RU2464317C2 - Method of chromosomal integration and replacement of dna sequence in clostridia - Google Patents
Method of chromosomal integration and replacement of dna sequence in clostridia Download PDFInfo
- Publication number
- RU2464317C2 RU2464317C2 RU2009116513/10A RU2009116513A RU2464317C2 RU 2464317 C2 RU2464317 C2 RU 2464317C2 RU 2009116513/10 A RU2009116513/10 A RU 2009116513/10A RU 2009116513 A RU2009116513 A RU 2009116513A RU 2464317 C2 RU2464317 C2 RU 2464317C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- vector
- acetobutylicum
- upp
- marker
- Prior art date
Links
- 0 CCC=*=C1C(C*)CCC1 Chemical compound CCC=*=C1C(C*)CCC1 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ ИЗОБРЕТЕНИЮ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION
Клостридии (Clostridia) представляют собой грамположительные, анаэробные бактерии с низким содержанием GC, широко используемые в промышленности благодаря своей способности продуцировать растворители, в частности бутанол, этанол и ацетон, а также диолы типа 1,3-пропандиола, органические кислоты типа уксусной, масляной или молочной кислоты, и в вакцинах.Clostridia (Clostridia) are gram-positive, anaerobic bacteria with a low GC content, widely used in industry due to their ability to produce solvents, in particular butanol, ethanol and acetone, as well as diols like 1,3-propanediol, organic acids like acetic, butyric or lactic acid, and in vaccines.
Конструирование рекомбинантных Clostridia составляет важную часть разработок в данной области техники. С целью улучшения возможностей их использования в промышленности штаммы Clostridium генетически модифицируют.The construction of recombinant Clostridia is an important part of the development in the art. In order to improve the possibilities of their use in industry, Clostridium strains are genetically modified.
Для проведения этих модификаций наиболее часто используемой методикой для всех видов микроорганизмов является гомологичная рекомбинация. Трансформация и гомологичная рекомбинация в некоторых микроорганизмах всесторонне описана в данной области техники. См., например (Datsenko and Wanner; PNAS, 2000) и (Fabret et al., Molecular Microbiology, 2002).To carry out these modifications, the most commonly used technique for all types of microorganisms is homologous recombination. Transformation and homologous recombination in certain microorganisms is comprehensively described in the art. See for example (Datsenko and Wanner; PNAS, 2000) and (Fabret et al., Molecular Microbiology, 2002).
Clostridia по своей природе не способны к трансформации, и существующие в настоящее время способы их трансформации являются неэффективными и не позволяют вносить множественные мутации. Это препятствует промышленным разработкам в данной области.Clostridia is inherently incapable of transformation, and current methods for their transformation are ineffective and do not allow multiple mutations to be introduced. This impedes industrial development in this area.
Обычно Clostridia продуцируют внеклеточные ДНКазы и рестрикционные ферменты, которые разрушают чужеродную ДНК до и после ее введения в клетки в целях проведения трансформации. Классические методы, основанные на введении ПЦР-фрагментов, которые хорошо работают во многих микроорганизмах, таких как E.coli или дрожжи, не выполняются в этих микроорганизмах, поскольку период полужизни вне клетки и внутри клетки такой ДНК-конструкции, которая подвергается рекомбинации, слишком мал и эффективность рекомбинации, как правило, низка. В других микроорганизмах эти трудности обойдены путем использования векторов, которые реплицируются в хозяине, увеличивая таким образом вероятность рекомбинационного события. Тем не менее, после завершения рекомбинационного события вектор, теперь несущий интактную последовательность ДНК-мишени, должен быть элиминирован. Эта проблема была разрешена в Lactococcus lactis (Biswas et al., J. Bacteriol., 1993) путем использования чувствительных к температуре репликонов, которые могут быть элиминированы при непермиссивной температуре. Ни один из векторов с такими характеристиками в настоящее время недоступен для Clostridia. Поэтому, конструирование мутантов в Clostridia до настоящего времени было очень трудоемким и зачастую безуспешным.Typically, Clostridia produce extracellular DNases and restriction enzymes that destroy foreign DNA before and after its introduction into cells in order to carry out the transformation. The classical methods based on the introduction of PCR fragments that work well in many microorganisms, such as E. coli or yeast, are not performed in these microorganisms, because the half-life outside the cell and inside the cell of such a DNA construct that undergoes recombination is too short and recombination efficiency is generally low. In other microorganisms, these difficulties are circumvented by the use of vectors that replicate in the host, thereby increasing the likelihood of a recombination event. However, after the completion of the recombination event, the vector, now carrying the intact sequence of the target DNA, must be eliminated. This problem has been resolved in Lactococcus lactis (Biswas et al., J. Bacteriol., 1993) by using temperature-sensitive replicons that can be eliminated at non-permissive temperature. None of the vectors with these characteristics are currently available for Clostridia. Therefore, the construction of mutants in Clostridia to date has been very laborious and often unsuccessful.
Об инактивации генов Clostridia сообщалось в следующих статьях (см. таблицу 1).Inactivation of Clostridia genes has been reported in the following articles (see table 1).
До настоящего времени инактивацию генов выполняли в Clostridia посредством трансформации с использованием кольцевой ДНК, которая не могла реплицироваться в штаммах-мишенях. Поскольку ДНКазы и эндонуклеазы рестрикции ДНК, присутствующие в Clostridia, быстро разрушают введенную ДНК и, как правило, частота рекомбинации в этом роду не очень высока, получение мутантов было очень трудоемким.To date, gene inactivation has been performed in Clostridia via transformation using circular DNA that could not replicate in target strains. Since DNA restriction enzymes and endonuclease DNAs present in Clostridia quickly destroy the introduced DNA and, as a rule, the recombination frequency in this genus is not very high, obtaining mutants was very difficult.
К тому же, все описанные до настоящего времени рекомбинантные штаммы (см. выше) устойчивы к MLS (макролид-линкозамид-стрептограмин) или хлорамфениколу, и соответствующие маркерные гены не могут быть удалены после осуществления рекомбинационного события. Это ограничивает количество возможных рекомбинаций количеством доступных маркеров устойчивости в этих бактериях максимум до 3. Кроме того, для промышленного применения этих бактерий, могло бы быть полезно иметь безмаркерные штаммы для того, чтобы избежать высвобождения генов устойчивости к антибиотикам в ферментационные среды.In addition, all the recombinant strains described so far (see above) are resistant to MLS (macrolide-lincosamide-streptogramin) or chloramphenicol, and the corresponding marker genes cannot be removed after the recombination event. This limits the number of possible recombinations by the number of available resistance markers in these bacteria to a maximum of 3. In addition, for the industrial use of these bacteria, it would be useful to have markerless strains in order to avoid the release of antibiotic resistance genes into fermentation media.
Более того, некоторые из этих штаммов, полученные в результате единичных рекомбинационных событий, имеют тот недостаток, что они не будут стабильны, если культивируются без какого-либо селекционного давления.Moreover, some of these strains resulting from single recombination events have the disadvantage that they will not be stable if cultivated without any selection pressure.
Следовательно, состояние данной области техники таково, что все еще существует необходимость в способе трансформации Clostridia с высокой эффективностью, с легкой в выполнении стадией селекции рекомбинантных штаммов, который позволяет осуществлять последующие замены последовательностей ДНК в одном и том же штамме, что приводит к получению рекомбинантных Clostridia, являющихся генетически стабильными и безмаркерными.Therefore, the state of the art is such that there is still a need for a method for transforming Clostridia with high efficiency, with an easy step to select recombinant strains, which allows subsequent replacement of DNA sequences in the same strain, which leads to the production of recombinant Clostridia being genetically stable and markerless.
Настоящее изобретение относится к новому способу замены или делетирования последовательности ДНК в Clostridia, легкому в выполнении и применимому в промышленном масштабе. Этот способ полезен для рутинной модификации нескольких генных локусов в Clostridia.The present invention relates to a new method for replacing or deleting a DNA sequence in Clostridia, easy to implement and applicable on an industrial scale. This method is useful for routine modification of several gene loci in Clostridia.
Этот способ основан на использовании репликативного вектора, полезного для трансформации Clostridia с высокой эффективностью.This method is based on the use of a replicative vector useful for transforming Clostridia with high efficiency.
С использованием этого нового способа в геном может быть введено неограниченное количество мутаций путем элиминирования кассет устойчивости из генома и повторного использования их в успешных раундах замены последовательности ДНК.Using this new method, an unlimited number of mutations can be introduced into the genome by eliminating resistance cassettes from the genome and reusing them in successful DNA sequence replacement rounds.
Эффективное введение множественных мутаций в Clostridia должно позволить промышленности улучшить существующие промышленные штаммы и разработать новые способы.The effective introduction of multiple mutations in Clostridia should allow the industry to improve existing industrial strains and develop new methods.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDESCRIPTION OF THE INVENTION
Согласно изобретению предложен способ замены последовательности ДНК-мишени посредством гомологичной рекомбинации в Clostridia, включающий:The invention provides a method for replacing a target DNA sequence by homologous recombination in Clostridia, comprising:
- трансформацию указанного штамма вектором, содержащим:- transformation of the specified strain by a vector containing:
- ориджин репликации, позволяющий осуществлять его репликацию в Clostridia, и- the origin of replication, allowing its replication in Clostridia, and
- замещающую кассету, содержащую первый маркерный ген, окруженный двумя последовательностями, гомологичными выбранным участкам вокруг последовательности ДНК-мишени, позволяющими осуществлять рекомбинацию данной кассеты, и- substitution cassette containing the first marker gene surrounded by two sequences homologous to selected regions around the target DNA sequence, allowing the recombination of this cassette, and
- второй маркерный ген,- second marker gene,
- селекцию штаммов с интегрированной в их геном указанной кассетой, которые экспрессируют первый маркерный ген,- selection of strains with the indicated cassette integrated into their genome, which express the first marker gene,
- селекцию штаммов с элиминированным указанным вектором, которые не экспрессируют второй маркерный ген.- selection of strains with eliminated the specified vector, which do not express the second marker gene.
Все молекулярно-биологические методики, используемые для реализации изобретения, полно описаны в Sambrook, Fritsch and Maniatis, "Molecular cloning: a laboratory manual", 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.All molecular biological techniques used to implement the invention are fully described in Sambrook, Fritsch and Maniatis, "Molecular cloning: a laboratory manual", 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
Используемый в контексте настоящего изобретения термин "замена" последовательности ДНК-мишени означает, что в локус последовательности ДНК-мишени вводят иную, нежели исходная, последовательность.As used in the context of the present invention, the term “replacement” of a target DNA sequence means that a different sequence than the original one is introduced into the locus of the target DNA sequence.
Согласно изобретению последовательность ДНК определяется как генная или межгенная последовательность. Обе они могут содержать промоторные или регуляторные последовательности.According to the invention, a DNA sequence is defined as a gene or intergenic sequence. Both of them may contain promoter or regulatory sequences.
Выражение "последовательность ДНК-мишени" обозначает любую интересуемую структуру, выбранную специалистом в данной области техники из гена, межгенного участка, промоторной или регуляторной последовательности. Так обозначаются, в частности, гены, кодирующие представляемые интерес белки, например ферменты, вовлеченные в клеточный метаболизм.The expression “target DNA sequence” means any structure of interest selected by one of ordinary skill in the art from a gene, intergenic region, promoter or regulatory sequence. This designates, in particular, genes encoding proteins of interest, for example, enzymes involved in cellular metabolism.
Замещающая/вставляемая последовательность ДНК может быть кодирующей или нет. Она может представлять собой мутированную последовательность гена-мишени, промоторную или регуляторную последовательность и/или маркер, как например ген устойчивости к антибиотику или дающий окраску фермент. Она может быть длиннее или короче замененной последовательности в зависимости от расстояния, разделяющего эти два гомологичных участка.The replacement / insertion DNA sequence may be coding or not. It can be a mutated sequence of a target gene, a promoter or regulatory sequence and / or a marker, such as an antibiotic resistance gene or a staining enzyme. It may be longer or shorter than the replaced sequence depending on the distance separating the two homologous regions.
Благодаря наличию вставки экспрессия гена-мишени обычно нарушается, частично или полностью подавляется или усиливается. Замена последовательности ДНК-мишени на последовательность, близкую первоначальной, но содержащую мутации, приводит к реальной экспрессии мутированного белка, промоторной или регуляторной последовательности.Due to the presence of the insert, the expression of the target gene is usually impaired, partially or completely suppressed or enhanced. Replacing the sequence of the target DNA with a sequence close to the original, but containing mutations, leads to real expression of the mutated protein, promoter or regulatory sequence.
Если в результате замены последовательности ДНК-мишени происходит полное элиминирование указанной последовательности ДНК, ген квалифицируется как "делетированный".If, as a result of replacing the target DNA sequence, complete elimination of the indicated DNA sequence occurs, the gene is qualified as "deleted".
Выражение "гомологичная рекомбинация" относится к событию замены сегмента ДНК другим таким сегментом, который имеет идентичные участки (гомологичные) или близкие к гомологичному. Это событие также называют кроссинговером ДНК.The expression "homologous recombination" refers to the event of replacing a DNA segment with another segment that has identical regions (homologous) or close to homologous. This event is also called DNA crossover.
Термин "трансформация" относится к инкорпорированию экзогенной нуклеиновой кислоты в клетку, при этом такое "приобретение" новых генов является временным (если вектор, несущий гены, "вылечивается") или постоянным (в том случае, если экзогенная ДНК интегрируется в хромосому).The term "transformation" refers to the incorporation of an exogenous nucleic acid into a cell, and such an "acquisition" of new genes is temporary (if the vector carrying the genes is "cured") or permanent (if the exogenous DNA integrates into the chromosome).
Термин "вектор" относится к внехромосомному элементу, несущему гены или кассеты, который обычно существует в форме кольцевых двухцепочечных молекул ДНК, но также может представлять собой одноцепочечную молекулу ДНК. Оба термина "вектор" и "плазмида" используются независимо.The term "vector" refers to an extrachromosomal element carrying genes or cassettes, which usually exists in the form of circular double-stranded DNA molecules, but can also be a single-stranded DNA molecule. Both terms "vector" and "plasmid" are used independently.
Вектором по изобретению является репликативный вектор. Он содержит по меньшей мере один ориджин репликации и предпочтительно несколько сайтов инициации репликации, что позволяет ему быть функционально активным в разных видах.The vector of the invention is a replicative vector. It contains at least one origin of replication and preferably several replication initiation sites, which allows it to be functionally active in different forms.
Особо предпочтительный вектор может содержать два сайта инициации репликации:A particularly preferred vector may contain two replication initiation sites:
- Ori, функционально активный в Е.coli,- Ori, functionally active in E. coli,
- RepL из pIM13, происходящего из В.subtilis, функционально активный в Clostridia (Mermelstein et al., Biotechnology, 1992).- RepL from pIM13 originating from B. subtilis, functionally active in Clostridia (Mermelstein et al., Biotechnology, 1992).
Выражение "последовательности, гомологичные последовательности ДНК-мишени" относится к последовательностям, имеющим большую схожесть последовательности с выбранными участками последовательности-мишени.The expression “sequences homologous to the target DNA sequences” refers to sequences having greater sequence similarity to selected portions of the target sequence.
Термин "маркерный ген" относится к последовательности, кодирующей маркерный белок под контролем регуляторных элементов, функционально активных в Clostridia. Такие белки общеизвестны в данной области техники. Например, специалист в данной области техники может использовать ген устойчивости к антибиотику, флуоресцентный или окрашивающий маркер или маркер ауксотрофности. Примеры полезных маркерных генов будут приведены ниже.The term "marker gene" refers to a sequence encoding a marker protein under the control of regulatory elements functionally active in Clostridia. Such proteins are well known in the art. For example, one skilled in the art may use an antibiotic resistance gene, a fluorescent or staining marker, or an auxotrophicity marker. Examples of useful marker genes will be given below.
Теперь, после осуществления рекомбинационного события, вектор несет интактную последовательность ДНК-мишени и поэтому должен быть элиминирован. Элиминирование репликативного вектора обычно происходит в последующих культурах клонов в результате негативной или позитивной селекции клонов, из которых этот вектор элиминирован. Элиминирование вектора также может представлять собой активную стадию этого способа с использованием эндонуклеаз, которые специфично расщепляют последовательности ДНК, присутствующие в векторе. Как только вектор "вылечивается", штаммы более не экспрессируют второй маркерный ген и могут быть отобраны по этой характеристике.Now, after the implementation of the recombination event, the vector carries the intact sequence of the target DNA and therefore must be eliminated. Elimination of the replicative vector usually occurs in subsequent cultures of clones as a result of negative or positive selection of clones from which this vector is eliminated. The elimination of the vector can also be an active step in this method using endonucleases that specifically cleave the DNA sequences present in the vector. Once the vector is "cured", the strains no longer express the second marker gene and can be selected by this characteristic.
В конкретном воплощении изобретения второй маркерный ген представляет собой ген устойчивости к антибиотику. Среди полезных генов устойчивости к антибиотику специалисту в данной области техники будет известен тот, который является наиболее соответствующим. Например, можно использовать следующие гены: ген CatP, дающий устойчивость к хлорамфениколу и тиамфениколу, или ген MLSR, дающий устойчивость к эритромицину.In a specific embodiment of the invention, the second marker gene is an antibiotic resistance gene. Among the useful antibiotic resistance genes, one skilled in the art will know which is most appropriate. For example, you can use the following genes: the CatP gene, which gives resistance to chloramphenicol and thiamphenicol, or the MLS R gene, which gives resistance to erythromycin.
В предпочтительном воплощении изобретения второй маркерный ген представляет собой встречно-селектируемый маркерный (counter-selective marker) ген.In a preferred embodiment of the invention, the second marker gene is a counter-selective marker gene.
Встречно-селектируемым маркером является ген, присутствие которого летально для микроорганизма-хозяина в некоторых случаях, как например присутствие родственного ему субстрата. Встречно-селектируемые маркеры могут быть использованы в качестве позитивной селекции на предмет утраты плазмиды.A counter-selectable marker is a gene whose presence is lethal to the host microorganism in some cases, such as the presence of a related substrate. Anti-selectable markers can be used as positive selection for plasmid loss.
Предпочтительно, чтобы встречно-селектируемым маркерным геном являлся ген, который восстанавливает активность отсутствующего или делетированного несущественного эндогенного гена.Preferably, the counter-selectable marker gene is a gene that restores the activity of an absent or deleted non-essential endogenous gene.
Наиболее часто используемыми встречно-селектируемыми маркерами являются гены, которые придают чувствительность к сахарозе, стрептомицину или фузаровой кислоте. Они использованы для конструирования мутантов или вакцинных штаммов в нескольких бактериальных штаммах. Для подробного рассмотрения см. обзор Reyrat et at., 1998, Infection and Immunity. Встречно-селектируемые маркеры, которые можно использовать в Clostridia, включают гены, дающие чувствительность к 5-фтор-урацилу (5-FU), гамма-глутамилгидразиду (GBS) или 8-аза-2,6-диаминопурину (8ADP).The most commonly used counter-selectable markers are genes that confer sensitivity to sucrose, streptomycin or fusaric acid. They are used to construct mutants or vaccine strains in several bacterial strains. See Reyrat et at., 1998, Infection and Immunity for a detailed discussion. Anti-selectable markers that can be used in Clostridia include genes that are sensitive to 5-fluoro-uracil (5-FU), gamma-glutamyl hydrazide (GBS), or 8-aza-2,6-diaminopurine (8ADP).
В предпочтительном воплощении встречно-селектируемый маркер представляет собой ген upp, кодирующий урацил-фосфорибозилтрансферазу, которая способствует превращению 5-фторурацила (5-FU) в токсичный продукт. Клетки, обладающие Upp-активностью, не могут расти на 6-FU-содержащей среде.In a preferred embodiment, the counter-selectable marker is the upp gene encoding uracil phosphoribosyl transferase, which promotes the conversion of 5-fluorouracil (5-FU) into a toxic product. Cells with Upp activity cannot grow on 6-FU-containing medium.
Использование этого встречно-селектируемого маркера, в частности, полезно, когда трансформированные Clostridia представляют собой Δupp и поэтому способны расти на содержащей 5-FU среде перед трансформацией и после элиминирования вектора. Штаммы с элиминированным вектором могут быть позитивно отселектированы.The use of this counter-selectable marker is particularly useful when transformed Clostridia are Δupp and therefore are able to grow on a 5-FU containing medium before transformation and after elimination of the vector. Eliminated vector strains can be positively selected.
Супрессорные мутации, которые могут появиться в гене upp в присутствии 5-FU, иногда могут приводить к ошибочным предположениям касательно утраты плазмиды. В предпочтительном воплощении изобретения вектор дополнительно содержит третий маркер, предпочтительно ген устойчивости к антибиотику, который дает возможность проведения второй селекции штаммов, чувствительных к антибиотику. Такая негативная селекция может быть использована в дополнение к позитивной селекции, основанной на гене upp.Suppressor mutations that can appear in the upp gene in the presence of 5-FU can sometimes lead to erroneous assumptions regarding plasmid loss. In a preferred embodiment of the invention, the vector further comprises a third marker, preferably an antibiotic resistance gene, which enables a second selection of antibiotic sensitive strains. Such negative selection can be used in addition to positive selection based on the upp gene.
В предпочтительном воплощении изобретения вектор элиминируется в результате переваривания эндонуклеазами после осуществления рекомбинационного события. Предпочтительно, вектор несет последовательности ДНК, которые распознаются рестрикционными эндонуклеазами и которые вместе с тем отсутствуют в геноме используемого вида Clostridium. Следовательно, вектор специфически разрушается без потери целостности генома Clostridium.In a preferred embodiment of the invention, the vector is eliminated by digestion with endonucleases after the implementation of the recombination event. Preferably, the vector carries DNA sequences that are recognized by restriction endonucleases and which, however, are missing from the genome of the used species of Clostridium. Therefore, the vector is specifically destroyed without loss of integrity of the Clostridium genome.
Рестрикционные эндонуклеазы представляют собой ферменты, которые расщепляют молекулы ДНК по положению конкретных последовательностей оснований, рестрикционному сайту эндонуклеазы. Специалист в данной области способен определить, сайт какой рестрикционной эндонуклеазы отсутствует в геноме представляющего интерес штамма Clostridium. Возможными рестрикционными эндонуклеазами, которые могут быть использованы для С.acetobutylicum, являются AscI, FseI, NotI, SfiI, SrfI. В другом воплощении могут быть использованы мегануклеазы, которые распознают большие (12-45 п.о.) сайты ДНК-мишеней, такие как I-SceI, НО или I-CreI.Restriction endonucleases are enzymes that cleave DNA molecules at the position of specific base sequences, the restriction site of the endonuclease. The person skilled in the art is able to determine which restriction endonuclease site is missing in the genome of the Clostridium strain of interest. Possible restriction endonucleases that can be used for C. acetobutylicum are AscI, FseI, NotI, SfiI, SrfI. In another embodiment, meganucleases that recognize large (12-45 bp) target DNA sites, such as I-SceI, HO or I-CreI, can be used.
В предпочтительном воплощении изобретения штамм Clostridium, который должен быть трансформирован, несет в своем геноме по меньшей мере один ген, кодирующий эндонуклеазу, которая распознает рестрикционной сайт эндонуклеазы, присутствующий в векторе. Возможно, что экспрессия рестрикционной эндонуклеазы находится под контролем индуцибельного промотора.In a preferred embodiment of the invention, the Clostridium strain to be transformed carries at least one gene encoding an endonuclease in its genome that recognizes the restriction site of the endonuclease present in the vector. It is possible that the expression of restriction endonuclease is under the control of an inducible promoter.
Индуцибельный промотор представляет собой элемент ДНК, который позволяет протекать экспрессии последовательности-мишени, обусловленной добавлением соответствующего индуктора. Например, система индуцибельного промотора в Clostridium, известная специалисту в данной области, описана в Girbal et al., 2003, Appl. Env. Microbiol. 69: 4985-8.An inducible promoter is a DNA element that allows expression of a target sequence due to the addition of an appropriate inducer. For example, the inducible promoter system in Clostridium, known to the person skilled in the art, is described in Girbal et al., 2003, Appl. Env. Microbiol. 69: 4985-8.
После осуществления рекомбинационного события и перед скринингом штаммов, в которых должен быть элиминирован вектор, можно индуцировать экспрессию рестрикционной эндонуклеазы. Рестрикционная эндонуклеаза будет расщеплять вектор, присутствующий в Clostridia, что приведет к его элиминированию.After the recombination event has occurred and before screening for the strains in which the vector is to be eliminated, expression of a restriction endonuclease can be induced. Restriction endonuclease will cleave the vector present in Clostridia, which will lead to its elimination.
Возможно, что ген, кодирующий рестрикционную эндонуклеазу, может быть вставлен в геном перед введением вектора в этот штамм.It is possible that a gene encoding a restriction endonuclease can be inserted into the genome before introducing a vector into this strain.
В другом воплощении изобретения ген, кодирующий рестрикционную эндонуклеазу, также может увеличивать частоту рекомбинации перед элиминированием плазмиды путем увеличения количества линейной ДНК в клетках, которая, как известно, подвергается рекомбинации лучше, чем кольцевая ДНК.In another embodiment of the invention, a restriction endonuclease encoding gene can also increase the recombination frequency before eliminating the plasmid by increasing the amount of linear DNA in the cells, which is known to undergo recombination better than ring DNA.
В конкретном воплощении изобретения первым маркерным геном является ген устойчивости к антибиотику, введенный в середину замещающей кассеты.In a specific embodiment of the invention, the first marker gene is an antibiotic resistance gene inserted in the middle of the replacement cassette.
В специфическом воплощении изобретения этот первый маркерный ген может быть удален из генома трансформированных штаммов Clostridium. В частности, первый маркерный ген может быть окружен двумя рекомбиназными сайтами-мишенями и затем элиминирован под действием рекомбиназы после того, как произошел акт гомологичной рекомбинации.In a specific embodiment of the invention, this first marker gene can be deleted from the genome of transformed Clostridium strains. In particular, the first marker gene can be surrounded by two recombinase target sites and then eliminated by the action of recombinase after the act of homologous recombination.
В предпочтительном воплощении изобретения рекомбиназа экспрессируется вторым вектором, несущим соответствующий ген, при этом указанный вектор введен в Clostridia в результате трансформации.In a preferred embodiment of the invention, the recombinase is expressed by a second vector carrying the corresponding gene, wherein said vector is introduced into Clostridia as a result of transformation.
Предпочтительно, чтобы рекомбиназными сайтами-мишенями были FRT (Flippase Recognition Target)-последовательности (распознаваемые флиппазой последовательности-мишени). Рекомбиназа FLP (флиппаза) из Saccharomyces cerevisiae является активной для конкретной, состоящей из 34 пар оснований последовательности ДНК, обозначаемой как FRT-последовательность (мишень для рекомбиназы FLP). Если присутствуют два из этих FRT-сайтов, то фермент FLP производит двухцепочечные разрывы в цепях ДНК, обменивает концы первой FRT с концами второй последовательности-мишени и затем вновь соединяет помененные цепи. Этот процесс приводит к делетированию ДНК, которая лежит между этими двумя сайтами.Preferably, the recombinase target sites are FRT (Flippase Recognition Target) sequences (recognized by the flippase of the target sequence). Recombinase FLP (flippase) from Saccharomyces cerevisiae is active for a particular 34-base DNA sequence designated as FRT sequence (target for FLP recombinase). If two of these FRT sites are present, then the FLP enzyme produces double-stranded breaks in the DNA chains, exchanges the ends of the first FRT with the ends of the second target sequence, and then reconnects the changed chains. This process leads to the deletion of the DNA that lies between these two sites.
В конкретном способе реализации изобретения, последовательности, гомологичные выбранным участкам около последовательности ДНК-мишени, могут содержать мутации, затрагивающие вплоть до 10% пар оснований, включая фрагмент ДНК, используемый для рекомбинационного события.In a particular embodiment of the invention, sequences homologous to selected regions near the target DNA sequence may contain mutations affecting up to 10% base pairs, including the DNA fragment used for the recombination event.
В предпочтительном воплощении изобретения штаммы Clostridium, которые должны быть трансформированы, имеют делеции в генах, кодирующих рестрикционные эндонуклеазы. Эти штаммы выгодны тем, что их легко трансформировать без какого-либо предварительного метилирования плазмиды in vivo.In a preferred embodiment of the invention, the Clostridium strains to be transformed have deletions in the genes encoding restriction endonucleases. These strains are advantageous in that they are easily transformed without any prior methylation of the plasmid in vivo.
В другом предпочтительном воплощении изобретения штаммы Clostridium, которые должны быть трансформированы, имеют делеции в генах, кодирующих внеклеточные ДНКазы.In another preferred embodiment of the invention, the Clostridium strains to be transformed have deletions in genes encoding extracellular DNAse.
В другом воплощении изобретения штаммы Clostridium, которые должны быть трансформированы, имеют делеции в гене upp.In another embodiment of the invention, the Clostridium strains to be transformed have deletions in the upp gene.
В другом предпочтительном воплощении изобретения штаммы Clostridium, которые должны быть трансформированы, выбраны среди Clostridium acetobutylicum, Clostridium bejeirinckii, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium butylicum, Clostridium butyricum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium sporogenes, Clostridium thermocellum, Clostridium saccharolyticum (теперь Thermoanaerobacter saccharolyticum), Clostridium thermosulfurogenes (теперь Thermoanaerobacter thermosulfurigenes), Clostridium thermohydrosulfuricum (теперь Thermoanaerobacter ethanolicus).In another preferred embodiment, strains of Clostridium, to be transformed are chosen among Clostridium acetobutylicum, Clostridium bejeirinckii, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium butylicum, Clostridium butyricum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium sporogenes, Clostridium thermocellum, Clostridium saccharolyticum (now the Thermoanaerobacter saccharolyticum), Clostridium thermosulfurogenes (now Thermoanaerobacter thermosulfurigenes), Clostridium thermohydrosulfuricum (now Thermoanaerobacter ethanolicus).
Предпочтительным штаммом Clostridium является Clostridium acetobutylicum.A preferred strain of Clostridium is Clostridium acetobutylicum.
В предпочтительном воплощении изобретения штаммом Clostridium acetobutylicum, который должен быть трансформирован, является штамм Δ Сас15, имеющий делецию в гене, кодирующем рестрикционную эндонуклеазу Сас 824I. Этот штамм выгоден тем, что его легко трансформировать без какого-либо предварительного метилирования плазмиды in vivo.In a preferred embodiment of the invention, the strain of Clostridium acetobutylicum to be transformed is strain ΔCac15 having a deletion in the gene encoding the restriction endonuclease Cac 824I. This strain is advantageous in that it is easy to transform without any prior methylation of the plasmid in vivo.
В другом предпочтительном воплощении изобретения штаммом Clostridium acetobutylicum, который должен быть трансформирован, является штамм, имеющий делецию в гене upp, обозначаемый как Δ upp. В результате, трансформация этого штамма вектором, несущим ген upp, позволяет осуществлять селекцию штаммов, чувствительных к 5-ри-содержащей среде, и после этого позитивную селекцию штаммов, утративших плазмиду, которые более нечувствительны к S-FU-содержащей среде.In another preferred embodiment of the invention, the strain of Clostridium acetobutylicum to be transformed is a strain having a deletion in the upp gene designated Δ upp. As a result, transformation of this strain with a vector carrying the upp gene allows selection of strains that are sensitive to 5-containing medium, and then positive selection of strains that have lost the plasmid, which are more insensitive to S-FU-containing medium.
Штаммом Clostridium acetobutylicum, который должен быть трансформирован, также может быть Δ Сас15 Δ upp.The strain Clostridium acetobutylicum, which must be transformed, can also be ΔCac15 Δ upp.
Этот способ предпочтительно используют для последующей замены двух или более генов-мишеней посредством гомологичной рекомбинации в одном и том же штамме Clostridium.This method is preferably used for subsequent replacement of two or more target genes by homologous recombination in the same strain of Clostridium.
Настоящее изобретение также относится к рекомбинантному штамму Clostridium, допускающему его получение в соответствии со способом по изобретению. Предпочтительно, что способ по изобретению может быть использован для получения рекомбинантных штаммов Clostridium, где ген сас15 был делетирован (штамм Δсас15), где ген upp был делетирован (штамм Δupp) и где оба гена сас15 и upp были делетированы (штамм ΔСас15 Δupp). Настоящее изобретение также относится к вектору для трансформации данного штамма, как например описано выше.The present invention also relates to a recombinant strain of Clostridium, allowing its production in accordance with the method according to the invention. Preferably, the method of the invention can be used to produce recombinant Clostridium strains, where the cac15 gene was deleted (strain Δcac15), where the upp gene was deleted (strain Δupp) and where both the cac15 and upp genes were deleted (strain ΔCac15 Δupp). The present invention also relates to a vector for transformation of a given strain, as for example described above.
ИЗЛОЖЕНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВSTATEMENT OF GRAPHIC MATERIALS
Фиг.1. Карта вектора pUC18-FRT-MLS2.Figure 1. PUC18-FRT-MLS2 vector map.
Фиг.2. Карта вектора pCons2-1.Figure 2. PCons2-1 vector map.
Фиг.3. Карта вектора pCIP2-1.Figure 3. PCIP2-1 vector map.
Фиг.4. Карта вектора pCons::UPP.Figure 4. PCons :: UPP. Vector Map
Фиг.5. Карта вектора pCLF1.Figure 5. PCLF1 vector map.
Фиг.6. Схематическое представление метода внесения делеций для Clostridia.6. Schematic representation of the deletion method for Clostridia.
Следующие далее стадии выполняются последовательно:The following steps are performed sequentially:
А - амплификация двух выбранных участков около последовательности ДНК-мишени; 1, 2, 3, 4 представляют собой ПЦР-праймеры;A — amplification of two selected regions near the target DNA sequence; 1, 2, 3, 4 are PCR primers;
В - клонирование полученных ПЦР-фрагментов в клонирующий вектор рТОРО;B - cloning of the obtained PCR fragments into the cloning vector rTORO;
С - вставка маркера в сайт рестрикции StuI, присутствующий в ПЦР-праймерах;C is the insertion of a marker into the StuI restriction site present in PCR primers;
D - клонирование замещающей кассеты в BamHI-сайт pCONS 2.1: конструирование вектора pREP cloY;D — cloning of the replacement cassette into the pCONS 2.1 BamHI site: construction of the pREP cloY vector;
Е - трансформация Clostridium вектором pREP cloY;E - transformation of Clostridium by the vector pREP cloY;
F - хромосомная интеграция замещающей кассеты посредством двойного кроссинговера в процессе субкультивирования;F - chromosome integration of the replacement cassette through double crossing over in the process of subculture;
G - скрининг клонов с фенотипами EryR и ThiamS;G - screening of clones with phenotypes Ery R and Thiam S ;
Н - ПЦР-анализ с целью контроля на предмет замены гена и утраты плазмиды;H - PCR analysis for the purpose of monitoring for gene replacement and plasmid loss;
илиor
D' - клонирование замещающей кассеты в BamHI-сайт pCONS::UPP: конструирование вектора pREP cloY:UPP;D '- cloning of the replacement cassette into the BamHI site pCONS :: UPP: construction of the vector pREP cloY: UPP;
Е' - трансформация Clostridium Δupp вектором pREP cloY: UPP;E 'is the transformation of Clostridium Δupp by the vector pREP cloY: UPP;
F' - хромосомная интеграция замещающей кассеты посредством двойного кроссинговера в процессе субкультивирования;F '- chromosome integration of the replacement cassette through double crossing over in the process of subculture;
G' -скрининг клонов с фенотипами EryR и 5-FUR (ThiamS);G 'screening of clones with phenotypes Ery R and 5-FU R (Thiam S );
Н' - ПЦР-анализ с целью контроля на предмет замены гена и утраты плазмиды.H '- PCR analysis to control for gene replacement and plasmid loss.
ПРИМЕРЫEXAMPLES
Пример 1. Конструирование векторовExample 1. Construction of vectors
1.1. Конструирование pUC18-FRT-MLS21.1. Construction of pUC18-FRT-MLS2
Эта плазмида содержит ген MLSr, функционально активный в Clostridia и фланкированный двумя FRT-сайтами и двумя StuI-сайтами и полезный для конструирования замещающих кассет. Обращенную полимеразную цепную реакцию (ОПЦР) проводили, используя ДНК-полимеразу Pwo с pKD4 в качестве матричной плазмиды (Datsenko и Wanner, 2000) и олигонуклеотиды PKD4.1 и PKD4.2 в качестве праймеров для амплификации участка плазмиды с FRT-сайтами, но без маркера Kmr. Этот дефосфорилированный на конце фрагмент позже лигировали с геном MLSr, полученным после переваривания с помощью HindIII плазмиды pETSPO (Harris et al., 2002, J. Bacteriol.) и обработки фрагментом Кленова. Затем использовали соответствующую плазмиду (pKD4-Ery1) в качестве матрицы для амплификации гена MLSr, фланкированного двумя FRT-сайтами и двумя StuI-сайтами, в ПЦР-реакции, используя олигонуклеотиды FRT-MLSR-F и FRT-MLSR-R в качестве праймеров и ДНК-полимеразу Pwo. Это фрагмент клонировали непосредственно в переваренную с помощью SmaI (плазмиду) pUC18, получая плазмиду pUC18-FRT-MLS2 (Фиг.1).This plasmid contains the MLS r gene, functionally active in Clostridia and flanked by two FRT sites and two StuI sites and useful for constructing replacement cassettes. Reverse polymerase chain reaction (PCR) was performed using Pwo DNA polymerase with pKD4 as the template plasmid (Datsenko and Wanner, 2000) and oligonucleotides PKD4.1 and PKD4.2 as primers for amplification of the plasmid region with FRT sites, but without marker Km r . This end-dephosphorylated fragment was later ligated to the MLS r gene obtained after digestion with the HindIII plasmid pETSPO (Harris et al., 2002, J. Bacteriol.) And treatment with the Klenov fragment. Then, the corresponding plasmid (pKD4-Ery1) was used as a template for amplification of the MLS r gene, flanked by two FRT sites and two StuI sites, in the PCR reaction using oligonucleotides FRT-MLSR-F and FRT-MLSR-R as primers and Pwo DNA polymerase. This fragment was cloned directly into pUC18 digested with SmaI (plasmid) to obtain plasmid pUC18-FRT-MLS2 (Figure 1).
ПЦР-праймеры:PCR primers:
1.2. Конструирование pCons 2.11.2. Design pCons 2.1
Эта плазмида содержит ориджин репликации pIM13, функционально активный в Clostridia (репликация по механизму "катящегося кольца"), ген catP, дающий устойчивость к тиамфениколу, и уникальный BamHI-сайт для клонирования замещающей кассеты. Эту плазмиду конструировали с использованием двухстадийной процедуры из плазмиды pETSPO (Harris et al., 2002, J. Bacteriol.) с удалением части полилинкера и, среди прочих, BamHI- и EcoRI-сайта. ОПЦР проводили с использованием ДНК-полимеразы Pwo с pETSPO в качестве матричной плазмиды и с олигонуклеотидами PCONSAccI и PCONSEcoRI в качестве праймеров, и ПЦР-продукт фосфорилировали и лигировали. После трансформации E.coli получали плазмиду pCons0. Затем эту плазмиду переваривали с использованием BamHI для удаления кассеты spo0A, нужный фрагмент ДНК очищали и лигировали, получая плазмиду pCons2-1. Карта pCons2-1 приведена на Фиг.2.This plasmid contains the origin of pIM13 replication, functionally active in Clostridia (“rolling ring” replication), the catP gene giving resistance to thiamphenicol, and a unique BamHI site for cloning a replacement cassette. This plasmid was constructed using a two-step procedure from the pETSPO plasmid (Harris et al., 2002, J. Bacteriol.) To remove part of the polylinker and, among others, the BamHI and EcoRI sites. OPCR was performed using Pwo DNA polymerase with pETSPO as a template plasmid and with oligonucleotides PCONSAccI and PCONSEcoRI as primers, and the PCR product was phosphorylated and ligated. After transformation of E. coli, plasmid pCons0 was obtained. Then this plasmid was digested using BamHI to remove the spo0A cassette, the desired DNA fragment was purified and ligated to obtain plasmid pCons2-1. The pCons2-1 map is shown in FIG. 2.
ПЦР-праймеры:PCR primers:
1.3. Конструирование вектора pCIP2-11.3. Construction of the pCIP2-1 Vector
В этом конструировании ориджин репликации р1М13 из pCons2-1 заменяли на ориджин репликации плазмиды pSOL1, плазмиды с θ-механизмом репликации. Для этого ориджин репликации pSOL1 подвергали ПЦР-амплификации с использованием ДНК-полимеразы Pwo, применяя суммарную ДНК С.acetobutylicum в качестве матрицы и олигонуклеотиды ori-3-D и ori-4-R в качестве праймеров. Этот ПЦР-продукт клонировали в pCR-Bluntll-TOPO, полученную плазмиду переваривали, используя EcoRI, и очищали фрагмент размером 2,2 т.п.о. Аналогично, плазмиду pCons2.1 переваривали, используя EcoRI, очищали фрагмент размером 2,4 т.п.о. и лигировали его с 2,2 т.п.о. EcoRI фрагментом, содержащим ориджин репликации от pSOL1, получая плазмиду pCIP2-1 (Фиг.3).In this design, the origin of replication p1M13 from pCons2-1 was replaced by the origin of replication of plasmid pSOL1, plasmid with θ-replication mechanism. For this, the origin of replication pSOL1 was subjected to PCR amplification using Pwo DNA polymerase using total DNA of C. acetobutylicum as a template and ori-3-D and ori-4-R oligonucleotides as primers. This PCR product was cloned into pCR-Bluntll-TOPO, the resulting plasmid was digested using EcoRI, and a 2.2 kb fragment was purified. Similarly, the plasmid pCons2.1 was digested using EcoRI, a 2.4 kb fragment was purified. and ligated it with 2.2 kb EcoRI fragment containing the origin of replication from pSOL1, obtaining the plasmid pCIP2-1 (Figure 3).
ПЦР-праймеры:PCR primers:
1.4. Конструирование вектора pCons::upp1.4. PCons :: upp vector construction
Ген upp, имеющий собственный сайт связывания с рибосомой (rbs; ribosome binding site), клонировали в pCons2.1 по BcgI-сайту, расположенному сразу вниз по течению от гена CatP, с целью конструирования искусственного оперона с upp, экспрессируемым под контролем промотора CatP. Таким образом, не было введено никаких гомологичных участков, которые бы сделали возможной хромосомную интеграцию гена upp в штамм Δсас15Δupp в последующих экспериментах по внесению делеций, в которых ген upp используют в качестве встречно-селектируемого маркера на предмет утраты плазмиды.The upp gene, which has its own ribosome binding site (rbs; ribosome binding site), was cloned into pCons2.1 at the BcgI site located immediately upstream of the CatP gene in order to construct an artificial operon with upp expressed under the control of the CatP promoter. Thus, no homologous regions were introduced that would allow chromosome integration of the upp gene into the Δcac15Δupp strain in subsequent deletion experiments, in which the upp gene is used as an anti-selectable marker for plasmid loss.
Ген upp вместе с его rbs подвергали ПЦР(Pfu)-амплификации из геномной ДНК С.acetobutylicum, используя олигонуклеотиды REP-UPP F и REP-UPP R в качестве праймеров. ПЦР-продукт в 664 п.о. переваривали, используя PvuII, клонировали в pCons2.1, переваренный с помощью Bcgl, и обрабатывали ДНК-полимеразой Т4 с получением дефосфорилированных концов. Таким образом, получали репликативный вектор pCons::UPP (см. Фиг.4).The upp gene, along with its rbs, was subjected to PCR amplification (Pfu) amplification from C. acetobutylicum genomic DNA using REP-UPP F and REP-UPP R oligonucleotides as primers. 664 bp PCR product digested using PvuII, cloned into pCons2.1 digested with Bcgl, and treated with T4 DNA polymerase to obtain dephosphorylated ends. Thus, the replicative vector pCons :: UPP was obtained (see Figure 4).
ПЦР-праймеры:PCR primers:
REP-UPP F (SEQ ID №9): 5'-aaaacagctgggaggaatgaaataatgagtaaagttacac-3'REP-UPP F (SEQ ID NO: 9): 5'-aaaacagctgggaggaatgaaataatgagtaaagttacac-3 '
REP-UPP R (SEQ ID №10); 5'-aaaacagctgttattttgtaccgaataatctatctccagc-3'REP-UPP R (SEQ ID No. 10); 5'-aaaacagctgttattttgtaccgaataatctatctccccagc-3 '
1.5. Конструирование вектора pCLF11.5. Construction of the pCLF1 Vector
Ген FLP1 S.cerevisiae, кодирующий рекомбиназу FLP, клонировали в вектор pCons2.1 под контролем промотора и RBS из гена тиолазы (thI) из С.acetobutylicum, что обуславливает высокий уровень экспрессии в этом микроорганизме.The S. cerevisiae FLP1 gene encoding the FLP recombinase was cloned into the pCons2.1 vector under the control of a promoter and RBS from the thiolase (thI) gene from C. acetobutylicum, which causes a high level of expression in this microorganism.
Ген FLP1 подвергали ПЦР(Pfu)-амплификации, используя олигонуклеотиды FLP1-D и FLP1-R в качестве праймеров и плазмиду рСР20 (Datsenko и Wanner, 2000) в качестве матрицы.The FLP1 gene was subjected to PCR amplification (Pfu) amplification using oligonucleotides FLP1-D and FLP1-R as primers and plasmid pCP20 (Datsenko and Wanner, 2000) as a template.
ПЦР-праймеры:PCR primers:
-FLP1-D (SEQ ID №11): 5'-aaaaggatccaaaaggagggattaaaatgccacaatttggtatattatgtaaaacaccacct-3'-FLP1-D (SEQ ID No. 11): 5'-aaaaggatccaaaaggagggattaaaatgccacaatttggtatattatgtaaaacaccacct-3 '
-FLP1-R (SEQ ID №12): 5'-aaatggcgccgcgtacttatatgcgtctatttatgtaggatgaaaggta-3'-FLP1-R (SEQ ID No. 12): 5'-aaatggcgccgcgtacttatatgcgtctatttatgtaggatgaaaggta-3 '
FLP1-D имеет удлиняющий сегмент на 5'-конце, включающий BamIII-сайт и RBS-последовательность от thI.FLP1-D has an extension segment at the 5'-end, including the BamIII site and the RBS sequence from thI.
С использованием FLP1-R вводили SfoI-сайт в 3'-конец ПЦР-продукта.Using FLP1-R, the SfoI site was introduced at the 3'-end of the PCR product.
ПЦР-продукт переваривали, используя BamHI и SfoI, и напрямую клонировали в экспрессирующий вектор pSOS95, который был переварен теми же ферментами, получая плазмиду pEX-FLP1 (6281 п.о.).The PCR product was digested using BamHI and SfoI and directly cloned into the pSOS95 expression vector, which was digested with the same enzymes, to obtain the plasmid pEX-FLP1 (6281 bp).
Фрагмент SalI (1585 п.о.) pEX-FLP1, содержащий FLPI-экспрессирующую касету, клонировали по SalI-сайту pCONS2.1 для получения плазмиды pCLF1 (4878 п.о.) (Фиг.5).The SalI fragment (1585 bp) of pEX-FLP1 containing the FLPI-expressing cassette was cloned at the pCONS2.1 SalI site to obtain plasmid pCLF1 (4878 bp) (Figure 5).
Пример 2. Делетирование гена сас1502, кодирующего рестрикционный фермент сас824I в Clostridium acetobutylicumExample 2. The deletion of the gene cas1502, encoding the restriction enzyme cas824I in Clostridium acetobutylicum
Для схематического представления данного способа см. Фиг.6.For a schematic representation of this method, see FIG. 6.
Два фрагмента ДНК, окружающие ген, кодирующий Сас824I, (САС1502) подвергали ПЦР-амплификации с использованием ДНК-полимеразы Pwo, применяя суммарную ДНК из С.acetobutylicum в качестве матрицы и две специфические пары олигонуклеотидов в качестве праймеров (см. Таблицу 2). Используя пары праймеров САС 1В-САС 2 и САС 3-САС 4В, получали ДНК-фрагменты 1493 п.о. и 999 п.о., соответственно. С использованием обоих праймеров САС 1В и САС 4В вводят SamHI-сайт, тогда как праймеры САС 2 и САС 3 имеют комплементарные удлиненные с 5'-конца последовательности, с помощью которых вводят StuI-сайт. ДНК-фрагменты САС 1 В-САС 2 и САС 3-САС 4 В соединяли в эксперименте по ПЦР-слиянию, используя праймеры САС 1В и САС 4В, и полученный фрагмент клонировали в вектор pCR4-TOPO-Blunt, получая рТОРО:сас15. По уникальному StuI-сайту рТОРО:сас15 вводили StuI-фрагмент размером 1372 п.о. от pUC18-FRT-MLS2, несущий ген устойчивости к антибиотикам MLSr с FRT-последовательностями по обеим сторонам. Замещающую кассету сас1502, полученную после переваривания полученной плазмиды с помощью BamHI, клонировали по BamHI-сайту в pCons2-1, получая плазмиду pREPCAC15, и в pCIP2.1, получая pCIPCAC15.Two DNA fragments surrounding the gene encoding Cac824I (CAC1502) were PCR amplified using Pwo DNA polymerase using total DNA from C. acetobutylicum as a template and two specific pairs of oligonucleotides as primers (see Table 2). Using pairs of primers CAC 1B-
Плазмиды pREPCAC15 и pCIPCAC15 метилировали in vivo и использовали для трансформации С.acetobutylicum путем электропорации. После селекции на чашках Петри на предмет клонов, устойчивых к эритромицину (40 мкг/мл), по одной колонии от каждого из трансформантов культивировали в течение 24 часов в жидкой синтетической среде с эритромицином в концентрации 40 мкг/мл и затем субкультивировали в жидкой среде 2YTG без антибиотика. Соответствующие разведения наносили на обогащенный агар для клостридий (RCA) с эритромицином в концентрации 40 мкг/мл. Для селекции интегрантов, утративших векторы pREPCAC15 или pCIPCAC15, устойчивые к эритромицину клоны наносили методом реплик как на RCA с эритромицином в концентрации 40 мкг/мл, так и на RCA с тиамфениколом в концентрации 50 мкг/мл. В то время как с использованием трансформантов pREPCAC15 было получено несколько колоний с желаемым фенотипом, никаких таких колоний при использовании трансформантов pCIPCAC15 получено не было. Этот факт демонстрирует, что θ-механизм репликации pCIPCAC15 в меньшей степени подходит для того, чтобы способствовать двойному кроссинговеру в С.acetobutylicum, нежели механизм "катящегося кольца". Генотип клонов, устойчивых к эритромицину и чувствительных к тиамфениколу, проверяли ПЦР-анализом (используя праймеры САС 0 и САС 5, локализованные вне замещающей кассеты САС15, и праймеры САС D и САС R, локализованные внутри сас1502). Штаммы Δcac15::mlsR, утратившие pREPCAC15, выделяли.Plasmids pREPCAC15 and pCIPCAC15 were methylated in vivo and used to transform C.acetobutylicum by electroporation. After selection on Petri dishes for clones resistant to erythromycin (40 μg / ml), one colony from each of the transformants was cultured for 24 hours in a liquid synthetic medium with erythromycin at a concentration of 40 μg / ml and then subcultured in 2YTG liquid medium without antibiotic. Appropriate dilutions were applied to enriched clostridia agar (RCA) with erythromycin at a concentration of 40 μg / ml. For the selection of integrants that have lost the pREPCAC15 or pCIPCAC15 vectors, erythromycin-resistant clones were applied by replica both on RCA with erythromycin at a concentration of 40 μg / ml, and on RCA with thiamphenicol at a concentration of 50 μg / ml. While several colonies with the desired phenotype were obtained using pREPCAC15 transformants, no such colonies were obtained using pCIPCAC15 transformants. This fact demonstrates that the θ replication mechanism of pCIPCAC15 is less suitable for promoting double crossing over in C. acetobutylicum than the rolling ring mechanism. The genotype of erythromycin-resistant and thiamphenicol-sensitive clones was verified by PCR analysis (using CAC 0 and
Штамм Δcac15::mlsR трансформировали вектором pCLF1, экспрессирующим ген FLP1, кодирующий рекомбиназу Flp из S.cerevisiae. После трансформации и селекции на предмет устойчивости к тиамфениколу (50 мкг/мл) на чашках Петри одну колонию культивировали на синтетической жидкой среде с тиамфениколом в концентрации 50 мкг/мл и соответствующие разведения наносили на RCA с тиамфениколом в концентрации 50 мкг/мл. Тиамфеникол-устойчивые клоны наносили методом реплик как на RCA с эритромицином в концентрации 40 мкг/мл, так и на RCA с тиамфениколом в концентрации 50 мкг/мл. Генотип клонов с чувствительностью к эритромицину и устойчивостью к тиамфениколу проверяли ПЦР-анализом, используя праймеры САС 0 и САС 5В.The strain Δcac15 :: mls R was transformed with the pCLF1 vector expressing the FLP1 gene encoding Flp recombinase from S. cerevisiae. After transformation and selection for resistance to thiamphenicol (50 μg / ml) in Petri dishes, one colony was cultured in a synthetic liquid medium with thiamphenicol at a concentration of 50 μg / ml and the corresponding dilutions were applied to RCA with thiamphenicol at a concentration of 50 μg / ml. Thiamphenicol-resistant clones were applied by the replica method both on RCA with erythromycin at a concentration of 40 μg / ml, and on RCA with thiamphenicol at a concentration of 50 μg / ml. The genotype of clones with sensitivity to erythromycin and resistance to thiamphenicol was checked by PCR analysis using CAS 0 and CAS 5B primers.
Проводили два последовательных 24-часовых культивирования штамма Δсас15 с чувствительностью к эритромицину и устойчивостью к тиамфениколу с целью удаления pCLF1. Штамм Δсас15, утративший pCLF1, выделяли в соответствии с его чувствительностью как к эритромицину, так и к тиамфениколу. Штамм обозначали как MGCΔcac15 С.acetobutylicum.Two consecutive 24-hour cultivations of the strain Δcac15 were carried out with sensitivity to erythromycin and resistance to thiamphenicol to remove pCLF1. Strain Δcac15, which lost pCLF1, was isolated in accordance with its sensitivity to both erythromycin and thiamphenicol. The strain was designated as MGCΔcac15 C.acetobutylicum.
Пример 3. Делетирование гена upp, кодирующего урацил-фосфорибозилтрансферазу в Clostridium acetobutylicum Δсас15Example 3. Deletion of the upp gene encoding uracil-phosphoribosyltransferase in Clostridium acetobutylicum Δcac15
Два фрагмента ДНК, расположенные "вверх по течению" и "вниз по течению" от upp (САС2879), подвергали ПЦР-амплификации с использованием ДНК-полимеразы Pwo, применяя суммарную ДНК из С.acetobutylicum в качестве матрицы и две специфические пары олигонуклеотидов в качестве праймеров (см. Таблицу 3). Используя пары праймеров UPP 1-UPP 2 и UPP 3-UPP 4, получали ДНК-фрагменты 1103 п.о. и 1105 п.о., соответственно. С использованием обоих праймеров UPP 1 и UPP 4 вводят BamHI-сайт, тогда как праймеры UPP 2 и UPP 3 имеют удлиненные с 5'-конца последовательности, с помощью которых вводят StuI-сайт. ДНК-фрагменты UPP 1-UPP 2 и UPP 3-UPP 4 соединяли в эксперименте по ПЦР-слиянию, используя праймеры UPP 1 и UPP 4, и полученный фрагмент клонировали в pCR4-TOPO-Blunt, получая рТОРО:upp. По уникальному StuI-сайту рТОРО:upp вводили StuI-фрагмент размером 1372 п.о. от pUC18-FRT-MLS2, несущий ген устойчивости к антибиотикам MLSr с FRT-последовательностями по обеим сторонам. Замещающую кассету upp, полученную после переваривания полученной плазмиды с помощью SamHI, клонировали в pCons2-1 по BamН1-сайту, получая плазмиду pREPUPP.Two upstream and downstream DNA fragments from upp (CAC2879) were PCR amplified using Pwo DNA polymerase using total DNA from C. acetobutylicum as template and two specific oligonucleotide pairs as primers (see Table 3). Using pairs of primers UPP 1-
Плазмиду pREPUPP использовали для трансформации штамма С.acetobutylicuin MGCΔcac15 путем электропорации без проведения предварительного in vivo метилирования. После селекции на чашках Петри на предмет клонов, устойчивых к эритромицину (40 мкг/мл), одну колонию культивировали в течение 24 часов в жидкой синтетической среде с эритромицином в концентрации 40 мкг/мл и затем субкультивировали в жидкой среде 2YTG без антибиотика. Соответствующие разведения наносили на RCA с эритромицином в концентрации 40 мкг/мл. Для селекции интегрантов, утративших вектор pREPUPP, устойчивые к эритромицину клоны наносили методом реплик как на RCA с эритромицином в концентрации 40 мкг/мл, так и на RCA с тиамфениколом в концентрации 50 мкг/мл. Генотип клонов, устойчивых к эритромицину и чувствительных к тиамфениколу, проверяли ПЦР-анализом (используя праймеры UPP 0 и UPP 5, локализованные вне замещающей кассеты UPP, и праймеры UPP D и UPP R, локализованные внутри UPP). Штамм Δcac15Δupp::mlsR, утративший pREPUPP, выделяли. Предыдущее делетирование сас1502 подтверждали, как описано ранее в первом примере. Штамм Δсас15Δupp::mlsR является устойчивым к 5-FU в концентрации 400 мкМ по сравнению с 50 мкМ для штамма Δсас15.Plasmid pREPUPP was used to transform C.acetobutylicuin MGCΔcac15 strain by electroporation without prior in vivo methylation. After selection on Petri dishes for clones resistant to erythromycin (40 μg / ml), one colony was cultured for 24 hours in a liquid synthetic medium with erythromycin at a concentration of 40 μg / ml and then subcultured in 2YTG liquid medium without antibiotic. Appropriate dilutions were applied to RCA with erythromycin at a concentration of 40 μg / ml. For the selection of integrants that have lost the pREPUPP vector, erythromycin-resistant clones were applied by replica both on RCA with erythromycin at a concentration of 40 μg / ml, and on RCA with thiamphenicol at a concentration of 50 μg / ml. The genotype of erythromycin-resistant and thiamphenicol-sensitive clones was verified by PCR analysis (using UPP 0 and
Штамм Δсас15Δupp::mlsR трансформировали вектором pCLF1, экспрессирующим ген FLP1, кодирующий рекомбиназу Flp из S.cerevisiae. После трансформации и селекции на устойчивость к тиамфениколу (50 мкг/мл) на чашках Петри одну колонию культивировали в синтетической жидкой среде с тиамфениколом в концентрации 50 мкг/мл и соответствующие разведения наносили на RCA с тиамфениколом в концентрации 50 мкг/мл. Тиамфеникол-устойчивые клоны наносили методом реплик как на RCA с эритромицином в концентрации 40 мкг/мл, так и на RCA с тиамфениколом в концентрации 50 мкг/мл. Генотип клонов с чувствительностью к эритромицину и устойчивостью к тиамфениколу проверяли ПЦР-анализом, используя праймеры UPP 0 и UPP 5. Проводили два последовательных 24-часовых культивирования штамма Δсас15Δupp с чувствительностью к эритромицину и устойчивостью к тиамфениколу с целью удаления pCLF1. Штамм Δсас15Δupp, утративший pCLF1, выделяли в соответствии с его чувствительностью как к эритромицину, так и к тиамфениколу.The strain Δcac15Δupp :: mls R was transformed with the pCLF1 vector expressing the FLP1 gene encoding Flp recombinase from S. cerevisiae. After transformation and selection for resistance to thiamphenicol (50 μg / ml) in Petri dishes, one colony was cultured in a synthetic liquid medium with thiamphenicol at a concentration of 50 μg / ml and the corresponding dilutions were applied to RCA with thiamphenicol at a concentration of 50 μg / ml. Thiamphenicol-resistant clones were applied by the replica method both on RCA with erythromycin at a concentration of 40 μg / ml, and on RCA with thiamphenicol at a concentration of 50 μg / ml. Clone genotype with erythromycin sensitivity and resistance to thiamphenicol was tested by PCR analysis using UPP 0 and
Пример 4. Делетирование гена сас3535 с использованием upp и 5-фторурацила в качестве позитивной селекции на предмет утраты плазмидыExample 4. The deletion of gene sas3535 using upp and 5-fluorouracil as a positive selection for the loss of plasmids
Два фрагмента ДНК, расположенные "вверх по течению" и "вниз по течению" от гена сас3535, кодирующего вторую систему рестрикции-модификации С.acetobutylicum, подвергали ПЦР-амплификации с использованием ДНК-полимеразы Pwo, применяя суммарную ДНК из С.acetobutylicum в качестве матрицы и две специфические пары олигонуклеотидов (см. Таблицу 4). Используя пары праймеров RM 1-RM 2 и RM 3-RM 4, получали ДНК-фрагменты 1 т.п.о. и 0,9 т.п.о., соответственно. С использованием обоих праймеров RM 1 и RM 4 вводят BamHI-сайт, тогда как праймеры RM 2 и RM 3 имеют комплементарные удлиненные с 5'-конца последовательности, с помощью которых вводят StuI-сайт. ДНК-фрагменты RM 1-RM 2 и RM 3-RM 4 соединяли в эксперименте по ПЦР-слиянию, используя праймеры RM 1 и RM 4, и полученный фрагмент клонировали в вектор pCR4-TOPO-Blunt, получая плазмиду рТОРО:сас3535. По уникальному StuI рТОРО:сас3535 вводили Sful-фрагмент размером 1372 п.о. от pUC18-FRT-MLS2, несущий ген устойчивости к антибиотикам MLSr с FRT-последовательностями по обеим сторонам. Замещающую кассету САС3535, полученную после переваривания полученной плазмиды с помощью BamHI, клонировали в pCons::upp по BamHI-сайту, получая плазмиду pREPCAC3535::upp.Two DNA fragments located upstream and downstream from the cac3535 gene encoding the second restriction-modification system of C.acetobutylicum were subjected to PCR amplification using Pwo DNA polymerase using total DNA from C.acetobutylicum as matrices and two specific pairs of oligonucleotides (see Table 4). Using pairs of primers RM 1-
Плазмиду pREPCAC3535::upp использовали для трансформации штамма С.acetobutylicum MGCΔcac15Δupp путем электропорации. После селекции на чашках Петри на предмет клонов, устойчивых к эритромицину (40 мкг/мл), одну колонию культивировали в течение 24 часов в жидкой синтетической среде с эритромицином в концентрации 40 мкг/мл и 100 мкл неразбавленной культуры наносили на RCA с эритромицином в концентрации 40 мкг/мл и 5-FU в концентрации 400 мкМ. Колонии, устойчивые как к эритромицину, так и к 5-FU, наносили методом реплик как на RCA с эритромицином в концентрации 40 мкг/мл, так и на RCA с тиамфениколом в концентрации 50 мкг/мл с целью проверки того, что устойчивость к 5-FU ассоциирована с чувствительностью к тиамфениколу. Генотип клонов, устойчивых к эритромицину и чувствительных к тиамфениколу, проверяли ПЦР-анализом (используя праймеры RM 0 и RM 5, локализованные вне замещающей кассеты САС3535, и праймеры RM D и RM R, локализованные внутри гена сас3535). Таким образом, выделяли штамм Δсас15ΔuppΔсас35::mR, утративший pREPCAC3535::upp.Plasmid pREPCAC3535 :: upp was used to transform C.acetobutylicum MGCΔcac15Δupp strain by electroporation. After selection on Petri dishes for clones resistant to erythromycin (40 μg / ml), one colony was cultured for 24 hours in a liquid synthetic medium with erythromycin at a concentration of 40 μg / ml and 100 μl of undiluted culture was applied to RCA with erythromycin at a
Claims (31)
- трансформацию клетки Clostridium acetobutylicum вектором, содержащим:
- ориджин репликации, позволяющий осуществлять его репликацию в С. acetobutylicum, и
- замещающую кассету, содержащую первый маркерный ген, окруженный двумя последовательностями, гомологичными выбранным участкам около последовательности ДНК-мишени, позволяющими осуществлять рекомбинацию данной кассеты, и
- второй маркерный ген,
- селекцию клеток с интегрированной в их геном указанной кассетой, которые экспрессируют первый маркерный ген,
- селекцию клеток с элиминированным указанным вектором, которые не экспрессируют второй маркерный ген,
где второй маркерный ген представляет собой ген upp, встречно-селектируемый маркер.1. A method of replacing a target DNA sequence by homologous recombination in Clostridium acetobutylicum, comprising:
- transformation of a Clostridium acetobutylicum cell with a vector containing:
- the origin of replication, allowing its replication in C. acetobutylicum, and
- a replacement cassette containing the first marker gene surrounded by two sequences homologous to selected regions near the target DNA sequence, allowing the recombination of this cassette, and
- second marker gene,
- selection of cells with an integrated cassette integrated into their genome that express the first marker gene,
- selection of cells with eliminated the specified vector, which do not express the second marker gene,
where the second marker gene is the upp gene, an anti-selectable marker.
- ориджин репликации, позволяющий осуществлять его репликацию в С. acetobutylicum, и
- замещающую кассету, содержащую первый маркерный ген, окруженный двумя последовательностями, гомологичными выбранным участкам около последовательности ДНК-мишени, позволяющими осуществлять рекомбинацию данной кассеты, и
- ген upp второй встречно-селектируемый маркерный ген.23. A transforming vector containing:
- the origin of replication, allowing its replication in C. acetobutylicum, and
- a replacement cassette containing the first marker gene surrounded by two sequences homologous to selected regions near the target DNA sequence, allowing the recombination of this cassette, and
- upp gene is the second counter-selectable marker gene.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2009116513/10A RU2464317C2 (en) | 2006-10-03 | 2006-10-03 | Method of chromosomal integration and replacement of dna sequence in clostridia |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2009116513/10A RU2464317C2 (en) | 2006-10-03 | 2006-10-03 | Method of chromosomal integration and replacement of dna sequence in clostridia |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2009116513A RU2009116513A (en) | 2010-11-10 |
RU2464317C2 true RU2464317C2 (en) | 2012-10-20 |
Family
ID=44025691
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2009116513/10A RU2464317C2 (en) | 2006-10-03 | 2006-10-03 | Method of chromosomal integration and replacement of dna sequence in clostridia |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2464317C2 (en) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003064623A2 (en) * | 2002-01-31 | 2003-08-07 | Washington State University Research Foundation | Methods and vectors for facilitating site-specific recombination |
-
2006
- 2006-10-03 RU RU2009116513/10A patent/RU2464317C2/en active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003064623A2 (en) * | 2002-01-31 | 2003-08-07 | Washington State University Research Foundation | Methods and vectors for facilitating site-specific recombination |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
HARRIS L.M. ET AL., Northern, morphological, and fermentation analysis of spo0A inactivation and overexpression in Clostridium acetobutylicum ATCC 824, J Bacteriol, 2002, v.184, no.13, pp.3586-3597. FABRET C. ET AL., A new mutation delivery system for genome-scale approaches in Bacillus subtilis, Mol Microbiol., 2002, v.46, no.1, pp.25-36. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2009116513A (en) | 2010-11-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5203375B2 (en) | Chromosome uptake and DNA sequence replacement in Clostridium bacteria | |
US20240002835A1 (en) | Genetic tool for the transformation of clostridium bacteria | |
Wasels et al. | A two-plasmid inducible CRISPR/Cas9 genome editing tool for Clostridium acetobutylicum | |
Li et al. | CRISPR‐based genome editing and expression control systems in Clostridium acetobutylicum and Clostridium beijerinckii | |
US11946067B2 (en) | Optimized genetic tool for modifying Clostridium bacteria | |
US20190144846A1 (en) | Harnessing heterologous and endogenous CRISPR-Cas machineries for efficient markerless genome editing in Clostridium | |
Al-Hinai et al. | Novel system for efficient isolation of Clostridium double-crossover allelic exchange mutants enabling markerless chromosomal gene deletions and DNA integration | |
JP5732496B2 (en) | DNA molecules and methods | |
CN105331627A (en) | Method for editing prokaryotic genomes using endogenic CRISPR-Cas (CRISPR-associated) system | |
US8753846B2 (en) | Methods of modifying nucleic acids in host cells | |
EP2389440A1 (en) | Method of double crossover homologous recombination in clostridia | |
EP2267126A1 (en) | Process for the stable gene interruption in clostridia | |
RU2464317C2 (en) | Method of chromosomal integration and replacement of dna sequence in clostridia | |
Yu et al. | Efficient and precise construction of markerless manipulations in the Bacillus subtilis genome | |
US20230109758A1 (en) | Genetically modified clostridium bacteria, preparation and uses of same | |
US20100330678A1 (en) | Process for the stable gene interruption in clostridia | |
US20220243170A1 (en) | Optimized genetic tool for modifying bacteria | |
JP2023127863A (en) | Method for modifying thermophile genome, method for producing genome-modified thermophile, and genome editing kit for thermophile | |
Huang et al. | Efficient long fragment editing technique enables rapid construction of genetically stable bacterial strains | |
CN118374535A (en) | Pichia pastoris efficient traceless gene knockout vector and application thereof | |
FR3025803A1 (en) | EXPRESSION CASSETTE AND USES THEREOF |