RU2458067C2 - Способ выделения плазминогена или плазмина в присутствии фибриногена из смеси - Google Patents
Способ выделения плазминогена или плазмина в присутствии фибриногена из смеси Download PDFInfo
- Publication number
- RU2458067C2 RU2458067C2 RU2008130356/10A RU2008130356A RU2458067C2 RU 2458067 C2 RU2458067 C2 RU 2458067C2 RU 2008130356/10 A RU2008130356/10 A RU 2008130356/10A RU 2008130356 A RU2008130356 A RU 2008130356A RU 2458067 C2 RU2458067 C2 RU 2458067C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- plasmin
- ogen
- matrix
- plasminogen
- tranexamic acid
- Prior art date
Links
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 title claims abstract description 163
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 title claims abstract description 40
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 title claims abstract description 40
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 title claims abstract description 40
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 32
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 title claims abstract description 19
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 title claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 89
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 claims abstract description 165
- 229960000401 tranexamic acid Drugs 0.000 claims abstract description 79
- GYDJEQRTZSCIOI-LJGSYFOKSA-N tranexamic acid Chemical compound NC[C@H]1CC[C@H](C(O)=O)CC1 GYDJEQRTZSCIOI-LJGSYFOKSA-N 0.000 claims abstract description 79
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 41
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 26
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims abstract description 26
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 5
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims abstract description 4
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 claims abstract 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 45
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 37
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 37
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 27
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 17
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 claims description 16
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 14
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 14
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 11
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 7
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 5
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 4
- UYBWIEGTWASWSR-UHFFFAOYSA-N 1,3-diaminopropan-2-ol Chemical compound NCC(O)CN UYBWIEGTWASWSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 3
- 101100008681 Glycine max DHPS1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical group ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- UATJOMSPNYCXIX-UHFFFAOYSA-N Trinitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1 UATJOMSPNYCXIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 claims description 3
- NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diamine Chemical compound NCCCCCCN NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 claims description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 claims description 3
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 claims description 2
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 2
- 239000003925 fat Substances 0.000 claims description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 2
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims 1
- XNYADZUHUHIGRZ-UHFFFAOYSA-N propane-1,1,3-triamine Chemical compound NCCC(N)N XNYADZUHUHIGRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 17
- 229940099990 ogen Drugs 0.000 description 139
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 70
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 59
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 59
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 44
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 41
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 37
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 35
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 35
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 26
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 24
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 23
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 20
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 19
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 19
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 13
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 12
- KHURTEAYLZEQHD-UHFFFAOYSA-N 3-n-propylpropane-1,1,3-triamine Chemical compound CCCNCCC(N)N KHURTEAYLZEQHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 9
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 9
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 9
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 8
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 8
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 7
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 6
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000001567 anti-fibrinolytic effect Effects 0.000 description 5
- 239000004023 fresh frozen plasma Substances 0.000 description 5
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 4
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 4
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000002806 plasmin inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AQYNZOSCOWGGTP-UHFFFAOYSA-N 2-pyridin-2-ylsulfanylpyridine Chemical compound C=1C=CC=NC=1SC1=CC=CC=N1 AQYNZOSCOWGGTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Natural products CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 2
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 2
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 2
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 2
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 125000002723 alicyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 2
- 239000003914 blood derivative Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 2
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 125000001288 lysyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- -1 tranexamic acid Chemical class 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- PKWPJBDFDHJNER-UHFFFAOYSA-N 1-(aminomethyl)bicyclo[2.2.2]octane-4-carboxylic acid Chemical compound C1CC2(C(O)=O)CCC1(CN)CC2 PKWPJBDFDHJNER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IEJPPSMHUUQABK-UHFFFAOYSA-N 2,4-diphenyl-4h-1,3-oxazol-5-one Chemical compound O=C1OC(C=2C=CC=CC=2)=NC1C1=CC=CC=C1 IEJPPSMHUUQABK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 1
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 1
- 101710081722 Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101150096839 Fcmr gene Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710196208 Fibrinolytic enzyme Proteins 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N Hydroxyethyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCO WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 239000004166 Lanolin Substances 0.000 description 1
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N N-phenyl amine Chemical group NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940122791 Plasmin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical group 0.000 description 1
- 125000002490 anilino group Chemical group [H]N(*)C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 230000001475 anti-trypsic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 1
- 229960003589 arginine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001559 benzoic acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- DAEAPNUQQAICNR-GFCOJPQKSA-N dadp Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 DAEAPNUQQAICNR-GFCOJPQKSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229940039717 lanolin Drugs 0.000 description 1
- 235000019388 lanolin Nutrition 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 108010064755 lys-plasmin Proteins 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 1
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000011546 protein dye Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N tributyl phosphate Chemical compound CCCCOP(=O)(OCCCC)OCCCC STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 1
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 1
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 1
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6435—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для выделения плазминогена или плазмина. Смесь, содержащую фибриноген и плазминоген или плазмин, наносят на хроматографическую колонку, содержащую нерастворимую матрицу для аффинной хроматографии, ковалентно сшитую с транексамовой кислотой. Затем проводят элюирование плазминогена или плазмина с матрицы для аффинной хроматографии водным раствором, содержащим достаточное количество лиганда, конкурирующего с плазмином или плазминогеном за связывающие участки указанной матрицы, связанной с транексамовой кислотой. При этом транексамовая кислота ковалентно связана с указанной матрицей через линкер, который находится между матрицей и транексамовой кислотой и длина которого составляет более трех атомов углерода. Изобретение позволяет повысить эффективность выделения плазминогена или плазмина в присутствии фибриногена из смеси. 9 з.п. ф-лы, 13 табл., 1 ил., 6 пр.
Description
ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Область техники
Данное изобретение относится к использованию смолы и созданию способа для специфического удаления плазмин(огена) и его производных из белковых растворов, причем полученный белковый раствор можно использовать для внутривенного введения и для местных применений, то есть в виде матриксного носителя для пролонгированного высвобождения и заживления ран или в виде индивидуального активного компонента, или в сочетании с другими фармацевтическими соответствующими лекарственными средствами. Удаление плазмин(огена) позволяет сохранять целостность и функцию белкового раствора во время более длительных периодов инкубации. Данное изобретение также относится к получению высокоочищенного плазмин(огена) для терапевтического применения.
Смежная область
Плазмин(оген) или его активная молекула плазмин (в дальнейшем плазмин(оген)) очень часто загрязняет белковые растворы, особенно растворы, экстрагированные из жидкостей или органов животных. С признанием плазмин(оген)а в качестве стабильного фармацевтического продукта присутствие плазмин(огена) в белковом растворе представляет многократную опасность, обусловленную известной протеолитической активностью молекулы в отношении различных белков и пептидов по пептидным связям аргинила и лизила (Weinstein M.J., Doolittle RF. Differential specificities of the thrombin, plasmin and trypsin with regard to synthetic and natural substrates and inhibitors RF Biochim Biophys Acta. 1972. 258: 577-90 и Ling CM, Summaria L, Robbins KC. Mechanism of formation of bovine plasmin(ogen) activator from human plasmin. J. Biol. Chem. 1965. 240: 4212-B); и основных аминокислот, его стимулирующей активностью в отношении различных тканей, особенно ткани центральной нервной системы, и его ролью в связывании (Chen ZL, Strickland S. Neuronal death in the hippocampus is promoted by plasmincatalyzed degradation of liminin. Cell. 1997. 91: 917-25) и, вероятно, поддержании прионов в крови млекопитающих (Fischer MB, Roeckl C, Parizek P, Schwarz HP. Aguzzi A Binding of disease associated prion protein to plasmin(ogen). Nature. 2000. 408: 479-83).
Разработано несколько хроматографических способов очистки плазмин(огена) из белковых растворов и, следовательно, удаления плазмин(огена) из белкового раствора.
Упомянутые способы по существу базируются на двух принципах. Первая группа способов основана на нескольких последовательных стадиях очистки, в которых используют различную растворимость, изоэлектрическую точку или распределение по размеру молекул (Alkjaerisig N. The purification and properties of human plasmin(ogen). Biochem. J. 1963, 93: 171-182). Так как их основной целью было очистить плазмин(оген), упомянутые способы полностью изменяли состав белкового раствора. Вторая группа способов основана на одностадийной аффинной очистке. Очистка базируется на связывании плазмин(огена) с различными синтетическими лигандами ω-аминокарбоновых кислот, которые могут связываться по лизин-связывающим участкам на тяжелой цепи плазмин(огена). Названные участки, состоящие из 5 дисульфидных мостиков тройной петли с гомологией внутренних последовательностей, известных как крингл-домены плазмин(огена), локализованных на NH2-конце тяжелой цепи плазмин(огена) и на большом расстоянии от каталитического центра, расположенного на СООН-конце легкой цепи, связывают фибрин(оген). Другой возможной перспективой для аффинной хроматографии является связывание плазмин(огена) через каталитический центр, потенциально менее специфическое связывание, так как он может связывать многие белки, такие как сериновые протеазы, имеющие подобное или более низкое сродство к пептидным связям аргинила или лизила и основным аминокислотам. Кратко, можно заключить, что, по существу, плазмин(оген)-аффинную хроматографию проводят с помощью определенного лиганда, который химически и по ионогенности напоминает ω-аминокарбоновую кислоту или субстрат каталитического центра плазмина. Лиганд связывается со смолой через соответствующий связывающий мостик или линкер. Однако идеальная аффинная смола для удаления плазмин(огена) по существу не является той смолой, которую создавали как идеальную для очистки плазмин(огена). Такие смолы должны содержать лиганд, который связывает плазмин(оген) с высоким сродством и имеет очень низкое сродство к другим белкам, таким как другие сериновые протеазы, и особенно очень низкое сродство к фибриногену, который является главным белком во фракции I Кона (Cohn) плазмы или в криопреципитатах. Также важно, что удаление плазмин(огена) с использованием данной аффинной хроматографии может быть проведено с помощью различных буферов и не ограничено определенным буфером, который может нарушать стабильность и целостность тех белков в растворе, которые, в отличие от плазмино(огена), и представляют интерес.
Антифибринолитическая активность (способность ингибировать высокоаффинное связывание плазмин(огена) с фибриногеном) ω-аминокарбоновых кислот зависит от присутствия свободной амино- и карбоксильной группы и от расстояния между СООН-группой и атомами углерода, к которым присоединяется NH2-группа (Markwardt 1978), такая как группа ε-аминокапроновой кислоты (ЕАСА) и пара-аминобензамидина (PAMBA). Сравнение антифибринолитических активностей ЕАСА и PAMBA показало, что последний является приблизительно в три раза более активным. Shimura et al. (1984) предложили смолу, в которой парааминобензамидин связан с микрочастицами гидрофильного винилполимера через связующий (линкерный) фрагмент. С использованием описанной смолы Shimura et al. удалось разделить плазмин и плазмин(оген) методом аффинной хроматографии высокого разрешения. Факты, что плазмин(оген) невозможно элюировать с помощью одной только 6-аминогексаноевой кислоты и что 3 М мочевина должна быть введена в элюционный буфер, указывают на двухцентровое взаимодействие плазмина с названным иммобилизованным лигандом, то есть с лизин-связывающими участками на тяжелой цепи и с каталитическим участком на легкой цепи. Это может объяснить данные, полученные другими исследователями, что парааминобензамидин удаляет также некоторые другие белки.
Другую смолу, лизин-смолу, производят и применяют для аффинной очистки плазмин(огена). Однако антифибринолитическая активность лизина очень низка, а следовательно, также и его сродство связывания. Он также связывается с другими белками, и его специфичность зависит от буфера.
Moroz LA. Gilmore NJ в Fibrinolysis in normal plasma and blood: evidence for significant mechanisms independent of the plasminogen-plasmin system, Blood, 1976, 48, 531-45, описывают получение плазмы, не содержащей плазмин(оген), методом аффинной хроматографии. На основании использованных методов авторами сделано сообщение относительно данных, указывающих, что процессы, которые в высшей степени способствуют образованию фибринолитического фермента плазмина, играют в лучшем случае минорную роль в спонтанной или базальной фибринолитической активности, измеряемой в нормальной плазме человека. Транексамовую кислоту используют вместе с другими ингибиторами протеаз в качестве ингибиторов плазмина для измерения фибринолитической активности. Для получения плазмы, не содержащей плазмин(оген), используют способ Deutsch and Meltz, Science 170: 1095-1096, 1997.
Iwamoto в Thrombos. Diathes. Heamorrh. (Stuttg.), 1975, 33, 573, описывает специфическое связывание транексамовой кислоты с плазмином. Хотя транексамовая кислота идентифицирована как эффективный лиганд плазмина, показано, что антифибринолитическое действие транексамовой кислоты является результатом не только связывания плазмин(огена), а также увеличения кооперации природных антиплазминов. Поэтому следует заключить, что связывание транексамовой кислоты с твердым носителем будет удалять из плазмы не только плазмин(оген), но также и природные антиплазмины. Также следует предположить, что транексамовые кислоты могут вызывать образование агрегатов (конгломератов) с ингибиторами плазмина. Это понимание базируется на различиях, которые могут быть установлены при сравнении антифибринолитических активностей ε-аминокапроновой кислоты и транексамовой кислоты, приводящих к 98% и 91% ингибированию плазмы, стимулированной урокиназой, по сравнению с плазмой, которая получена из перорально гепаринизированной крови (65 и 39% для ε-аминокапроновой кислоты и транексамовой кислоты, соответственно - ср. таблицы 2 и 7 в статье Moroz et al.). Следует предположить, что вследствие их высокого коэффициента связывания транексамовая кислота и ε-аминокапроновая кислота являются хорошими кандидатами на высокоаффинные лиганды. Однако также следует предположить, что названные лиганды будут блокировать аффинную колонку в результате связывания плазмина и комплексов плазмин-ингибитор.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
На фигуре 1 представлен градиентный электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) (5-12% полиакриламид) 7 мкг белков, элюированных двумя способами (описаны в разделе Материалы и методы), с трех различных смол - ТЕА-сефарозы, Lys-Ceramic Hyper DF и Lys-сефарозы 4В. Дорожки: 1 - Glu-плазминоген; 2 - фибриноген; 3 - альбумин; 4 - иммуноглобулин G; 5 - стандарт молекулярных масс; элюционные пики: 6 - способа с использованием ТЕА; 7 - способа 2 с использованием ТЕА; 8 - способа 1 с использованием лизин-Ceramic Hyper D; 9 - способа 1 с использованием лизин-сефарозы; 10 - способа 1 с лизин-Ceramic Hyper D; 11 - способа 1 с использованием лизин-сефарозы.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение базируется на данных, что неподвижная аминокислота, как было установлено, способна специфически связывать плазмин(оген). В контексте описания изобретения выражение «специфически связывать» означает, что из смеси, содержащей белки, такие как плазмин(оген) и фибриноген, в основном удаляется плазмин(оген), тогда как фибриноген удерживается в смеси почти без изменений. Предпочтительно удаляют по меньшей мере от 85 до 99% плазмин(огена), и по меньшей мере 85% фибриногена остается в смеси. Более предпочтительно удаляют по меньшей мере от 98,0% до 99,9% плазминогена, или сохраняют 95%-99% фибриногена.
Аминогруппа аминокислоты и карбоксильная группа аминокислоты находятся на расстоянии около 6-8 ангстрем, предпочтительно около 7 ангстрем, неподвижная аминокислота ковалентно связана с носителем через аминогруппу аминокислоты. Особенно предпочтительными являются транексамовая кислота в ее трансконфигурации и 4-аминометилбицикло-[2.2.2]-октан-1-карбоновая кислота (EMBOCA).
Неожиданно было установлено, что, во-первых, ε-аминокапроновая кислота не работает так, как транексамовая кислота, и что как только транексамовая кислота связывается с твердой поверхностью, она проявляет всю свою повышенную плазмин(оген)-связывающую способность (так называемая кооперативность), а смола удаляет из плазмы или из продуктов плазмы только плазмин(оген). Если ε-аминокапроновую кислоту присоединяют к колонке, ее повышенная активность в отношении плазмин(оген)а еще остается прежней, но тем не менее она связывает фибриноген и другие белки из плазмы, тогда как согласно изобретению полностью исключается повышенная активность транексамовой кислоты в отношении плазмин(оген)а. Однако сродство смолы с транексамовой кислотой к плазмин(огену) не изменяется.
Ригидную аминокислоту присоединяют к соответствующему связывающему мостику, в частности более длинному, чем 3 углеродных атома, а носитель и аффинный материал могут удалять плазмин(оген) из смеси, содержащей белки, без дальнейшего изменения состава белкового раствора. Удаление можно проводить в присутствии различных буферов. Способ изобретения также подходит для получения чистых фракций плазмин(оген)а после элюции с аффинного носителя.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к созданию способа специфического удаления или выделения плазмин(оген)а в присутствии фибриногена из смеси, содержащей плазмин(оген), в результате контакта смеси с неподвижной аминокислотой, в которой аминогруппа аминокислоты и карбоксильная группа аминокислоты находятся на расстоянии около 6-8 ангстрем, предпочтительно около 7 ангстрем, а неподвижная аминокислота ковалентно связана с носителем через аминогруппу аминокислоты.
Предпочтительно, в способе согласно изобретению смесь выбирают из группы, состоящей из жидкостей организма, таких как кровь; из фракций крови, криопреципитата, клеточных культур, экстрактов тканей животных, таких как легкие быка, бычий кишечник, или экстракты костей животных; желатина, бычьего сывороточного альбумина, а также несмешивающихся с водой жиров животного происхождения, таких как ланолин (РС-фосфатидилхолин).
Способ согласно изобретению можно использовать для получения высокоочищенного плазмин(оген)а из соответствующих смесей. После контакта смеси, например с хроматографирующим веществом, связанным с ригидной аминокислотой, плазмин(оген) можно элюировать с твердого аффинного вещества. Как таковые в данном случае также можно применять известные принципы твердофазной экстракции. Плазмин(оген) можно элюировать раствором, содержащим лиганд, который конкурирует со связывающими участками ригидной аминокислоты, например транексамовой кислоты, за плазмин(оген)овый белок. Такими лигандами обычно являются ε-аминокислоты, предпочтительно лизин. Например, лизин можно применять в концентрациях от 0,85% мас. до 0,99% мас. Также возможно использование других концентраций, особенно когда ионная сила элюционной среды уравновешена другими ингредиентами, например электролитами.
Плазмин(оген), элюирующийся с твердой фазы, может быть освобожден от элюционного буфера по способу, при котором буферные компоненты экстрагируют, например, диализом. Полученный согласно способу данного изобретения плазмин(оген) характеризуется очень высокой степенью чистоты. Исключительное свойство становится очевидным из следующих данных.
Суммарная таблица 1: Сравнение удельной активности, степени очистки и выхода плазмин(оген)а из криоистощенной FFP-плазмы в предпочтительных условиях нанесения и элюции для каждой из смол | ||||
Использованная смола |
Способ | Удельная активность (мг плазмин(оген)а/ мг белка |
Степень очистки |
Выход (%) |
ТЕА-сефароза 4В | 2 | 0,794 | 567 | 91,6 |
Лизин-Ceramic Hyper DF | 2 | 0,444 | 444 | 10,9 |
Лизин-сефароза 4В | 1 | 0,121 | 101 | 11,6 |
Суммарная таблица 2: Сравнение удаления плазмин(оген)а из криоистощенной FFP-плазмы в предпочтительных условиях нанесения для каждой смолы | ||
Использованная смола | Способ | Удаление (%) |
ТЕА-сефароза 4В | 1 и 2* | 99,5 |
Лизин-Ceramic Hyper DF | 1 | 54,6 |
Лизин-сефароза 4В | 1 | 58,0 |
*Оба способа являются идентичными вплоть до сбора несвязанного пика, включая и саму эту стадию. |
Как можно видеть из суммарной таблицы, когда коммерчески поставляемые смолы с иммобилизованными лизиновыми лигандами и ТЕА-смолу использовали при оптимизированных условиях хроматографии, выход и удельная активность плазмин(оген)а были выше в случае ТЕА-смолы (суммарная таблица 1). Также достойно внимания то, что смола ТЕА оказалась значительно более эффективной при удалении плазмин(оген)а (как показали при исследовании Glu-плазмин(оген)а) из криоистощенной плазмы, чем лизин-смола (суммарная таблица 2).
Чистоту элюатов оценивали с помощью SDS-гель-электрофореза. Элюаты с трех разных смол (ТЕА-сефарозы, Lys-Ceramic Hyper DF и Lys-сефарозы 4В) подвергали SDS-PAGE с использованием 5-12% градиента акриламида и при нанесении 7 мкг белка на дорожку. Полученный гель, окрашенный кумасси голубым, изображен на фиг. 1.
На фигуре 1 представлен градиентный гелевый SDS-PAGE (5-12% полиакриламид) белков по 7 мкг, элюированных двумя способами (описано в разделе Материалы и методы) с трех разных смол - ТЕА-сефарозы, Lys-Ceramic Hyper DF и Lys-сефарозы 4В. Дорожки: 1 - Glu-плазмин(оген); 2 - фибриноген; 3 - альбумин; 4 - иммуноглобулин G; 5 - стандарт молекулярных масс. Элюционные пики: 6 - способа с использованием ТЕА; 7 - способа 2 с использованием ТЕА; 8 - способа 1 с использованием лизин-Ceramic Hyper D; 9 - способа 1 с использованием лизин-сефарозы; 10 - способа 1 с лизин-Ceramic Hyper D; 11 - способа 1 с использованием лизин-сефарозы.
Полученные белковые зоны и чистота продукта хорошо коррелировали с удельной активностью полазмин(оген)а, которая указана в суммарной таблице 1. Данные показывают, что применение ТЕА-сефарозы дает высокоочищенный плазмин(оген) лишь с минорным загрязнением альбумином. Очевидно, что по клиническим критериям никакой дальнейшей очистки не требуется для применения этого продукта.
Поэтому содержащая плазмин(оген) композиция также является предметом изучения данного изобретения.
Предметом рассмотрения данного изобретения также является носитель, ковалентно связанный с ригидной аминокислотой, причем аминогруппа аминокислоты и карбоксильная группа аминокислоты находятся на расстоянии приблизительно 6-8 ангстрем, предпочтительно приблизительно 7 ангстрем.
Предпочтительным для осуществления способа данного изобретения носителем является хроматографическое вещество, которое способно связывать ригидную аминокислоту, в которой аминогруппа аминокислоты и карбоксильная группа аминокислоты находятся на расстоянии около 6-8 Ангстрем, предпочтительно около 7 Ангстрем. Расстояние между аминогруппой и карбоксильной группой, по существу, поддерживается постоянным жесткой структурой аминокислоты. Жесткость аминокислоты может быть получена с помощью алициклических колец, предпочтительно циклогексанового кольца, причем амино- и карбоксильная группы расположены в 1,4-положении алициклического кольца. Также к области, охватываемой данным изобретением, относятся ароматические системы, например замещенные бензойные кислоты или анилин-замещенная уксусная кислота.
Согласно изобретению носитель предпочтительно связывают с аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из транексамовой кислоты и ЕМВОСА.
Хроматографическим веществом, которое применяют согласно способу данного изобретения, является, например, гидрофильное вещество, такое как агароза, целлюлоза, стекло с регулируемой пористостью, силикагели, декстраны или органический синтетический полимер, такой как полимер на основе полиакриламидов, полистиролов. Обычные вещества поставляются коммерчески под торговыми названиями сефакрил® (Pharmacia, Sweden), ультрагель® (Biosepara, France), TSK-гель Toyopearl® (Toso Corp., Japan), HEMA (Alltech Ass. (Deer-field, Il, USA), Eupergit® (Rohm Pharma, Darmstadt, Germany). Также можно использовать материалы, созданные на основе азлактонов (3M, St. Paul, Minn, USA). Особо предпочтительной является агароза® или сефароза®. Названные материалы поставляются коммерчески, например, фирмой Sigma, St. Louis.
В предпочтительном аспекте способ согласно изобретению осуществляют при использовании корпускулярного хроматографического материала из макрочастиц или монолитного блок-вещества. Корпускулярное вещество можно суспендировать в соответствующей среде, и полученную суспензию можно использовать, например, в хроматографической колонке. Однако способ согласно изобретению можно осуществлять порциями. Кроме того, полимеры могут быть использованы в виде корпускулярного вещества или также в форме мембран.
Транексамовую кислоту связывают с носителем предпочтительно через линкер, в частности бифункциональный линкер между носителем и транексамовой кислотой. Если применяют бифункциональный линкер, его можно выбрать из группы, состоящей из N-гидроксисукцинимида, DAPA, CNBr, эпокси, диаминодипропиламина (DADPA), 1,6-диаминогексана, янтарной кислоты, 1,3-диамино-2-пропанола, этилендиамина (EDA), TNB, пиридилсульфида, иодацетамида, активированного малеимидом носителя или их комбинаций.
Для осуществления способа согласно изобретению носитель предпочтительно модифицируют по фрагменту, который взаимодействует с первичными или вторичными аминогруппами.
В соответствии со способом согласно изобретению смесь инкубируют с носителем в течение достаточного периода времени, и после контакта смеси с носителем, связанным с транексамовой кислотой, элюируют нейтральным водным раствором, содержащим соли натрия, соли кальция, буферные соли. Впоследствии плазмин или плазмин(оген) можно элюировать водным раствором, содержащим достаточное количество лизина или эквивалента, который конкурирует с ковалентно связанной транексамовой кислотой.
Предметом изобретения является полученная из природных источников смесь, которая по существу свободна от плазмин(оген)а и плазмина.
В частности, смесью согласно изобретению является кровь, производное крови или фракция крови, криопреципитат.
Производным крови согласно изобретению является, в частности, фактор свертывания крови, полученный из плазмы, или смесь факторов свертывания крови, таких как FVIII, FIX, фибриноген, фибронектин, α1-антитрипсин, антитромбин III, фактор фон Виллебранда, альбумин, иммуноглобулин.
Кроме того, носитель, содержащий ковалентно связанную транексамовую кислоту, также является предметом данного изобретения. Носитель согласно изобретению предпочтительно является хроматографическим веществом, более предпочтительно -гидрофильным хроматографическим веществом, таким как декстраны или органический синтетический полимер, такой как упомянутые выше. Наиболее предпочтительным носителем является агароза® или сефароза®, с которой связывается транексамовая кислота.
Хроматографический материал, который образует носитель, может быть корпускулярным веществом или монолитным блок-веществом. Последний описан в цитируемой работе Hermanson et al. (Hermanson GT, Mallia AK and Smith PK 1992 “Immobilization Affinity Ligand Techniques” pp. 454 Academic Press, Inc. San Diego, USA).
В другом предпочтительном аспекте согласно изобретению транексамовая кислота связывается с носителем через линкер между носителем и транексамовой кислотой. Благоприятно, когда носитель не имеет функциональных групп, способных ковалентно связывать транексамовую кислоту. В таком случае носитель сначала активируют, а затем вводят в реакцию с линкером, который способен связывать транексамовую кислоту. Спейсерные группы, или привязи, являются низкомолекулярными молекулами, которые применяют как промежуточные линкеры между носителем или матриксом и аффинным лигандом, который в соответствии с изобретением представляет собой аминокислоту, имеющую жесткую структуру и аминогруппу на расстоянии около 6-7 Ангстрем от карбоксильной группы. Предпочтительно, спейсерные группы содержат две функциональные группы на обоих концах для легкого взаимодействия с лигандом и носителем. Обычно спейсерная группа представляет собой углеводородное соединение, имеющее на концах две функциональные группы. Один из двух концов ковалентно присоединяется к матриксу с помощью общепринятых или известных реакций. Второй конец ковалентно связывается с лигандом с помощью другого способа присоединения.
Предпочтительно линкером является бифункциональный линкер, такой как N-гидроксисукцинимид, DAPA, CNBr, эпокси, диаминодипропиламин (DADPA), 1,6-диаминогексан, янтарная кислота, 1,3-диамино-2-пропанол, этилендиамин (EDA), TNB, пиридилсульфид, иодацетамид, активированный малеимидом носитель или их комбинации.
Так как большинство активированных носителей поставляется коммерчески, может оказаться полезным начинать с носителя, модифицированного по фрагменту, который взаимодействует с первичными или вторичными аминогруппами.
Кроме того, способ согласно изобретению более подробно описан с использованием в качестве примера получения криопреципитата, по существу свободного от плазмин(оген)а, который может быть исходным материалом для многочисленных продуктов, полученных из крови.
Криопреципитат подвергают аффинной хроматографии с иммобилизованным лигандом, чтобы получить адсорбированную фракцию и неадсорбированную фракцию. Вещество, которое может быть элюировано из адсорбированной фракции, представляет собой плазмин(оген).
Иммобилизованный лиганд может быть любым аналогом, который может взаимодействовать с лизин-связывающими участками плазмин(оген)а. Способ получения иммобилизованных лигандов, которые используют согласно изобретению, описан ниже. Следующие примеры иллюстрируют изобретение, но не ограничивают его.
ПРИМЕР 1: Иммобилизация различных лигандов ε-аминокарбоновых кислот.
Несколько лигандов ε-аминокарбоновых кислот в комбинации с различными спейсерами в нескольких смолах либо получали, либо покупали (если они коммерчески доступны), чтобы оценить удаление плазмин(оген)а из растворов, полученных из плазмы. В следующей таблице суммированы все изученные комбинации (номера смол внизу относятся к разделу, в котором описан ниже синтез для каждой комбинации):
1) Сложный N-гидроксисукцинимидный эфир ε-аминогексаноевой кислоты-сефароза 4В был произведен на фирме Sigma.
2) Изготовление парааминобензамидин-4% агарозы.
Следующий способ использовали для иммобилизации диаминодипропиламина (DADPA) на 4% агарозе (Pierce), реакция происходила на аминоконцевом связующем геле, который затем модифицировали ангидридом.
25 мл DADPA-агарозного геля промывали очищенной водой, а затем гель суспендировали в равном объеме очищенной воды. Суспензионную смесь медленно перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре, добавляя к нему 2,5 г янтарного ангидрида. В конце перемешивания сукцинилированный гель последовательно промывали очищенной водой, 1 М NaCl и снова очищенной водой, чтобы удалить избыток непрореагировавшей янтарной кислоты.
Негативный тест с TNBS (Sigma) показал, что все амины DADPA были успешно блокированы янтарной кислотой.
Иммобилизованный сукцинилированный DADPA промывали 250 мл очищенной воды, затем избыток воды отсасывали, чтобы высушить до влажного осадка, и переносили в 500-мл химический стакан. Гель повторно суспендировали в 25 мл 0,1 М MES-буфера, рН 4,7, и медленно перемешивали, добавляя 0,25 г парааминобензамидина (Sigma) и 0,75 г EDC (Pierce). РН реакционной смеси поддерживали при 4,7 в течение 1 часа, непрерывно добавляя 0,5 М NaOH. Затем реакционную смесь оставляли на ночь при комнатной температуре при постоянном медленном перемешивании.
Гель последовательно промывали 0,5 л каждого из следующих компонентов: очищенной водой, 0,1 М ацетатом натрия, рН 4,7, 0,5 М бикарбонатом натрия и очищенной водой.
Иммобилизованный парааминобензамидин хранили до использования в 0,02% азиде натрия при 4°С.
3) Аргинин-4% агароза
Синтез аргинин-4% агарозы проводили в соответствии с вышеописанным способом для парааминобензамидин-4% агарозы (см. 2).
4) Транексамовая кислота (ТЕА)-4% агароза
Синтез транексамовой кислоты (ТЕА)-4% агарозы предпочтительно проводили в соответствии с вышеописанной процедурой для парааминобензамидин-4% агарозы (см. 2).
5) Аргинин-сефароза 4В
Следующий способ использовали, чтобы иммобилизовать аргинин или транексамовую кислоту на CNBr-сефарозе 4В (Pharmacia) в качестве связующего геля. Синтезы двух лигандов при двух различных концентрациях (10 ммоль или 0,01 ммоль/мл сухого геля) были одинаковыми, как указано в этом и следующем разделах (5-6).
2,5 г CNBr-активированной сефарозы 4В суспендировали в 50 мл 1 мМ HCl. Гель оставляли для набухания в течение 10 минут при комнатной температуре с последующим 15-минутным промыванием 500 мл 1 мМ HCl на агломерированном стеклянном фильтре.
Аргинин растворяли в 12,5 мл связывающего буфера, 0,1 М NaHCO3, pH 8,3, содержащего 0,5 М NaCl. Связывающий раствор, содержащий лиганд, смешивали с гелем в пластиковой пробирке с последующим вращением в течение ночи при 4°С.
В конце инкубации полученную смесь отмывали от избытка лиганда 10 гелевыми объемами связывающего буфера через агломерированный стеклянный фильтр. Белковый раствор промывали 3 циклами по 50 мл буфера при изменении значений рН (0,1 М ацетатный буфер, рН 4, содержащий 0,5 М NaCl, с последующим промыванием 0,1 М трис-HCl-буфером, рН 8, содержащим 0,5 М NaCl). Иммобилизованную аргинин-сефарозу 4В хранили до использования в 0,02% азиде натрия при 4°С.
6) Транексамовая кислота (ТЕА)-сефароза 4В
Этот синтез проводили в соответствии с описанным выше способом для аргинин-сефарозы 4В (см. раздел 5).
7) Аргинин-сефароза 6В
Аргинин в двух различных концентрациях (2 ммоль или 0,2 ммоль/мл сухого геля) присоединяли к коммерческой иммобилизованной эпокси-сефарозе 6В (Pharmacia) следующим образом:
2,5 г эпокси-активированной сефарозы 6В суспендировали в 200 мл очищенной воды. Гель оставляли для набухания приблизительно в течение 5 минут при комнатной температуре, затем промывали в течение 1 часа 500 мл очищенной воды, добавляемой в аликвотах, через агломерированный стеклянный фильтр.
20 мл связывающего буфера (0,1 М NaHCO3, рН 9,3 и 0,5 М NaCl) и набухший гель вливали в две пробирки, содержащие аргинин. Смеси перемешивали в пластиковой пробирке в течение ночи при RT (комнатной температуре).
В конце инкубации полученную смесь отмывали от избытка лиганда 5 гелевыми объемами связывающего буфера через агломерированный стеклянный фильтр. Продукт промывали 3 циклами с изменением рН (0,1 М ацетатный буфер, рН 4,0 и 0,5 М NaCl, с последующим промыванием 0,1 М трис-HCl-буфером, рН 8 и 0,5 М NaCl). Иммобилизованную аргинин-сефарозу 6В хранили до использования в 0,02% азиде натрия при 4°С.
8) Транексамовая кислота (ТЕА)-сефароза 6В
Этот синтез проводили в соответствии с описанным выше способом для аргинин-сефарозы 6В (см. раздел 7).
9) L-Лизин эпокси-активированный Ceramic Hyper DF-гидрогель приобретали на фирме Sigma.
10) парааминобензамидин, ковалентно присоединенный к сефарозе 6В, приобретали на фирме Pharmacia.
ПРИМЕР 2: Тестирование различных аффинных хроматографических смол для удаления плазмин(оген)а.
Объединенный криопреципитат плазмы человека, содержащий 1 МЕ/мл плазмин(оген)а и 50 мг/мл фибриногена, использовали для следующего исследования.
Аликвоты замороженного криопреципитата подвергали оттаиванию при 37°С и диализовали против буфера BN1 (0,12 М NaCl, 10 мМ Tri Na-цитрат, 1 мМ CaCl2 при рН 7,0). Полученный белковый раствор фильтровали через глубокий фильтр 5 мкм, чтобы получить прозрачный раствор. В цилиндр 5 мл-шприца с диаметром 8,36 мм вносили 1,5 мл (влажный объем) следующих аффинных смол, описанных в примере 1: иммобилизованная ε-аминогексаноевая кислота (Сефароза 4В, использовали CNBr в качестве спейсера), иммобилизованные пара-аминобензамидин/аргинин/ТЕА (4% Агароза, с использованием DADPA в качестве спейсера), иммобилизованные аргинин/ТЕА (Сефароза 4В с использованием CNBr в качестве спейсера), иммобилизованные аргинин/ТЕА (Сефароза 6В с использованием эпокси в качестве спейсера) и иммобилизованный L-лизин (Ceramic Hyper DF-гидрогель с использованием эпокси в качестве спейсера). Оптимизированный способ упаковки геля заключался в следующем: упакованный гель промывали 4 объемами: i) очищенной воды, ii) 1 М NaCl, iii) очищенной воды, iv) буфера TLN 0,1 (0,05 М Трис, 0,02 М лизин, 0,1 М NaCl, рН 9,0), v) буфера TLN 1 (0,05 М Трис, 0,02 М лизин, 1 М NaCl, рН 9,0) и vi) очищенной воды. Все образцы буфера для нанесения и промывания вносили в цилиндр шприца после центрифугирования при 1000 оборотов в минуту в течение 1 минуты при 25°С. Уравновешивание проводили 4 объемами BN1, и предварительно профильтрованный, концентрированный криопреципитат наносили на смолу (2:1, об./об. соответственно), затем полученную смесь инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Аликвоты несвязанных «спин»-промывок собирали в пластиковые пробирки после каждого центрифугирования. Смолу промывали по меньшей мере 13 колоночными объемами BN1-буфера до тех пор, пока O.D280 (оптическая плотность) не достигала 0,02. Элюцию плазмин(оген)а проводили буфером TLN 1 с последующим промыванием четырьмя объемами слоя 3 М NaCl. Миниколонки плотно закрывали и хранили при 4°С.
Смолы, которые разрушались во время процесса или удаляли менее 50% плазмин(оген)а, исключали еще в начале исследования. Результаты суммированы в Таблице 2.
Таблица 2 Удаление плазмин(оген)а Р в несвязанном материале с использованием различных иммобилизованных лигандов с буфером BN1 |
|
Иммобилизованные лиганды | Удаление плазмин(оген)а (%) |
ε-Аминогексаноевая кислота, использовали CNBr в качестве спейсера | 13,36 |
пара-Аминобензамидин, использовали DADPA в качестве спейсера | Нет (колонка упакована) |
пара-Аминобензамидин, использовали эпокси в качестве спейсера | 19,78 |
Аргинин, использовали DADPA в качестве спейсера | 6,04* |
ТЕА (высокая концентрация), использовали CNBr в качестве спейсера | 0 |
ТЕА (низкая концентрация), использовали CNBr в качестве спейсера | 0 |
Аргинин (низкая концентрация), использовали CNBr в качестве спейсера | 23,25 |
Аргинин (низкая концентрация), использовали эпокси в качестве спейсера | 0 |
Аргинин (высокая концентрация), использовали эпокси в качестве спейсера | 5,61 |
*Приведенные данные являются средней величиной из трех опытов. |
В вышеприведенной таблице показано, что лучшие лиганды для удаления плазмин(оген)а из криопреципитата содержали аффинные гели, которые были достаточно сильными, чтобы выдержать последствие нанесения, промывания и элюции без сжатия, или гели, которые удерживают более 50% нанесенного фибриногена.
В таблица 3 продемонстрирована как эффективность различных типов гелей при удалении плазмин(оген)а, так и их способность удерживать фибриноген в концентрированном криопреципитате.
Присутствующий в криопреципитате остаточный плазмин(оген) адсорбировался смолами, тогда как фибриноген не адсорбировался, что делает полученный супернатант по существу свободным от плазмин(оген)а.
Содержание фибриногена определяли по времени свертывания, тогда как содержание плазмин(оген)а определяли при исследовании с хромогенным субстратом.
Рассчитанный выход плазмин(оген)а и фибриногена с лизин-гелей служил в качестве золотого стандарта для всех других использованных гелевых лигандов. Результаты, представленные в таблице 2, показывают, что только ТЕА-лиганды с эпоксиспейсером обеспечивали хорошее удаление плазмин(оген)а и высокий выход фибриногена (см. таблицу 3).
Высокая концентрация иммобилизованной ТЕА обеспечивала лучшее удаление плазмин(оген)а и сравнимый выход фибриногена по сравнению со связанным с лизином лигандом: выход 89% против 92% в случае фибриногена и 89% против 56% в случае удаления плазмин(оген)а соответственно. Все другие смолы оказались значительно менее эффективными либо при удалении плазмин(оген)а, либо в отношении выхода фибриногена.
Таблица 3 Сводка данных по выходу фибриногена и удалению плазмин(оген)а в несвязанный материал, полученных при использовании различных иммобилизованных лигандов с буфером BN1 |
||
Иммобилизованные лиганды | Удаление плазмин(оген)а (%) | Выход фибриногена (%) |
Лизин, при использовании эпокси в качестве спейсера |
56* | 92* |
ТЕА, при использовании DADP в качестве спейсера | 49 | 84 |
ТЕА (низкая концентрация), при использовании эпокси в качестве спейсера |
44,35 | 88,62 |
ТЕА (высокая концентрация), при использовании эпокси в качестве спейсера |
89 | 89 |
Аргинин (высокая концентрация), при использовании CNBr в качестве спейсера | 91,26 | 49 |
*Приведенные данные являются средними величинами из трех исследований. |
ПРИМЕР 3: Влияние фосфатного и BN1 буфера на профиль аффинной хроматографии на смоле с иммобилизованным лизином и ТЕА.
Криопреципитат обрабатывали гидроокисью алюминия, чтобы адсорбировать факторы свертывания, зависящие от витамина К, а затем инкубировали со смесью детергентных растворителей (SD-1% Tri (н-бутил)фосфат, 1% тритон Х-100) в течение 4 часов при 30°С, чтобы инактивировать вирусы в липидной оболочке. SD-Реагенты удаляли экстракцией касторовым маслом и хроматографией гидрофобного взаимодействия, препарат впоследствии пастеризовали (10 часов при 60°С) в присутствии сахарозы и глицина в качестве стабилизаторов.
После пастеризации сахарозу и глицин удаляли диафильтрацией. Транексамовую кислоту (ТЕА) и аргинин-гидрохлорид добавляли в качестве стабилизаторов перед фильтрацией в стерильных условиях. Аликвоты стабилизированного продукта хранили до применения при -30°С.
Аликвоты замороженного криопреципитата, с инактивированными вирусами подвергали оттаиванию при 37°С и диализовали против буфера BN1 (состоящего из 0,12 М NaCl, 0,01 М Tri Na-цитрата, 1 мМ CaCl2, при рН 7,0) или, альтернативно, против 25 мМ фосфатного буфера. Последний раствор фильтровали через глубокий фильтр 5 мкм, чтобы получить прозрачный раствор.
В колонку, 10 мм в диаметре (Biorad, USA), вносили 6 мл (влажный объем) либо иммобилизованной ТЕА (ТЕА-сефароза 6В), либо иммобилизованного лизина (Ceramic Hyper DF/сефароза 4В) и по очереди промывали 4 объемами каждого из следующих растворов: i) очищенная вода, ii) 1 M NaCl, iii) очищенная вода, iv) буфер TLN 0,1 (0,1 М NaCl, лизин 0,02 М, 0,05 М трис, рН 9,0), v) буфер TLN 1 (1 М NaCl, лизин 0,02 М, 0,05 М трис, рН 9) и vi) очищенная вода. Уравновешивание осуществляли 4 объемами BN1 или, альтернативно, фосфатным буфером. Профильтрованный криопреципитат наносили на колонку при скорости тока 100 мкл/мин.
Образцы несвязанного материала собирали в пластиковые пробирки, а смолу промывали 16 колоночными объемами или буфера BN1, или фосфатного буфера. Элюцию плазмин(оген)а проводили буфером TLN 1 с последующим промыванием четырьмя объемами 3 М раствора NaCl, четырьмя объемами очищенной воды и четырьмя объемами 25% этанола, дополненного 1 М NaCl.
Таблица 4 иллюстрирует эффективность удаления плазмин(оген)а различными видами смол и выход фибриногена. Содержание фибриногена определяли по времени свертывания (анализ Клауса (Clauss)), в то время как содержание плазмин(оген)а определяли с помощью хромогенного субстрата.
Сравнение различных смол показало, что от 95,4% до 96,4% содержания фибриногена оставалось в несвязанном пике при использовании буфера BN1. В противоположность этому выход фибриногена был низким, если использовали фосфатный буфер. Неожиданно выяснилось, что только смола с иммобилизованной ТЕА обеспечивала как высокую степень очистки от плазмин(оген)а, так и высокий выход фибриногена.
Результаты, полученные на лизин-смоле, также продемонстрировали улучшенную эффективность с буфером BN1 по сравнению с фосфатным буфером.
Таблица 4 Сводка данных, полученных при определении выхода фибриногена и плазмин(оген)а при использовании иммобилизованных смол либо с буфером BN1, либо с фосфатным буфером |
||
Иммобилизованные лиганды | Удаление плазмин(оген)а (%) | Выход фибриногена (%) |
ТЕА (высок. конц.) эпокси + буфер BN1 |
77,1 | 96,4 |
Лизин-эпокси + буфер BN1 | 68,87 | 95,4 |
Лизин-эпокси + фосфатный буфер |
100 | 66,9 |
Лизин CNBr + буфер BN1 | 62,5 | 121,8 |
Лизин CNBr + фосфатный буфер |
100 | 62,2 |
ПРИМЕР 4
Аликвоты замороженного криопреципитата с инактивированными вирусами подвергали оттаиванию при 37°С и диализовали против буфера BN1 (0,12 М NaCl, 0,01 М Tri Na-цитрат, 1 мМ CaCl2, при рН 7,0) или, альтернативно, против 25 мМ фосфатного буфера. Последний раствор фильтровали через глубокий фильтр 5 мкм, чтобы удалить нерастворенные вещества.
В колонку, 26 мм в диаметре (Pharmacia, Sweden), вносили 50 мл (влажный объем) иммобилизованной ТЕА (ТЕА-сефароза 6В) и промывали 4 объемами очищенной воды и таким же объемом буфера TLN 0,1 (0,1 М NaCl, лизин 0,02 М, 0,05 М трис, рН 9,0), буфера TLN 1 (1 М NaCl, лизин 0,02 М, 0,05 М трис, рН 9) и очищенной водой. Уравновешивание осуществляли 4 объемами буфера BN1 (NaCl, Tri Na-цитрат, CaCl2, рН 7,0) и отфильтрованный ВАС пропускали через колонку при скорости тока 700 мкл/мл.
Образцы несвязанного материала собирали в пластиковые чашки, а смолу промывали по меньшей мере 3 гелевыми объемами буфера BN1. Элюцию плазмин(оген)а осуществляли буфером TLN 1 с последующим промыванием 3 М NaCl.
Несвязанные фракции от двух пропусканий объединяли и хранили при 4°С до концентрирования. Наконец, ВАС концентрировали приблизительно до первоначального объема диафильтрацией, используя мембрану, отсекающую 100, и против буфера В1 (глицин, NaCl, Tri Na-цитрат, CaCl2, рН 7) с последующим фильтрованием через 0,45 мкм фильтр. К фильтрату добавляли 2% аргинин.
Для контроля стабильности полученный продукт фильтровали в стерильных условиях через 0,2 мкм фильтр.
Как показано в таблице 5, использование более крупной и более длинной колонки улучшало эффективность ТЕА-лиганда, выход фибриногена составлял 100%, а удаление плазмин(оген)а оказалось ниже определяемого уровня при исследовании плазмин(оген)а хромогенным способом.
При сравнении продукта до и после диафильтрации выявили, что содержание фибриногена снижается на 33%. Этот феномен можно объяснить техническими проблемами, которые возникают только при обработке небольших количеств. Смола с иммобилизованной ТЕА несомненно обеспечивала как хорошее удаление плазмин(оген)а, так и хороший выход фибриногена.
Таблица 5 Сводка данных, полученных при определении выхода фибриногена и плазмин(оген)а в несвязанный пик. Каждый пункт данных представляет собой среднюю величину из двух пропусканий |
||
Проба | Выход фибриногена (%) | Выход плазмин(оген)а (%) |
После нанесения | 100 | 0 |
После нанесения и диафильтрации |
66,2 | 0* |
*Выход плазмин(оген)а после того, как объединенную пробу концентрировали в 3,7 раз. |
Никакой оставшейся ТЕА не обнаруживали как в элюированном белковом растворе, так и в концентрированном ультрафильтрацией продукте. Анализы остаточного уровня транексамовой кислоты осуществляли с помощью ВЭЖХ.
Проводили четыре дополнительных эксперимента по удалению плазмин(оген)а, используя одну и ту же смолу и такие условия пропускания, как описано выше (пример 4). Вообще результаты для всех исследованных проб оказались подобными первым результатам, представленным выше.
Никакой оставшейся ТЕА не обнаруживали как в элюированном белковом растворе, так и в концентрированном ультрафильтрацией продукте. Анализы остаточного уровня транексамовой кислоты осуществляли с помощью ВЭЖХ.
Не наблюдали никакой адгезии ни в случае полосок перед удалением плазмин(оген)а, ни после того как его исследовали на крысиной модели.
Криопреципитат до и после удаления плазмин(оген)а исследовали в отношении деградации во время его инкубации при комнатной температуре. Данные, выраженные как процент коагулированных белков (по поглощению в УФ), для различных проб представлены в Таблице 6.
Таблица 6 Процент коагулированных белков после инкубации при комнатной температуре концентрированного криопреципитата после двойной инактивации вирусов до и после удаления плазминогена на эпокси-сефарозе 6В, связанной с транексамовой кислотой |
|||||||
Время инкубации (недели) | |||||||
0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
До обработки | 62,91 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
После обработки | 73,44 | 70,80 | 68,24 | 65,6 | 63,69 | 63,84 | 62,46 |
Исследования стабильности проводили на полосках, которые готовили из криопреципитата до и после удаления плазмин(оген)а, с последующей инкубацией при 37°С в присутствии буфера. Названные полоски обрабатывали добавлением или без добавления глицина и/или аргинина. Результаты суммированы в Таблице 7 ниже.
Таблица 7 Время деградации на полосках до и после удаления плазмин(оген)а |
|||||||
Приготовление | Время деградации полосок (дни) | ||||||
0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
До обработки | +++ | ||||||
До обработки + 2% аргинин | +++ | - | - | - | - | - | - |
До обработки + 2% аргинин + 1% глицин | +++ | - | - | - | - | - | - |
После обработки | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | - |
После обработки + 2% аргинин + 1% глицин | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | - |
+++ Этот набор данных означает наличие полоски. - Этот набор данных означает деградацию полоски. |
1. Исследования, описанные в следующих примерах, проводили на криоистощенной объединенной свежезамороженной плазме от нормальных здоровых доноров. Вследствие высокой концентрации антиплазмина и небольшого количества плазмина у нормальных здоровых доноров (1) плазмин не может быть определен с помощью функционального (хромогенного) способа (Schreiber AD, Kaplan AP, Austen KF, Plasma inhibitors of the components of the fibrinolytic pathway in man. J. Clin. Invest 52: 1394-1401, 1973). Следовательно, невозможно продемонстрировать удаление, очистку и выход с ТЕА-смолы плазмина из образцов плазмы здоровых доноров. Однако коммерческий ELISA-набор для определения очень низких количеств Glu-плазмин(оген)а и, как было установлено в предыдущих исследованиях, ТЕА-смола характеризуются одинаковым сродством к обеим формам плазмин(оген)а, а также плазмину (Fredenburgh JP, Nesheim ME. Lys-plasmin(ogen) is a significant intermediate in the activation of Glu-plasmin(ogen) during fibrinolysis in vitro. J. Biol. Chem. 267. 26150-6. 1992 и Miyashita C, Wenzel E., Heiden M. Plasmin(ogen): a brief introduction into ist biochemistry and function. Haemostasis 1:7-13, 1988).
2. Таким образом, определение glu-плазмин(оген)а можно использовать как показатель общего плазмин(оген)а в плазме.
ПРИМЕР 5: Стадия хроматографии.
Исследования проводили, чтобы установить эффективность ТЕА, иммобилизованной на сефарозе 4FF, при удалении плазмин(оген)а из криоистощенной свежезамороженной плазмы (FFP), содержащей 1 МЕ/мл плазмин(оген)а. Аликвоты криоистощенной свежезамороженной плазмы подвергали оттаиванию при 37°С и фильтровали через 3-мкм глубокий фильтр, чтобы удалить нерастворимые белки.
В колонку, 10 мм в диаметре (Pharmacia, Sweden), вносили 2 мл (влажный объем) иммобилизованной ТЕА и промывали 4 объемами очищенной воды и таким же объемом буфера TLN 0,1 (0,1 М NaCl, 0,02 М лизин, 0,05 М трис, рН 9,0), буфера TLN 1 (1 М NaCl, лизин 0,02 М, 0,05 М трис, рН 9,0) и очищенной водой. Уравновешивание осуществляли 4 объемами буфера BN1 (0,12 М NaCl, 0,01 М Tri Na-цитрат, 1 мМ CaCl2, рН 7,0) и отфильтрованную плазму (~20 МЕ плазмин(оген)а) пропускали через колонку при скорости тока 1 мл/мл.
Протекающий через колонку материал собирали и замораживали в пластиковом флаконе, а смолу промывали по меньшей мере 3 колоночными объемами буфера BN1. Элюцию плазмин(оген)а осуществляли буфером TLN-1 с последующим промыванием приблизительно тремя объемами 3 М раствора NaCl, двумя объемами очищенной воды и двумя объемами 20% этанола + 1 М NaCl (Способ 1). По второму способу (Способ 2) выполняли такую же процедуру, которую использовали для Способа 1, но с дополнительным промыванием 3 М NaCl перед элюцией плазмин(оген)а.
Аналитические исследования.
Способ определения Glu-плазмин(оген)а: ELISA-набор для Glu-плазмин(оген)а, имунклон (Imunclone®) (American Diagnostica, Greenwich, CT, USA), использованный в описываемых экспериментах, представляет собой иммуноферментный сэндвич-анализ, специфичный для определения уровней нативного плазмин(оген)а человека. Количественный порог анализа (в соответствии с наиболее низким стандартом калибровочной кривой) в плазме или производных плазмы составляет 0,063 мкг/мл.
Активность плазмина: фибринолитическое исследование проводили полуколичественным определением активности плазмина в элюатах. Кратко, свободный от фибриногена плазмин(оген) (Enzyme Research) инкубировали с разными концентрациями нормальной объединенной плазмы (Unicalibrator, Stago) или очищенного плазминогена, элюированного с аффинных колонок, в присутствии избытка стрептокиназы. Время, в течение которого завершалась деградация сгустка, регистрировали и сравнивали с полной деградацией сгустка в образце.
Определение белка: Общий белок анализировали, используя метод Бредфорда (Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-54, 1976). В таблицах 8а и 8b представлены результаты хроматографического удаления и очистки Glu-плазмин(оген)а плазмы человека с помощью ТЕА-лиганда. В таблице 8а суммированы данные, полученные при очистке плазмин(оген)а. В таблице показано, что способ 2 дает несколько лучшую очистку плазмин(оген)а, чем способ 1, с очисткой в 567-раз и выходом 91,6%. В таблице 8b показано, что в среднем 99,5% плазмин(оген)а удаляли из несвязанной фракции, большей частью составленных количеством, полученным в элюате (таблица 8а).
Таблица 8а Влияние дополнительного промывания ТЕА-смолы 3 М хлоридом натрия (Способ 1 по сравнению со Способом 2) на удельную активность, очистку и выход плазмин(оген)а из плазмы |
||||
Способ 1 | Способ 1 | Способ 2 | Способ 2 | |
Фракция | Исходный материал | Элюат | Исходный материал | Элюат |
Объем (мл) | 40 | 13,2 | 40 | 20 |
Белок (мг/мл) | 46,96 | 0,291 | 55,41 | 0,180 |
Glu-плазмин(оген) (мкг/мл) |
65,4 | 18,2 | 78,0 | 142,9 |
Плазмин(оген) (МЕ/мл) |
Не проводили | ~0,5 | ~1 | |
Удельная активность (мг плазмин(оген)а/ мг белка) |
0,0014 | 0,625 | 0,0014 | 0,794 |
Степень очистки | 446 | 567 | ||
Выход плазмин(оген)а (%) | 91,8 | 91,6 |
Таблица 8b Удаление плазмин(оген)а из плазмы (среднее значение результатов для двух способов)* |
||||
Способ | Хроматогра- фическая фракция |
Glu- Плазмин(оген) (среднее, мкг/мл) |
Объем (средний, мл) |
Удаление плазмин(оген)а (%) |
1 & 2* | Плазма | 71,7 | 40,0 | 99,5 |
Несвязанная фракция | 0,18 | 83,5 | ||
*Способы 1 и 2 являются идентичными и включающими сбор несвязанной (протекающей) фракции. |
ПРИМЕР 6: Влияние условий хроматографии на эффективность лизин-иммобилизованного лиганда при аффинной очистке плазмин(оген)а.
Стадия хроматографии.
Изучали аффинную очистку с применением смолы с иммобилизованным лизиновым лигандом, используя две коммерческие лизин-смолы. Использовали способ хроматографии, представленный в литературе (см. Robbins KC, Summaria L. Plasmin(ogen) and Plasmin. Methods Enzymol. 45: 257-73, 1976, для Способа 2, описанного ниже), и способ, разработанный в лаборатории авторов изобретения (Способ 1, ниже).
Каждую из двух смол с иммобилизованным лизином (Ceramic Hyper DF получены с помощью Biosepra и сефарозы 4В производства фирмы Pharmacia) вносили в колонки с диаметром 10 мм (Pharmacia, Sweden). Каждая колонка содержала 2 мл (влажный объем) смолы.
Аликвоты криоистощенной свежезамороженной плазмы подвергали оттаиванию при 37°С и фильтровали через глубокий фильтр 3 мкм, чтобы получить прозрачный раствор.
Стадию хроматографии проводили, используя один из следующих способов.
Способ 1
Колонку промывали 4 объемами каждого из следующих растворов: 1) очищенной воды, 2) TLN-0,1, 3) TLN-1 и 4) очищенной воды. Уравновешивание осуществляли 4 объемами BN1. Отфильтрованную плазму (40 мл) наносили на колонку при скорости тока 1 мл/мин. Образцы протекающего через колонку материала собирали в пластиковые флаконы, а смолу промывали буфером BN1. Элюцию плазмин(оген)а проводили буфером TLN-1 с последующим промыванием 3 М раствором NaCl, 2 объемами очищенной воды и 2 объемами 20% этанола + 1 М NaCl.
Способ 2: (ссылка 5)
Аликвоты криоистощенной свежезамороженной плазмы (40 мл) фильтровали через фильтр глубиной 3 мкм. К 40 мл отфильтрованной плазмы добавляли 4 мл 0,5 М триса, 0,2 М лизина, 1 М NaCl-буфера, рН 9.
Колонку промывали 4 колоночными объемами очищенной воды и уравновешивали 0,1 М фосфатным буфером, рН 7,4. Разбавленную плазму пропускали через смолу со скоростью 1 мл/мин. Образцы несвязанного материала собирали в пластиковые флаконы, и смолу промывали 0,1 М фосфатным буфером, рН 7,4 до тех пор, пока оптическое поглощение вытекающей жидкости при 280 нм не достигало базисной величины. Затем плазмин(оген) элюировали 0,2 М ε-аминокапроновой кислотой, растворенной в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,4, и собирали в пластиковую чашку. За элюцией следовало промывание приблизительно 2 объемами 3 М раствора NaCl и очищенной воды.
В таблицах 9а и 9b сравнивают удаление и очистку плазмин(оген)а с помощью двух коммерческих смол с иммобилизованным лизином, используя для каждой смолы два различных способа очистки. Хотя имеется относительно небольшое различие в выходе плазмин(оген)а в элюаты (табл. 9а), можно видеть, что при использовании способа 2 и смолы Ceramic Hyper DF достигается более высокая очистка плазминогена.
Результаты показали, что при применении смолы Lys-Ceramic Hyper DF и хроматографического способа 2 удавалось достичь 444-кратной очистки. Кроме того, большую часть плазмин(оген)а исходного материала получали во фракциях пика (76,5% в несвязанной фракции + 10,9% в элюате, приблизительно только 10% нанесенного плазмин(оген)а остается неучтенным). Однако удаление плазмин(оген)а из несвязанной фракции составляло только 23,5%.
Таблица 9а Удельная активность, степень очистки и выход из плазмы плазмин(оген)а при использовании двух различных коммерческих смол с иммобилизованным лизином и двух разных способов хроматографии |
||||||
Фракция | Способ 1 | Способ 2 | ||||
Нанесе- ние |
Элюат | Нанесе- ние |
Элюат | |||
Ceramic HyperDF |
Сефароза 4В |
Ceramic HyperDF |
Сефароза 4В |
|||
Объем (мл) |
40 | 8,1 | 7,2 | 40 | 8,2 | 9,8 |
Белок (мг/мл) |
55,94 | 0,347 | 0,345 | 60,05 | 0,0719 | 0,672 |
Glu- Плазмино-ген (мкг/мл) |
65,4 | 40,3 | 41,9 | 60,8 | 32,2 | 19,9 |
Удельная активность (мг плазминогена/ мг белка) |
0,0012 | 0,116 | 0,121 | 0,001 | 0,444 | 0,030 |
Степень очистки | 97 | 101 | 444 | 30 | ||
Выход (%) | 12,5 | 11,6 | 10,9 | 8,2 |
Таблица 9b Удаление плазмин(оген)а в несвязанных пиках для обоих способов |
||||||
Способ | Использ. смола |
Хромато- графич. фракция |
Объем (мл) |
Glu- Плазмин (оген) мкг/мл |
Общий Glu-Плазмин (оген) (мкг) |
Удаление плазмин (оген)а (%)* |
1 | Ceramic Hyper DF |
Плазма | 40 | 65,4 | 2616 | 54,6 (45,4) |
Несвязан. | 72 | 16,5 | 1188 | |||
Сефароза 4B |
Плазма | 40 | 65,4 | 2616 | 58,0 (42,0) |
|
Несвязан. | 82 | 13,4 | 1099 | |||
2 | Ceramic Hyper DF |
Плазма | 40 | 60,8 | 2432 | 23,5 (76,5) |
Несвязан. | 89 | 20,9 | 1860 | |||
Сефароза 4B |
Плазма | 40 | 60,8 | 2432 | 33,0 (67,0) |
|
Несвязан. | 91 | 17,9 | 1629 | |||
*Величины в скобках соответствуют выходу плазминогена в несвязанном пике. |
Claims (10)
1. Способ выделения плазминогена или плазмина в присутствии фибриногена из смеси, содержащей плазминоген или плазмин, путем приведения смеси в контакт с транексамовой кислотой, при этом стадия приведения в контакт предусматривает нанесение смеси, содержащей фибриноген и плазминоген или плазмин, на хроматографическую колонку, содержащую нерастворимую матрицу для аффинной хроматографии, ковалентно сшитую с транексамовой кислотой, и элюирования плазминогена или плазмина с матрицы для аффинной хроматографии водным раствором, содержащим достаточное количество лиганда, конкурирующего с плазмином или плазминогеном за связывающие участки указанной матрицы, связанной с транексамовой кислотой, где транексамовая кислота ковалентно связана с указанной матрицей через линкер, который находится между матрицей и транексамовой кислотой и длина которого составляет более трех атомов углерода.
2. Способ по п.1, где смесь выбрана из группы, состоящей из жидкостей организма, таких как кровь; из фракций крови, криопреципитата, клеточных культур, экстрактов тканей животных, таких как легкие быка, бычий кишечник, или экстрактов костей животных, а также не смешивающихся с водой жиров, полученных из организма животных.
3. Способ по п.1, где указанная нерастворимая матрица для аффинной хроматографии является гидрофильным веществом, таким как агароза, целлюлоза, стекло с регулируемыми порами, силикагели, декстраны или органический синтетический полимер, такой как полимер на основе полиакриламидов-полистиролов.
4. Способ по п.1, где указанная нерастворимая матрица для аффинной хроматографии является агарозой или сефарозой.
5. Способ по п.1, где указанная нерастворимая матрица для аффинной хроматографии представляет собой корпускулярное вещество или монолитный блок-материал.
6. Способ по п.1, где линкер является бифункциональным линкером.
7. Способ по п.6, где бифункциональный линкер выбран из группы, состоящей из N-гидроксисукцинимида, DAPA, CNBr, эпокси, диаминопропиламина (DADPA), 1,6-диаминогексана, янтарной кислоты, 1,3-диамино-2-пропанола, этилендиамина (EDA), TNB, пиридилдисульфида, иодацетамида, активированного малеимидом нерастворимого носителя для аффинной хроматографии или их комбинаций.
8. Способ по п.1, где указанная матрица модифицирована фрагментом, который взаимодействует с первичными или вторичными аминогруппами.
9. Способ по п.1, где после приведения смеси в контакт с нерастворимой матрицей для аффинной хроматографии, связанной с транексамовой кислотой, смесь инкубируют с матрицей в течение периода, достаточного для того, чтобы связать плазминоген или плазмин, и элюируют нейтральным водным раствором, содержащим соли натрия, соли кальция, соли буфера.
10. Способ по п.1, где лигандом является лизин.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US29196801P | 2001-05-21 | 2001-05-21 | |
US60/291,968 | 2001-05-21 | ||
EP01115157 | 2001-06-21 | ||
EP01115157.8 | 2001-06-21 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2003136746/13A Division RU2344143C2 (ru) | 2001-05-21 | 2002-05-17 | Удаление плазмин(оген)а из белковых растворов |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2008130356A RU2008130356A (ru) | 2010-01-27 |
RU2458067C2 true RU2458067C2 (ru) | 2012-08-10 |
Family
ID=26076623
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2008130356/10A RU2458067C2 (ru) | 2001-05-21 | 2002-05-17 | Способ выделения плазминогена или плазмина в присутствии фибриногена из смеси |
RU2003136746/13A RU2344143C2 (ru) | 2001-05-21 | 2002-05-17 | Удаление плазмин(оген)а из белковых растворов |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2003136746/13A RU2344143C2 (ru) | 2001-05-21 | 2002-05-17 | Удаление плазмин(оген)а из белковых растворов |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US20040197891A1 (ru) |
EP (1) | EP1390485B1 (ru) |
JP (1) | JP4385097B2 (ru) |
KR (1) | KR100871454B1 (ru) |
AT (1) | ATE342353T1 (ru) |
AU (1) | AU2002314081B2 (ru) |
CA (1) | CA2447789C (ru) |
CZ (1) | CZ20033097A3 (ru) |
DE (1) | DE60215338T2 (ru) |
EE (1) | EE05485B1 (ru) |
ES (1) | ES2274044T3 (ru) |
HK (1) | HK1060902A1 (ru) |
HU (1) | HU228899B1 (ru) |
IL (2) | IL158754A0 (ru) |
MX (1) | MXPA03010616A (ru) |
PL (1) | PL205685B1 (ru) |
RU (2) | RU2458067C2 (ru) |
SK (1) | SK288005B6 (ru) |
WO (1) | WO2002095019A1 (ru) |
ZA (1) | ZA200309030B (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2685956C2 (ru) * | 2012-12-05 | 2019-04-23 | Цсл Беринг Гмбх | Способ очистки лечебных белков |
Families Citing this family (66)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002095019A1 (en) | 2001-05-21 | 2002-11-28 | Omrix Biopharmaceuticals S.A. | Removal of plasmin(ogen) from protein solutions |
SE526038C2 (sv) * | 2002-07-08 | 2005-06-21 | Gambro Lundia Ab | Polymeraffinitetsmatris, förfarande för framställning därav och anvädning därav |
AU2004208038B2 (en) | 2003-01-30 | 2007-09-06 | Prochon Biotech Ltd. | Freeze-dried fibrin matrices and methods for preparation thereof |
US7067123B2 (en) | 2003-04-29 | 2006-06-27 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Glue for cartilage repair |
US7901457B2 (en) | 2003-05-16 | 2011-03-08 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Cartilage allograft plug |
DE102004009400A1 (de) | 2004-02-24 | 2005-09-08 | Zlb Behring Gmbh | Fibrinogen Reinigung |
US7335508B2 (en) | 2004-07-22 | 2008-02-26 | Prochon Biotech Ltd. | Porous plasma protein matrices and methods for preparation thereof |
US7837740B2 (en) | 2007-01-24 | 2010-11-23 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Two piece cancellous construct for cartilage repair |
US9358318B2 (en) | 2004-10-20 | 2016-06-07 | Ethicon, Inc. | Method of making a reinforced absorbable multilayered hemostatic wound dressing |
EP1809342B1 (en) | 2004-10-20 | 2015-08-05 | Ethicon, Inc. | Absorbable hemostat |
US7815926B2 (en) | 2005-07-11 | 2010-10-19 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Implant for articular cartilage repair |
JP2007068497A (ja) * | 2005-09-09 | 2007-03-22 | Nihon Pharmaceutical Co Ltd | プラスミンの精製法 |
US8921109B2 (en) | 2005-09-19 | 2014-12-30 | Histogenics Corporation | Cell-support matrix having narrowly defined uniformly vertically and non-randomly organized porosity and pore density and a method for preparation thereof |
US20070134231A1 (en) * | 2005-12-13 | 2007-06-14 | Jani Dharmendra M | Method for prolonging activity of autodegradable enzymes and compositions thereof |
CN101534952B (zh) | 2006-11-02 | 2012-10-31 | 欧姆瑞克斯生物医药有限公司 | 微粉化方法 |
US8435551B2 (en) | 2007-03-06 | 2013-05-07 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Cancellous construct with support ring for repair of osteochondral defects |
US7704453B2 (en) | 2007-06-07 | 2010-04-27 | Ethicon, Inc. | Method for establishing a sterilizing dose for radiation sensitive products |
US8409499B2 (en) | 2007-06-07 | 2013-04-02 | Ethicon, Inc. | Method for establishing a sterilizing dose for radiation sensitive products |
EP2011524A1 (en) * | 2007-07-02 | 2009-01-07 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Fibrin glue with a visualization agent |
EP2034010A1 (en) | 2007-08-30 | 2009-03-11 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Compositions suitable for repair and/or treatment of injured spinal tissue |
CA2717725A1 (en) | 2008-03-05 | 2009-09-11 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Cancellous constructs, cartilage particles and combinations of cancellous constructs and cartilage particles |
ES2438491T3 (es) | 2008-09-22 | 2014-01-17 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Dispositivo implantable que comprende un sustrato pre-recubierto con fibrina estabilizada |
EP2398394B1 (en) * | 2009-02-20 | 2021-08-04 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Device for administering an at least two-component substance |
KR101786786B1 (ko) | 2010-01-28 | 2017-10-18 | 옴릭스 바이오파머슈티컬스 리미티드 | 개선된 피브린 밀봉 방법 |
BR112012030530A2 (pt) * | 2010-05-18 | 2022-12-20 | Abbvie Inc | Aparelho e processo para purificação de proteínas |
IL207586A0 (en) | 2010-08-12 | 2010-12-30 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | A fibrin based therapeutic preparation and use thereof |
WO2012036140A1 (ja) * | 2010-09-14 | 2012-03-22 | 株式会社カネカ | クリングル配列を有する蛋白質またはペプチドを精製または除去するアフィニティ担体、及びそれを用いた精製方法、除去方法 |
JP5836577B2 (ja) * | 2010-09-14 | 2015-12-24 | 株式会社カネカ | クリングル配列を有する蛋白質またはペプチドを精製または除去するアフィニティ担体の製造方法、その精製方法、除去方法 |
CN103328503B (zh) * | 2010-09-20 | 2016-08-24 | 欧克塔医药公司 | 纤维蛋白原生产方法 |
IL210162A0 (en) | 2010-12-21 | 2011-03-31 | Omrix Biopharmaceuticals | Viral inactivated platelet extract, use and preparation thereof |
IL213375A0 (en) | 2011-06-05 | 2011-07-31 | Omrix Biopharmaceuticals | Device for spraying fluids in proximity to a surface |
AU2012275562B2 (en) | 2011-06-27 | 2016-10-20 | Children's Healthcare Of Atlanta, Inc. | Compositions, uses, and preparation of platelet lysates |
IL213864A0 (en) | 2011-06-30 | 2011-08-31 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | Method for removing a lytic enzyme from a heterogeneous mixture |
US10618950B2 (en) | 2011-12-29 | 2020-04-14 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Method and device for fast dissolution of solid protein composition |
US10130346B2 (en) | 2012-07-24 | 2018-11-20 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Device and method for the application of a curable fluid composition to a bodily organ |
WO2014097289A1 (en) | 2012-12-20 | 2014-06-26 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Viral inactivated biological mixture |
EP2941196A1 (en) | 2012-12-30 | 2015-11-11 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Device and method for the application of a curable fluid composition to a portion of a bodily organ |
USD754325S1 (en) | 2013-06-06 | 2016-04-19 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Device of a curable fluid composition to a bodily organ |
IL230150A0 (en) | 2013-12-24 | 2014-09-30 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | One-component fibrin glue containing zymogens |
IL230151A0 (en) | 2013-12-24 | 2014-09-30 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | One-component fibrin glue containing a polymerization inhibitor |
IL231230A0 (en) | 2014-02-27 | 2014-08-31 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | Fibrinogen preparation |
IL231792A0 (en) | 2014-03-27 | 2014-08-31 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | Device and method for the preparation and administration of one-component fibrin glue |
IL234246A0 (en) | 2014-08-21 | 2014-11-30 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | Stabilized thrombin |
WO2016079727A1 (en) | 2014-11-18 | 2016-05-26 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Spray-drying apparatus and method of use |
IL235751A0 (en) | 2014-11-18 | 2015-02-26 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | An addition to the spray dryer |
US10077420B2 (en) | 2014-12-02 | 2018-09-18 | Histogenics Corporation | Cell and tissue culture container |
EP3258945B1 (en) | 2015-02-16 | 2020-10-07 | Nayacure Therapeutics Ltd. | Modified blood clots |
WO2016135719A1 (en) | 2015-02-25 | 2016-09-01 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Method for purifying and quantifying thrombin and its degradation polypeptides |
IL242984A0 (en) | 2015-12-08 | 2016-02-29 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | Thrombin microcapsules, their preparation and how to use them |
US10159720B2 (en) | 2015-12-08 | 2018-12-25 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | Thrombin microcapsules, preparation and uses thereof |
US20170128617A1 (en) | 2015-11-11 | 2017-05-11 | Ethicon, Inc. | Sealant formulation and uses thereof |
IL242924A0 (en) | 2015-12-03 | 2016-04-21 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | Syringe system for storing and mixing two ingredients |
WO2018042438A2 (en) * | 2016-09-01 | 2018-03-08 | Plas-Free Ltd | Human blood-derived products having decreased fibrinolytic activity and uses thereof in hemostatic disorders |
IT201600091964A1 (it) * | 2016-09-13 | 2018-03-13 | Kedrion Spa | Processo per la purificazione del plasminogeno a partire da plasma umano. |
IL247821A0 (en) * | 2016-09-14 | 2017-01-31 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | Adhesive preparations and their use |
US11759505B2 (en) | 2017-03-09 | 2023-09-19 | Previpharma Consulting Gmbh | Preparing and use of Glu-plasminogen from blood fractions |
IL256405A (en) | 2017-12-19 | 2018-01-31 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | Wound bandage and method for its production |
CA3089175A1 (en) * | 2018-02-28 | 2019-09-06 | Plas-free Ltd. | Extracorporeal device and matrix for removing fibrinolytic proteins from biological fluids, methods and uses thereof |
WO2020121289A1 (en) | 2018-12-12 | 2020-06-18 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Low concentrated protein compositions for preventing tissue adhesion |
IL263679A (en) | 2018-12-12 | 2019-03-31 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | Kits, methods, and ingredients for preventing tissue adhesion |
CN111760556B (zh) * | 2020-07-09 | 2023-06-30 | 江苏尤里卡生物科技有限公司 | 一种尿激酶吸附剂及其制备方法和应用 |
US20220380439A1 (en) | 2020-11-09 | 2022-12-01 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Purification of fviii from plasma using silicon oxide adsorption |
WO2022258590A1 (en) | 2021-06-08 | 2022-12-15 | Previpharma Consulting Gmbh | Process for isolating plasminogen from a blood plasma fraction |
CN113533594A (zh) * | 2021-06-30 | 2021-10-22 | 长沙都正生物科技股份有限公司 | 用于测定氨甲环酸含量的方法及试剂盒 |
US20230085152A1 (en) | 2021-09-16 | 2023-03-16 | Ethicon, Inc. | Kit for Composition for Tissue Tract Sealing |
WO2023119277A1 (en) | 2021-12-21 | 2023-06-29 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Highly soluble fibrinogen compositions |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU979508A1 (ru) * | 1980-07-23 | 1982-12-07 | Ордена Трудового Красного Знамени Институт Биохимии Им.А.В.Палладина | Способ получени иммобилизованного плазминогена |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3943245A (en) * | 1974-02-14 | 1976-03-09 | Armour Pharmaceutical Company | Purification of plasminogen |
US4639513A (en) * | 1984-02-02 | 1987-01-27 | Cuno Inc. | Intravenously injectable immunoglobulin G (IGG) and method for producing same |
US4639543A (en) | 1985-02-04 | 1987-01-27 | Richard J. Birch | Semiconductor devices having a metallic glass substrate |
JPS6391080A (ja) | 1986-10-03 | 1988-04-21 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | ヒト組織プラスミノゲン活性化因子の精製法 |
GB8902771D0 (en) * | 1989-02-08 | 1989-03-30 | Bioprocessing Ltd | Improvements in or relating to affinity chromatography |
DE69033653T2 (de) | 1989-04-07 | 2001-06-07 | Cancerforskningsfonden Af 1989 | Plasminogen-aktivator-rezeptor vom urokinasetyp |
SU1727839A1 (ru) | 1990-05-30 | 1992-04-23 | МГУ им.М.В.Ломоносова | Способ получени фибриногена |
US5792835A (en) * | 1991-09-05 | 1998-08-11 | Baxter International Inc. | Method of preparing a topical fibrinogen complex |
DK82592D0 (da) * | 1992-06-23 | 1992-06-23 | Novo Nordisk As | Fremstilling af proteiner |
US5362859A (en) * | 1992-07-27 | 1994-11-08 | Sepracor, Inc. | High-capacity affinity supports and methods for the preparation and use of same |
JPH08225461A (ja) | 1995-02-21 | 1996-09-03 | Green Cross Corp:The | プラスミノーゲンの精製方法およびプラスミノーゲン製剤 |
JP3763598B2 (ja) | 1995-09-11 | 2006-04-05 | 旭電化工業株式会社 | トラネキサム酸の製造方法 |
US6451978B2 (en) * | 2000-01-21 | 2002-09-17 | Biovitrum Ab | Purification of antithrombin-III-α and β |
WO2002095019A1 (en) | 2001-05-21 | 2002-11-28 | Omrix Biopharmaceuticals S.A. | Removal of plasmin(ogen) from protein solutions |
-
2002
- 2002-05-17 WO PCT/EP2002/005462 patent/WO2002095019A1/en active IP Right Grant
- 2002-05-17 CZ CZ20033097A patent/CZ20033097A3/cs unknown
- 2002-05-17 KR KR1020037015108A patent/KR100871454B1/ko active IP Right Grant
- 2002-05-17 CA CA2447789A patent/CA2447789C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-17 EP EP02740615A patent/EP1390485B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-17 RU RU2008130356/10A patent/RU2458067C2/ru active
- 2002-05-17 IL IL15875402A patent/IL158754A0/xx unknown
- 2002-05-17 PL PL365808A patent/PL205685B1/pl unknown
- 2002-05-17 HU HU0600110A patent/HU228899B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2002-05-17 RU RU2003136746/13A patent/RU2344143C2/ru active
- 2002-05-17 AT AT02740615T patent/ATE342353T1/de active
- 2002-05-17 US US10/477,519 patent/US20040197891A1/en not_active Abandoned
- 2002-05-17 SK SK1420-2003A patent/SK288005B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2002-05-17 JP JP2002592482A patent/JP4385097B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-17 AU AU2002314081A patent/AU2002314081B2/en not_active Expired
- 2002-05-17 DE DE60215338T patent/DE60215338T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-17 MX MXPA03010616A patent/MXPA03010616A/es active IP Right Grant
- 2002-05-17 ES ES02740615T patent/ES2274044T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-17 EE EEP200300578A patent/EE05485B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2002-05-20 US US10/150,490 patent/US7125569B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-11-05 IL IL158754A patent/IL158754A/en unknown
- 2003-11-20 ZA ZA2003/09030A patent/ZA200309030B/en unknown
-
2004
- 2004-05-28 HK HK04103846A patent/HK1060902A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-10-17 US US11/581,753 patent/US7641918B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2008
- 2008-10-29 US US12/289,499 patent/US8563288B2/en active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU979508A1 (ru) * | 1980-07-23 | 1982-12-07 | Ордена Трудового Красного Знамени Институт Биохимии Им.А.В.Палладина | Способ получени иммобилизованного плазминогена |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
HATTON M.W. et al., The relevance of the structure of lysine bound to Sepharose for the affinity of rabbit plasminogen, Biochim Biophys Acta., 1975, v.379, n.2, p.504-511. MOROZ L.A. ET AL., Fibrinolysis in Normal Plasma and Blood; Evidence for Significant Mechanisms Independent of the Plasminogen- Plasmin System, BLOOD, 1976, v.48, n.4, p.531-546. * |
IWAMOOTO MASAHIRO, Plasminogen- Plasmin System XI. Specific Binding of Tranexamic Acid to plasmin, THROMB.DIATH.HAEMORRH, 1975, v.33, n.3, p.573-585. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2685956C2 (ru) * | 2012-12-05 | 2019-04-23 | Цсл Беринг Гмбх | Способ очистки лечебных белков |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2458067C2 (ru) | Способ выделения плазминогена или плазмина в присутствии фибриногена из смеси | |
AU2002314081A1 (en) | Removal pf plasmin(Ogen) from protein solutions | |
Thaler et al. | A simple two‐step isolation procedure for human and bovine antithrombin II/III (heparin cofactor): a comparison of two methods | |
AU2010277491B2 (en) | Method for purifying recombinant ADAMTS13 and other proteins and compositions thereof | |
FI96211C (fi) | Menetelmä yksisäikeisen kudosplasminogeeniaktivaattorin (tPA) ja kaksisäikeisen tPA:n puhdistamiseksi ja eristämiseksi | |
AU2021200815B2 (en) | Methods of purifying recombinant adamts13 and other proteins and compositions thereof | |
JPH07508009A (ja) | クリングル含有タンパク質及び特にt−PAの精製 | |
JP2714817B2 (ja) | ウロキナーゼ前駆体の製造方法 | |
EP3512940A1 (en) | Process for plasminogen purification starting from human plasma | |
JPH0759191B2 (ja) | ヒトプラスミン−α2−プラスミンインヒビタ−複合体の製造方法およびその分離方法 |