RU2468372C1

RU2468372C1 - Method of estimating efficiency of therapy of urinary bladder cancer by means of oncomarker nusap1

Info

Publication number: RU2468372C1
Application number: RU2011109878/15A
Authority: RU
Inventors: Анастасия Александровна Заболотнева; Петр Викторович Шегай; Нуршат Минуллаевич Гайфуллин; Игорь Георгиевич Русаков; Борис Яковлевич Алексеев; Антон Александрович Буздин
Priority date: 2011-03-16
Filing date: 2011-03-16
Publication date: 2012-11-27
Also published as: RU2011109878A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: claimed is method of estimating efficiency of therapy of urinary bladder cancer by method of immunofermentative analysis, which includes obtaining samples of patient's urine and blood, separation of mixture of protein components of urine and blood, carrying out ELISA with monoclonal and/or polyclonal antibodies and/or their fragments against recombinant protein NUSAP1 and/or its unique fragments longer than 8 amino acids and determination of protein NUSAP1 content in analysed samples. 1.5-5 fold reduction of protein NUSAP1 level in urine and blood after performed therapy in comparison with initial level of said protein, determined before beginning of treatment, is index of efficiency of therapy of urine bladder cancer.

EFFECT: invention provides efficient method of estimating therapy of urinary bladder cancer by method of immunofermentative analysis by the level of protein NUSAP1 in urine and blood.

3 dwg, 4 tbl, 5 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, в частности онкологии и молекулярной биологии, и касается способа оценки эффективности терапии рака мочевого пузыря (РМП) и набора для его осуществления.The invention relates to medicine, in particular oncology and molecular biology, and relates to a method for evaluating the effectiveness of treatment of bladder cancer (RMP) and a kit for its implementation.

Рак мочевого пузыря (РМП) является распространенной патологией. Ежегодно в мире диагностируется около 356000 новых случаев заболевания РМП [Ploeg, М., К.К.Aben and L.A.Kiemeney, The present and future burden of urinary bladder cancer in the world. World J Urol, 2009. 27 (3): p.289-93]. Существующие методы диагностики РМП разделяют на две группы: инвазивные и неинвазивные. К инвазивным методам диагностики относятся цистоскопия, позволяющая визуализировать опухоль и провести биопсию мочевого пузыря, а также трансуретральное ультразвуковое исследование (трансуретральная ультрасонография) [Qu, X., X.Huang, L.Wu, et al., Comparison of virtual cystoscopy and ultrasonography for bladder cancer detection: A meta-analysis. Eur J Radiol, 2010]. Все инвазивные методы связаны с дискомфортом и риском для здоровья пациента, дороговизной и сложностью выполнения.Bladder cancer (RMP) is a common pathology. About 356,000 new cases of RMP are diagnosed annually in the world [Ploeg, M., K.K. Aben and L. A. Kiemeney, The present and future burden of urinary bladder cancer in the world. World J Urol, 2009.27 (3): p. 289-93]. Existing methods for diagnosing RMP are divided into two groups: invasive and non-invasive. Invasive diagnostic methods include cystoscopy, which allows visualization of the tumor and biopsy of the bladder, as well as transurethral ultrasound (transurethral ultrasonography) [Qu, X., X. Huang, L. Wu, et al., Comparison of virtual cystoscopy and ultrasonography for bladder cancer detection: A meta-analysis. Eur J Radiol, 2010]. All invasive methods are associated with discomfort and risk to the patient’s health, high cost and complexity of execution.

К неинвазивным относятся обнаружение в физиологических жидкостях организма маркеров РМП, трансабдоминальная ультразвуковая томография, рентгеновская компьютерная томография, магнитно-резонансная томография, цитологическое исследование мочи или промывной жидкости [Kenney, D.M., R.D.Geschwindt, M.R.Каrу, et al., Detection of newly diagnosed bladder cancer, bladder cancer recurrence and bladder cancer in patients with hematuria using quantitative rt-PCR of urinary survivin. Tumour Biol, 2007. 28 (2): p.57-62, Van Tilborg, A.A., C.H.Bangma and E.C.Zwarthoff, Bladder cancer biomarkers and their role in surveillance and screening. Int J Urol, 2009. 16 (1): р.23-30].Non-invasive include the detection of RMP markers in physiological body fluids, transabdominal ultrasound tomography, X-ray computed tomography, magnetic resonance imaging, cytological examination of urine or wash fluid [Kenney, DM, RDGeschwindt, MRKaru, et al., Detection of newly diagnosed bladder cancer, bladder cancer recurrence and bladder cancer in patients with hematuria using quantitative rt-PCR of urinary survivin. Tumour Biol, 2007.28 (2): p. 57-62, Van Tilborg, A.A., C.H. Bangma and E.C. Zwarthoff, Bladder cancer biomarkers and their role in surveillance and screening. Int J Urol, 2009.16 (1): p. 23-30].

Биомаркеры РМП подразделяют на следующие группы:RMP biomarkers are divided into the following groups:

1. Маркеры, представляющие собой РНК генов, дифференциально экспрессирующихся в нормальных и опухолевых тканях.1. Markers, which are RNA genes differentially expressed in normal and tumor tissues.

2. Белковые маркеры, а также пептиды и продукты белковой деградации, специфично обнаруживаемые в моче или крови больного.2. Protein markers, as well as peptides and protein degradation products that are specifically found in the patient’s urine or blood.

Для оценки содержания РНК-маркеров РМП используют различные методы, прежде всего микрочиповую гибридизацию и метод ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) [Livak K.J., Flood S.J., Marmaro J., Giusti W., Deets K. 1995. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Appl. 4, 357-362].Various methods are used to evaluate the content of RNA markers of RMP, primarily microarray hybridization and real-time PCR (PCR-RV) [Livak KJ, Flood SJ, Marmaro J., Giusti W., Deets K. 1995. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Appl. 4, 357-362].

В качестве РНК-маркеров РМП используют:As RNA markers of RMP use:

- сурвивин (повышенный уровень мРНК обнаруживается в опухолевых тканях, моче и промывной жидкости) [Kenney, D.M., R.D.Geschwindt, M.R.Kary, et al., Detection of newly diagnosed bladder cancer, bladder cancer recurrence and bladder cancer in patients with hematuria using quantitative rt-PCR of urinary survivin. Tumour Biol, 2007. 28 (2): p.57-62];- survivin (elevated mRNA levels are found in tumor tissues, urine, and lavage fluid) [Kenney, DM, RDGeschwindt, MRKary, et al., Detection of newly diagnosed bladder cancer, bladder cancer recurrence and bladder cancer in patients with hematuria using quantitative rt-PCR of urinary survivin. Tumour Biol, 2007. 28 (2): p. 57-62];

- цитокератин 20 (повышенный уровень мРНК в моче и промывной жидкости) [Guo, В., С.Luo, С.Xun, et al., Quantitative detection of cytokeratin 20 mRNA in urine samples as diagnostic tools for bladder cancer by real-time PCR. Exp Oncol, 2009. 31 (1): p.43-7];- cytokeratin 20 (elevated levels of mRNA in urine and wash fluid) [Guo, B., C. Luo, C. Xun, et al., Quantitative detection of cytokeratin 20 mRNA in urine samples as diagnostic tools for bladder cancer by real-time PCR Exp Oncol, 2009. 31 (1): p. 43-7];

- гиалуронидазы (уровень мРНК повышен в моче) [Van Tilborg, A.A., C.H.Bangma and Е.С.Zwarthoff, Bladder cancer biomarkers and their role in surveillance and screening. Int J Urol, 2009. 16 (1): p.23-30];- hyaluronidase (mRNA level is elevated in the urine) [Van Tilborg, A.A., C.H. Bangma and E.C. Zwarthoff, Bladder cancer biomarkers and their role in surveillance and screening. Int J Urol, 2009.16 (1): p.23-30];

- теломеразы (уровень мРНК повышен в моче) [Eissa, S., M.Swellam, R.Ali-Labib, et al., Detection of telomerase in urine by 3 methods: evaluation of diagnostic accuracy for bladder cancer. J Urol, 2007. 178 (3 Pt 1): p.1068-72].- telomerase (mRNA level is elevated in urine) [Eissa, S., M.wellam, R. Ali-Labib, et al., Detection of telomerase in urine by 3 methods: evaluation of diagnostic accuracy for bladder cancer. J Urol, 2007. 178 (3 Pt 1): p.1068-72].

Однако же, существенным недостатком всех существующих РНК-маркеров РМП является их низкая прогностическая ценность (менее 20% случаев РМП), что приводит к слабой воспроизводимости результатов и низкой клинической ценности таких тестов.However, a significant drawback of all existing RNA markers of RMP is their low prognostic value (less than 20% of cases of RMP), which leads to poor reproducibility of the results and low clinical value of such tests.

Для диагностики РМП с помощью белковых маркеров используют методы иммунохимического анализа, основанные на реакции взаимодействия специфических антител с белком-маркером. С помощью этих методов можно оценить количественное содержание белка-маркера РМП и его пространственное распределение в исследуемой ткани. Биологический образец, для которого проводится анализ белка, может быть иммобилизован на твердом носителе, например, на полимерной мембране, на которой можно иммобилизовать клетки, части клеток или белки. Этот носитель в дальнейшем гибридизуют с мечеными антителами, специфичными к исследуемому белку. Затем оценивают количество связавшихся с носителем антител. Как правило, для этого используют первичные или вторичные антитела, меченые химически связанным с ними ферментом [Voller, A., The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (theory, technique and applications). Ric Clin Lab, 1978. 8 (4): p.289-98, de Savigny, D. and A.Voller, The communication of ELISA data from laboratory to clinician. J Immunoassay, 1980. 1 (1); p.105-28]. Фермент, связанный с антителом, реагирует с соответствующим субстратом, изменяющим свои спектральные характеристики в результате реакции, с образованием химической группировки или соединения, которое может быть обнаружено с помощью спектрометрических или флуореметрических методов, или визуально. Кроме того, антитела также метят радиоизотопами, наночастицами металлов и другими веществами. На этом принципе основаны коммерчески доступные методы диагностики РМП, такие как NMP-22 (детекция в моче ядерного белка, высвобождаемого при апоптозе). Эта диагностическая тест-система может служить прототипом данного изобретения [Landman J, Chang Y, Kavaler E, Droller MJ, Liu ВС., Sensitivity and specificity of NMP-22, telomerase, and BTA in the detection of human bladder cancer. Urology. 1998 Sep; 52 (3): 398-402]. В качестве диагностических признаков в ней используют следующие критерии: 1) статистически значимое повышение уровня содержания маркера в образце РМП относительно верхней границы нормы; 2) выраженная динамика снижения уровня маркера при успешном лечении РМП не менее чем на 50%. Эта система также может быть использована для обнаружения рецидивов и прогнозирования будущего течения болезни. Вместе с тем, эта и другие доступные системы диагностики РМП, основанные на детекции белковых маркеров в физиологических жидкостях, обладают недостаточной чувствительностью (менее 25%) для эффективного применения в клинической практике.For the diagnosis of RMP using protein markers, immunochemical analysis methods based on the reaction of interaction of specific antibodies with a protein marker are used. Using these methods, one can evaluate the quantitative content of the marker protein RMP and its spatial distribution in the tissue under study. The biological sample for which the protein analysis is carried out can be immobilized on a solid support, for example, on a polymer membrane, on which cells, parts of cells or proteins can be immobilized. This carrier is subsequently hybridized with labeled antibodies specific for the test protein. The amount of antibody bound to the carrier is then evaluated. As a rule, primary or secondary antibodies labeled with a chemically bound enzyme are used for this [Voller, A., The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (theory, technique and applications). Ric Clin Lab, 1978. 8 (4): p. 289-98, de Savigny, D. and A. Voller, The communication of ELISA data from laboratory to clinician. J Immunoassay, 1980.1 (1); p.105-28]. The enzyme associated with the antibody reacts with the appropriate substrate, changing its spectral characteristics as a result of the reaction, with the formation of a chemical moiety or compound that can be detected using spectrometric or fluoremetric methods, or visually. In addition, antibodies are also labeled with radioisotopes, metal nanoparticles and other substances. This principle is based on commercially available methods for the diagnosis of RMP, such as NMP-22 (detection in the urine of a nuclear protein released during apoptosis). This diagnostic test system can serve as a prototype of the present invention [Landman J, Chang Y, Kavaler E, Droller MJ, Liu BC., Sensitivity and specificity of NMP-22, telomerase, and BTA in the detection of human bladder cancer. Urology. 1998 Sep; 52 (3): 398-402]. The following criteria are used as diagnostic features in it: 1) a statistically significant increase in the level of marker content in the RMP sample relative to the upper limit of the norm; 2) pronounced dynamics of a decrease in marker levels with successful treatment of RMP by at least 50%. This system can also be used to detect relapses and predict the future course of the disease. At the same time, this and other available diagnostic systems for RMP, based on the detection of protein markers in physiological fluids, have insufficient sensitivity (less than 25%) for effective use in clinical practice.

Изобретение позволяет проводить оценку эффективности лечения рака мочевого пузыря, а также решает задачу повышения чувствительности маркеров РМП и позволяет проводить диагностику РМП с чувствительностью 89%.The invention allows to evaluate the effectiveness of the treatment of bladder cancer, and also solves the problem of increasing the sensitivity of markers of RMP and allows the diagnosis of RMP with a sensitivity of 89%.

Поставленная задача решается за счет определения уровня белка NUSAP1 в моче и крови испытуемого (пациента) методом иммуноферментного анализа, включающем получение образцов мочи и крови от пациента, выделение смеси белковых компонентов мочи и крови, проведение реакции иммуноферментного анализа с моноклональными и/или поликлональными антителами и/или их фрагментами против рекомбинантного белка NUSAP1 и/или его уникальных фрагментов длиной свыше 8 аминокислот и проведение диагностики путем определения содержания белка NUSAP1 в исследуемых образцах. При этом снижение уровня белка NUSAP1 в моче и крови в 1.5-5 раз после проведенной терапии по сравнению с исходным уровнем данного белка в моче и крови, выявленным до начала лечения, является показателем эффективности терапии рака мочевого пузыря.The problem is solved by determining the level of NUSAP1 protein in the urine and blood of the test person (patient) by enzyme-linked immunosorbent assay, which includes obtaining urine and blood samples from the patient, isolating a mixture of protein components of urine and blood, conducting an enzyme-linked immunosorbent assay with monoclonal and / or polyclonal antibodies and / or their fragments against the recombinant protein NUSAP1 and / or its unique fragments with a length of more than 8 amino acids and conducting diagnostics by determining the content of NUSAP1 protein in the studied image Tsakh. At the same time, a decrease in the level of NUSAP1 protein in urine and blood by 1.5-5 times after the treatment compared with the initial level of this protein in urine and blood detected before treatment is an indicator of the effectiveness of treatment for bladder cancer.

В настоящем изобретении, в качестве маркера РМП используют продукты гена NUSAP1, обладающего высокой специфичностью экспрессии именно в клетках РМП, но не в нормальной ткани мочевого пузыря. В настоящем изобретении, в качестве показателя наличия раковых и/или предраковых изменений для РМП служит изменение содержания белка гена NUSAP1 у пациентов, больных РМП.In the present invention, as a marker of RMP, the products of the NUSAP1 gene are used, which have high specificity of expression specifically in RMP cells, but not in normal bladder tissue. In the present invention, as an indicator of the presence of cancerous and / or precancerous changes for RMP, there is a change in the protein content of the NUSAP1 gene in patients with RMP.

В ходе проведенного авторами поиска дифференциальных транскриптов с помощью анализа на микрочипах и идентификации дифференциально экспрессирующихся генов в нормальных и опухолевых образцах тканей мочевого пузыря на разных этапах злокачественного перерождения обнаружено значительное повышение содержания мРНК гена NUSAP1 уже на ранних стадиях злокачественной трансформации клеток мочевого пузыря.In the course of the authors' search for differential transcripts using microarray analysis and identification of differentially expressed genes in normal and tumor samples of bladder tissue at various stages of malignant transformation, a significant increase in the NUSAP1 gene mRNA was detected already in the early stages of malignant transformation of bladder cells.

Уровень мРНК гена NUSAP1 определяют при помощи следующих процедур: получение исходных образцов биоматериала, например, тканей от пациента; выделение и очистка препаратов РНК из образцов тканей; синтез кДНК на матрице РНК, определение концентрации мРНК гена NUSAP1 при помощи количественной ПЦР-амплификации с использованием матрицы кДНК; нормирование концентрации мРНК гена NUSAP1 по контрольному гену, содержание мРНК которого относительно постоянно в здоровых и раковых тканях человека, в том числе и в мочевом пузыре; проведение диагностики РМП. Например, показанием для обнаружения РМП служит уровень содержания мРНК гена NUSAP1 в тканях мочевого пузыря, превышающий 0,5% от уровня содержания в этих тканях мРНК гена бета-актина человека (АСТВ).The NUSAP1 gene mRNA level is determined using the following procedures: obtaining initial samples of biomaterial, for example, tissues from a patient; Isolation and purification of RNA preparations from tissue samples; synthesis of cDNA on the RNA matrix, determination of the concentration of mRNA of the NUSAP1 gene using quantitative PCR amplification using a cDNA matrix; normalization of the NUSAP1 gene mRNA concentration according to the control gene, the mRNA content of which is relatively constant in healthy and cancerous human tissues, including the bladder; diagnostics of RMP. For example, an indication for the detection of RMP is the level of NUSAP1 mRNA in bladder tissues in excess of 0.5% of the level of human beta-actin gene (ASTV) mRNA in these tissues.

Олигонуклеотидные праймеры, используемые для синтеза одноцепочечной или двуцепочечной кДНК, выбирают из числа олиго(dТ)-содержащих праймеров, случайных гексамеров, или их комбинации, а также геноспецифичных праймеров.Oligonucleotide primers used for the synthesis of single-stranded or double-stranded cDNA are selected from oligo (dT) -containing primers, random hexamers, or a combination thereof, as well as gene-specific primers.

Для амплификации кДНК используют олигонуклеотидные праймеры и зонд, подобранные таким образом, что они специфически гибридизуются с кДНК даже в присутствии в препарате примеси геномной ДНК. Возможная последовательность праймеров представлена SEQ ID NO 1-2.For amplification of cDNA, oligonucleotide primers and a probe are used that are selected in such a way that they specifically hybridize with cDNA even in the presence of an impurity of genomic DNA. A possible sequence of primers is presented by SEQ ID NO 1-2.

Количественная реакция амплификации фрагмента гена NUSAP1 представляет собой ПЦР в реальном времени или ОТ-ПЦР в реальном времени.The quantitative amplification reaction of the NUSAP1 gene fragment is real-time PCR or real-time RT-PCR.

В качестве контрольного гена используют ген АСТВ, кодирующий актин бета. Возможная последовательность праймеров для определения концентрации контрольного гена представлена SEQ ID NO 3-4. Последовательность кодирующей белок ДНК гена NUSAP1 представлена на SEQ ID NO 5. Последовательность белка NUSAP1 представлена на SEQ ID NO 6.The ASTV gene encoding actin beta is used as a control gene. A possible sequence of primers for determining the concentration of the control gene is presented by SEQ ID NO 3-4. The sequence of the NUSAP1 gene coding for the DNA protein is shown in SEQ ID NO 5. The NUSAP1 protein sequence is shown in SEQ ID NO 6.

Набор праймеров для осуществления полимеразной цепной реакции для определения содержания мРНК гена NUSAP1 имеют последовательности SEQ ID NO 1-2.The set of primers for the implementation of the polymerase chain reaction for determining the content of mRNA of the NUSAP1 gene have the sequence of SEQ ID NO 1-2.

В дальнейшем, при помощи иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием моноклональных антител против белкового продукта гена NUSAP1, обнаружено также и повышенное содержание белка NUSAP1 в моче и в крови больных РМП. Всего, из 200 исследованных образцов тканей больных РМП, в 178 (89%) наблюдался уровень белкового продукта NUSAP1, в два раза и более превышающий наивысшее значение по уровню NUSAP1 для группы из 74 образцов тканей здоровых доноров.Later, using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using monoclonal antibodies against the protein product of the NUSAP1 gene, an increased content of NUSAP1 protein in the urine and blood of patients with RMP was also found. In total, out of 200 examined tissue samples from patients with RMP, in 178 (89%) the level of protein product NUSAP1 was observed, twice or more exceeding the highest value in terms of NUSAP1 for a group of 74 tissue samples from healthy donors.

Настоящее изобретение относится к новому маркеру для диагностики рака мочевого пузыря (РМП), который представляет собой продукт гена NUSAP1. Увеличение содержания белка NUSAP1 (продукта гена NUSAP1) в моче предположительно больного РМП человека по сравнению с содержанием белка в моче здорового человека, служит диагностическим маркером РМП. Снижение уровня белка NUSAP1 после проведенной терапии является показателем успешности проведенного лечения.The present invention relates to a new marker for the diagnosis of bladder cancer (RMP), which is a product of the NUSAP1 gene. An increase in the content of NUSAP1 protein (a product of the NUSAP1 gene) in the urine of a presumably sick human RMP compared to the protein content in the urine of a healthy person serves as a diagnostic marker of RMP. The decrease in the level of NUSAP1 protein after the treatment is an indicator of the success of the treatment.

Настоящее изобретение относится к способу оценки эффективности терапии рака мочевого пузыря. Данный способ включает следующие стадии: получение образца мочи и крови от пациента, для которого проводится исследование на наличие РМП; выделение смеси белковых компонентов мочи и крови; проведение реакции иммуноферментного или другого иммунологического анализа с моноклональными или поликлональными антителами или их фрагментами против рекомбинантного белка NUSAP1 или его уникальных фрагментов длиной свыше 8 аминокислот; проведение диагностики РМП путем сравнения содержания белка NUSAP1 в моче и/или крови исследуемого пациента с концентрацией содержания белка NUSAP1 в моче и/или крови здоровых людей и больных РМП.The present invention relates to a method for evaluating the effectiveness of the treatment of bladder cancer. This method includes the following stages: obtaining a sample of urine and blood from a patient for whom a study is performed for the presence of RMP; the allocation of a mixture of protein components of urine and blood; conducting an enzyme immunoassay or other immunological analysis with monoclonal or polyclonal antibodies or their fragments against the recombinant protein NUSAP1 or its unique fragments with a length of more than 8 amino acids; diagnostics of RMP by comparing the NUSAP1 protein content in the urine and / or blood of the patient under study with the concentration of NUSAP1 protein in the urine and / or blood of healthy people and patients with RMP.

В данном варианте могут быть использованы химерные антитела или антитела, состоящие из одной цепи или Fab/F(аb')₂-фрагменты или антиидиотипические антитела или эпитоп-связывающие фрагменты.In this embodiment, chimeric antibodies or antibodies consisting of a single chain or Fab / F (ab ') ₂ fragments or anti-idiotypic antibodies or epitope-binding fragments can be used.

В данном изобретении предложены варианты способа диагностики рака мочевого пузыря методами ПЦР в реальном времени и иммуноферментного анализа (ИФА), основанными на измерении содержания мРНК гена NUSAP1 и/или его белкового продукта, а также набор для осуществления этого способа. Достоверно обнаруживаемое различие в содержании мРНК гена NUSAP1 в нормальных и опухолевых тканях или белка NUSAP1 в моче и/или крови больных РМП и здоровых людей может быть использовано для обнаружения РМП в исследуемых образцах.The present invention provides variants of a method for diagnosing bladder cancer by real-time PCR and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based on measuring the mRNA content of the NUSAP1 gene and / or its protein product, as well as a kit for implementing this method. A reliably detectable difference in the NUSAP1 gene mRNA content in normal and tumor tissues or NUSAP1 protein in the urine and / or blood of patients with RMP and healthy people can be used to detect RMP in the studied samples.

В качестве образцов для проведения анализа берут биоптаты, пунктаты, в том числе материал, полученный при цистоскопии с прямой биопсией, моча и периферическая кровь.Biopsy samples, punctate, including material obtained by cystoscopy with direct biopsy, urine and peripheral blood are taken as samples for analysis.

В основе метода иммуноферментного анализа и его наиболее часто применяемой модификации (англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) лежит принцип специфического взаимодействия между антигеном и соответствующим ему антителом. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием конъюгата, который представляет собой комплекс вторичного антитела, соединенного с ферментной меткой (обычно используют пероксидазу хрена либо другие пероксидазы) или помеченного иным способом. Конъюгат может быть получен как с использованием поликлональных антител (например, кроличьи антитела против иммуноглобулинов человека), так и моноклональных антител, направленных против человеческих иммуноглобулинов определенного класса (М, G, А). В настоящем изобретении предполагается использование моноклональных и/или поликлональных антител и/или их фрагментов, полученных против рекомбинантного белка NUSAP1 и/или его уникальных фрагментов длиной свыше 8 аминокислот.The enzyme immunoassay method and its most frequently used modification (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) are based on the principle of specific interaction between an antigen and its corresponding antibody. Identification of the resulting complex is carried out using a conjugate, which is a complex of a secondary antibody connected to an enzyme label (usually horseradish peroxidase or other peroxidases are used) or otherwise labeled. The conjugate can be obtained using polyclonal antibodies (for example, rabbit antibodies against human immunoglobulins) or monoclonal antibodies directed against human immunoglobulins of a certain class (M, G, A). The present invention contemplates the use of monoclonal and / or polyclonal antibodies and / or fragments thereof obtained against the recombinant NUSAP1 protein and / or its unique fragments of more than 8 amino acids in length.

Существует несколько методов постановки реакции, однако в настоящее время наиболее часто для выявления специфических антител используется следующая схема (т.н. сэндвич-метод ИФА):There are several methods for setting the reaction, however, at present, the following scheme is most often used to detect specific antibodies (the so-called ELISA sandwich method):

1) на лунках тест-планшета фиксируют антиген, который инкубируется с испытуемой сывороткой или плазмой крови. При наличии в них специфических антител происходит связывание их с образованием комплекса антиген-антитело;1) the antigen is fixed on the wells of the test tablet, which is incubated with the test serum or blood plasma. In the presence of specific antibodies in them, they bind to form an antigen-antibody complex;

2) в дальнейшем, при инкубации этого комплекса с конъюгатом вторичного антитела и пероксидазы хрена, происходит присоединение анти-антител к имеющимся комплексам антиген-антитело. Ферментативная реакция (цветная реакция) проходит в присутствии перекиси водорода и субстрата, представленного неокрашенным соединением, которое в процессе пероксидазной реакции (или другой ферментативной реакции) окисляется до окрашенного продукта на заключительном этапе проведения исследования. Интенсивность окрашивания прямо коррелирует с количеством выявленных специфических антител;2) in the future, when this complex is incubated with a conjugate of a secondary antibody and horseradish peroxidase, the anti-antibodies attach to the existing antigen-antibody complexes. An enzymatic reaction (color reaction) takes place in the presence of hydrogen peroxide and a substrate represented by an unpainted compound, which, during the peroxidase reaction (or other enzymatic reaction), is oxidized to a colored product at the final stage of the study. Staining intensity directly correlates with the number of specific antibodies detected;

3) результат определения оценивают спектрофотометрически или визуально (Фиг.1).3) the determination result is evaluated spectrophotometrically or visually (Figure 1).

В настоящем изобретении в качестве маркера успешности терапии РМП выступает уровень белка NUSAP1, содержание которого повышено в моче больных РМП по сравнению со здоровыми донорами, не имеющими злокачественных новообразований.In the present invention, the level of NUSAP1 protein, the content of which is increased in the urine of patients with RMP in comparison with healthy donors without malignant tumors, is a marker of the success of treatment for RMP.

Настоящее изобретение проиллюстрировано со ссылкой на конкретные примеры, представляющие собой наиболее предпочтительные воплощения изобретения. Изобретение не ограничивается описанными воплощениями, но включает любые альтернативы, модификации или эквиваленты, допустимые с учетом сущности и объема изобретения.The present invention is illustrated with reference to specific examples representing the most preferred embodiments of the invention. The invention is not limited to the described embodiments, but includes any alternatives, modifications, or equivalents that are acceptable given the nature and scope of the invention.

Изобретение иллюстрируют чертежи.The invention is illustrated by drawings.

Фигура 1. Схема иммунофлуоресцентного анализа.Figure 1. Scheme of immunofluorescence analysis.

Фигура 2. Электрофоретическое разделение в 1,5%-ном агарозном геле продукта ПЦР-РВ (35 циклов ПЦР) - транскрипта гена NUSAP1 (размер 232 п.н.), 1-я дорожка - маркер молекулярных масс ДНК от 100 до 1500 п.н., 2-я дорожка - транскрипт гена NUSAP1 ожидаемого размера в опухолевых тканях, 3-я дорожка - в нормальных тканях мочевого пузыря.Figure 2. Electrophoretic separation in a 1.5% agarose gel of the PCR-PB product (35 PCR cycles) - NUSAP1 gene transcript (size 232 bp), 1st lane - DNA molecular weight marker from 100 to 1500 p .n., 2nd lane - a transcript of the NUSAP1 gene of the expected size in tumor tissues, 3rd lane - in normal tissues of the bladder.

Фигура 3. Относительный уровень экспрессии гена NUSAP1 в опухолевых и нормальных тканях мочевого пузыря, измеренный путем ПЦР-РВ после нормализации его экспрессии относительно экспрессии гена АСТВ в тех же образцах тканей. Образцы №№1-9 - опухолевые ткани мочевого пузыря, 10-12 - нормальные (не имеющие злокачественной трансформации) ткани мочевого пузыря.Figure 3. Relative level of NUSAP1 gene expression in tumor and normal bladder tissues, measured by PCR-RV after normalizing its expression relative to ASTV gene expression in the same tissue samples. Samples No. 1-9 - tumor tissue of the bladder, 10-12 - normal (without malignant transformation) tissue of the bladder.

Изобретение иллюстрируют примеры.The invention is illustrated by examples.

Пример 1. Определение уровня мРНК гена NUSAP1 в нормальных и раковых тканях мочевого пузыря.Example 1. Determination of the mRNA level of the NUSAP1 gene in normal and cancerous tissues of the bladder.

1) Образцы тканей1) Tissue samples

Образцы тканей различных гистологических типов ПРМП (Т), морфологически нормальные ткани, прилегающие к опухолям (т.н. условные нормы (N), а также нормальные ткани мочевого пузыря (NB) от скоропостижно скончавшихся доноров собраны и охарактеризованы независимо двумя различными группами сотрудников ФГУ МНИОИ им. П.А.Герцена Росмедтехнологии и факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В.Ломоносова). Клинический диагноз установлен с учетом данных ретроспективного анализа первичной медицинской документации больных, цито- и гистологических исследований биоптатов, полученных при цистоскопии, а также образцов тканей мочевого пузыря, полученных после трансуретральной резекции и операционного материала. Образцы тканей мочевого пузыря (опухоль, условно-нормальная ткань) получены непосредственно после удаления опухоли. Каждый образец хранят в растворе RNALater Reagent (QIAGEN), стабилизирующем молекулы РНК, при температуре -70°С. Все опухолевые образцы охарактеризованы согласно международной системе клинико-морфологической классификации опухолей ТНМ, где Т (tumor) - Т0-Т4 - категории, отражающие увеличение размера и/или местного распространения первичной опухоли, N (nodules) - N0-N3 - категории, отражающие различную степень поражения метастазами регионарных лимфатических узлов; M (metastasis) - М0-М1 - характеризует отдаленные метастазы. Все возможные комбинации ТНМ объединяют в более крупные группы - стадии, отражающие течение опухолевого процесса.Tissue samples of different histological types of PRMP (T), morphologically normal tissues adjacent to tumors (the so-called conditional norms (N), as well as normal tissues of the bladder (NB) from suddenly died donors were collected and characterized independently by two different groups of FSI employees MNIII named after P.A. Herzen of Rosmedtechnology and the faculty of fundamental medicine of Moscow State University named after M.V. Lomonosov). The clinical diagnosis was established taking into account data from a retrospective analysis of the primary medical documentation of patients, cytological and histological studies of biopsy specimens obtained by cystoscopy, as well as samples of bladder tissue obtained after transurethral resection and surgical material. Bladder tissue samples (tumor, conditionally normal tissue) were obtained immediately after removal of the tumor. Each sample was stored in an RNALater Reagent (QIAGEN) solution stabilizing RNA molecules at a temperature of -70 ° C. All tumor samples were characterized according to the international system of clinical and morphological classification of TNM tumors, where T (tumor) - T0-T4 - categories reflecting an increase in the size and / or local distribution of the primary tumor, N (nodules) - N0-N3 - categories reflecting different the degree of defeat by metastases of the regional lymph nodes; M (metastasis) - M0-M1 - characterizes distant metastases. All possible combinations of TNM are combined into larger groups - stages that reflect the course of the tumor process.

2) Выделение препаратов РНК из тканей2) Isolation of RNA preparations from tissues

Суммарную РНК выделяют из замороженных, хранящихся в растворе RNALater Reagent (QIAGEN) образцов опухолевых и нормальных тканей с использованием TRIZOL Reagent (Invitrogen). Основные этапы включают:Total RNA was isolated from frozen, stored in RNALater Reagent (QIAGEN) solution samples of tumor and normal tissue using TRIZOL Reagent (Invitrogen). The main steps include:

а) разрушение ткани, замороженной в жидком азоте, с использованием микродесмембратора («Sartorius», Германия) и гомогенизацию разрушенного образца в лизирующем растворе, содержащем гуанидинизотиоцианат и фенол;a) the destruction of tissue frozen in liquid nitrogen, using a microdesembler ("Sartorius", Germany) and the homogenization of the destroyed sample in a lysis solution containing guanidine isothiocyanate and phenol;

б) добавление хлороформа и центрифугирование в течение 10 минут при ≤12000×g при температуре 4°С;b) the addition of chloroform and centrifugation for 10 minutes at ≤12000 × g at a temperature of 4 ° C;

в) осаждение РНК из водной фазы, образующейся после центрифугирования, путем добавления изопропилового спирта и повторного центрифугирования в течение 10 минут при ≤12000×g при температуре 4°С.c) precipitation of RNA from the aqueous phase formed after centrifugation by adding isopropyl alcohol and centrifuging again for 10 minutes at ≤12000 × g at 4 ° C.

Далее осадок РНК после повторного центрифугирования промывают водным 75% этиловым спиртом, высушивают и растворяют в воде, очищенной от нуклеаз.Next, the RNA pellet after repeated centrifugation is washed with aqueous 75% ethanol, dried and dissolved in water purified from nucleases.

Концентрацию РНК определяют спектрофотометрически. Качество выделенной РНК проверяют электрофорезом в 1%-ной агарозе в присутствии бромистого этидия и спектрофотометрически («Nanodrop», США).The concentration of RNA is determined spectrophotometrically. The quality of the isolated RNA was checked by electrophoresis in 1% agarose in the presence of ethidium bromide and spectrophotometrically (Nanodrop, USA).

3) Реакция обратной транскрипции3) reverse transcription reaction

На матрице РНК, выделенной, как описано в пункте 2), синтезируют одноцепочечную кДНК. Для проведения реакции обратной транскрипции берут по 1 мкг РНК, полученной одним из двух вышеописанных методов с использованием наборов реагентов Trizol Reagent (Invitrogen) или реагентов RNeasy Mini Kit (Qiagen), предварительно обработанной не содержащей РНКаз ДНКазой I (Sigma-Aldrich), и инкубируют 5 мин при 70°С, затем помещают в лед.Single-stranded cDNA is synthesized on an RNA template isolated as described in paragraph 2). For the reverse transcription reaction, 1 μg of RNA obtained by one of the two methods described above using Trizol Reagent reagent kits (Invitrogen) or RNeasy Mini Kit reagents (Qiagen) pretreated with RNase-free DNase I (Sigma-Aldrich) is taken and incubated. 5 min at 70 ° C, then placed in ice.

На каждую пробу готовят 20 мкл смеси, содержащей:For each sample, 20 μl of a mixture containing:

5 м MgCl₂;5 m MgCl ₂ ;

1 × Буфер для обратной транскриптазы AMV, содержащий 250 мМ Tris-HCl (pH 8.3, 25°С), 250 мМ КСl, 50 мМ MgCl₂ 2,5 мМ спермидин и 50 мМ DTT (Promega);1 × AMV reverse transcriptase buffer containing 250 mM Tris-HCl (pH 8.3, 25 ° C), 250 mM KCl, 50 mM MgCl ₂ 2.5 mM spermidine and 50 mM DTT (Promega);

100 нг гексануклеотидных праймеров;100 ng hexanucleotide primers;

1 мМ dNTP (Evrogen);1 mM dNTP (Evrogen);

200 единиц обратной транскриптазы AMV (Promega).200 units of AMV reverse transcriptase (Promega).

К смеси добавляют РНК и воду до конечного объема 20 мкл и проводят реакцию при следующем температурном режиме: 25°С - 10 мин, 42°С - 60 мин, 70°С - 10 мин.RNA and water are added to the mixture to a final volume of 20 μl and the reaction is carried out at the following temperature conditions: 25 ° C for 10 minutes, 42 ° C for 60 minutes, 70 ° C for 10 minutes.

4) Подбор условий определения содержания мРНК гена NUSAP1 в образцах тканей мочевого пузыря4) Selection of conditions for determining the content of mRNA of the NUSAP1 gene in samples of bladder tissue

Для ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ используют одинаковые праймеры NUSAP1_F (SEQ ID NO:1) и NUSAP1_R (SEQ ID NO:2) при их молярном соотношении 1:1, специфичные для разных экзонов гена NUSAP1, причем один из праймеров перекрывает границу между экзонами. Размер ампликона - 232 п.н.For RT-PCR and PCR-PB, the same primers NUSAP1_F (SEQ ID NO: 1) and NUSAP1_R (SEQ ID NO: 2) are used with their molar ratio 1: 1, specific for different exons of the NUSAP1 gene, one of the primers overlapping the boundary between exons. Amplicon size - 232 bp

Последовательности выбранных праймеров для контрольного гена: SEQ ID NO 3-4, при их молярном соотношении 1:1, размер ампликона - 145 п.н.The sequence of the selected primers for the control gene: SEQ ID NO 3-4, with their molar ratio of 1: 1, the size of the amplicon is 145 bp

Для проведения ПЦР-РВ подбирают оптимальные концентрации праймеров исследуемого и контрольного генов (Фиг.2).For PCR-PB select the optimal concentration of primers of the studied and control genes (Figure 2).

5) Количественная оценка содержания мРНК гена NUSAP15) Quantification of the mRNA content of the NUSAP1 gene

Для количественных измерений используют прибор Stratagene MX3000P (США).For quantitative measurements using the device Stratagene MX3000P (USA).

Протокол определения содержания мРНК методом ПЦР-РВ с использованием набора «Комплект реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I» или «Комплект реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии EVA Green» (Синтол, Россия):Protocol for determining the mRNA content by PCR-RV using the kit “Set of reagents for PCR-RV in the presence of SYBR Green I” or “Set of reagents for PCR-RV in the presence of EVA Green” (Syntol, Russia):

1. Готовят реакционные смеси для генов NUSAP1 и АСТВ, осторожно смешав все компоненты реакции, кроме матрицы (кДНК), из расчета 1 реакция объемом 25 мкл для каждого образца +1 дополнительная реакция по 25 мкл.1. Prepare the reaction mixtures for the NUSAP1 and ASTV genes, carefully mixing all the components of the reaction, except the template (cDNA), at the rate of 1 reaction with a volume of 25 μl for each sample + 1 additional reaction of 25 μl.

Таблица 1Table 1 Состав реакционной смеси для тепа АСТВ:The composition of the reaction mixture for heat ASTV: РеагентReagent Концентрация исходных растворовThe concentration of stock solutions Объем в расчете на одну реакцию (мкл)Volume per reaction (μl) Конечные концентрации в реакцииThe final concentration in the reaction ПЦР Буфер БPCR Buffer B 10Х10X 2,52.5 1X1X dNTPsdNTPs 2,5 мМ2.5 mm 2,52.5 250 мкМ250 μM MgCl₂ MgCl ₂ 25 мМ25 mm 2,52.5 2,5 мМ2.5 mm Праймер ACTB_FPrimer ACTB_F 10 мкМ10 μM 1one 0,4 мкМ0.4 μM Праймер ACTB_RPrimer ACTB_R 10 мкМ10 μM 1one 0,4 мкМ0.4 μM Таq ДНК-полимеразаTaq DNA polymerase 5 ед./мкл5 units / μl 0,50.5 0,1 ед./мкл0.1 units / μl H₂OH ₂ O 13,213,2 кДНКcDNA 22 1one

Таблица 2table 2 Состав реакционной смеси для гена NUSAP1:The composition of the reaction mixture for the NUSAP1 gene: РеагентReagent Концентрация исходных растворовThe concentration of stock solutions Объем в расчете на одну реакцию (мкл)Volume per reaction (μl) Конечные концентрации в реакцииThe final concentration in the reaction ПЦР Буфер БPCR Buffer B 10Х10X 2,52.5 IXIX dNTPsdNTPs 2,5 мМ2.5 mm 2,52.5 250 мкМ250 μM MgCl₂ MgCl ₂ 25 мМ25 mm 2,52.5 2,5 мМ2.5 mm Праймер NUSAP1_FPrimer NUSAP1_F 10 мкМ10 μM 1one 0,4 мкМ0.4 μM Праймер NUSAP1_RPrimer NUSAP1_R 10 мкМ10 μM 1one 0,4 мкМ0.4 μM Taq ДHK-полимеразаTaq DNK polymerase 5 ед./мкл5 units / μl 0,50.5 0,1 ед./мкл0.1 units / μl H₂OH ₂ O 13,213,2 кДНКcDNA 22

2. В 0,2 мл пробирки, предназначенные для ПЦР-РВ, добавляют по 23 мкл приготовленных реакционных смесей без матрицы.2. In 0.2 ml tubes designed for PCR-PB, add 23 μl of the prepared reaction mixtures without a matrix.

3. Вносят по 2 мкл матрицы, плотно закрывают пробирки крышками.3. Pipette 2 μl of the matrix, tightly close the tubes with caps.

4. Помещают пробирки в приборное отделение, задают названия ячеек, температурный режим для 35 циклов: 95°С - 5 мин - денатурация и активация фермента, 95°С - 20 сек - денатурация, 60°С - 20 сек - отжиг зонда и полимеризация, 72°С - 30 сек - элонгация цепей.4. Place the tubes in the instrument compartment, set the cell names, temperature conditions for 35 cycles: 95 ° С - 5 min - denaturation and enzyme activation, 95 ° С - 20 sec - denaturation, 60 ° С - 20 sec - probe annealing and polymerization , 72 ° С - 30 sec - elongation of chains.

5. Реакции проводят в режиме относительных количественных измерений (программное обеспечение Stratagene MxPro, США).5. The reactions are carried out in the mode of relative quantitative measurements (software Stratagene MxPro, USA).

6. После завершения реакции амплификации сохраняют данные.6. After completion of the amplification reaction, data is saved.

7. Проводят анализ продуктов реакции с помощью гель-электрофореза в ТВЕ-буфере, содержащем 10 мг/л этидий бромида. Для этого отбирают 5 мкл продуктов амплификации (40 циклов), наносят образцы на 1.8% агарозный гель, содержащий 0.5 мг/л этидий бромида, и маркер молекулярных масс ДНК, позволяющий оценить размер продуктов амплификации (НПО «СибЭнзим»).7. The reaction products are analyzed by gel electrophoresis in TBE buffer containing 10 mg / l ethidium bromide. For this, 5 μl of amplification products (40 cycles) are taken, 1.8% agarose gel containing 0.5 mg / L ethidium bromide samples and a molecular weight marker for DNA are used to evaluate the size of the amplification products (SibEnzyme NPO).

6) Математическая обработка данных ПЦР-РВ6) Mathematical processing of PCR-RV data

Данные ПЦР-РВ переносят в виде текстового файла в Microsoft Excel и проводят математическую обработку данных. Относительное содержание мРНК гена NUSAP1-R_кДНК (далее R) в опухолевых и нормальных тканях мочевого пузыря нормируют относительно содержания мРНК гена АСТВ по формуле:PCR-RV data is transferred as a text file to Microsoft Excel and mathematical processing of the data is carried out. The relative content of mRNA of the NUSAP1-R _cDNA gene (hereinafter R) in tumor and normal tissues of the bladder is normalized relative to the content of mRNA of the ASTV gene according to the formula:

R-2^(Ct(ACTB)-Ct(NUSAP1)) где Ct - пороговый цикл.R-2 ^ (Ct (ACTB) -Ct (NUSAP1)) where Ct is the threshold cycle.

Интервал крайних значений R вычисляют с учетом рассчитанных отклонений Е для значений Ct:The range of extreme values of R is calculated taking into account the calculated deviations E for the Ct values:

Е=((Σ(x-x_ср)²)/(n-1))^1/2,E = ((Σ (xx _cp ) ² ) / (n-1)) ^1/2 ,

где х - значения, полученные в результате измерения (число 1, число 2…),where x is the values obtained as a result of the measurement (number 1, number 2 ...),

x_cp=Σx/n,x _cp = Σx / n,

n - размер выборки (число повторов реакции).n is the sample size (the number of repetitions of the reaction).

Достоверность наблюдаемых изменений оценивают исходя из нормального распределения данных. Данные считают достоверными при Р<0.05, где Р - показатель статистической значимости данных (Фиг.3).The reliability of the observed changes is estimated based on the normal distribution of data. Data is considered reliable at P <0.05, where P is an indicator of the statistical significance of the data (Figure 3).

7) Результаты7) Results

В результате, для всех исследованных образцов РМП (n=26) выявлено 5-76-кратное превышение уровня мРНК гена NUSAP1 относительно нормальных образцов ткани мочевого пузыря (n=47).As a result, for all the studied RMP samples (n = 26), a 5-76-fold excess of the NUSAP1 gene mRNA level was detected relative to normal bladder tissue samples (n = 47).

Пример 2. Определение уровня белка NUSAP1 в нормальных и раковых тканях мочевого пузыря методом иммуноферментного анализа.Example 2. Determination of the level of NUSAP1 protein in normal and cancerous tissues of the bladder by enzyme-linked immunosorbent assay.

1) Образцы тканей1) Tissue samples

Образцы тканей различных гистологических типов РМП (Т), морфологически нормальные ткани, прилегающие к опухолям (т.н. условные нормы (N), а также нормальные ткани мочевого пузыря (NB) от скоропостижно скончавшихся доноров собраны и охарактеризованы независимо двумя различными группами сотрудников ФГУ МНИОИ им. П.А.Герцена Росмедтехнологии и факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В.Ломоносова). Клинический диагноз установлен с учетом данных ретроспективного анализа первичной медицинской документации больных, цито- и гистологических исследований биоптатов, полученных при цистоскопии, а также образцов тканей мочевого пузыря, полученных после трансуретральной резекции и операционного материала. Образцы тканей мочевого пузыря (опухоль, условно-нормальная ткань) получены непосредственно после удаления опухоли. Каждый образец хранят в растворе RNALater Reagent (QIAGEN), стабилизирующем молекулы РНК, при температуре -70°С. Все опухолевые образцы охарактеризованы согласно международной системе клинико-морфологической классификации опухолей ТНМ, где Т (tumor) - Т0-Т4 - категории, отражающие увеличение размера и/или местного распространения первичной опухоли, N (nodules) - N0-N3 - категории, отражающие различную степень поражения метастазами регионарных лимфатических узлов; M (metastasis) - М0-М1 - характеризует отдаленные метастазы. Все возможные комбинации ТНМ объединяют в более крупные группы - стадии, отражающие течение опухолевого процесса.Tissue samples of various histological types of RMP (T), morphologically normal tissues adjacent to tumors (the so-called conditional norms (N), as well as normal bladder tissue (NB) from suddenly died donors were collected and characterized independently by two different groups of FSI employees MNIII named after P.A. Herzen of Rosmedtechnology and the faculty of fundamental medicine of Moscow State University named after M.V. Lomonosov). The clinical diagnosis was established taking into account data from a retrospective analysis of the primary medical documentation of patients, cytological and histological studies of biopsy specimens obtained by cystoscopy, as well as samples of bladder tissue obtained after transurethral resection and surgical material. Bladder tissue samples (tumor, conditionally normal tissue) were obtained immediately after removal of the tumor. Each sample was stored in an RNALater Reagent (QIAGEN) solution stabilizing RNA molecules at a temperature of -70 ° C. All tumor samples were characterized according to the international system of clinical and morphological classification of TNM tumors, where T (tumor) - T0-T4 - categories reflecting an increase in the size and / or local distribution of the primary tumor, N (nodules) - N0-N3 - categories reflecting different the degree of defeat by metastases of the regional lymph nodes; M (metastasis) - M0-M1 - characterizes distant metastases. All possible combinations of TNM are combined into larger groups - stages that reflect the course of the tumor process.

3) Выделение суммарного белка из образцов тканей мочевого пузыря.3) Isolation of total protein from tissue samples of the bladder.

Суммарный белок выделяют из замороженных образцов мочевого пузыря путем гомогенизации кусочков тканей, пунктатов или биоптатов в лизирующем буфере. Состав лизирующего буфера: 1XPBS (рН 7.6) буфер (1.7 mM КН₂РО₄ 5.2 mМ Na₂HPO₄, 150 mМ NaCl), 8 М мочевина. Для анализа содержания исследуемого белка в крови используют фракцию плазмы. Для анализа содержания исследуемого белка в моче используют цельную мочу.Total protein is isolated from frozen bladder samples by homogenizing pieces of tissue, punctate, or biopsy specimens in a lysis buffer. The composition of the lysis buffer: 1XPBS (pH 7.6) buffer (1.7 mM KH ₂ PO ₄ 5.2 mM Na ₂ HPO ₄ , 150 mM NaCl), 8 M urea. To analyze the content of the studied protein in the blood, a plasma fraction is used. Whole urine is used to analyze the protein content in the urine.

2) Для связывания антигенов (белка NUSAP1 или его фрагментов длиной свыше 8 аминокислот) с твердой фазой (носителем) проводится инкубация антигена с носителем в течение 14 часов при 4°С из расчета 100 мкл раствора антигена на ячейку в 96-луночном планшете.2) To bind antigens (NUSAP1 protein or its fragments with a length of more than 8 amino acids) to the solid phase (carrier), the antigen is incubated with the carrier for 14 hours at 4 ° C at the rate of 100 μl of antigen solution per cell in a 96-well plate.

3) Удаляют не связавшиеся антигены и промывают планшет 3 раза 1x PBS.3) Remove unbound antigens and wash the plate 3 times with 1x PBS.

4) Блокируют неспецифичное связывание добавлением 1% BSA (100 мкл/ячейка) в 1x PBS не менее 1 часа при 37°С.4) Block non-specific binding by adding 1% BSA (100 μl / well) in 1x PBS for at least 1 hour at 37 ° C.

5) Удаляют BSA и промывают 3 раза 1x PBS, содержащим 0,01% твин (полисорбат).5) BSA is removed and washed 3 times with 1x PBS containing 0.01% tween (polysorbate).

6) Добавляют анти-сыворотку, разведенную в 1x PBS (если нужно), и инкубируют 2 часа при 37°С.6) Add anti-serum diluted in 1x PBS (if necessary) and incubate for 2 hours at 37 ° C.

7) Промывают планшет 4 раза 1x PBS, содержащим 0,01% твин (полисорбат).7) Wash the plate 4 times with 1x PBS containing 0.01% tween (polysorbate).

8) Добавляют конъюгат пероксидазы (или другого фермента) (50 мкл/ячейка), разведенный 1:1000 в 1% BSA, и инкубируют 1 час при 37°С.8) A conjugate of peroxidase (or another enzyme) (50 μl / well) diluted 1: 1000 in 1% BSA is added and incubated for 1 hour at 37 ° C.

9) Промывают планшет 4 раза 1x PBS, содержащим 0,01% твин (полисорбат).9) Wash the plate 4 times with 1x PBS containing 0.01% tween (polysorbate).

10) Добавляют субстрат (100 мкл/ячейка).10) Add substrate (100 μl / well).

11) Инкубируют 1-5 мин в темноте. Регистрируют изменение окраски (изменяется на синюю при протекании реакции).11) Incubate 1-5 minutes in the dark. Record a color change (changes to blue during the course of the reaction).

12) Останавливают реакцию добавлением 25 мкл 0.1М Н₂SO₄/ячейка.12) Stop the reaction by adding 25 μl of 0.1 M H ₂ SO ₄ / well.

13) Анализируют результаты с помощью спектрофотометра при длине волны 450 нм (для тетраметилбензидинового субстрата - ТМБ).13) Analyze the results using a spectrophotometer at a wavelength of 450 nm (for tetramethylbenzidine substrate - TMB).

Состав используемых буферов:The composition of the buffers used:

1×PBS (Phosphate-Buffered Saline):1 × PBS (Phosphate-Buffered Saline):

NaCl 8 гNaCl 8 g

KCl 0.2 гKCl 0.2 g

Nа₂PO₄ (безводный) 1.15 гNa ₂ PO ₄ (anhydrous) 1.15 g

КН₂РO₄ (безводный) 0.2 гKH ₂ PO ₄ (anhydrous) 0.2 g

dd H₂O - до 100 мл.dd H ₂ O - up to 100 ml.

PBS для отмывки плашек:PBS for washing dies:

100 мл 1×РВS100 ml 1 × PBS

10 мкл Твин (до конечной концентрации 0.01%)10 μl of tween (to a final concentration of 0.01%)

Цитрат/ацетатный буфер (рН 6.0):Citrate / Acetate Buffer (pH 6.0):

1. 500 мл 0,1 М ацетата натрия (ацетат натрия - 4,1 г, dd Н₂O - до 500 мл)1. 500 ml of 0.1 M sodium acetate (sodium acetate - 4.1 g, dd H ₂ O - up to 500 ml)

2. 100 мл 0,1 М лимонной кислоты (лимонная кислота - 2,1 г, dd Н₂О - до 100 мл)2.100 ml of 0.1 M citric acid (citric acid - 2.1 g, dd H ₂ O - up to 100 ml)

Титровать раствор 1 раствором 2 до конечного рН 6.0. Хранить полученный буфер при -20°С.Titrate solution 1 with solution 2 to a final pH of 6.0. Store the resulting buffer at -20 ° C.

Раствор ТМБ - 10 мг/мл в DMSO (хранить при 4°С).A solution of TMB - 10 mg / ml in DMSO (store at 4 ° C).

Добавить 3 мкл H₂O₂ к 20 мл цитрат/ацетатного буфера. На каждые 5 мл буфера добавляется 50 мкл раствора ТМБ. При этом цвет раствора изменяется с бесцветного на синий.Add 3 μl of H ₂ O ₂ to 20 ml of citrate / acetate buffer. For every 5 ml of buffer, 50 μl of TMB solution is added. The color of the solution changes from colorless to blue.

7) Результаты7) Results

В результате, для всех исследованных опухолевых образцов (n=26) выявлено 6-55-кратное превышение уровня белка NUSAP1 относительно нормальных образцов ткани мочевого пузыря (n=47).As a result, for all studied tumor samples (n = 26), a 6-55-fold excess of the level of NUSAP1 protein was revealed relative to normal samples of bladder tissue (n = 47).

Пример 3. Определение концентрации мРНК гена NUSAP1 в моче и крови больных РМП и здоровых людей.Example 3. Determination of the concentration of mRNA of the NUSAP1 gene in the urine and blood of patients with RMP and healthy people.

1) Образцы мочи и крови1) Urine and blood samples

Образцы крови и мочи от пациентов с диагнозом РМП, а также от здоровых доноров собраны и охарактеризованы группой сотрудников ФГУ МНИОИ им. П.А.Герцена Росмедтехнологии. Клинический диагноз установлен с учетом данных ретроспективного анализа первичной медицинской документации больных, цито- и гистологических исследований биоптатов, полученных при цистоскопии, а также образцов тканей мочевого пузыря, полученных после трансуретральной резекции и операционного материала. Кровь смешивают с раствором антикоагулянта (например, цитратом натрия, ЭДТА и др.) в соотношении 9:1 (9 частей крови и 1 часть антикоагулянта), отделяют плазму от форменных элементов крови путем центрифугирования в течение 15 минут при 1500×g и сразу же смешивают с раствором, стабилизирующим молекулы РНК (RNAlater Reagent, QIAGEN). Полученный раствор хранят при температуре -20°С. Образцы мочи смешивают с раствором RNAlater Reagent, QIAGEN, замораживают и хранят при температуре -20°С.Blood and urine samples from patients diagnosed with RMP, as well as from healthy donors, were collected and characterized by a group of employees of FGU MNIII im. P.A. Herzen of the Russian Medical Technologies. The clinical diagnosis was established taking into account data from a retrospective analysis of the primary medical documentation of patients, cytological and histological studies of biopsy specimens obtained by cystoscopy, as well as samples of bladder tissue obtained after transurethral resection and surgical material. Blood is mixed with a solution of an anticoagulant (for example, sodium citrate, EDTA, etc.) in a ratio of 9: 1 (9 parts of blood and 1 part of an anticoagulant), the plasma is separated from blood cells by centrifugation for 15 minutes at 1500 × g and immediately mixed with a solution that stabilizes RNA molecules (RNAlater Reagent, QIAGEN). The resulting solution was stored at a temperature of -20 ° C. Urine samples are mixed with a solution of RNAlater Reagent, QIAGEN, frozen and stored at a temperature of -20 ° C.

Суммарную РНК выделяют из замороженных, хранящихся в растворе RNALater Reagent (QIAGEN) образцов мочи и крови, полученных от больных и здоровых доноров, с использованием TRIZOL Reagent (Invitrogen). Основные этапы включают:Total RNA was isolated from frozen, stored in a solution of RNALater Reagent (QIAGEN) urine and blood samples obtained from patients and healthy donors using TRIZOL Reagent (Invitrogen). The main steps include:

а) обработка крови и мочи лизирующим раствором, содержащим гуанидинизотиоцианат и фенол;a) treatment of blood and urine with a lysing solution containing guanidine isothiocyanate and phenol;

б) добавление хлороформа и центрифугирование в течение 10 минут при 12000×g при температуре 4°С;b) the addition of chloroform and centrifugation for 10 minutes at 12000 × g at a temperature of 4 ° C;

в) осаждение РНК из водной фазы, образующейся после центрифугирования, путем добавления изопропилового спирта и повторного центрифугирования в течение 10 минут при 12000×g при температуре 4°С.c) precipitation of RNA from the aqueous phase formed after centrifugation by adding isopropyl alcohol and centrifuging again for 10 minutes at 12000 × g at 4 ° C.

5 мM MgCl₂;5 mM MgCl ₂ ;

1×Буфер для обратной транскриптазы AMV, содержащий 250 мМ Tris-HCl (pH 8.3, 25°С), 250 мМ КСl, 50 мМ MgCl₂, 2,5 мМ спермидин и 50 мМ DTT (Promega);1 × AMV reverse transcriptase buffer containing 250 mM Tris-HCl (pH 8.3, 25 ° C), 250 mM KCl, 50 mM MgCl ₂ , 2.5 mM spermidine and 50 mM DTT (Promega);

1 мМ dNTP (Evrogen);1 mM dNTP (Evrogen);

К смеси добавляют РНК и воду до конечного объема 20 мкл и проводят реакцию при следующем температурном режиме: 25°С - 10 мин, 42°С - 60 мин, 70°С -10 мин.RNA and water are added to the mixture to a final volume of 20 μl and the reaction is carried out at the following temperature conditions: 25 ° C for 10 minutes, 42 ° C for 60 minutes, 70 ° C for 10 minutes.

4) Подбор условий определения содержания мРНК гена NUSAP14) Selection of conditions for determining the content of mRNA of the NUSAP1 gene

Для ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ используют одинаковые праймеры NUSAP1_F (SEQ ID NO: 1) и NUSAP1_R (SEQ ID NO: 2), специфичные для разных экзонов гена NUSAP1, при их молярном соотношении 1:1, причем один из праймеров перекрывает границу между экзонами. Размер ампликона - 232 п.н.For RT-PCR and PCR-PB, the same primers NUSAP1_F (SEQ ID NO: 1) and NUSAP1_R (SEQ ID NO: 2) are used, specific for different exons of the NUSAP1 gene, with their molar ratio 1: 1, one of the primers overlapping the border between exons. Amplicon size - 232 bp

Последовательности выбранных праймеров для контрольного гена: SEQ Ю NO 3-4, размер ампликона - 145 п.н.The sequence of the selected primers for the control gene: SEQ Yu NO 3-4, the size of the amplicon - 145 BP

Для проведения ПЦР-РВ подбирают оптимальные концентрации праймеров исследуемого и контрольного генов.For PCR-RV, optimal primer concentrations of the studied and control genes are selected.

Таблица 3Table 3 Состав реакционной смеси для гена АСТВ:The composition of the reaction mixture for the ASTV gene: РеагентReagent Концентрация исходных растворовThe concentration of stock solutions Объем в расчете на одну реакцию (мкл)Volume per reaction (μl) Конечные концентрации в реакцииThe final concentration in the reaction ПЦР Буфер БPCR Buffer B 10Х10X 2,52.5 1X1X dNTPsdNTPs 2,5 мМ2.5 mm 2,52.5 250 мкМ250 μM MgCl₂ MgCl ₂ 25 мМ25 mm 2,52.5 2,5 мМ2.5 mm Праймер ACTB_FPrimer ACTB_F 10 мкМ10 μM 1one 0,4 мкМ0.4 μM Праймер ACTB_RPrimer ACTB_R 10 мкМ10 μM 1one 0,4 мкМ0.4 μM Taq ДНК-полимеразаTaq DNA polymerase 5 ед./мкл5 units / μl 0,50.5 0,1 ед./мкл0.1 units / μl Н₂ОH ₂ O 13,213,2 кДНКcDNA 22

Таблица 4Table 4 Состав реакционной смеси для гена NUSAP1:The composition of the reaction mixture for the NUSAP1 gene: РеагентReagent Концентрация исходных растворовThe concentration of stock solutions Объем в расчете на одну реакцию (мкл)Volume per reaction (μl) Конечные концентрации в реакцииThe final concentration in the reaction ПЦР Буфер БPCR Buffer B 10Х10X 2,52.5 IXIX dNTPsdNTPs 2,5 мМ2.5 mm 2,52.5 250 мкМ250 μM MgCl₂ MgCl ₂ 25 мМ25 mm 2,52.5 2,5 мМ2.5 mm Праймер NUSAP1_FPrimer NUSAP1_F 10 мкМ10 μM 1one 0,4 мкМ0.4 μM Праймер NUSAP1_RPrimer NUSAP1_R 10 мкМ10 μM 1one 0,4 мкМ0.4 μM Taq ДНК-полимеразаTaq DNA polymerase 5 ед./мкл5 units / μl 0,50.5 0,1 ед./мкл0.1 units / μl H₂OH ₂ O 13,213,2 кДНКcDNA 22

R=2^Λ(Ct(ACTB)-Ct(NUSAP1)) где Ct - пороговый цикл.R = 2 ^Λ (Ct (ACTB) -Ct (NUSAP1)) where Ct is the threshold cycle.

Е=((Σ(х-х_ср)²)/(n-1))^1/2,E = ((Σ (x-x _avg ) ² ) / (n-1)) ^1/2 ,

x_cp=Σx/n,x _cp = Σx / n,

Достоверность наблюдаемых изменений оценивают исходя из нормального распределения данных. Данные считают достоверными при Р<0.05, где Р - показатель статистической значимости данных.The reliability of the observed changes is estimated based on the normal distribution of data. Data is considered reliable at P <0.05, where P is an indicator of the statistical significance of the data.

7) Результаты7) Results

В результате, для всех исследованных образцов мочи и крови, полученных от больных РМП (n=26), выявлено 9-70-кратное превышение концентрации мРНК гена NUSAP1 относительно образцов мочи и крови, полученных от здоровых доноров (n=65).As a result, for all the studied urine and blood samples obtained from patients with RMP (n = 26), a 9-70-fold excess of the NUSAP1 gene mRNA concentration relative to urine and blood samples obtained from healthy donors (n = 65) was revealed.

Пример 4. Определение уровня белка NUSAP1 в моче и крови больных РМП и здоровых людей методом иммуноферментного анализа.Example 4. Determination of the level of NUSAP1 protein in the urine and blood of patients with RMP and healthy people by enzyme-linked immunosorbent assay.

1) Образцы мочи и крови1) Urine and blood samples

Образцы крови и мочи от пациентов с диагнозом РМП, а также от здоровых доноров собраны и охарактеризованы группой сотрудников ФГУ МНИОИ им. П.А.Герцена Росмедтехнологии. Клинический диагноз установлен с учетом данных ретроспективного анализа первичной медицинской документации больных, цито- и гистологических исследований биоптатов, полученных при цистоскопии, а также образцов тканей мочевого пузыря, полученных после трансуретральной резекции и операционного материала. Кровь смешивают с раствором антикоагулянта (например, цитратом натрия, ЭДТА и др.) в соотношении 9:1 (9 частей крови и 1 часть антикоагулянта) и хранят при +4°С или отделяют плазму от форменных элементов крови путем центрифугирования в течение 15 минут при 1500×g и хранят при температуре -20°С. Образцы мочи замораживают и хранят при температуре -20°С.Blood and urine samples from patients diagnosed with RMP, as well as from healthy donors, were collected and characterized by a group of employees of FGU MNIII im. P.A. Herzen of the Russian Medical Technologies. The clinical diagnosis was established taking into account data from a retrospective analysis of the primary medical documentation of patients, cytological and histological studies of biopsy specimens obtained by cystoscopy, as well as samples of bladder tissue obtained after transurethral resection and surgical material. Blood is mixed with a solution of an anticoagulant (for example, sodium citrate, EDTA, etc.) in a ratio of 9: 1 (9 parts of blood and 1 part of an anticoagulant) and stored at + 4 ° C or the plasma is separated from blood cells by centrifugation for 15 minutes at 1500 × g and stored at a temperature of -20 ° C. Urine samples are frozen and stored at -20 ° C.

Для анализа содержания исследуемого белка в крови используют фракцию плазмы. Для анализа содержания исследуемого белка в моче используют цельную мочу.To analyze the content of the studied protein in the blood, a plasma fraction is used. Whole urine is used to analyze the protein content in the urine.

6) Добавляют анти-сыворотку, разведенную в 1x PBS (если нужно) и инкубируют 2 часа при 37°С.6) Add anti-serum diluted in 1x PBS (if necessary) and incubate for 2 hours at 37 ° C.

11) Инкубируют 5 мин в темноте. Регистрируют изменение окраски (изменяется на синюю при протекании реакции).11) Incubate for 5 minutes in the dark. Record a color change (changes to blue during the course of the reaction).

12) Останавливают реакцию добавлением 25 мкл 0.1М H₂SO₄/ячейка.12) Stop the reaction by adding 25 μl of 0.1 M H ₂ SO ₄ / well.

1×PBS (Phosphate-Buffered Saline):1 × PBS (Phosphate-Buffered Saline):

NaCl 8 гNaCl 8 g

KCl 0.2 гKCl 0.2 g

Na₂PO₄ (безводный) 1.15 гNa ₂ PO ₄ (anhydrous) 1.15 g

KH₂РO₄ (безводный) 0.2 гKH ₂ PO ₄ (anhydrous) 0.2 g

dd H₂O - до 100 мл.dd H ₂ O - up to 100 ml.

PBS для отмывки плашек:PBS for washing dies:

100 мл 1×PBS100 ml 1 × PBS

1. 500 мл 0,1 М ацетата натрия (ацетат натрия - 4,1 г, dd H₂O - до 500 мл)1.500 ml of 0.1 M sodium acetate (sodium acetate - 4.1 g, dd H ₂ O - up to 500 ml)

2.100 мл 0,1 М лимонной кислоты (лимонная кислота - 2,1 г, dd H₂O - до 100 мл)2.100 ml 0.1 M citric acid (citric acid - 2.1 g, dd H ₂ O - up to 100 ml)

Добавить 3 мкл Н₂О₂ к 20 мл цитрат/ацетатного буфера. На каждые 5 мл буфера добавляется 50 мкл раствора ТМБ. При этом цвет раствора изменяется с бесцветного на синий.Add 3 μl of H ₂ O ₂ to 20 ml of citrate / acetate buffer. For every 5 ml of buffer, 50 μl of TMB solution is added. The color of the solution changes from colorless to blue.

Результаты.Results.

В результате, для всех исследованных образцов мочи и крови, полученных от больных РМП (n=26), выявлено 7-43-кратное превышение уровня белка NUSAP1 относительно образцов мочи и крови, полученных от здоровых доноров (n=65).As a result, for all studied urine and blood samples obtained from patients with RMP (n = 26), a 7-43-fold excess of the NUSAP1 protein level was revealed relative to urine and blood samples obtained from healthy donors (n = 65).

Пример 5.Example 5

Оценка эффективности проведенной терапии РМП по изменению уровня экспрессии гена NUSAP1 и/или белка NUSAP1 в моче и/или крови обследуемых пациентов.Evaluation of the effectiveness of the treatment of RMP by changing the expression level of the NUSAP1 gene and / or NUSAP1 protein in the urine and / or blood of the examined patients.

Оценка эффективности проведенной терапии РМП проводится путем анализа содержания белка NUSAP1 и/или уровня экспрессии гена NUSAP1 в моче и/или крови больных РМП до начала лечения и после проведенной терапии способами, указанными в примерах 3 и 4. В результате, для всех обследованных пациентов (n=12) с установленным диагнозом РМП выявлено снижение уровня экспрессии гена NUSAP1 и уровня белка NUSAP1 в моче и крови в 1.5-5 раз после проведенной терапии по сравнению с исходным уровнем экспрессии данного гена или уровнем белка в моче и крови, выявленными до начала лечения. Это указывает на возможность использования настоящего изобретения при мониторинге эффективности проводимой противораковой терапии, причем анализ способами настоящего изобретения следует проводить до начала и после окончания курса лечения, а также при необходимости по ходу курса лечения. Снижение содержания мРНК гена NUSAP1 и/или белка NUSAP1 по ходу или по завершении курса лечения может свидетельствовать о положительных сдвигах при лечении. Дальнейшее повышение содержания мРНК гена NUSAP1 и/или белка NUSAP1 указывает на низкую эффективность лечения.Evaluation of the effectiveness of the treatment of RMP is carried out by analyzing the NUSAP1 protein content and / or the expression level of the NUSAP1 gene in the urine and / or blood of RMP patients before treatment and after treatment by the methods described in examples 3 and 4. As a result, for all examined patients ( n = 12) with the diagnosis of RMP, a decrease in the level of NUSAP1 gene expression and the level of NUSAP1 protein in the urine and blood was found to be 1.5-5 times after the treatment as compared with the initial level of expression of this gene or the level of protein in the urine and blood detected before and treatment. This indicates the possibility of using the present invention in monitoring the effectiveness of anti-cancer therapy, and analysis by the methods of the present invention should be carried out before and after the course of treatment, and also, if necessary, during the course of treatment. A decrease in the NUSAP1 gene mRNA and / or NUSAP1 protein during or at the end of the course of treatment may indicate positive changes in treatment. A further increase in the mRNA content of the NUSAP1 gene and / or the NUSAP1 protein indicates a low treatment efficiency.

Claims

Способ оценки эффективности терапии рака мочевого пузыря методом иммуноферментного анализа, включающий получение образцов мочи и крови от пациента, выделение смеси белковых компонентов мочи и крови, проведение реакции иммуноферментного анализа с моноклональными и/или поликлональными антителами и/или их фрагментами против рекомбинантного белка NUSAP1 и/или его уникальных фрагментов длиной свыше 8 аминокислот и определение содержания белка NUSAP1 в исследуемых образцах, причем снижение уровня белка NUSAP1 в моче и крови в 1,5-5 раз после проведенной терапии по сравнению с исходным уровнем данного белка в моче и крови, выявленным до начала лечения, является показателем эффективности терапии рака мочевого пузыря. A method for evaluating the effectiveness of treatment of bladder cancer with an enzyme immunoassay, including obtaining urine and blood samples from a patient, isolating a mixture of protein components of urine and blood, conducting an enzyme immunoassay reaction with monoclonal and / or polyclonal antibodies and / or fragments thereof against recombinant protein NUSAP1 and / or its unique fragments with a length of over 8 amino acids and determination of the NUSAP1 protein content in the studied samples, with a decrease in the level of NUSAP1 protein in urine and blood by 1.5-5 times after oh therapy compared with the initial level of the protein in the urine and blood, diagnosed before treatment, it is indicative of the efficacy of therapy for bladder cancer.