RU2472525C2 - Universal vaccine for treating and preventing lyme disease applicable in human and veterinary science, and method for preparing it - Google Patents
Universal vaccine for treating and preventing lyme disease applicable in human and veterinary science, and method for preparing it Download PDFInfo
- Publication number
- RU2472525C2 RU2472525C2 RU2010123897/15A RU2010123897A RU2472525C2 RU 2472525 C2 RU2472525 C2 RU 2472525C2 RU 2010123897/15 A RU2010123897/15 A RU 2010123897/15A RU 2010123897 A RU2010123897 A RU 2010123897A RU 2472525 C2 RU2472525 C2 RU 2472525C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- borrelia
- vaccine
- ospa
- ospc
- universal
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/0225—Spirochetes, e.g. Treponema, Leptospira, Borrelia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИFIELD OF TECHNOLOGY
Изобретение относится к композиции универсальной вакцины для лечения и профилактики болезни Лайма для применения у людей и в ветеринарии и способу ее производства.The invention relates to a universal vaccine composition for the treatment and prevention of Lyme disease for use in humans and in veterinary medicine and a method for its production.
СОВРЕМЕННЫЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИMODERN BACKGROUND
Болезнь Лайма представляет собой хроническое инфекционное заболевание, характеризующееся множественным поражением систем органов. Это наиболее распространенное, переносимое членистоногими заболевание в Европе и Соединенных Штатах. Значимость этого заболевания показана в ряде публикаций в журналах, посвященных инфекционным заболеваниям. С этой точки зрения, в ряду болезней, за последнее десятилетие, болезнь Лайма становится сразу за приобретенным синдромом иммунодефицита, как описано, например, в "The biological and social phenomenon of Lyme disease" (Barbour AG, Fish D, Science. 1993 Jun 11;260(5114):1610-6).Lyme disease is a chronic infectious disease characterized by multiple lesions of organ systems. This is the most common arthropod-borne disease in Europe and the United States. The significance of this disease is shown in a number of publications in journals dedicated to infectious diseases. From this point of view, in a series of diseases over the past decade, Lyme disease immediately follows acquired immunodeficiency syndrome, as described, for example, in "The biological and social phenomenon of Lyme disease" (Barbour AG, Fish D, Science. 1993 Jun 11 ; 260 (5114): 1610-6) .
Заболевание вызывается группой спирохет с общим названием Borrelia burgdorferi sensu lato. Эта группа микроорганизмов, главным образом, включает три близкородственных подвида, т.е. Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii и Borrelia garinii. В то время как Borrelia burgdorferi sensu stricto является причиной практически всех случаев Болезни Лайма на Северо-Американском континенте, в Европе преобладают Borrelia garinii и Borrelia afzeli.The disease is caused by a group of spirochetes under the general name Borrelia burgdorferi sensu lato . This group of microorganisms mainly includes three closely related subspecies, i.e. Borrelia burgdorferi sensu stricto , Borrelia afzelii and Borrelia garinii . While Borrelia burgdorferi sensu stricto is the cause of almost all cases of Lyme disease on the North American continent, Borrelia garinii and Borrelia afzeli predominate in Europe.
Серьезные поражения организма-хозяина млекопитающего, а также проблемы, связанные с диагностикой и лечением болезни Лайма, являются существенными стимулами для разработки эффективных вакцин. С другой стороны, существуют сомнения в отношении разработки вакцин и их использования, особенно у человека. Основными причинами являются отсутствие контагиозности заболевания, то, что его довольно просто можно лечить антибиотиками, а клинические проявления с серьезными последствиями возникают только у части инфицированных пациентов. Более того, это заболевание редко заканчивается летальным исходом. Таким образом, опасение, связанное с возможными побочными эффектами новой вакцины, которая, в данных условиях, была бы с трудом разрешена к применению, не является неожиданностью, как описано в статье "Experimental immunization against Lyme borreliosis with recombinant Osp proteins: an overview" (Sadziene A, Barbour AG., Infecrion. 1996 Mar-Apr;24(2): 195-202).Serious damage to the mammalian host, as well as problems associated with the diagnosis and treatment of Lyme disease, are significant incentives for the development of effective vaccines. On the other hand, there are doubts about the development of vaccines and their use, especially in humans. The main reasons are the lack of contagiousness of the disease, the fact that it can be treated quite simply with antibiotics, and clinical manifestations with serious consequences occur only in some infected patients. Moreover, this disease rarely ends in death. Thus, the concern about the possible side effects of the new vaccine, which, under these conditions, would have been difficult to resolve, is not unexpected, as described in the article "Experimental immunization against Lyme borreliosis with recombinant Osp proteins: an overview" ( Sadziene A, Barbour AG., Infecrion. 1996 Mar-Apr; 24 (2): 195-202) .
Первая ветеринарная вакцина против боррелиоза была разработана для собак в Соединенных Штатах в 1990 году. Лицензия для нее была получена в 1992 году, в соответствии со статьями "Performance of a Borrelia burgdorferi bacterin in borreliosis-endemic areas" (Levy SA, Lissman BA, Ficke СМ., J Am Vet Med Assoc. 1993 Jun 1;202(11):1834-8) and "Immunization against Lyme Disease?" (Wormser, GP., Ann Intern Med 123,627-629,1995). The first veterinary vaccine against borreliosis was developed for dogs in the United States in 1990. A license for it was obtained in 1992, in accordance with the articles “Performance of a Borrelia burgdorferi bacterin in borreliosis-endemic areas” (Levy SA, Lissman BA, Ficke CM., J Am Vet Med Assoc. 1993 Jun 1; 202 (11 ): 1834-8) and "Immunization against Lyme Disease?" (Wormser, GP., Ann Intern Med 123,627-629,1995).
Цельноклеточную, химически инактивированную вакцину применяют с использованием носителя, содержащего вещество полимерного адъюванта. Вакцину применяют внутримышечно, дважды с интервалом в две или три недели. Поддерживающая доза (ревакцинация) рекомендована по прошествии года. Вакцинация домашних животных, особенно собак, рекомендована независимо от того, было ли животное инфицировано или заболевание как раз на стадии прогрессирования. Получение данной вакцины основано на знаниях, полученных в экспериментах на грызунах. Протективный эффект цельноклеточной вакцины впервые описан у хомяков.A whole cell, chemically inactivated vaccine is used using a carrier containing a polymeric adjuvant substance. The vaccine is administered intramuscularly, twice with an interval of two or three weeks. A maintenance dose (revaccination) is recommended after one year. Vaccination of domestic animals, especially dogs, is recommended regardless of whether the animal was infected or the disease is just at the stage of progression. Obtaining this vaccine is based on knowledge obtained in experiments on rodents. The protective effect of the whole-cell vaccine was first described in hamsters.
Разработке цельноклеточной вакцины для ветеринарных целей, главным образом, способствовали простой способ получения и низкая стоимость. Однако эта вакцина не была рекомендована для использования у людей из-за того, что некоторые антигены боррелии реагируют с антигенами человека, и, таким образом, нельзя исключить стимуляцию иммунопатологических процессов, как описано в "Molecular mimicry and Lyme borreliosis: a shared antigenic determinant between Borrelia burgdorferi and human tissue" (Aberer E et al., Ann Neurol. 1989 Dec; 26(6)732-7) или "Serologic response to the Borrelia burgdorferi flagellin demonstrates an epitope common to a neuroblastoma cell line". (Fikrig et al. 1993, Proc Nat Acad Sci USA. 1993 Jan 1;90(1): 183-7). The development of a whole-cell vaccine for veterinary purposes was mainly promoted by a simple method of preparation and low cost. However, this vaccine was not recommended for use in humans because some Borrelia antigens react with human antigens, and thus the stimulation of immunopathological processes cannot be ruled out, as described in Molecular mimicry and Lyme borreliosis: a shared antigenic determinant between Borrelia burgdorferi and human tissue "(Aberer E et al., Ann Neurol. 1989 Dec; 26 (6) 732-7) or" Serologic response to the Borrelia burgdorferi flagellin demonstrates an epitope common to a neuroblastoma cell line ". (Fikrig et al. 1993, Proc Nat Acad Sci USA. 1993 Jan 1; 90 (1): 183-7).
Получены данные, что некоторые антигены Borrelia burgdorferi активируют пул специфичных T лимфоцитов, принимающих участие в развитии артрита у хомяков, смотри "Involvement of CD4+ T lymphocytes in induction of severe destructive Lyme arthritis in inbred LSH hamsters" (Lim LC et al., Infect Immun. 1995 Dec; 63(12):4818-25). It was found that some Borrelia burgdorferi antigens activate a pool of specific T lymphocytes involved in the development of arthritis in hamsters, see "Involvement of CD4 + T lymphocytes in induction of severe destructive Lyme arthritis in inbred LSH hamsters" (Lim LC et al., Infect Immun 1995 Dec; 63 (12): 4818-25).
Кролики оказывались защищенными от инфекции, если перед проведением экспериментального заражения применяли иммунную сыворотку, полученную после иммунизации животных иммуногенными белками штамма боррелии. Введение иммунной сыворотки после возникновения инфекции не препятствовало развитию мигрирующей эритемы и висцеральных типов проявления инфекции. Аналогичные результаты также были получены для мышей и хомяков и описаны в "Serum-mediated resolution of Lyme arthritis in mice" (Barthold SW et al, Lab. Invest. 1996, Jan;74(1):57-67) или "Protective and arthritis-resolving activity in sera of mice infected with Borrelia burgdorferi" (Barthold SW et al., Clin Infect Dis 1997 Jul; 25 Suppl 1:S9-17.) или "Experimental infection of the hamster with Borrelia Burgdorferi" (Johnson RC et al., Ann Acad Sci. 1988;539:258-63). Rabbits were protected from infection if, before carrying out experimental infection, they used the immune serum obtained after immunization of animals with immunogenic proteins of the Borrelia strain. The introduction of immune serum after infection did not prevent the development of migratory erythema and visceral types of infection. Similar results were also obtained for mice and hamsters and are described in "Serum-mediated resolution of Lyme arthritis in mice" (Barthold SW et al, Lab. Invest. 1996, Jan; 74 (1): 57-67) or "Protective and arthritis-resolving activity in sera of mice infected with Borrelia burgdorferi "(Barthold SW et al., Clin Infect Dis 1997 Jul; 25 Suppl 1: S9-17.) or " Experimental infection of the hamster with Borrelia Burgdorferi "(Johnson RC et al., Ann Acad Sci. 1988; 539: 258-63).
Полученные экспериментальные данные подчеркивают возможность разработки безопасной субъединичной вакцины. Основными антигенами-кандидатами такой вакцины являются белки наружной мембраны (Osp), обозначенные как OspA, В, С и D. Особенно тщательно исследовали белок OspA. Протективный эффект данной субъединичной вакцины экспериментально подтвердили на мышах, хомяках и кроликах и описали в статьях "Protection of mice against the Lyme Disease agent by immunizing with recombinant OspA" (Firking E et al., Science 1990 Oct 26; 250(4980):553-6) и "Long-term protection of mice from Lyme Disease by vaccination with OspA" (Firking E et al., Infect Immun. 1992 Mar; 60(3):773-7). Лабораторные тесты подтвердили, что применение этого белка в форме очищенного рекомбинантного белка, полученного путем образования соединения с липидами, при парентеральном введении стимулирует защитный иммунитет и защищает от боррелиозной инфекции, внесенной посредством инъекции или через клещевого переносчика инфекции. Также было подтверждено, что зараженные клещи, присасавшиеся к иммунизированным животным, теряли свою инфективность, как описано в "Safety and immunogenicity of a recombinant outer surface protein A Lyme vaccine" (Keller D et al., JAMA. 1994 Jun 8;271(22): 1764-8) или "Elimination of Borrelia burgdorferi from vector ticks feeding on OspA-immunized mice" (Firking E et al.,Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Jun 15;89(12):5418-21).The obtained experimental data emphasize the possibility of developing a safe subunit vaccine. The main candidate antigens for such a vaccine are the outer membrane proteins (Osp), designated as OspA, B, C, and D. The OspA protein has been carefully studied. The protective effect of this subunit vaccine was experimentally confirmed in mice, hamsters, and rabbits and described in the articles "Protection of mice against the Lyme Disease agent by immunizing with recombinant OspA" (Firking E et al., Science 1990 Oct 26; 250 (4980): 553 -6) and "Long-term protection of mice from Lyme Disease by vaccination with OspA" (Firking E et al., Infect Immun. 1992 Mar; 60 (3): 773-7). Laboratory tests have confirmed that the use of this protein in the form of a purified recombinant protein obtained by forming a compound with lipids, when administered parenterally, stimulates protective immunity and protects against borreliosis infection by injection or tick-borne infection. It has also been confirmed that infected ticks adhering to immunized animals lose their infectivity as described in Safety and immunogenicity of a recombinant outer surface protein A Lyme vaccine (Keller D et al., JAMA. 1994 Jun 8; 271 (22 ): 1764-8) or "Elimination of Borrelia burgdorferi from vector ticks feeding on OspA-immunized mice" (Firking E et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Jun 15; 89 (12): 5418-21) .
В случае отсутствия липидных частиц, образование антител путем стимуляции требует адъювантного эффекта полного адъюванта Фрейнда или другого иммунного адъюванта, как описано в статье "Role of attached lipid in immunogenicity of Borrelia burgdorferi OspA" (Erdile IF et al., Infect Immun. 1993 Jan;61(1):81-90). При этом отмечено на два возможных эффекта вакцинации:In the absence of lipid particles, the formation of antibodies by stimulation requires the adjuvant effect of Freund's complete adjuvant or other immune adjuvant, as described in the article "Role of attached lipid in immunogenicity of Borrelia burgdorferi OspA" (Erdile IF et al., Infect Immun. 1993 Jan; 61 (1): 81-90). At the same time, two possible effects of vaccination were noted:
(1) Спирохеты инактивированы уже в организме клеща и, таким образом, предотвращается передача инфекции,(1) Spirochetes are inactivated already in the tick body and, thus, transmission of the infection is prevented,
(2) Спирохеты могут быть быстро инактивированы после попадания в организм хозяина, непосредственно перед антигенными вариациями и снижением выработки антигена OspA.(2) Spirochetes can be rapidly inactivated after ingestion of the host, immediately before antigenic variation and decreased production of OspA antigen.
Для подтверждения протективного эффекта антигена OspA были получены две различные конструкции и составы вакцины:To confirm the protective effect of the OspA antigen, two different vaccine designs and compositions were obtained:
1. Нативный и очищенный рекомбинантный OspA, описанный в "Recombinant outer surface protein A from Borrelia burgdorferi induces antibody protective against spirochetal infection in mice" (Simon MM et al.,.J Infect Dis. 1991 Jul;164(1):123-32). 1. Native and purified recombinant OspA described in "Recombinant outer surface protein A from Borrelia burgdorferi induces antibody protective against spirochetal infection in mice" (Simon MM et al.,. J Infect Dis. 1991 Jul; 164 (1): 123- 32).
2. OspA, включенный в геном BCG (Calmette, Guerin). OspA экспрессируется снаружи в качестве мембрано-связанного липопротеина, как следует из статьи "Protective immunity elicited by rBCG viccines" (Stover CK et al., Dev Biol Stand. 1994; 82:163-70). В данной форме OspA исследовали при внутрибрюшинном и интраназальном введении, как опубликовано в "Systemic and mucosal immunity induced by BCG vector expressing outer-surface protein A of Borrelia burgdorferi" (Langermann S et al., Nature. 1994 Dec 8;372(6506):552-5). При применении в данной форме, специфичные антитела IgG и IgA вырабатывались в течение длительного времени, что очевидно из статьи "Protective immunity elicited by recombinant bacille Calmette-Guerin (BCG) expressing outer surface protein A (OspA) lipoprotein: a candidate Lyme Disease vaccine" (Stover CK et al., J Exp Med. 1993 Jul 1;178(1):197-209). 2. OspA included in the BCG genome (Calmette, Guerin). OspA is expressed externally as a membrane-bound lipoprotein, as follows from the article "Protective immunity elicited by rBCG viccines" (Stover CK et al., Dev Biol Stand. 1994; 82: 163-70). In this form, OspA was studied by intraperitoneal and intranasal administration, as published in "Systemic and mucosal immunity induced by BCG vector expressing outer-surface protein A of Borrelia burgdorferi" (Langermann S et al., Nature. 1994 Dec 8; 372 (6506) : 552-5). When used in this form, specific IgG and IgA antibodies have been produced for a long time, as is evident from the article "Protective immunity elicited by recombinant bacille Calmette-Guerin (BCG) expressing outer surface protein A (OspA) lipoprotein: a candidate Lyme Disease vaccine" (Stover CK et al., J Exp Med. 1993 Jul 1; 178 (1): 197-209).
В настоящее время существует единственный производитель данной вакцины для применения у человека в Соединенных Штатах Америки. Вакцина была одобрена управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration, FDA) 21-го декабря 1998 и описана в исследовании "Vaccination against Lyme Disease with recombinant Borrelia burgdorferi outer-surface lipoprotein A with adjuvant. Lyme Disease Vaccine Study Group" (Steere AC et al., N Engl J Med, 1998 Jul 23; 339(4):209-15). Продукт LYMErix производится SmithKline Beecham. Согласно третьей фазе клинических испытаний, вакцина обеспечивает 80-90% защиту, что подтверждено в статье "A vaccine, consisting of recombinant Borrelia burgdorferi outer-surface protein A to prevent Lyme Disease. Recombinant Outer-Surface protein A Lyme Disease Vaccine Study Consortium" (Sigal LH et al., N Engl J Med. 1998 Jul 23; 339(4):216-22. Erratum in: N Engl J Med 1998 Aug 20; 339(8):571). There is currently the only manufacturer of this vaccine for human use in the United States of America. The vaccine was approved by the Food and Drug Administration (FDA) on December 21, 1998 and described in the study "Vaccination against Lyme Disease with recombinant Borrelia burgdorferi outer-surface lipoprotein A with adjuvant. Lyme Disease Vaccine Study Group "(Steere AC et al., N Engl J Med, 1998 Jul 23; 339 (4): 209-15). LYMErix product is manufactured by SmithKline Beecham. According to the third phase of clinical trials, the vaccine provides 80-90% protection, as confirmed in the article "A vaccine, consisting of recombinant Borrelia burgdorferi outer-surface protein A to prevent Lyme Disease. Recombinant Outer-Surface protein A Lyme Disease Vaccine Study Consortium" ( Sigal LH et al., N Engl J Med. 1998 Jul 23; 339 (4): 216-22. Erratum in: N Engl J Med 1998 Aug 20; 339 (8): 571).
Хотя вакцина уже получила распространение, из-за минимальных сведений о ее долговременном применении, она находится под постоянным контролем. Для достижения максимального иммунного ответа, вакцину применяют инъекционно три раза в течение 12-месячного периода (0, 1, 12). Эффективность вакцины описал, например, Wahlberg, который утверждал, что эффективность вакцины составляла 50% (1 год) после двух доз рекомбинантного белка OspA, связанного с гидроксидом алюминия в фосфатном буфере, и 79% после трех доз вакцины (20 месяцев). Титр антител достаточно быстро снижался и через два года достигал уровня первого года вакцинации (50% эффективность). Данные о вторичном иммунном ответе отсутствуют. Согласно данным, не разрешено применение вакцины у детей в возрасте до 15 лет и у людей, страдающих аутоиммунными заболеваниями, в частности артритом. В группе из 5765 вакцинированных людей артрит развился у двух человек с фенотипом HLA-DR4, как опубликовано в статье "Guarded endorsement for Lyme Disease vaccine" (Marwick C, JAMA. 1998 Jun 24;279(24):1937-8). Although the vaccine has already gained distribution, due to minimal information about its long-term use, it is under constant monitoring. To achieve the maximum immune response, the vaccine is injected three times over a 12-month period (0, 1, 12). The effectiveness of the vaccine was described, for example, by Wahlberg, who claimed that the effectiveness of the vaccine was 50% (1 year) after two doses of recombinant OspA protein bound to aluminum hydroxide in phosphate buffer, and 79% after three doses of the vaccine (20 months). The antibody titer decreased quite quickly and after two years reached the level of the first year of vaccination (50% effectiveness). There is no evidence of a secondary immune response. According to the data, the use of the vaccine is not allowed in children under the age of 15 years and in people suffering from autoimmune diseases, in particular arthritis. In a group of 5765 vaccinated people, arthritis developed in two people with the HLA-DR4 phenotype, as published in the article "Guarded endorsement for Lyme Disease vaccine" (Marwick C, JAMA. 1998 Jun 24; 279 (24): 1937-8).
Коммерчески доступную вакцину получают из белка OspA из Borrelia burgdorferi sensu stricto. В связи с тем, что эта бактерия является доминантным инфекционным возбудителем болезни Лайма на Северо-Американском континенте, вакцина может быть достаточно эффективной в отношении населения США. В Европе, однако, это заболевание, главным образом, вызывают следующие три патогенных подвида, т.е. Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii и Borrelia garinii. На Европейском континенте антигенная вариабельность была описана для всех данных видов. Таким образом, вакцина для применения у людей и в ветеринарии, полученная только из вида Borrelia burgdorferi sensu stricto является непригодной для применения в Европе. Для разработки эффективной формы вакцины применяли новые направления технологий вакцинации. Например, об эффективной ДНК вакцине опубликовано в "Protective immunization with plasmid DNA containing the outer surface lipoprotein A gene of Borrelia burgdorferi is independent of an eukaryotic promoter" (Simon MM et al., Eur J Immunol. 1996 Dec;26(12):2831-40) или "DNA vaccines expressing a fusion product of outer surface proteins A and С from Borrelia burgdorferi induce protective antibodies suitable for prophylaxis but not for resolution of Lyme Disease" (Wallich R. et al., Infect Immun. 2001 Apr;69(4):2130-6). A commercially available vaccine is obtained from the OspA protein from Borrelia burgdorferi sensu stricto . Due to the fact that this bacterium is the dominant infectious causative agent of Lyme disease in the North American continent, the vaccine can be quite effective against the US population. In Europe, however, this disease is mainly caused by the following three pathogenic subspecies, i.e. Borrelia burgdorferi sensu stricto , Borrelia afzelii and Borrelia garinii . On the European continent, antigenic variability has been described for all of these species. Thus, a vaccine for use in humans and in veterinary medicine, obtained only from the species Borrelia burgdorferi sensu stricto, is unsuitable for use in Europe. To develop an effective form of the vaccine, new directions of vaccination technologies were used. For example, an effective DNA vaccine is published in "Protective immunization with plasmid DNA containing the outer surface lipoprotein A gene of Borrelia burgdorferi is independent of an eukaryotic promoter" (Simon MM et al., Eur J Immunol. 1996 Dec; 26 (12): 2831-40) or "DNA vaccines expressing a fusion product of outer surface proteins A and C from Borrelia burgdorferi induce protective antibodies suitable for prophylaxis but not for resolution of Lyme Disease" (Wallich R. et al., Infect Immun. 2001 Apr; 69 (4): 2130-6).
Другой возможностью является получение вакцины из белка OspC, экспрессируемого на поверхности микроорганизмов, находящихся в организме хозяина. По данным литературы, гуморальный иммунитет против данного белка носит протективный характер, как описано в "Protective immunization with plasmid DNA containing the outer surface lipoprotein A gene of Borrelia burgdorferi is independent of an eukaryotic promoter" (Simon MM et al., Eur. J. Immunol. 26, 2831-2840, 1996). Another possibility is to obtain a vaccine from the OspC protein expressed on the surface of microorganisms in the host body. According to the literature, humoral immunity against this protein is protective in nature, as described in "Protective immunization with plasmid DNA containing the outer surface lipoprotein A gene of Borrelia burgdorferi is independent of an eukaryotic promoter" (Simon MM et al., Eur. J. Immunol. 26, 2831-2840, 1996).
OspC является основным мембранным антигеном, экспрессируемым на ранней стадии инфекции. В случае Borrelia burgdorferi sensu stricto, антиген OspC является высоко вариабельным. Двадцать одна аллельная группа, известная как A-U, была обнаружена для этого антигена с помощью эпидемиологического анализа и секвенирования генов OspC конкретных штаммов и с использованием GeneBank, как описано в "Four clones of Borrelia burgdorferi sensu stricto case invasive infection in humans" (Seinost G et al., Infect. Immun. 67, 3518-3524, 1999). OspC is the primary membrane antigen expressed at an early stage of infection. In the case of Borrelia burgdorferi sensu stricto , the OspC antigen is highly variable. Twenty-one allelic groups, known as AUs, were detected for this antigen by epidemiological analysis and sequencing of the OspC genes of specific strains and using GeneBank as described in “Four clones of Borrelia burgdorferi sensu stricto case invasive infection in humans” (Seinost G et al., Infect. Immun. 67, 3518-3524, 1999).
Наружный поверхностный антиген A (OspA) является основным поверхностным антигеном, который Borrelia burgdorferi экспрессирует вовне, когда находится внутри клеща. В момент, когда клещ начинает сосать кровь млекопитающего, синтез этого антигена возобновляется, а синтез антигена OspC наоборот усиливается. Таким образом, OspC становится основным антигеном наружной поверхности мембраны на ранней стадии инфекции, который описан, например, в "Induction of an outer surface protein of Borrelia burgdorferi during tick feeding" (Schwan TG et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 2909-2913. 1995). Хотя и было показано, что OspC ограниченно присутствует на поверхности, он является мощным иммуногеном. Иммунизация с помощью OspC защищает от боррелиозной инфекции. Однако защита связана с конкретным аллелем OspC, который контролирует синтез конкретного белка. Инфекция другим видом боррелии вызывает заболевание у индивида, подвергнутого иммунизации. Это, естественным образом, ограничивает использование данного антигена, полученного только из одного геновида боррелии, при получении универсальной вакцины.The outer surface antigen A (OspA) is a principal surface antigen that expresses a Borrelia burgdorferi outwards when situated inside the tick. At the moment when the tick begins to suck the blood of a mammal, the synthesis of this antigen resumes, and the synthesis of the OspC antigen, on the contrary, intensifies. Thus, OspC becomes the main antigen of the outer surface of the membrane at an early stage of infection, which is described, for example, in "Induction of an outer surface protein of Borrelia burgdorferi during tick feeding" (Schwan TG et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 2909-2913. 1995). Although it has been shown that OspC is limitedly present on the surface, it is a potent immunogen. OspC immunization protects against borreliosis infection. However, protection is associated with a specific OspC allele, which controls the synthesis of a particular protein. Infection with another type of borrelia causes a disease in the immunized individual. This, of course, limits the use of this antigen, obtained from only one genus of Borrelia, in the preparation of a universal vaccine.
Таким образом, вопрос об успешной вакцинации против болезни Лайма остается открытым. Более того, в Европе это осложняется существованием трех различных геновидов (Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii и Borrelia garinii) и возникновением болезни Лайма не только у людей, но также у разных видов домашних животных и скота. Проблемы, касающиеся этого заболевания у собак и кошек, описаны в "Canine borreliosis" (Littman MP, Vet Clin Small Anim 33, 2003, 827-862), а заболеваемость лошадей рассмотрена в "Equine Abortion Associated with the Borrelia parker i- B. turicatae Tick-Borne Relapsing Fever Spirochete Group" (Walker RL et al., Journal of Clinical Microbiology, 2002, 40, 4, 1558-1562). Thus, the question of successful vaccination against Lyme disease remains open. Moreover, in Europe this is complicated by the existence of three different genovids ( Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii and Borrelia garinii ) and the occurrence of Lyme disease not only in humans, but also in different species of domestic animals and livestock. Problems with this disease in dogs and cats are described in Canine borreliosis (Littman MP, Vet Clin Small Anim 33, 2003, 827-862), and the incidence of horses is addressed in Equine Abortion Associated with the Borrelia parker i-B. turicatae Tick-Borne Relapsing Fever Spirochete Group "(Walker RL et al., Journal of Clinical Microbiology, 2002, 40, 4, 1558-1562).
Livey et al. попытались преодолеть эти проблемы получением так называемой "вакцины-коктейля". Их результаты опубликованы в "OspC vaccine candidate" (Abstract of the Symposium on the Pathogenesis and Management of Tick-borne Diseases. 1998 Sept. 28-30. Vienna, Austria. 1998). Livey et al. tried to overcome these problems by obtaining the so-called "vaccine-cocktail." Their results are published in the OspC vaccine candidate (Abstract of the Symposium on the Pathogenesis and Management of Tick-borne Diseases. 1998 Sept. 28-30. Vienna, Austria. 1998).
Вместе с существующими проблемами диагностики и лечения болезни Лайма, а также из-за невозможности эффективно контролировать и сокращать распространение векторов боррелий, существует экстренная необходимость в вакцине, способной осуществлять эффективную иммунизацию восприимчивых видов домашних животных и скота, а также людей против инфекции, вызываемой Borrelia burgdorferi sensu lato. Вакцины, созданные на основе цельноклеточной бактериальной вакцины из Borrelia burgdorferi, были разработаны для домашних животных, как, например, описано в патентных документах US 4721617, US 6316005. Аналогично, вакцины, содержащие OspA, OspC или другие иммуногенные белки наружной поверхности, полученные из культур культивируемых боррелий, вырабатываемые в качестве рекомбинантных белков в различных клетках-хозяевах (E. coli), или полученные синтетически, были разработаны как описано в документах WO 094/25596, WO 96/05313, WO 9749812, US 6716574, US 2004067517, US 6676942, WO 0216422, US 5530103, US 6486130, US 6464985, EP 633028).Along with the existing problems in the diagnosis and treatment of Lyme disease, and also because of the inability to effectively control and reduce the spread of Borrelia vectors, there is an urgent need for a vaccine capable of effectively immunizing susceptible species of domestic animals and livestock, as well as people against Borrelia burgdorferi infection sensu lato . Vaccines based on the whole-cell bacterial vaccine from Borrelia burgdorferi have been developed for domestic animals, as, for example, described in patent documents US 4721617, US 6316005. Similarly, vaccines containing OspA, OspC or other immunogenic proteins of the outer surface obtained from cultures cultured borrelia, produced as recombinant proteins in various host cells ( E. coli ), or synthetically prepared, were developed as described in documents WO 094/25596, WO 96/05313, WO 9749812, US 6716574, US 2004067517, US 6676942 , WO 0216422, US 5530103, US 6486130, US 646 4985, EP 633028).
Однако эти цельноклеточные или субъединичные вакцины не включали защиту от полного спектра патогенных боррелий всех геновидов, главным образом, Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii и Borrelia afzelii и других, в зависимости от конкретного случая. Вакцины всегда производят из единственного геновида - Borrelia burgdorferi sensu stricto. However, these whole-cell or subunit vaccines did not include protection against the full spectrum of pathogenic borrelia of all genes, mainly Borrelia burgdorferi sensu stricto , Borrelia garinii and Borrelia afzelii and others, as the case may be. Vaccines are always produced from a single genotype - Borrelia burgdorferi sensu stricto.
Задачей по данному изобретению является предоставление новой универсальной вакцины, содержащей основные иммуногенные белки OspA и OspC в различных комбинациях из одного двух или, предпочтительно, всех трех широко известных патогенных геновидов, т.е. Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii и Borrelia afzelii, или, возможно, других, которую можно успешно применять без каких-либо территориальных ограничений.The objective of this invention is to provide a new universal vaccine containing the main immunogenic proteins OspA and OspC in various combinations of one of two or, preferably, all three well-known pathogenic genovidov, i.e. Borrelia burgdorferi sensu stricto , Borrelia garinii and Borrelia afzelii , or, possibly, others, which can be successfully applied without any territorial restrictions.
ОБЪЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯOBJECT OF THE INVENTION
Упомянутая выше цель достигается созданием универсальной вакцины для лечения и профилактики болезни Лайма для использования у людей и в ветеринарии, созданной на основе цельноклеточной бактериальной вакцины или бактериальных лизатов или очищенных препаратов из, по меньшей мере, одного или нескольких геновидов боррелий, суть чего заключается в том факте, что каждый геновид боррелии, предпочтительно выбранный из группы Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii и Borrelia garinii, содержит, как минимум, один иммуногенный протективный белок наружной мембраны, либо OspA или OspC или одновременно оба иммуногенных протективных белка OspA и OspC, или, возможно, другие иммуногенные протективные белки наружной мембраны.The goal mentioned above is achieved by creating a universal vaccine for the treatment and prevention of Lyme disease for use in humans and in veterinary medicine, created on the basis of a whole-cell bacterial vaccine or bacterial lysates or purified preparations from at least one or more genes of Borrelia, the essence of which is fact that each genospecies of Borrelia, preferably selected from the group of Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii and Borrelia garinii, contains as a minimum one immunogenic protective protein of outer membrane , Either OspA or OspC, or simultaneously both the immunogenic protective proteins OspA and OspC, or possibly other immunogenic protective proteins of outer membrane.
Предпочтительный вариант вакцины включает все три наиболее патогенных геновида - Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii и Borrelia garrinii, каждый из которых содержит одновременно оба иммуногенных протективных белка наружной мембраны OspA и OspC.The preferred vaccine variant includes all three of the most pathogenic genes - Borrelia burgdorferi sensu stricto , Borrelia afzelii and Borrelia garrinii , each of which simultaneously contains both immunogenic protective proteins of the outer membrane of OspA and OspC.
Более того, объектом по настоящему изобретению является то, что иммуногенные протективные белки наружной мембраны OspA и OspC включены в вакцину предпочтительно в соотношении 1:1, то, что вакцину выпускают в лиофилизированной или жидкой форме или применяют в буферном физиологическом растворе или с минеральным или масляным иммунологическим адъювантом, или, возможно, с другими иммуномодулирующими средствами, и то, что величина pH вакцины находится в диапазоне 4-9.Moreover, the object of the present invention is that the immunogenic protective proteins of the outer membrane of OspA and OspC are included in the vaccine, preferably in a 1: 1 ratio, that the vaccine is released in lyophilized or liquid form or used in physiological buffered saline or mineral or oil immunological adjuvant, or, possibly, with other immunomodulatory agents, and the fact that the pH of the vaccine is in the range of 4-9.
В заключение, объектом по настоящему изобретению является способ производства универсальной вакцины для лечения и профилактики болезни Лайма у людей и применения в ветеринарии по пп.1-5, в течение которого каждый производственный штамм боррелии, культивируют, инактивируют и независимо проверяют перед составлением смеси, где культура пролиферирует и воспроизводится предпочтительно при 26-35°C в течение 6-18 суток (каждый этап) для экспрессии антигена OspA и при 36-38°C в течение 6-18 суток (каждый этап) для экспрессии антигена OspC.In conclusion, the object of the present invention is a method for the production of a universal vaccine for the treatment and prevention of Lyme disease in humans and for use in veterinary medicine according to claims 1-5, during which each production strain of Borrelia is cultivated, inactivated and independently checked before preparation of the mixture, where the culture proliferates and reproduces preferably at 26-35 ° C for 6-18 days (each stage) for the expression of the OspA antigen and at 36-38 ° C for 6-18 days (each stage) for the expression of the OspC antigen.
Новый эффект представленного изобретения заключается в том, что специфичные антитела к OspA и OspC вырабатываются в организме подвергнутых вакцинации животных и людей после применения вакцины, которая предотвращает перенос патогенных боррелий из клеща в подвергнутый вакцинации организм (антитела к OspA) и обеспечивают гибель боррелий вскоре после возможного переноса патогенных боррелий в подвергнутый вакцинации организм (антитела к OspC) и, возможно, в образовании других поствакцинационных протективных антител, это не определено в деталях, и в стимуляции иммунных механизмов. Другим полезным эффектом является то, что помимо общепринятого применения у взрослых особей, вакцину можно применять у молодых домашних животных (предпочтительно, собак и кошек) и молодого скота (предпочтительно, лошадей) в возрасте от 3 недель для индукции активного протективного иммунитета против болезни Лайма. Аналогично, вакцину можно применять одновременно с другими препаратами, лекарственными средствами и вакцинами против вирусных, бактериальных, грибковых и других заболевания у собак, кошек, лошадей и других видов животных, для которых предназначена вакцина.A new effect of the present invention is that specific antibodies to OspA and OspC are produced in the body of vaccinated animals and humans after the use of a vaccine that prevents the transfer of pathogenic borrelia from the tick to the vaccinated organism (antibodies to OspA) and ensures the death of borrelia shortly after the possible transfer of pathogenic borrelia to the vaccinated organism (antibodies to OspC) and, possibly, to the formation of other post-vaccination protective antibodies, this is not defined in detail, and in stimulation of immune mechanisms. Another useful effect is that, in addition to the generally accepted use in adults, the vaccine can be used in young domestic animals (preferably dogs and cats) and young cattle (preferably horses) from 3 weeks old to induce active protective immunity against Lyme disease. Similarly, the vaccine can be used simultaneously with other drugs, medicines and vaccines against viral, bacterial, fungal and other diseases in dogs, cats, horses and other animal species for which the vaccine is intended.
ПРИМЕРЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯEXAMPLES OF IMPLEMENTATION
Пример № 1:Example No. 1:
Данный пример осуществления демонстрирует подтверждение протективности универсальной вакцины после иммунизации экспериментальных кошек, собак и лошадей против инфекции, вызываемой вирулентными штаммами Borrelia burgdorferi sensu lato, однако, ни в одном из случаев не ограничивает патентные права, относящиеся к данной патентной заявке.This embodiment demonstrates confirmation of the efficacy of a universal vaccine after immunization of experimental cats, dogs and horses against infection caused by virulent strains of Borrelia burgdorferi sensu lato , however, in no case does it limit the patent rights related to this patent application.
Получение экспериментального образца вакцины и результаты эксперимента:Obtaining an experimental sample of the vaccine and the results of the experiment:
A) Культивирование производственных штаммов боррелий, экспрессирующих антиген OspA:A) Cultivation of production strains of borrelia expressing the OspA antigen:
Во время культивирования производственных штаммов боррелий, экспрессирующих антиген OspA, в качестве исходных составляющих на начальном этапе использовали следующие средства:During the cultivation of production strains of borrelia expressing the OspA antigen, the following agents were used as initial components at the initial stage:
- среда BSK-H + кроличья сыворотка- medium BSK-H + rabbit serum
- среда BSK-H, полная- BSK-H environment, complete
вместе с производственными штаммами Borrelia afzelii, Borrelia garinii и Borrelia burgdorferi sensu stricto согласно следующей схеме технологии производства:together with the production strains of Borrelia afzelii , Borrelia garinii and Borrelia burgdorferi sensu stricto according to the following scheme of production technology:
Собственно культивирование осуществляют в пластиковых или стеклянных матрасах Ру, предназначенных для культивирования культур боррелий. Культуральную среду BSK обогащают 6% стерильной кроличьей сывороткой, подходящей для культивирования боррелий, перед самим культивированием, или можно использовать полную среду BSK-H, содержащую 6% кроличью сыворотку. Исходный и рабочий производственные штаммы поддерживают в жидком азоте при -196°C.The actual cultivation is carried out in plastic or glass mattresses Ru, intended for the cultivation of Borrelia cultures. The BSK culture medium is enriched with 6% sterile rabbit serum suitable for culturing borrelia before the cultivation itself, or full BSK-H medium containing 6% rabbit serum can be used. The starting and working production strains are maintained in liquid nitrogen at -196 ° C.
Для восстановления культуры, ампулу с культурой достают из жидкого азота и размораживают приблизительно при 30°C. Сразу после размораживания культуру пересевают в пробирку с питательной средой, нагретую до приблизительно 28°C в соотношении 1+9 (1 часть культуры + 9 частей среды). Каждый штамм культивируют отдельно. Инкубацию осуществляют при 26-35°C в течение от 6 до 18 суток.To restore the culture, the culture vial is removed from liquid nitrogen and thawed at approximately 30 ° C. Immediately after thawing, the culture is transplanted into a test tube with a nutrient medium heated to approximately 28 ° C in a ratio of 1 + 9 (1 part of the culture + 9 parts of the medium). Each strain is cultivated separately. Incubation is carried out at 26-35 ° C for 6 to 18 days.
При размножении культуры, за хорошо растущей, жизнеспособной культурой (когда красный цвет среды изменяется на желтый) наблюдают в микроскоп и в стерильных условиях пересевают в питательную среду в соотношении 1 часть культуры + 9 частей среды. Культивирование проводят при 26-35°C в течение 6-10 суток. Дальнейшие пассажи хорошо растущих боррелий проводят в соотношении 1 часть культуры: от 10 до 100 частей культуральной среды. Число дальнейших пассажей зависит от количества боррелий, необходимого для получения вакцины.When propagating the culture, a well-growing, viable culture (when the red color of the medium changes to yellow) is observed under a microscope and, under sterile conditions, is subcultured into the nutrient medium in the ratio of 1 part of the culture + 9 parts of the medium. Cultivation is carried out at 26-35 ° C for 6-10 days. Further passages of well-growing borrelia are carried out in a ratio of 1 part of the culture: from 10 to 100 parts of the culture medium. The number of further passages depends on the number of borrelia needed to receive the vaccine.
При получении культуры для производства вакцины, взрослые культуры после предыдущих культивирований в стерильных условиях используют в качестве посевной культуры, применяемой в бульоне во флаконах объемом 1000-мл в соотношении 1 часть культуры: от 10 до 100 частей культуральной среды. Культивирование проводят при 26-35°C в течение 6-10 суток.Upon receipt of the culture for the production of vaccines, adult cultures after previous cultivations under sterile conditions are used as a seed culture used in broth in 1000-ml bottles in the ratio of 1 part of the culture: from 10 to 100 parts of the culture medium. Cultivation is carried out at 26-35 ° C for 6-10 days.
Количество боррелий определяют в темном поле микроскопа с помощью значений счетной камеры Петрова-Хауссера.The number of borrelia is determined in the dark field of the microscope using the values of the Petrov-Hausser counting chamber.
В ходе процесса, контроль за ростом культуры и чистотой осуществляют макроскопически, микроскопически и наблюдением за культивированием. Макроскопическое наблюдение состоит в визуальном наблюдении за тем, изменяет ли соответствующая культура красный цвет культуральной среды на желтый, и присутствует ли в среде осадок. При микроскопическом наблюдении за темными полями в микроскопе осуществляют контроль за достаточной подвижностью боррелий и наличием небольшого количества детрита, без каких-либо признаков бактериальной контаминации. При наблюдении за культивированием, 0,5 мл оцениваемой культуры боррелий переносят на предварительно высушенный кровяной агар и проводят культивирование при 35-37°C в течение 48 часов.During the process, control of culture growth and purity is carried out macroscopically, microscopically and by monitoring the cultivation. Macroscopic observation consists in visual observation of whether the corresponding culture changes the red color of the culture medium to yellow, and whether a precipitate is present in the medium. Microscopic observation of dark fields in a microscope controls the sufficient mobility of borrelia and the presence of a small amount of detritus, without any signs of bacterial contamination. When observing the cultivation, 0.5 ml of the evaluated culture of borrelia is transferred to pre-dried blood agar and cultivation is carried out at 35-37 ° C for 48 hours.
При оценке теста, наличие какого-либо видимого нежелательного бактериального роста влечет за собой отбраковывание культур с бактериальной контаминацией.When evaluating the test, the presence of any visible unwanted bacterial growth entails the rejection of cultures with bacterial contamination.
Присутствие OspA определяют с помощью электрофореза белков в ПААГ в присутствии ДСН (SDS) после окрашивания голубым Кумасси или иммунологическим способом вестерн-блоттинг с использованием антисыворотки против OspA.The presence of OspA is determined by SDSP protein electrophoresis in the presence of SDS after staining with Coomassie blue or by immunological Western blotting using anti-OspA antiserum.
B) Культивирование производственных штаммов боррелии для экспрессии антигена OspC:B) Cultivation of production strains of Borrelia for the expression of OspC antigen:
Для осуществления культивирования использовали те же самые исходные составляющие, производственные штаммы и схему технологии производства, что и при выработке антигена OspA, описанного в A).To carry out the cultivation, the same initial components, production strains and production technology scheme were used as for the production of the OspA antigen described in A).
Аналогично, собственно культивирование протекает таким же образом с той лишь разницей, что при восстановлении культуры, ампулу с размораживаемой культурой пересевают в пробирку с жидкой средой, нагретой до приблизительно 37°C в соотношении 1+9 (1 часть культуры + 9 частей среды) и проводят инкубирование при 36-38°C в течение от 6 до 18 суток. Точно так же, размножение культуры проводят аналогичным способом, но с разницей в том, что культивирование проводят при 36-38°C в течение 6-10 суток. Получение культуры для производства вакцины, определение количества боррелий, контроль за ходом процесса, контроль за ростом и чистотой культуры и определение присутствия OspC проводят таким же образом, как описано в A).Similarly, the cultivation itself proceeds in the same way with the only difference being that when the culture is restored, the ampoule with the defrosted culture is transferred to a test tube with a liquid medium heated to approximately 37 ° C in a ratio of 1 + 9 (1 part of the culture + 9 parts of the medium) and carry out incubation at 36-38 ° C for 6 to 18 days. Similarly, the propagation of the culture is carried out in a similar way, but with the difference that the cultivation is carried out at 36-38 ° C for 6-10 days. Obtaining a culture for vaccine production, determining the number of borrelia, monitoring the progress of the process, monitoring the growth and purity of the culture and determining the presence of OspC is carried out in the same manner as described in A).
C) Надлежащий способ получения окончательного вида вакцины:C) The proper way to obtain the final type of vaccine:
Концентрированные, очищенные, устойчивые и инактивированные бактериальные штаммы Borrelia burgdorferi senzu stricto, Borrelia afzelii и Borrelia garinii, для которых доказана выработка белка наружной мембраны OspA, и концентрированные, очищенные, устойчивые и инактивированные бактериальные штаммы Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii и Borrelia garinii, для которых доказана выработка белка наружной мембраны OspC, смешивали вместе таким образом, что OspA и OspC отдельного геновида боррелии присутствовали в одинаковом соотношении. Далее компонент боррелий (90% объема) смешивали с гелеобразным гидроксидом алюминия (10% объема). После тщательной гомогенизации проверяли pH и доводили до величины между 7,5 и 8,0. Флаконы для хранения наполняли вакциной и проводили пробу на стерильность. Далее, флаконы для отправки наполняли вакциной, упаковывали и отправляли для окончательной проверки.The concentrated, purified, stable and inactivated bacterial strains of Borrelia burgdorferi senzu stricto, Borrelia afzelii and Borrelia garinii, which proved production of outer membrane protein OspA, and concentrated, purified, stable and inactivated bacterial strains of Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii and Borrelia garinii, for which the production of the OspC outer membrane protein was proven, they were mixed together so that the OspA and OspC of the individual Borrelia genotype were present in the same ratio. Next, the Borrelia component (90% by volume) was mixed with gel aluminum hydroxide (10% by volume). After thorough homogenization, the pH was checked and adjusted to between 7.5 and 8.0. Storage vials were filled with vaccine and a sterility test was performed. Further, the dispensing vials were filled with vaccine, packaged and sent for final inspection.
D) Результаты иследованияD) Test results
a) Проверка эффективности у кошек:a) Testing effectiveness in cats:
Шесть кошек подвергали вакцинации и ревакцинации с помощью экспериментального образца вакцины и через 90 суток их заражали клещами (Ixodes ricinus), естественным образом инфицированными геновидами Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii и Borrelia garinii. В качестве контроля использовали трех кошек, не подвергнутых вакцинации.Six cats were vaccinated and revaccinated with an experimental vaccine sample and after 90 days they were infected with ticks ( Ixodes ricinus ), naturally infected with the genes Borrelia burgdorferi sensu stricto , Borrelia afzelii and Borrelia garinii . Three cats that were not vaccinated were used as controls.
Кошек вакцинировали подкожно с помощью 1 мл вакцины и спустя 3 недели таким же образом проводили ревакцинацию. Кровь брали перед вакцинацией и ревакцинацией. В дальнейшем кровь брали спустя 1 месяц после ревакцинации. Спустя три месяца после ревакцинации кошек заражали собранными естественным образом клещами (Ixodes ricinus), которые были естественным образом заражены всеми тремя наиболее патогенными геновидами - Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii и Borrelia garinii. Степень инфицированности клещей проверяли перед началом экспериментального заражения.Cats were vaccinated subcutaneously with 1 ml of the vaccine and 3 weeks later they were revaccinated in the same way. Blood was taken before vaccination and revaccination. Subsequently, blood was taken 1 month after revaccination. Three months after revaccination, cats were infected with naturally collected ticks ( Ixodes ricinus ), which were naturally infected with all three of the most pathogenic genes - Borrelia burgdorferi sensu stricto , Borrelia afzelii and Borrelia garinii . The degree of infection of ticks was checked before the start of experimental infection.
После заражения, каждый день всем экспериментальным животным (подвергнутым и не подвергнутым вакцинации, служащих контролем кошкам) проводили клинический осмотр и регистрировали состояние их здоровья, включая измерение температуры тела. После заражения, кровь всех экспериментальных животных брали для проверки на 14, 28, 42 и 60 сутки. Кровь также брали в день заражения, сразу после заражения клещами. На 7, 28 и 60 сутки после заражения, брали образцы кожи для биопсии в тех местах, где присасывались клещи для того, чтобы заново выделить боррелии из этих образцов. На 60 сутки после заражения всех экспериментальных животных умерщвляли и проводили патолого-анатомическое вскрытие и в качестве образцов брали мышцу, суставную жидкость, лимфатический узел, кожу и почки для того, чтобы заново выделить боррелии из этих предрасполагающих участков.After infection, every day all experimental animals (subjected and not subjected to vaccination serving as control cats) underwent a clinical examination and recorded their health status, including measuring body temperature. After infection, the blood of all experimental animals was taken to check on 14, 28, 42 and 60 days. Blood was also taken on the day of infection, immediately after infection with ticks. On the 7th, 28th and 60th days after infection, skin samples were taken for biopsy in those places where ticks were sucked in order to re-isolate borrelia from these samples. On the 60th day after infection, all experimental animals were sacrificed and an autopsy was performed and muscle, joint fluid, lymph node, skin, and kidneys were taken as samples in order to re-isolate borrelia from these predisposing sites.
Полученные результаты представлены в сводных таблицах № 1, 2, 3 и 4. Из полученных результатов однозначно следует, что вакцина против боррелиоза, полученная из производственных штаммов Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii и Borrelia garinii, экспрессирующих поверхностные белки OspA и OspC, является безвредной для кошек и способствует выработке у них протективного иммунитета против природной клещевой инфекции всех трех наиболее патогенных геновидов Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii и Borrelia garinii, и, возможно, вследствие перекрестного иммунитета, других известных геновидов боррелий.The results are presented in summary tables No. 1, 2, 3, and 4. It clearly follows from the results that the borreliosis vaccine obtained from the production strains of Borrelia burgdorferi sensu stricto , Borrelia afzelii and Borrelia garinii expressing the surface proteins OspA and OspC is harmless for cats and contributes to the development of protective immunity in cats against natural tick-borne infections of all three of the most pathogenic genes Borrelia burgdorferi sensu stricto , Borrelia afzelii and Borrelia garinii , and possibly due to cross-immunity, other known Enovid Borrelia.
в клиникеDaily
in the clinic
в клиникеDaily
in the clinic
в клиникеDaily
in the clinic
в клиникеDaily
in the clinic
в клиникеDaily
in the clinic
в клиникеDaily
in the clinic
в клиникеDaily
in the clinic
в клиникеDaily
in the clinic
в клиникеDaily
in the clinic
V - вакцинация
КО - не подвергнутые вакцинации контроли
+ - действие выполняли
- - действие не выполняли
В - биопсия кожи
К - забор крови
P - патолого-анатомическое вскрытиеExplanations:
V - vaccination
KO - not vaccinated controls
+ - the action was performed
- - action not performed
B - skin biopsy
K - blood sampling
P - pathological anatomical autopsy
+ - наличие клинических симптомов
- - отсутствие клинических симптомовExplanations:
+ - the presence of clinical symptoms
- - lack of clinical symptoms
+ - положительный результат
- - отрицательный результатExplanations:
+ - positive result
- - negative result
+ - положительный результат
- - отрицательный результат
PA - патолого-анатомическое вскрытиеExplanations:
+ - positive result
- - negative result
PA - Anatomical autopsy
b) Проверка эффективности у собак:b) Testing effectiveness in dogs:
Шесть собак подвергали вакцинации и ревакцинации с помощью экспериментального образца вакцины и через 90 суток их заражали клещами (Ixodes ricinus), естественным образом инфицированными геновидами Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii и Borrelia garinii. В качестве контроля использовали трех собак, не подвергнутых вакцинации. Вакцинацию, ревакцинацию, забор крови, клиническую оценку, взятие образцов для исследования и другие манипуляции проводили так же как в исследовании для кошек.Six dogs were vaccinated and revaccinated with an experimental vaccine sample and after 90 days they were infected with ticks ( Ixodes ricinus ) naturally infected with the genes Borrelia burgdorferi sensu stricto , Borrelia afzelii and Borrelia garinii . Three dogs that were not vaccinated were used as controls. Vaccination, revaccination, blood sampling, clinical evaluation, sampling for research and other manipulations were performed as in the study for cats.
Полученные результаты представлены в сводных таблицах № 5, 6, 7 и 8. Из полученных результатов однозначно следует, что вакцина против боррелиоза, полученная из производственных штаммов Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii и Borrelia garinii, экспрессирующих поверхностные белки OspA и OspC, является безвредной для собак и способствует выработке у них протективного иммунитета против природной клещевой инфекции всех трех наиболее патогенных геновидов Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii и Borrelia garinii, и, возможно, вследствие перекрестного иммунитета, других известных геновидов боррелий.The results are presented in summary tables No. 5, 6, 7, and 8. It clearly follows from the results that the vaccine against borreliosis obtained from the production strains of Borrelia burgdorferi sensu stricto , Borrelia afzelii and Borrelia garinii expressing the surface proteins OspA and OspC is harmless for dogs and contributes to the development of protective immunity in them against natural tick-borne infection of all three of the most pathogenic genes Borrelia burgdorferi sensu stricto , Borrelia afzelii and Borrelia garinii , and possibly due to cross-immunity, other known Enovid Borrelia.
нацияRevacci
nation
V - вакцинация
КО - не подвергнутые вакцинации контроли
+ - действие выполнялиExplanations:
V - vaccination
KO - not vaccinated controls
+ - the action was performed
В - биопсия кожи
К - забор крови
P - патолого-анатомическое вскрытие- - action not performed
B - skin biopsy
K - blood sampling
P - pathological anatomical autopsy
+ - наличие клинических симптомов
- - отсутствие клинических симптомовExplanations:
+ - the presence of clinical symptoms
- - lack of clinical symptoms
+ - положительный результат
- - отрицательный результат
PA - патолого-анатомическое вскрытиеExplanations:
+ - positive result
- - negative result
PA - Anatomical autopsy
c) Проверка эффективности у лошадей:c) Testing of effectiveness in horses:
Шесть лошадей подвергали вакцинации и ревакцинации с помощью экспериментального образца вакцины и через 90 суток их заражали клещами (Ixodes ricinus), естественным образом инфицированными геновидами Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii и Borrelia garinii. В качестве контроля использовали трех лошадей, не подвергнутых вакцинации.Six horses were vaccinated and revaccinated with an experimental vaccine sample and after 90 days they were infected with ticks ( Ixodes ricinus ) naturally infected with the genes Borrelia burgdorferi sensu stricto , Borrelia afzelii and Borrelia garinii . Three horses not vaccinated were used as controls.
Вакцинацию, ревакцинацию, забор крови, клиническую оценку, взятие образцов для исследования и другие манипуляции проводили так же, как в исследовании для кошек и собак.Vaccination, revaccination, blood sampling, clinical evaluation, sampling for research and other manipulations were carried out in the same way as in the study for cats and dogs.
Полученные результаты представлены в сводных таблицах № 9, 10, 11 и 12. Из полученных результатов однозначно следует, что вакцина против боррелиоза, полученная из производственных штаммов Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii и Borrelia garinii, экспрессирующих поверхностные белки OspA и OspC, является безвредной для лошадей и способствует выработке у них протективного иммунитета против природной клещевой инфекции всех трех наиболее патогенных геновидов Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii и Borrelia garinii, и, возможно, вследствие перекрестного иммунитета, других известных геновидов боррелий.The results obtained are presented in summary tables No. 9, 10, 11 and 12. It clearly follows from the results that the borreliosis vaccine obtained from the production strains of Borrelia burgdorferi sensu stricto , Borrelia afzelii and Borrelia garinii expressing the surface proteins OspA and OspC is harmless for horses and helps them develop protective immunity against natural tick-borne infections of all three of the most pathogenic genes Borrelia burgdorferi sensu stricto , Borrelia afzelii and Borrelia garinii , and, possibly, due to cross-immunity, others are known genotypes of Borrelia.
V - вакцинация
КО - не подвергнутые вакцинации контроли
+ - действие выполняли
- - действие не выполняли
В - биопсия кожи
К - забор крови
P - патолого-анатомическое вскрытиеExplanations:
V - vaccination
KO - not vaccinated controls
+ - the action was performed
- - action not performed
B - skin biopsy
K - blood sampling
P - pathological anatomical autopsy
+ - наличие клинических симптомов
- - отсутствие клинических симптомовExplanations:
+ - the presence of clinical symptoms
- - lack of clinical symptoms
+ - положительный результат
- - отрицательный результатExplanations:
+ - positive result
- - negative result
+ - положительный результат
- - отрицательный результат
PA - патолого-анатомическое вскрытиеExplanations:
+ - positive result
- - negative result
PA - Anatomical autopsy
Описанные примеры получения вакцины не являются единственным способом осуществления по изобретению, но цельноклеточные бактериальные вакцины или бактериальные лизаты или очищенные соединения, содержащие иммуногенные протективные белки, можно применять без какого-либо влияния на субъект по изобретению в буферных физиологических растворах или с помощью минерального или масляного иммунологического адъюванта или с помощью иммунологических комплексов (ISCOM), липосом и других природных или синтетических иммунологических адъювантов.The described vaccine preparation examples are not the only mode of implementation according to the invention, but whole-cell bacterial vaccines or bacterial lysates or purified compounds containing immunogenic protective proteins can be used without any effect on the subject of the invention in physiological buffered saline solutions or using mineral or oil immunological adjuvant or using immunological complexes (ISCOM), liposomes and other natural or synthetic immunological adjuvants.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬINDUSTRIAL APPLICABILITY
Универсальную вакцину для лечения и профилактики болезни Лайма можно применять в качестве лекарственного препарата у людей и в ветеринарии и можно успешно применять внутримышечно, подкожно, внутрикожно или чрескожно.A universal vaccine for the treatment and prevention of Lyme disease can be used as a medicine in humans and in veterinary medicine and can be successfully applied intramuscularly, subcutaneously, intradermally or transdermally.
Claims (9)
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZPV2007-791 | 2007-11-14 | ||
| CZ20070791A CZ301244B6 (en) | 2007-11-14 | 2007-11-14 | General-purpose vaccine for treatment and prevention of Lyme borreliosis for human and veterinary use and method for preparing thereof |
| PCT/CZ2008/000130 WO2009062454A2 (en) | 2007-11-14 | 2008-10-21 | Universal vaccine for the treatment and prophylaxis of lyme disease for human and veterinary use and method of its manufacture |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2010123897A RU2010123897A (en) | 2011-12-20 |
| RU2472525C2 true RU2472525C2 (en) | 2013-01-20 |
Family
ID=40600158
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010123897/15A RU2472525C2 (en) | 2007-11-14 | 2008-10-21 | Universal vaccine for treating and preventing lyme disease applicable in human and veterinary science, and method for preparing it |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP2219670A2 (en) |
| CZ (1) | CZ301244B6 (en) |
| RU (1) | RU2472525C2 (en) |
| UA (1) | UA102081C2 (en) |
| WO (1) | WO2009062454A2 (en) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ301244B6 (en) * | 2007-11-14 | 2009-12-16 | Bioveta, A.S. | General-purpose vaccine for treatment and prevention of Lyme borreliosis for human and veterinary use and method for preparing thereof |
| CZ301548B6 (en) * | 2008-08-20 | 2010-04-14 | Bittner@Libor | General-purpose composition for enhancing stamina, prevention, prophylaxis and therapy of Lyme borreliosis for human and veterinary application, process for preparing such composition and its use |
| PL223175B1 (en) | 2012-10-22 | 2016-10-31 | Inst Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk | Vaccine against Lyme disease, a genetic construct, the recombinant protein, the method for preparing a genetic construct, a method of preparing a vaccine, a method of preparing a recombinant protein, the use of recombinant proteins for the manufacture of a vaccine against Lyme borreliosis |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2102081C1 (en) * | 1991-07-11 | 1998-01-20 | Иммуно АГ | Immunogenic composition against laima borreliosis, method to immunize mammals against borreliosis laima, method to obtain protein pc borrelia burgdorferi, diagnostic agent to reveal b burgdorferi and method to reveal antibodies to b burgdorferi |
| US6872550B1 (en) * | 1991-07-11 | 2005-03-29 | Baxter Vaccine Ag | Immunogenic formulation of OspC antigen vaccines for the prevention and treatment of lyme disease and recombinant methods for the preparation of such antigens |
| US20070020286A1 (en) * | 1993-11-01 | 2007-01-25 | Dattwyler Raymond J | Recombinant constructs of Borrelia burgdorferi |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0701612B1 (en) * | 1993-04-29 | 1998-01-21 | IMMUNO Aktiengesellschaft | IMMUNOGENIC FORMULATION OF OspC ANTIGEN VACCINES FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF LYME DISEASE AND RECOMBINANT METHODS FOR THE PREPARATION OF SUCH ANTIGENS |
| WO1995027504A1 (en) * | 1994-04-11 | 1995-10-19 | Solvay Animal Health, Inc. | Borrelia burgdorferi bacterin |
| US5846946A (en) * | 1996-06-14 | 1998-12-08 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins | Compositions and methods for administering Borrelia DNA |
| MX2009004866A (en) * | 2006-11-03 | 2009-05-19 | Schering Plough Ltd | Canine lyme disease vaccine. |
| CZ301244B6 (en) * | 2007-11-14 | 2009-12-16 | Bioveta, A.S. | General-purpose vaccine for treatment and prevention of Lyme borreliosis for human and veterinary use and method for preparing thereof |
-
2007
- 2007-11-14 CZ CZ20070791A patent/CZ301244B6/en unknown
-
2008
- 2008-10-21 UA UAA201007218A patent/UA102081C2/en unknown
- 2008-10-21 EP EP08850812A patent/EP2219670A2/en not_active Ceased
- 2008-10-21 WO PCT/CZ2008/000130 patent/WO2009062454A2/en active Application Filing
- 2008-10-21 RU RU2010123897/15A patent/RU2472525C2/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2102081C1 (en) * | 1991-07-11 | 1998-01-20 | Иммуно АГ | Immunogenic composition against laima borreliosis, method to immunize mammals against borreliosis laima, method to obtain protein pc borrelia burgdorferi, diagnostic agent to reveal b burgdorferi and method to reveal antibodies to b burgdorferi |
| US6872550B1 (en) * | 1991-07-11 | 2005-03-29 | Baxter Vaccine Ag | Immunogenic formulation of OspC antigen vaccines for the prevention and treatment of lyme disease and recombinant methods for the preparation of such antigens |
| US20070020286A1 (en) * | 1993-11-01 | 2007-01-25 | Dattwyler Raymond J | Recombinant constructs of Borrelia burgdorferi |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2219670A2 (en) | 2010-08-25 |
| WO2009062454A2 (en) | 2009-05-22 |
| UA102081C2 (en) | 2013-06-10 |
| RU2010123897A (en) | 2011-12-20 |
| CZ301244B6 (en) | 2009-12-16 |
| CZ2007791A3 (en) | 2009-05-27 |
| WO2009062454A3 (en) | 2009-07-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Fikrig et al. | Long-term protection of mice from Lyme disease by vaccination with OspA | |
| JP4301415B2 (en) | Lyme disease combination composition and use thereof | |
| Gern et al. | Immunization with a polyvalent OspA vaccine protects mice against Ixodes ricinus tick bites infected by Borrelia burgdorferi ss, Borrelia garinii and Borrelia afzelii | |
| Gatto et al. | Characterization of, and immune responses of mice to, the purified OmpA-equivalent outer membrane protein of Pasteurella multocida serotype A: 3 (Omp28) | |
| JP2017019873A (en) | Canine lyme disease vaccine | |
| Jacques et al. | Immunological responses and protective efficacy against Brucella melitensis induced by bp26 and omp31 B. melitensis Rev. 1 deletion mutants in sheep | |
| US20060251674A1 (en) | Formulations and process for production of Bordetella bronchiseptica P68 antigen and vaccines | |
| CA2046025A1 (en) | Vaccine against lyme disease and a challenge model for evaluating vaccine efficiency | |
| Telford III et al. | Efficacy of human Lyme disease vaccine formulations in a mouse model | |
| RU2472525C2 (en) | Universal vaccine for treating and preventing lyme disease applicable in human and veterinary science, and method for preparing it | |
| UA121097C2 (en) | Immunogenic composition comprising mycoplasma antigens | |
| Šadžiene et al. | A flagella-less mutant of Borrelia burgdorferi as a live attenuated vaccine in the murine model of Lyme disease | |
| Krajacich et al. | Vaccination with the variable tick protein of the relapsing fever spirochete Borrelia hermsii protects mice from infection by tick-bite | |
| Simon et al. | Lyme disease: pathogenesis and vaccine development | |
| US9764017B2 (en) | Potomac horse fever isolates | |
| Simon et al. | Spirochetes: vaccines, animal models and diagnostics | |
| CZ301548B6 (en) | General-purpose composition for enhancing stamina, prevention, prophylaxis and therapy of Lyme borreliosis for human and veterinary application, process for preparing such composition and its use | |
| CZ18920U1 (en) | General-purpose composition for enhancing stamina, prevention, prophylaxis and therapy of Lyme borreliosis for human and veterinary application | |
| ARIMITSU et al. | Cross antigenicities of Leptospira interrogans serovar copenhageni Shibaura strain for preparing biological products in Japan | |
| Hassan | Protective Efficacy of a Borrelia burgdorferi BB0172 Derived-Peptide Based Vaccine Formulation in the Murine Model against Lyme Disease | |
| ABD EL-SAMIE | Immunogenicity of experimental Pasteurella multocida vaccine in rabbits | |
| Carroll | Virulence-associated membrane proteins expressed by Borrelia burgdorferi, the causative agent of Lyme disease | |
| Wills et al. | Lyme Borreliosis, the Australian perspective | |
| Alharbi | Evaluation a polyvalent vaccine against abscess disease of sheep from pathogenic bacteria isolated from Saudi Arabia | |
| Hudson | Characterization of differential expression of vlsE and a conjugal macrolide-lincosamide-streptogramin type B (MLS (B)) resistance determinant from Borrelia burgdorferi |