RU2472162C1 - Method of serologic diagnosis of viral gastrointestinal infections in cattle by method of enzyme-immunoassay - Google Patents

Abstract

FIELD: veterinary medicine.

SUBSTANCE: method includes the interaction of antigens with antibodies, with anti-species antibodies labeled with horseradish peroxidase, adding the substrate mixture and recording the results of the reaction on the colour intensity of the complex formed. In the reaction the plates are used with antigens of rotavirus, coronavirus, the virus of diarrhea preliminary sorbed on them, and after applying the test samples of serum 0.10-0.12 ml each. The plates were incubated for 1.5-2 h at 36-37°C and washed. Then total anti-species immunosorbent conjugate is applied of 0.10-0.12 ml consisting of enzyme-labeled antibodies against globulins of blood serum of cattle and the results of the reaction are recorded.

EFFECT: invention provides simultaneous diagnosis of rotavirus, coronavirus enteritis, viral diarrhea in cattle, sensitivity, specificity, and ease of the assay, and the ability to automate the process of research.

2 ex

Description

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к разработке способа выявления антител против вирусов, вызывающих желудочно-кишечные инфекции крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа.The present invention relates to the field of veterinary virology, in particular to the development of a method for detecting antibodies against viruses that cause gastrointestinal infections of cattle by enzyme-linked immunosorbent assay.

Ведущую роль в этиологии диареи у молодняка с/х животных играют рота-, коронавирусы, вирус диареи-болезни слизистых, в меньшей степени другие инфекционные агенты. Указанные болезни широко распространены как в Российской Федерации, так и за рубежом и наносят животноводческим хозяйствам ощутимый экономический ущерб, складывающийся из потерь от гибели, особенно, в раннем возрасте, средств, затрачиваемых на лечение больных и недополучении продукции от переболевших животных. Ежегодно половина потерь молодняка приходится на желудочно-кишечные заболевания в раннем возрасте.The leading role in the etiology of diarrhea in young farm animals is played by rota-, coronaviruses, mucosal diarrhea virus, and to a lesser extent other infectious agents. These diseases are widespread both in the Russian Federation and abroad and cause significant economic damage to livestock farms, resulting from losses from death, especially at an early age, of the funds spent on treating patients and not receiving production from sick animals. Every year, half of the young growth is due to gastrointestinal diseases at an early age.

В связи с вышеизложенным проблема диагностики и борьбы с данными инфекциями является актуальной. С большой эффективностью решить проблему диагностики позволяет высокочувствительный метод иммуноферментного анализа.In connection with the foregoing, the problem of diagnosis and control of these infections is relevant. Highly sensitive method of enzyme immunoassay allows solving the diagnostic problem with great efficiency.

Известен способ исследования сывороток крови на наличие антител к возбудителю вирусной диареи методом ИФА при эпизоотологическом обследовании животноводческих хозяйств [1].A known method for the study of blood serum for the presence of antibodies to the causative agent of viral diarrhea by ELISA by epizootological examination of livestock farms [1].

Известен также способ серодиагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней иммуноферментным методом, для чего в лунки полистиролового планшета вносят специфический антиген по 0,1 мл и сорбируют его на поверхности лунок. На следующем этапе в лунки микропанели вносят контрольные и испытуемые сыворотки по 0,1 мл и инкубируют в течение 1,5-2 ч при 37°C. Несвязавшиеся антитела удаляют многократным промыванием, затем добавляют в каждую лунку антивидовой иммуноферментный конъюгат в объеме 0,1 мл в рабочем разведении. В положительных случаях конъюгат связывается с фиксированными на сенсибилизированной поверхности антителами, образуя комплекс антиген-антитело-конъюгат. Избыток конъюгата удаляют промыванием и вносят во все лунки субстратный индикаторный раствор, который меняет окраску по принципу окислительно-восстановительной реакции, пропорционально количеству конъюгированного с антителами фермента. Количество фермента пропорционально количеству антител, связавшихся с фиксированным на поверхности лунок антигеном [2]. (Прототип).There is also a method for serodiagnosis of transmissible gastroenteritis of pigs by enzyme immunoassay, for which a specific antigen of 0.1 ml is added to the wells of a polystyrene tablet and sorbed on the surface of the wells. At the next stage, control and test sera of 0.1 ml are added to the micropanel wells and incubated for 1.5-2 hours at 37 ° C. Unbound antibodies are removed by repeated washing, then 0.1 ml of antispecies enzyme-linked conjugate is added to each well in working dilution. In positive cases, the conjugate binds to antibodies fixed on the sensitized surface, forming an antigen-antibody-conjugate complex. Excess conjugate is removed by washing and a substrate indicator solution is added to all wells, which changes color according to the principle of the redox reaction, in proportion to the amount of enzyme conjugated with antibodies. The amount of the enzyme is proportional to the number of antibodies bound to the antigen fixed on the surface of the wells [2]. (Prototype).

В задачу наших исследований входило - разработать чувствительный, эффективный способ серодиагностики рота-, коронавирусного энтеритов, вирусной диареи крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа и значительно сократить время на постановку диагноза за счет одновременного исследования сыворотки на наличие антител к этим возбудителям. Литературные данные по использованию ИФА-теста для исследования сывороток крови на наличие антител к рота-, коронавирусам крупного рогатого скота отсутствуют.The objective of our research was to develop a sensitive, effective method for serodiagnostics of rota-, coronavirus enteritis, and cattle viral diarrhea by enzyme immunoassay and to significantly reduce the time for diagnosis by simultaneously examining serum for the presence of antibodies to these pathogens. There are no published data on the use of an ELISA test for the study of blood serum for the presence of antibodies to rota-, bovine coronaviruses.

Сущность предложенного способа состоит в следующем. В лунки одного планшета с предварительно сорбированными ротавирусным, коронавирусным, диарейным антигенами автоматической пипеткой вносят испытуемую пробу сыворотки крови по 0,10-0,12 мл в лунки с различными антигенами, инкубируют 1,5-2 часа при температуре 37-38°C, планшет отмывают, вносят по 0,10-0,12 мл антивидовой иммуноферментный конъюгат, состоящий из меченных ферментом антител к глобулинам сыворотки крови крупного рогатого скота, инкубируют при тех же условиях, планшет отмывают и после добавления субстратной смеси проводят одновременный учет результатов реакции на рота-, коронавирусный энтерит, вирусную диарею крупного рогатого скота.The essence of the proposed method is as follows. In the wells of one tablet with pre-sorbed rotavirus, coronavirus, diarrheal antigens with an automatic pipette, a test sample of blood serum of 0.10-0.12 ml is introduced into wells with various antigens, incubated 1.5-2 hours at a temperature of 37-38 ° C, the tablet is washed, 0.10-0.12 ml of an anti-enzyme immunoassay conjugate consisting of enzyme labeled antibodies to cattle blood serum globulins is introduced, incubated under the same conditions, the tablet is washed, and after adding the substrate mixture, simultaneous results of reactions to rota-, coronavirus enteritis, and cattle viral diarrhea.

Пример 1Example 1

На первом этапе реакции во все лунки планшета автоматической пипеткой вносят по 0,1 мл 0,01М фосфатно-буферного раствора. В первые лунки рядов с нанесенными антигенами ротавируса, коронавируса, вируса диареи вносят по 0,1 мл исследуемой сыворотки, пипетируют и по 0,1 мл переносят в следующую лунку и т.д. Для контроля реакции параллельно вносят по 0,1 мл специфических гомологичных сывороток и также титруют их как пробу. Таким же образом вносят и титруют отрицательную сыворотку. Планшет инкубируют в термостате 1,5 часа при 36°C, затем отмывают его от несвязавшихся антител. В отмытые лунки планшета вносят по 0,1 мл антивидовой иммуноферментный конъюгат, состоящий из глобулинов сыворотки крови крупного рогатого скота, меченных пероксидазой хрена. Планшет инкубируют в термостате при 36°C 1,5 часа и вновь трижды отмывают фосфатно-буферным раствором с твином-20. Затем в лунки вносят по 0,1 мл субстратной смеси, состоящей из раствора 5-аминосалициловой кислоты и перекиси водорода. Результат реакции учитывают через 30 минут по изменению окраски образовавшегося реакционного продукта от коричневого до светло-коричневого цвета:At the first stage of the reaction, 0.1 ml of 0.01 M phosphate-buffered solution is added to all wells of the tablet with an automatic pipette. In the first wells of the rows with the applied antigens of rotavirus, coronavirus, diarrhea virus, 0.1 ml of the test serum are added, pipetted and 0.1 ml are transferred to the next well, etc. To control the reaction, 0.1 ml of specific homologous sera are introduced in parallel and also titrated as a sample. Negative serum is added and titrated in the same manner. The plate is incubated in a thermostat for 1.5 hours at 36 ° C, then it is washed from unbound antibodies. 0.1 ml of antispecies enzyme-linked immunosorbent conjugate consisting of cattle blood serum globulins labeled with horseradish peroxidase is added to the washed wells of the plate. The tablet is incubated in a thermostat at 36 ° C for 1.5 hours and again washed three times with phosphate-buffered solution with tween-20. Then, 0.1 ml of a substrate mixture consisting of a solution of 5-aminosalicylic acid and hydrogen peroxide is added to the wells. The reaction result is taken into account after 30 minutes by changing the color of the resulting reaction product from brown to light brown:

- интенсивное коричневое окрашивание, коричневое окрашивание - положительный результат;- intense brown staining, brown staining - a positive result;

- светло-коричневое окрашивание - сомнительный результат;- light brown staining - a dubious result;

- окрашивание отсутствует или находится на уровне отрицательного контроля - отрицательный результат.- staining is absent or is at the level of negative control - a negative result.

При исследовании 97 проб сывороток крови крупного рогатого скота из неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям хозяйств антитела к ротавирусу выявлены у 54 животных, к коронавирусу антитела обнаружены у 47, а к вирусу диареи - у 21 животного, что составило 55,6%, 48,4%, 21,6% соответственно.In a study of 97 samples of cattle blood serum from gastrointestinal dysfunctional farms, antibodies to rotavirus were detected in 54 animals, antibodies to coronavirus were detected in 47, and diarrhea virus in 21 animals, which amounted to 55.6%, 48, 4%, 21.6%, respectively.

Пример 2.Example 2

Реакцию проводят аналогично примеру 1, но сыворотку, коньюгат и субстратную смесь вносят в объеме 0,12 мл и планшеты инкубируют при 37°C в течение 2-х часов. Получены аналогичные результаты, что и в примере 1.The reaction is carried out analogously to example 1, but the serum, conjugate and substrate mixture are added in a volume of 0.12 ml and the plates are incubated at 37 ° C for 2 hours. Similar results are obtained as in example 1.

Предложенный способ не имеет отечественных аналогов. Позволяет при проведении диагностики рота-, коронавирусного энтеритов, вирусной диареи крупного рогатого скота методом ИФА значительно сократить время на постановку реакции и получить более достоверные результаты при учете реакции, так как исследования на эти инфекции осуществляются одновременно на одном планшете с предварительно сорбированными антигенами рота-, коронавирусов, вируса диареи крупного рогатого скота с использованием общего иммуноферментного конъюгата при одних и тех же условиях. Кроме того, отсутствуют литературные данные об использовании антительной иммуноферментной диагностики при рота-, коронавирусных энтеритах крупного рогатого скота.The proposed method has no domestic analogues. When diagnosing rotavirus, coronavirus enteritis, and viral diarrhea of cattle by ELISA, it allows significantly reducing the time required to formulate a reaction and obtain more reliable results when taking into account the reaction, since studies on these infections are carried out simultaneously on the same tablet with pre-adsorbed antigens of rota-, coronaviruses, cattle diarrhea virus using a common enzyme-linked immunosorbent conjugate under the same conditions. In addition, there are no published data on the use of antibody-based immunoassay for the diagnosis of rota-, coronavirus enteritis in cattle.

Предложенный способ для серологической диагностики рота-, коронавирусного энтеритов, вирусной диареи КРС методом иммуноферментного анализа испытан комиссионно в сентябре 2009 года и апробирован в нескольких ветеринарных лабораториях с положительным результатом (ФГУ Центральная научно-методическая ветлаборатория 2010 г., ГУ Курская областная ветлаборатория 2010 г., Тверская межобластная ветлаборатория 2011 г.)The proposed method for serological diagnosis of rotavirus, coronavirus enteritis, and cattle viral diarrhea by enzyme immunoassay was tested in September 2009 and tested in several veterinary laboratories with a positive result (FGU Central Scientific and Methodological Veterinary Laboratory in 2010, GU Kursk Regional Veterinary Laboratory in 2010 , Tver Interregional Veterinary Laboratory 2011)

На основании полученных в ходе проверки результатов комиссия сделала выводы о том, что способ чувствителен и позволяет выявлять указанные специфические антитела в исследуемых сыворотках в значительно более короткие сроки.Based on the results obtained during the verification, the commission concluded that the method is sensitive and allows you to identify these specific antibodies in the studied sera in a much shorter time.

Предложенный способ найдет применение при обследовании крупного рогатого скота в неблагополучных по желудочно-кишечным инфекциям хозяйствах с целью диагностики рота-, коронавирусных энтеритов, вирусной диареи КРС. Высокая чувствительность, специфичность, простота постановки реакции и возможность автоматизации процессов исследования позволяют в короткие сроки проводить массовые обследования животных с целью определения распространения этих инфекций. Сокращение времени на диагностику весьма существенно для неблагополучных по этим инфекциям хозяйствам, поскольку ускоренная постановка диагноза позволяет приступить к своевременному лечению и проведению профилактических мероприятий и, тем самым, оздоровить и сохранить поголовье скота.The proposed method will find application in the examination of cattle in farms with gastrointestinal infections in order to diagnose rota-, coronavirus enteritis, and cattle viral diarrhea. High sensitivity, specificity, simplicity of the reaction and the ability to automate research processes allow for a short time to conduct mass examination of animals in order to determine the spread of these infections. Reducing the time for diagnosis is very important for farms that are unsuccessful for these infections, since accelerated diagnosis allows you to start timely treatment and preventive measures, and thereby improve and maintain livestock.

Данную тест-систему можно использовать при оценке иммунного статуса поголовья, для контроля антигенной активности соответствующих компонентов моно- и поливалентных вакцин.This test system can be used to assess the immune status of the livestock, to control the antigenic activity of the corresponding components of mono- and polyvalent vaccines.

Источники информацииInformation sources

1. Ветеринария, 4, 2004, с.201. Veterinary medicine, 4, 2004, p.20

2. Ветеринария, 5, 2005, с.17-20.2. Veterinary Medicine, 5, 2005, pp. 17-20.

Claims (1)

Способ серологической диагностики вирусных желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа, преимущественно рота-, коронавирусного энтеритов, вирусной диареи крупного рогатого скота, включающий взаимодействие антигенов с антителами, с антивидовыми антителами, меченными пероксидазой хрена, добавление субстратной смеси и учет результатов реакции по интенсивности окраски образовавшегося комплекса, отличающийся тем, что в реакции используют планшеты с предварительно сорбированными на них антигенами рота-, коронавирусов, вируса диареи и после внесения испытуемых проб сывороток по 0,10-0,12 мл планшеты инкубируют 1,5-2 ч при 36-37°С, отмывают, далее вносят по 0,10-0,12 мл общего антивидового иммуноферментного конъюгата, состоящего из меченных ферментом антител против глобулинов сыворотки крови крупного рогатого скота и проводят учет результатов реакции. A method for serological diagnosis of viral gastrointestinal infections of cattle by enzyme-linked immunosorbent assay, mainly rotavirus, coronavirus enteritis, cattle viral diarrhea, including the interaction of antigens with antibodies, with antiviral antibodies labeled with horseradish peroxidase, adding a substrate mixture and taking into account the reaction results by the color intensity of the resulting complex, characterized in that the reaction uses tablets with antigens pre-sorbed on them ami of rota-, coronaviruses, diarrhea virus, and after making test samples of serum of 0.10-0.12 ml, the plates are incubated for 1.5-2 hours at 36-37 ° C, washed, then they are added 0.10-0.12 ml of the general antispecies enzyme-linked immunosorbent conjugate, consisting of enzyme-labeled antibodies against bovine serum globulins, and the reaction results are recorded.