RU2480479C1

RU2480479C1 - Heterologous peptide mini-antigene in polymer particle for making anti-allergy vaccine

Info

Publication number: RU2480479C1
Application number: RU2011143988/10A
Authority: RU
Inventors: Елена Викторовна Свирщевская; Людмила Геннадьевна Алексеева
Original assignee: Елена Викторовна Свирщевская; Людмила Геннадьевна Алексеева
Priority date: 2011-11-01
Filing date: 2011-11-01
Publication date: 2013-04-27

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: invention discloses artificial peptide mini-antigens (PMA) which can be used to induce controlled protective humoral IgG-mediated immune response against allergen. The mini-antigen includes: hydrophobic peptides from different proteins and any pathogens which are linked with pockets of the most common MHC (major histocompatibility complex) molecules class II and to which, in the human population, there are memory T cells (memory T cell T epitopes (MTC)), and hydrophilic peptides from different proteins which are on the surface of wild type allergen, which are conjugated onto the support of the cladding of the polymer particle and are accessible for antibodies. (The structure of the mini-antigen is shown on fig 14 in the description). The mini-antigens are characterised by the capacity to replace B epitopes with peptides of another allergen while preserving the nucleus of the MTC T epitopes, which enables to use the peptide mini-antigens to make anti-allergy vaccines against different types of allergies. The presence of memory T cells helps to considerably speed up immune response triggering. The introduction of peptides of only basic allergen proteins into the structure ensures anti-allergy protection with minimal load on the immune system.

EFFECT: absence of binding of IgE with peptides makes vaccination safe and fast.

14 dwg, 2 tbl, 3 ex

Description

Изобретение относится к области иммунологии и медицины и касается искусственных пептидных мини-антигенов (ПМА), которые могут применяться для индукции контролируемого протективного гуморального IgG-опосредованного иммунного ответа против аллергена с целью замены патогенного IgE-опосредованного иммунного ответа.The invention relates to the field of immunology and medicine and relates to artificial peptide mini-antigens (PMA), which can be used to induce a controlled protective humoral IgG-mediated immune response against an allergen to replace a pathogenic IgE-mediated immune response.

ПМА является мини-аналогом гаптена на белке-носителе и состоит из пептидов, происходящих из разных белков.PMA is a mini-analogue of hapten on a carrier protein and consists of peptides derived from different proteins.

ПМА является безопасной заменой экстрактов аллергенов для проведения специфической иммунотерапии (СИТ).PMA is a safe substitute for allergen extracts for specific immunotherapy (SIT).

Областью медицинского применения являются все виды пыльцевой, пищевой, грибной и бытовой аллергии.The field of medical use is all types of pollen, food, mushroom and household allergies.

Биомишенью ПМА является адаптивный (антиген-специфический) иммунный ответ, включающий антигенпредставляющие клетки (макрофаги, дендритные и B-клетки), T- и B-клетки.The PMA biotarget is an adaptive (antigen-specific) immune response, including antigen-presenting cells (macrophages, dendritic and B cells), T and B cells.

Ключевые слова: аллергия, пептиды, T- и B-эпитопы, наночастицы, структура вакцины, специфическая иммунотерапия, IgE, IgG.Key words: allergy, peptides, T- and B-epitopes, nanoparticles, vaccine structure, specific immunotherapy, IgE, IgG.

Список сокращенийList of abbreviations

ПМАPMA Пептидный мини-антигенPeptide Mini Antigen СИТCIT Специфическая иммунотерапияSpecific immunotherapy АСИОASIO Антиген-специфический иммунный ответAntigen-specific immune response ГАСИОGACIO Гуморальный антиген-специфический иммунный ответHumoral antigen-specific immune response T-клеткиT cells Клетки тимического происхожденияThymic cells B-клеткиB cells Клетки, продуцирующие антитела (иммуноглобулины)Antibody-producing cells (immunoglobulins) АПКAgribusiness Антигенпредставляющие клеткиAntigen presenting cells ГКГСGKGS Главный комплекс гистосовместимостиThe main histocompatibility complex ГКГСIIGCHSII Молекулы ГКГС II классаGKGS class II molecules HLA-DR, DQ, DPHLA-DR, DQ, DP Номенклатура молекул ГКГСII человекаThe nomenclature of human MHCII molecules ТКРTKR Т-клеточный рецепторT cell receptor ВКРWRC В-клеточный рецептор или IgDB cell receptor or IgD IgD, IgM, IgG, IgE, IgAIgD, IgM, IgG, IgE, IgA Иммуноглобулины разных классовImmunoglobulins of different classes ТКПTCH T-клетки памятиMemory T cells FcFc Константный участок антителаAntibody constant region FabFab Вариабельный антигенсвязывающий участок антителаAntigen binding variable region TLRTLR Toll-like receptor, рецептор клеток врожденного иммунитетаToll-like receptor, innate immunity cell receptor АБЛАABLA Аллергический бронхолегочный аспергиллезAllergic bronchopulmonary aspergillosis Asp f2, Asp f3Asp f2, Asp f3 Основные белки аллергена гриба Aspergillus fumigatusThe main proteins of the allergen of the fungus Aspergillus fumigatus Der f1, Der f2, Der f3Der f1, Der f2, Der f3 Основные белки аллергена клеща домашней пылиBasic house dust mite allergen proteins

2. Введение2. Introduction

Для объяснения сути изобретения требуется схематичное понимание механизма формирования Антиген-специфического Иммунного Ответа (АСИО). Следует отметить, что АСИО всегда направлен на распознавание чужеродного белка. Именно белки несут в себе генетическую информацию в наиболее концентрированном виде. Фрагмент белка (пептид) длиной в 9 аминокислот (аа) может распознаваться иммунной системой как генетически чужеродный и против него может формироваться АСИО. Механизмов АСИО несколько. Для изложения сути данного изобретения мы остановимся только на одном механизме, называемом гуморальным АСИО (ГАСИО), поскольку именно формирование гуморального АСИО в виде молекул IgE является механизмом патогенеза аллергии I типа, для лечения которой может использоваться данное изобретение.To explain the essence of the invention requires a schematic understanding of the mechanism of formation of the Antigen-specific Immune Response (ASIO). It should be noted that ASIO is always aimed at recognizing a foreign protein. It is the proteins that carry the genetic information in the most concentrated form. A fragment of a protein (peptide) with a length of 9 amino acids (aa) can be recognized by the immune system as genetically foreign and ASIO can form against it. ASIO mechanisms are several. To explain the essence of this invention, we will focus only on one mechanism called humoral ASIO (GASIO), since it is the formation of humoral ASIO in the form of IgE molecules that is the mechanism of the pathogenesis of type I allergy, for the treatment of which this invention can be used.

3. Биомишень I. Для формирования любого ГАСИО необходим белок-антиген (белок из аллергена или любой другой белок) и клетки иммунной системы, которые его распознают и реагируют формированием иммуноглобулинов. Такие иммуноглобулины, называемые также антителами, могут формировать стабильные комплексы с этим антигеном при встрече с ним в любых жидкостях и тканях организма. Существует несколько типов иммуноглобулинов: D, M, G1, G2, G3, G4, E и A. У каждого из типов иммуноглобулинов своя функция в иммунной системе. В идеале эти молекулы созданы природой для удаления из организма генетически чужеродного материала, попадающего в организм с патогенами: бактериями, вирусами, грибами, паразитами. Каждый из типов антител может оказывать как защитный (протективный) эффект, так и патогенный. Так, IgE-опосредованный ГАСИО на аллергены является патологической реакцией иммунитета, а такой же IgE ГАСИО на паразитов - протективной. Имеется ряд аутоиммунных заболеваний, где патогенный эффект оказывают IgG или IgA антитела.3. Biotarget I. For the formation of any GASIO, a protein antigen (a protein from an allergen or any other protein) and cells of the immune system that recognize it and react with the formation of immunoglobulins are necessary. Such immunoglobulins, also called antibodies, can form stable complexes with this antigen when meeting with it in any body fluids and tissues. There are several types of immunoglobulins: D, M, G1, G2, G3, G4, E and A. Each type of immunoglobulin has its own function in the immune system. Ideally, these molecules are created by nature to remove genetically foreign material from the body that enters the body with pathogens: bacteria, viruses, fungi, parasites. Each type of antibody can have both a protective (protective) effect and a pathogenic one. So, IgE-mediated GASIO for allergens is a pathological reaction of the immune system, and the same IgE GASIO for parasites is protective. There are a number of autoimmune diseases where IgG or IgA antibodies have a pathogenic effect.

Для формирования ГАСИО необходимо, чтобы иммунная система опознала патоген, что на первом этапе происходит с помощью врожденной состемы иммунитета, узнающей не белки, а характерные структуры патогенов, например клеточную стенку бактерий, состоящую из полисахаридов. Это приводит к захвату патогена специализированными клетками-фагоцитами (фагоцитозу). После фагоцитоза патогены попадают в специализированные органелы фагоцитов (эндосомы и лизосомы), где патоген убивается и фракционируется на отдельные молекулы. Среди фагоцитов часть клеток имеет специализированную функцию для передачи информации клеткам адаптивного иммунитета с целью дальнейшего формирования АСИО. Дендритные клетки и макрофаги (в меньшей степени также и В-клетки) обладают такой функцией, за что получили название антигенпредставляющих клеток (АПК). Особенностью АПК является наличие эндосом, куда попадает патоген после фагоцитоза и куда клетки транспортируют специальные молекулы, называемые молекулами главного комплекса гистосовместимости II класса (ГКГСII). Эти молекулы играют доминирующую роль в формировании АСИО и являются первой биомишенью данного изобретения (Рис.1).For the formation of GASIO, it is necessary that the immune system recognizes the pathogen, which at the first stage occurs using an innate immune system that recognizes not the proteins, but the characteristic structures of pathogens, for example, the bacterial cell wall consisting of polysaccharides. This leads to the capture of the pathogen by specialized phagocyte cells (phagocytosis). After phagocytosis, pathogens enter specialized phagocyte organs (endosomes and lysosomes), where the pathogen is killed and fractionated into individual molecules. Among phagocytes, part of the cells has a specialized function for transmitting information to cells of adaptive immunity in order to further form ASIO. Dendritic cells and macrophages (to a lesser extent also B cells) have this function, for which they are called antigen-presenting cells (APCs). A specific feature of APC is the presence of endosomes, where the pathogen enters after phagocytosis and where the cells transport special molecules called molecules of the main histocompatibility complex of class II (HCHII). These molecules play a dominant role in the formation of ASIO and are the first biological target of the present invention (Fig. 1).

В процессе переваривания патогена в эндосомах его белки высвобождаются и фрагментируются на пептиды. Молекулы ГКГСII формируют комплекс с пептидами белков-антигенов за счет наличия специализированного участка-ловушки (кармана) на их поверхности, в который могут попасть пептиды только определенной структуры (Рис.2).In the process of digestion of a pathogen in endosomes, its proteins are released and fragmented into peptides. MCHCII molecules form a complex with peptides of protein antigens due to the presence of a specialized trap site (pocket) on their surface, into which peptides of only a certain structure can fall (Fig. 2).

В организме человека молекул ГКГСII всего 3 (DR, DQ, DP), но имеется вариабельность этих молекул у разных людей (полиморфизм). Каждая молекула состоит из 2 цепей - α и β (Рис.1, 2), которые могут собираться из разных вариантов (аллелей). В результате вариабельности отдельный индивидуум может иметь до 12 различных комбинаций молекул ГКГСII. Общее количество вариантов в популяции людей ограничено. Все они классифицированы в системе HLA-DR, DQ, DP (от human leukocyte antigens DR, DQ, DP). Структура молекул HLA-DR охарактеризована для многих аллелей (см., например, базу данных http://www.syfpeithi.de). Для DQ и DP данных пока меньше.There are only 3 HCHGII molecules in the human body (DR, DQ, DP), but there is variability of these molecules in different people (polymorphism). Each molecule consists of 2 chains - α and β (Fig. 1, 2), which can be assembled from different variants (alleles). As a result of the variability, an individual can have up to 12 different combinations of HCHII molecules. The total number of options in a human population is limited. All of them are classified in the HLA-DR, DQ, DP system (from human leukocyte antigens DR, DQ, DP). The structure of HLA-DR molecules has been characterized for many alleles (see, for example, the database http://www.syfpeithi.de). For DQ and DP data is less so far.

Комплекс чужеродного пептида, связанного в кармане ГКГСII, экспрессируется на поверхности АПК и является мощным стимулятором Т-клеток (Т-хелперов, CD4+ клеток) к активации, синтезу различных молекул, пролиферации (Рис.3) и активации других клеток АСИО, в случае ГАСИО - в стимулиции B-клеток к продукции антител (Рис.4). Такой пептид называется Т-эпитопом.The complex of a foreign peptide bound in the pocket of HCHGII is expressed on the surface of the APC and is a powerful stimulator of T cells (T-helper cells, CD4 + cells) to activate, synthesize various molecules, proliferate (Fig. 3) and activate other ASIO cells, in the case of HASIS - in stimulating B cells to produce antibodies (Fig. 4). Such a peptide is called a T-epitope.

Зная структуру кармана определенной молекулы из любого белка, можно подобрать Т-эпитоп, который подходит по форме к карману ГКГСII. Зная, что тот или иной индивидуум имеет ту или иную молекулу ГКГСII, можно вводить в организм данный пептид и получить на него ответ, который выражается в пролиферации Т-клеток, распознающих именно тот пептид, что введен в организм.Knowing the structure of the pocket of a specific molecule from any protein, you can choose a T-epitope that fits in shape to the pocket of HCHII. Knowing that this or that individual has this or that MHCII molecule, you can enter this peptide into the body and get an answer to it, which is expressed in the proliferation of T cells that recognize exactly the peptide that is introduced into the body.

После окончания иммунного ответа часть Т-клеток, специфичных к данному пептиду, сохраняется в виде Т-клеток памяти (ТКП). ТКП значительно быстрее активируются, чем наивные Т-клетки, впервые встретившие антиген. Когда человек часто болеет, например, гриппом определенного распространенного штамма, например, N1H1, то в его организме имеется достаточно много ТКП, которые обеспечивают реактивацию АСИО при новой инфекции - это и есть иммунитет, защищающий нас от знакомой инфекции. На принципе стимуляции ТКП (В-клетки памяти тоже имеются) основаны все современные вакцины.After the end of the immune response, part of the T cells specific for this peptide is stored as memory T cells (TKPs). TKPs are much faster activated than naive T cells that first encounter antigen. When a person is often ill, for example, with the flu of a certain common strain, for example, N1H1, then in his body there are quite a lot of TKPs that provide ASIO reactivation in case of a new infection - this is the immunity that protects us from a familiar infection. All modern vaccines are based on the principle of stimulation of TKP (memory B cells also).

Формулой изобретения, часть 1, является использование для индукции ГАСИО к аллергену пула предсуществующих ТКП, неспецифичных к аллергену. Специфичность ТКП может быть направлена на белки вируса гриппа, вируса Эпштейн-Барра, герпесов 1 и 2 типа и др, то есть на белки патогенов, вызывающих часто случающуюся или хроническую персистирующую инфекцию. Для индукции ГАСИО этим путем необходимо провести HLA-DR типирование конкретного больного (что делает множество фирм) и выбрать подходящий пептид для данной молекулы из базы данных.The claims, part 1, is the use for the induction of GASIO to an allergen of a pool of pre-existing TSTs that are non-specific to the allergen. The specificity of TKP can be directed to proteins of the influenza virus, Epstein-Barr virus, herpes type 1 and 2, etc., that is, to proteins of pathogens that cause a frequent or chronic persistent infection. To induce GASIO in this way, it is necessary to perform HLA-DR typing of a particular patient (which is done by many companies) and select the appropriate peptide for this molecule from the database.

При использовании полноразмерных белков рестрикция молекулами ГКГСII не является детерминирующей. Однако при работе с пептидными конструкциями этот вопрос является одним из наиболее важных и лимитирующих применение пептидных вакцин, поскольку в составе коротких фрагментов может не оказаться ни одного Т-клеточного эпитопа, способного связываться с конкретными молекулами ГКГС.When using full-sized proteins, restriction by HCHII molecules is not determinative. However, when working with peptide constructs, this question is one of the most important and limiting the use of peptide vaccines, since short fragments may not contain a single T-cell epitope capable of binding to specific MHC molecules.

4. Биомишень II. Т-клетки, начинающие иммунный ответ, называются Т-клетками-хелперами. Их функцией является помощь другим клеткам, которые называются эффекторами. Эффекторами ГАСИО являются В-клетки. Функция B-клеток - продуцировать антитела высокой специфичности. В-клетки изначально распознают совсем другие пептиды, чем Т-клетки. На поверхности всех В-клеток имеются молекулы, являющиеся составной частью антитела, которая собственно и должна связываться с антигеном (IgD). Эта молекула называется В-клеточным рецептором (ВКР). В организме имеется большое разнообразие ВКР, за счет чего в норме иммунная система может распознавать все имеющиеся в природе патогены. В процессе формирования ГАСИО В-клетка проходит ряд преобразований, что в итоге приводит к двум принципиальным событиям: 1) аффинность взаимодействия ВКР с распознаваемым пептидом резко возрастает (константа диссоциации уменьшается с 10^-6 до 10^-9 и выше) и 2) В-клетка формирует растворимую (гуморальную) форму антитела, состоящую из высокоаффинного ВКР и константной части антитела (Fc, от fragment constant). Именно Fc определяет тип антитела: M, G1, G2, G3, G4, E или A (Рис.4).4. The biological target II. T cells that initiate an immune response are called helper T cells. Their function is to help other cells called effectors. GASIO effectors are B cells. The function of B cells is to produce highly specific antibodies. B cells initially recognize completely different peptides than T cells. On the surface of all B cells there are molecules that are an integral part of the antibody, which in fact must bind to the antigen (IgD). This molecule is called a B-cell receptor (SRS). The body has a wide variety of SRS, due to which the normal immune system can recognize all naturally occurring pathogens. In the process of the formation of GACIO, the B-cell undergoes a series of transformations, which ultimately leads to two fundamental events: 1) the affinity of the interaction of SRS with the recognized peptide increases sharply (the dissociation constant decreases from 10 ^-6 to 10 ^-9 and higher) and 2) B- the cell forms a soluble (humoral) form of the antibody, consisting of high affinity SRS and the constant part of the antibody (Fc, from fragment constant). It is Fc that determines the type of antibody: M, G1, G2, G3, G4, E or A (Fig. 4).

Для формирования протективного противоаллергенного ГАСИО требуется, чтобы появились В-клетки памяти (ВКП), продуцирующие IgG антитела к белкам аллергена. В этом случае говорят, что антитела распознают В-эпитопы белков аллергена. Получить IgG антитела на В-эпитопы аллергена очень просто. Можно, например, проиммунизировать больного с аллергией экстрактом аллергена, что и делается при проведении лечения с помощью Специфической Иммунотерапии (СИТ). Однако при этом возникает много проблем, изложенных далее.The formation of a protective antiallergenic GASIO requires that memory B cells (VKPs) appear that produce IgG antibodies to allergen proteins. In this case, it is said that the antibodies recognize the B-epitopes of the allergen proteins. Obtaining IgG antibodies to allergen B-epitopes is very simple. It is possible, for example, to immunize a patient with an allergy with an allergen extract, which is done during treatment with the help of Specific Immunotherapy (SIT). However, this raises many problems, which are described below.

1. Опасность лечения методом СИТ. Можно спровоцировать обострение заболевания за счет активации тучных клеток, на которых уже имеются IgE антитела к данному аллергену. В ряде случаев может последовать анафилактический шок и опасность для жизни больного.1. The danger of treatment with SIT. An exacerbation of the disease can be triggered by the activation of mast cells that already have IgE antibodies to this allergen. In some cases, anaphylactic shock and a life threat to the patient may follow.

2. Экстенсивная иммунизация. В экстракте аллергенов много белков, иммунная система будет распознавать несколько белков, представленных в наибольшем количестве. В результате будет формироваться ГАСИО на пул белков. В случае успеха это защитит больного от дальнейшей аллергии на этот аллерген. При этом иммунная система подвергается значительной нагрузке. Любой иммунный ответ обходится организму очень дорого - при селекции Т- и В-клеток 90-99% пула селектируемых клеток погибает.2. Extensive immunization. There are a lot of proteins in the allergen extract, the immune system will recognize several proteins present in the greatest amount. As a result, GACIO will form on a protein pool. If successful, this will protect the patient from further allergies to this allergen. In this case, the immune system is subjected to significant stress. Any immune response is very expensive for the body - when selecting T- and B-cells, 90-99% of the pool of breeding cells dies.

3. Неоправданная нагрузка. При формировании АСИО на патогены экстенсивный иммунный ответ необходим: иммунная система ищет ключевой АСИО, который блокирует размножение патогена в организме. В отличие от патогенов - большинство аллергенов не размножаются в организме! Это безвредные объекты: пыльца, пылевые клещи, кусочки эпидермиса животных и птиц, пищевые белки и др. Для их удаления из организма не нужно искать самый главный белок. Достаточно иметь антитела к белку, экспонированному на поверхности аллергенного комплекса. За этот белок антитело свяжется, а затем такой комплекс выведется из организма с помощью обычных механизмов, существующих для выведения комплексов антиген-антитело. При проведении СИТ, соответственно, лучше вызвать ответ на один-два таких поверхностных белка, чтобы решить проблему. С учетом того, что у аллергических больных IgE ответ часто наблюдается ко многим аллергенам, необходимо щадить иммунную систему. Им потребуется пройти несколько курсов десенсибилизации к разным аллергенам для того, чтобы выздороветь.3. Unjustified load. In the formation of ASIO for pathogens, an extensive immune response is necessary: the immune system is looking for a key ASIO that blocks the reproduction of the pathogen in the body. Unlike pathogens - most allergens do not multiply in the body! These are harmless objects: pollen, dust mites, pieces of the epidermis of animals and birds, food proteins, etc. To remove them from the body, you do not need to look for the most important protein. It is enough to have antibodies to the protein exposed on the surface of the allergenic complex. An antibody will bind to this protein, and then such a complex will be excreted from the body using the usual mechanisms that exist to remove antigen-antibody complexes. When conducting SIT, accordingly, it is better to elicit a response to one or two of these surface proteins in order to solve the problem. Given that in allergic IgE patients, the response is often observed to many allergens, it is necessary to spare the immune system. They will need to undergo several desensitization courses for different allergens in order to recover.

4. Нет стандартных экстрактов. Большой проблемой разработки препаратов для СИТ (а это экстракты аллергенов) является нестандартизованность таких препаратов. Каждая фирма получает свой экстракт. Даже при использовании одного протокола выделения аллергены различаются между собой из-за различий в исходном сырье.4. There are no standard extracts. The big problem of developing drugs for SIT (and these are extracts of allergens) is the non-standardization of such drugs. Each company gets its own extract. Even when using the same isolation protocol, allergens differ from each other due to differences in feedstock.

5. Рекомбинантные аллергены. Альтернативой нестандартности сырья является получение рекомбинантных аллергенов. В мире ведется такая работа. Аллергенов много. В составе каждого из аллергенов также много белков. В настоящий момент проводят тестирование на «основные аллергены», то есть определяют, какие из белков конкретного аллергена чаще распознается IgE больных. Эти белки в дальнейшем планируется использовать для СИТ. Рекомбинантные белки дороги в производстве. Соответственно, дорогим будет и лечение.5. Recombinant allergens. An alternative to non-standard raw materials is the production of recombinant allergens. Such work is being done in the world. There are a lot of allergens. Each allergen also has a lot of proteins. At the moment, testing is carried out for the “main allergens”, that is, they determine which of the proteins of a particular allergen is more often recognized by IgE patients. These proteins are planned to be used for SIT in the future. Recombinant proteins are expensive in production. Accordingly, treatment will also be expensive.

6. Пептидные вакцины. В мире также разрабатываются пептидные вакцины для лечения аллергии. Это наиболее близкие к нашему изобретению препараты. Они состоят из пептидов основных белков аллергенов. Эффективность пептидных вакцин пока мала, что связано с рядом проблем, о которых будет идти речь далее.6. Peptide vaccines. Peptide vaccines for the treatment of allergies are also being developed in the world. These are the closest preparations to our invention. They consist of peptides of the main proteins of allergens. The effectiveness of peptide vaccines is still low, which is associated with a number of problems, which will be discussed later.

Формулой изобретения, часть 2, является индукция ГАСИО на 5-8 любых гидрофильных пептидов длиной 10-15 аминокислот из поверхностно экспонированных на диком аллергене белков (можно из нескольких разных белков), поскольку иммунная система умеет формировать антитела к любым чужеродным пептидам. Не требуется определять природные В-эпитопы. Достаточно, чтобы формировались IgG к любым участкам белка-аллергена. В примере 1 показано, что при индукции IgG на произвольно выбранный гидрофильный пептид белка ДСГЗ полученные антитела связывают полноразмерный белок, что и требовалось доказать.The formula of the invention, part 2, is the induction of GASIO on 5-8 any hydrophilic peptides 10-15 amino acids in length from proteins superficially exposed to a wild allergen proteins (can be from several different proteins), since the immune system can form antibodies to any foreign peptides. It is not required to determine natural B-epitopes. It is enough that IgG forms to any areas of the allergen protein. Example 1 shows that upon induction of IgG on a randomly selected hydrophilic peptide of the DSHP protein, the resulting antibodies bind a full-sized protein, which was to be proved.

Требование экспонирования белков на поверхности аллергена дикого типа необходимо для доступа антител к этому белку. Требование гидрофильности к используемым пептидам является нежестким и связано с лучшей экспонированностью гидрофильных пептидов в водную среду при создании вакцины.The requirement to expose proteins on the surface of a wild-type allergen is necessary for antibodies to access this protein. The requirement of hydrophilicity to the peptides used is non-rigid and is associated with a better exposure of hydrophilic peptides to the aquatic environment when creating a vaccine.

5. Структура вакцины. Для индукции эффективного ГАСИО необходимо выбранные пептиды упаковать специальным образом, а именно физически связать T- и B-эпитопы между собой. Это требование связано с тем, что механизм активации ГАСИО связан с одновременным присутствием Т- и В-эпитопов одного белка в одной АПК (Рис.5). Каждый природный белок имеет много потенциальных Т- и В-эпитопов. На рис.5 приведена кристаллографическая структура белка, на котором разными оттенками серого отмечены участки в структуре молекулы белка, соответствующие В- и Т-эпитопам белка.5. The structure of the vaccine. To induce effective HACIO, it is necessary to package the selected peptides in a special way, namely, physically bind the T and B epitopes to each other. This requirement is due to the fact that the GASIO activation mechanism is associated with the simultaneous presence of T and B epitopes of one protein in one APC (Fig. 5). Each natural protein has many potential T and B epitopes. Figure 5 shows the crystallographic structure of the protein, in which, in different shades of gray, the areas in the structure of the protein molecule corresponding to the B and T epitopes of the protein are marked.

При формировании АСИО принципиальным является участие АПК на этапе возникновения центра, в котором проходит селекция Т- и В-клеток (герминальные центры в лимфатических узлах и селезенке). Такие АПК собирают антиген на периферии за счет липких рецепторов (маннозные рецепторы, мусорные рецепторы и др). Патогены налипают на поверхность АПК. Часть из них фагоцитируется и попадает внутрь. Такой «ежик», набрав антиген, продвигается в ближайший лимфатический узел, где и оседает, формируя вокруг себя «шубу» из В-клеток, отловленных из потока лимфы за счет разпознавая пока с малой аффинностью В-эпитопов белков прилипших патогенов (Рис.6, слева).In the formation of ASIO, the participation of the AIC is fundamental at the stage of emergence of the center, in which the selection of T and B cells (germinal centers in the lymph nodes and spleen) takes place. Such APCs collect antigen on the periphery due to sticky receptors (mannose receptors, garbage receptors, etc.). Pathogens adhere to the surface of the APC. Some of them are phagocytosed and get inside. Having accumulated antigen, such a “hedgehog” advances to the nearest lymph node, where it settles, forming a “coat” of B cells collected from the lymph flow due to recognition of proteins of adhering pathogens with low affinity for B epitopes (Fig. 6 left).

Одновременно АПК процессирует белки патогена внутри в эндосомах и формирует комплексы ГКГСII-пептиды, которые затем траспортирует на свою поверхность. За эти комплексы, как за крючки, тормозятся рядом Т-клетки данной специфичности. Формируется терминальный центр, где потом будет происходить формирование АСИО.At the same time, APC processes the pathogen proteins inside in the endosomes and forms complexes of HCH-II peptides, which are then transported to its surface. For these complexes, as for hooks, T-cells of a given specificity are inhibited next to each other. A terminal center is formed, where ASIO will then form.

Для завершения процесса активации и формирования клеток-эффекторов гуморального ответа (созревание ГАСИО) требуется взаимодействие между T- и B-клетками, специфичными к одному и тому же белку (когнатное взаимодействие) (Рис.7).To complete the activation process and the formation of effector cells of the humoral response (GASIO maturation), an interaction between T and B cells specific to the same protein (cognate interaction) is required (Fig. 7).

Для этого природа создала специальный механизм: все активированные B-клетки становятся АПК, то есть начинают процессировать антиген и представлять пептиды белков антигена в комплексе с ГКГСII. T- и B-клетки размножаются (пролиферируют) и, в процессе размножения, на каждом цикле деления отбираются только те, что смогли вступить в контакт друг с другом и с материнской АПК (Рис.7). При этом между T- и B-клетками появляется второй контакт через специальные молекулы CD40-CD40L, без сигнала от которого В-клетка не может начать синтезировать IgG (не переключает тип антитела, что связано с генными перестроениями). Похоже, что именно этот контакт нарушен при аллергической реакции из-за недостаточного градиента концентрации антигена. Кроме двух контактов (ГКГСII-пептид-антигена-ТКР и CD40-CD40L) для оптимального ГАСИО требуется еще и сигнал через гуморальные факторы (цитокины), которые продуцируются АПК и T-клетками локально и связываются В-клетками также локально. Формируется трехсигнальная система запуска ГАСИО. Все это происходит в непосредственной близости трех клеток: АГГК-Т-клетка-В-клетка. При их разделении в пространстве координированность нарушается и ГАСИО не формируется. Именно требование сближенности в пространстве этих клеток требует, чтобы Т- и В-эпитопы антигена были связаны друг с другом физически. Особый способ связи (линкер) является третьей сутью изобретения, о чем пойдет речь ниже.For this, nature has created a special mechanism: all activated B cells become APCs, that is, they begin to process the antigen and present the antigen protein peptides in complex with HCHII. T- and B-cells multiply (proliferate) and, in the process of reproduction, only those that were able to come into contact with each other and with the maternal AIC are selected on each division cycle (Fig. 7). At the same time, a second contact appears between T- and B-cells through special CD40-CD40L molecules, without a signal from which the B-cell cannot begin to synthesize IgG (it does not switch the type of antibody, which is associated with gene rearrangements). It seems that it is this contact that is broken in an allergic reaction due to an insufficient gradient of antigen concentration. In addition to two contacts (MHCII-peptide-antigen-TCR and CD40-CD40L), optimal HASIO also requires a signal through humoral factors (cytokines), which are produced locally by APC and T-cells and also bind locally. A three-signal trigger system GASIO is formed. All this happens in the immediate vicinity of three cells: AGHC-T-cell-B-cell. When they are divided in space, coordination is broken and GASIO is not formed. It is the requirement of proximity in the space of these cells that requires that the T and B epitopes of the antigen be physically linked to each other. A special communication method (linker) is the third essence of the invention, which will be discussed below.

Каждая из T- и B-клеток, вступившая в такой контакт с АПК, перестает быть наивной и начинает активироваться. В результате активации появляются зрелые Т-клетки хелперы и высокоаффинные В-клетки, секретирующие антитела определенного класса.Each of the T and B cells that came into such contact with the APC ceases to be naive and begins to activate. As a result of activation, mature helper T cells and high affinity B cells secrete antibodies of a certain class.

Именно этот этап определяет, будет ли В-клетка продуцировать IgG или IgE. Это зависит от нескольких параметров, часть из которых пока плохо определена. Но точно известно, что для получения высокоаффинных антител G класса требуется:It is this step that determines whether the B cell will produce IgG or IgE. It depends on several parameters, some of which are still poorly defined. But it is precisely known that to obtain high-affinity antibodies of class G it is required:

1. Достаточно высокая пороговая концентрация антигена (очень малые концентрации иммунная система считает «шумом» и не реагирует на них);1. A sufficiently high threshold concentration of antigen (the immune system considers very low concentrations “noise” and does not respond to them);

2. Градиент антигена во времени (можно ввести сразу много антигена, который быстро выведется, в этом случае не будет ГАСИО);2. The antigen gradient in time (you can enter a lot of antigen at once, which will quickly be eliminated, in this case there will be no HASIO);

3. Имеется некая оптимальная скорость поступления антигена, которая отобрана в процессе эволюции и связана со скоростью размножения патогенов и клеток иммунной системы;3. There is a certain optimal rate of antigen delivery, which is selected during evolution and is associated with the rate of reproduction of pathogens and cells of the immune system;

4. Наличие сигнала через систему TLR врожденных рецепторов (Toll-like receptors).4. The presence of a signal through the TLR system of congenital receptors (Toll-like receptors).

Из трех необходимых условий аллергены удовлетворяют только одному: имеется градиент антигена во времени (сезон пыления деревьев и трав; постоянный контакт с домашними животными и пр). Пороговая концентрация белков аллергена ниже оптимума, так как аллергены не реплицируются в организме. Соответственно, скорость поступления аллергена ниже необходимой. Кроме того, аллергены не экспрессируют необходимых лигандов для системы TLR. А без этих сигналов меняется функционирование АПК. У людей, не склонных к аллергии, недостаток активации АПК приводит к игнорированию аллергена (толерантности). У 30% популяции людей имеется генетическая предрасположенность к распознаванию аллергенов, что выражается в аллергической реакции.Of the three necessary conditions, allergens satisfy only one: there is a gradient of antigen in time (the season of dusting of trees and grasses; constant contact with pets, etc.). The threshold concentration of allergen proteins is below the optimum, since allergens do not replicate in the body. Accordingly, the allergen intake rate is lower than necessary. In addition, allergens do not express the necessary ligands for the TLR system. And without these signals, the functioning of the agro-industrial complex changes. In people who are not prone to allergies, a lack of activation of the APC leads to ignoring the allergen (tolerance). 30% of the human population has a genetic predisposition to recognition of allergens, which is expressed in an allergic reaction.

Нами проведены многочисленные эксперименты по анализу распознавания связанных между собой Т- и В-эпитопов. Оказалось, что при предъявлении иммунной системе «голого» Т-эпитопа к нему будут также формироваться антитела (пример 2). Этого, однако, хотелось бы избежать. Наличие в организме высокоаффинных антител к любому пептиду удалит этот пептид в любом окружении из организма в том случае, если такой пептид будет доступен антителам. Поскольку при проведении гипосенсибилизации против многих аллергенов хочется использовать ограниченный спектр Т-эпитопов, к которым имеется пул ТКП, мы постарались «спрятать» Т-эпитопы. Соответственно, мы разработали систему упаковки Т-эпитопов в гидрофобную частицу. Структура такой частицы является, по-видимому, уже запатентованным объектом. Так, аналогичную упаковку предлагает американская компания Selecta Biosciences. Область исследований Selecta Biosciences несколько иная, чем аллергия, но принцип упаковки пептидов один и тот же, а именно: пептиды, являющиеся Т-эпитопами, пакуются внутрь наночастицы, а гидрофильные пептиды, являющиеся В-эпитопами, располагаются на внешней поверхности частицы и доступны для иммунной системы и антител. Линкером может являться любой биоразлагаемый материал: полипептидный линкер, полисахариды, липиды. Структура комплекса показана на рис.8. Следует отметить, что пример 2 также демонстрирует отсутствие ответа при отсутствии в составе ПМА Т-эпитопов.We have conducted numerous experiments on the analysis of recognition of related T and B epitopes. It turned out that upon presentation of the “naked” T-epitope to the immune system, antibodies will also form towards it (Example 2). This, however, I would like to avoid. The presence in the body of high-affinity antibodies to any peptide will remove this peptide in any environment from the body in the event that such a peptide is available to antibodies. Since when carrying out hyposensitization against many allergens, I would like to use a limited spectrum of T-epitopes, to which there is a pool of TKP, we tried to “hide” T-epitopes. Accordingly, we have developed a system for packing T-epitopes into a hydrophobic particle. The structure of such a particle is, apparently, already a patented object. So, similar packaging offers the American company Selecta Biosciences. The field of research of Selecta Biosciences is somewhat different than allergy, but the principle of packing peptides is the same, namely: peptides that are T-epitopes are packed inside a nanoparticle, and hydrophilic peptides that are B-epitopes are located on the outer surface of the particle and are available for immune system and antibodies. The linker can be any biodegradable material: a polypeptide linker, polysaccharides, lipids. The structure of the complex is shown in Fig. 8. It should be noted that example 2 also demonstrates the absence of response in the absence of T-epitopes in the composition of PMA.

Один из наиболее важных параметров для новых аллерговакцин является отсутствие связывания IgE антител самой вакциной. Это позволит использовать высокую дозу для иммунизации больных, что сократит процесс лечения до 2-3 инъекций. Поскольку ПМА состоит из линейных пептидов аллергена, a IgE распознают преимущественно конформационные эпитопы (собирающиеся только в свернутом белке), то скорее всего такая конструкция не будет связывать IgE. Нами протестировано 7 сывороток больных с аллергией на гриб Aspergillus fumigatus (больные аллергическим бронхолегочным аспергиллезом, АБЛА) и показано, что сыворотки распознают основные белки, но не смесь линейных пептидов этих белков (Пример 3).One of the most important parameters for new allergy vaccines is the lack of binding of IgE antibodies to the vaccine itself. This will allow the use of a high dose for immunization of patients, which will reduce the treatment process to 2-3 injections. Since PMA consists of linear allergen peptides, and IgE is primarily recognized by conformational epitopes (assembled only in a folded protein), this construct is most likely not to bind IgE. We tested 7 sera of patients allergic to Aspergillus fumigatus fungus (patients with allergic bronchopulmonary aspergillosis, ABLA) and showed that sera recognize basic proteins, but not a mixture of linear peptides of these proteins (Example 3).

6. Ближайшие аналоги6. The closest analogues

Ближайшими аналогами предлагаемых ПМА являются: 1) пептидные вакцины для специфической иммунотерапии (ПИТ) и 2) пептидные конструкции с использованием «универсальных» Т-эпитопов.The closest analogues of the proposed PMA are: 1) peptide vaccines for specific immunotherapy (PIT) and 2) peptide constructs using "universal" T-epitopes.

1. Пептидные вакцины для специфической иммунотерапии 1. Peptide vaccines for specific immunotherapy

СИТ известна более 100 лет [1] и на настоящий момент является единственным способом патогенетического лечения аллергии. С учетом того, что число людей, страдающих аллергическими заболеваниями, постоянно растет, а для достижения состояния ремиссии требуется длительная СИТ, стоимость лечения выходит на первый план. Кроме того, из-за отсутствия стандартных экстрактов для СИТ не существует единых препаратов для лечения той или иной формы аллергии. Использование стандартизованных препаратов рекомбинантных аллергенов или пептидов из них дает надежду на решение данной проблемы [2-3]. При сравнении стоимости и безопасности пептидных и рекомбинантных препаратов для иммунотерапии преимущество имеет несомненно ПИТ. Существуют исследовательские препараты, направленные на разработку ПИТ, ориентированной на Т- и В-эпитопы белков аллергенов. Из них в клинических исследованиях изучены только пептиды, идентифицированные как Т-эпитопы аллергенов. К сожалению ПИТ, основанная на использовании Т-эпитопов, показала себя эффективной только при лечении аллергии на укусы пчел [4]. В лабораториях мира продолжаются исследования ПИТ, основанной на разных подходах [5]. При этом время от времени исследователи регистрируют формирование IgE у мышей на пептиды, что требуется учитывать при разработке вакцин [6]. Вакцин для ПИТ, основанных на гетерологичных пептидах, мы не встречали.SIT has been known for over 100 years [1] and is currently the only way to pathogenetic treatment of allergies. Given the fact that the number of people suffering from allergic diseases is constantly growing, and to achieve a state of remission requires a long-term CIT, the cost of treatment comes to the fore. In addition, due to the lack of standard extracts for SIT, there are no single drugs for the treatment of one form or another of allergies. The use of standardized preparations of recombinant allergens or peptides from them gives hope for a solution to this problem [2-3]. When comparing the cost and safety of peptide and recombinant drugs for immunotherapy, PIT undoubtedly has an advantage. There are research drugs aimed at the development of PIT, focused on T - and B-epitopes of allergen proteins. Of these, only peptides identified as allergen T-epitopes have been studied in clinical studies. Unfortunately, PIT based on the use of T-epitopes proved to be effective only in the treatment of allergies to bee stings [4]. In the laboratories of the world, research on PIT based on different approaches is ongoing [5]. Moreover, from time to time, researchers register the formation of IgE in mice on peptides, which must be taken into account when developing vaccines [6]. We did not see vaccines for PIT based on heterologous peptides.

2. Пептидные конструкции с использованием «универсальных» Т-эпитопов2. Peptide constructs using "universal" T-epitopes

Поиск в базе данных PubMed по ключевым словам «universal T-cell epitopes allergy» не дал результатов.A search of the PubMed database for the keywords "universal T-cell epitopes allergy" returned no results.

Поиск в базе данных PubMed по ключевым словам «universal T-cell epitopes vaccines» дал несколько интересных результатов.A search of the PubMed database for the keywords “universal T-cell epitopes vaccines” yielded some interesting results.

В статье Alexander J et al [7] авторы излагают часть нашей идеологии для создания вакцины против различных типов гриппа. В работе описан поиск универсальных Т-эпитопов вируса гриппа, которые распознаются (связываются) наиболее распространенными гаплотипами молекул ГКГСII HLA-DR. При создании противоаллергенных вакцин такие эпитопы могут быть частью противоаллергенной вакцины. Именно предсуществующие к ним T-клетки памяти будут помогать формировать ответ на В-эпитопы аллергенов.In an article by Alexander J et al [7], the authors set out part of our ideology for creating a vaccine against various types of influenza. The work describes the search for universal T-epitopes of the influenza virus that are recognized (bound) by the most common haplotypes of HCHAII HLA-DR molecules. When creating anti-allergenic vaccines, such epitopes can be part of an anti-allergenic vaccine. It is the preexisting T-cells of memory that will help shape the response to B-epitopes of allergens.

В работе Gao J et al [8] описывается конструирование миниантигена, состоящего из T- и B-эпитопов вируса гепатита С. При этом все эпитопы происходят из одного антигенного комплекса, хотя и из разных белков. Подход близкий по сути, но сделан на основе получения слитого белка генноинженерными методами, что опять же даст более дорогой продукт, чем синтетические пептиды. Близкая идея описана в работах Calvo-Calle JM et al [9-10], где авторы получили пептидный «ежик» из одного T- и одного B-эпитопа Plasmodium falciparum для создания вакцины против малярии. Продукт получают уже синтетическим образом за счет синтеза разветвленных пептидов. Отсюда один шаг до наночастиц с нашитыми пептидами. Однако пока этот шаг не сделан.Gao J et al [8] describes the construction of a mini-antigen consisting of T- and B-epitopes of hepatitis C virus. Moreover, all epitopes come from the same antigenic complex, albeit from different proteins. The approach is close in essence, but made on the basis of obtaining fusion protein by genetic engineering methods, which again will give a more expensive product than synthetic peptides. A similar idea was described in the work of Calvo-Calle JM et al [9-10], where the authors obtained a peptide “hedgehog” from one T- and one B-epitope of Plasmodium falciparum to create a vaccine against malaria. The product is already synthesized through the synthesis of branched peptides. Hence, one step to nanoparticles with crosslinked peptides. However, this step has not yet been taken.

Еще ближе к нашему изобретению лежит работа Batzloff MR et al [11], в которой «универсальный» Т-эпитоп GKLIPNASLIENCTKAEL из вируса кори собаки (!) сшивали с В-эпитопом белка M стрептококка группы A, получали липопептиды для интраназальной иммунизации. Один Т-эпитоп, один В-эпитоп, но уже из различных белков, то есть гетерологичные пептиды.Still closer to our invention is the work of Batzloff MR et al [11], in which the “universal” T-epitope GKLIPNASLIENCTKAEL from the measles virus of a dog (!) Was cross-linked with the B-epitope of group A streptococcus protein M, lipopeptides for intranasal immunization were obtained. One T-epitope, one B-epitope, but from different proteins, that is, heterologous peptides.

Нет работ, где бы авторы использовали пул предсуществующих Т-клеток памяти для поддержания de novo формирующегося ответа на безвредные антигены, такие как аллергены.There is no work where the authors would use a pool of pre-existing memory T cells to maintain a de novo emerging response to harmless antigens such as allergens.

Суммируя приведенные сведения, суть данного изобретения может быть описана следующим образом:Summarizing the above information, the essence of this invention can be described as follows:

Пептидный конъюгат любых гидрофобных пептидов, которые связываются с карманами наиболее распространенных молекул ГКГС II класса и к которым в популяции людей имеются Т-клетки памяти, с любыми гидрофильными пептидами аллергенов, представляет собой пептидный мини-антиген, который можно использовать для терапии аллергии. Пептиды должны быть упакованы специальным образом с тем, чтобы Т-эпитопы были свернуты внутри молекулы, а В-эпитопы экспонированы наружу с тем, чтобы Т-эпитопы не распознавались как В-эпитопы.The peptide conjugate of any hydrophobic peptides that bind to the pockets of the most common HCCG class II molecules and to which there are memory T cells in humans, with any hydrophilic peptides of allergens, is a peptide mini-antigen that can be used to treat allergies. Peptides must be specially packaged so that T-epitopes are folded inside the molecule and B-epitopes are exposed to the outside so that T-epitopes are not recognized as B-epitopes.

Такая упаковка возможна, но является предметом другого патента.Such packaging is possible, but is the subject of another patent.

7. Экспериментальные доказательства положений изобретения7. Experimental evidence of the provisions of the invention

Пример 1. Иммунизация кролика произвольно выбранными пептидами белка адгезии десмоглеина 3 (ДСГЗ) приводит к появлению антител на этот пептид. Такие антитела распознают полноразмерный белок ДСГЗ в нативной конформации. При иммунизации комплексом, содержащим пептид вируса гриппа N1H1, аффинность антител резко возрастает.Example 1. Immunization of a rabbit with randomly selected peptides of desmoglein 3 adhesion protein (DSGZ) leads to the appearance of antibodies to this peptide. Such antibodies recognize the full-length DSHZ protein in the native conformation. When immunized with a complex containing the peptide of the influenza virus N1H1, the affinity of antibodies increases dramatically.

ДСГЗ является белком адгезии кератиноцитов кожи. ДСГЗ является аутоантигеном при пузырном дерматозе аутоиммунного происхождения вульгарной пузырчатке (ВП). Этот белок экспрессируют клетки линии кератиноцитов человека НаСаТ.DSGZ is a skin keratinocyte adhesion protein. DSHZ is an autoantigen in cystic dermatosis of autoimmune origin of pemphigus vulgaris (CAP). This protein is expressed by human keratinocyte cell line NaCaT.

Кролика №1 иммунизировали пептидом 89-97 из белка человека десмоглеина 3. В-эпитопы этого белка не известны не только для кролика, но и для человека. В результате многократных иммунизаций получили антитела, которые распознавали клетки НаСаТ (Рис.9). Аффинность полученных антител не была высокой. Высокоаффинные антитела больных ВП связывали белок по всей поверхности клетки (правый рисунок), а сыворотки иммунного кролика связывались в основном с белком в цитоплазме клеток, и лишь некоторые - с десмосомами, где это белок концентрируется (центральная фотография). Сыворотка интактного кролика не связывалась с данными клетками (левый снимок). Поскольку произвольно выбранный пептид может не содержать Т-эпитопа или содержать не полный Т-эпитоп, то мы провели некоторую работу по подбору кролика, который отвечал на выбранный ранее нами пептид из белка вируса гриппа штамма N1H1 (RMQFSSLTVNVRGSGMR).Rabbit No. 1 was immunized with peptide 89-97 from desmoglein 3 human protein. The B-epitopes of this protein are not known not only for the rabbit, but also for humans. As a result of repeated immunizations, antibodies were obtained that recognized NaCaT cells (Fig. 9). The affinity of the obtained antibodies was not high. High affinity antibodies of patients with VP bound protein over the entire surface of the cell (right figure), and the immune rabbit serum bound mainly to the protein in the cytoplasm of the cells, and only a few to desmosomes where this protein is concentrated (central photograph). The intact rabbit serum did not bind to these cells (left picture). Since a randomly selected peptide may not contain a T-epitope or contain a incomplete T-epitope, we did some work on the selection of a rabbit that responded to our previously selected peptide from an influenza virus protein of strain N1H1 (RMQFSSLTVNVRGSGMR).

Данный пептид был ранее идентифицирован как Т-эпитоп в системе HLA-DR4 (Tan et al. Conservation and diversity of influenza A H1N1 HLA-restricted T cell epitope candidates for epitope-based vaccines. PLoS One. 2010 Jan 18; 5(1):e8754). Был получен конъюгат пептида ДСГЗ 89-97 с пептидом RMQFSSLTVNVRGSGMR. После иммунизации кролика конъюгатом, содержащим гетерологичные пептиды (Т-эпитоп - из белка вируса гриппа, В-эпитоп - из белка ДСГЗ), получили высокоаффинные антитела, связывающиеся с ДСГЗ внутри десмосом, что характерно для высокоаффинных антител таких, как антитела больных ВП (Рис.9, 10). Соответственно, нами показано, что введение пептида, распознаваемого иммунной системой как Т-эпитоп, в состав конъюгата с любым пептидом любого белка приводит к формированию антител на эти пептиды.This peptide was previously identified as a T-epitope in the HLA-DR4 system (Tan et al. Conservation and diversity of influenza A H1N1 HLA-restricted T cell epitope candidates for epitope-based vaccines. PLoS One. 2010 Jan 18; 5 (1) : e8754). A conjugate of peptide DSGZ 89-97 with peptide RMQFSSLTVNVRGSGMR was obtained. After immunizing the rabbit with a conjugate containing heterologous peptides (T-epitope from the influenza virus protein, B-epitope from the DSHP protein), high-affinity antibodies binding to the DSHP inside desmosomes were obtained, which is typical for high-affinity antibodies such as antibodies of patients with VP (Fig .9, 10). Accordingly, we have shown that the introduction of a peptide recognized by the immune system as a T-epitope into the conjugate with any peptide of any protein leads to the formation of antibodies to these peptides.

Пример 2. Поскольку природный Т-эпитоп обычно спрятан внутри молекулы белка из-за его гидрофобности, то к нему не образуются антитела. Мишенью антител являются гидрофильные экспонированные на поверхности пептиды. Однако при использовании мини-антигенов все пептиды, включая сам Т-эпитоп, оказываются доступны для антител. С большой вероятностью в этом случае антитела будут образовываться и к Т-эпитопу. Для проверки данного предположения был получен конъюгат, содержащий 4 различных пептида, один из которых был ранее идентифицирован как В-эпитоп (B1), а 3 - как потенциальные Т-эпитопы (T1, Т2, Т3). До иммунизации проверяли активность Т-эпитопов по индукции пролиферации лимфоцитов периферической крови кроликов №№1110-1112. Кролик №1111 ответил только на пептид Т2, остальные кролики вообще не ответили на пептиды (Рис.11). Поскольку мы отбирали Т-эпитопы по литературным данным для человека, то для кроликов мы посчитали удачей, что хотя бы один из 3-х кроликов ответил на 1 из 3-х эпитопов. Эти данные демонстрируют, что для подбора вакцины необходимо типирование HLA больного.Example 2. Since the natural T-epitope is usually hidden inside a protein molecule due to its hydrophobicity, no antibodies are formed to it. The target of antibodies are hydrophilic surface-exposed peptides. However, when using mini-antigens, all peptides, including the T-epitope itself, are available for antibodies. With a high probability in this case, antibodies will also form to the T-epitope. To verify this assumption, a conjugate was obtained containing 4 different peptides, one of which was previously identified as a B-epitope (B1), and 3 as potential T-epitopes (T1, T2, T3). Prior to immunization, T-epitope activity was checked by inducing the proliferation of peripheral blood lymphocytes of rabbits No. 1110-1112. Rabbit No. 1111 responded only to T2 peptide, the remaining rabbits did not respond to peptides at all (Fig. 11). Since we selected T-epitopes according to literature data for humans, we considered it fortunate for rabbits that at least one of the 3 rabbits answered 1 out of 3 epitopes. These data demonstrate that typing of the patient's HLA is necessary to select a vaccine.

Кроликов №1111 и №1110 иммунизировали конъюгатом В1-Т1-Т2-Т3 в гидроокиси алюминия 3 раза. Анализ продукции IgG антител проводили иммуно-ферментным методом, где в качестве подложки использовали индивидуальные пептиды. Показали, что кролик №1110 не ответил формированием IgG ни на один пептид (нет Т-эпитопов, подходящих под ГКГСII кролика). Кролик №1111 ответил формированием IgG на пептиды В1, Т2 и Т3 (Рис.12). Антитела на Т1 не формировались. Полученные данные показали два факта: 1) при отсутствии подходящего Т-эпитопа в составе конъюгата иммунный ответ (ГАСИО) формироваться не будет; 2) «голые» Т-эпитопы могут становиться В-эпитопами, к которым формируются антитела.Rabbits No. 1111 and No. 1110 were immunized with conjugate B1-T1-T2-T3 in aluminum hydroxide 3 times. Analysis of the production of IgG antibodies was carried out by the enzyme immunoassay, where individual peptides were used as the substrate. It was shown that rabbit No. 1110 did not respond to the formation of IgG to any peptide (there are no T epitopes suitable for rabbit HCHGII). Rabbit No. 1111 responded by forming IgG to peptides B1, T2 and T3 (Fig. 12). Antibodies on T1 were not formed. The data obtained showed two facts: 1) in the absence of a suitable T-epitope in the conjugate, an immune response (GASIO) will not be formed; 2) “naked” T-epitopes can become B-epitopes to which antibodies are formed.

Аналогичные данные были нами получены и на мышах. Ни один из выбранных Т-эпитопов не распознавался мышами линии BALB/c - ни одна мышь не формировала антител на конъюгаты. Мы заменили мышей на беспородных, у которых более рандомизированный ГКГСII. У 70% беспородных мышей формировался ГАСИО на все или почти все предъявленные пептиды (данные не приводятся).Similar data were obtained by us on mice. None of the selected T-epitopes was recognized by BALB / c mice - not a single mouse formed antibodies to conjugates. We replaced mice with outbred mice that have a more randomized HCHII. In 70% of outbred mice, GACIO was formed on all or almost all of the presented peptides (data not shown).

Пример 3. Линейные пептиды не содержат конформационных эпитопов, в то время как IgE чаще распознают именно конформационные эпитопы. Для проверки связывания пептидами IgE мы использовали пул синтетических пептидов Asp f2 и Asp f3, приведенных в таблицах 1 и 2. Сыворотки 7 из 10 больных АБЛА распознавали рекомбинантные белки Asp f2 и Asp f3, являющиеся основными аллергенами гриба Aspergillus fumigatus (Рис.13, серые столбики). При этом связывания с пулом линейных пептидов Asp f2 выявлено не было (Рис.13, черные столбики). Аналогичные данные были получены и для пула пептидов Asp f3 (данные не приводятся).Example 3. Linear peptides do not contain conformational epitopes, while conformational epitopes are more often recognized by IgE. To check the binding of IgE peptides, we used the pool of synthetic peptides Asp f2 and Asp f3 shown in Tables 1 and 2. Sera of 7 out of 10 patients with ABA recognized the recombinant proteins Asp f2 and Asp f3, which are the main allergens of the fungus Aspergillus fumigatus (Fig. 13, gray columns). However, no binding to the pool of linear peptides Asp f2 was detected (Fig. 13, black bars). Similar data were obtained for the Asp f3 peptide pool (data not shown).

Claims

Гетерологичный пептидный мини-антиген в составе полимерной частицы для создания противоаллергенной вакцины, включающий:
- гидрофобные пептиды, которые связываются с карманами наиболее распространенных молекул ГКГС II класса (HLA-DR) и к которым в популяции людей имеются Т-клетки памяти, пептиды происходят из любых белков и любых патогенов, пептиды упакованы в ядро полимерного носителя и недоступны для антител (Рис.14);
- гидрофильные пептиды из различных белков одного аллергенного комплекса, происходящие из белков, находящихся на поверхности дикого аллергена, пептиды конъюгированы на носитель оболочки полимерной частицы и доступны для антител. A heterologous peptide mini-antigen in the composition of a polymer particle to create an anti-allergenic vaccine, including:
- hydrophobic peptides that bind to the pockets of the most common MHC class II molecules (HLA-DR) and to which there are memory T cells in the human population, peptides come from any proteins and any pathogens, the peptides are packed into the core of the polymer carrier and are not accessible to antibodies (Fig. 14);
- hydrophilic peptides from various proteins of the same allergenic complex, originating from proteins located on the surface of the wild allergen, the peptides are conjugated to the carrier of the shell of a polymer particle and are accessible to antibodies.