RU2467761C2 - Лечение нейродегенеративных расстройств - Google Patents

Лечение нейродегенеративных расстройств Download PDF

Info

Publication number
RU2467761C2
RU2467761C2 RU2008116309/15A RU2008116309A RU2467761C2 RU 2467761 C2 RU2467761 C2 RU 2467761C2 RU 2008116309/15 A RU2008116309/15 A RU 2008116309/15A RU 2008116309 A RU2008116309 A RU 2008116309A RU 2467761 C2 RU2467761 C2 RU 2467761C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
molecule
erythropoietin
erythropoietic
brain
epo
Prior art date
Application number
RU2008116309/15A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2008116309A (ru
Inventor
Антон ХАЗЕЛЬБЕК
Франк ХЕРТИНГ
Йерг ХУВИЛЕР
Михаэль ЯРШ
Original Assignee
Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=37622051&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU2467761(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг filed Critical Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг
Publication of RU2008116309A publication Critical patent/RU2008116309A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2467761C2 publication Critical patent/RU2467761C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1816—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицине и касается применения эритропоэтической молекулы для получения лекарственного средства для лечения нейродегенеративных расстройств головного и спинного мозга введением эффективного количества лекарственного средства в кровяное русло пациента, нуждающегося в таком лечении, в котором эритропоэтическая молекула включает часть молекулы эритропоэтина, имеющую по меньшей мере одну свободную аминогруппу, выбранную из группы, включающей эритропоэтин человека и его аналоги, которые имеют последовательность эритропоэтина человека, модифицированную добавлением 1-6 сайтов гликозилирования или реаранжировкой по меньшей мере одного сайта гликозилирования; указанная часть молекулы эритропоэтина ковалентно связана с «n» группами полиэтиленгликоля формулы -CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR с -СО каждой группы полиэтилена, формирующей амидную связь с одной из указанных аминогрупп. Изобретение обеспечивает проникновение эритропоэтической молекулы через барьер между кровью и мозгом, хороший период полураспада, что позволяет вводить молекулу в более низкой начальной дозе. 4 н. и 15 з.п. ф-лы, 3 пр., 3 ил., 1 табл.

Description

Изобретение относится к способу лечения нейродегенеративных расстройств головного и спинного мозга, используя новый агент на основе эритропоэтина (НАЭ).
Биодоступность коммерческих белковых терапевтических средств, например эритропоэтина человека (ЭПО), ограничена их коротким периодом полураспада в плазме и чувствительностью к разрушению протеазами. Эти недостатки мешают их широкому клиническому применению. Новые агенты на основе эритропоэтина были разработаны путем химической модификации ЭПО и его аналогов. Эти новые агенты обеспечивают мощное и пролонгированное эритропоэтиновое действие, способствуя оптимальному лечению анемии у пациентов с болезнью почек и СПИДом, а также у онкологических больных, проходящих курс химиотерапии.
Настоящее изобретение относится к способу лечения нейродегенеративных расстройств головного и спинного мозга путем введения пациенту, нуждающемуся в такой терапии, терапевтически эффективного количества нового агента на основе эритропоэтина (НАЭ), который является химически модифицированным эритропоэтином человека или химически модифицированным аналогом эритропоэтина человека, включающим ковалентно интегрированные группы полиэтиленгликоля определенной молекулярной массы и линкерной структуры.
Описание фигур
Фиг.1 показывает концентрацию ЭПО и НАЭ настоящего изобретения в сыворотке крыс через 2 и 6 ч после инъекции.
Фиг.2 показывает концентрацию ЭПО и НАЭ настоящего изобретения в ликворе крыс через 2 и 6 ч после инъекции.
Фиг.3 показывает концентрацию ЭПО и НАЭ настоящего изобретения в ликворе и сыворотке крыс через 2 и 6 ч после инъекции.
Конкретно НАЭ, используемые в настоящем изобретении, являются молекулами химически модифицированного эритропоэтина, включающего предпочтительно по меньшей мере одну свободную аминную группу и включающего часть молекулы эритропоэтина, выбранного из группы, состоящей из эритропоэтина человека и его аналогов, у которых последовательность представляет последовательность эритропоэтина человека, модифицированную введением 1-6 сайтов гликозилирования или реаранжировкой по меньшей мере одного сайта гликозилирования; указанная часть эритропоэтина ковалентно связана с «n» группами полиэтиленгликоля формулы -СО-(CH2)х-(ОCH2CH2)m-OR с -СО (т.е. карбонилом) каждой группы полиэтиленгликоля, формируя амидную связь с одной из указанных аминогрупп; в которой R является низким алкилом; x обозначает 2 или 3; m обозначает число примерно от 450 до примерно 900; n обозначает число 1, 2 или 3, причем n и m выбраны таким образом, что молекулярная масса образуемого НАЭ, за вычетом молекулярной массой немодифицированной части молекулы эритропоэтина, составляет примерно от 20 кДа до примерно 100 кДа. Такие НАЭ описаны, например, в патенте US 6583272, соответствующая часть которого включена в настоящее изобретение в виде ссылки.
Новые агенты на основе эритропоэтина (НАЭ), используемые в настоящем изобретении, биохимически и функционально отличны от ЭПО. Полученные in vivo и in vitro данные свидетельствуют, что эти НАЭ проявляют существенно заниженное связывающее сродство с рецептором ЭПО и по сравнению с ЭПО диссоциируют быстрее. По сравнению с эритропоэтином человека (ЭПОч) такие НАЭ проявляют иные полезные клинические свойства, в том числе повышенный полупериод циркуляции в крови и повышенное время пребывания в плазме, пониженный клиренс и повышенное клиническое действие in vivo.
Некоторые из указанных выше наблюдений, связанных с отличительными свойствами НАЭ настоящего изобретения, возможно, могут быть объяснены новым механизмом действия. Быстрая диссоциация с рецептора эритропоэтина («ЭПО-Р») наряду с повышенным периодом полураспада в сыворотке могут привести к повышенному и устойчивому действию эритропоэтипа за счет множественных взаимодействий с рецептором. Исходя из стереохимии, такие множественные взаимодействия могут быть достаточными для индукции каскада сигналов ЭПО-Р, но они недостаточно плотные, чтобы вызвать такое прочное связывание, которое приведет к тому, что комплекс рецептор/молекула интернализируется и разрушается. Статистически только определенный процент молекул может проявлять такое прочное связывание. В итоге такой механизм действия может привести к тому, что одна молекула будет активировать более одного рецептора до своего разрушения.
Важно, что полезные свойства таких НАЭ позволяют снизить частоту введения и обеспечить более стабильный контроль над содержанием гемоглобина, позволяя оптимально лечить анемию у пациентов с болезнью почек, СПИДом или у онкологических больных во время химиотерапии. Предполагается, что такие полезные свойства приводят к лучшему исходу лечения и улучшенному качеству жизни пациентов.
Природный эритропоэтин человека (ЭПОч) вырабатывается в разных тканях организма (например, в почках, головном мозге и др.) и является гуморальным фактором плазмы, который в частности стимулирует выработку эритроцитов (Carnot P., Deflandre С., C.R. Acad. Sci. 143, 1906, с.432, Erslev A.J., Blood 8, 1953, с.349, Reissmann K.R., Blood 5, 1950, с.372, Jacobson L.O., Goldwasser E., Freid W., Pizak L.F., Nature 179, 1957, cc.6331-6334). Природный эритропоэтин стимулирует деление и дифференциацию предшественников эритроцитов в костном мозге и проявляет биологическую активность в виде связывания с рецепторами предшественников эритроцитов (Krantz B.S., Blood 77, 1991, с.419).
Ранее предполагали, что помимо применения ЭПО для лечения анемии эта молекула может применяться в связи с ее нейро- и миокардиальным защитным действием. См. обзор W. Jelkmann, K. Wagner, Ann. Hematol 83, 2004, cc.673-686.
Настоящее изобретение предусматривает применение НАЭ настоящего изобретения для лечения нейродегенеративных расстройств головного и спинного мозга путем введения НАЭ в кровяное русло. Настоящее изобретение основывается на том наблюдении, что, несмотря на относительно крупный размер, НАЭ настоящего изобретения могут преодолевать барьер между кровью и мозгом, выступая в качестве нейропротекторных агентов для нейронов головного и спинного мозга. Напротив, описанные ранее клинические свойства, которые такие НАЭ проявляют при других назначениях, также предположительно обеспечивают значительное терапевтическое преимущество при лечении нейродегенеративных расстройств по сравнению с лечением ЭПО.
Эритропоэтин получают путем биосинтеза, используя методику рекомбинантной ДНК (Egrie J.C., Strickland T.W., Lane J. и др., Immunobiol., 1986, 72, cc.213-224), и он является продуктом клонированного гена ЭПО человека, инсертированного в клетки ткани яичников китайского хомячка (клетках СНО) и экспрессирующегося в них. Первичная структура преобладающей полностью процессированной формы ЭПОч представлена последовательностью SEQ ID NO: 1. Имеется два дисульфидных мостика, расположенных между Cys7-Cys161 и Cys29-Cys33. Молекулярная масса цепи полипептида ЭПО без сахаров составляет 18236 Да. В интактной молекуле ЭПО примерно 40% молекулярной массы приходится на углеводные группы, которые гликозилируют белок по имеющимся у него сайтам гликозилирования (Sasaki Н., Bothner В., Dell A., Fukuda М., J. Biol. Chem. 262, 1987, с.12059).
Понятие «Эритропоэтин» или «ЭПО» относится к гликозилированному белку с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 2, или аминокислотной последовательностью, существенным образом гомологичной им, биологические свойства которых могут быть связаны со стимуляцией выработки эритроцитов и стимуляцией деления и дифференциации предшественников эритроцитов в костном мозге. Кроме того, понятие «эритропоэтин» относится к гликозилированному белку, проявляющему по меньшей мере одно из биологических свойств или связывающее сродство, известные в данной области техники. Таким образом, молекулы проявляют только ингибирующие нейрозащитные эффекты. В контексте настоящего изобретения к таким понятиям относятся белки, которые модифицированы целенаправленно, например, сайт-направленным мутагенезом или в результате случайных мутаций. К этим понятиям также относятся аналоги, имеющие 1-6 дополнительных сайтов для гликозилирования, аналоги, имеющие по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту с С-конца гликопротеина, причем дополнительная аминокислота включает по меньшей мере один сайт гликозилирования, и аналоги с аминокислотной последовательностью, включающей перегруппировку по меньшей мере одного сайта для гликозилирования. К этим понятиям относятся и природный, и рекомбинантный эритропоэтин человека.
ЭПО связывается со специфическими трансмембранными рецепторами (ЭПО-Р). Функциональный ЭПО-Р человека является представителем надсемейства рецептора цитокина класса I и присутствует в виде гомодимера двух идентичных цепей гликопротеина из 484 аминокислот. Каждая цепь включает внеклеточный домен, гидрофобную трансмембранную последовательность и цитоплазматический домен, к которому присоединяется протеинтирозинкиназа JAK2. Немодифицированный ЭПО связывается с субъединицами рецептора, в соответствии с чем константы диссоциации двух сайтов связывания существенно отличаются. Связывание ЭПО с рецептором приводит к конформационному изменению и тесному соединению двух субъединиц ЭПО-Р, которое приводит к аутофосфорилированию двух молекул JAK и затем к комплексному сигнальному каскаду. Установлено, что ЭПО-индуцированный сигнальный метаболический путь возвращается примерно к исходным уровням через 30-60 мин после стимулирования. Действие ЭПО прекращается действием гемопоэтической клеточной фосфатазой (ГКФ), вызывающей интернализацию и разрушение комплекса ЭПО/ЭПО-Р.
Ранее было установлено, что ЭПО является в большей степени выраженным плейотропным фактором выживания, чем предполагалось ранее. Вероятно, ЭПО проявляет нейротрофическую и нейропротекторную (Cerami А. и др., Nephrol. Dial. Transplant. 17, 2002, cc.8-12, Chong Z.Z. и др. Curr. Drug Targets Cardiovasc. Haematol. Disord. 3, 2003, cc.141-154, Jumbe N.L. Oncology 16, 2002, cc.91-107, Marti H.H. и др. News Physiol. Sci. 15, 2000, cc.225-229), сосудистую (Masuda S. и др. Int. J. Hematol. 70, 1999, cc.1-6, Smith K.J. и др. Cardiovasc. Res. 59, 2003, cc.538-548) и кардиопротекторную функции (Smith K.J. и др. Cardiovasc. Res. 59, 2003, cc.538-548, Parsa C.J. и др. J. Clin. Invest. 112, 2003, cc.999-1007). Установлено, что ЭПО-Р находятся в разных областях мозга грызунов и других млекопитающих (Digicaylioglu М. и др. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1995, cc.3717-3720, Li Y. и др. Pediatr. Res. 40, 1996, cc.376-380, Marti H.H. и др. Eur. J. Neurosci. 8, 1996, cc.666-676). Сайты связывания ЭПО преимущественно локализованы в гиппокампе, capsula interna, коре и среднем мозге мышей (Digicaylioglu М. и др. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1995, cc.3717-3720). Кроме того, установлено, что ЭПО стимулирует пролиферацию и дифференциацию нейронного ствола и клеток-предшественниц (Shingo Т. и др. J. Neurosci. 21, 2001, cc.9733-9743, Studer L. и др. J. Neurosci. 20, 2000, cc.7377-7383).
Нейрозащитное действие ЭПО может быть прослежено по метаболическому пути первоочередного значения PI-3K/Akt нейропротекторного действия ЭПО за счет поддержания мембранного потенциала митохондрий в бескислородных культурах первичных нейрональных клеток гиппокампа (Chong Z.Z. и др. Circulation 106, 2003, cc.2973-2979). Дестабилизация потенциала мембраны митохондрий приводит к высвобождению цитохрома С, который активирует каспазы 8, 1 и 3, индуцирующие фрагментацию ДНК.
Нейропротекторное действие ЭПО в мозге впервые было установлено in vivo группой Sasaki в 1998 году (Sadamoto Y. и др., Biochem. Biophys. Res. Commun. 253, 1998, cc.26-32, Sakanak М. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1998, cc.4635-4640) на монгольских песчанках. Установлено, что инфузия ЭПО в боковые желудочки предупреждает индуцируемое ишемией нарушение обучения и спасает нейроны СА1 гиппокампа от гибели. Сходные эксперименты на крысах показали индуцированное ишемией снижение способности к ориентации на месте, инфаркт коры и дегенерацию таламуса (Sadamoto Y. и др. Biochem. Biophys. Res. Commun. 253, 1998, cc.26-32). Кроме того, известный защитный эффект гипоксической предобработки существенно снижен у мышей, если передача сигнала ЭПО локально блокируется инфузией растворимого ЭПО-Р в желудочек мозга (Prass K. и др. Stroke 34, 2003, cc.1981-1986).
Ранее предполагалось, что вводимый системно ЭПО не может проникнуть в головной мозг из-за гематоэнцефалического барьера (Junk. А.K. и др., Proc. Natl. Acad. Sci USA 99, 2002, cc.10659-10664, Juul S.E. и др., Pediatr. Res., 46, 1999, cc.543-547). Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) отделяет мозг и спинномозговую жидкость (СМЖ, ликвор) от крови и регулирует обмен веществ между кровью и мозгом. В контексте настоящего изобретения понятие «ГЭБ» включает и барьер между мозгом и кровью, и барьер между кровью и СМЖ. В основном это относится к капиллярам мозга, кубическому эпителию сосудистого сплетения и оболочке головного мозга. Все участки ГЭБ характеризуются наличием плотного контакта между соседними клетками, отсутствием эндотелиальных пор и малочисленностью пинноцитозных пузырьков. Кроме того, капилляры мозга содержат в несколько раз большее количество эндотелиальных митохондрий по сравнению с капиллярами других частей тела. Клетки, обусловливающие эффективное функционирование ГЭБ, представляют непрерывный слой клеток, допускающих обмен растворенными соединениями только за счет межклеточного пути. Например, жирорастворимые растворы легко преодолевают ГЭБ, хотя электролиты, нерастворимые в жирах неэлектролиты и белки проникают в мозг из крови медленнее, чем они входят в ткани, отличные от нервной ткани. Эта барьерная функция способствует защите мозга от вредных веществ.
Существует четыре основных механизма, с помощью которых растворимые молекулы движутся сквозь мембраны. (1) Простая диффузия, (2) облегченная диффузия, (3) простая диффузия через водный канал и (4) активный транспорт посредством белкового носителя. Трансклеточная диффузия отсутствует в какой-либо значительной степени в ГЭБ из-за тесного контакта. В случае трансклеточной диффузии основной принцип заключается в том, что чем выше липофильность вещества, тем существеннее диффузия в мозг. Глюкоза, спирт и другие низкомолекулярные вещества непосредственно поступают в мозг за счет диффузии. Для большинства белков обычно требуется активный транспорт.
Гематоэнцефалический барьер может быть «открыт» определенными растворами, например, внутриартериальной инъекцией гипертонического раствора маннита. Предполагают, что маннит открывает гематоэнцефалический барьер за счет осмоса в результате сжатия эндотелиальных клеток.
СМЖ находится в желудочках головного мозга, спинномозговом канале и подпаутинном пространстве. СМЖ в основном образуется в сосудистых сплетениях боковых, третьего и четвертого желудочков головного мозга, и ее объем варьирует в пределах 10-20% от массы мозга. Объем СМЖ у людей составляет 140-150 мл и обновляется за 5 ч (у крыс за 1 ч). СМЖ движется в желудочках мозга и подпаутинном пространстве под давлением гидростатического давления, индуцируемого при выработке СМЖ. СМЖ создает внутреннюю опору для мозга, регулирует внеклеточную жидкость в мозге, осуществляет распределение нейроактивных веществ и является сливом, в котором собираются продукты обмена, вырабатываемые мозгом.
В работе Jumbe (Jumbe N.L., Oncology 16, 2002, cc.91-107) установлено, что соотношение концентраций в СМЖ и в сыворотке у крыс, которым ввели внутривенно рекомбинантный ЭПО человека (500 Ед./кг), составляет примерно 1×10-3. Близкие результаты получены при введении дарбепоэтина в количестве 25 мкг/кг. Рассчитанная средняя величина области под кривой зависимости концентрации от времени (AUC0-8) анализом без разделения составила 340 мЕд. ч/мл для рекомбинантного ЭПО человека (рЭПОч) и 3,6 нг ч/мл для дарбепоэтина альфа в спинномозговой жидкости против 370000 мЕд. ч/мл и 4500 нг ч/мл в сыворотке, соответственно.
В экспериментах с инфарктом установлено, что системное введение высоких доз рЭПОч подопытным животным снизило область инфаркта через 24 ч после закупорки мозговой артерии (Siren A.L. и др., Proc. Natl. Acad. Sci USA 98, 2001, cc.4044-4049), понизило смертность (Buemi М. и др., Eur. J. Pharmacol. 392, 2001, cc.31-34), предупредило нейрональное разрушение (Alafaci С. и др., Eur. J. Pharmacol. 406, 2000, cc.219-225), усилило мозговое кровообращение (Grasso G., J. Neurosurg. Sci. 45, 2001, cc.7-14) и понизило нейрологический дефицит (Grasso G. и др., J. Neurosurg. 96, 2002, cc.565-570). ЭПО также предупреждает апоптоз двигательных нейронов и нейрологическую беспомощность (Cerami А. и др., Nephrol. Dial. Transplant 17, 2002, cc.8-12), улучшает восстановление двигательной функции (Gorio А. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 2002, cc.9450-9455) и снижает воспалительную реакцию при гипоксии мозга (Villa Р. и др., J. Exp. Med. 198, 2003, cc.971-975).
Кроме того, в настоящее время рассматривается применение эритропоэтина при множественном склерозе (МС). МС является воспалительным заболеванием центральной нервной системы (ЦНС), которая состоит из головного и спинного мозга. У пациентов с рассеянным склерозом очаги разрушений, называемые бляшками или поражениями, по-видимому, появляются в случайных местах в белом веществе ЦНС. В области повреждения материал, изолирующий нерв (миелин), исчезает, предположительно во время аутоиммунного воспаления. Миелиновая оболочка сходит с аксонов в ходе процесса демиелинизации. Миелиновая оболочка формируется в ЦНС в определенных участках олигодендроцитов. До сих пор неизвестна причина возникновения рассеянного склероза (PC). Выдвигались различные теории, например аутоиммунная, связанная с патогенами, с генетическими компонентами, собственными биохимическими изменениями, разрушением гематоэнцефалического барьера, диетой или недостаточностью витаминов, аллергической реакцией и др. Кроме того, обсуждается, что воспаление также вредоносно для мембран аксонов. В связи с этим до сих пор не существует радикального лечения PC. Однако может быть использован ряд лекарственных средств для симптоматического лечения заболевания. Например, могут вводиться кортикостероиды, ряд иммунносупрессантов и интерферон бета.
Diem и др., Brain, 128, 2005, cc.375-85, описали комбинированное лечение стероидами с применением ЭПО для локального воспаления, а также для лечения нейродегенеративных расстройств. Например, метилпреднизолон и эритропоэтин успешно применяют в виде комбинированной терапии на модели PC.
Выполненные Ehrenreich и др. эксперименты на людях (Ehrenreich H. и др., Mol. Med. 8, 2002, cc.495-505) с диагнозом удар показали, что имеется жесткая тенденция к снижению размера инфаркта у пациентов, которых лечили рЭПОч, связанная с выраженным неврологическим восстановлением и клиническим исходом через 1 месяц после удара. Пациенты получали внутривенно рЭПОч (3,3×104 Ед.) один раз в сутки в первые дни после удара. Средняя концентрация ЭПО в спинномозговой жидкости пациентов повышается до 17 Ед./л (в норме величина примерно составляет 1 Ед./л). Уровни в сыворотке пациентов приближаются к 5000 Ед./л через 3 ч после инфузии (нормальный уровень в сыворотке примерно составляет 15 Ед./л). Кроме того, ЭПО может успешно применяться для снижения реперфузионных повреждений в области, охватывающей место острого удара.
Известно, что ЭПО и ЭПО-Р, экспрессируемые в ткани мозга людей и грызунов (Siren A.L. и др., Acta Neuropathologica 101, 2001, cc.271-276), индуцируются гипоксией (Jelkmann W., din. Investig. 72, 1994, cc.3-10) и проявляют выраженный нейропротекторный потенциал (Bernaudin M. и др., J. Cereb. Blood Flow Metab. 19, 1999, cc.643-651, Gene S. и др., Neurosci. Lett. 298, 2001, cc.139-141). Сообщалось, что в мозге взрослых людей имеется только слабая экспрессия ЭПО и его рецептора в нейронах и астроцитах (Siren A.L. и др., Acta Neuropathologica 101, 2001, cc.271-276). В любом случае, в головном мозге людей после ишемии или гипоксии установлено, что ЭПО содержится в ткани сосудов и в воспаленных клетках, ЭПО-Р - в кровеносных сосудах, и нейрональные и астроцитные процессы - в зоне инфаркта или около зоны инфаркта. При ишемическом инфаркте ЭПО и ЭПО-Р преобладают в реактивной нейроглие. Общий эффект стимуляции ЭПО-Р в клетке-мишени сводится к пролиферации, подавлению апоптоза и, в случае эритробластов, к дифференциации.
Предполагалось, что ГЭБ эффективно сдерживает крупные гликозилированные молекулы, например ЭПО. Хотя согласно классической точке зрения ГЭБ непроницаем для крупных молекул, в исследованиях установлено, что некоторые крупные молекулы могут специфически транспортироваться в мозг через капиллярный эндотелий и влиять на функцию мозга. Это происходит через связывание с рецепторами, присутствующими на поверхностях эндотелиальных клеток в просвете сосудов. В результате инициируется эндоцитоз с последующей транслокацией через ГЭБ. Поскольку ЭПО-Р экспрессируется на капиллярах мозга, предполагалось, что транспорт ЭПО через ГЭБ действует через рецепторы.
Примечательно, что концентрации ЭПО в сыворотке, необходимые для защиты ткани, выше концентраций, требуемых для эритропоэза. Одной из причин этого является то, что рецептор для защиты ткани проявляет пониженное сродство (примерно в 1000 раз) по сравнению с предшественниками эритроцитов (Masuda S. и др., J. Biol. Chem. 268, 1993, cc.11208-11216). Другой причиной может быть ГЭБ. Предклинические данные свидетельствуют, что минимальный терапевтический уровень ЭПО, необходимый для защиты от разрушения ткани, находится в диапазоне 300-500 мл Ед./кг массы тела. Единицы ЭПО выражают количество ЭПО, вызывающее такую же эритропоэтическую реакцию у крыс, что и 15 мкмолей CoCl2 (кобальта хлорида). Вкратце, таким образом, установлено, что ЭПО обладает нейропротекторным действием на нейроны головного и спинного мозга. Однако предполагаемое использование ЭПО для такого лечения ограничено потребностью в весьма высоких терапевтических уровнях, которые требуются для достижения такого эффекта. Новый эритропоэз-стимулирующий фактор (ЭСФ), обладающий улучшенным периодом полураспада и преодолевающий ГЭБ, может быть предпочтительным, особенно если такой ЭСФ может быть введен в относительно низкой начальной концентрации в кровяное русло для того, чтобы избежать нежелательных побочных эффектов.
Проблемы в данной области решаются применением НАЭ настоящего изобретения, включающего ковалентно интегрированные группы полиэтиленгликоля, обладающего определенной молекулярной массой и линкерной структурой, которые указаны в прилагаемой формуле изобретения. В частности, НАЭ используют для выработки лекарственного средства для лечения нейродегенеративных расстройств головного и спинного мозга путем введения лекарственного средства в кровяное русло. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный НАЭ является химически модифицированной эритропоэтической молекулой, содержащей по меньшей мере одну свободную аминогруппу и включающей часть эритропоэтина, выбранную из группы, состоящей из эритропоэтина человека и его аналогов, которые имеют последовательность эритропоэтина человека, модифицированную добавлением 1-6 сайтов гликозилирования или реаранжировкой по меньшей мере одного сайта гликозилирования; указанная часть молекулы эритропоэтина ковалентно связана с «n» группами полиэтиленгликоля формулы -СО-(CH2)х-(ОCH2CH2)m-OR с -СО (т.е. карбонилом) каждой группы полиэтиленгликоля, формируя амидную связь с одной из указанных аминогрупп; в которой R обозначает низший алкил, x обозначает число 2 или 3, m обозначает число примерно от 450 до примерно 900, n обозначает число от 1 до 3, а n и m выбраны таким образом, что молекулярная масса образуемого НАЭ, за вычетом молекулярной массой гликопротеина немодифицированного эритропоэтина, составляет примерно от 20 кДа до примерно 100 кДа.
Предпочтительно НАЭ имеет формулу:
Figure 00000001
в которой х, m, n и R описаны в п.1, а Р является остатком части молекулы эритропоэтина без n аминогруппы (аминогрупп), который формирует амидную связь (связи) с группой (группами) полиэтиленгликоля. В представленной выше формуле R наиболее предпочтительно является метилом, m обозначает число примерно от 650 до примерно 750, а n обозначает 1.
Наиболее предпочтительно НАЭ, используемый в способе настоящего изобретения, имеет формулу
[CH3O(CH2CH2O)mCH2CH2CH2CO-NH]n-P
в которой m обозначает число от 650 до 750, n обозначает 1 и Р обозначает остаток эритропоэтиновой части.
Предпочтительно часть молекулы эритропоэтина является гликопротеином эритропоэтина человека, который может экспрессироваться за счет активирования эндогенного гена и имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения часть молекулы эритропоэтина имеет последовательность эритропоэтина человека, модифицированную внесением от 1 до 6 сайтов гликозилирования.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения нейродегенеративные расстройства головного и спинного мозга, поддающиеся лечению согласно способу настоящего изобретения, связаны с острым случаем, выбранным из удара, травмы головного или спинного мозга. Кроме того, нейродегенеративные расстройства головного и спинного мозга могут быть связаны с хроническим лечением удара, шизофрении, болезни Альцгеймера, болезни Гентингтона, слабоумия, синдрома временного X-ассоциированного тремора/атаксии, болезни Паркинсона, губчатой энцефалопатии, множественного склероза и нейродегенерации, связанной с бактериальными или вирусными инфекциями.
В способе настоящего изобретения НАЭ вводят в количестве, достаточном для лечения или облегчения нейродегенеративных расстройств («в терапевтически эффективном количестве»). НАЭ может быть введен пациентам традиционными методами, применимыми для терапии с применением ЭПО. Точное количество НАЭ зависит от типа заболевания, подвергаемого лечению, состояния пациента, подвергаемого лечению, а также от других составляющих в композиции. Количество, выраженное в мкг, относится только к соответствующей части молекулы эритропоэтина (которая является белком). Предпочтительно пациенту вводят примерно от 0,1 до примерно 100 мкг/кг массы тела ЭСФ настоящего изобретения, предпочтительно примерно от 1 до примерно 10 мкг/кг массы тела один раз в неделю.
При необходимости НАЭ может вводиться чаще. Однако НАЭ, используемый в настоящем изобретении, также может быть введен раз в две недели, раз в три недели, или раз в месяц, или даже с более длительными интервалами, зависящими от подвергаемого лечению заболевания и способа введения. Фармацевтические композиции, содержащие конъюгат, могут быть переработаны в высокоэффективные для введения разными способами пациенту с нейродегенеративным расстройством, которому свойственна гибель нейронов. Средние терапевтически эффективные количества конъюгата могут варьировать, в частности могут основываться на рекомендациях и предписаниях опытных врачей.
Специфическая активность НАЭ в соответствии с настоящим изобретением может быть определена разными методами, известными в данной области. Биологическое действие очищенных НАЭ настоящего изобретения таково, что введение НАЭ пациентам, например инъекцией, приводит к защите нейронов головного и спинного мозга.
Фармацевтические препараты настоящего изобретения включают фармацевтические композиции, пригодные для инъекции, которые перерабатывают с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем. Приготовление таких фармацевтических композиций известно в данной области техники. См., например, заявку US 2002/0037841 А1 (соответствует WO 01/87329), включенную в настоящее изобретение в виде ссылки. К фармацевтически приемлемым носителям для переработки продуктов настоящего изобретения относятся сывороточный альбумин человека, белки плазмы человека и др.
Кроме того, применение высушенных разбрызгиванием препаратов настоящей композиции может быть желательно с/без добавления каких-либо стабилизаторов или наполнителей.
Эритропоэз-стимулирующие факторы (ЭСФ), используемые в настоящем изобретении, могут быть переработаны в 10 мМ буфере натрия/калия фосфата рН 7, содержащем тонический агент, например 132 мМ хлорид натрия. Необязательно фармацевтическая композиция может содержать консервант. Фармацевтическая композиция может содержать разные количества белка эритропоэтина, например 10-1000 мкг/мл, предпочтительно 50 мкг или 400 мкг.
НАЭ предпочтительно может быть введен в кровяное русло инъекцией, кожным пластырем, подкожным депо или ингаляцией.
Предпочтительно НАЭ может быть введен индивидууму в дозе примерно от 25 мкг до примерно 500 мкг/сутки на протяжении двух недель в острых случаях нейродегенерации или в дозе примерно от 25 мкг до примерно 1000 мкг/неделю при хроническом лечении нейродегенеративных заболеваний. В последнем случае введение также может быть осуществлено до одного раза в месяц или даже реже, в зависимости от типа применения и типа заболевания. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения НАЭ может быть применен в дозе примерно 165 мкг/сутки на протяжении до одной недели в острых случаях или примерно 200 мкг/неделю в хронических случаях.
Кроме того, настоящее изобретение относится к набору, включающему НАЭ, применимый согласно описанным выше применениям, а веществом, улучшающим проницаемость гематоэнцефалического барьера, является маннит.
Эритропоэтин человека и его белки-аналоги, описанные выше, могут экспрессироваться в результате активирования эндогенных генов. Предпочтительными гликопротеинами эритропоэтина человека являются гликопротеины последовательностей SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, наиболее предпочтительно последовательности SEQ ID NO:1.
Кроме того, Р может быть выбран из группы, состоящей из остатков эритропоэтина человека и его аналогов, содержащих 1-6 дополнительных сайтов гликозилирования. Приготовление и очистка ЭПО хорошо известны в данной области и подробно описаны в настоящем изобретении ниже. Понятие «ЭПО» означает природный или рекомбинантный белок, предпочтительно белок человека, полученный из какого-либо традиционного источника, например выделенный из тканей, полученный в результате синтеза белка, из культуры природных или рекомбинантных клеток. Это понятие также относится к какому-либо белку, проявляющему активность ЭПО, например мутеинам или иным образом модифицированным белкам. Понятие «какая-либо активность» также относится к связывающей специфичности с рецептором ЭПО, присутствующим только на нейрональных клетках. Таким образом, производные НАЭ согласно настоящему изобретению, которые не проявляют эритропоэтической активности, также относятся к ним. Рекомбинантный ЭПО может быть получен экспрессией в клеточных линиях СНО-, BHK- или HeLa, методом рекомбинантной ДНК или активацией эндогенных генов. Экспрессия белков, в том числе ЭПО, путем активирования эндогенных генов хорошо известна в данной области и описана, например, в патентах US 5733761, 5641670 и 5733746, а также в международных патентных заявках WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 и WO 91/09955, содержание которых включено в настоящее изобретение в виде ссылок. Предпочтительными продуктами ЭПО для приготовления продуктов на основе гликопротеина эритропоэтина являются продукты на основе ЭПО человека. Более предпочтительными являются продукты ЭПО человека с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, более предпочтительно с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.
Кроме того, Р может быть остатком аналога гликопротеина с 1-6 дополнительными сайтами гликозилирования. Гликозилирование белка одной или несколькими группами олигосахаридов происходит по определенным местам в каркасе молекулы полипептида и существенно влияет на физические свойства белка, например стабильность, секрецию, субклеточную локализацию и биологическую активность. Гликозилирование обычно бывает двух типов. O-связанные олигосахариды присоединяются к остаткам серина или треонина, a N-связанные олигосахариды присоединяются к остаткам аспарагина. Одним из типов олигосахаридов, обнаруженных и в N-связанных, и в O-связанных олигосахаридах, является N-ацетилнейраминовая кислота (сиаловая кислота), которая относится к семейству аминосахаров, содержащих 9 или более атомов углерода. Сиаловая кислота обычно является концевым остатком и на N-связанных, и на O-связанных олигосахаридах, и поскольку она несет отрицательный заряд, придает кислотные свойства гликопротеину. Эритропоэтин человека, имеющий 165 аминокислот, содержит три N-связанные и одну O-связанную цепи олигосахарида, которые составляют примерно 40% общей молекулярной массы гликопротеина. N-связанное гликозилирование происходит по остаткам аспарагина, расположенным в положениях 24, 38 и 83, а O-связанное гликозилирование происходит по остатку серина в положении 126. Цепочки олигосахарида модифицированы концевыми остатками сиаловой кислоты. Ферментативное удаление всех остатков сиаловой кислоты из гликозилированного эритропоэтина приводит к утрате активности in vivo, но не активности in vitro, поскольку сиалирование эритропоэтина предупреждает его связывание связывающим белком печени с последующим клиренсом.
К гликопротеинам, используемым в химическом синтезе НАЭ настоящего изобретения, относятся аналоги эритропоэтина человека с одним или несколькими изменениями аминокислотной последовательности эритропоэтина человека, что приводит к повышению числа сайтов присоединения сиаловой кислоты. Эти гликопротеиновые аналоги, которые могут быть получены сайт-направленным мутагенезом, имеют дополнения, делеции или замещения аминокислотных остатков, которые усиливают или изменяют сайты, доступные для гликозилирования. Аналоги гликопротеина, у которых уровни содержания сиаловой кислоты выше уровней в эритропоэтине человека, получают добавлением сайтов гликозилирования, которые не нарушают вторичную или третичную конформацию, необходимую для проявления биологической активности. Гликопротеины, используемые в химическом синтезе НАЭ согласно настоящему изобретению, также включают аналоги с повышенными уровнями содержания присоединенных углеводов по сайту гликозилирования, который обычно включает замещение одной или нескольких аминокислот непосредственно около N-связанного или O-связанного сайта. К гликопротеинам, используемым в химическом синтезе НАЭ настоящего изобретения, также относятся аналоги с одной или несколькими аминокислотами, протяженными от С-конца эритропоэтина, содержащие по меньшей мере один дополнительный сайт присоединения углеводов. К гликопротеинам, используемым в химическом синтезе НАЭ настоящего изобретения, также относятся аналоги с аминокислотной последовательностью, включающей реаранжировку по меньшей мере одного сайта для гликозилирования. Такая реаранжировка сайта гликозилирования включает делецию одного или нескольких сайтов гликозилирования в эритропоэтине человека и добавление одного или нескольких искусственных сайтов гликозилирования. Аналоги эритропоэтина с дополнительными сайтами гликозилирования описаны более подробно в заявке на получение европейского патента 640619.
Кроме того, гликопротеины, используемые для химического синтеза НАЭ настоящего изобретения, содержат аминокислотную последовательность, включающую по меньшей мере один дополнительный сайт гликозилирования, например эритропоэтины (которыми перечень не ограничивается), включающие последовательность эритропоэтина человека, модифицированные следующим образом:
Asn30Thr32,
Asn51Thr53,
Asn57Thr59,
Asn69,
Asn69Thr71,
Ser68Asn69Thr71,
Val87Asn88Thr90,
Ser87Asn88Thr90,
Ser87Asn88Gly89Thr90,
Ser87Asn88Thr90Thr92,
Ser87Asn88Thr90Ala162,
Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90,
Asn30Thr32Val87Asn88Thr90,
Asn89Ile90Thr91,
Ser89Asn89Ile90Thr91,
Asn136Thr138,
Asn138Thr140,
Thr125 и
Pro124Thr125.
Обозначение, применяемое в настоящем изобретении для модификации аминокислотной последовательности, означает, что положение (положения) соответствующего немодифицированного белка (например, ЭПОч последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2), показанное надстрочным индексом (индексами), изменено по аминокислоте (аминокислотам), которые непосредственно предшествуют соответствующему приведенному вверху номеру (номерам).
Гликопротеин также может быть аналогом, содержащим по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту с С-конца гликопротеина, в котором дополнительная аминокислота включает по меньшей мере один сайт гликозилирования, т.е. конъюгат, описанный выше, также относится к соединению, в котором гликопротеин содержит последовательность эритропоэтина человека и вторую последовательность с С-конца последовательности эритропоэтина человека, причем вторая последовательность содержит по меньшей мере один сайт гликозилирования. Дополнительная аминокислота может включать фрагмент пептида, производный с С-конца хорионического гонадотропина человека. Предпочтительно гликопротеин является аналогом, выбранным из группы, состоящей из (а) эритропоэтина человека, имеющего аминокислотную последовательность Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln (SEQ ID NO: 3), протяженную с С-конца, (б) аналога (а), дополнительно включающего Ser87 Asn88 Thr90 ЭПО, и (в) аналога (а), дополнительно включающего Asn30 Thr32 Val87 Asn88 Thr90 ЭПО.
Гликопротеин также может быть аналогом с аминокислотной последовательностью, включающей реаранжировку по меньшей мере одного сайта гликозилирования. Реаранжировка может включать делецию какого-либо из N-связанных углеводных сайтов в эритропоэтине человека и добавление N-связанного углеводного сайта в положении 88 аминокислотной последовательности эритропоэтина человека. Предпочтительно, гликопротеин является аналогом, выбранным из группы, включающей Gln24 Ser87 Asn88 Thr90 EPO; Gln38 Ser87 Asn88 Thr90 ЭПО и Gln83 Ser87 Asn88 Thr90 ЭПО.
В контексте настоящего изобретения понятие «низший алкил» означает линейную или разветвленную алкильную группу, содержащую от одного до шести атомов углерода. К примерам низших алкильных групп относятся метильная, этильная и изопропильная группы. В соответствии с настоящим изобретением R обозначает какой-либо из низших алкилов. Конъюгаты, в которых R обозначает метил, являются предпочтительными.
Буква «m» обозначает число остатков оксида этилена (OCH2CH2) в группе полиэтиленоксида. Молекулярная масса одной субъединицы ПЭГ оксида этилена составляет примерно 44 Да. В связи с этим молекулярная масса конъюгата (исключая молекулярную массу ЭПО) зависит от числа «m». В конъюгатах настоящего изобретения «m» составляет примерно от 450 до примерно 900 (что соответствует молекулярной массе примерно от 20 кДа до примерно 40 кДа), предпочтительно примерно от 650 до примерно 750 (что соответствует молекулярной массе примерно 30 кДа). Число m выбирают таким образом, что образующийся конъюгат настоящего изобретения имеет физиологическую активность, сопоставимую с немодифицированным ЭПО, чья активность может представлять такую же активность, повышенную активность или часть соответствующей активности немодифицированного ЭПО. Понятие «примерно» применительно к молекулярной массе означает, что она находится в определенном диапазоне, определенном обычными аналитическими методами. Число «m» выбирают таким образом, что молекулярная масса каждой группы полиэтиленгликоля, ковалентно связанная с гликопротеином эритропоэтина, составляет примерно от 20 кДа до примерно 40 кДа, предпочтительно примерно 30 кДа.
В конъюгатах настоящего изобретения буква «n» обозначает число групп полиэтилена, ковалентно связанных со свободными аминогруппами (включая ε-аминогруппы аминокислоты лизина и/или амино-концевые аминогруппы) белка эритропоэтина через амидную связь (связи). Конъюгат настоящего изобретения может содержать одну, две или три группы ПЭГ на молекулу ЭПО. Буква «n» обозначает целое число от 1 до 3, предпочтительно «n» обозначает 1 или 2, более предпочтительно «n» обозначает 1.
Соединение формулы I может быть получено из известного полимерного материала
Figure 00000002
где обозначения R и m описаны выше, путем конденсации соединения формулы II с гликопротеином эритропоэтина. Соединения формулы II, в которой x обозначает 3, являются альфа-низшим алкокси, сукцинимидильными сложными эфирами масляной кислоты и полиэтиленгликоля (низший алкокси-ПЭГ-СМК). Соединения формулы II, в которой x обозначает 2, являются альфа-низшим алкокси, сукцинимидильными сложными эфирами пропионовой кислоты и полиэтиленгликоля (низший алкокси-ПЭГ-СПК). Может быть применен какой-либо традиционный метод химического взаимодействия активированного сложного эфира с амином для формирования амида. В описанной выше реакции приведенный в качестве примера сукцинимидильный сложный эфир является отщепляемой группой, вызывающей формирование амида. Применение сукцинимидильных сложных эфиров, например соединений формулы II, для получения конъюгатов с белками, описано в патенте US 5672662.
ЭПО человека содержат девять свободных аминогрупп, амино-концевые аминогруппы плюс ε-аминогруппы 8 остатков лизина. Установлено, что при соединении пэгелирующего реагента с соединением СМК формулы II при рН 7,5, соотношении белок:ПЭГ=1:3, температуре реакционной смеси 20-25°С, получают смесь моно-, ди- и следовые количества трипэгелированных соединений. Если пэгелированный реагент является соединением СПК формулы II в сходных условиях проведения реакции, за исключением соотношения белка:ПЭГ, составляющего 1:2, в основном получают монопэгелированные продукты. Пэгелированный ЭПО может быть введен в виде смеси или отдельных различных пэгелированных продуктов, разделенных с помощью катионообменной хроматографии. За счет изменения условий проведения реакции (например, соотношения реагентов, рН, температуры, концентрации белков, длительности реакции и т.д.), количества разных пэгелированных продуктов могут меняться.
Настоящее изобретение предусматривает применение композиции, включающей конъюгаты, подобные описанным выше. Композиция, содержащая по меньшей мере 90% монопэгелированных конъюгатов, т.е. в которых n обозначает 1, может быть приготовлена согласно описанному в примере 5. Обычно желательны монопэгелированные конъюгаты эритропоэтиновых гликопротеинов, поскольку они склонны проявлять повышенную активность по сравнению с дипэгелированными конъюгатами. Процент монопэгелированных конъюгатов и соотношение моно- и дипэгелированных продуктов могут контролироваться более широким объединением фракций вокруг элюируемого пика для снижения процентного содержания монопэгелированных или более узких фракций для повышения процентного содержания монопэгелированных продуктов в композиции. Примерно 90% монопэгелированных конъюгатов является хорошим балансом между продуктивностью синтеза и активностью. Некоторые композиции могут быть желательными, в которых, например, по меньшей мере 92% или по меньшей мере 96% конъюгатов являются монопэгелированными продуктами (n=1). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения процентное содержание конъюгатов, у которых n обозначает 1, составляет от 90% до 96%.
Учитывая вышесказанное, маловероятно, что химически модифицированный эритропоэтический белок, описанный в настоящем изобретении, может пройти сквозь ГЭБ за счет простой диффузии, поскольку НАЭ настоящего изобретения в высокой степени гидрофильны и имеют большую молекулярную массу. С этим связано наблюдение Partridge и др. (Pharmaceutical Research, 15, 1998, No. 4), заключающееся в том, что пэгелирование низкомолекулярными молекулами ПЭГ (молекулярная масса 2000 Да) снижает пассивное поступление в мозг пептидов, например формируемый мозгом нейротрофический фактор. Тем не менее, приведенные ниже примеры ясно показывают присутствие НАЭ в СМЖ. Эти данные согласуются (и подтверждают высказанное предположение) с тем, что НАЭ настоящего изобретения, включающие полиэтиленгликолевые части, интегрированные в структуру молекулы, проходят через ГЭБ за счет облегченного или активного транспортного процесса.
Пациенты, получившие удар, должны подвергаться лечению НАЭ настоящего изобретения как можно скорее. При хронических неврологических заболеваниях НАЭ следует вводить периодически из-за его повышенного времени пребывания в кровяном русле (т.е повышенный период полувыведения). Поскольку НАЭ обладает повышенным временем пребывания и показывает пониженное сродство с рецептором ЭПО, уровень гемоглобина может контролироваться в выраженном узком диапазоне. Поскольку пики и падения уровней гемоглобина, обычно устанавливаемые для ЭПО, снижаются введением НАЭ, снижаются побочные эффекты, например повышенный риск тромбоза и загущения крови.
Ниже настоящее изобретение поясняется примерами. Эти примеры графически представляют различные варианты осуществления настоящего изобретения, которые никоим образом не ограничивают его применения.
Примеры
Пример 1. Применение mПЭГ-СМК для пэгелирования ЭПО
Ферментирование и очистка ЭПО человека описаны, например, в патенте US 6583272, пример 1.
ЭПО, очищенный от сыворотки по методике, описанной в примере 1 патента US 6583272 (ЭПО без сыворотки - ЭПОбс), является гомогенным согласно аналитическим методам определения и представляет типичный образец изоформы, состоящий из 8 изоформ. ЭПО обладает специфической биологической активностью 190000 МЕ/мг, которая была определена исследованием нормоцитов мышей. Используемым пэгелирующим реагентом является метокси-ПЭГ-СМК, который представляет соединение формулы II, в которой R обозначает метил, x обозначает 3, а m обозначает число от 650 до 750 (в среднем примерно число 680, соответствующее средней молекулярной массе, примерно равной 30 кДа).
Реакция пэгелирования
К 100 мг ЭПОбс (9,71 мл исходного раствора 10,3 мг/мл ЭПОбс, 5,48 мкмолей) добавляют 10 мл буфера 0,1 М фосфата калия, рН 7,5, содержащего 506 мг 30 кДа метокси-ПЭГ-СМК (16,5 мкмолей) (фирма Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Алабама), и перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре (20-23°C). Конечная концентрация белка составляет 5 мг/мл, а соотношение белок:ПЭГ-реагент составляет 1:3. Через 2 ч реакцию останавливают подкислением ледяной уксусной кислотой до величины рН 4,5 и хранят при -20°С до проведения очистки.
Очистка
1. Конъюгационная смесь: примерно 28 мл SP-SEPHAROSE FF (сульфопропил катионобменная смола) помещают в стеклянную колонку AMICON (2,2×7,5 см) и уравновешивают буфером 20 мМ ацетата рН 4,5 при скорости потока 150 мл/ч. Шесть мл реакционной смеси, содержащей 30 мг белка, пятикратно разводят уравновешивающим буфером и вносят в колонку. Неадсорбированные материалы вымывают буфером, а адсорбированную ПЭГ-конъюгационную смесь элюируют из колонки 0,175 М NaCl в уравновешивающем буфере. Немодифицированный ЭПОбс, остающийся в колонке, элюируют 750 мМ NaCl. Колонку повторно уравновешивают исходным буфером. Образцы анализируют методом SDS-PAGE и определяют степень их пэгелирования. Установлено, что элюат 0,175 М NaCl содержит моно-, ди- и следовые количества трипэгелированных продуктов, а 750 мМ NaCl элюат содержит немодифицированный ЭПОбс.
2. Ди-ПЭГ и моно-ПЭГ-ЭПОбс: очищенную конъюгационную смесь, элюированную из колонки на предыдущей стадии, четырехкратно разводят буфером и повторно наносят в колонку, затем промывают согласно описанной методике. Ди-ПЭГ-ЭПОбс и моно-ПЭГ-ЭПОбс элюируют по отдельности с колонки буферами 0,1М NaCl и 0,175 М NaCl, соответственно. Также проводят элюцию 750 мМ NaCl для удаления каких-либо оставшихся немодифицированных ЭПОбс.
В другом варианте реакционную смесь разводят пятикратно ацетатным буфером и вносят в колонку с SP-Sepharose (~0,5 мг белка/мл геля). Колонку промывают и адсорбированные моно-ПЭГ-ЭПОбс, ди-ПЭГ-ЭПОбс и немодифицированные ЭПОбс элюируют согласно описанному в предыдущем разделе.
Результаты
ПЭГ-ЭПОбс синтезируют химической конъюгацией линейной молекулы ПЭГ со средней молекулярной массой 30 кДа. ПЭГ-ЭПОбс получают реакцией между первичными аминогруппами ЭПОбс и производным сукцинимидильного эфира 30 кДа ПЭГ-масляной кислоты с формированием амидной связи.
Результаты суммированы в таблице. Очищенная конъюгирующая смесь включает моно- и ди-ПЭГ-ЭПОбс и не содержит немодифицированные ЭПОбс, что было показано анализом SDS-PAGE. Конъюгирующая смесь насчитывает до 23,4 мг или 78% исходного материала. Катионообменное хроматографическое разделение моно- и ди-ПЭГ-ЭПОбс показало, что соотношение моно- к ди-ПЭГ в конъюгирующей смеси составляет почти 1:1. После завершения реакции соотношение отдельных моно:ди:немодифицированных компонентов составляет 40:38:20 (%). Общий выход практически является количественным.
Суммирование результатов пэгелирования ЭПОбс
Образец Белок (мг) Выход (%)
Реакционная смесь 30 100
Моно- 12,0 40
Ди- 11,4 38
Немодифицированный 6,0 20
Смесь конъюгатов 23,4 78
Пример 2. Применение mПЭГ-СПК для пэгелирования ЭПО
Разные аликвоты ЭПОбс, используемые в примере 2, взаимодействуют с 30 кДа метокси-PEG-SPA (фирма Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Алабама). Реакцию проводят в соотношении белок:реагент = 1:2, а очистку проводят методами, описанными в примере 2. Главным образом получают монопэгелированные продукты.
Действие описанных конъюгатов ЭПО in vivo описано в патенте US 6583272, пример 4.
Пример 3. Исследования in vivo
Эксперименты in vivo проводят на самцах крыс линии Wistar, получаемых от фирмы Charles River RCC, Fullinsdorf, Швейцария. И ЭПО, и конъюгат ЭПО (полученный согласно описанному в примере 1) вводят внутривенно в виде однократной дозы 25 мкг/кг массы тела в хвостовую вену крыс. Через определенное время (2 и 6 ч после инъекции) отбирают образцы спинномозговой жидкости и затем отбирают плазму (из подъязычной или хвостовой вены). СМЖ получают, вставляя иглу для отбора образца (0,7×19 мм) в мозжечково-мозговую цистерну (cisterna magna). СМЖ получают дренажом с помощью силиконовой трубки (внутренний диаметр 0,5 мм) за счет капиллярных сил. С помощью этого метода можно получить от одной крысы ~0,1 мл СМЖ.
Соединения:
ЭПО, концентрация 1, 84 мг/мл
Вводимый объем: 2 мл/кг массы тела
Композиция: водный буфер
Конъюгат ЭПО, концентрация 6,2 мг/мл
Вводимый объем: 2 мл/кг массы тела
Композиция: водный буфер
Концентрацию соединений в отобранных образцах определяют фермент-связанным иммуносорбентным анализом (ELISA).
Результаты
Фигуры 1-3 показывают, что НАЭ согласно настоящему изобретению может преодолеть гематоэнцефалический барьер. В течение 2-6 ч концентрация конъюгата в ликворе возрастает.

Claims (19)

1. Применение эритропоэтической молекулы для получения лекарственного средства для лечения нейродегенеративных расстройств головного и спинного мозга введением эффективного количества лекарственного средства в кровяное русло пациента, нуждающегося в таком лечении, в которой эритропоэтическая молекула включает часть молекулы эритропоэтина, имеющую по меньшей мере одну свободную аминогруппу, выбранную из группы, включающей эритропоэтин человека и его аналоги, которые имеют последовательность эритропоэтина человека, модифицированную добавлением 1-6 сайтов гликозилирования или реаранжировкой по меньшей мере одного сайта гликозилирования; указанная часть молекулы эритропоэтина ковалентно связана с «n» группами полиэтиленгликоля формулы
-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR
с -СО каждой группы полиэтилена, формирующей амидную связь с одной из указанных аминогрупп, в которой
R обозначает низший алкил,
x обозначает число 2 или 3,
m обозначает число примерно от 450 до примерно 900,
n обозначает число от 1 до 3, и
n и m выбраны таким образом, что молекулярная масса формируемой эритропоэтической молекулы, за вычетом молекулярной массой части молекулы эритропоэтина, составляет примерно от 20 кДа до примерно 100 кДа.
2. Применение эритропоэтической молекулы по п.1 формулы
Figure 00000001

в которой x, m, n, R обозначают то же, что и в п.1, а Р является остатком части молекулы эритропоэтина с n аминогруппой (группами), которая формирует амидную связь (связи) с группой (группами) полиэтиленгликоля.
3. Применение эритропоэтической молекулы по п.1 или п.2, в которой R обозначает метил.
4. Применение эритропоэтической молекулы по п.1 или п.2, в которой m обозначает число примерно от 650 до примерно 750.
5. Применение эритропоэтической молекулы по п.1 или п.2, в которой n обозначает 1.
6. Применение эритропоэтической молекулы по п.1 или п.2, в которой R обозначает метил, m обозначает число примерно от 650 до примерно 750 и n обозначает 1.
7. Применение эритропоэтической молекулы по п.1 или п.2 формулы
[СН3О(СН2СН2O)mСН2СН2СН2СО-NH]n-Р
в которой m обозначает число от 650 до 750, n обозначает 1 и Р обозначает то же, что и в п.1.
8. Применение эритропоэтической молекулы по п.1 или п.2, в которой часть эритропоэтина является эритропоэтином человека.
9. Применение эритропоэтической молекулы по п.1 или п.2, в которой часть молекулы эритропоэтина имеет последовательность SEQ ID NO:1.
10. Применение эритропоэтической молекулы по п.1 или п.2, в которой часть молекулы эритропоэтина имеет последовательность эритропоэтина человека, модифицированного добавлением от 1 до 6 сайтов гликозилирования.
11. Применение эритропоэтической молекулы по п.1 или п.2, в которой нейродегенеративные расстройства головного и спинного мозга связаны с острым заболеванием, выбранным из удара, травматического повреждения головного или спинного мозга.
12. Применение эритропоэтической молекулы по п.1 или п.2, в котором нейродегенеративные расстройства головного мозга связаны с хроническим лечением и выбраны из шизофрении, болезни Альцгеймера, болезни Гантингтона, слабоумия, синдрома временного X-ассоциированного тремора/атаксии, болезни Паркинсона, губчатой энцефалопатии, множественного склероза и нейродегенерации, связанной с бактериальными или вирусными инфекциями.
13. Применение эритропоэтической молекулы по п.1 или п.2, в котором введение эритропоэтической молекулы в кровяное русло осуществляется инъекцией, кожным пластырем, подкожным депо или ингаляцией.
14. Применение эритропоэтической молекулы по п.1 или п.2, в котором вводимое количество, определяемое по количеству части молекулы эритропоэтина, составляет примерно от 25 мкг до примерно 500 мкг/сутки примерно до двух недель в острых случаях или примерно от 25 мкг до примерно 1000 мкг/неделю в хронических случаях.
15. Применение эритропоэтической молекулы по п.14 в дозе 165 мкг/сутки на протяжении до одной недели в острых случаях или в дозе 200 мкг/неделю при постоянном лечении.
16. Набор для лечения нейродегенеративных расстройств спинного и головного мозга, содержащий эритропоэтическую молекулу, которая включает часть молекулы эритропоэтина, имеющую по меньшей мере одну свободную аминогруппу, выбранную из группы, включающей эритропоэтин человека и его аналоги, которые имеют последовательность эритропоэтина человека, модифицированную добавлением 1-6 сайтов гликозилирования или реаранжировкой по меньшей мере одного сайта гликозилирования; указанная часть молекулы эритропоэтина ковалентно связана с «n» группами полиэтиленгликоля формулы
-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR
с -СО каждой группы полиэтилена, формирующей амидную связь с одной из указанных аминогрупп, в которой
R обозначает низший алкил,
x обозначает число 2 или 3,
m обозначает число примерно от 450 до примерно 900,
n обозначает число от 1 до 3, и
n и m выбраны таким образом, что молекулярная масса формируемой эритропоэтической молекулы, за вычетом молекулярной массой части молекулы эритропоэтина, составляет примерно от 20 кДа до примерно 100 кДа.
17. Набор по п.16, включающий эритропоэтическую молекулу и вещество, улучшающее проницаемость гематоэнцефалического барьера.
18. Способ лечения нейродегенеративных расстройств головного и спинного мозга, включающий введение в кровяное русло пациента, нуждающегося в таком лечении, терапевтически эффективного количества эритропоэтической молекулы, которая включает часть молекулы эритропоэтина, содержащую по меньшей мере одну свободную аминогруппу, выбранную из группы, включающей эритропоэтин человека и его аналоги, которые имеют последовательность эритропоэтина человека, модифицированную добавлением 1-6 сайтов гликозилирования или реаранжировкой по меньшей мере одного сайта гликозилирования; указанная часть молекулы эритропоэтина ковалентно связана с «n» группами полиэтиленгликоля формулы
-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR
с -СО каждой группы полиэтилена, формирующей амидную связь с одной из указанных аминогрупп, в которой
R обозначает низший алкил,
х обозначает число 2 или 3,
m обозначает число примерно от 450 до примерно 900,
n обозначает число от 1 до 3, и
n и m выбраны таким образом, что молекулярная масса формируемой эритропоэтической молекулы, за вычетом молекулярной массой части молекулы эритропоэтина, составляет примерно от 20 кДа до примерно 100 кДа.
19. Лекарственное средство, включающее эритропоэтическую молекулу для лечения нейродегенеративных расстройств головного и спинного мозга введением эффективного количества лекарственного средства в кровяное русло пациента, нуждающегося в таком лечении, в котором эритропоэтическая молекула включает часть молекулы эритропоэтина, содержащую по меньшей мере одну свободную аминогруппу, выбранную из группы, включающей эритропоэтин человека или его аналоги, которые имеют последовательность эритропоэтина человека, модифицированную добавлением 1-6 сайтов гликозилирования или реаранжировкой по меньшей мере одного сайта гликозилирования; указанная часть молекулы эритропоэтина ковалентно связана с «n» группами полиэтиленгликоля формулы
-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR
с -СО каждой группы полиэтилена, формирующей амидную связь с одной из указанных аминогрупп, в которой
R обозначает низший алкил;
x обозначает 2 или 3;
m обозначает число примерно от 450 до примерно 900;
n обозначает число от 1 до 3; и
n и m выбраны таким образом, что молекулярная масса образуемой эритропоэтической молекулы, за вычетом молекулярной массой части молекулы эритропоэтина, составляет примерно от 20 кДа до примерно 100 кДа.
RU2008116309/15A 2005-09-28 2006-09-18 Лечение нейродегенеративных расстройств RU2467761C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP05108946 2005-09-28
EP05108946.4 2005-09-28
PCT/EP2006/066438 WO2007039436A1 (en) 2005-09-28 2006-09-18 Treatment of neurodegenerative disorders

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2008116309A RU2008116309A (ru) 2009-11-10
RU2467761C2 true RU2467761C2 (ru) 2012-11-27

Family

ID=37622051

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2008116309/15A RU2467761C2 (ru) 2005-09-28 2006-09-18 Лечение нейродегенеративных расстройств

Country Status (18)

Country Link
US (2) US20070072795A1 (ru)
EP (1) EP1940447B1 (ru)
JP (1) JP5096345B2 (ru)
KR (1) KR20080038440A (ru)
CN (1) CN101277715B (ru)
AR (1) AR055654A1 (ru)
AU (1) AU2006298826B2 (ru)
BR (1) BRPI0616572A2 (ru)
CA (1) CA2622609A1 (ru)
DK (1) DK1940447T3 (ru)
ES (1) ES2445035T3 (ru)
IL (1) IL189853A (ru)
PL (1) PL1940447T3 (ru)
RU (1) RU2467761C2 (ru)
SI (1) SI1940447T1 (ru)
TW (1) TWI380824B (ru)
WO (1) WO2007039436A1 (ru)
ZA (1) ZA200802270B (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2515914C1 (ru) * 2013-02-12 2014-05-20 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика" Гибридный белок на основе рекомбинантного эритропоэтина человека, обладающий пролонгированным действием (варианты), и способ его получения

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR067536A1 (es) 2007-07-17 2009-10-14 Hoffmann La Roche Metodo para obtener una eritropoyetina mono-pegilada en una forma sustancialmente homogenea
CL2008002053A1 (es) 2007-07-17 2009-05-22 Hoffmann La Roche Metodo para la purificacion de una eritropoyetina monopeguilada (epompeg) que consiste en proporcionar una solucion que contiene eritropoyetina mono, poli y no peguilada y hacerla pasar por dos pasos de cromatografia de intercambio cationico y metodo para producir epo mpeg que incluye metodo de purificacion.
RU2561050C2 (ru) 2013-08-28 2015-08-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук (ИБК РАН) Применение белка yb-1 и его фрагментов для изготовления лекарственных средств при лечении болезни альцгеймера
AR113091A1 (es) * 2018-09-27 2020-01-22 Univ Nacional Del Litoral Eritropoyetina humana modificada

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000061164A1 (en) * 1999-04-13 2000-10-19 Kenneth S. Warren Laboratories Modulation of excitable tissue function by peripherally administered erythropoietin
WO2002049673A2 (en) * 2000-12-20 2002-06-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugates of erythropoietin (pep) with polyethylene glycol (peg)
US6943148B1 (en) * 1998-08-14 2005-09-13 Nobex Corporation Methods for delivering therapeutics across blood-barrier and for altering receptor binding affinity

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US644077A (en) * 1898-08-01 1900-02-27 Farbenfabriken Of Elberfeld Company Acetyl salicylic acid.
FR2646438B1 (fr) * 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
US5968502A (en) * 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5641670A (en) * 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5672662A (en) * 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US6225895B1 (en) * 1999-05-26 2001-05-01 Floyd E. Bigelow, Jr. Towed vehicle monitor system
CZ299516B6 (cs) * 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
EP1311285B2 (en) * 2000-05-15 2017-04-12 F. Hoffmann-La Roche AG Liquid pharmaceutical composition containing an erythropoietin derivative
EP1298994A2 (en) * 2000-07-10 2003-04-09 NAITO, Albert T. Method for opening the blood-brain barrier
DE10043457A1 (de) * 2000-09-04 2002-03-28 Hannelore Ehrenreich Verfahren zur Behandlung von Schizophrenie und verwandten Psychosen sowie Verwendung von Erythropoietin oder Erythropoietinderivaten zur Behandlung von Schizophrenien und verwandten Psychosen
US7767643B2 (en) * 2000-12-29 2010-08-03 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
US20030072737A1 (en) * 2000-12-29 2003-04-17 Michael Brines Tissue protective cytokines for the protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues and organs
US6531121B2 (en) * 2000-12-29 2003-03-11 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
US7439063B2 (en) * 2002-06-11 2008-10-21 Burnham Institute For Medical Research Neuroprotective synergy of erythropoietin and insulin-like growth factors
NZ537306A (en) * 2002-07-01 2008-11-28 Kenneth S Warren Inst Inc Compositions comprising mutein recombinant tissue protective cytokines having one or more amino acid substitutions facilitating transport of a molecule via transcytosis across an endothelial cell barrier
US7459436B2 (en) * 2002-11-22 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
US7718363B2 (en) * 2003-04-25 2010-05-18 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Tissue protective cytokine receptor complex and assays for identifying tissue protective compounds
EA200501828A1 (ru) * 2003-05-19 2006-08-25 Дзе Кеннет С. Уоррен Инститьют, Инк. Тканепротекторные цитокины с увеличенным терапевтическим окном для защиты, восстановления и стимулирования реагирующих клеток, тканей и органов
SI1696947T1 (sl) * 2003-12-19 2014-05-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Uporaba eritropoetina pri zdravljenju motenj porazdelitve železa pri kroničnih vnetnih črevesnih boleznih
WO2007039438A1 (en) * 2005-09-28 2007-04-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Indol-3-yl-carbonyl-azaspiro derivatives as vasopressin receptor antagonists

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6943148B1 (en) * 1998-08-14 2005-09-13 Nobex Corporation Methods for delivering therapeutics across blood-barrier and for altering receptor binding affinity
WO2000061164A1 (en) * 1999-04-13 2000-10-19 Kenneth S. Warren Laboratories Modulation of excitable tissue function by peripherally administered erythropoietin
WO2002049673A2 (en) * 2000-12-20 2002-06-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugates of erythropoietin (pep) with polyethylene glycol (peg)

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Dockal M., et al., "Conformational transitions of the three recombinant domains of human serum albumin depending on pH." J Biol Chem. 2000 Feb 4; 275(5):3042-50. *
Pardridge WM., "Tyrosine hydroxylase replacement in experimental Parkinson's disease with transvascular gene therapy." NeuroRx. 2005 Jan; 2(1):129-38. *
Pardridge WM., et al., "Chimeric peptides as a vehicle for peptide pharmaceutical delivery through the blood-brain barrier." Biochem Biophys Res Commun. 1987 Jul 15; 146(1):307-13. *
Wiig H., et al., "The interstitial distribution of macromolecules in rat tumours is influenced by the negatively charged matrix components." J Physiol. 2005 Sep 1; 567(Pt 2):557-67. Epub 2005 Jun 30. *
Wu D., et al., "Neuroprotection with noninvasive neurotrophin delivery to the brain." Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Jan 5; 96(1):254-9. *
Wu D., et al., "Neuroprotection with noninvasive neurotrophin delivery to the brain." Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Jan 5; 96(1):254-9. Pardridge WM., "Tyrosine hydroxylase replacement in experimental Parkinson's disease with transvascular gene therapy." NeuroRx. 2005 Jan; 2(1):129-38. Pardridge WM., et al., "Chimeric peptides as a vehicle for peptide pharmaceutical delivery through the blood-brain barrier." Biochem Biophys Res Commun. 1987 Jul 15; 146(1):307-13. Wiig H., et al., "The interstitial distribution of macromolecules in rat tumours is influenced by the negatively charged matrix components." J Physiol. 2005 Sep 1; 567(Pt 2):557-67. Epub 2005 Jun 30. Dockal M., et al., "Conformational transitions of the three recombinant domains of human serum albumin depending on pH." J Biol Chem. 2000 Feb 4; 275(5):3042-50. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2515914C1 (ru) * 2013-02-12 2014-05-20 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика" Гибридный белок на основе рекомбинантного эритропоэтина человека, обладающий пролонгированным действием (варианты), и способ его получения

Also Published As

Publication number Publication date
PL1940447T3 (pl) 2014-04-30
EP1940447B1 (en) 2013-11-27
AU2006298826B2 (en) 2010-04-01
TW200727911A (en) 2007-08-01
US20070072795A1 (en) 2007-03-29
ZA200802270B (en) 2009-02-25
CN101277715A (zh) 2008-10-01
AR055654A1 (es) 2007-08-29
IL189853A0 (en) 2008-11-03
TWI380824B (zh) 2013-01-01
US20100267632A1 (en) 2010-10-21
KR20080038440A (ko) 2008-05-06
CN101277715B (zh) 2013-03-27
BRPI0616572A2 (pt) 2009-11-24
JP2009510008A (ja) 2009-03-12
IL189853A (en) 2012-06-28
ES2445035T3 (es) 2014-02-27
SI1940447T1 (sl) 2014-03-31
CA2622609A1 (en) 2007-04-12
EP1940447A1 (en) 2008-07-09
WO2007039436A1 (en) 2007-04-12
DK1940447T3 (da) 2014-01-20
AU2006298826A1 (en) 2007-04-12
RU2008116309A (ru) 2009-11-10
JP5096345B2 (ja) 2012-12-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100593143B1 (ko) 에리트로포이에틴 컨쥬게이트
KR100839302B1 (ko) 심장 질환에서 에리스로포이에틴의 신규한 용도
CA2460489C (en) Pegylated and diglycosylated erythropoietin
US7459435B2 (en) Treatment of disturbances of iron distribution
PL201754B1 (pl) Koniugat zawierający glikoproteinę erytropoetynę, kompozycja koniugatów, środek farmaceutyczny, zastosowanie koniugatu lub kompozycji koniugatów i sposób wytwarzania koniugatu lub kompozycji koniugatów
US7459429B2 (en) Method of treating disturbances of iron distribution in inflammatory intestinal diseases
CZ20024005A3 (cs) Nová farmaceutická kompozice
RU2467761C2 (ru) Лечение нейродегенеративных расстройств
AU2004260543A8 (en) Long acting erythropoietins that maintain tissue protective activity of endogenous erythropoietin

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20190919