RU2463963C1 - Method of diagnosing cancer and potential resistance of malignant cells to hypoxia - Google Patents
Method of diagnosing cancer and potential resistance of malignant cells to hypoxia Download PDFInfo
- Publication number
- RU2463963C1 RU2463963C1 RU2011130947/14A RU2011130947A RU2463963C1 RU 2463963 C1 RU2463963 C1 RU 2463963C1 RU 2011130947/14 A RU2011130947/14 A RU 2011130947/14A RU 2011130947 A RU2011130947 A RU 2011130947A RU 2463963 C1 RU2463963 C1 RU 2463963C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- hypoxia
- fluorescence
- nad
- conditions
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, в частности к способам физического анализа биологических материалов, и может быть использовано для диагностики рака в цитологических образцах ткани и идентификации единичных злокачественных клеток с высокой устойчивостью к повреждениям в условиях гипоксии.The invention relates to medicine, in particular to methods of physical analysis of biological materials, and can be used to diagnose cancer in cytological tissue samples and to identify single malignant cells with high resistance to damage in conditions of hypoxia.
В настоящее время основным методом диагностики раковых (онкологических) заболеваний является патогистологический анализ архитектуры ткани, полученной при оперативном удалении опухоли, или образца биопсии. Однако такой анализ является длительным и чрезвычайно трудоемким и не всегда обеспечивает 100% надежность. Это может быть обусловлено как малым размером опухоли, так и отсутствием соответствующего оборудования и квалификацией медперсонала.Currently, the main method for the diagnosis of cancer (oncological) diseases is a histopathological analysis of the tissue architecture obtained by surgical removal of the tumor, or biopsy sample. However, such an analysis is lengthy and extremely time-consuming and does not always provide 100% reliability. This may be due to both the small size of the tumor, and the lack of appropriate equipment and the qualifications of the medical staff.
Известны способы цитологической диагностики заболеваний, основанные на классических методах окраски клеток и их внутриклеточных органелл, тестируемых при визуальном анализе. Определенным недостатком данных подходов является то, что их разрешающая способность не позволяет в ряде случаев дифференцировать ранние предраковые изменения, обусловленные появлением единичных опухолевых клеток, отличающихся повышенной устойчивостью к повреждениям, в частности к гипоксии. В этих случаях на помощь приходят более сложные методы окраски клеток, а также количественный, морфометрический анализ [Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. - М.: Медицина. 1990. - 384 с.; Автандилов Г.Г., Глухов Ю.К. и Шабалова И.П. Плоидометрическая диагностика предраковых процессов и рака шейки матки по цитологическим препаратам // Клиническая лабораторная диагностика. - 2004. - №3. - С.45-47; Новик В.И., Агроскин Л.С., Папаян Г.В. и др. Биометрические исследования в диагностике предопухолевых состояний и эндоцервикального рака // Архив патологии. 1989, №12, с.45-49; Погорелов В.М., Байдурин С.А., Капланская И.Б. и др. Морфометрические параметры злокачественных клеток при нелейкемических гемобластозах с первичным поражением лимфатических узлов // Гематология и трансфузиология. 1992, №3, с.5-10; Bittinger A., von Keitz A., Ruschoff J., Melekos M.D. Silver staining nucleolar organizer region in prostate cytology // Zentralbl Pathol. 1994. Mar. 140 (1): 103-6].Known methods for the cytological diagnosis of diseases based on classical methods of staining cells and their intracellular organelles, tested by visual analysis. A definite drawback of these approaches is that their resolution does not allow in some cases to differentiate early precancerous changes due to the appearance of single tumor cells that are characterized by increased resistance to damage, in particular to hypoxia. In these cases, more complex cell staining methods come to the rescue, as well as quantitative, morphometric analysis [G. Avtandilov Medical morphometry. Leadership. - M.: Medicine. 1990 .-- 384 p .; Avtandilov G.G., Glukhov Yu.K. and Shabalova I.P. Ploidometric diagnosis of precancerous processes and cervical cancer by cytological preparations // Clinical Laboratory Diagnostics. - 2004. - No. 3. - S. 45-47; Novik V.I., Agroskin L.S., Papayan G.V. et al. Biometric studies in the diagnosis of precancerous conditions and endocervical cancer // Archive of Pathology. 1989, No. 12, p. 45-49; Pogorelov V.M., Baydurin S.A., Kaplanskaya I.B. et al. Morphometric parameters of malignant cells in non-leukemic hemoblastoses with primary lesion of the lymph nodes // Hematology and Transfusiology. 1992, No. 3, pp. 5-10; Bittinger A., von Keitz A., Ruschoff J., Melekos M.D. Silver staining nucleolar organizer region in prostate cytology // Zentralbl Pathol. 1994. Mar. 140 (1): 103-6].
Однако в этих работах даются, как правило, усредненные, групповые морфометрические характеристики клеточных популяций в целом, что делает весьма затруднительным идентификацию единичных злокачественных клеток.However, in these works, as a rule, averaged, group morphometric characteristics of cell populations as a whole are given, which makes identification of single malignant cells very difficult.
Известна работа В.И.Цыганкова, Н.П.Мельниковой Н.П. и Г.Л.Могилевой [Морфотипы железистого эпителия при добро- и злокачественных заболеваниях молочных желез // Клиническая лабораторная диагностика. 2004, №1. - С.43-45], в которой авторам, анализируя цитологический материал молочной железы, окрашенный 50% раствором азотнокислого серебра, удалось разделить популяцию ядер на 6 морфотипов, увязав их с определенными клинико-морфологическими диагнозами. Показано, что для рака молочной железы характерны морфотипы ядер, не встречающиеся при дисплазиях, и на этом основании высказывается мнение, что их обнаружение может указывать на наличие рака. Данный подход имеет интерес для диагностики, когда среди массива доброкачественных клеток присутствуют единичные злокачественные клетки.Famous work of V.I. Tsygankov, N.P. Melnikova N.P. and GL Mogileva [Morphotypes of glandular epithelium in benign and malignant diseases of the mammary glands // Clinical Laboratory Diagnostics. 2004, No. 1. - S.43-45], in which the authors, analyzing the cytological material of the mammary gland stained with a 50% silver nitrate solution, were able to divide the nuclear population into 6 morphotypes, linking them to certain clinical and morphological diagnoses. It has been shown that breast cancer is characterized by nuclear morphotypes that are not found in dysplasia, and on this basis it is believed that their detection may indicate the presence of cancer. This approach is of interest for diagnosis when single malignant cells are present among an array of benign cells.
Недостатком же данного способа является то, морфометрические параметры даны для клеток пунктатов молочной железы, что исключает их использование для анализа цитологических препаратов других видов форм онкологических заболеваний.The disadvantage of this method is that morphometric parameters are given for punctate cells of the mammary gland, which excludes their use for the analysis of cytological preparations of other types of oncological diseases.
Известен способ диагностики рака с помощью онкомаркеров, основанный на повышении или снижении синтеза тканеспецифических онкобелков; или экспрессии в опухолевых тканях белков, характерных для эмбрионального периода развития организма [Белохвостов А.С., Румянцев А.Г. Онкомеркеры: Молекулярные, генетические, иммунохимические и биохимические анализы. Пособие для врачей. - М.: МАКС Пресс, 2003, 91 стр.]. Однако этот способ не пригоден для выявления злокачественных опухолей, для которых онкомаркеры еще не выявлены или когда предложенный онкоген не обладает достаточный высокой тканевой онкоспецифичностью. Например, мониторинг альфа-фетопротеина (или фетальной формы альбумина) показан для диагностики и эффективности терапии первичной карциномы печени, но карциномы другой тканевой локализации не могут быть диагностированы с его помощью.A known method for the diagnosis of cancer using tumor markers, based on the increase or decrease in the synthesis of tissue-specific oncoproteins; or expression in tumor tissues of proteins characteristic of the embryonic period of the body's development [Belokhvostov AS, Rumyantsev AG Onkomerki: Molecular, genetic, immunochemical and biochemical analyzes. Manual for doctors. - M .: MAKS Press, 2003, 91 pp.]. However, this method is not suitable for detecting malignant tumors for which tumor markers have not yet been identified or when the proposed oncogen does not possess a sufficiently high tissue specificity. For example, monitoring of alpha-fetoprotein (or the fetal form of albumin) is indicated for the diagnosis and effectiveness of treatment of primary liver carcinoma, but carcinomas of other tissue localization cannot be diagnosed with it.
Кроме того, разрабатывается новый способ диагностики онкологических заболеваний, базирующийся на мониторинге генетических или эпигенетических маркеров, часто встречающихся лишь в строго определенных новообразованиях [Система генетических или эпигенетических маркеров в диагностике онкологических заболеваний (под редакцией Пальцева М.А., Залетаева Д.В.). М.: Медицина, 2007, 384 стр.].In addition, a new method for the diagnosis of cancer is being developed, based on monitoring genetic or epigenetic markers, often found only in strictly defined neoplasms [System of genetic or epigenetic markers in the diagnosis of cancer (edited by M. Paltseva, D. Zaletaeva) . M.: Medicine, 2007, 384 pp.].
Недостаток этого способа состоит в том, что он пока находится на стадии апробации и поиска более информационных маркеров, требуемых для диагностики ранних форм рака и достоверного прогноза течения заболевания в ответ на терапевтические воздействия.The disadvantage of this method is that it is still at the stage of testing and searching for more information markers required for the diagnosis of early forms of cancer and a reliable prognosis of the course of the disease in response to therapeutic effects.
Известен способ диагностики рака путем исследования прижизненной динамики клеток с помощью динамической когерентной фазовой микроскопии (патент РФ 2306868, опубликованный 27.09.2007). Способ заключается в том, что определяют интенсивность и спектральные характеристики флуктуации фазовой толщины ядрышек клеток и при наличии характерных спектральных компонентов в диапазоне 8,0-20,0 Гц диагностируют присутствие в образце клеток рака.A known method for the diagnosis of cancer by studying the intravital dynamics of cells using dynamic coherent phase microscopy (RF patent 2306868, published September 27, 2007). The method consists in determining the intensity and spectral characteristics of fluctuations in the phase thickness of the nucleoli of the cells and, in the presence of characteristic spectral components in the range of 8.0-20.0 Hz, diagnose the presence of cancer cells in the sample.
Недостаток этого способа состоит в том, что не показана эффективность его применения для разных форм рака с учетом их тканевой принадлежности и стадии развития.The disadvantage of this method is that the effectiveness of its use for various forms of cancer is not shown, taking into account their tissue affiliation and stage of development.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ флуоресцентной диагностики базальноклеточного рака кожи (см. патент РФ 2387376, опубликованный 27.04.2010), заключающийся в том, что больному с подозрением на базальноклеточный рак кожи на область поражения наносят флюорохром акридиновый оранжевый в концентрации 1:5000 с последующим изучением очага контактными объективами лк 25*0,75 в режиме флуоресценции в диапазоне 480-700 нм биомикроскопом ЛЮМАМ-ИЗ. Определяют опухолевые комплексы базальноклеточного рака кожи по участкам скопления интенсивно флуоресцирующих клеток на фоне зеленого свечения межклеточного вещества и коллагеновых волокон и диагностируют базальноклеточный рак кожи. Использование заявляемого способа позволяет: 1) исключить вероятность выставления ложноположительных и ложноотрицательных заключений; 2) провести исследование с минимальной травматичностью для пациента; 3) выявить комплексы опухолевых клеток, характерные для базальноклеточного рака прижизненно; 4) сократить сроки проведения диагностического исследования.Closest to the technical nature of the proposed method is a method for fluorescence diagnosis of basal cell skin cancer (see RF patent 2387376, published 04/27/2010), which consists in the fact that a patient with suspected basal cell skin cancer is applied to the affected area with fluorochrome acridine orange in a concentration of 1 : 5000 followed by the study of the focus with
Недостатки этого способа состоят в том, что с его помощью изучаются лишь поверхностно расположенные опухолевые клетки и самому больному вводится краситель, интеркалирующий в ДНК/РНК и потенциально способный вызывать мутации.The disadvantages of this method are that with its help only superficially located tumor cells are studied and the dye is introduced to the patient himself, intercalating in DNA / RNA and potentially capable of causing mutations.
Другим близким по технической сущности к предлагаемому способу является флуоресцентный низкотемпературный способ диагностики рака с высоким потенциалом к метастазированию (Xu H.N., Nioka S., Clickon J.D., Chance В., Li L.Z. Quantitative mitochondrial redox imaging of breast cancer metastatic potential. J Biomedical. Optics, 2010, 15(3): 136010). При изучении эндогенной флуоресценции [окисленных флавинов (Ф) и восстановленных никотинамид динуклеотидов (NADH)] в образцах биопсии рака были обнаружены значительные флуоресцентные различия в центральных зонах высокометастазирующих опухолей молочной железы и меланомы в сравнении с образцами биопсии от низкометастазирующих типов опухолей той же тканевой локализации. Обнаруженные различия в спектральных характеристиках флуоресценции флавинов и NADH, позволили авторам во главе с профессором Чансом (Xu H.N., Nioka S., Clickon J.D., Chance В., Li L.Z. Quantitative mitochondrial redox imaging of breast cancer metastatic potential. J Biomedical. Optics, 2010, 15(3): 136010) предложить новый способ прогнозирования метастазов по параметрам флуоресценции в образцах биопсии от первичной опухоли.Another close in technical essence to the proposed method is a fluorescent low-temperature method for the diagnosis of cancer with high potential for metastasis (Xu HN, Nioka S., Clickon JD, Chance B., Li LZ Quantitative mitochondrial redox imaging of breast cancer metastatic potential. J Biomedical. Optics 2010, 15 (3): 136010). When studying endogenous fluorescence [of oxidized flavins (F) and reduced nicotinamide dinucleotides (NADH)] in cancer biopsy samples, significant fluorescence differences were found in the central areas of highly metastatic breast and melanoma tumors compared to biopsy samples from low metastatic tumor types of the same tissue. Discovered differences in the spectral characteristics of the fluorescence of flavins and NADH allowed authors led by Professor Chance (Xu HN, Nioka S., Clickon JD, Chance B., Li LZ Quantitative mitochondrial redox imaging of breast cancer metastatic potential. J Biomedical. Optics, 2010 , 15 (3): 136010) to propose a new method for predicting metastases by fluorescence parameters in biopsy samples from a primary tumor.
Однако проведение таких исследований требует дорогостоящей спектральной аппаратуры, оснащенной приставкой для работы с замороженными образцами биопсии, необходимыми для их измерения параметров флуоресцентрии с высокой разрешающей способностью.However, carrying out such studies requires expensive spectral equipment equipped with an attachment for working with frozen biopsy samples necessary for their measurement of high-resolution fluorescence parameters.
Техническая задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, состоит в расширении арсенала способов, позволяющих диагностировать наличие раковых клеток на живых клетках без их окрашивания, упрощении способа и повышении его чувствительности.The technical problem to which the invention is directed is to expand the arsenal of methods to diagnose the presence of cancer cells on living cells without staining, simplifying the method and increasing its sensitivity.
Поставленная задача решена тем, что предложен способ диагностики рака и потенциальной устойчивости злокачественных клеток к гипоксии путем выявления в цитологических образцах, или биоптатах ткани клеток, обладающих способностью к неоднократно повторяющейся репарации пула восстановленных никотинамид динуклеотидов [NAD(P)H] в условиях, сохраняющейся гипоксии, которые обнаруживают по приросту интенсивности NAD(P)H флуоресценции после выдерживания исследуемого образца в темновых условиях, и по количеству циклов репарации NAD(P)H флуоресценции и величине прироста интенсивности NAD(P)H флуоресценции в каждом цикле оценивают потенциальную устойчивость различных опухолевых клеток к выживанию в условиях гипоксии, по которой судят о наличии злокачественных клеток и степени их устойчивости к гипоксии.The problem is solved by the fact that a method for diagnosing cancer and the potential resistance of malignant cells to hypoxia by identifying cells in the cytological samples or biopsy samples of cells with the ability to repeatedly repair a pool of restored nicotinamide dinucleotides [NAD (P) H] under conditions of persisting hypoxia is proposed which are detected by the increase in the intensity of NAD (P) H fluorescence after keeping the test sample under dark conditions, and by the number of repair cycles of NAD (P) H fluorescence and the magnitude of the increase in the intensity of NAD (P) H fluorescence in each cycle, the potential resistance of various tumor cells to survival under hypoxia is assessed, which is used to judge the presence of malignant cells and their degree of resistance to hypoxia.
При этом условия гипоксии создают, например, путем помещения суспензии клеток или клеточного отпечатка в виде монослоя между двумя стеклами, края которых плотно запечатывают, в частности, расплавленным парафином с целью предотвращения контакта клеток с кислородом воздуха, а затем проводят спектрофлуорометрические исследования в диапазоне 440-470 нм при длине волны возбуждения 365-370 нм.In this case, hypoxia conditions are created, for example, by placing a suspension of cells or a cell imprint in the form of a monolayer between two glasses, the edges of which are tightly sealed, in particular, with molten paraffin in order to prevent contact of cells with atmospheric oxygen, and then spectrofluorometric studies are carried out in the range of 440- 470 nm at an excitation wavelength of 365-370 nm.
Сущность изобретения заключается в том, что экспериментальным путем были установлены принципиальные различия в потенциальной устойчивости опухолевых и нормальных клеток к выживанию в условиях гипоксии, оцениваемой в динамике по изменению интенсивности NAD(P)H флуоресценции и способности, присущей только раковым клеткам, частично восстанавливать пул NAD(P)H в темновых условиях.The essence of the invention lies in the fact that experimentally established fundamental differences in the potential resistance of tumor and normal cells to survival under hypoxia, evaluated in dynamics by the change in the intensity of NAD (P) H fluorescence and the ability inherent only in cancer cells to partially restore the NAD pool (P) H in dark conditions.
Сущность изобретения поясняется графическими материалами, где на фиг.1 показана типичная кривая изменения суммарной интенсивности флуоресценции при λ=460 нм (I460); характерная для перевиваемых мышам опухолевых клеток асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ), находящихся в условиях гипоксии при действии на них УФ-света (заштрихованные участки) и в темновых условиях (после выключения УФ-света; незаштрихованные участки).The invention is illustrated by graphic materials, where figure 1 shows a typical curve of the total fluorescence intensity at λ = 460 nm (I 460 ); characteristic of Ehrlich ascites carcinoma (AKE) tumor cells transplanted into mice under hypoxia under the influence of UV light (shaded areas) and in dark conditions (after turning off UV light; unshaded areas).
Суммарная интенсивность эндогенной флуоресценции живых клеток (в полосе 440-470 нм) обусловлена флуоресценцией двух основных флуоресцентных компонентов: 1) флуоресцирующими продуктами перекисного окисления липидов (ФППОЛ), которые высокочувствительны к УФ-индуцируемой фотодеструкции [после 0,5-1 мин действия УФ-света (λ-365 нм), флуоресценция от ФППОЛ не обнаруживается] и 2) пулом восстановленных никотинамид динуклеотидов [NAD(P)H], интенсивность флуоресценции которых достигает максимальной в условиях гипоксии. Доля каждого из этих компонентов (в процентах) в общей полосе флуоресценции (с максимумом I460), характерная для большинства опухолевых АКЭ клеток, указана на шкале ординат.The total intensity of the endogenous fluorescence of living cells (in the band 440-470 nm) is due to the fluorescence of two main fluorescent components: 1) the fluorescent products of lipid peroxidation (FPPOL), which are highly sensitive to UV-induced photodestruction [after 0.5-1 min of UV light (λ-365 nm), fluorescence from FPPOL is not detected] and 2) a pool of reduced nicotinamide dinucleotides [NAD (P) H], the fluorescence intensity of which reaches its maximum under hypoxia. The percentage of each of these components (in percent) in the total fluorescence band (with a maximum of I 460 ), characteristic of most tumor AKE cells, is indicated on the ordinate scale.
А - кинетика фотодеструкции флуоресценции (I460) опухолевых АКЭ клеток при постоянном действии УФ-света (λ-365 нм).A - kinetics of photodegradation of fluorescence (I 460 ) of tumor AKE cells under constant exposure to UV light (λ-365 nm).
В - репарация пула NAD(P)H, измеряемая по приросту интенсивности NAD(P)H-флуоресценции после нахождения гипоксических опухолевых АКЭ клеток в темновых условиях [т.е. без повреждающего действия УФ-света (λ-365 nm)]. Величина прироста I460 (в процентах) после каждого цикла восстановления NAD(P)H флуоресценции обозначена величиной стрелок, направленных вверх.B - NAD (P) H pool repair, measured by the increase in NAD (P) H fluorescence intensity after finding hypoxic tumor AKE cells in dark conditions [i.e. without the damaging effect of UV light (λ-365 nm)]. The increase in I 460 (in percent) after each recovery cycle of NAD (P) H fluorescence is indicated by the magnitude of the arrows pointing up.
На фиг.2 показаны кинетические особенности I460 фотодеструкции лимфоцитов, выделенных из лимфоузла здоровых мышей и помещенных в условия гипоксии. Для нормальных лимфоцитов характерна перманентная фотодеструкция флуоресценции (при I460), которая наблюдалась как при действии УФ-света (λ-365 нм) (заштрихованные участки), так и в темновых условиях (при выключении УФ-света; незаштрихованные участки). Величина I460 фотодеструкции обозначена величиной стрелок, направленных вниз, что указывает на низкую устойчивость нормальных лимфоидных клеток в условиях гипоксии. Противоположный эффект характерен для опухолевых АКЭ клеток (Фиг.1), обладающих повышенной потенциальной устойчивостью в аналогичных условиях гипоксии. Обнаруженные различия между опухолевыми и нормальными клетками по потенциальной устойчивости к гипоксии могут быть использованы как для идентификации единичных опухолевых клеток с целью их диагностирования, так и для прогнозирования выживаемости опухолевых клеток в гипоксических зонах опухоли.Figure 2 shows the kinetic features of I 460 photodestruction of lymphocytes isolated from the lymph node of healthy mice and placed in hypoxic conditions. Normal lymphocytes are characterized by permanent photodestruction of fluorescence (at I 460 ), which was observed both under the action of UV light (λ-365 nm) (shaded areas) and in dark conditions (when the UV light was turned off; unshaded areas). The value of I 460 photodestruction is indicated by the size of the arrows pointing down, which indicates a low resistance of normal lymphoid cells under conditions of hypoxia. The opposite effect is characteristic of tumor AKE cells (Figure 1), with increased potential resistance in similar conditions of hypoxia. The revealed differences between tumor and normal cells in terms of potential resistance to hypoxia can be used both to identify single tumor cells for the purpose of their diagnosis and to predict the survival of tumor cells in the hypoxic zones of the tumor.
На фиг.3 - аналогичные исследования представлены для другого типа высокоагрессивных опухолевых клеток - асцитной гепатомы Зайделя (АГЗ), перевиваемой крысам [изучались АГЗ клетки, находящиеся в асцитной жидкости и при их метастазировании в селезенку, а также нормальные спленоциты, окружающие метастаз (фиг.4)]. Асцитные АГЗ клетки, а также АГЗ клетки метастаза (фиг.3) отличались высокой потенциальной устойчивостью к повреждающему действию гипоксии, так как они были способны в 3-5-кратному восстановлению пула NAD(P)H, оцениваемому по приросту интенсивности I460 [величина прироста обозначена цифрами (в %) и отмечена стрелками, направленными вверх]. Время действия УФ-света на АГЗ клетки и их нахождение в темновых условиях обозначено в секундах на шкале абсцисс.Figure 3 - similar studies are presented for another type of highly aggressive tumor cells - Seidel ascites hepatoma (AGP), transplanted into rats [studied AGZ cells located in ascites fluid and when they metastasize to the spleen, as well as normal splenocytes surrounding metastasis (Fig. four)]. Ascitic AGH cells, as well as AGH metastasis cells (Fig. 3), were characterized by high potential resistance to the damaging effect of hypoxia, since they were capable of 3-5-fold restoration of the NAD (P) H pool, estimated by an increase in intensity I 460 [value growth is indicated by numbers (in%) and is marked by arrows pointing upwards]. The time of action of UV light on AGZ cells and their presence in dark conditions is indicated in seconds on the abscissa scale.
На фиг.4 - аналогичные спектрофлуоресцентные исследования клеток от тканевого отпечатка селезенки крысы-опухоленосителя (фиг.3), проведены в условиях гипоксии для спленоцитов, т.е. нетрансформированных клеток селезенки, окружающих клетки АГЗ метастаза. Такие спленоциты характеризовались низкой потенциальной устойчивостью к повреждающему действию УФ-света, так как для них обнаружена характерная перманентная фотодеструкция интенсивности флуоресценции NAD(P)H при λ=460 нм (I460), выявляемая как при действии УФ-света, так и в его отсутствие (фотодеструкция интенсивности флуоресценции NAD(P)H при λ=460 нм на фиг.4 оказана в % по оси ординат).Figure 4 - similar spectrofluorescence studies of cells from tissue imprint of the spleen of a rat tumor carrier (figure 3), carried out under hypoxia for splenocytes, i.e. non-transformed spleen cells surrounding AGZ metastasis cells. Such splenocytes were characterized by low potential resistance to the damaging effect of UV light, since they revealed a characteristic permanent photodestruction of the fluorescence intensity of NAD (P) H at λ = 460 nm (I 460 ), detected both under the action of UV light and in it absence (photo-destruction of the fluorescence intensity of NAD (P) H at λ = 460 nm in Fig. 4 is shown in% along the ordinate).
На фиг.5 представлены результаты спектрофлуоресцентных исследований клеток [из биопсии подмышечного лимфатического узла пациентки (46 лет)], которые были диагностированы как раковые. В условиях гипоксии эти клетки проявляли способность восстанавливать NAD(P)H флуоресценцию в темновых условиях [при выключении УФ-света (незаштрихованные участки)], интенсивность которой измерялась по приросту I460 (в %). Величина прироста I460 обозначена стрелкой, направленной вверх. Количество циклов NAD(P)H флуоресценции в таких клетках было ограничено (1-2 цикла не более), что указывало на невысокую устойчивость этих клеток к гипоксии в сравнении с АГЗ клетками (фиг.3).Figure 5 presents the results of spectrofluorescence studies of cells [from a biopsy of the axillary lymph node of the patient (46 years old)], which were diagnosed as cancerous. Under hypoxic conditions, these cells showed the ability to restore NAD (P) H fluorescence in dark conditions [when turning off UV light (open areas)], the intensity of which was measured by the increase in I 460 (in%). The increase in I 460 is indicated by an arrow pointing up. The number of NAD (P) H fluorescence cycles in such cells was limited (1-2 cycles no more), which indicated a low resistance of these cells to hypoxia in comparison with AGZ cells (Fig. 3).
На фиг.6 представлены результаты спектрофлуоресцентных исследования той же суспензии клеток (из биопсийного материала пациентки), которые были диагностированы как нетрансформированные. Для этих клеток была характерна перманентная УФ-индуцируемая фотодеструкция I460 как при действии УФ-света (заштрихованные участки), так и в отсутствие УФ-света (незаштрихованные участки). Для этих клеток также было обнаружено типичное увеличение содержания ФППОЛ (в %) и снижение доли базальной NAD(P)H флуоресценции I460, шкала ординат).Figure 6 presents the results of spectrofluorescence studies of the same cell suspension (from the biopsy material of the patient), which were diagnosed as untransformed. These cells were characterized by permanent UV-induced photodestruction I 460 both under the action of UV light (shaded areas) and in the absence of UV light (unshaded areas). For these cells, a typical increase in the content of FPPOL (in%) and a decrease in the proportion of basal NAD (P) H fluorescence I 460 , ordinate scale) were also found.
Сущность изобретения поясняется также примером конкретного осуществления.The invention is also illustrated by an example of a specific implementation.
ПРИМЕР.EXAMPLE.
У больной К. (46 лет) с подозрением на развитие процессов метастазирования рака молочной железы в близлежащий лимфоузел был взят биопсийный материал (в виде клеточной суспензии) для цитологического и гистологического исследования.Patient K. (46 years old) with a suspicion of the development of breast cancer metastasis in a nearby lymph node was taken biopsy material (in the form of a cell suspension) for cytological and histological examination.
Часть изъятого биопсийного образца была помещена во влажную охлаждаемую камеру с целью сохранения клеток во время их транспортировки в лабораторию. Исследования предлагаемым способом были проведены через 1,5 часа после изъятия клеточного материала. С этой целью изучаемую суспензию клеток помещали между предметным и покровными стеклами, края которых плотно запечатывали жидким парафином для создания условий гипоксии в изучаемых клетках. Далее на люминесцентном микроскопе МЛД-2, используя ртутную лампу сверхвысокого давления ДРШ-250-2 (источник УФ-света, λ-365 нм), проводили спектрофлуоресцентные исследования кинетики фотодеструкции I460 в анализируемых клетках, находящихся в условиях гипоксии при действии на них УФ-света и при его выключении (темновые условия). Проводили поиск клеток, которые обладали способностью к репарации интенсивности NAD(P)H флуоресценции (I460) в темновых условиях. Такие клетки диагностировались авторами как раковые [(фиг.5), эффект указан стрелкой, направленной вверх)]. Другие же клетки, для которых была характерна перманентная УФ-индуцируемая фотодеструкция как при действии УФ-света, так и в его отсутствие диагностировались как нетрансформированные (фиг.6). Полученные результаты представлены на фиг.5 и фиг.6. Как видно из фиг.5 и фиг.6, в условиях сохраняющейся гипоксии среди анализируемых клеток были обнаружены клетки (фиг.5), способные к приросту интенсивности NAD(P)H флуоресценции (I460) в темновых условиях, что позволяло идентифицировать их как злокачественные опухолевые клетки. Эти клетки обнаруживали единичные циклы репарации NAD(P)H флуоресценции в темновых условиях (единичная стрелка вверх), что позволяло их идентифицировать как раковые клетки, хотя они и не обладали столь высокой потенциальной устойчивостью к гипоксии как высокозлокачественные АГЗ клетки (фиг.3).A portion of the seized biopsy sample was placed in a humid cooled chamber in order to preserve the cells during their transportation to the laboratory. Studies of the proposed method were carried out 1.5 hours after the removal of cellular material. For this purpose, the studied cell suspension was placed between a glass slide and a cover slip, the edges of which were tightly sealed with liquid paraffin to create hypoxic conditions in the studied cells. Then, using an MLD-2 luminescent microscope, using a DRSh-250-2 ultrahigh-pressure mercury lamp (UV light source, λ-365 nm), spectrofluorescence studies of the photodetection kinetics of I 460 were performed in the analyzed cells under hypoxia under the influence of UV -light and when it is turned off (dark conditions). A search was made for cells that were capable of repairing the intensity of NAD (P) H fluorescence (I 460 ) under dark conditions. Such cells were diagnosed as cancerous by the authors [(Fig. 5), the effect is indicated by an arrow pointing up)]. Other cells, which were characterized by permanent UV-induced photodegradation, both under the action of UV light and in its absence, were diagnosed as non-transformed (Fig.6). The results are presented in Fig.5 and Fig.6. As can be seen from Fig. 5 and Fig. 6, under conditions of persistent hypoxia among the analyzed cells, cells were detected (Fig. 5), capable of increasing the intensity of NAD (P) H fluorescence (I 460 ) in dark conditions, which made it possible to identify them as malignant tumor cells. These cells showed single NAD (P) H repair cycles of fluorescence under dark conditions (single up arrow), which allowed them to be identified as cancer cells, although they did not have such high potential resistance to hypoxia as high-grade AGZ cells (Fig. 3).
Большинство анализируемых клеток в биопсийном образце пациентки не проявляло способность к репарации NAD(P)H флуоресценции в темновых условиях (фиг.6), что позволяло их отнести к нетрансформированным клеткам.Most of the analyzed cells in the biopsy sample of the patient did not show the ability to repair NAD (P) H fluorescence in dark conditions (Fig.6), which allowed them to be attributed to untransformed cells.
Диагноз затем был подтвержден гистологически.The diagnosis was then confirmed histologically.
Таким образом, проведенные исследования, результаты которых отражены на фиг.1-6, подтверждают возможность выявления даже единичных злокачественных клеток по их потенциальной устойчивости к гипоксии (выживаемости) в темновых условиях.Thus, the studies conducted, the results of which are shown in figures 1-6, confirm the possibility of detecting even single malignant cells by their potential resistance to hypoxia (survival) in dark conditions.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011130947/14A RU2463963C1 (en) | 2011-07-26 | 2011-07-26 | Method of diagnosing cancer and potential resistance of malignant cells to hypoxia |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011130947/14A RU2463963C1 (en) | 2011-07-26 | 2011-07-26 | Method of diagnosing cancer and potential resistance of malignant cells to hypoxia |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2463963C1 true RU2463963C1 (en) | 2012-10-20 |
Family
ID=47145278
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011130947/14A RU2463963C1 (en) | 2011-07-26 | 2011-07-26 | Method of diagnosing cancer and potential resistance of malignant cells to hypoxia |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2463963C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2547790C1 (en) * | 2013-10-18 | 2015-04-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный Центр сердца, крови и Эндокринологии имени В.А. Алмазова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of evaluating tolerance to physical loading by measurement of autofluorescent properties of skin |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100075367A1 (en) * | 2003-07-22 | 2010-03-25 | Vadivel Masilamani | Lung cancer detection by optical analysis of body fluids |
| RU2387376C1 (en) * | 2008-11-27 | 2010-04-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Красноярская государственная медицинская академия имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" | Method of fluorescent diagnostics of basal cell skin cancer |
| UA55311U (en) * | 2010-06-01 | 2010-12-10 | Черновицкий Национальный Университет Имени Юрия Федьковича | Method differential fluorescent diagnostics of pathology of stomach |
-
2011
- 2011-07-26 RU RU2011130947/14A patent/RU2463963C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100075367A1 (en) * | 2003-07-22 | 2010-03-25 | Vadivel Masilamani | Lung cancer detection by optical analysis of body fluids |
| RU2387376C1 (en) * | 2008-11-27 | 2010-04-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Красноярская государственная медицинская академия имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" | Method of fluorescent diagnostics of basal cell skin cancer |
| UA55311U (en) * | 2010-06-01 | 2010-12-10 | Черновицкий Национальный Университет Имени Юрия Федьковича | Method differential fluorescent diagnostics of pathology of stomach |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SUN Y. et al. Fluorescence lifetime imaging microscopy for brain tumor image-guided surgery. J Biomed Opt. 2010 Sep-Oct; 15(5):056022. (реферат), [он-лайн], [найдено 27.02.2012], найдено из базы данных PubMed. GEORGAKOUDI I. et al. NAD(P)H and collagen as in vivo quantitative fluorescent biomarkers of epithelial precancerous changes. Cancer Res. 2002 Feb 1; 62(3):682-7. (реферат), [он-лайн], [найдено 27.02.2012], найдено из базы данных PubMed. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2547790C1 (en) * | 2013-10-18 | 2015-04-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный Центр сердца, крови и Эндокринологии имени В.А. Алмазова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of evaluating tolerance to physical loading by measurement of autofluorescent properties of skin |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Panikar et al. | Towards translation of surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) to clinical practice: Progress and trends | |
| Kong et al. | Raman spectroscopy for medical diagnostics—From in-vitro biofluid assays to in-vivo cancer detection | |
| Mo et al. | High wavenumber Raman spectroscopy for in vivo detection of cervical dysplasia | |
| Wang et al. | Rapid diagnosis and intraoperative margin assessment of human lung cancer with fluorescence lifetime imaging microscopy | |
| Drezek et al. | Autofluorescence microscopy of fresh cervical‐tissue sections reveals alterations in tissue biochemistry with dysplasia¶ | |
| Ramos et al. | Current advances in the application of Raman spectroscopy for molecular diagnosis of cervical cancer | |
| JP2002530676A (en) | Cell in situ analysis method | |
| Roden et al. | Analysis of MAML2 rearrangement in mucoepidermoid carcinoma of the thymus | |
| Kaur et al. | Recent advances in point-of-care diagnostics for oral cancer | |
| Rubina et al. | Raman spectroscopy in cervical cancers: an update | |
| EP2596348B1 (en) | System and method for analyzing samples labeled with 5, 10, 15, 20 tetrakis (4-carboxyphenyl) porphine (tcpp) | |
| AU2010247132B2 (en) | Tissue sample analysis | |
| Liang et al. | Exploring type II microcalcifications in benign and premalignant breast lesions by shell-isolated nanoparticle-enhanced Raman spectroscopy (SHINERS) | |
| Chacko et al. | NAD (P) H fluorescence lifetime measurements in fixed biological tissues | |
| Atif et al. | A study for the detection of kidney cancer using fluorescence emission spectra and synchronous fluorescence excitation spectra of blood and urine | |
| JP2002521682A5 (en) | ||
| Wang et al. | Evaluation of Raman spectroscopy for diagnosing EGFR mutation status in lung adenocarcinoma | |
| Al-Sammarraie et al. | Silver nanoparticles-based substrate for blood serum analysis under 785 nm laser excitation | |
| CN106834511A (en) | A kind of kit of the breast cancer detection based on liquid biopsy | |
| Nomura et al. | Detection of field alterations using useful tools for oral squamous cell carcinoma | |
| KR20140055145A (en) | A method of sequential and multiple immunostaining for detection of various antigens in the same specimens | |
| RU2463963C1 (en) | Method of diagnosing cancer and potential resistance of malignant cells to hypoxia | |
| CN107847145B (en) | Photonic structures and chemometric pathological systems | |
| Krishnamurthy et al. | Feasibility of using digital confocal microscopy for cytopathological examination in clinical practice | |
| Palmer et al. | Diagnosis of breast cancer using optical spectroscopy |