 1 до 30, более предпочтительно, от 1 до 15, и наиболее предпочтительно, от 1 до 5 изменений в последовательности исходного однодоменного наноантитела. Эти изменения могут иметь место в областях полипептида, которые не являются критичными для его функции. Это становится возможным благодаря тому, что некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг с другом, и поэтому третичная структура или активность белка не нарушаются при таком изменении. Поэтому в качестве варианта белка может выступать белок, который характеризуется гомологией не менее 70%, предпочтительно, не менее 80%, более предпочтительно, не менее 90%, и наиболее предпочтительно, не менее 95% по отношению к аминокислотной последовательности исходного однодоменного наноантитела при условии сохранения активности полипептида. Гомология между аминокислотными последовательностями может быть установлена с использованием хорошо известных методов, например с помощью выравнивания последовательностей в компьютерной программе BLAST 2.0, которая вычисляет три параметра: счет, идентичность и сходство.So, single-domain nanoantibodies can be the original modules (blocks) of more complex multimodule preparations. It is possible to combine in one multivalent derivative two, three or more monovalent primary single-domain nanoantibodies. These single domain nanoantibodies combined into a single construction can bind both to the same epitope of the target antigen and to its different epitopes, or even to different target antigens. It is also possible combined combination into a single design of single-domain nanoantibodies and other molecules or drugs to obtain multifunctional drugs; multimerization by introducing additional amino acid sequences, interacting protein domains, such as leucine zippers, or sequences of small proteins that form stable complexes. To modulate the properties of the preparation of a single-domain nanoantibody, for example, to increase the lifetime or to improve the purification method, additional amino acid sequences can be introduced into the final compound. It will be apparent to one of ordinary skill in the art that such modifications and other antibody variants that underlie the present invention fall within the scope of the present invention as they are structural and functional variants of single domain nanoantibodies. Thus, the authors of the present invention understand the term "single-domain nanoantibodies" as the primary, initially obtained, "minimum" amino acid sequences of single-domain nanoantibodies, as well as their modifications resulting from the mentioned adaptations or "formatting" and their variants. The term "antibody variant" for the purposes of the present invention means a polypeptide that contains changes in the amino acid sequence, namely deletion, insertion, addition or replacement of amino acids, provided that this maintains the necessary level of protein activity, for example, at least 10% of the activity initial single domain nanoantibody. A number of changes in the variant of the protein depends on the position or type of amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein. The number of changes can be, for example, from 1 to 30, more preferably from 1 to 15, and most preferably, from 1 to 5 changes in the sequence of the original single domain nanoantibody. These changes can occur in areas of the polypeptide that are not critical to its function. This is possible due to the fact that some amino acids have high homology with each other, and therefore the tertiary structure or activity of the protein is not violated by such a change. Therefore, as a variant of the protein can be a protein that is characterized by a homology of at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% with respect to the amino acid sequence of the original single domain nanoantibody, provided maintaining the activity of the polypeptide. Homology between amino acid sequences can be established using well-known methods, for example, using sequence alignment in the BLAST 2.0 computer program, which calculates three parameters: count, identity, and similarity.

Замена, делеция, вставка, добавление или замена одного или нескольких аминокислотных остатков будут представлять собой консервативную мутацию или консервативные мутации при условии, что активность белка при этом сохраняется. Примером консервативной мутации(ий) является консервативная замена(ы). "Консервативная аминокислотная замена" представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. В данной области техники определены семейства аминокислот, имеющих сходные боковые цепи. Эти семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Поскольку гипервариабельные районы наноантител определяют их специфическое взаимодействие с антигеном, то именно гомологичные замены аминокислот в этих участках могут приводить к получению несколько различающихся по последовательности наноантител, которые обладают идентичными или близкими свойствами. Таким образом, среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что под объем настоящего изобретения подпадают не только указанные в приложении последовательности наноантител, но и те, которые могут быть получены путем замен аминокислот в гипервариабельных участках (указанных в перечне последовательностей как CDR) на другие, но очень близкие по свойствам, аминокислоты (консервативных замен).Substitution, deletion, insertion, addition or replacement of one or more amino acid residues will be a conservative mutation or conservative mutations, provided that the protein activity is maintained. An example of a conservative mutation (s) is a conservative substitution (s). A “conservative amino acid substitution” is a substitution in which an amino acid residue is replaced by an amino acid residue having a similar side chain. Families of amino acids having similar side chains are defined in the art. These families include amino acids with basic side chains (e.g., lysine, arginine, histidine), acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), non-polar side chains (e.g. alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), beta-branched side chains (e.g. threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (e.g. tyrosine , fe nilalanine, tryptophan, histidine). Since the hypervariable regions of nanoantibodies determine their specific interaction with the antigen, it is precisely the homologous substitutions of amino acids in these regions that can lead to the production of nanoantibodies slightly different in sequence, which have identical or similar properties. Thus, it will be apparent to one of ordinary skill in the art that the scope of the present invention includes not only the nanoantibody sequences indicated in the appendix, but also those that can be obtained by substituting amino acids in the hypervariable regions (indicated in the sequence listing as CDRs) with other , but very similar in properties, amino acids (conservative substitutions).

Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же функциональный полипептид, могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, кодирующего исходное однодоменное наноантитело, например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что один или несколько аминокислотных остатков в определенном сайте будут делегированы, заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные, как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации.DNA fragments that encode essentially the same functional polypeptide can be obtained, for example, by modifying the nucleotide sequence of a DNA fragment encoding the original single domain nanoantibody, for example, using the site-directed mutagenesis method, so that one or more amino acid residues at a particular site will be delegated, replaced, inserted or added. DNA fragments modified as described above can be obtained using traditional processing methods to obtain mutations.

Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же функциональный полипептид исходного однодоменного наноантитела, могут быть получены путем экспрессирования фрагментов ДНК, имеющих мутацию, описанную выше, и установления активности экспрессируемого продукта.DNA fragments that encode essentially the same functional polypeptide of the original single domain nanoantibody can be obtained by expressing DNA fragments having the mutation described above and establishing the activity of the expressed product.

Замена, делеция, вставка или добавление нуклеотидов, описанных выше, также включают мутации, которые имеют место в природе и, например, обусловлены изменчивостью.Substitution, deletion, insertion or addition of nucleotides described above also includes mutations that occur in nature and, for example, are due to variability.

Полипептиды однодоменных наноантител согласно настоящему изобретению могут кодироваться большим множеством молекул нуклеиновых кислот, что является результатом хорошо известного в данной области техники явления вырожденности генетического кода. Суть феномена состоит в том, что любая аминокислота (за исключением триптофана и метионина), входящая в состав природных пептидов, может кодироваться более чем одним триплетным нуклеотидным кодоном. Любая из этих вырожденных кодирующих молекул нуклеиновых кислот может входить в состав кассет, экспрессирующих антитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, и подпадающих под объем настоящего изобретения.The single-domain nanoantibody polypeptides of the present invention can be encoded by a large number of nucleic acid molecules, which is the result of the degeneracy of the genetic code well known in the art. The essence of the phenomenon is that any amino acid (with the exception of tryptophan and methionine) that is part of natural peptides can be encoded by more than one triplet nucleotide codon. Any of these degenerate coding nucleic acid molecules may be included in cassettes expressing antibodies of the invention and falling within the scope of the invention.

Получение функционально-активных наноантител, распознающих антигены S100A4 показано в примерах 3, 4.Obtaining functionally active nanoantibodies that recognize S100A4 antigens is shown in examples 3, 4.

Возможность использования полученных наноантител и их комбинаций в диагностических исследованиях продемонстрировано в примерах 4 и 5.The possibility of using the obtained nanoantibodies and their combinations in diagnostic studies is demonstrated in examples 4 and 5.

Краткое описание фигурBrief Description of the Figures

На фиг.1 представлена нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующая полученное однодоменное наноантитело aMTS1 (SEQ ID NO:1). Из нее была выведена соответствующая аминокислотная последовательность наноантитела (SEQ ID NO:2). В указанной последовательности подчеркнуты соответственно (слева направо, от N- к С-концу) гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, которые являются определяющими для специфического узнавания наноантителом aMTS1 белка S100A4/Mts1. Стрелками указаны позиции аминокислотных остатков, являющихся характеристическими для вариабельных доменов особых одноцепочечных антител (отличающихся от остатков в вариабельных доменах тяжелых цепей классических антител). В CDR1 и CDR3 участках aMTS1 выявляются остатки цистеина, часто встречающиеся именно в наноантителах и, повидимому, стабилизирующие наноантитело, образуя дополнительную С-С сявязь между первым и третьим гипервариабельными участками.Figure 1 shows the cDNA nucleotide sequence encoding the resulting single-domain aMTS1 nanoantibody (SEQ ID NO: 1). The corresponding amino acid sequence of the nanoantibody was derived from it (SEQ ID NO: 2). In the indicated sequence, hypervariable regions of CDR1, CDR2, and CDR3 are underlined respectively (from left to right, from the N- to the C-terminus), which are crucial for the specific recognition of the S100A4 / Mts1 protein by the aMTS1 nanoantibody. The arrows indicate the positions of amino acid residues that are characteristic of the variable domains of specific single chain antibodies (differing from residues in the variable domains of the heavy chains of classical antibodies). In the CDR1 and CDR3 regions of aMTS1, cysteine residues are detected, which are often found precisely in nanoantibodies and, apparently, stabilize the nanoantibodies, forming an additional CC bond between the first and third hypervariable regions.

На фиг.2 представлена электорофореграмма полиакриламидного геля с наработанным (с помощью отобранной клонированной кодирующей последовательности) и затем очищенным наноантителом aMTS1.Figure 2 presents the electrophoregram of the polyacrylamide gel with the accumulated (using the selected cloned coding sequence) and then purified nanoantibody aMTS1.

На фиг.3 представлены результаты иммуноферментного анализа узнавания отобранным однодоменным наноантителом aMTS1 иммобилизованных в лунках иммунологической плашки рекомбинантных белков, соответствующих по аминокислотной последовательности белкам S100A4/Mts1 человека и мыши.Figure 3 presents the results of an enzyme-linked immunosorbent assay for recognition of selected recombinant proteins immobilized in the wells of the immunological plate of the aMTS1 single-domain nanoantibody aMTS1 corresponding in amino acid sequence to human and mouse S100A4 / Mts1 proteins.

На фиг.4 представлены результаты Вестерн-блот детекции белка S100A4/Mts1 в лизатах клеток HeLa (человека) и NIH3T3 (мыши) с помощью наноантитела aMTS1.Figure 4 presents the results of Western blot detection of S100A4 / Mts1 protein in lysates of HeLa (human) and NIH3T3 (mouse) cells using aMTS1 nanoantibody.

Примеры осуществления настоящего изобретенияExamples of the implementation of the present invention

Пример 1Example 1

Получение библиотеки вариабельных доменов одноцепочечных антителObtaining a library of variable domains of single-chain antibodies

ИммунизацияImmunization

Двугорбого верблюда Camelus bactrianus последовательно иммунизировали 5 раз путем подкожного введения антигенного материала, смешанного с равным объемом полного (в при первой инъекции) или неполного (при остальных инъекциях) адъюванта Фрейнда. В качестве антигена использовали смесь рекомбинантных белков (по 2 мг каждого из двух белков на 1 инъекцию), полностью соответствовавших по аминокислотной последовательности белкам S100A4/Mts1 человека и мыши, наработанных в бактериях Е.coli (Эти рекомбинантные белки были любезно предоставлены Луканидиным Е.М., Institute of Cancer Biology, Copenhagen, Denmark). Вторую инъекцию (стадию иммунизации) проводили через 3 недели после первой, затем с интервалом в две недели проводили еще три иммунизации. Взятие крови (150 мл) проводили через 5 дней после последней инъекции. Для предотвращения свертывания взятой крови добавляли 50 мл стандартного фосфатно-солевого раствора (PBS), содержащего гепарин (100 ед./мл) и ЭДТА (3 мМ).Bactrian camel Camelus bactrianus was subsequently immunized 5 times by subcutaneous administration of antigenic material mixed with an equal volume of Freund's adjuvant (in the first injection) or incomplete (in the remaining injections). A mixture of recombinant proteins (2 mg of each of two proteins per injection) was used as antigen, which fully corresponded in amino acid sequence to human and mouse S100A4 / Mts1 proteins produced in E. coli bacteria (These recombinant proteins were kindly provided by E. M. Lukanidin ., Institute of Cancer Biology, Copenhagen, Denmark). The second injection (stage of immunization) was carried out 3 weeks after the first, then three more immunizations were carried out with an interval of two weeks. Blood sampling (150 ml) was performed 5 days after the last injection. To prevent coagulation of the taken blood, 50 ml of standard phosphate-saline solution (PBS) containing heparin (100 units / ml) and EDTA (3 mM) was added.

Кровь разводили в 2 раза раствором PBS, содержащим 1 мМ ЭДТА. 35 мл разбавленного раствора крови наслаивали на ступеньку специальной среды (Histopaque-1077, Sigma) с плотностью 1,077 г/мл объемом 15 мл и проводили центрифугирование в течение 20 мин при 800×g. Мононуклеарные клетки (лимфоциты и моноциты) отбирали из интерфазной зоны плазма/Histopaque, после чего промывали раствором PBS, содержащим 1 мМ ЭДТА.Blood was diluted 2 times with a PBS solution containing 1 mM EDTA. 35 ml of a diluted blood solution was layered on a step of a special medium (Histopaque-1077, Sigma) with a density of 1.077 g / ml and a volume of 15 ml and centrifugation was performed for 20 min at 800 × g. Mononuclear cells (lymphocytes and monocytes) were selected from the plasma / Histopaque interphase, and then washed with a PBS solution containing 1 mM EDTA.

Суммарную РНК из В-лимфоцитов выделяли с помощью реагента TRIzol (Invitrogen). Затем, на колонке с олиго(dT)-целлюлозой из тотальной РНК очищали поли(А)-содержащую РНК. Концентрацию РНК определяли с помощью биофотометра (Eppendorf) и проверяли качество выделенной РНК с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле с формальдегидом.Total RNA from B lymphocytes was isolated using TRIzol reagent (Invitrogen). Then, on a column of oligo (dT) cellulose from total RNA, poly (A) -containing RNA was purified. RNA concentration was determined using a biophotometer (Eppendorf) and the quality of the isolated RNA was checked by electrophoresis in 1.5% formaldehyde agarose gel.

Реакцию обратной транскрипции проводили по стандартному протоколу [Sambrook et al., 1989] с использованием обратной транскриптазы H^-M-MuLV и праймера олиго(dT)₁₅ в качестве затравки.The reverse transcription reaction was carried out according to the standard protocol [Sambrook et al., 1989] using reverse transcriptase H ^- M-MuLV and oligo primer (dT) ₁₅ as a seed.

Продукты обратной транскрипции использовали в качестве матрицы в двухступенчатой полимеразной цепной реакции и полученные продукты амплификации клонировали по сайтам Ncol(Pstl) и NotI в фагмидный вектор, как описано ранее [Hamers-Casterman et al., 1993; Nguyen et al., 2001; Saerens et al., 2004; Rothbauer et al., 2006]. Процедедуру селекции проводили также аналогично тем, что в указанных работах. Она базировалась на методе фагового дисплея, в которой в качестве фага-помощника использовали бактериофаг М13КО7 (New England Biolabs, США).Reverse transcription products were used as a template in a two-step polymerase chain reaction, and the resulting amplification products were cloned at the Ncol (Pstl) and NotI sites into a phagemid vector as previously described [Hamers-Casterman et al., 1993; Nguyen et al., 2001; Saerens et al., 2004; Rothbauer et al., 2006]. The selection procedure was also carried out similarly to those in the indicated works. It was based on the phage display method, in which the bacteriophage M13CO7 (New England Biolabs, USA) was used as an assistant phage.

Пример 2Example 2

Селекция однодоменных наноантител, специфически узнающих S100A4/Mts1Selection of single domain nanoantibodies that specifically recognize S100A4 / Mts1

Селекцию однодоменных наноантител проводили методом фагового дисплея с использованием тех же, что и для иммунизации, препаратов рекомбинантных белков S100A4/Mts1 человека и мыши (параллельно), которые иммобилизовали на дне лунок 96-луночного ИФА-планшета. Использовали полистироловые иммунологические плашки с высокой сорбцией MICROLON 600 (Greiner Bio-One). Для блокировки использовали 1% БСА (Sigma-Aldrich, США) и/или 1% обезжиренное молоко (Bio-Rad, США) в PBS. Процедуру селекции и последующей амплификации отбираемых фаговых частиц (содержащих ген однодоменного наноантитела внутри, а экспрессирующееся однодоменное наноантитело - в составе поверхностного фагового белка pIII) повторяли, как правило, последовательно три раза. Все манипуляции проводили, как описано в публикациях [Тиллиб С.В., Иванова Т.И., Васильев Л.А. 2010. Фингерпринтный анализ селекции «наноантител» методом фагового дисплея с использованием двух вариантов фагов-помощников. Acta Naturae 2010; 2 (3): 100-108; Hamers-Casterman C., Atarhouch Т., Muyldermans S. et al. Nature 1993; 363: 446-448.; Nguyen V.K., Desmyter A., Muyldermans S. Adv. Immunol. 2001; 79: 261-296; Saerens D., Kinne J., Bosmans E., Wernery U., Muyldermans S., Conrath K. J Biol Chem. 2004; 279: 51965-51972; Rothbauer U., Zolghadr K., Tillib S., et al. Nature Methods 2006; 3: 887-889].Single domain nanoantibodies were selected by phage display using the same human and mouse recombinant S100A4 / Mts1 proteins as immunization that were immobilized on the bottom of the wells of a 96-well ELISA plate. Used polystyrene immunological plates with high sorption MICROLON 600 (Greiner Bio-One). For blocking, 1% BSA (Sigma-Aldrich, USA) and / or 1% skim milk (Bio-Rad, USA) in PBS were used. The selection and subsequent amplification of the selected phage particles (containing the single-domain nanoantibody gene inside, and the expressed single-domain nanoantibody as part of the surface phage protein pIII) was repeated, as a rule, three times in succession. All manipulations were performed as described in the publications [Tillib S.V., Ivanova T.I., Vasiliev L.A. 2010. Fingerprint analysis of the selection of "nanoantibodies" by the phage display method using two variants of assistant phages. Acta Naturae 2010; 2 (3): 100-108; Hamers-Casterman C., Atarhouch T., Muyldermans S. et al. Nature 1993; 363: 446-448 .; Nguyen V.K., Desmyter A., Muyldermans S. Adv. Immunol. 2001; 79: 261-296; Saerens D., Kinne J., Bosmans E., Wernery U., Muyldermans S., Conrath K. J Biol Chem. 2004; 279: 51965-51972; Rothbauer U., Zolghadr K., Tillib S., et al. Nature Methods 2006; 3: 887-889].

Последовательности клонов отобранных наноантител группировали согласно схожести их фингерпринтов, получаемых при электрофоретическом разделении продуктов гидролиза амплифицированных последовательностей однодоменных наноантител параллельно тремя частощепящими рестрикционными эндонуклеазами (Hinfl, Mspl, Rsal). Последовательность кДНК однодоменного наноантитела aMTS1 (SEQ ID NO:1) была определена (см. фиг.1). Из нее была выведена соответствующая аминокислотная последовательность наноантитела (SEQ ID NO:2). В указанной последовательности подчеркнуты соответственно (слева направо, от N- к С-концу) гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, которые являются определяющими для специфического узнавания наноантителом aMTS1 белка S100A4/Mts1. Стрелками указаны позиции аминокислотных остатков, являющихся характеристическими для вариабельных доменов особых одноцепочечных антител (отличающихся от остатков в вариабельных доменах тяжелых цепей классических антител). В CDR1 и CDR3 участках aMTS1 выявляются остатки цистеина, часто встречающиеся именно в наноантителах и, по-видимому, стабилизирующие наноантитело, образуя дополнительную С-С связь между первым и третьим гипервариабельными участками.Clone sequences of selected nanoantibodies were grouped according to the similarity of their fingerprints obtained by electrophoretic separation of the hydrolysis products of amplified sequences of single-domain nanoantibodies in parallel with three frequently-banded restriction endonucleases (Hinfl, Mspl, Rsal). The cDNA sequence of the single domain aMTS1 nanoantibody (SEQ ID NO: 1) was determined (see FIG. 1). The corresponding amino acid sequence of the nanoantibody was derived from it (SEQ ID NO: 2). In the indicated sequence, hypervariable regions of CDR1, CDR2, and CDR3 are underlined respectively (from left to right, from the N- to the C-terminus), which are crucial for the specific recognition of the S100A4 / Mts1 protein by the aMTS1 nanoantibody. The arrows indicate the positions of amino acid residues that are characteristic of the variable domains of specific single chain antibodies (differing from residues in the variable domains of the heavy chains of classical antibodies). In the CDR1 and CDR3 regions of aMTS1, cysteine residues are detected, which are often found precisely in nanoantibodies and, apparently, stabilize the nanoantibodies, forming an additional CC bond between the first and third hypervariable regions.

Продукция наноантителNanoantibody Products

Последовательности кДНК отобранных наноантител переклонировали в экспрессионный плазмидный вектор - модифицированный вектор pHEN6 [Conrath KE, Lauwereys M, Galleni M, Matagne A, Frère JM, Kinne J, Wyns L, Muyldermans S. Beta-lactamase inhibitors derived from single-domain antibody fragments elicited in the Camelidae. / «Бэта-лактомазные ингибиторы, происходящие из фрагментов однодоменных антител, индуцированных у Верблюдовых». Antimicrob Agents Chemother. 2001; 45:2807-12], позволяющий присоединение к С-концу однодоменного нано-антитела (His)₆-эпитопа (сразу вслед за НА-эпитопом). Благодаря наличию на N-конце экспрессируемой последовательности сигнального пептида (peIB) нарабатываемый рекомбинантный белок (однодоменное нано-антитело) накапливается в периплазме бактерий, что позволяет эффективно его выделять методом осмотического шока, не разрушая собственно бактериальные клетки. Продукцию однодоменных наноантител проводили в Е. coli (штамм BL21). Экспрессию индуцировали добавлением 1 мМ индолил-бета-D-галактопиранозида и клетки инкубировали при интенсивном перемешивании в течение 7 часов при 37°С или в течение ночи при 29°С. Однодоменное наноантитело выделяли из периплазматического экстракта с использованием аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе с использованием системы для очистки QIAExpressionist (QIAGEN, США).The cDNA sequences of the selected nanoantibodies were cloned into an expression plasmid vector — a modified pHEN6 vector [Conrath KE, Lauwereys M, Galleni M, Matagne A, Frère JM, Kinne J, Wyns L, Muyldermans S. Beta lactamase inhibitors derived from single-domain fragments in the Camelidae. / "Beta-lactase inhibitors derived from fragments of single-domain antibodies induced in Camelids." Antimicrob Agents Chemother. 2001; 45: 2807-12], allowing the attachment to the C-terminus of a single-domain nano-antibody (His) ₆ epitope (immediately after the HA epitope). Due to the presence of the signal peptide sequence (peIB) at the N-terminus of the expressed sequence, the produced recombinant protein (single-domain nano-antibody) accumulates in the periplasm of bacteria, which allows it to be efficiently isolated by the osmotic shock method without destroying the bacterial cells themselves. The production of single domain nanoantibodies was carried out in E. coli (strain BL21). Expression was induced by adding 1 mM indolyl-beta-D-galactopyranoside and the cells were incubated with vigorous stirring for 7 hours at 37 ° C or overnight at 29 ° C. A single domain nanoantibody was isolated from the periplasmic extract using affinity chromatography on Ni-NTA agarose using the QIAExpressionist purification system (QIAGEN, USA).

На фиг.2 представлена электорофореграмма полиакриламидного геля с наработанным (с помощью отобранной клонированной кодирующей последовательности) и затем очищенным наноантителом aMTS1.Figure 2 presents the electrophoregram of the polyacrylamide gel with the accumulated (using the selected cloned coding sequence) and then purified nanoantibody aMTS1.

Пример 3Example 3

Детекция рекомбинантных белков S100A4/Mts1 человека и мыши с помощью отобранного наноантитела aMTS1.Detection of human and mouse recombinant S100A4 / Mts1 proteins using selected aMTS1 nanoantibodies.

Способность наноантитела aMTS1 связываться с иммобилизованными в лунках иммунологической плашки рекомбинантными белками S100A4/Mts1 человека и мыши проверяли с использованием стандартного протокола метода иммуноферментного анализа. В качестве контроля использовали лунки с иммобилизованным белком овальбумином кур или бычим сывороточным альбумином (неспецифические белки).The ability of aMTS1 nanoantibodies to bind to human and mouse recombinant S100A4 / Mts1 recombinant proteins immobilized in the wells of the immunological plate was tested using the standard protocol of the enzyme immunoassay. As a control, wells with immobilized chicken ovalbumin protein or bovine serum albumin (non-specific proteins) were used.

В качестве вторичных антител к НА-тагу (присутствующему на С-конце проверяемого наноантитела aMTS1) использовали конъюгированные с пероксидазой хрена анти-НА-моноклональные антитела (CHGT-45P-Z, ICL, Inc., США). Активность пероксидазы хрена определяли, используя в качестве хромогенного субстрата ABTS (2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат). Оптическую плотность измеряли при длине волны 405 нм с помощью планшетного флуориметра. Контрольные лунки (с иммобилизованным неспецифическим белком, белком овальбумином кур или бычим сывороточным альбумином) не содержали антиген и далее были блокированы и процессированы параллельно с экспериментальными ячейками (с антигеном).Secondary antibodies to the HA tag (present at the C-terminus of the aMTS1 nanoantibody tested) were horseradish peroxidase conjugated anti-HA monoclonal antibodies (CHGT-45P-Z, ICL, Inc., USA). The horseradish peroxidase activity was determined using ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonate) as a chromogenic substrate. The optical density was measured at a wavelength of 405 nm using a plate fluorimeter. Control wells (with immobilized nonspecific protein , chicken ovalbumin protein or bovine serum albumin) did not contain antigen and were then blocked and processed in parallel with experimental cells (with antigen).

На фиг.3 представлен результат иммуноферментного анализа, из которого следует, что наноантитело aMTS1 специфически связывается с иммобилизованными (из раствора с концентрацией 2 мкг/мл) рекомбинантными белками S100A4/Mts1 как человека, так и мыши. Более эффективное связывание наблюдается в случае мышиного белка. Наноантитело брали в концентрации 1- 1 мкг/мл и 2- 0,1 мкг/мл, соответственно. Величина столбцов на рисунке соответствует относительным величинам поглощения при длине волны 405 нм, количественно отражающим эффективность связывания наноантитела aMTS1.Figure 3 presents the result of an enzyme immunoassay, from which it follows that the aMTS1 nanoantibody specifically binds to immobilized (from a solution with a concentration of 2 μg / ml) recombinant S100A4 / Mts1 proteins in both human and mouse. More effective binding is observed in the case of mouse protein. Nanoantibodies were taken at a concentration of 1-1 μg / ml and 2-1.1 μg / ml, respectively. The size of the columns in the figure corresponds to the relative values of absorption at a wavelength of 405 nm, quantitatively reflecting the binding efficiency of aMTS1 nanoantibody.

Пример 4Example 4

Детекция белка S100A4/Mts1 («Вестерн-блот»-детекция) в лизатах клеток линии HeLa (человека) и NIH3T3 (мыши) с помощью наноантитела aMTS1.Detection of S100A4 / Mts1 protein (Western blot detection) in lysates of HeLa (human) and NIH3T3 (mouse) cells using aMTS1 nanoantibody.

Способность наноантитела aMTS1 связывать белок S100A4/Mts1 в лизатах клеток человека и мыши после фракционирования белков с помощью диск-электрофореза (по Лэммли) в полиакриламидном геле и переноса разделенных белков на PVDF-мембрану проверяли с помощью стандартного протокола Вестерн-блот анализа. В качестве негативного контроля использовали экстракт клеток НЕК293 (происходящей из клеток эмбриональной почки человека), в которых, согласно литературным данным, белок S100A4/Mts1 не детектируется. Другие две взятые для анализа линии клеток - это широко распространенные линия клеток человека HeLa (происходящей из клеток аденокарциномы шейки матки) и линия клеток мыши NIH3T3 (происходящей из клеток аденокарциномы эмбриональных фибробластов). Все линии клеток культивировали на среде DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки пересаживали раз в неделю. Для получения клеточных лизатов клетки сперва промывали в стандартном фосфатно-солевом растворе (PBS), а затем лизировали при температуре 4°С в лизирующем буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl, рН 7, 5, 150 мМ NaCl, 1% SDS, 5 мМ ЭДТА, коктейль протеазных ингибиторов фирмы Roche). Лизаты центрифугировали 10 мин при 12000×g, отбрасывали осадок. Для более достоверной детекции белка (для усиления детектирующего сигнала) мы использовали процедуру предварительного специфического обогащения белка S100A4 из полученных лизатов (с помощью иммобилизованных на BrCN-сефарозе наноантител aMTS1) перед проведением электрофореза. Для этого лизаты диализовали в растворе для связывания, содержащем 10 мМ Трис-HCl, рН 7, 5, 200 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF и затем пропускали через колонку с иммобилизованным на сефарозе наноантителом aMTS1, промывали тем же раствором, а затем элюировали в свежеприготовленном 1,4% растворе триэтиламина в воде (рН~11). Элюаты сразу же нейтрализовали, добавляя 1М Трис-HCl, рН 7,0 (пол-объема на один объем элюата). Одинаковые аликвоты элюатов, полученные из лизатов клеток трех разных клеточных линий брали для нанесения на полиакриламидный гель (использовали 12% разделяющий гель). Разделенные электрофорезом по Лэммли белки переносили из геля на PVDF-мембрану (Hybond-P, GE Healthcare) и затем проводили согласно протоколу производителя иммунохимическую реакцию, завершающуюся хемиллюминисцентной детекцией (с помощью набора ECL, GE Healcare) целевого белка. Наноантитела для детекции использовали в концентрации 10 мкг/мл. В качестве вторичных антител к НА-тагу (присутствующему на С-конце проверяемых наноантител aMTS1) использовали конъюгированные с пероксидазой хрена анти-НА-моноклональные антитела (CHGT-45P-Z, ICL, Inc., США).The ability of aMTS1 nanoantibody to bind S100A4 / Mts1 protein in human and mouse cell lysates after protein fractionation using Lammley disk electrophoresis in polyacrylamide gel and transfer of the separated proteins to the PVDF membrane was tested using the standard Western blot analysis protocol. As a negative control, an extract of HEK293 cells (originating from human embryonic kidney cells) was used, in which, according to published data, the S100A4 / Mts1 protein is not detected. The other two cell lines taken for analysis are the widespread human cell line HeLa (originating from cervical adenocarcinoma cells) and the mouse cell line NIH3T3 (originating from embryonic fibroblast adenocarcinoma cells). All cell lines were cultured on DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) containing 10% fetal calf serum. Cells were transplanted once a week. To obtain cell lysates, the cells were first washed in standard phosphate-saline solution (PBS) and then lysed at 4 ° C in lysis buffer containing 50 mM Tris-HCl, pH 7, 5, 150 mM NaCl, 1% SDS, 5 mM EDTA, Roche protease inhibitor cocktail). Lysates were centrifuged for 10 min at 12,000 × g, and the precipitate was discarded. For more reliable protein detection (to enhance the detection signal), we used the preliminary specific enrichment of S100A4 protein from the obtained lysates (using aMTS1 nanoantibodies immobilized on BrCN-Sepharose) before electrophoresis. For this, lysates were dialyzed in a binding solution containing 10 mM Tris-HCl, pH 7, 5, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, and then passed through a column with aMTS1 nanoantibody immobilized on sepharose, washed with the same solution, and then, it was eluted in a freshly prepared 1.4% solution of triethylamine in water (pH ~ 11). The eluates were immediately neutralized by adding 1M Tris-HCl, pH 7.0 (half volume per volume of eluate). The same aliquots of eluates obtained from cell lysates of three different cell lines were taken for application onto a polyacrylamide gel (a 12% separating gel was used). Protein separated by Lammley electrophoresis was transferred from the gel to the PVDF membrane (Hybond-P, GE Healthcare) and then, according to the manufacturer's protocol, an immunochemical reaction was completed, resulting in chemiluminescent detection (using the ECL kit, GE Healcare) of the target protein. Detection nanoantibodies were used at a concentration of 10 μg / ml. Secondary antibodies to the HA tag (present at the C-terminus of the tested aMTS1 nanoantibodies) were horseradish peroxidase conjugated anti-HA monoclonal antibodies (CHGT-45P-Z, ICL, Inc., USA).

На фиг.4 представлены результаты проведенного анализа. Полученные результаты демонстрируют то, что полученное наноантитело aMTS1 способно детектировать методом Вестерн-блот-анализа эндогенные белки S100A4/Mts1 в экстрактах клеток человека и мыши. На фиг.4 стрелкой указано положение маркерного белка лизоцима. Белок S100A4/Mts1 детектируется в виде мажорной полосы в зоне белков размером примерно 12 кДа.Figure 4 presents the results of the analysis. The obtained results demonstrate that the obtained aMTS1 nanoantibody is capable of detecting endogenous S100A4 / Mts1 proteins in extracts of human and mouse cells by Western blot analysis. In figure 4, the arrow indicates the position of the marker protein lysozyme. Protein S100A4 / Mts1 is detected as a major band in a zone of proteins of about 12 kDa.

Приведенные примеры с фигурами подтверждают выполнение поставленной технической задачи, а именно создание новых антител, способных эффективно связывать белок S100A4. Представлено получение этих антител, производство и хранение которых будет экономичным. Заявленные наноантитела являются эффективными и относительно простыми; а их размер в несколько раз меньше, чем у классических антител. Особенности их компактной структуры позволяют относительно просто проводить всевозможные генно-инженерные манипуляции, адаптированные для конкретных задач, обеспечивают возможность создания на их основе различных многовалентных и многофункциональных производных. На базе создаваемых наноантител появляются новые возможности для более эффективного таргетирования белка S100A4 и влияния на связанные с ним биологические процессы и заболевания.The above examples with figures confirm the fulfillment of the technical task, namely the creation of new antibodies that can efficiently bind the S100A4 protein. The preparation of these antibodies is presented, the production and storage of which will be economical. The claimed nanoantibodies are effective and relatively simple; and their size is several times smaller than that of classical antibodies. The features of their compact structure make it relatively easy to carry out all kinds of genetic engineering manipulations, adapted for specific tasks, provide the ability to create various multivalent and multifunctional derivatives on their basis. On the basis of the created nanoantibodies, new possibilities appear for more effective targeting of the S100A4 protein and the effect on the biological processes and diseases associated with it.

Таким образом, задача, поставленная в данном изобретении, решена.Thus, the problem posed in this invention is solved.

Claims (2)

1. Однодоменное антитело, специфически связывающее белки S100A4/Mts1 человека и мыши и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.1. A single domain antibody that specifically binds human and mouse S100A4 / Mts1 proteins and has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. 2. Применение антитела по п.1 для детекции белка S100A4/Mts1 в биологических жидкостях человека и мыши. 2. The use of antibodies according to claim 1 for the detection of protein S100A4 / Mts1 in biological fluids of humans and mice.

Images