RU2471190C1 - Method of quantitative estimation of apoptosis modified by organic low-molecular compounds - Google Patents
Method of quantitative estimation of apoptosis modified by organic low-molecular compounds Download PDFInfo
- Publication number
- RU2471190C1 RU2471190C1 RU2011140115/15A RU2011140115A RU2471190C1 RU 2471190 C1 RU2471190 C1 RU 2471190C1 RU 2011140115/15 A RU2011140115/15 A RU 2011140115/15A RU 2011140115 A RU2011140115 A RU 2011140115A RU 2471190 C1 RU2471190 C1 RU 2471190C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- annexin
- sample
- apoptosis
- organic low
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины и биологии, в частности к исследованиям веществ, модифицирующих апоптоз у населения, проживающего в районах экологического неблагополучия, и может быть использовано для диагностики токсического действия органических низкомолекулярных соединений на иммунную систему для тестирования ранних нарушений состояния здоровья как в скрининговых, так и мониторинговых исследованиях.The invention relates to medicine and biology, in particular to studies of substances modifying apoptosis in a population living in areas of ecological distress, and can be used to diagnose the toxic effects of organic low molecular weight compounds on the immune system to test early health disorders in both screening and and monitoring studies.
Для понимания сути вопроса, следует пояснить следующее. Постоянное многокомпонентное воздействие техногенных химических факторов в промышленно развитых регионах оказывает негативное влияние на здоровье населения. Ряд известных исследований посвящены изучению влияния антропогенной нагрузки на здоровье работающих на производстве людей. Однако несомненный интерес также представляет изучение состояния иммунной системы у людей, постоянно проживающих в непосредственной близости к источникам выбросов и сбросов промышленных отходов.To understand the essence of the issue, the following should be clarified. The constant multicomponent effect of technogenic chemical factors in industrially developed regions has a negative impact on public health. A number of well-known studies are devoted to studying the effect of anthropogenic stress on the health of people working in production. However, the study of the state of the immune system in people permanently living in close proximity to sources of emissions and discharges of industrial waste is also of undoubted interest.
Апоптоз - генетическая запрограммированная форма клеточной гибели, определяемая на основе характерных морфологических изменений умирающих клеток. Данный процесс является одним из ключевых процессов, определяющих формирование антигенспецифической составляющей иммунной системы и в значительной степени реализацию ее эффекторных функций. Однако известны патологические состояния, при которых механизм запрограммированной клеточной гибели оказывается заблокированным либо активированным, что приводит либо к неконтролируемой клеточной пролиферации, не сдерживаемой конкурирующим процессом апоптоза, либо к ускоренной клеточной гибели и снижению их иммунокомпетентности. При этом экотоксиканты химического производства, в частности органические низкомолекулярные соединения, способны нарушать регуляторные функции иммунной системы, что может способствовать снижению адаптационных возможностей организма, возникновению онкологических, аутоиммунных и иммунодефицитных состояний. Этим и обусловлена потребность в получении количественной оценки апоптоза, модифицированного органическими низкомолекулярными соединениями.Apoptosis is a genetic programmed form of cell death, determined on the basis of characteristic morphological changes in dying cells. This process is one of the key processes that determine the formation of the antigen-specific component of the immune system and, to a large extent, the implementation of its effector functions. However, pathological conditions are known in which the mechanism of programmed cell death appears to be blocked or activated, which leads either to uncontrolled cell proliferation not controlled by the competing apoptosis process, or to accelerated cell death and a decrease in their immunocompetence. At the same time, chemical production ecotoxicants, in particular organic low molecular weight compounds, can disrupt the regulatory functions of the immune system, which can contribute to a decrease in the adaptive capacity of the body, the oncological, autoimmune and immunodeficiency states. This is the reason for the need to obtain a quantitative assessment of apoptosis modified with organic low molecular weight compounds.
Из уровня техники известен ряд способов, при реализации которых оценивают апоптоз у биологических объектов, а именно:A number of methods are known from the prior art for the implementation of which apoptosis in biological objects is evaluated, namely:
- «Способ определения тяжести заболевания и эффективности лечения у больных бронхолегочными заболеваниями (заявка на изобретение №2009101693, от 2009 г.). Согласно указанному известному решению производят отбор исследуемого материала, выделение из него клеточной субстанции, подготовку ее к исследованию, определение величины альтерации клеток путем оценки их апоптоза, при этом в качестве исследуемого материала используют индуцированную мокроту больного и здорового человека, в клеточной субстанции дополнительно определяют величину альтерации клеток путем некроза, при этом показатели апоптоза и некроза определяют при двух и более обследованиях с интервалом в 1-3 суток, полученные показатели выражают в виде апоптотического индекса (АИ) и индекса некроза (ИН), рассчитывают индекс альтерации клеток (ИАК) по формуле: ИАК=ИН/АИ, где ИН - индекс некроза; АИ - апоптотический индекс; при этом тяжесть заболевания определяют путем сравнения показателя индекса альтерации клеток больного с показателем индекса альтерации клеток здоровых лиц, и диагностируют легкое течение бронхолегочного заболевания при показателях ИАК более 1,5, среднее до 1,0 и тяжелое менее 1,0, а эффективность лечения определяют путем сравнения начальных показателей индекса альтерации клеток больного с показателем индекса альтерации после лечения и диагностируют положительную динамику лечения при увеличении ИАК до значений для здоровых лиц 2,0.- “A method for determining the severity of the disease and the effectiveness of treatment in patients with bronchopulmonary diseases (application for invention No. 2009101693, from 2009). According to the specified well-known solution, the test material is selected, the cellular substance is isolated from it, it is prepared for the study, the alteration of the cells is determined by evaluating their apoptosis, and the induced sputum of a sick and healthy person is used as the test material, and the amount of alteration is additionally determined in the cellular substance cells by necrosis, while apoptosis and necrosis are determined by two or more examinations with an interval of 1-3 days, the obtained results spruces are expressed as apoptotic index (AI) and necrosis index (IN), the cell alteration index (IAA) is calculated by the formula: IAA = IN / AI, where IN is the necrosis index; AI - apoptotic index; the severity of the disease is determined by comparing the index of the alteration index of the patient’s cells with the index of the alteration index of the cells of healthy individuals, and a mild course of bronchopulmonary disease is diagnosed with an IAA of more than 1.5, moderate to 1.0 and severe less than 1.0, and the treatment effectiveness is determined by comparing the initial indicators of the patient’s cell alteration index with the indicator of alteration index after treatment, positive dynamics of treatment is diagnosed with an increase in IAC to 2.0 for healthy individuals.
Предлагаемый способ отличается от указанного известного тем, что оценивается не степень тяжести патологии, а идентифицируется этиологический фактор (химический), инициирующий процесс апоптоза, а также степень вызываемых исключительно этим фактором отклонений по данному критерию. Кроме того, в качестве показателя гибели используется критерий только апоптоз (некроз, как в известном способе, не учитывается), что позволяет анализировать ранние нарушения состояния запрограммированного процесса клеточной гибели.The proposed method differs from the known one in that it does not assess the severity of the pathology, but identifies the etiological factor (chemical) that initiates the apoptosis process, as well as the degree of deviations caused exclusively by this factor according to this criterion. In addition, as an indicator of death, the criterion is only apoptosis (necrosis, as in the known method, is not taken into account), which allows you to analyze early violations of the state of the programmed process of cell death.
- «Функциональный иммуноанализ in vitro» (патент РФ №2416797 от 2005), согласно которому производят выделение клеток, первичную инкубацию из крови, сыворотки или плазмы пациента клеток с исследуемым веществом, получение супернатанта или смеси из клеток и супернатанта первичной инкубации, вторичную инкубацию клеток-мишеней с супернатантом или смесью из клеток и супернатанта и анализ клеток-мишеней. При этом в случае выделенных клеток речь идет о первичной инкубации эффекторных клеток иммунной системы. В случае клеток-мишеней вторичной инкубации речь идет о клетках человека или клетках высших млекопитающих. Указанный способ принимается за наиболее близкий аналог - прототип.- “Functional immunoanalysis in vitro” (RF patent No. 2416797 from 2005), according to which cells are isolated, cells are initially incubated from the patient’s blood, serum or plasma with the test substance, a supernatant or mixture of cells and a primary incubation supernatant is obtained, secondary cell incubation targets with a supernatant or a mixture of cells and supernatant; and analysis of target cells. Moreover, in the case of isolated cells, we are talking about the primary incubation of effector cells of the immune system. In the case of target cells of secondary incubation, we are talking about human cells or cells of higher mammals. The specified method is taken as the closest analogue - the prototype.
Предлагаемый способ повторяет два первых этапа известного способа, однако отличается тем, что преследует цель определить уровень опасности уже имеющейся экспозиции вещества по критерию апоптоза для дальнейшего ограничения поступления и форсированной элиминации. В известном же способе вещество используется как лекарственное преиммобилизационное средство, измененные клетки и супернатант после экспозиции которого будут применяться для апоптоза опухолевых клеток.The proposed method repeats the first two steps of the known method, however, it differs in that it aims to determine the hazard level of an existing exposure of a substance by apoptosis criterion to further limit intake and forced elimination. In the known method, the substance is used as a drug pre-mobilization agent, modified cells and supernatant after exposure of which will be used for apoptosis of tumor cells.
Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в обеспечении высокой точности количественной оценки апоптоза, модифицированного органическими низкомолекулярными соединениями, с обеспечением возможности в последующем судить об иммунодефицитных состояниях населения.The technical result achieved by the present invention is to ensure high accuracy of the quantitative assessment of apoptosis modified by organic low molecular weight compounds, with the possibility of subsequently judging the immunodeficiency of the population.
Указанный технический результат достигается предлагаемым способом количественной оценки апоптоза, модифицированного органическими низкомолекулярными соединениями, включающим отбор пробы крови у пациента, выделение из пробы мононуклеарных клеток и инкубацию клеток с исследуемым соединением, при этом, согласно изобретению, выделение из пробы мононуклеарных клеток производят путем введения в пробу этилендиаминтетраацетата, разведения ее водным раствором хлорида натрия, наслоения на 3 мл фиколла-урографина с градиентом плотности 1,077 г/мл, с последующим центрифугированием в течение 30 мин при 1500 об/мин и отбором мононуклеарных клеток, затем производят двукратный отмыв выделенных клеток раствором хлорида натрия и проводят ресуспендирование указанных клеток в рабочем растворе буфера для окрашивания 1X Annexin V Binding Buffer до концентрации 1×106 клеток/мл, при этом рабочий раствор буфера для окрашивания 1X Annexin V Binding Buffer представляет собой смесь концентрированного буфера для окрашивания 10Х Annexin V Binding Buffer с дистиллированной водой в объемном соотношении 1:9 соответственно, затем осуществляют инкубацию полученных клеток с исследуемым органическим низкомолекулярным соединением, получая опытный образец, и осуществляют инкубацию полученных клеток без добавления указанного соединения, получая контрольный образец, при этом инкубацию полученных клеток с исследуемым органическим низкомолекулярным соединением и без него проводят в течение 1 часа при температуре 37°С, после инкубации в опытный и контрольный образцы вводят реагенты аннексии V и йодид пропидия, образцы вновь инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин, добавляют рабочий раствор буфера для окрашивания 1X Annexin V Binding Buffer и осуществляют цитометрический анализ полученных образцов с определением содержания в них аннексина V, сравнивают численные величины содержания аннексина V в контрольном и опытном образцах и по соотношению большего числа содержания аннексина V к меньшему количественно оценивают апоптоз, модифицированный органическим низкомолекулярным соединением, причем при указанном соотношении, равном 1,5 и более, судят об апоптозе - критическом состоянии запрограммированной клеточной гибели в связи с влиянием указанного органического соединения.The specified technical result is achieved by the proposed method for the quantitative assessment of apoptosis modified with organic low molecular weight compounds, including taking a blood sample from a patient, isolating mononuclear cells from a sample and incubating cells with the test compound, while, according to the invention, mononuclear cells are isolated from the sample by introducing into the sample ethylenediaminetetraacetate, diluting it with an aqueous solution of sodium chloride, layering on 3 ml of ficoll-urographin with a density gradient of 1.077 / Ml, followed by centrifugation for 30 min at 1500 rev / min and collecting mononuclear cells then produce twice washing the isolated cells with a solution of sodium chloride and carried resuspending said cells in a working buffer solution for staining 1X Annexin V Binding Buffer to a concentration of 1 × 10 6 cells / ml, the working solution of the staining buffer 1X Annexin V Binding Buffer is a mixture of concentrated staining buffer 10X Annexin V Binding Buffer with distilled water in a volume ratio of 1: 9, respectively, then carried out incubation of the obtained cells with the studied organic low molecular weight compound is performed, obtaining a test sample, and the obtained cells are incubated without adding the indicated compound, obtaining a control sample, while the incubation of the obtained cells with and without the studied low molecular weight organic compound is carried out for 1 hour at a temperature of 37 ° C, after incubation, annexation V reagents and propidium iodide are introduced into the experimental and control samples, the samples are again incubated in the dark at room temperature at for 15 min, add a working solution of the 1X Annexin V Binding Buffer staining buffer and cytometric analysis of the obtained samples is carried out to determine the content of annexin V in them, the numerical values of the content of annexin V in the control and experimental samples are compared and the ratio of the higher content of annexin V to less Apoptosis modified by an organic low molecular weight compound is quantified; moreover, apoptosis is judged at a specified ratio of 1.5 or more; a critical condition is programmed th cell death due to the influence of said organic compound.
В качестве водного раствора хлорида натрия используют раствор с концентрацией 9 г/л и рН 7,2.As an aqueous solution of sodium chloride, a solution with a concentration of 9 g / l and a pH of 7.2 is used.
При наслоении на 3 мл градиента плотности фиколла-урографина концентрация фиколла составляет 9 об.%, а плотность градиента - 1,077 г/мл.When layered on a 3 ml density gradient of ficoll-urographin, the concentration of ficoll is 9 vol.%, And the density of the gradient is 1.077 g / ml.
Указанный технический результат достигается за счет следующего.The specified technical result is achieved due to the following.
Благодаря тому что выделение из пробы мононуклеарных клеток производят путем введения в пробу этилендиаминтетраацетата (ЭДТА), разведения ее водным раствором хлорида натрия, наслоения на 3 мл фиколла-урографина с градиентом плотности 1,077 г/мл с последующим центрифугированием в течение 30 мин при 1500 об/мин, обеспечиваются оптимальные условия для получения чистой культуры специфических клеток (мононуклеаров).Due to the fact that mononuclear cells are isolated from the sample by introducing ethylenediaminetetraacetate (EDTA) into the sample, diluting it with an aqueous solution of sodium chloride, layering 3 ml of ficoll-urographin with a density gradient of 1.077 g / ml, followed by centrifugation for 30 minutes at 1500 rpm min, provides optimal conditions for obtaining a pure culture of specific cells (mononuclear cells).
Осуществление двукратного отмыва выделенных клеток раствором хлорида натрия необходимо для максимального освобождения культуры мононуклеаров от тканевых «примесей».The implementation of the double washing of the selected cells with a solution of sodium chloride is necessary to maximize the release of the culture of mononuclear cells from tissue "impurities".
Последующее их ресуспендирование в рабочем растворе буфера для окрашивания 1X Annexin V Binding Buffer до концентрации 1×106 клеток/мл обеспечивает необходимый количественный стандарт мононуклеаров. Использование при этой операции рабочего раствора буфера для окрашивания 1X Annexin V Binding Buffer, представляющего смесь концентрированного буфера для окрашивания 10Х Annexin V Binding Buffer с дистиллированной водой в объемном соотношении 1:9 соответственно, необходимо для подготовки смеси мононуклеаров к дальнейшему внесению красителей (аннексина V и йодида пропидия).Their subsequent resuspension in the working solution of the 1X Annexin V Binding Buffer staining buffer to a concentration of 1 × 10 6 cells / ml provides the required quantitative standard for mononuclear cells. The use of a working solution of 1X Annexin V Binding Buffer for this operation, which is a mixture of concentrated 10X Annexin V Binding Buffer with distilled water in a volume ratio of 1: 9, respectively, is necessary to prepare the mixture of mononuclear cells for further application of dyes (annexin V and propidium iodide).
Проведение цитометрического анализа после добавления в образцы реагентов аннексина V и йодида пропидия является традиционным.Cytometric analysis after adding annexin V and propidium iodide to the reagent samples is traditional.
Однако как показали наши исследования, точность предлагаемого способа в установлении факта критического состояния запрограммированной клеточной гибели в связи с воздействием на организм человека низкомолекулярного органического соединения обеспечивается и тем, что экспериментально установлен соответствующий этому состоянию конкретный численный показатель 1,5 и более через соотношение большего числа содержания аннексина V к меньшему числу его содержания в контрольном или опытном образцах. Благодаря этому в дальнейшем можно говорить либо о формировании иммунодефицитного состояния (если содержание аннексина V в опытном образце превосходит его содержание в контрольном образце), либо о старении клетки (если содержание аннексина V в контрольном образце превосходит его содержание в опытном образце).However, as our studies have shown, the accuracy of the proposed method in establishing the fact of a critical state of programmed cell death due to the exposure of a low molecular weight organic compound to the human body is ensured by the fact that a specific numerical indicator of 1.5 or more is experimentally established through the ratio of a larger number of contents annexin V to a smaller number of its content in the control or experimental samples. Due to this, in the future, one can talk either about the formation of an immunodeficiency state (if the content of annexin V in the test sample exceeds its content in the control sample), or about the aging of the cell (if the content of annexin V in the control sample exceeds its content in the test sample).
По указанному установленному предлагаемым способом показателю в дальнейшем можно судить о нарушении состояния здоровья, связанном с воздействием анализируемого низкомолекулярного органического соединения, при одновременном обнаружении этого соединения в пробе крови в концентрации, превышающей референтную.Based on the indicated indicator established by the proposed method, it is possible in the future to judge a health condition associated with the effect of the analyzed low molecular weight organic compound, while detecting this compound in a blood sample at a concentration exceeding the reference.
Предлагаемый способ реализуется следующим образом.The proposed method is implemented as follows.
В процессе испытаний была исследована кровь у 12 пациентов. Исследования проводили следующим образом. Для исследования кровь с ЭДТА разводили в два раза раствором хлорида натрия (9 г/л, рН 7,2), наслаивали на 3 мл градиента плотности фиколла-урографина (концентрация фиколла составляла 9%, плотность градиента - 1,077 г/мл) и центрифугировали 30 мин при 1500 об/мин.During the tests, blood was examined in 12 patients. Research was carried out as follows. For the study, blood with EDTA was diluted twice with sodium chloride solution (9 g / l, pH 7.2), layered on 3 ml of a density gradient of ficoll-urografin (the concentration of ficoll was 9%, the gradient density was 1.077 g / ml) and centrifuged 30 min at 1500 rpm
Образовавшееся в интерфазе «кольцо» мононуклеарных клеток отбирали пипеткой, полученную клеточную взвесь дважды отмывали раствором хлорида натрия (9 г/л, рН 7,2).The “ring” of mononuclear cells formed in the interphase was pipetted, and the resulting cell suspension was washed twice with sodium chloride solution (9 g / L, pH 7.2).
Полученную взвесь мононуклеаров ресуспендировали в рабочем растворе буфера для окрашивания (1X Annexin V Binding Buffer) до концентрации 1×106 клеток/мл. Причем рабочий раствор буфера для окрашивания 1X Annexin V Binding Buffer представлял собой смесь концентрированного буфера для окрашивания 10Х Annexin V Binding Buffer (компонент No. 51-66121E из набора Cat. No. 556570, производство фирмы Бектон Дикинсон) с дистиллированной водой в объемном соотношении 1:9. В состав концентрированного буфера для окрашивания 10Х Annexin V Binding Buffer входила смесь солей: хлорида натрия, хлорида кальция, Hepes/NaOH, с рН=7,4.The resulting suspension of mononuclear cells was resuspended in a working solution of staining buffer (1X Annexin V Binding Buffer) to a concentration of 1 × 10 6 cells / ml. Moreover, the working solution of 1X Annexin V Binding Buffer was a mixture of concentrated 10X Annexin V Binding Buffer (component No. 51-66121E from Cat. No. 556570, manufactured by Becton Dickinson) with distilled water in a volume ratio of 1 :9. The composition of the concentrated 10X Annexin V Binding Buffer staining buffer included a mixture of salts: sodium chloride, calcium chloride, Hepes / NaOH, with pH = 7.4.
В процессе конкретных исследований на этих 12 пациентах оценивали влияние хлороформа (это вещество относится к органическому низкомолекулярному соединению) на включение клеток в апоптоз. Для этого 100 мкл суспензии ранее подготовленных мононуклеарных клеток (1×106 клеток/мл) инкубировали с референтной концентрацией хлороформа (0,017 мкг/см3) в течение 1 часа при 37°С. Хлороформ доводили до нужной концентрации путем разведения в отмывочном растворе в соотношении 20 мкл хлороформа к 10 мл раствора хлорида натрия (9 г/л, рН 7,2). В качестве контроля 100 мкл мононуклеарных клеток без добавления хлороформа инкубировалось при таких же условиях.In the course of specific studies on these 12 patients, the effect of chloroform (this substance refers to an organic low molecular weight compound) on the incorporation of cells into apoptosis was evaluated. For this, 100 μl of a suspension of previously prepared mononuclear cells (1 × 10 6 cells / ml) were incubated with a reference concentration of chloroform (0.017 μg / cm 3 ) for 1 hour at 37 ° C. Chloroform was adjusted to the desired concentration by dilution in a washing solution in the ratio of 20 μl of chloroform to 10 ml of sodium chloride solution (9 g / l, pH 7.2). As a control, 100 μl of mononuclear cells without adding chloroform were incubated under the same conditions.
После инкубации переносили 100 мкл клеточной суспензии в пробирку емкостью 5 мл, добавляли 5 мкл Annexin V-FITC и 5 мкл Propidium Iodide (PI). После этого содержимое пробирки аккуратно перемешивали и инкубировали 15 мин при комнатной температуре в темноте. Далее в каждую пробирку добавляли 400 мкл рабочего раствора буфера для окрашивания 1X Annexin V Binding Buffer. Анализировали на проточном цитометре в течение часа после окрашивания. Таким образом, для каждого пациента анализировалось 2 пробы - опытная (с добавлением референтной дозы хлороформа) и контрольная (без нее).After incubation, 100 μl of the cell suspension was transferred to a 5 ml tube, 5 μl of Annexin V-FITC and 5 μl of Propidium Iodide (PI) were added. After that, the contents of the tube were gently mixed and incubated for 15 min at room temperature in the dark. Next, 400 μl of a 1X Annexin V Binding Buffer staining solution was added to each tube. Analyzed on a flow cytometer within an hour after staining. Thus, for each patient, 2 samples were analyzed - experimental (with the addition of a reference dose of chloroform) and control (without it).
Цитометрический анализ мононуклеарных клеток проводили на проточном цитофлуориметре FACSCalibur фирмы «Becton Dickinson» с использованием универсальной программы CellQuest.PrO. Накопление производили до 10000 событий в лимфоцитарной области. Для настройки режимов компенсации и установки границ квадрантов использовали следующие контроли: неокрашенные клетки, клетки, окрашенные только Annexin V-FITC (без PI), клетки, окрашенные только Propidium Iodide (без Annexin V-FITC).Cytometric analysis of mononuclear cells was carried out on a Fectscalibur flow cytometer FACSCalibur (Becton Dickinson) using the universal CellQuest.PrO program. Accumulation produced up to 10,000 events in the lymphocytic region. The following controls were used to set compensation modes and set quadrant boundaries: unpainted cells, cells stained with Annexin V-FITC only (without PI), cells stained with Propidium Iodide only (without Annexin V-FITC).
В образце оценивали показатели прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния клеток, интенсивность флуоресценции Annexin V-FITC (FL1) и Propidium Iodide (FL3). После исключения дебриса (по показателям прямого и бокового светорассеяния) и выделения лимфоцитарного гейта определяли количество Annexin+- и Рi+-клеток в режиме DotPlot (двумерная гистограмма). Количество апоптотических Annexin+-клеток определяли в нижнем правом квадранте, клетки в позднем апоптозе (Annexin+PI+-клетки) оценивали в верхнем правом квадранте гистограммы. Данные, полученные в ходе испытаний, приведены в таблице.For the sample, direct (FSC) and lateral (SSC) light scattering, fluorescence intensity of Annexin V-FITC (FL1) and Propidium Iodide (FL3) were evaluated. After exclusion of debris (according to direct and lateral light scattering) and isolation of the lymphocyte gate, the number of Annexin + and Pi + cells in the DotPlot mode (two-dimensional histogram) was determined. The number of apoptotic Annexin + cells was determined in the lower right quadrant, cells in late apoptosis (Annexin + PI + cells) were evaluated in the upper right quadrant of the histogram. The data obtained during the tests are shown in the table.
Данные, приведенные в таблице, показывают, что добавление референтной концентрации хлороформа в взвесь мононуклеаров модифицирует апоптоз (графа 3). Причем степень отклонения показателя, фиксируемая по величине соотношения содержания аннексина в контрольных и опытных образцах (графа 5), зависит от базового уровня содержания органического соединения в крови пациента (графа 4). Чем выше концентрация хлороформа в крови, тем больше соотношение содержания аннексина контрольной и опытной проб. Так, пациенты под номерами 1, 6, 8, 10 характеризуются снижением содержания аннексина после инкубации с референтной концентрацией хлороформа более чем в 1,5 раза по отношению к контрольной пробе. При этом базовое содержание хлороформа в крови у данных пациентов превышало референтную концентрацию. Пациент под номером 11 характеризуется повышением содержания аннексина после инкубации с референтной концентрацией хлороформа более чем в 1,5 раза по отношению к контрольной пробе. При этом базовое содержание хлороформа в крови у данного пациента также превышало референтную концентрацию.The data in the table show that the addition of a reference concentration of chloroform to a suspension of mononuclear cells modifies apoptosis (column 3). Moreover, the degree of deviation of the indicator, fixed by the value of the ratio of the annexin content in the control and experimental samples (column 5), depends on the baseline level of the organic compound in the patient's blood (column 4). The higher the concentration of chloroform in the blood, the greater the ratio of the annexin content of the control and experimental samples. Thus, patients numbered 1, 6, 8, 10 are characterized by a decrease in the annexin content after incubation with a reference concentration of chloroform of more than 1.5 times in relation to the control sample. Moreover, the basic content of chloroform in the blood in these patients exceeded the reference concentration. Patient number 11 is characterized by an increase in the annexin content after incubation with a reference concentration of chloroform more than 1.5 times in relation to the control sample. Moreover, the basic content of chloroform in the blood of this patient also exceeded the reference concentration.
Подобные опыты были проведены с исследованием влияния фенола на апоптоз клеток. В качестве референтной концентрации фенола использовали концентрацию 0,05 мкг/см3. Результаты были аналогичны предыдущим исследованиям.Similar experiments were conducted with the study of the effect of phenol on cell apoptosis. As a reference phenol concentration, a concentration of 0.05 μg / cm 3 was used . The results were similar to previous studies.
Ускорение аннексин-индуцированного апоптоза ведет к дефициту иммуноцитов, замедлению иммуноопосредованных реакций, снижению функционального резерва и клеточной компетенции специфических лимфоцитарных фенотипов.Acceleration of annexin-induced apoptosis leads to a deficiency of immunocytes, a slowdown in immune-mediated reactions, a decrease in the functional reserve and cellular competence of specific lymphocytic phenotypes.
Замедление аннексин-индуцированного апоптоза снижает готовность к клеточной гибели в условиях контаминантной нагрузки и может служить отправной точкой инициации иммунопролиферативных состояний и снижения компетенции иммунной системы, ведет к ускоренному старению и онкогенной преформированности клетки.Slowing down annexin-induced apoptosis reduces the preparedness for cell death under conditions of a contaminant load and can serve as a starting point for the initiation of immunoproliferative states and a decrease in the competence of the immune system, leading to accelerated aging and oncogenic transformation of the cell.
Нагрузка с референтной концентрацией органического токсиканта, в зависимости от исходного его содержания в крови, может приводить либо к ускорению (опыты 1, 6, 8 и 10), либо к замедлению (опыт 11) клеточной гибели. И тот, и другой процесс являются негативными и изменение относительного количества апоптотических клеток в 1,5 и более раз свидетельствует о критическом состоянии процесса запрограммированной клеточной гибели в связи с экспозицией конкретного техногенного химического фактора и сдвиге его за границы диапазона оптимума с формированием либо иммунодефицитного состояния, либо старения клетки.A load with a reference concentration of an organic toxicant, depending on its initial content in the blood, can either accelerate (experiments 1, 6, 8, and 10) or slow down (experiment 11) cell death. Both processes are negative and a change in the relative number of apoptotic cells by 1.5 or more times indicates a critical state of the programmed cell death process due to exposure of a specific technogenic chemical factor and its shift beyond the optimum range with the formation of either an immunodeficiency state, either aging cells.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011140115/15A RU2471190C1 (en) | 2011-10-03 | 2011-10-03 | Method of quantitative estimation of apoptosis modified by organic low-molecular compounds |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011140115/15A RU2471190C1 (en) | 2011-10-03 | 2011-10-03 | Method of quantitative estimation of apoptosis modified by organic low-molecular compounds |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2471190C1 true RU2471190C1 (en) | 2012-12-27 |
Family
ID=49257570
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011140115/15A RU2471190C1 (en) | 2011-10-03 | 2011-10-03 | Method of quantitative estimation of apoptosis modified by organic low-molecular compounds |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2471190C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2621155C1 (en) * | 2016-07-19 | 2017-05-31 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" (ФБУН "ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения") | Method for evaluation of strontium impact on apoptosis, associated with allellic variants of fas gene in children |
| RU2626516C1 (en) * | 2016-08-22 | 2017-07-28 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" (ФБУН "ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения") | Method of estimation of influence of nitrosamines on apoptosis in children living in adverse environmental conditions |
| RU2645076C2 (en) * | 2016-07-07 | 2018-02-15 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина" (ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина) | Method for acoustic noninvasive impact on target cells of canine tissue |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2009101693A (en) * | 2009-01-20 | 2010-07-27 | ГУ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ГУ НИИ | METHOD FOR DETERMINING THE SEVERITY OF THE DISEASE AND EFFECTIVENESS OF TREATMENT IN PATIENTS WITH BRONCHOPULOUS DISEASES |
| RU2416797C2 (en) * | 2005-09-08 | 2011-04-20 | Мологен Аг | FUNCTIONAL IMMUNOASSAY in vitro |
-
2011
- 2011-10-03 RU RU2011140115/15A patent/RU2471190C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2416797C2 (en) * | 2005-09-08 | 2011-04-20 | Мологен Аг | FUNCTIONAL IMMUNOASSAY in vitro |
| RU2009101693A (en) * | 2009-01-20 | 2010-07-27 | ГУ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ГУ НИИ | METHOD FOR DETERMINING THE SEVERITY OF THE DISEASE AND EFFECTIVENESS OF TREATMENT IN PATIENTS WITH BRONCHOPULOUS DISEASES |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| DEROUET M. et al. Granulocyte macrophage colony-stimulating factor signaling and proteasome inhibition delay neutrophil apoptosis by increasing the stability of Mcl-1 // J.Biol.Chem. - 2004, V.279, No.26, P.26915-26921. * |
| KLEIN J.B. et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor delays neutrophil constitutive apoptosis through phosphoinositide 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase pathways // J.Immunol. - 2000, V.164, P.4286-4291. * |
| KLEIN J.B. et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor delays neutrophil constitutive apoptosis through phosphoinositide 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase pathways // J.Immunol. - 2000, V.164, P.4286-4291. DEROUET M. et al. Granulocyte macrophage colony-stimulating factor signaling and proteasome inhibition delay neutrophil apoptosis by increasing the stability of Mcl-1 // J.Biol.Chem. - 2004, V.279, No.26, P.26915-26921. Манских В.Н. Морфологические методы верификации и количественной оценки апоптоза // Бюллетень сибирской медицины. - 2004, 1, с.63-70. Долгих О.В., Зайцева Н.В., Дианова Д.Г. Аннексин-индуцированный апоптоз в условиях производственной среды // Материалы XLV научно-практической конференции с международным участием «Гигиена, организация здравоохранения и профпатология» и семинара «Актуальные вопросы современной профпатологии». - Новокузнецк: 17-18 ноября 2010 г, с.102-103. * |
| Манских В.Н. Морфологические методы верификации и количественной оценки апоптоза // Бюллетень сибирской медицины. - 2004, 1, с.63-70. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2645076C2 (en) * | 2016-07-07 | 2018-02-15 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина" (ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина) | Method for acoustic noninvasive impact on target cells of canine tissue |
| RU2621155C1 (en) * | 2016-07-19 | 2017-05-31 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" (ФБУН "ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения") | Method for evaluation of strontium impact on apoptosis, associated with allellic variants of fas gene in children |
| RU2626516C1 (en) * | 2016-08-22 | 2017-07-28 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" (ФБУН "ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения") | Method of estimation of influence of nitrosamines on apoptosis in children living in adverse environmental conditions |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20090081689A1 (en) | Reagents and methods to enrich rare cells from body fluids | |
| US20190078153A1 (en) | Method of analyzing genetically abnormal cells | |
| RU2471190C1 (en) | Method of quantitative estimation of apoptosis modified by organic low-molecular compounds | |
| CN111189761A (en) | Cell signal channel detection kit based on mass spectrometry flow technology and detection method | |
| KR20150134383A (en) | Methods, devices, and systems for sample analysis | |
| US20200116622A1 (en) | Use of Tumor Dissociation Reagent in Flow Cytometry | |
| EP2511707B1 (en) | Method for detection of basic peptide and reagent for detection of basic peptide | |
| CN113552347A (en) | Application of reagent for detecting follicular regulatory T cells in preparation of diagnostic reagent for prognosis of immunotherapy of allergic rhinitis | |
| Venable et al. | An analysis of endothelial microparticles as a function of cell surface antibodies and centrifugation techniques | |
| Sreejit et al. | S100A8/A9 in myocardial infarction | |
| CN110564864A (en) | Application of miR-6090 as gamma-ray radiation marker | |
| KR101138343B1 (en) | Quick test for the diagnosis of alzheimer's disease | |
| SK282091B6 (en) | Immuno-magnetic cell separation | |
| TR201808349T4 (en) | A method for predicting a therapeutic prevention response of a tumor disease. | |
| Kuczynski et al. | Longitudinal tracking of T cell lymphomas in mice using flow cytometry | |
| JP7368678B1 (en) | Methods for measuring the relative abundance of specific cell subpopulations in a CD4+ T cell population | |
| RU2621155C1 (en) | Method for evaluation of strontium impact on apoptosis, associated with allellic variants of fas gene in children | |
| US20240085306A1 (en) | Method for enriching cells or cell nuclei | |
| CN114459857B (en) | Pretreatment method for maintaining animal sperm motility and animal sperm apoptosis determination | |
| EP2818558B1 (en) | Method for assessing the viability of viruses with lymphotropism | |
| JP2023553609A (en) | How to determine the likelihood that a subject will respond to lipid-lowering therapy | |
| Maspero et al. | Detection of ubiquitinated targets in mammalian and Drosophila models | |
| Sakai et al. | Rapid and sensitive neurotoxicity test based on the morphological changes of PC12 cells with simple computer-assisted image analysis | |
| KR101236983B1 (en) | A method for the diagnosis of cancer by identifying subtypes of peripheral blood dendritic cells | |
| CN115290536A (en) | Improved detection method for cross matching of trace lymphotoxin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20131004 |