RU2458992C1 - Способ определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови - Google Patents
Способ определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови Download PDFInfo
- Publication number
- RU2458992C1 RU2458992C1 RU2011118091/15A RU2011118091A RU2458992C1 RU 2458992 C1 RU2458992 C1 RU 2458992C1 RU 2011118091/15 A RU2011118091/15 A RU 2011118091/15A RU 2011118091 A RU2011118091 A RU 2011118091A RU 2458992 C1 RU2458992 C1 RU 2458992C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- peroxidase activity
- blood plasma
- hemoglobin
- plasma
- dianisidine
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биохимической диагностике и касается способа определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови. В разбавленную фосфат-цитратным буфером (рН 5,5) плазму крови вносят субстрат о-дианизидин. После добавления пероксида водорода в концентрации 2 мМ осуществляют спектрофотометрическое определение скорости окисления субстрата в присутствии ингибитора миелопероксидазы - гидразида 4-аминобензойной кислоты. Пероксидазную активность гемоглобина в плазме крови определяют как скорость окисления субстрата о-дианизидина. Способ позволяет быстро и достоверно определить вклад гемоглобина в общую пероксидазную активность плазмы крови, что может быть использовано в прогнозировании развития заболеваний и выборе стратегии их лечения. 2 ил., 1 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к биохимической диагностике, а именно к способам определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови.
Определение параметров, характеризующих окислительно-восстановительные и воспалительные процессы в крови, необходимо как для диагностики и прогнозирования течения заболеваний, так и для мониторинга эффективности проводимой терапии. Одним из таких важных показателей является пероксидазная активность плазмы крови, которая определяется преимущественно активностью железосодержащих белков миелопероксидазы (МПО) и гемоглобина и его производных.
Являясь основным компонентом эритроцитов, гемоглобин при патологических процессах в результате разрушения эритроцитов (гемолиза) в достаточно больших количествах (до 15,3 мкМ) может попадать в плазму крови. Так, показано изменение содержания свободного гемоглобина в плазме при гемолитических анемиях, сердечной недостаточности, сахарном диабете и др.
МПО секретируется во внеклеточное пространство в результате дегрануляции или лизиса лейкоцитов в очагах воспаления. Повышение концентрации МПО, а также появление ее биомаркеров обнаружено при атеросклерозе, сердечно-сосудистых, онкологических, нейродегенеративных заболеваниях, нарушении дыхательной функции легких, при заболеваниях почек, системных васкулитах, ревматоидном артрите и др.
Известен способ определения пероксидазной активности МПО в плазме, включающий внесение в плазму крови субстрата пероксидаз, в качестве которого используют о-дианизидин, и спектрофотометрическое определение скорости окисления субстрата после добавления пероксида водорода (100-200 мкМ) в присутствии и в отсутствие ингибитора МПО - гидразида 4-аминобензойной кислоты в фосфат-цитратном буфере (рН 4,5) [1]. Однако данным способом нельзя оценить пероксидазную активность гемоглобина в плазме.
В качестве прототипа принят способ определения общей пероксидазной активности плазмы, включающий внесение в плазму крови субстрата, в качестве которого используют о-дианизидин, и спектрофотометрическое определение скорости его окисления в присутствии пероксида водорода (3 мМ) в фосфатном буфере (рН 6,9) [2].
Однако известный способ имеет недостатки, так как не позволяет оценивать пероксидазную активность присутствующего в плазме гемоглобина, а дает возможность определить лишь общую пероксидазную активность, включающую вклад как МПО, так и гемоглобина.
Задачей изобретения является создание способа быстрого определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови.
Поставленная задача достигается тем, что в способе определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови, включающем внесение субстрата о-дианизидина в разбавленную буферным раствором плазму крови, спектрофотометрическое определение скорости окисления субстрата осуществляют в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты в фосфат-цитратном буфере (рН 5,5), пероксид водорода используют в концентрации 2 мМ, а пероксидазную активность гемоглобина в плазме крови определяют как скорость окисления о-дианизидина.
Сущность изобретения состоит в том, что субстрат о-дианизидин вносят в разбавленную буферным раствором плазму крови, спектрофотометрически определяют пероксидзаную активность гемоглобина как скорость окисления субстрата после добавления пероксида водорода (2 мМ) в фосфат-цитратном буфере (рН 5,5) в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты. Такие условия измерения позволяют минимизировать вклад миелопероксидазы в определяемую пероксидазную активность гемоглобина.
Сущность предлагаемого изобретения поясняется чертежами, где:
на фиг.1 показана рН-зависимость пероксидазной активности гемоглобина (1 мкМ) в плазме;
на фиг.2 приведена зависимость пероксидазной активности гемоглобина (1 мкМ) в плазме от концентрации H2O2.
Способ позволяет определить пероксидазную активность гемоглобина в плазме крови. Это дает возможность прогнозировать развитие заболеваний, уточнить диагноз и своевременно принять меры, направленные на регулирование пероксидазной активности гемоглобина, а также провести мониторинг пероксидазной активности плазмы во время клинических испытаний фармакологических препаратов.
Простота и скорость предлагаемого способа обеспечивают возможность его использования в экспресс-диагностике.
Способ осуществляется следующим образом. Для работы используют спектрофотометр, позволяющий регистрировать оптическую плотность в видимой области спектра. Отделенную от клеточного осадка путем центрифугирования плазму крови в количестве 60-70 мкл вносят в спектрофотометрическую кювету объемом не менее 0,8 мл, содержащую фосфат-цитратный буфер (рН 5,5) в присутствии ингибитора МПО - гидразида 4-аминобензойной кислоты (50 мкМ), и субстрат о-дианизидин (380 мкМ). После добавления пероксида водорода (2 мМ) пробу (общий объем пробы 0,8 мл) быстро перемешивают непосредственно в кювете и начинают регистрацию увеличения оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 450-460 нм в течение 8-10 мин. Оптическим контролем служит проба, содержащая те же компоненты, что и опытная проба, но вместо плазмы добавлен равный объем буферного раствора. Расчет пероксидазной активности гемоглобина (ПАHb) проводят по формуле:
где ΔD - прирост оптической плотности при 460 нм за t минут;
V - общий объем реакционной смеси (мл);
υ - объем образца плазмы (мл);
0,0152 - прирост ΔD, соответствующий окислению 1 мкМ о-дианизидина. Данный коэффициент определяли по калибровочной прямой зависимости оптической плотности при 460 нм от концентрации о-дианизидина (25-150 мкМ) после его полного окисления пероксидазой хрена (0,1 мкг/мл) в присутствии пероксида водорода (2 мМ). Единица пероксидазной активности гемоглобина в плазме (ПАHb) выражена в условных единицах (далее усл. ед.) и соответствует окислению 1 мкМ о-дианизидина за 1 минуту в описанных условиях.
Пример 1, демонстрирующий выбор оптимального рН при определении пероксидазной активности гемоглобина в плазме.
В одну опытную кювету вносили фосфат-цитратный буфер (0,05 М Na2HPO4/0,025 М), 60 мкл плазмы, содержащей гемоглобин в концентрации 13,3 мкМ, и субстрат - о-дианизидин (380 мкМ). В контрольную кювету - те же компоненты за исключением того, что вместо плазмы вносили 60 мкл фосфат-цитратного буфера. Общий объем образца - 0,8 мл. Растворы в кюветах тщательно перемешивали и одновременно в две кюветы добавляли раствор пероксида водорода (1 мМ). Содержимое кювет еще раз тщательно перемешивали и регистрировали оптическую плотность в опытных кюветах против контрольной пробы при длине волны 460 нм в течение 8-10 мин. Предлагаемым способом была измерена пероксидазная активность гемоглобина в плазме при различных значениях рН: 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0 и 7,0, что достигалось путем использования фосфат-цитратного буфера с указанными значениями рН.
Пероксидазная активность гемоглобина в плазме рассчитывалась согласно формуле:
где ΔDHb и ΔD - прирост оптической плотности за t мин в присутствии и в отсутствие добавленного извне гемоглобина соответственно;
0,8 - объем реакционной смеси (мл);
0,06 - объем плазмы в опытной пробе (мл).
Результаты измерений приведены на фиг.1, откуда следует, что зависимость пероксидазной активности гемоглобина в плазме от рН имеет максимум в диапазоне рН 4,5-5,5. Однако ранее было показано, что зависимость активности МПО от рН носит экстремальный характер с максимумом при рН 4,5 и значительно снижается при рН 5,5. Поэтому анализ данных, приведенных на фиг.1, позволяет сделать вывод о том, что значение рН 5,5 оптимально для измерения активности гемоглобина в плазме с миминальным вкладом активности МПО.
Пример 2, демонстрирующий выбор оптимальной концентрации пероксида водорода при определении пероксидазной активности гемоглобина в плазме.
Определение пероксидазной активности гемоглобина плазмы проводили, как описано в примере 1, но при различных концентрациях пероксида водорода в диапазоне 100-4000 мкМ. Используемый фосфат-цитратный буфер имел значение рН 5,5.
Результаты определения активности гемоглобина при разных добавках пероксида водорода приведены на фиг.2, откуда следует, что пероксидазная активность гемоглобина в плазме практически линейно увеличивалась с ростом концентрации H2O2 вплоть до 2 мМ. Анализ этих данных позволяет сделать вывод о том, что концентрация пероксида водорода, равная 2 мМ, оптимальна для определения пероксидазной активности гемоглобина.
Пример 3. Предлагаемым способом измерена активность гемоглобина в плазме крови 5 человек.
В одну опытную кювету вносили 60 мкл плазмы, фосфат-цитратный буфер (0,05 М Na2HPO4/0,025 М), (рН 5,5), гидразид 4-аминобензойной кислоты в концентрации 50 мкМ и субстрат - о-дианизидин (380 мкМ). В контрольную кювету - те же компоненты за исключением того, что вместо плазмы вносили 60 мкл фосфат-цитратного буфера. Содержание кювет тщательно перемешивали и одновременно в две кюветы добавляли раствор пероксида водорода (2 мМ). Содержимое кювет еще раз тщательно перемешивали и начинали регистрацию плотности в опытных кюветах против контрольной пробы при длине волны 460 нм в течение 8-10 мин.
Пероксидазная активность гемоглобина в плазме рассчитывалась согласно формуле:
где ΔD - прирост оптической плотности плазмы крови за t мин;
0,8 - объем реакционной смеси (мл);
0,06 - объем плазмы в опытной пробе (мл).
Полученные результаты приведены в таблице.
Таблица | |
Показатель пероксидазной активности гемоглобина в плазме | |
Номер образца | ПАHb, усл. ед. |
1 | 0,855 |
2 | 0,789 |
3 | 6,776 |
4 | 0,461 |
5 | 5,263 |
Анализ данных, приведенных в таблице, позволяет сделать вывод о том, что предлагаемый способ пригоден для определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет быстро и реально определить пероксидазную активность гемоглобина в плазме крови.
Источники информации
1. Патент BY №13675, G01N 33/48, 30.10.2010.
2. Waugh W.H. (2003) J. Pediatr. Hematol. Oncol, 25, 831-834.
Claims (1)
- Способ определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови, включающий внесение субстрата о-дианизидина в разбавленную буферным раствором плазму крови с последующим спектрофотометрическим определением скорости его окисления после добавления пероксида водорода, отличающийся тем, что спектрофотометрическое определение скорости окисления субстрата осуществляют в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты в фосфат-цитратном буфере (рН 5,5), пероксид водорода используют в концентрации 2 мМ, а пероксидазную активность гемоглобина в плазме крови определяют как скорость окисления о-дианизидина.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011118091/15A RU2458992C1 (ru) | 2011-05-04 | 2011-05-04 | Способ определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011118091/15A RU2458992C1 (ru) | 2011-05-04 | 2011-05-04 | Способ определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2458992C1 true RU2458992C1 (ru) | 2012-08-20 |
Family
ID=46936682
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2011118091/15A RU2458992C1 (ru) | 2011-05-04 | 2011-05-04 | Способ определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2458992C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2612149C1 (ru) * | 2015-11-23 | 2017-03-02 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского" | Способ определения активности миелопероксидазы нейтрофилов в мазках крови животных |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0222700B1 (en) * | 1985-10-31 | 1991-01-02 | Warner-Lambert Company | Composition and method for determining peroxidase-like activity of hemoglobin |
EP0444273B1 (en) * | 1990-01-30 | 1994-11-02 | Miles Inc. | Composition, device and method of assaying for a peroxidatively active substance |
-
2011
- 2011-05-04 RU RU2011118091/15A patent/RU2458992C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0222700B1 (en) * | 1985-10-31 | 1991-01-02 | Warner-Lambert Company | Composition and method for determining peroxidase-like activity of hemoglobin |
EP0444273B1 (en) * | 1990-01-30 | 1994-11-02 | Miles Inc. | Composition, device and method of assaying for a peroxidatively active substance |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
WAUGH W.H. Simplified method to assay total plasma peroxidase activity and ferriheme products in sickle cell anemia, with initial results in assessing clinical severity in a trial with citrulline therapy. J Pediatr Hematol Oncol. 2003 Oct; 25(10): 831-834. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2612149C1 (ru) * | 2015-11-23 | 2017-03-02 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского" | Способ определения активности миелопероксидазы нейтрофилов в мазках крови животных |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Dounousi et al. | Oxidative stress is progressively enhanced with advancing stages of CKD | |
Turpin et al. | Enhanced oxidative stress and damage in glycated erythrocytes | |
Can et al. | Role of oxidative stress and serum lipid levels in stable chronic obstructive pulmonary disease | |
Davison et al. | Exercise, free radicals, and lipid peroxidation in type 1 diabetes mellitus | |
Lacy et al. | Plasma hydrogen peroxide production in hypertensives and normotensive subjects at genetic risk of hypertension | |
Kirk | Neonatal jaundice: a critical review of the role and practice of bilirubin analysis | |
Gaggini et al. | Conventional and innovative methods to assess oxidative stress biomarkers in the clinical cardiovascular setting | |
Gorni et al. | Oxidative stress in elderly population: A prevention screening study | |
Qi et al. | Thioredoxin is a novel diagnostic and prognostic marker in patients with ischemic stroke | |
JPH09511575A (ja) | ヘモグロビンの定量用無シアン化物試薬及び方法 | |
JP2015509361A (ja) | 酵素法を利用したヘモグロビンA1c定量分析のための溶血試薬組成物 | |
de Macedo et al. | Strong anion determination in biological fluids by capillary electrophoresis for clinical diagnostics | |
Bulbul et al. | Are oxidative stress markers useful to distinguish schizoaffective disorder from schizophrenia and bipolar disorder? | |
Lentini et al. | The role of advanced oxidation protein products in intensive care unit patients with acute kidney injury | |
Schillern et al. | Serum free thiols in type 2 diabetes mellitus: A prospective study | |
Samanta | Glycated hemoglobin and subsequent risk of microvascular and macrovascular complications | |
Gomes et al. | Assessment of oxidative status markers and NO bioavailability in hypertensive disorders of pregnancy | |
Maciejczyk et al. | Effect of normobaric hypoxia on alterations in redox homeostasis, nitrosative stress, inflammation, and lysosomal function following acute physical exercise | |
Cialoni et al. | Nitric oxide and oxidative stress changes at depth in breath-hold diving | |
Lima et al. | Identification of erythrocyte biomarkers in amyotrophic lateral sclerosis | |
Sánchez-Illana et al. | Oxidative stress biomarkers in the preterm infant | |
RU2458992C1 (ru) | Способ определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови | |
Polat et al. | Comparison of oxidative stress parameters, thiol-disulfide homeostasis, and pro-inflammatory cytokines levels in patients with bipolar disorder and their first-degree relatives | |
WO2016172650A1 (en) | Micro magnetic resonance relaxometry | |
RU2700708C1 (ru) | Способ раздельного определения органических и неорганических гидропероксидов при помощи хемилюминесценции с использованием каталазы |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140505 |