RU2453601C2 - Seedlings improved with endophyte with increased resistance to pests - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnologies.

SUBSTANCE: invention relates to biotechnology. The method is described to get a germ of a coniferous plant with increased resistance to pests, which includes the following: inoculation of a coniferous plant seed or an intact coniferous germ with an extracted toxigenic endophyte within a time interval of sensitivity, when the coniferous seed or coniferous germ is sensitive to colonisation with a toxigenic endophyte, where the time interval of sensitivity for the seed during seed stratification and for the coniferous germ is an interval from the stage of postemergence to the period of final formation of cuticle, where the stage of inoculation provides for bringing coniferous seed or coniferous germ in contact with the inoculate composition, containing a toxigenic endophyte, and growing the specified coniferous seed or coniferous germ to get a coniferous germ with higher resistance to pests. A coniferous plant is proposed, colonised with an extracted toxigenic endophyte, where the coniferous plant is grown from a coniferous plant seed or a coniferous germ produced by the specified method, where the coniferous plant produces a toxin moderating growth of pests, where the toxin contains rugulosin, vermiculin or 5-methoxy-carbonylmellein.

EFFECT: invention makes it possible to do large-scale inoculation of coniferous plants with desirable strains of endophytes.

18 cl, 11 dwg, 4 tbl, 17 ex

Description

Область техники, которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Изобретение относится к экологически ориентированным способам борьбы с вредителями. Оно относится к способу получения улучшенных эндофитом растений с увеличенной устойчивостью к вредителям, таким как растительноядные насекомые, посредством инокуляции токсикогенными эндофитными грибками.The invention relates to environmentally friendly methods of pest control. It relates to a method for producing improved endophyte plants with increased resistance to pests, such as herbivorous insects, by inoculation with toxicogenic endophytic fungi.

Предпосылки изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION

Известно, что листья различных растений, включая макроводоросли, траву и осоки, обладают бессимптомными инфекциями. Вовлеченные в это грибки обычно обозначают как эндофиты (Carroll, 1988; Clay, 1988). Эндофит представляет собой «организм, обитающий в органах растений, который в какое-то время в его жизни может колонизировать внутреннюю ткань растения, не вызывая очевидного вреда для хозяина» (Petrini 1991). Считают, что грибковые эндофиты являются специфическими для хозяина, так что они инфицируют один или небольшую подгруппу видов растений.It is known that the leaves of various plants, including macroalgae, grass and sedge, have asymptomatic infections. The fungi involved in this are usually referred to as endophytes (Carroll, 1988; Clay, 1988). Endophyte is “an organism living in the organs of plants, which at some time in its life can colonize the internal tissue of a plant without causing obvious harm to the host” (Petrini 1991). Fungal endophytes are believed to be host-specific, so that they infect one or a small subset of plant species.

Хорошо понятно, что токсические метаболиты, продуцируемые эндофитами травы, сильно снижают популяции растительноядных насекомых, атакующих растение. Это оказывает большое влияние на приспособленность растений (Clay, 1988; Clay & Holah, 1999). Семена травы из культиваров, содержащих грибковые эндофиты листьев, в течение 10 лет составляли доминирующий способ, применяемый для газонов и полей для игры в гольф в местностях США и Канады. Эти грибки продуцируют внутри листьев травы очень сильные токсины, которые убивают насекомых. Это намного уменьшает количество жестких химических пестицидов, используемых для полученных газонов. Такие газоны обладают увеличенной засухоустойчивостью и обладают увеличенной устойчивостью к грибковым заболеваниям.It is well understood that toxic metabolites produced by grass endophytes greatly reduce the populations of herbivorous insects attacking the plant. This has a large effect on plant fitness (Clay, 1988; Clay & Holah, 1999). Grass seeds from cultivars containing fungal leaf endophytes for 10 years have been the dominant method used for lawns and golf courses in the United States and Canada. These fungi produce very powerful toxins inside the leaves of the grass that kill insects. This greatly reduces the amount of harsh chemical pesticides used for the resulting lawns. Such lawns have increased drought tolerance and have increased resistance to fungal diseases.

Иглы хвойных также являются инфицированными системными грибковыми эндофитами, которые могут исполнять несколько экологических ролей (Carroll 1988; Ganley et al. 2004).Conifer needles are also infected with systemic fungal endophytes, which can play several environmental roles (Carroll 1988; Ganley et al. 2004).

Carroll & Carroll (1978) впервые предположили, что грибковые эндофиты, выделенные из игл хвойных, могут представлять собой мутуалистические симбионты. Это позволяет предполагать уменьшение вкусовой привлекательности для пасущихся насекомых и антагонизм против патогенов игл как возможные преимущества для деревьев-хозяев. В последующей работе эта группа изучала связь между Дугласовой пихтой (Pseudotsuga menziesii) и эндофитом игл Rhabdocline parkeri (Sherwood-Pike et al., 1986; Todd, 1988). Экстракт R. parkeri являлся цитотоксическим для клеток HeLa и приводил к уменьшению скорости роста и к смертности при введении в синтетические рационы Choristoneura fumiferana (гусеницы листовертки-почкоеда елового) при 10 мкг г^-1 (Miller, 1986).Carroll & Carroll (1978) first suggested that fungal endophytes isolated from conifers needles may be mutualistic symbionts. This suggests a decrease in palatability for grazing insects and antagonism against needle pathogens as potential benefits for host trees. In a subsequent work, this group studied the relationship between Douglas fir ( Pseudotsuga menziesii ) and the endophyte of Rhabdocline parkeri needles (Sherwood-Pike et al., 1986; Todd, 1988). The extract of R. parkeri was cytotoxic for HeLa cells and led to a decrease in growth rate and mortality when introduced into synthetic diets of Choristoneura fumiferana (spruce leaf-bud caterpillar tracks) at 10 μg g ^-1 (Miller, 1986).

Хвойные, подобно другим видам растений, чувствительны к повреждению вредителями. Например, гусеница листовертки-почкоеда восточной ели представляет собой наносящего экономический убыток насекомого-вредителя. Последний раз, когда случилась эпидемия в Восточной Канаде, предпринимали крупномасштабное опрыскивание жесткими химическими пестицидами. Когда это осуществили, леса были уничтожены. Только в 1977 г. стоимость программы опрыскивания в Нью-Брансуик составила приблизительно 47 миллионов $ для неизменяющегося курса доллара. В течение двух промежуточных десятилетий, в течение спада в цикле гусеницы листовертки-почкоеда, для жестких химических пестицидов, применяемых в 1970-е годы, отменили регистрацию в пользу биопестицидов. Вне зависимости от этого в настоящее время менее вероятно, что будет существовать общественное согласие для широко распространенного использования химических инсектицидов, когда популяция гусеницы листовертки-почкоеда елового вернется к эпидемическим соотношениям. Необходимы новые способы борьбы с гусеницей листовертки-почкоеда елового и другими насекомыми-вредителями.Conifers, like other types of plants, are susceptible to damage by pests. For example, the caterpillar of the oriental spruce bud-leaf beetle is an economically damaging pest. The last time an epidemic occurred in eastern Canada, large-scale spraying with harsh chemical pesticides was undertaken. When this was done, the forests were destroyed. In 1977 alone, the cost of a spraying program in New Brunswick was approximately $ 47 million for a constant dollar rate. For two intermediate decades, during the recession in the caterpillar cycle of the bud-leaf beetle, for the harsh chemical pesticides used in the 1970s, deregistered in favor of biopesticides. Regardless of this, it is now less likely that there will be public consensus for the widespread use of chemical insecticides when the spruce bud-caterpillar caterpillar population returns to epidemic proportions. New methods are needed to combat the caterpillar of the spruce bud-leaf beetle and other pests.

Royama (1984) опубликовал всесторонний анализ динамики популяций гусеницы листовертки-почкоеда елового, сфокусированный на периоде от 1945 до 1983 гг. в Нью-Брансуик (NB), Канада. Один признак этого анализа заключался в том, что он предположил «пятый агент», относящийся к неизвестному фактору, который необходим для построения моделей, лучше всего подходящих к наблюдаемым изменениям популяций. Важнейшей характеристикой этого пятого агента являлось то, что он некоторым образом изменял ответ на популяции насекомых на известные факторы, такие как погода, хищники и заболевания.Royama (1984) published a comprehensive analysis of the dynamics of populations of the spruce bud-leaf beetle caterpillar, focused on the period from 1945 to 1983. in New Brunswick (NB), Canada. One sign of this analysis was that he suggested a “fifth agent”, referring to an unknown factor that is necessary to build models that are best suited to observed changes in populations. The most important characteristic of this fifth agent was that it somehow changed the response to insect populations to known factors, such as weather, predators and diseases.

С 1984-1994 гг. проведены выделения эндофитов, присутствующих на иглах различных видов хвойных в окрестностях NB. Как обнаружили рабочие по всему миру, иглы всех проверенных зрелых хвойных были колонизированы несколькими видами эндофитов (Johnson & Whitney, 1989; Wilson, 1994). Обнаружили, что из коллекций из окрестностей NB, содержащих 3500 штаммов, низкий процент из Abies balsamea (бальзамическая пихта), Picea rubens (красная ель), Picea glauca (белая ель) и Picea mariana (черная ель) продуцировал токсины против насекомых (Calhoun et al., 1992; Clark et al., 1989 Findlay, 1996; Findlay et al., 1994; Findlay et al., 1995). Один из токсинов, ругулозин, получен из культур, полученных из игл красной ели (Calhoun et al., 1992).From 1984-1994 endophytes present on needles of various species of conifers in the vicinity of NB were isolated. As workers around the world have discovered, the needles of all tested mature conifers have been colonized by several endophytic species (Johnson & Whitney, 1989; Wilson, 1994). Found that from collections from the vicinity of NB containing 3500 strains, a low percentage of Abies balsamea (balsam fir), Picea rubens (red spruce), Picea glauca (white spruce) and Picea mariana (black spruce) produced insect toxins (Calhoun et al., 1992; Clark et al., 1989 Findlay, 1996; Findlay et al., 1994; Findlay et al., 1995). One of the toxins, rugulosin, is derived from cultures derived from red spruce needles (Calhoun et al., 1992).

В природе саженцы деревьев могут нуждаться в эндофитах игл с деревьев, окружающих растущее дерево. Однако большинство из этих штаммов, по-видимому, неспособны продуцировать соединения против насекомых. Коммерчески полученные саженцы, покидающие производственные объекты, не являются колонизированными эндофитами игл (Miller et al., 2002). Хвойные, инокулированные эндофитами для увеличения устойчивости к вредителям, были бы очень желательными, учитывая сотни миллионов саженцев, производимых ежегодно в Северной Америке.In nature, tree seedlings may need endophytes of needles from the trees surrounding a growing tree. However, most of these strains appear to be unable to produce insect compounds. Commercially obtained seedlings leaving production facilities are not colonized endophytic needles (Miller et al., 2002). Conifers inoculated with endophytes to increase pest resistance would be highly desirable given the hundreds of millions of seedlings produced annually in North America.

Существуют трудности в колонизации хвойных эндофитами. Экономически жизнеспособная крупномасштабная инокуляция хвойных желательными штаммами эндофитов требует способа с увеличенной эффективностью колонизации и простотой инокуляции.There are difficulties in the colonization of coniferous endophytes. An economically viable large-scale inoculation of conifers with desired endophyte strains requires a method with increased colonization efficiency and ease of inoculation.

Краткое изложение сущности изобретенияSummary of the invention

Изобретение относится к новым выделенным штаммам токсикогенных эндофитов и относится к способам для получения сеянцев хвойных с увеличенной устойчивостью к вредителям и для инокуляции сеянцев хвойных композицией инокулята. Авторы изобретения обнаружили, что сеянцы хвойных можно колонизировать токсикогенным эндофитом с использованием способа, который не требует нанесения ран. Инокулят можно вводить, в одном варианте осуществления, распылением. Кроме того, авторы изобретения обнаружили, что эффективность инокуляции является наиболее высокой в период времени, обозначенный здесь как «окно времени чувствительности» или период времени «восприимчивости». Таким образом, изобретение относится к способам, позволяющим увеличенную эффективность колонизации и пригодным к крупномасштабным инокуляциям. Изобретение также относится к сеянцам, деревьям и частям деревьев (таким, как иглы и семена), полученным согласно способам по изобретению.The invention relates to new isolated strains of toxicogenic endophytes and relates to methods for producing coniferous seedlings with increased resistance to pests and for inoculating coniferous seedlings with an inoculum composition. The inventors have found that conifer seedlings can be colonized with toxicogenic endophyte using a method that does not require wounds. The inoculum may be administered, in one embodiment, by nebulization. In addition, the inventors have found that inoculation efficiency is highest in a time period, referred to herein as a “sensitivity time window” or “susceptibility” time period. Thus, the invention relates to methods that allow increased colonization efficiency and are suitable for large-scale inoculations. The invention also relates to seedlings, trees and parts of trees (such as needles and seeds) obtained according to the methods of the invention.

Соответственно изобретение относится к способу получения сеянцев хвойных (т.е. колонизированных сеянцев хвойных) с увеличенной устойчивостью к вредителям, включающему в себя инокуляцию сеянцев хвойных (т.е. нативных сеянцев хвойных) для получения увеличенной устойчивости к вредителям, включающему в себя инокуляцию сеянцев хвойных выделенным токсикогенным эндофитом, когда сеянцы хвойных являются чувствительными к колонизации эндофитом. Авторы изобретения идентифицировали ряд токсикогенных эндофитов.Accordingly, the invention relates to a method for producing coniferous seedlings (i.e., colonized coniferous seedlings) with increased pest resistance, including inoculating coniferous seedlings (i.e., native coniferous seedlings) to obtain increased pest resistance, including inoculation of seedlings conifers with isolated toxicogenic endophyte, when coniferous seedlings are sensitive to endophyte colonization. The inventors have identified a number of toxicogenic endophytes.

Соответственно в другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному токсикогенному эндофиту.Accordingly, in another embodiment, the invention relates to isolated toxicogenic endophyte.

Выделенные токсикогенные эндофиты являются применимыми для получения сеянцев хвойных с увеличенной устойчивостью к вредителям. Соответственно в другом варианте осуществления изобретение относится к хвойным, колонизированным выделенным токсикогенным эндофитом, продуцирующим токсин, замедляющий рост вредителей.Isolated toxicogenic endophytes are suitable for the production of coniferous seedlings with increased resistance to pests. Accordingly, in another embodiment, the invention relates to coniferous, colonized secreted toxicogenic endophyte producing toxin, slowing down the growth of pests.

В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному токсикогенному эндофиту, выбранному из группы, состоящей из 05-37A, 06-486D, 06-485A, 04-052B, 06-011B, 06-011D, 06-012C, 06-013A, 06-014C, 08-040B, 06-264A, 06-332A, 06-268A, 07-013D, 08-011D, 01-002A, 04-002G, 03-020B, 04-012A, 06-063D, 02-002C, 06-073C, 06-094E, 06-255A, 06-097D и 08-018A.In another embodiment, the invention relates to an isolated toxicogenic endophyte selected from the group consisting of 05-37A, 06-486D, 06-485A, 04-052B, 06-011B, 06-011D, 06-012C, 06-013A, 06 -014C, 08-040B, 06-264A, 06-332A, 06-268A, 07-013D, 08-011D, 01-002A, 04-002G, 03-020B, 04-012A, 06-063D, 02-002C , 06-073C, 06-094E, 06-255A, 06-097D and 08-018A.

В другом варианте осуществления изобретение относится к композиции инокулята для инокуляции хвойных для получения увеличенной устойчивости к вредителям, содержащей разбавитель и выделенный токсикогенный эндофит, продуцирующий токсин, токсичный для вредителя.In another embodiment, the invention relates to an inoculum composition for inoculating conifers to obtain increased pest resistance, comprising a diluent and an isolated toxicogenic endophyte producing a toxin toxic to the pest.

В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу, направленному против токсикогенного эндофита, выбранного из группы, состоящей из 5WS22E1, 5WS11/1, 05-37A, 06-486D, 06-485A, 04-052B, 06-011B, 06-011D, 06-012C, 06-013A, 06-014C, 08-040B, 06-264A, 06-332A, 06-268A, 07-013D, 08-011D, 01-002A, 04-002G, 03-020B, 04-012A, 06-063D, 02-002C, 06-073C, 06-094E, 06-255A, 06-097D и 08-018A.In another embodiment, the invention relates to an antibody directed against a toxicogenic endophyte selected from the group consisting of 5WS22E1, 5WS11 / 1, 05-37A, 06-486D, 06-485A, 04-052B, 06-011B, 06-011D, 06-012C, 06-013A, 06-014C, 08-040B, 06-264A, 06-332A, 06-268A, 07-013D, 08-011D, 01-002A, 04-002G, 03-020B, 04- 012A, 06-063D, 02-002C, 06-073C, 06-094E, 06-255A, 06-097D and 08-018A.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу детекции присутствия намеченного выделенного токсикогенного эндофита в образце хвойных, включающему в себя:In another embodiment, the invention relates to a method for detecting the presence of an intended isolated toxicogenic endophyte in a coniferous sample, comprising:

a) приведение в контакт образца хвойных с антителом, направленным против эндофита;a) contacting a sample of conifers with an antibody directed against an endophyte;

b) детекцию присутствия связавшегося антитела в образе, где присутствие связавшегося антитела является показательным для присутствия токсикогенного эндофита.b) detecting the presence of a bound antibody in an image where the presence of a bound antibody is indicative of the presence of a toxicogenic endophyte.

Представлены также способы выделения токсикогенных эндофитов, выделенные нуклеиновые кислоты и наборы для практического осуществления описанных здесь способов.Also provided are methods for isolating toxicogenic endophytes, isolated nucleic acids, and kits for practicing the methods described herein.

Другие признаки и преимущества по настоящему изобретению станут очевидными из следующего подробного описания. Следует понимать, однако, что подробное описание и конкретные примеры, в то время как показывают предпочтительные варианты осуществления изобретения, приведены только с целью иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации в пределах содержания и объема изобретения будут очевидными для специалистов в данной области из этого подробного описания.Other features and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description. It should be understood, however, that the detailed description and specific examples, while showing preferred embodiments of the invention, are for illustrative purposes only, since various changes and modifications within the scope and scope of the invention will be apparent to those skilled in the art from this detailed description. .

Краткое описание рисунковBrief Description of Drawings

Варианты осуществления изобретения будут описаны в отношении рисунков, где:Embodiments of the invention will be described in relation to the drawings, where:

На фигуре 1 показан ответ серийных разведений поликлонального антитела на намеченный эндофит 5WS22E1 [кривая наилучшего соответствия с использованием способа LOWESS] вместе со сравнениями при 60 нг/лунку с клетками некоторых эндофитов белой ели (WS331L1, WS11/1), некоторых грибов, общераспространенных в окружении сеянцев (A. alternata; A. fumigatus, C. cladosporioides, виды Phoma), так же как с контрольными порошкообразными лиофилизированными иглами белой ели.Figure 1 shows the response of serial dilutions of a polyclonal antibody to the target 5WS22E1 endophyte [best fit curve using the LOWESS method] together with comparisons at 60 ng / well with cells of some white spruce endophytes (WS331L1, WS11 / 1), some common mushrooms in the environment seedlings ( A. alternata ; A. fumigatus , C. cladosporioides , Phoma species), as well as with control powdery lyophilized needles of white spruce.

На фигуре 2 показан ответ поликлонального антитела на 30, 60, 120 и 240 нг клеток 5WS22E1 и на такие же количества, добавленные к 500 нг порошкообразных клеток белой ели [среднее плюс стандартная ошибка].Figure 2 shows the response of a polyclonal antibody to 30, 60, 120, and 240 ng of 5WS22E1 cells and to the same amounts added to 500 ng of powdery white spruce cells [mean plus standard error].

На фигуре 3 показано распределение концентраций ругулозина в иглах от 113 сеянцев, принимая половину предела детекции за отсутствие детекции [с нормальным сглаживанием].The figure 3 shows the concentration distribution of rugulosin in the needles from 113 seedlings, taking half the detection limit for the lack of detection [with normal smoothing].

Фигура 4 представляет собой график линейности и авидности поликлонального антитела для эндофита 5WS11/1.Figure 4 is a graph of linearity and avidity of a polyclonal antibody for endophyte 5WS11 / 1.

На фигуре 5 показано применение поликлонального антитела, применяемого для детекции эндофита 5WS11/1 in planta.Figure 5 shows the use of a polyclonal antibody used to detect 5WS11 / 1 endophyte in planta .

На фигуре 6 показан график примера окна времени чувствительности сеянцев для колонизации токсикогенными эндофитами.Figure 6 shows a graph of an example time window of the sensitivity of seedlings for colonization with toxicogenic endophytes.

На фигуре 7 показана запись самописца для HPLC для ругулозина.Figure 7 shows a recorder for HPLC for rugulosin.

На фигуре 8 показана средняя масса гусеницы листовертки-почкоеда елового, выращенной на рационе с увеличивающейся концентрацией ругулозина.The figure 8 shows the average weight of the caterpillar spruce bud-leaf bud, grown on a diet with an increasing concentration of rugulosin.

Фигура 9 представляет собой 3D-гистограмму, показывающую концентрацию ругулозина в иглах в ~300 ветвях с 20 деревьев через 15 месяцев после инокуляции эндофитом 5WS22E1 по отношению к доле образцов; среднее геометрическое концентрации составляло 0,8 мкг г^-1.Figure 9 is a 3D histogram showing the concentration of rugulosin in needles in ~ 300 branches from 20 trees 15 months after inoculation with 5WS22E1 endophyte in relation to the proportion of samples; geometric mean concentration was 0.8 μg g ^-1 .

Фигура 10 представляет собой фотографию деревьев в возрасте четырех лет, показывающую сетчатое покрытие на отдельных ветвях.Figure 10 is a photograph of four-year-old trees showing a mesh coating on individual branches.

Фигура 11 представляет собой график, показывающий распределение массы насекомых между инфицированными эндофитами и неинфицированными деревьями в возрасте трех лет; массы между двумя группами значимо различались по ANOVA, P = 0,018.Figure 11 is a graph showing the mass distribution of insects between infected endophytes and uninfected trees at the age of three years; the masses between the two groups differed significantly in ANOVA, P = 0.018.

Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Авторы изобретения идентифицировали способы инокуляции сеянцев хвойных токсикогенными штаммами грибковых эндофитов и получения инфицированных токсикогенным эндофитом сеянцев хвойных, которые являются более устойчивыми к повреждению вредителями.The inventors have identified methods of inoculating coniferous seedlings with toxicogenic strains of fungal endophytes and producing toxicogenic endophyte-infected coniferous seedlings that are more resistant to damage by pests.

Некоторые штаммы эндофитов, естественным образом колонизирующие иглы хвойных, продуцируют соединения или токсины, влияющие на выживаемость вредителей. Иглы колонизированных таким образом сеянцев содержат токсины, и скорость роста вредителей снижена, а чувствительность к паразитам и природным бактериальным патогенам увеличена. Авторы изобретения выделили множество штаммов токсикогенных эндофитов и разработали способы размножения этих штаммов. Кроме того, авторы изобретения показали, что сеянцы хвойных можно инокулировать продуцирующими токсин штаммами эндофитов во время окна времени чувствительности. Инокуляция во время периода времени чувствительности улучшает колонизацию токсикогенным эндофитом. Авторы изобретения показали, что колонизация токсикогенным эндофитом персистирует и распространяется на неинокулированные новые выросшие ветви так, же как на соседние сеянцы. Кроме того, эти способы, как показали авторы изобретения, поддаются крупномасштабной продукции в промышленных посадках. Авторы изобретения также выделили несколько новых штаммов эндофитов и идентифицировали главный токсин, продуцируемый некоторыми из этих штаммов эндофитов.Some strains of endophytes, naturally colonizing conifer needles, produce compounds or toxins that affect pest survival. The needles of seedlings colonized in this way contain toxins, and the growth rate of the pests is reduced, and the sensitivity to parasites and natural bacterial pathogens is increased. The inventors have identified many strains of toxicogenic endophytes and developed methods of propagation of these strains. In addition, the inventors have shown that conifer seedlings can be inoculated with toxin-producing endophyte strains during the sensitivity time window. Inoculation during a time period of sensitivity improves colonization with toxicogenic endophyte. The inventors have shown that the colonization of toxicogenic endophyte persists and spreads to uninoculated new grown branches as well as to neighboring seedlings. In addition, these methods, as shown by the inventors, lend themselves to large-scale production in industrial plantings. The inventors also isolated several new endophyte strains and identified the major toxin produced by some of these endophyte strains.

Представлены способы для инокуляции сеянцев хвойных, для детекции успешно инокулированных растений, для получения эффективной композиции инокулята, так же как способы получения колонизированных токсикогенным эндофитом хвойных растений, которые являются устойчивыми к вредителям, таким как гусеница листовертки-почкоеда елового. Изобретение относится также к новым штаммам токсикогенного эндофита, композициям инокулята и токсикогенным, колонизированным эндофитом хвойным растениям.Methods are presented for inoculating coniferous seedlings, for detecting successfully inoculated plants, for obtaining an effective inoculum composition, as well as methods for producing coniferous plants colonized by toxicogenic endophyte that are resistant to pests, such as a spider bud-leaf caterpillar. The invention also relates to new strains of toxicogenic endophyte, inoculum compositions and toxicogenic coniferous plants colonized by endophyte.

Соответственно в одном варианте осуществления изобретение относится к способу инокуляции сеянца хвойного, где способ включает в себя инокуляцию сеянца хвойного эффективным количеством композиции инокулята, содержащей выделенный токсикогенный эндофит, во время окна времени чувствительности, где окно времени чувствительности представляет собой период времени, во время которого сеянец хвойного является чувствительным к колонизации токсикогенным эндофитом.Accordingly, in one embodiment, the invention relates to a method for inoculating a conifer seedling, wherein the method comprises inoculating a conifer seedling with an effective amount of an inoculum composition containing an isolated toxicogenic endophyte during a sensitivity time window, where the sensitivity time window is a period of time during which the seedling coniferous is sensitive to colonization by toxicogenic endophyte.

Термин «сеянец», как применяют здесь, обозначает молодое растение и включает в себя молодое растение, выращенное в промышленном питомнике перед окончательной посадкой, и включает в себя период развития сеянца от семени до 16 недель после прорастания.The term "seedling", as used here, means a young plant and includes a young plant grown in an industrial nursery before the final planting, and includes the period of development of the seedling from seed to 16 weeks after germination.

Термин «колонизация», как применяют здесь, обозначает персистенцию инокулированного эндофита в хвойном растении, где хвойное является хозяином для эндофита, и эндофит персистирует в достаточном количестве для детекции каким-либо анализом, например анализом детекции антителом с использованием антитела, направленного против эндофита и/или анализом для детекции производного токсина эндофита или модифицированной растением формы, или, альтернативно, персистирует в достаточном количестве для придания хозяину устойчивости к вредителям. Необязательно вегетативно размножаемые обрезки колонизированного растения также являются колонизированными, и сеянцы, приобретшие токсикогенный эндофит посредством вертикальной передачи, также являются колонизированными.The term "colonization", as used here, means the persistence of the inoculated endophyte in the coniferous plant, where the coniferous is the host for the endophyte, and the endophyte persists in sufficient quantity for detection by any analysis, for example, an antibody detection analysis using an antibody directed against the endophyte and / or by an analysis to detect a derivative of an endophyte toxin or plant modified form, or alternatively, persists in sufficient quantity to confer pest resistance to the host. Optional vegetatively propagated prunings of the colonized plant are also colonized, and seedlings that have acquired the toxicogenic endophyte through vertical transmission are also colonized.

Токсикогенные эндофитыToxicogenic endophytes

Термин «токсикогенный», как применяют здесь, обозначает токсичный для вредителей, таких как вредители хвойных. «Токсикогенный» включает в себя токсичность против насекомых и против грибов. Термин «выделенный токсикогенный эндофит», как применяют здесь, обозначает выделенный штамм эндофита, продуцирующий токсин, который является токсичным для вредителя. Выделенный токсикогенный эндофит является способным колонизировать сеянцы хвойных и продуцировать токсин в колонизированном растении. Токсин, продуцированный токсикогенным эндофитом, придает увеличенную устойчивость к вредителям посредством контроля, снижения, уменьшения, предупреждения или отпугивания вредителей, и/или роста вредителей, и/или повреждения вредителей в колонизированном растении по сравнению с неколонизированным растением.The term “toxicogenic”, as used herein, means toxic to pests such as conifers. "Toxicogenic" includes toxicity against insects and against fungi. The term “isolated toxicogenic endophyte”, as used herein, means an isolated strain of endophyte producing a toxin that is toxic to the pest. Isolated toxicogenic endophyte is capable of colonizing coniferous seedlings and producing toxin in a colonized plant. Toxin produced by toxicogenic endophyte gives increased resistance to pests by controlling, reducing, reducing, preventing or deterring pests, and / or growth of pests, and / or damage to pests in a colonized plant compared to an uncolonized plant.

В одном варианте осуществления токсикогенный эндофит по изобретению включает в себя штаммы, описанные в таблицах 1-3, и штаммы, перечисленные в другом месте в этом документе. Другие токсикогенные эндофиты легко использовать в способах по изобретению. Кроме того, необязательно, инокулируют более одного токсикогенного эндофита. Более одного токсикогенного эндофита, необязательно, инокулируют в одно и то же время или последовательно.In one embodiment, the toxicogenic endophyte of the invention includes the strains described in Tables 1-3 and the strains listed elsewhere in this document. Other toxicogenic endophytes are readily used in the methods of the invention. In addition, optionally, more than one toxicogenic endophyte is inoculated. More than one toxicogenic endophyte is optionally inoculated at the same time or sequentially.

Авторы изобретения показали, что различные эндофиты, выделенные из белой ели, являются токсикогенными для вредителей хвойных деревьев. Они включают в себя: продуцирующие ругулозин эндофиты; продуцирующие вермикулин эндофиты; продуцирующие меллеин, включая 5-метоксикарбонилмеллеин, 5-формилмеллеин, 5-метилмеллеин, эндофиты; продуцирующие тирозол, включая 3-бутил-4-метилфуран-2(5H)-он-бутиролактонтирозол, эндофиты; продуцирующие изокумарин, такой как 8-гидрокси-6-метокси-3-пропил-3,4-дигидроизокумарин, эндофиты; и продуцирующие 3-метил-5,7-диметоксифталид эндофиты. Эти метаболиты являются главными компонентами смесей различных метаболитов против насекомых и/или грибов, продуцируемых каждым штаммом, и включают в себя производные, модифицированные растением формы и их метаболиты, которые являются токсичными. Главные метаболиты, их производные, продукты деградации или модифицированные растением формы можно использовать в качестве посредников для токсичности. Грибы продуцируют смеси метаболитов, и токсичность смеси может быть больше, чем у доминирующего соединения, применяемого в качестве посредника. Это может вносить вклад в способность токсикогенного эндофита придавать длительную устойчивость. Термин 5-метоксикарбонилмеллеин, как применяют здесь, необязательно, включает в себя производные, модифицированные растением формы и их метаболиты, токсичные для вредителя.The inventors have shown that various endophytes isolated from white spruce are toxicogenic for pests of conifers. They include: rugulosin-producing endophytes; vermiculin producing endophytes; producing melein, including 5-methoxycarbonylmellein, 5-formylmellein, 5-methylmellein, endophytes; tyrosol-producing, including 3-butyl-4-methylfuran-2 (5H) -on-butyrolacton tyrosol, endophytes; producing isocoumarin, such as 8-hydroxy-6-methoxy-3-propyl-3,4-dihydroisocoumarin, endophytes; and producing 3-methyl-5,7-dimethoxyphthalide endophytes. These metabolites are the main components of mixtures of various metabolites against insects and / or fungi produced by each strain, and include derivatives, plant-modified forms and their metabolites, which are toxic. The major metabolites, their derivatives, degradation products or plant-modified forms can be used as intermediaries for toxicity. Fungi produce mixtures of metabolites, and the toxicity of the mixture may be greater than that of the dominant compound used as an intermediary. This may contribute to the ability of the toxicogenic endophyte to impart long-term resistance. The term 5-methoxycarbonylmellein, as used herein, optionally includes derivatives, plant-modified forms and their metabolites that are toxic to the pest.

В одном варианте осуществления выделенный токсикогенный эндофит, присутствующий в композиции инокулята, представляет собой продуцирующий ругулозин эндофит. В более конкретном варианте осуществления продуцирующий ругулозин эндофит представляет собой выделенный эндофит 5WS22E1, содержащий SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления выделенный токсикогенный эндофит представляет собой продуцирующий вермикулин эндофит. В более конкретном варианте осуществления продуцирующий вермикулин эндофит представляет собой выделенный эндофит 5WS11/1, содержащий SEQ ID NO: 2. В другом варианте осуществления выделенный токсикогенный эндофит представляет собой продуцирующий меллеин, такой как 5-метоксикарбонилмеллеин, эндофит. В более конкретном варианте осуществления продуцирующий 5-метоксикарбонилмеллеин эндофит представляет собой выделенный штамм 05-37A, содержащий SEQ ID NO: 3. В другом варианте осуществления выделенный токсикогенный эндофит представляет собой продуцирующий изокумарин, такой как 8-гидрокси-6-метокси-3-пропил-3,4-дигидроизокумарин, эндофит. В более конкретном варианте осуществления продуцирующий соединение изокумарина эндофит представляет собой 06-485A, содержащий SEQ ID NO:5. В другом варианте осуществления выделенный токсикогенный эндофит представляет собой продуцирующий тирозол эндофит. В более конкретном варианте осуществления продуцирующий тирозол эндофит выбран из группы, состоящей из 05-037A (SEQ ID NO:3), 06-486D (SEQ ID NO:4) и 06-485A (SEQ ID NO:5).In one embodiment, the isolated toxicogenic endophyte present in the inoculum composition is a rugulosin-producing endophyte. In a more specific embodiment, the rugulosin-producing endophyte is an isolated 5WS22E1 endophyte comprising SEQ ID NO: 1. In another embodiment, the isolated toxicogenic endophyte is a vermiculin-producing endophyte. In a more specific embodiment, the vermiculin producing endophyte is an isolated 5WS11 / 1 endophyte containing SEQ ID NO: 2. In another embodiment, the isolated toxicogenic endophyte is a producing melein such as 5-methoxycarbonylmellein, endophyte. In a more specific embodiment, the 5-methoxycarbonylmellein-producing endophyte is an isolated strain 05-37A containing SEQ ID NO: 3. In another embodiment, the isolated toxicogenic endophyte is isocoumarin-producing, such as 8-hydroxy-6-methoxy-3-propyl -3,4-dihydroisocoumarin, endophyte. In a more specific embodiment, the isocoumarin-producing endophyte compound is 06-485A comprising SEQ ID NO: 5. In another embodiment, the isolated toxicogenic endophyte is a tyrosol producing endophyte. In a more specific embodiment, the tyrosol-producing endophyte is selected from the group consisting of 05-037A (SEQ ID NO: 3), 06-486D (SEQ ID NO: 4) and 06-485A (SEQ ID NO: 5).

Выделенные токсикогенные эндофиты легко идентифицировать, например, авторы изобретения секвенировали области внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) рибосомальной ДНК (рДНК). Анализ последовательности выявил, что штаммы 5WS22E1 и 5WS11/1 представляют собой виды Phialocephala. Соответственно в другом варианте осуществления штамм токсикогенного эндофита, применяемый в способах по изобретению, представляет собой токсикогенный штамм вида Phialocephala.Isolated toxicogenic endophytes are easy to identify, for example, the inventors sequenced regions of the internal transcribed spacer (ITS) of ribosomal DNA (rDNA). Sequence analysis revealed that strains 5WS22E1 and 5WS11 / 1 are Phialocephala species. Accordingly, in another embodiment, the toxicogenic endophyte strain used in the methods of the invention is a toxicogenic strain of the Phialocephala species.

Кроме того, авторы изобретения выделили несколько новых токсикогенных эндофитов из игл белой ели, включая штаммы, обозначенные 05-037A, 06-486D, 06-485A, 04-052B, 06-011B, 06-011 D, 06-012C, 06-013A, 06-014C, и 08-040B.In addition, the inventors isolated several new toxicogenic endophytes from white spruce needles, including strains designated 05-037A, 06-486D, 06-485A, 04-052B, 06-011B, 06-011 D, 06-012C, 06- 013A, 06-014C, and 08-040B.

Данные последовательности показывают, что штамм эндофита 05-037A [SEQ ID NO: 3] является родственным Nemania serpens, что штамм 06-486D является родственным инвентарному номеру в Genbank AY971727, и 06-485A является родственным инвентарному номеру в Genbank AY971740, оба выделены из ели в Квебеке (родственные видам Lophodermium). Оба представляют собой виды Lophodermium (94% и 98% сходства ITS, соответственно), где 06-486D является более сходным с Rhytistimataceae.These sequences show that endophyte strain 05-037A [SEQ ID NO: 3] is related to Nemania serpens , that strain 06-486D is related to Genbank AY971727, and 06-485A is related to Genbank AY971740, both isolated from ate in Quebec (related to the species Lophodermium ). Both are Lophodermium species (94% and 98% similarity of ITS, respectively), where 06-486D is more similar to Rhytistimataceae .

Соответственно изобретение, кроме того, относится к выделенному токсикогенному эндофиту, содержащему последовательность в SEQ ID NO:3 (05-037A).Accordingly, the invention further relates to an isolated toxicogenic endophyte containing the sequence in SEQ ID NO: 3 (05-037A).

В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному токсикогенному эндофиту, содержащему последовательность в SEQ ID NO: 4 (06-486D). В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному токсикогенному эндофиту, содержащему последовательность в SEQ ID NO: 5 (06-485A). В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному токсикогенному эндофиту, содержащему последовательность в SEQ ID NO: 6 (04-052B).In another embodiment, the invention relates to an isolated toxicogenic endophyte comprising the sequence in SEQ ID NO: 4 (06-486D). In another embodiment, the invention relates to an isolated toxicogenic endophyte containing the sequence in SEQ ID NO: 5 (06-485A). In another embodiment, the invention relates to an isolated toxicogenic endophyte containing the sequence in SEQ ID NO: 6 (04-052B).

В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному токсикогенному эндофиту, содержащему последовательность в SEQ ID NO: 7 (06-011B).In another embodiment, the invention relates to an isolated toxicogenic endophyte containing the sequence in SEQ ID NO: 7 (06-011B).

В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному токсикогенному эндофиту, содержащему последовательность в SEQ ID NO: 8 (06-011D), и в другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному токсикогенному эндофиту, содержащему последовательность в SEQ ID NO: 9 (06-012C).In another embodiment, the invention relates to an isolated toxicogenic endophyte containing the sequence in SEQ ID NO: 8 (06-011D), and in another embodiment, the invention relates to an isolated toxicogenic endophyte containing the sequence in SEQ ID NO: 9 (06-012C) .

В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному токсикогенному эндофиту, содержащему последовательность в SEQ ID NO: 10 (06-013A). В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному токсикогенному эндофиту, содержащему последовательность в SEQ ID NO: 11 (06-014C). В дополнительном варианте осуществления изобретение относится к выделенному токсикогенному эндофиту, содержащему последовательность в SEQ ID NO: 12 (08-040B).In another embodiment, the invention relates to an isolated toxicogenic endophyte containing the sequence in SEQ ID NO: 10 (06-013A). In another embodiment, the invention relates to an isolated toxicogenic endophyte containing the sequence in SEQ ID NO: 11 (06-014C). In a further embodiment, the invention relates to an isolated toxicogenic endophyte comprising the sequence in SEQ ID NO: 12 (08-040B).

Кроме того, авторы изобретения выделили множество штаммов токсикогенных эндофитов из игл красной ели. Авторы изобретения подобным образом секвенировали области ITS из каждого штамма (см. таблицу 3).In addition, the inventors have isolated many strains of toxicogenic endophytes from red spruce needles. The inventors similarly sequenced ITS regions from each strain (see table 3).

Выделены также токсикогенные эндофиты из бальзамической пихты, такие как 7BF 36H1 (Findlay et al, 1995).Toxicogenic endophytes from balsamic fir, such as 7BF 36H1, were also isolated (Findlay et al, 1995).

В одном варианте осуществления токсикогенный эндофит содержит все или часть из одного из SEQ ID NO: 1-12, и предпочтительно по меньшей мере: 25-50 или 50-100 последовательных нуклеотидов из одного из SEQ ID NO: 1-12. В другом варианте осуществления токсикогенный эндофит содержит все или часть из одного из SEQ ID NO: 13-28, и предпочтительно по меньшей мере: одно из 25-50 или 50-100 последовательных нуклеотидов из SEQ ID NO: 13-28.In one embodiment, the toxicogenic endophyte contains all or part of one of SEQ ID NO: 1-12, and preferably at least: 25-50 or 50-100 consecutive nucleotides from one of SEQ ID NO: 1-12. In another embodiment, the toxicogenic endophyte contains all or part of one of SEQ ID NO: 13-28, and preferably at least: one of 25-50 or 50-100 consecutive nucleotides from SEQ ID NO: 13-28.

Несколько штаммов токсикогенных эндофитов для использования в способах по изобретению депонированы в международном депонирующем агентстве Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) в Нидерландах (инвентарные no. в таблице 1). Кроме того, два из штаммов депонированы в National Mycological Herbarium/Herbier National de Mycologie и идентифицированы под аббревиатурой DAOM, как показано в таблице 1. DAOM обозначает Department of Agriculture, Ottawa, Mycology.Several strains of toxicogenic endophytes for use in the methods of the invention have been deposited with the international deposit agency Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) in the Netherlands (inventory no. In table 1). In addition, two of the strains were deposited with the National Mycological Herbarium / Herbier National de Mycologie and identified under the abbreviation DAOM, as shown in Table 1. DAOM stands for Department of Agriculture, Ottawa, Mycology.

 

 

^a Calhoun, Findlay, Miller, Whitney. Mycological Research 1992, 96:281-280. Bouhet, Van Chong, Toma, Kirszenbum, Fromageot. J Agric Food Chem 1976, 24:964- 972. Обнаружено в 1939 г. и опубликовано в 1955 г.
^b Findlay, Li, Miller, Womiloju. Can J Chem, 2003, 81:284-292.
^c среди прочих; новое соединение тригидрокси-4-1'-гидроксиэтил) изокумарин, токсичный также для клеток гусеницы листовертки-почкоеда елового (Can J Chem 81 :284).
^d Anderson, Edwards, Whalley. J Chem Soc Perkin Trans I 1983, (2)185-255; Wang, Zhang, Huang, Su, Yang, Zhaob, Ng. Acta Cryst 2003, E59:o1233-1234. ^a Calhoun, Findlay, Miller, Whitney. Mycological Research 1992, 96: 281-280. Bouhet, Van Chong, Toma, Kirszenbum, Fromageot. J Agric Food Chem 1976, 24: 964–972. Discovered in 1939 and published in 1955.
^b Findlay, Li, Miller, Womiloju. Can J Chem, 2003, 81: 284-292.
^c among others; a new compound, trihydroxy-4-1'-hydroxyethyl) isocoumarin, which is also toxic for spruce bud-leaf caterpillar cells (Can J Chem 81: 284).
^d Anderson, Edwards, Whalley. J Chem Soc Perkin Trans I 1983, (2) 185-255; Wang, Zhang, Huang, Su, Yang, Zhaob, Ng. Acta Cryst 2003, E59: o1233-1234.  

Специалисту в данной области понятно, что другие выделенные штаммы токсикогенных эндофитов можно использовать в способах и композициях по изобретению. Другие штаммы токсикогенных эндофитов можно выделять с использованием способов скрининга токсикогенных эндофитов, представленных здесь.One skilled in the art will recognize that other isolated strains of toxicogenic endophytes can be used in the methods and compositions of the invention. Other toxicogenic endophyte strains can be isolated using the toxicogenic endophyte screening methods provided herein.

Токсины эндофитовEndophyte toxins

Токсикогенные эндофиты продуцируют токсины, которые обеспечивают увеличенную устойчивость к вредителям. Термин «токсин», как применяют здесь, относится к веществу или веществам, которые придают увеличенную устойчивость к вредителям посредством контроля, снижения, уменьшения, предупреждения или отпугивания вредителей, и/или роста вредителей, и/или повреждения вредителей. Токсины нескольких штаммов токсикогенных эндофитов идентифицированы и описаны в таблице 1. Конкретный токсикогенный эндофит может продуцировать более одного токсина. Токсины, идентифицированные в таблице 1, представляют собой доминирующие токсины, продуцируемые перечисленными штаммами. Исследования, цитируемые в таблице 1, иллюстрируют, что каждый штамм может продуцировать множество токсинов. Проиллюстрирован штамм 5WS11/1, продуцирующий, среди прочих, вермикулин, тригидрокси-4-1'-гидроксиэтил и изокумарин.Toxicogenic endophytes produce toxins that provide increased resistance to pests. The term "toxin", as used here, refers to a substance or substances that give increased resistance to pests by controlling, reducing, reducing, preventing or deterring pests, and / or growth of pests, and / or damage to pests. The toxins of several strains of toxicogenic endophytes are identified and described in table 1. A specific toxicogenic endophyte can produce more than one toxin. The toxins identified in table 1 are the dominant toxins produced by these strains. The studies cited in table 1 illustrate that each strain can produce many toxins. Illustrated is strain 5WS11 / 1, producing, among others, vermiculin, trihydroxy-4-1'-hydroxyethyl and isocoumarin.

Способность токсина контролировать, снижать, уменьшать, предупреждать или отпугивать вредителей, и/или уменьшать рост вредителей, и/или повреждать вредителей, можно оценивать in vitro в анализе токсичности для вредителей. Например, авторы изобретения предоставляют способ оценки токсичности токсина-кандидата с использованием способа, оценивающего рост личинок, такой как анализ личинок гусеницы листовертки-почкоеда елового, который измеряет эффекты на рост.The ability of the toxin to control, reduce, reduce, prevent or deter pests, and / or reduce the growth of pests and / or damage the pests, can be evaluated in vitro in a toxicity analysis for pests. For example, the inventors provide a method for assessing the toxicity of a candidate toxin using a method evaluating the growth of larvae, such as an analysis of the larvae of a spruce bud-caterpillar caterpillar that measures growth effects.

Термин «токсичность», как применяют здесь по отношению к анализу вредителей, такому как анализ личинок гусеницы листовертки-почкоеда елового, обозначает токсины или штаммы эндофитов, обладающие статистически отличающимися от контролей параметрами, для снижения либо массы, либо ширины головной капсулы, либо и того, и другого. Токсичные эндофиты приводят у вредителей, таких как личинки гусеницы листовертки-почкоеда елового, к более низкой массе и/или меньшей головной капсуле, и вышеупомянутые параметры являются статистически сниженными по сравнению с контролем.The term “toxicity”, as used here in relation to pest analysis, such as the analysis of spruce bud-leaf beetle caterpillar larvae, refers to toxins or strains of endophytes that have statistically different parameters from the controls to reduce either the weight or width of the head capsule or both , and another. Toxic endophytes in pests, such as the spruce bud caterpillar larvae of the spruce bud, lead to a lower mass and / or smaller head capsule, and the above parameters are statistically reduced compared to the control.

Представлены различные анализы токсичности для вредителей. Например, анализ на иглах гусеницы листовертки-почкоеда елового сравнивает активность гусениц листовертки-почкоеда елового на листьях различного возраста и видов деревьев. Система, необязательно, содержит конусовидный контейнер, содержащий перегородку, позволяющую поддерживать отдельную иглу вертикально и подвергать воздействию отдельной гусеницы листовертки-почкоеда елового, причем основание иглы контактирует с увлажнителем. Иглу вставляют в перегородку перед добавлением гусеницы листовертки. Перегородка позволяет собирать несъеденные части иглы.Various pest toxicity analyzes are presented. For example, an analysis on the needles of a caterpillar of a spider leaf bud-companion compares the activity of caterpillars of a spruce leaf-bud companion on leaves of different ages and tree species. The system optionally contains a cone-shaped container containing a baffle that allows you to maintain a separate needle vertically and expose a separate caterpillar of a spruce bud-leaf bud, and the base of the needle is in contact with the humidifier. The needle is inserted into the septum before adding the caterpillar leafworm. The partition allows you to collect the uneaten parts of the needle.

Личинок гусеницы листовертки-почкоеда елового, как правило, выращивают на искусственном рационе (McMorran, 1965), пока они не достигают стадии, на которой они будут потреблять суккулентные иглы. В каждую пробирку помещают отдельную гусеницу листовертки-почкоеда. Тестируют иглы похожего размера и массы, собранные вокруг точки инокуляции инокулированного токсикогенным эндофитом сеянца (тестируемый сеянец) плюс контрольные иглы. Измеряют данные роста вредителей, которые, необязательно, включают в себя количество несъеденных игл, ширину головной капсулы и массы личинок. Массы гусениц листовертки и оставшихся игл, и ширину головной капсулы гусениц листовертки определяют для тестируемого и контрольного образцов, и сравнивают. Других насекомых и личинок можно легко тестировать в подобных анализах, например пяденицу гемлоковую и листовертку-почкоеда елового.The spruce bud caterpillar larvae are usually grown on an artificial diet (McMorran, 1965) until they reach the stage at which they will consume succulent needles. A separate caterpillar of the kidney leaf beetle is placed in each tube. Needles of similar size and weight collected around the inoculation point of a seedling inoculated with toxicogenic endophyte (test seedling) plus control needles are tested. Pest growth data is measured, which optionally includes the number of uneaten needles, the width of the head capsule, and the mass of the larvae. The masses of the leafworm caterpillars and the remaining needles, and the width of the head capsule of the leafworm caterpillars are determined for the test and control samples, and compared. Other insects and larvae can be easily tested in such analyzes, for example, hemlock moth and spruce bud-leaf moth.

Токсичность токсина эндофита для вредителя, такого как пяденица гемлоковая, необязательно, тестируют согласно следующему способу. Токсин, подлежащий тестированию, вводят в искусственный рацион, подходящий для роста вредителей. Искусственный рацион получают в отдельных чашках, содержащих концентрации токсина 5 микромолярную, 10 микромолярную, 25 микромолярную, 50 микромолярную и 100 микромолярную. Одну 3^-ю насекомых в стадии личинки добавляют в каждую из 75 чашек на разведение и инкубируют в камере для роста в подходящих условиях, таких как 22°C, 55% относительная влажность с 16 час света/сутки. Спустя 4 суток, насекомых замораживают, взвешивают и измеряют их головные капсулы. Уменьшение размера головной капсулы (например, ширины) или массы по сравнению с контрольным образцом является показательным для присутствия токсина. Специалисту в данной области будет понятно, что этот способ можно модифицировать для тестирования различных концентраций токсина, и что условия можно модифицировать для тестирования множества различных вредителей.The toxicity of an endophyte toxin for a pest such as hemlock moth is optionally tested according to the following method. The toxin to be tested is introduced into an artificial diet suitable for pest growth. An artificial diet is obtained in separate cups containing toxin concentrations of 5 micromolar, 10 micromolar, 25 micromolar, 50 micromolar and 100 micromolar. One 3 ^-th stage insect larvae are added to each of 75 plates per dilution and incubated in a growth chamber under suitable conditions such as 22 ° C, 55% relative humidity with 16 hours light / day. After 4 days, the insects are frozen, weighed and their head capsules are measured. A reduction in head capsule size (e.g., width) or weight compared to a control sample is indicative of the presence of the toxin. One skilled in the art will understand that this method can be modified to test different concentrations of the toxin, and that the conditions can be modified to test many different pests.

Количество токсикогенного эндофита, адекватное для уменьшения роста в хвойном растении, представляет собой количество, для которого показывают статистически значимое уменьшение скорости роста, и/или развития личинки, или снижение прироста массы по сравнению с неинокулированными, но в остальном эквивалентными контрольными сеянцами. Количество будет меняться в зависимости от видов эндофита, концентрации токсина и природы продуцируемого токсина.The amount of toxicogenic endophyte adequate to reduce growth in a coniferous plant is the amount for which a statistically significant decrease in growth rate and / or larval development is shown, or a decrease in weight gain compared to uninoculated but otherwise equivalent control seedlings. The amount will vary depending on the types of endophyte, the concentration of the toxin and the nature of the produced toxin.

В одном варианте осуществления анализ, применяемый для оценки токсичности для вредителей, представляет собой анализ in vitro и включает в себя изоляцию хвойных игл в подходящем контейнере, чтобы убедиться, что иглы остаются увлажненными. Контейнер является подходящим для сбора и оценки массы и ширины головной капсулы подходящего тестируемого насекомого, подразумевая насекомого, которое в норме потребляет иглы во время его роста и развития, так же как для сбора всех оставшихся игл для оценки потребления игл.In one embodiment, the assay used to assess pest toxicity is an in vitro assay and includes isolating the needles in a suitable container to ensure that the needles remain moist. The container is suitable for collecting and evaluating the weight and width of the head capsule of a suitable test insect, implying an insect that normally consumes needles during its growth and development, as well as for collecting all remaining needles for estimating needle consumption.

В другом варианте осуществления анализ токсичности для вредителя представляет собой анализ in vivo и включает в себя помещение подходящих видов насекомых на ветви колонизированных эндофитом растений и/или деревьев, содержащихся в мешках и/или других контейнерах при плотности, необязательно, не более 10 насекомых/м² площади ветвей, оставление насекомых на месте в течение подходящего периода времени, сбор насекомых с последующими определениями массы и ширины головной капсулы. Необязательно, можно анализировать другие параметры. Подходящий период времени для оставления вредителя в контакте с ветвями колонизированного эндофитом растения будет меняться с такими факторами, как личиночная стадия развития, погодные условия, виды хвойных и виды насекомых. В одном варианте осуществления период времени, необязательно, составляет между 1-14 сутками, например, 3-7 суток.In another embodiment, the pest toxicity analysis is an in vivo analysis and includes placing suitable insect species on the branches of endophytic colonized plants and / or trees contained in bags and / or other containers at a density of optionally not more than 10 insects / m ² areas of branches, leaving insects in place for a suitable period of time, collecting insects with subsequent determination of the mass and width of the head capsule. Optionally, other parameters can be analyzed. A suitable time period for leaving the pest in contact with the branches of the endophytic colonized plant will vary with factors such as the larval developmental stage, weather conditions, conifer species and insect species. In one embodiment, the time period is optionally between 1-14 days, for example 3-7 days.

В другом варианте осуществления токсичность эндофита оценивают посредством подвергания колонизированного хвойного растения по меньшей мере одному характеристическому тесту, выбранному из группы, состоящей из анализа токсичности для вредителя, и/или анализа присутствия токсина.In another embodiment, endophyte toxicity is assessed by exposing the colonized coniferous plant to at least one characteristic test selected from the group consisting of a pest toxicity analysis and / or toxin presence analysis.

Соответственно изобретение относится к способу оценки токсичности для вредителя токсинов токсикогенного эндофита с использованием анализа токсичности для вредителя.Accordingly, the invention relates to a method for assessing toxicity for a pest of toxogenic endophyte toxins using a toxicity analysis for a pest.

Окно времени чувствительностиSensitivity Time Window

Термин «окно времени чувствительности», как применяют здесь, обозначает период времени, во время которого сеянец хвойного является чувствительным или восприимчивым к колонизации при инокуляции композицией инокулята, содержащей токсикогенный эндофит. «Чувствительный» используют здесь взаимозаменяемо с «восприимчивый».The term “sensitivity time window”, as used herein, means a period of time during which a conifer seedling is susceptible or susceptible to colonization upon inoculation with an inoculum composition containing a toxicogenic endophyte. “Sensitive” is used interchangeably with “receptive” here.

Термин «инокуляция», как применяют здесь, обозначает инокуляцию эндофитом способом, позволяющим колонизацию. Инокулят, необязательно, представляет собой полученную в лаборатории композицию для инокуляции, содержащую токсикогенный эндофит. Инокулят может также представлять собой колонизированное растение, которое инокулирует сеянцы по соседству посредством прямого или вертикального переноса. Вертикальный перенос, необязательно, происходит посредством контакта неинфицированных сеянцев с колонизированными инфицированными иглами, включая опавшие иглы.The term "inoculation", as used here, means inoculation with endophyte in a way that allows colonization. The inoculum, optionally, is a laboratory-derived inoculation composition containing a toxicogenic endophyte. The inoculum may also be a colonized plant that inoculates seedlings in the neighborhood by direct or vertical transfer. Vertical transfer, optionally, occurs through contact of uninfected seedlings with colonized infected needles, including fallen needles.

Авторы изобретения определили, что эффективная инокуляция сеянцев хвойных токсикогенными эндофитами происходит во время окна времени чувствительности. Окно времени чувствительности, необязательно, включает стадию стратификации семян и/или послевсходовый период непрерывного удлинения верхушки побега, когда кутикула еще не полностью сформирована.The inventors have determined that effective inoculation of coniferous seedlings with toxicogenic endophytes occurs during the sensitivity time window. The sensitivity time window optionally includes a stage of seed stratification and / or a post-emergence period of continuous elongation of the apex of the shoot when the cuticle is not yet fully formed.

Образование воска происходит внутри кутикулы, и его можно обозначить как кутикулярный воск, так же как на поверхности кутикулы, где его можно обозначить как эпикутикулярный воск. Кутикулярный воск может функционировать для обеспечения водоотталкивающих свойств поверхности игл.Waxing occurs inside the cuticle, and it can be labeled as cuticular wax, as well as on the surface of the cuticle, where it can be labeled as epicuticular wax. Cuticular wax can function to provide water-repellent properties to the surface of the needles.

Без желания быть связанными с теорией, считают, что верхний лимит времени, во время которого послевсходовые сеянцы можно инокулировать неинвазивным способом, соответствует образованию воска на и/или в сеянце, что нарушает инокуляцию.Without a desire to be associated with theory, it is believed that the upper time limit during which post-emergence seedlings can be inoculated in a non-invasive manner corresponds to waxing on and / or in the seedling, which disrupts inoculation.

Термин «стратификация семян», как применяют здесь, обозначает процесс искусственного или естественного прерывания покоя зародыша, так что семя может прорастать, и покой зародыша, как правило, включает в себя период времени от взятия семени из охлаждаемого хранилища до высевания семян. «Покой зародыша семени», необязательно, прерывают для белой ели посредством замачивания семени в воде в течение ночи и подвергания высушенного семени воздействию температур приблизительно 3-6° C в течение приблизительно 2 недель. Термин «прорастание», как применяют здесь, обозначает растрескивание оболочки семени и роста сеянца из семени.The term "seed stratification", as used here, refers to the process of artificial or natural interruption of the dormancy of the embryo, so that the seed can germinate, and dormancy of the embryo, as a rule, includes the period of time from taking the seed from the refrigerated storage to sowing seeds. The "seed germ rest" is optionally interrupted for white spruce by soaking the seed in water overnight and exposing the dried seed to temperatures of about 3-6 ° C for about 2 weeks. The term "germination", as used here, means cracking of the seed coat and growth of the seedling from the seed.

Авторы изобретения обнаружили, что семена можно инокулировать во время стратификации семян. В одном варианте осуществления способ включает в себя замачивание семени хвойного в воде, содержащей инокулят, во время стратификации семян. В другом варианте осуществления семя хвойного белой ели замачивают в воде, содержащей инокулят, в течение ночи, высушивают, и еще влажное семя охлаждают при 2-6°C в течение приблизительно двух недель.The inventors have found that seeds can be inoculated during stratification of seeds. In one embodiment, the method includes soaking coniferous seed in water containing the inoculum during stratification of the seeds. In another embodiment, the coniferous white spruce seed is soaked in water containing inoculum overnight, dried, and the still wet seed is cooled at 2-6 ° C. for approximately two weeks.

Авторы изобретения обнаружили также, что окно времени чувствительности включает период времени непрерывного удлинения верхушки побега до формирования кутикулы иглы. Окно времени чувствительности будет меняться по отношению к высоте сеянца и времени после прорастания с видами хвойных, однако включает период статистически значимой максимальной чувствительности, который, при использовании белой ели в качестве модели, начинается во время периода непрерывного удлинения верхушки побега (>10 мм <100 мм). Минимум определяется биологически периодом после преимущественного завершения процессов прорастания. Это включает в себя время после растрескивания оболочки семени и появления зародышевого корня. Зародышевый корень и гипокотиль, и семядоли быстро удлиняются до момента, где начинает удлиняться основание семядоли. В течение периода, ограниченного высотой сеянца >10, но >40 мм, верхушка побега, примордиальные иглы и противолежащие междоузлия быстро появляются, вытягиваются и развиваются. Рудиментарные иглы и междоузлия становятся полностью дифференцированными, включая формирование кутикулы и мезофилла. Критический период успешной инокуляции связан с процентом игл с промежуточной дифференцировкой по сравнению с полной дифференцировкой, при которой кутикула сформирована полностью. В одном варианте осуществления сеянец инокулируют до полного формирования кутикулы. В другом варианте осуществления сеянец инокулируют в течение периода непрерывного удлинения верхушки побега. В другом варианте осуществления сеянец инокулируют, когда процент игл с промежуточной дифференцировкой кутикулы больше, чем число игл, где кутикула сформирована полностью. Специалист в данной области будет легко способен оценить эти параметры.The inventors also found that the sensitivity time window includes a period of time continuously extending the tip of the shoot to form a cuticle needle. The sensitivity time window will vary with respect to seedling height and time after germination with conifer species, however, it includes a period of statistically significant maximum sensitivity, which, when using white spruce as a model, begins during a period of continuous elongation of the shoot tip (> 10 mm <100 mm). The minimum is determined biologically by the period after the predominant completion of germination processes. This includes the time after cracking of the seed coat and the appearance of the germinal root. The germinal root and hypocotyl, and the cotyledons quickly lengthen to the point where the base of the cotyledon begins to lengthen. During the period limited by the height of the seedling> 10, but> 40 mm, the shoot tip, primordial needles, and opposite internodes quickly appear, stretch, and develop. Rudimentary needles and internodes become completely differentiated, including the formation of cuticles and mesophyll. The critical period of successful inoculation is associated with the percentage of needles with intermediate differentiation compared with complete differentiation, in which the cuticle is fully formed. In one embodiment, the seedling is inoculated until the cuticle is completely formed. In another embodiment, the seedling is inoculated over a period of continuous elongation of the shoot tip. In another embodiment, the seedling is inoculated when the percentage of needles with intermediate cuticle differentiation is greater than the number of needles where the cuticle is fully formed. A person skilled in the art will be easily able to evaluate these parameters.

Для белой ели авторы изобретения определили, что в окно времени чувствительности входит, пока сеянцы достигают 16 недель после прорастания. В предпочтительном варианте осуществления сеянцы инокулируют между 2-12 неделями, 6-10 неделями или 7-9 неделями после прорастания. В другом варианте осуществления сеянцы инокулируют на 2-3 неделях, 3-4 неделях, 4-5 неделях, 5-6 неделях, 6-7 неделях, 7-8 неделях, 8-9 неделях, 9-10 неделях после всходов. Определили, что особенно успешную инокуляцию сеянцев белой ели получают в варианте осуществления, когда сеянцы инокулируют на приблизительно 8 неделе после всходов (например, 7-9 недели после всходов). По отношению к высоте сеянца период успешности для белой ели включает стадию прорастания вплоть до высоты сеянцев приблизительно 10 см. В другом варианте осуществления сеянцы инокулируют при высоте 1-2 см, при высоте 2-3 см, при высоте 3-4 см, при высоте 4-5 см, при высоте 5-6 см, при высоте 6-7 см, при высоте 7-8 см, при высоте 8-9 см, при высоте 9-10 см. Определили, что особенно успешную инокуляцию получили при варианте осуществления, когда сеянцы инокулируют при высоте приблизительно 3 см (например, при высоте 2-4 см).For white spruce, the inventors have determined that it enters the sensitivity time window until the seedlings reach 16 weeks after germination. In a preferred embodiment, the seedlings are inoculated between 2-12 weeks, 6-10 weeks or 7-9 weeks after germination. In another embodiment, the seedlings are inoculated at 2-3 weeks, 3-4 weeks, 4-5 weeks, 5-6 weeks, 6-7 weeks, 7-8 weeks, 8-9 weeks, 9-10 weeks after germination. It was determined that a particularly successful inoculation of white spruce seedlings was obtained in an embodiment when the seedlings were inoculated at approximately 8 weeks after germination (for example, 7-9 weeks after germination). In relation to the height of the seedling, the success period for white spruce includes the germination stage up to a height of seedlings of approximately 10 cm. In another embodiment, the seedlings are inoculated at a height of 1-2 cm, at a height of 2-3 cm, at a height of 3-4 cm, at a height 4-5 cm, at a height of 5-6 cm, at a height of 6-7 cm, at a height of 7-8 cm, at a height of 8-9 cm, at a height of 9-10 cm. It was determined that a particularly successful inoculation was obtained with the embodiment when the seedlings are inoculated at a height of approximately 3 cm (for example, at a height of 2-4 cm).

Период чувствительности сеянцев ели является таким, как описано для белой ели.The sensitivity period of spruce seedlings is as described for white spruce.

Способы инокуляцииInoculation Methods

Различные способы можно использовать для инокуляции сеянцев хвойных. В вариантах осуществления способа инокуляция сеянцев хвойных включает в себя приведение в контакт композиции инокулята с сеянцем, таким как интактный сеянец. «Интактный сеянец», как применяют здесь, относится к сеянцу, где сеянец остается без повреждений до или во время контакта с композицией инокулята. Более конкретно, на стебель интактного сеянца не наносят проколов или ранений до или во время контакта с композицией инокулята. Композицию инокулята, необязательно, вводят в интактный сеянец опрыскиванием интактного сеянца композицией инокулята. Использование интактных сеянцев является очень преимущественным, поскольку оно исключает стадию нанесения ранений и облегчает быструю инокуляцию, обеспечивая очень важную экономию времени в обстановке высокопроизводительного хвойного питомника. В другом варианте осуществления способ инокуляции включает в себя приведение в контакт композиции инокулята с областью поверхности сеянца хвойного. Композицию инокулята, необязательно, вводят в сеянец хвойного опрыскиванием области поверхности сеянца хвойного композицией инокулята. Термин «приведение в контакт» используют взаимозаменяемо с «введение».Various methods can be used to inoculate coniferous seedlings. In embodiments of the method, inoculating coniferous seedlings includes contacting the inoculum composition with a seedling, such as an intact seedling. An “intact seedling” as used herein refers to a seedling where the seedling remains intact before or during contact with the inoculum composition. More specifically, no punctures or injuries are applied to the stem of the intact seedling before or during contact with the inoculum composition. The inoculum composition is optionally introduced into the intact seedling by spraying the intact seedling with the inoculum composition. The use of intact seedlings is very advantageous, since it eliminates the stage of wounding and facilitates rapid inoculation, providing a very important time saving in the setting of a highly productive coniferous nursery. In another embodiment, the inoculation method comprises contacting the inoculum composition with a surface area of a conifer seedling. The inoculum composition is optionally introduced into the seedling of the conifer by spraying the surface area of the seedling with the coniferous inoculum composition. The term “contacting” is used interchangeably with “introduction”.

Термин «опрыскивание», как применяют здесь, включает в себя любой способ доставки жидких частиц композиции инокулята к поверхности растения и включает в себя затуманивание, опрыскивание почвы, воздуходувное опрыскивание, и способы веерообразного распыления. Опрыскивание, необязательно, осуществляют с использованием баллона для опрыскивания или штангового опрыскивателя. В одном варианте осуществления композицию инокулята доставляют с использованием штангового опрыскивателя и инжекторного насоса для инъекции композиции инокулята на линию орошения. Инокуляцию легко проводят в течение времени, когда сеянец будет оставаться влажным в течение наиболее длительного периода времени, и она, необязательно, включает в себя повторное введение в те же самые или в другие сутки. В других вариантах осуществления композиция инокулята, необязательно, содержит добавки, которые улучшают и/или увеличивают поглощение токсикогенного эндофита. В данной области известен ряд химических веществ и/или препаратов, которые будут облегчать поглощение инокулята. Например, добавки могут уменьшать время высушивания после опрыскивания. В одном варианте осуществления добавка представляет собой углевод. В другом варианте осуществления углевод выбран из группы, содержащей сахара. В другом варианте осуществления углевод представляет собой углевод, подобный CMC. Кроме того, можно добавлять флуоресцентные индикаторы к композиции инокулята для определения количества накопленного аэрозоля.The term “spraying” as used herein includes any method for delivering liquid particles of an inoculum composition to a plant surface and includes misting, spraying the soil, blowing spraying, and fan-shaped spraying methods. Spraying is optionally carried out using a spray bottle or a boom sprayer. In one embodiment, the inoculum composition is delivered using a boom sprayer and an injection pump to inject the inoculum composition onto the irrigation line. Inoculation is easily carried out over a period of time when the seedling will remain moist for the longest period of time, and it optionally includes repeated administration on the same or other days. In other embodiments, the implementation of the inoculum composition, optionally, contains additives that improve and / or increase the absorption of toxicogenic endophyte. A number of chemicals and / or preparations are known in the art that will facilitate the absorption of the inoculum. For example, additives can reduce the drying time after spraying. In one embodiment, the additive is a carbohydrate. In another embodiment, the carbohydrate is selected from the group consisting of sugars. In another embodiment, the carbohydrate is a CMC-like carbohydrate. In addition, fluorescent indicators can be added to the inoculum composition to determine the amount of aerosol accumulated.

Доставку композиции инокулята можно осуществлять посредством объединения или повторения способов, включая опрыскивание. Необязательно, композицию инокулята можно доставлять посредством повторяющегося опрыскивания.The delivery of the inoculum composition can be accomplished by combining or repeating methods, including spraying. Optionally, the inoculum composition may be delivered by repeated spraying.

В другом варианте осуществления способ инокуляции включает в себя введение композиции инокулята на почву.In another embodiment, the inoculation method comprises administering the inoculum composition to the soil.

Инокуляция сеянцев хвойных, в другом варианте осуществления, включает в себя надрезание, прокалывание или проникновение в сеянец другим способом, и доставку композиции инокулята. В одном варианте осуществления участок проникновения представляет собой нелигнифицированную ткань стебля сеянца. В другом варианте осуществления в стебель проникают в 5-15 мм от верхушечного побега. Термин «верхушечный побег», как применяют здесь, обозначает побег, дистальный от самого нижнего листа, оставшегося на главном стебле.Inoculation of conifer seedlings, in another embodiment, involves incising, puncturing or penetrating the seedling in another way, and delivering the inoculum composition. In one embodiment, the penetration site is an unlignified tissue of a seedling stem. In another embodiment, 5-15 mm from the apical shoot penetrate into the stem. The term “apical shoot”, as used herein, means a shoot distal from the bottommost leaf remaining on the main stem.

В одном варианте осуществления способ инокуляции включает в себя раневую инокуляцию. «Раневая инокуляция», как применяют здесь, относится к способу, где композицию инокулята вводят в сеянцы хвойных способом, включающим в себя нанесение ранения сеянцу. Инокулят можно вводить способом инъекции иглой. В другом варианте осуществления сеянцы хвойных инокулируют приведением носителя, содержащего токсикогенные эндофиты, в контакт со средой для роста сеянца. В одном варианте осуществления носитель содержит облученные иглы хвойных. В другом варианте осуществления сеянец высевают в среду для роста, и облученные иглы хвойных, колонизированные токсикогенными эндофитами, или другие части хвойных растений, колонизированные токсикогенными эндофитами, добавляют к среде для роста. В другом варианте осуществления среда для роста содержит горшечную смесь, окружающую или поддерживающую сеянцы хвойных, подлежащие инокуляции. В другом варианте осуществления среда для роста содержит компост. В конкретных вариантах осуществления хвойные инокулируют через рану с использованием композиции инокулята, содержащей токсикогенный эндофит, выбранный из группы, включающей 05-37A, 06-486D, 06-485A, 04-052B, 06-011B, 06-011D, 06-012C, 06-013A, 06-014C, 08-040B, 06-264A, 06-332A, 06-268A, 07-013D, 08-011D, 01-002A, 04-002G, 03-020B, 04-012A, 06-063D, 02-002C, 06-073C, 06-094E, 06-255A, 06-097D и 08-018A.In one embodiment, the inoculation method includes wound inoculation. "Wound inoculation", as used here, refers to a method where the inoculum composition is introduced into the conifer seedlings by a method involving wounding the seedling. The inoculum can be administered by needle injection. In another embodiment, conifer seedlings are inoculated by bringing the carrier containing toxicogenic endophytes into contact with the seedling growth medium. In one embodiment, the carrier comprises irradiated conifer needles. In another embodiment, the seedling is plated on growth medium, and irradiated conifer needles colonized with toxicogenic endophytes, or other parts of coniferous plants colonized with toxicogenic endophytes, are added to the growth medium. In another embodiment, the growth medium comprises a potted mixture surrounding or supporting coniferous seedlings to be inoculated. In another embodiment, the growth medium comprises compost. In specific embodiments, conifers are inoculated through the wound using an inoculum composition containing a toxicogenic endophyte selected from the group consisting of 05-37A, 06-486D, 06-485A, 04-052B, 06-011B, 06-011D, 06-012C, 06-013A, 06-014C, 08-040B, 06-264A, 06-332A, 06-268A, 07-013D, 08-011D, 01-002A, 04-002G, 03-020B, 04-012A, 06- 063D, 02-002C, 06-073C, 06-094E, 06-255A, 06-097D and 08-018A.

Кроме того, сеянец хвойного можно инокулировать смачиванием семян хвойных инокулятом, содержащим токсикогенный эндофит.In addition, the seedling of coniferous can be inoculated by wetting the seeds of conifers with an inoculum containing a toxicogenic endophyte.

Авторы изобретения показали также, что деревья, посаженные по соседству с инфицированными деревьями (например, где будет опадать хвоя), являются инокулированными через 1 год после посадки. Соответственно в одном варианте осуществления изобретение относится к способу инокуляции или переноса эндофита к сеянцу посредством вертикального переноса, включающего в себя помещение сеянца поблизости от колонизированного хвойного. В одном варианте осуществления колонизированное хвойное является колонизированным токсикогенным эндофитом. В другом варианте осуществления токсикогенный эндофит выбран из таблицы 1-3. В одном варианте осуществления близость включает в себя область или зону, где будут опадать иглы. В одном варианте осуществления область включает в себя радиус 0,25 метров вокруг колонизированного хвойного. Специалисту в данной области будет понятно, что площадь, где будут опадать иглы, зависит от таких факторов, как размер колонизированного дерева. В другом варианте осуществления способ дополнительно включает в себя детекцию перенесенного эндофита в сеянце. Подходящий диапазон радиусов в одном варианте осуществления составляет вплоть до 250 см.The inventors also showed that trees planted next to infected trees (for example, where the needles will fall) are inoculated 1 year after planting. Accordingly, in one embodiment, the invention relates to a method of inoculating or transferring an endophyte to a seedling by vertical transfer, comprising placing the seedling in the vicinity of a colonized conifer. In one embodiment, the colonized conifer is a colonized toxigenic endophyte. In another embodiment, the toxicogenic endophyte is selected from table 1-3. In one embodiment, proximity includes the area or zone where the needles will fall. In one embodiment, the area includes a radius of 0.25 meters around the colonized conifer. One skilled in the art will understand that the area where the needles will fall depends on factors such as the size of the colonized tree. In another embodiment, the method further includes detecting the transferred endophyte in the seedling. A suitable range of radii in one embodiment is up to 250 cm.

В другом варианте осуществления способ инокуляции включает в себя приведение облученных игл хвойных, инфицированных токсикогенным эндофитом, в контакт с сеянцами хвойных. Иглы в одном варианте осуществления являются облученными. Иглы и эндофит можно приводить в контакт, напрямую или опосредованно, с сеянцами хвойных. Например, иглы можно приводить в непосредственный физический контакт с сеянцем, или можно приводить в опосредованный контакт с сеянцем посредством контактирования игл с горшечной смесью, поддерживающей рост сеянца. В одном варианте осуществления горшечная смесь содержит компост.In another embodiment, the inoculation method includes contacting the irradiated conifer needles infected with a toxicogenic endophyte in contact with conifer seedlings. The needles in one embodiment are irradiated. Needles and endophytes can be brought into contact, directly or indirectly, with coniferous seedlings. For example, the needles can be brought into direct physical contact with the seedling, or can be brought into indirect contact with the seedling by contacting the needles with a potted mixture supporting the growth of the seedling. In one embodiment, the potted mixture comprises compost.

Количество инокулированного токсикогенного эндофита составляет предпочтительно в одном варианте осуществления приблизительно 10 пропагул. «Пропагула», как обозначают здесь, означает инфекционную грибковую клетку. Специалисту в данной области будет понятно, что количество инокулированного токсикогенного эндофита может меняться с факторами внешней среды и другими факторами. Например, если инокуляцию сеянцев хвойных проводят при условиях внешней среды, таких как низкая температура, которые не являются благоприятными для инокуляции эндофитами, количество токсикогенного эндофита, необязательно, увеличивают. Подобным образом повторяющиеся инокуляции необязательно используют, если сеянцы подвержены воздействию различных условий внешней среды, таких как высокое количество осадков, когда композиция инокулята разводится или смывается.The amount of inoculated toxicogenic endophyte is preferably in one embodiment about 10 propagules. “Propaganda,” as used herein, means an infectious fungal cell. One skilled in the art will understand that the amount of inoculated toxicogenic endophyte may vary with environmental factors and other factors. For example, if conifers seedlings are inoculated under environmental conditions, such as low temperatures, which are not favorable for endophyte inoculation, the amount of toxicogenic endophyte is optionally increased. Similarly, repeated inoculations are not necessarily used if the seedlings are exposed to various environmental conditions, such as high rainfall, when the inoculum composition is diluted or washed off.

Способы инокуляции, описанные выше, можно комбинировать и/или повторять. В одном варианте осуществления комбинированные и/или повторяющиеся способы инокуляции включают в себя один и тот же способ инокуляции. В другом варианте осуществления комбинированные и/или повторяющиеся способы представляют собой различные способы инокуляции. Например, в одном варианте осуществления сеянец сначала инокулируют во время стратификации семян, а затем инокулируют во время непрерывного удлинения верхушки побега.The inoculation methods described above can be combined and / or repeated. In one embodiment, combined and / or repeated inoculation methods include the same inoculation method. In another embodiment, the combined and / or repeating methods are various inoculation methods. For example, in one embodiment, the seedling is first inoculated during stratification of the seeds, and then inoculated during continuous elongation of the shoot tip.

Композиция инокулятаInoculum Composition

Авторы изобретения показали, что различные инокуляты можно использовать для инокуляции сеянцев хвойных. Термин «инокулят», как применяют здесь, относится к веществу, содержащему токсикогенный эндофит, которое вводят для придания устойчивости к вредителям и которое представляет собой, необязательно, композицию инокулята, содержащую токсикогенный эндофит, например композицию, содержащую токсикогенный эндофит, выращенный in vitro, или, необязательно, субстрат инокулята, такой как иглы хвойных, содержащий токсикогенный эндофит, или носитель, содержащий токсикогенный эндофит.The inventors have shown that various inoculums can be used to inoculate coniferous seedlings. The term "inoculum", as used here, refers to a substance containing a toxicogenic endophyte that is administered to confer resistance to pests and which is optionally an inoculum composition containing a toxicogenic endophyte, for example a composition containing a toxicogenic endophyte grown in vitro , or optionally, an inoculum substrate, such as coniferous needles, containing a toxicogenic endophyte, or a carrier containing a toxicogenic endophyte.

Термин «композиция инокулята, содержащая токсикогенный эндофит», как применяют здесь, обозначает композицию для инокуляции, где токсикогенный эндофит присутствует в эффективном количестве, чтобы колонизировать сеянцы хвойных, придавая увеличенную устойчивость к вредителям посредством контроля, снижения, уменьшения, предупреждения или отпугивания вредителей, и/или повреждения вредителей, и/или уменьшения роста вредителей. Композиция инокулята, также альтернативно обозначаемая «инокулят», является эффективной, если уровень продуцируемого токсина является достаточным, чтобы контролировать, снижать, уменьшать, предупреждать или отпугивать вредителей, и/или уменьшать рост вредителей, и/или повреждать вредителей. Примеры подходящих композиций описаны в этой заявке, и их, необязательно, легко идентифицируют с использованием анализов, таких как анализ личинок гусеницы листовертки-почкоеда елового, описанный здесь.The term “toxigenic endophyte-containing inoculum composition”, as used herein, means an inoculation composition where the toxogenic endophyte is present in an effective amount to colonize conifer seedlings, giving increased resistance to pests by controlling, reducing, reducing, preventing or deterring pests, and / or damage to pests, and / or to reduce the growth of pests. An inoculum composition, also alternatively referred to as an “inoculum," is effective if the level of toxin produced is sufficient to control, reduce, reduce, prevent or deter pests, and / or to reduce the growth of pests and / or damage the pests. Examples of suitable compositions are described in this application, and they are optionally easily identified using assays, such as the spruce bud-leaf caterpillar larva analysis described herein.

Авторы изобретения идентифицировали новые способы получения композиции инокулята по изобретению. Филаменты токсикогенного эндофита, необязательно, разрезают посредством способов разрезания, уменьшающих число полученных мертвых эндофитов по сравнению с другими способами измельчения, таким образом, увеличивая число живых токсикогенных эндофитов на объем инокулята и облегчая колонизацию инокулированных сеянцев хвойных.The inventors have identified new methods for producing the inoculum composition of the invention. Toxicogenic endophyte filaments are optionally cut by cutting methods that reduce the number of dead endophytes obtained compared to other grinding methods, thus increasing the number of living toxicogenic endophytes per inoculum volume and facilitating the colonization of inoculated coniferous seedlings.

В одном варианте осуществления эндофит выращивают в агрегате для ферментации с перемешиваемым баком, так что клетки присутствуют в не превышающих 5 мм кластерах мицелия или спорах, являются более чем на 80%, и, предпочтительно, более чем на 95% жизнеспособными, и более чем на 80% и, предпочтительно, более чем на 95% инфекционными на восприимчивой ткани, в жидкости, по существу, свободной от бактерий и существенных концентраций оставшихся питательных веществ.In one embodiment, the endophyte is grown in a stirred tank fermentation unit such that the cells are present in not exceeding 5 mm mycelial clusters or spores, are more than 80%, and preferably more than 95% viable, and more than 80% and preferably more than 95% infectious on susceptible tissue, in a fluid substantially free of bacteria and substantial concentrations of remaining nutrients.

В другом варианте осуществления изобретение относится к композиции инокулята, которую, необязательно, получают способом выращивания выделенного эндофита, включающим в себя:In another embodiment, the invention relates to an inoculum composition, which is optionally prepared by a method for growing an isolated endophyte, including:

a) получение культуры эндофита на скошенной питательной среде (например, культуры на скошенном агаре);a) obtaining a culture of endophyte on a beveled nutrient medium (for example, cultures on beveled agar);

b) инокуляцию культурой первой жидкой культуры;b) inoculating the culture of the first liquid culture;

c) подвергание первой жидкой культуры срезающему усилию, разрезающему гифу эндофита;c) subjecting the first liquid culture to shearing force, cutting the endophyte hyphae;

d) инокуляцию второй жидкой культуры первой жидкой культурой;d) inoculating a second liquid culture with a first liquid culture;

e) подвергание второй жидкой культуры второму срезающему усилию для разрезания гифы эндофита.e) subjecting the second liquid culture to a second shearing force to cut the endophyte hyphae.

В другом варианте осуществления, способ включает в себя:In another embodiment, the method includes:

a) выращивание исходной культуры эндофита (например, культуры на скошенном агаре);a) growing the original culture of endophyte (for example, culture on mowed agar);

b) инокуляцию первой жидкой культуры суспензией, содержащей культуру на скошенном агаре, где первую жидкую культуру выращивают в течение приблизительно 2 недель;b) inoculating the first liquid culture with a suspension containing the culture on mowed agar, where the first liquid culture is grown for approximately 2 weeks;

c) измельчение первой жидкой культуры;c) grinding the first liquid culture;

d) инокуляцию второй жидкой культуры измельченной первой жидкой культурой в условиях срезающего усилия, достаточного для разрезания гифы эндофита, где вторую культуру выращивают в большом сосуде и с аэрацией.d) inoculating the second liquid culture with the ground first liquid culture under shearing forces sufficient to cut the endophyte hyphae, where the second culture is grown in a large vessel and aerated.

В одном варианте осуществления композицию инокулята, необязательно, собирают из большого сосуда, который включает в себя ферментер, центрифугируют и ресуспендируют в разбавителе. В одном варианте осуществления разбавитель представляет собой стерильную воду.In one embodiment, the inoculum composition is optionally collected from a large vessel that includes a fermenter, centrifuged, and resuspended in a diluent. In one embodiment, the diluent is sterile water.

В одном варианте осуществления скошенный агар представлял собой скошенный агар с экстрактом солода. В другом варианте осуществления первая жидкая культура представляет собой 2% экстракт солода, и суспензию добавляют при 5% об./об. Срезающее усилие в одном варианте осуществления включает в себя встряхивание или повороты при 200-310 об/мин. В другом необязательном варианте осуществления встряхивание или повороты осуществляют при 220 об/мин. В одном варианте осуществления первую жидкую культуру предпочтительно инкубируют при 25°C. В одном варианте осуществления первая жидкая культура содержит экстракт солода. В другом варианте осуществления измельченную жидкую культуру добавляют в 1-3% среды с экстрактом солода. В одном варианте осуществления концентрация экстракта солода составляет приблизительно 1%. В другом варианте осуществления измельченную жидкую культуру и среду с экстрактом солода перемешивают при 200-310 об/мин, например, перемешивание при 280 об/мин. В другом варианте осуществления температура в большом сосуде, который, необязательно, может представлять собой перемешиваемый ферментер, составляет 20-22°C и, необязательно, составляет 21°C. В другом варианте осуществления присутствует аэрация 0,05-0,15 об./об. в минуту и, необязательно, составляет 0,1 об./об. в минуту. В другом варианте осуществления расщепленную жидкую культуру и экстракт солода инкубируют в течение 6-10 суток и предпочтительно 7 суток. Специалисту в данной области будет понятно, что потребуются общепринятые адаптации для выращивания новых идентифицированных штаммов токсикогенного эндофита. Кроме того, специалисту в данной области будет понятно, что изменения концентрации сахара, температуры и давления кислорода могут требовать компенсирующих изменений других переменных. Специалисту в данной области будут также понятны общепринятые эксперименты для дальнейшего масштабирования продукции композиции инокулята.In one embodiment, the slanted agar was slanted malt extract agar. In another embodiment, the first liquid culture is a 2% malt extract, and the suspension is added at 5% v / v. The shearing force in one embodiment includes shaking or turning at 200-310 rpm. In another optional embodiment, shaking or turning is carried out at 220 rpm. In one embodiment, the first liquid culture is preferably incubated at 25 ° C. In one embodiment, the first liquid culture comprises a malt extract. In another embodiment, the ground liquid culture is added to 1-3% of the malt extract medium. In one embodiment, the concentration of the malt extract is about 1%. In another embodiment, the ground liquid culture and the malt extract medium are mixed at 200-310 rpm, for example, stirring at 280 rpm. In another embodiment, the temperature in the large vessel, which optionally may be a stirred fermenter, is 20-22 ° C and, optionally, 21 ° C. In another embodiment, aeration of 0.05-0.15 vol./about is present. per minute and, optionally, is 0.1 vol./about. per minute. In another embodiment, the split liquid culture and the malt extract are incubated for 6-10 days, and preferably 7 days. A person skilled in the art will understand that generally accepted adaptations will be required to grow the newly identified toxicogenic endophyte strains. In addition, one skilled in the art will appreciate that changes in sugar concentration, temperature, and oxygen pressure may require compensating changes in other variables. The person skilled in the art will also understand the generally accepted experiments for further scaling the production of the inoculum composition.

Композиция инокулята может являться разведенной или концентрированной. В одном варианте осуществления композицию инокулята разводят водой перед инокуляцией.The inoculum composition may be diluted or concentrated. In one embodiment, the inoculum composition is diluted with water before inoculation.

Авторы изобретения детектировали ругулозин в деревьях через 3,5 года и 4,5 года после инокуляции. Средняя концентрация, с поправкой на восстановление структуры, составляла 0,7 мкг/г, и это было приблизительно таким же для различных классов возраста игл. В течение двух лет после инокуляции деревьев авторы изобретения детектировали ругулозин, концентрированный от 0,15 мкг/г до 24,8 мкг/мл. Авторы изобретения показали также, что иглы через 15 месяцев после последней инокуляции обладают средней арифметической концентрацией ругулозина 1 мкг/г. Эти концентрации являлись достаточными для уменьшения роста гусеницы листовертки-почкоеда елового.The inventors detected rugulosin in trees 3.5 years and 4.5 years after inoculation. The average concentration, adjusted for restoration of the structure, was 0.7 μg / g, and this was approximately the same for different age classes of needles. Within two years after the inoculation of the trees, the inventors detected rugulosin concentrated from 0.15 μg / g to 24.8 μg / ml. The inventors also showed that the needles 15 months after the last inoculation have an arithmetic average concentration of rugulosin of 1 μg / g. These concentrations were sufficient to reduce the growth of the spruce bud-leaf beetle caterpillar.

Авторы изобретения показали, что концентрация ругулозина в иглах, инфицированных продуцирующими ругулозин грибковыми штаммами, которая уменьшает рост вредителей, составляет в среднем 1 микрограмм/грамм массы игл. Концентрация, влияющая на рост вредителей, необязательно, является настолько низкой, как 0,15 микрограмм/грамм массы игл. Присутствие токсина или эндофита детектируют в колонизированном образце хвойного. Образец хвойного включает в себя ткань хвойного из растения, предварительно инокулированного эффективной концентрацией инокулята, содержащего токсикогенный эндофит. Соответственно в одном варианте осуществления эффективная композиция инокулята представляет собой композицию, продуцирующую в среднем приблизительно 10 микромолярную концентрацию токсина ругулозина в колонизированном сеянце хвойного. В другом варианте осуществления концентрация токсина достигает в среднем, необязательно, 10-25 микромолярной, или необязательно 25-50 микромолярной.The inventors have shown that the concentration of rugulosin in needles infected with fungal strains producing rugulosin, which reduces the growth of pests, averages 1 microgram / gram of needle weight. The concentration affecting pest growth is not necessarily as low as 0.15 micrograms / gram of needle mass. The presence of a toxin or endophyte is detected in a colonized coniferous sample. A sample of conifers includes coniferous tissue from a plant previously inoculated with an effective concentration of an inoculum containing a toxicogenic endophyte. Accordingly, in one embodiment, an effective inoculum composition is a composition that produces an average of approximately 10 micromolar concentrations of rugulosin toxin in a colonized conifer seedling. In another embodiment, the toxin concentration reaches, on average, optionally 10-25 micromolar, or optionally 25-50 micromolar.

Эффективность инокулята меняется с длительностью времени хранения инокулята. Предпочтительно инокулят собирают, разводят и/или получают в те же сутки, что и для инокуляции.The effectiveness of the inoculum varies with the length of time the inoculum is stored. Preferably, the inoculum is collected, diluted and / or obtained on the same day as for inoculation.

В другом варианте осуществления изобретение относится к композиции инокулята, содержащей токсикогенный эндофит, которую можно использовать в способах по изобретению для получения сеянца хвойного, инфицированного грибковым токсикогенным эндофитом.In another embodiment, the invention relates to an inoculum composition containing a toxicogenic endophyte that can be used in the methods of the invention to produce a conifer seedling infected with a fungal toxicogenic endophyte.

В одном варианте осуществления способ инокуляции сеянцев хвойных дополнительно включает в себя детекцию, является ли сеянец колонизированным токсикогенным эндофитом.In one embodiment, the method of inoculating coniferous seedlings further includes detecting whether the seedling is colonized with a toxicogenic endophyte.

Способ детекции токсикогенного эндофитаMethod for the detection of toxicogenic endophyte

Различные способы можно применять для детекции присутствия токсикогенных эндофитов. Анализы с использованием способов на основе антител для детекции эндофитов травы разработаны для нескольких видов эндофитов с использованием, например, анализов в микропланшетах и способов иммуноблоттинга тканей (Gwinn et al., 1991; Johnson et al., 1982; Reddick & Collins, 1998). По сравнению с конкурирующими способами, такими как ПЦР, они обладают большим потенциалом для использования в полевых условиях на основе простых протоколов.Various methods can be used to detect the presence of toxicogenic endophytes. Assays using antibody-based methods for detecting grass endophytes have been developed for several types of endophytes using, for example, microplate assays and tissue immunoblot methods (Gwinn et al., 1991; Johnson et al., 1982; Reddick & Collins, 1998). Compared to competing methods such as PCR, they have great potential for use in the field based on simple protocols.

Авторы изобретения разработали анализ с использованием детектирующего средства для анализа намеченных эндофитов. В одном варианте осуществления анализ нацелен на эндофиты, такие как 5WS22E1, с использованием детектирующего средства, такого как антитело. Разработанное антитело обладает сравнимой чувствительностью к анализам с антителами эндофитов травы (Gwinn et al., 1991; Johnson et al., 1982; Reddick & Collins, 1998). Это достигнуто, несмотря на большие трудности с матриксом игл хвойных по сравнению с листьями травы. Авторы изобретения получили также антитела к 5WS22E1, 5WS11/1, 05-37A, 06-486D, 06-485A.The inventors have developed an analysis using a detecting agent for the analysis of targeted endophytes. In one embodiment, the analysis targets endophytes, such as 5WS22E1, using a detecting agent, such as an antibody. The developed antibody has comparable sensitivity to assays with grass endophyte antibodies (Gwinn et al., 1991; Johnson et al., 1982; Reddick & Collins, 1998). This is achieved, despite the great difficulties with the matrix of needles of conifers compared with leaves of grass. The inventors also obtained antibodies to 5WS22E1, 5WS11 / 1, 05-37A, 06-486D, 06-485A.

Детекцию токсикогенного эндофита можно осуществлять посредством детекции штамма токсикогенного эндофита или продукта эндофита, такого как токсин. Соответственно изобретение относится к анализу с использованием детектирующего средства, которое связывает токсин или узнает токсикогенный штамм эндофита для детекции присутствия намеченных эндофитов в образце хвойного, где анализ включает в себя:Detection of a toxicogenic endophyte can be accomplished by detecting a toxicogenic endophyte strain or endophyte product, such as a toxin. Accordingly, the invention relates to an analysis using a detecting agent that binds a toxin or recognizes a toxicogenic endophyte strain to detect the presence of targeted endophytes in a coniferous sample, where the analysis includes:

a) приведение в контакт образца хвойного со средством, узнающим токсикогенный штамм эндофита;a) bringing into contact a sample of conifers with an agent recognizing a toxicogenic strain of endophyte;

b) детекцию присутствия связанного средства в образце хвойного, где присутствие связанного средства является показательным для присутствия токсикогенного штамма эндофита, распознаваемого антителом.b) detecting the presence of a bound agent in a coniferous sample, where the presence of a bound agent is indicative of the presence of a toxicogenic strain of endophyte recognized by the antibody.

В одном варианте осуществления средство, которое связывает токсин или узнает токсикогенный штамм эндофита, представляет собой антитело. Соответственно в одном варианте осуществления анализ представляет собой анализ с антителом.In one embodiment, the agent that binds the toxin or recognizes a toxicogenic strain of endophyte is an antibody. Accordingly, in one embodiment, the assay is an antibody assay.

В другом варианте осуществлении анализ с антителом представляет собой анализ ELISA. В другом варианте осуществления анализ с антителом представляет собой портативный анализ на основе иммуноблоттинга. В другом варианте осуществления анализ с антителом заключен в наборе, содержащем антитело, которое узнает токсикогенный штамм эндофита и детектирующие средства для детекции присутствия штамма, узнаваемого антителом. В другом варианте осуществления набор содержит антитело, узнающее токсикогенный штамм эндофита, и инструкции для применения.In another embodiment, the antibody assay is an ELISA assay. In another embodiment, the antibody assay is a portable immunoblot analysis. In another embodiment, the antibody assay is enclosed in a kit comprising an antibody that recognizes a toxicogenic endophyte strain and detecting agents for detecting the presence of a strain recognized by the antibody. In another embodiment, the kit comprises an antibody recognizing a toxicogenic strain of endophyte and instructions for use.

Авторы изобретения показали, что присутствие токсикогенного штамма эндофита может не поддаваться детекции в успешно колонизированных сеянцах, пока сеянец растет в течение периода времени. Таким образом, в одном варианте осуществления образец хвойного получают, когда растение старше чем 3 месяца, старше чем 4 месяца, старше чем 5 месяцев, старше чем 6 месяцев, старше чем 7 месяцев, старше чем 8 месяцев, старше чем 9 месяцев, старше чем 10 месяцев или старше чем 11 месяцев после прорастания. В другом варианте осуществления образец хвойного получают, когда растение старше чем 1 год после прорастания. В другом варианте осуществления образец хвойного получают, когда растению 12-18 месяцев после прорастания. В другом варианте осуществления образец хвойного получают, когда возраст растения больше чем 18 месяцев после прорастания.The inventors have shown that the presence of a toxicogenic strain of endophyte may not be detectable in successfully colonized seedlings while the seedling grows over a period of time. Thus, in one embodiment, a coniferous sample is obtained when a plant is older than 3 months, older than 4 months, older than 5 months, older than 6 months, older than 7 months, older than 8 months, older than 9 months, older than 10 months or older than 11 months after germination. In another embodiment, a coniferous sample is obtained when the plant is older than 1 year after germination. In another embodiment, a coniferous sample is obtained when the plant is 12-18 months after germination. In another embodiment, a coniferous sample is obtained when the age of the plant is more than 18 months after germination.

Авторы изобретения показали, что инокулированные токсикогенные эндофиты персистируют в течение по меньшей мере пяти лет. Кроме того, токсикогенные эндофиты распространяются по ветвям и распространяются на другие сеянцы поблизости от колонизированного дерева. Специалисту в данной области будет понятно, что образец можно получать через много месяцев или лет после инокуляции, и его можно получать из ткани, проксимальной или дистальной от участка инокуляции. Например, специалисту в данной области будет понятно, что ветви, близкие к участку инокуляции, по-видимому, будут положительными в более ранних временных точках, чем ветви дальше от участка инокуляции. Подобным образом можно тестировать несколько ветвей при анализе хвойного по колонизации. Детекции токсикогенного эндофита или токсина в 9 образцах хвойного достаточно, чтобы показать, что хвойное является колонизированным.The inventors have shown that inoculated toxicogenic endophytes persist for at least five years. In addition, toxicogenic endophytes spread along branches and spread to other seedlings in the vicinity of the colonized tree. One skilled in the art will understand that a sample can be obtained many months or years after inoculation, and can be obtained from tissue proximal or distal from the site of inoculation. For example, one skilled in the art will recognize that branches close to the inoculation site are likely to be positive at earlier time points than branches further from the inoculation site. Similarly, you can test several branches when analyzing conifers by colonization. Detection of a toxicogenic endophyte or toxin in 9 coniferous samples is sufficient to show that the coniferous is colonized.

Образец хвойного, необязательно, содержит ткани хвойного, включая иглы. Образец хвойного, как правило, размалывают в порошок перед контактом с узнающим токсикогенный эндофит антителом и/или суспендируют в соответствующем буфере, таком как забуференный Tris солевой раствор (TBS).A conifer sample optionally contains conifer tissue, including needles. A conifer sample is typically ground into powder before contact with a toxicogenic endophyte-recognizing antibody and / or suspended in an appropriate buffer, such as Tris buffered saline (TBS).

Кроме того, присутствие токсикогенного эндофита можно детектировать посредством аналитической детекции токсина эндофита. Авторы изобретения представляют аналитический способ детекции основного токсина, связанного с токсикогенным штаммом эндофита. Аналитический способ включает в себя получение образца хвойного, содержащего токсин-кандидат токсикогенного эндофита, для переработки посредством разделения, такого как HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография), где способ получения образца хвойного, необязательно, включает в себя:In addition, the presence of toxicogenic endophyte can be detected by analytical detection of endophyte toxin. The inventors provide an analytical method for the detection of a major toxin associated with a toxicogenic strain of endophyte. An analytical method includes obtaining a conifer sample containing a toxigenic candidate endogenous toxin candidate for processing by separation, such as HPLC (high performance liquid chromatography), where the method of obtaining a conifer sample is optionally includes:

a) первую экстракцию с использованием петролейного эфира в условиях низкой освещенности;a) first extraction using petroleum ether in low light conditions;

b) вторую экстракцию хлороформом;b) a second extraction with chloroform;

c) промывку экстракта NaHCO₃;c) washing the NaHCO ₃ extract;

d) подкисление экстракта;d) acidification of the extract;

e) третью экстракцию хлороформом; высушивание экстракта;e) a third extraction with chloroform; drying the extract;

f) растворение высушенного экстракта в ацетонитриле.f) dissolving the dried extract in acetonitrile.

Полученный образец, необязательно, анализируют на аппарате для HPLC и анализируют полученный спектр по присутствию токсина. В одном варианте осуществления образец, подлежащий подготовке для анализа HPLC, содержит продуцирующий ругулозин токсикогенный эндофит.The resulting sample is optionally analyzed on an HPLC apparatus and the spectrum obtained is analyzed for the presence of the toxin. In one embodiment, the sample to be prepared for HPLC analysis contains a rugulosin-producing toxicogenic endophyte.

Соответственно изобретение относится к способу детекции токсина, связанного с токсикогенным штаммом эндофита, включающему в себя получение образца хвойного для анализа HPLC, разделяющего экстракт эндофита жидкостной хроматографией высокого давления с получением спектра на выходе, детекцию присутствия или отсутствия значения для токсина в спектре на выходе, где присутствие значения для токсина является показательным для присутствия токсина.Accordingly, the invention relates to a method for detecting a toxin associated with a toxicogenic strain of endophyte, comprising obtaining a conifer sample for HPLC analysis, separating the endophyte extract by high pressure liquid chromatography to obtain an output spectrum, detecting the presence or absence of a value for the toxin in the output spectrum, where the presence of a value for the toxin is indicative of the presence of the toxin.

В другом варианте осуществления способ включает в себя:In another embodiment, the method includes:

a) разделение экстракта эндофита жидкостной хроматографией высокого давления с получением спектра на выходе;a) separation of the endophyte extract by high pressure liquid chromatography to obtain an output spectrum;

b) детекцию присутствия или отсутствия значения для токсина в спектре на выходе, где присутствие значения для токсина является показательным для присутствия токсина.b) detecting the presence or absence of a value for the toxin in the output spectrum, where the presence of a value for the toxin is indicative of the presence of the toxin.

Токсин также, необязательно, детектируют с использованием других анализов, включая ЯМР, препаративную тонкослойную хроматографию, препаративную ВЭЖХ, ВЭЖХ с масс-спектроскопией и колоночную хроматографию. Способы использования этих техник известны в данной области.The toxin is also optionally detected using other assays, including NMR, preparative thin layer chromatography, preparative HPLC, HPLC with mass spectroscopy and column chromatography. Methods for using these techniques are known in the art.

Виды и генотипы хвойных деревьев, чувствительных к колонизации токсикогенными эндофитамиSpecies and genotypes of conifers sensitive to colonization with toxicogenic endophytes

Изобретение осуществляют на практике для хвойных растений и сеянцев. «Хвойный», как применяют здесь, относится к множеству иглолистных деревьев или кустарников и включает в себя все виды ели (виды Picea), сосны (виды Pinus) и деревья бальзамической пихты (Abies balsamea), и «растение», как применяют здесь, включает в себя сеянец или дерево и включает древесную изгородь для получения укоренившихся побегов или кустарника.The invention is practiced for conifers and seedlings. "Coniferous", as used here, refers to a variety of needle-like trees or shrubs and includes all types of spruce ( Picea species), pine ( Pinus species) and balsam fir trees ( Abies balsamea ), and a "plant", as used here, includes a seedling or tree, and includes a tree fence to receive rooted shoots or shrubs.

В конкретных вариантах осуществления инокулируемый сеянец хвойного представляет собой сеянец белой ели (Picea glauca). В других вариантах осуществления инокулируемый сеянец хвойного представляет собой сеянец красной ели (Picea rubens). В следующих вариантах осуществления инокулируемый сеянец представляет собой сеянец бальзамической пихты. В другом варианте осуществления инокулируемый сеянец хвойного представляет собой сеянец сосны, например веймутовой сосны (Pinus strobus).In specific embodiments, the inoculated conifer seedling is a white spruce seedling ( Picea glauca ). In other embodiments, the inoculated conifer seedling is a red spruce seedling ( Picea rubens ). In further embodiments, the inoculable seedling is a seedling of balsamic fir. In another embodiment, the inoculated conifer seedling is a seedling of a pine, for example a weymouth pine ( Pinus strobus ).

В одном варианте осуществления сеянец белой ели инокулируют композицией инокулята, содержащей токсикогенный эндофит 5WS22E1. В другом варианте осуществления сеянец белой ели инокулируют композицией инокулята, содержащей токсикогенный эндофит 5WS11/1. В другом варианте осуществления сеянец белой ели инокулируют композицией инокулята, содержащей токсикогенный эндофит 05-037A (SEQ ID NO: 3). В другом варианте осуществления сеянец белой ели инокулируют композицией инокулята, содержащей токсикогенный эндофит 06-486D (SEQ ID NO: 4). В другом варианте осуществления сеянец белой ели инокулируют композицией инокулята, содержащей токсикогенный эндофит 06-485A (SEQ ID NO:5).In one embodiment, a white spruce seedling is inoculated with a toxogenic endophyte 5WS22E1 inoculum composition. In another embodiment, a white spruce seedling is inoculated with an inoculum composition containing the toxicogenic endophyte 5WS11 / 1. In another embodiment, a white spruce seedling is inoculated with a toxogenic endophyte 05-037A inoculum composition (SEQ ID NO: 3). In another embodiment, a white spruce seedling is inoculated with the inoculum composition containing the toxicogenic endophyte 06-486D (SEQ ID NO: 4). In another embodiment, a white spruce seedling is inoculated with a toxogenic endophyte composition 06-485A inoculum (SEQ ID NO: 5).

В другом варианте осуществления сеянец красной ели инокулируют композицией инокулята, содержащей токсикогенный эндофит, выбранный из группы, содержащей 06-264A (SEQ ID NO:13), 06-332A (SEQ ID NO:14), 06-268A (SEQ ID NO:15), 07-013D (SEQ ID NO:16), 08-011 (SEQ ID NO:17), 01-002A (SEQ ID NO:18), 04-002G (SEQ ID NO:19), 03-020B (SEQ ID NO:20), 04-012A (SEQ ID NO:21), 06-063D (SEQ ID NO:22), 02-002C (SEQ ID NO:23), 06-073C (SEQ ID NO:24), 06-094E (SEQ ID NO:25), 06-255A (SEQ ID NO:26), 06-097D (SEQ ID NO:27) и 08-018 (SEQ ID NO:28).In another embodiment, a red spruce seedling is inoculated with a toxogenic endophyte inoculum composition selected from the group consisting of 06-264A (SEQ ID NO: 13), 06-332A (SEQ ID NO: 14), 06-268A (SEQ ID NO: 15), 07-013D (SEQ ID NO: 16), 08-011 (SEQ ID NO: 17), 01-002A (SEQ ID NO: 18), 04-002G (SEQ ID NO: 19), 03-020B (SEQ ID NO: 20), 04-012A (SEQ ID NO: 21), 06-063D (SEQ ID NO: 22), 02-002C (SEQ ID NO: 23), 06-073C (SEQ ID NO: 24 ), 06-094E (SEQ ID NO: 25), 06-255A (SEQ ID NO: 26), 06-097D (SEQ ID NO: 27) and 08-018 (SEQ ID NO: 28).

Авторы изобретения обнаружили, что инокуляция сеянцев из выведенной популяции белой ели композицией инокулята по изобретению являлась успешной для ряда генотипов. Из 25 тестируемых семей белой ели шесть обладали индивидуумами, тестированными как положительные по заражению одним из тестируемых штаммов эндофитов. Из этих шести семей были представлены 11 из 31 родителя, и эти 11 родителей перекрывали тот же самый диапазон, что охватывала большая выборка. Это обеспечивает хороший показатель того, что широкий диапазон генотипов будет являться чувствительным к инфекции тестируемыми эндофитами.The inventors found that inoculation of seedlings from an excreted white spruce population with the inoculum composition of the invention was successful for a number of genotypes. Of the 25 tested families of white spruce, six had individuals tested as positive for infection by one of the tested endophyte strains. Of these six families, 11 out of 31 parents were represented, and these 11 parents covered the same range that covered the large sample. This provides a good indication that a wide range of genotypes will be susceptible to infection by the tested endophytes.

Улучшенное эндофитом хвойное растениеEndophyte-enhanced coniferous plant

Изобретение относится также к хвойному растению, колонизированному штаммом токсикогенного эндофита. В одном варианте осуществления хвойное растение представляет собой растение белой ели с токсикогенным эндофитом 05-037A (SEQ ID NO: 3). В другом варианте осуществления хвойное растение представляет собой растение белой ели, колонизированное токсикогенным эндофитом 06-486D (SEQ ID NO: 4). В другом варианте осуществления хвойное растение представляет собой растение белой ели, колонизированное токсикогенным эндофитом 06-485A (SEQ ID NO: 5).The invention also relates to a coniferous plant colonized by a toxicogenic endophyte strain. In one embodiment, the coniferous plant is a white spruce plant with a toxicogenic endophyte 05-037A (SEQ ID NO: 3). In another embodiment, the coniferous plant is a white spruce plant colonized by the toxicogenic endophyte 06-486D (SEQ ID NO: 4). In another embodiment, the coniferous plant is a white spruce plant colonized by a toxicogenic endophyte 06-485A (SEQ ID NO: 5).

В другом варианте осуществления хвойное растение представляет собой растение красной ели, колонизированное токсикогенным эндофитом, выбранным из группы, состоящей из 06-264A (SEQ ID NO:13), 06-332A (SEQ ID NO:14), 06-268A (SEQ ID NO:15), 07-013D (SEQ ID NO:16), 08-011 (SEQ ID NO:17), 01-002A (SEQ ID NO:18), 04-002G (SEQ ID NO:19), 03-020B (SEQ ID NO:20), 04-012A (SEQ ID NO:21), 06-063D (SEQ ID NO:22), 02-002C (SEQ ID NO:23), 06-073C (SEQ ID NO:24), 06-094E (SEQ ID NO:25), 06-255A (SEQ ID NO:26), 06-097D (SEQ ID NO:27) и 08-018 (SEQ ID NO:28).In another embodiment, the coniferous plant is a red spruce plant colonized by a toxicogenic endophyte selected from the group consisting of 06-264A (SEQ ID NO: 13), 06-332A (SEQ ID NO: 14), 06-268A (SEQ ID NO: 15), 07-013D (SEQ ID NO: 16), 08-011 (SEQ ID NO: 17), 01-002A (SEQ ID NO: 18), 04-002G (SEQ ID NO: 19), 03 -020B (SEQ ID NO: 20), 04-012A (SEQ ID NO: 21), 06-063D (SEQ ID NO: 22), 02-002C (SEQ ID NO: 23), 06-073C (SEQ ID NO : 24), 06-094E (SEQ ID NO: 25), 06-255A (SEQ ID NO: 26), 06-097D (SEQ ID NO: 27) and 08-018 (SEQ ID NO: 28).

Вредители, чувствительные к токсинам токсикогенного эндофитаPests sensitive to toxigenic endophyte toxins

Термин «вредитель», как применяют здесь, обозначает любой организм, который может вызывать повреждение хвойного растения, включая любой патоген игл, и включает в себя насекомых, личинок насекомых и грибковые патогены. Вредители-насекомые включают в себя насекомых, которые потребляют листья, таких как гусеница листовертки-почкоеда елового, листовертка-почкоед еловый, пяденицы гемлоковые, пилильщики и гусеница листовертки-почкоеда сосны Банкса. Грибковые вредители включают в себя серянку сосны веймутовой и виды возбудителей фузариоза.The term "pest", as used here, means any organism that can cause damage to conifers, including any pathogen of needles, and includes insects, insect larvae and fungal pathogens. Insect pests include insects that consume leaves, such as the spruce bud-leaf caterpillar, spruce leaf-bud caterpillar, hemlock moths, sawflies and the Banks pine bud-leaf bud caterpillar. Fungal pests include weymouth pine seryanka and species of Fusarium pathogens.

Все токсины или культуры эндофитов, описанные здесь, тестировали на личинках гусениц листовертки-почкоеда елового (Choristoneura fumiferana). В случае токсина ругулозина 5WS22E1 гусеницы листовертки-почкоеда елового (фигура 8) и пяденицы гемлоковые (Lambdina fiscellaria) являлись пораженными при концентрациях ругулозина в рационе между 25 и 50 мкМ. Тесты с собранным диким листоверткой-почкоедом еловым (Zeiraphera canadensis) показали, что эти виды также являлись пораженными ругулозином в том же порядке величины. Тесты на плодовых мушках (Drosophila melanogaster) также показали токсичность ругулозина в рационе в диапазоне 50 мкМ (Dobias et al., 1980). Это соединение является также токсичным для культивируемых клеток из нескольких линий клеток насекомых, включая совку травяную (Spodoptera frugiperda) и личинок комара (Aedes albopictus; Watts et al., 2003).All toxins or endophyte cultures described herein were tested on the larvae of spruce bud-leaf beetle caterpillars ( Choristoneura fumiferana ). In the case of the rugulosin 5WS22E1 toxin, the spruce bud-caterpillar caterpillar (Figure 8) and the hemlock moth ( Lambdina fiscellaria ) were affected at a concentration of rugulosin in the diet between 25 and 50 μM. Tests with spruce wild wild leaf bud-eater ( Zeiraphera canadensis ) collected showed that these species were also affected by rugulosin in the same order of magnitude. Tests on fruit flies ( Drosophila melanogaster ) also showed toxicity of rugulosin in the diet in the range of 50 μM (Dobias et al., 1980). This compound is also toxic to cultured cells from several insect cell lines, including grass scoop ( Spodoptera frugiperda ) and mosquito larvae ( Aedes albopictus ; Watts et al., 2003).

При тестировании в условиях, описанных выше, полуочищенные экстракты оставшихся перечисленных эндофитов приводили к статистически значимым уменьшениям скорости роста и/или максимальной личиночной стадии гусеницы листовертки-почкоеда елового в пределах функциональных параметров тестов.When testing under the conditions described above, the semi-purified extracts of the remaining listed endophytes led to statistically significant decreases in the growth rate and / or maximum larval stage of the spruce bud-caterpillar caterpillar within the functional parameters of the tests.

Способы скрининга эндофитовMethods for screening endophytes

Авторы изобретения идентифицировали множество штаммов токсикогенных эндофитов, которыми можно инокулировать сеянцы хвойных для уменьшения поражения вредителями колонизированных хозяев. При идентификации токсикогенных эндофитов по изобретению авторы изобретения взяли грибковые штаммы из существующей литературы, из общедоступных коллекций и тестировали дополнительные коллекции более 1000 штаммов эндофитов. Культивировали эндофитные штаммы из игл случайным образом выбранных еловых деревьев и разработали антитело, позволяющее детекцию. Анализ с антителом позволил детекцию успешных инокуляций. Один аспект изобретения относится к способу идентификации новых токсикогенных эндофитов, которые можно использовать со способами и композициями по изобретению.The inventors have identified many strains of toxicogenic endophytes, which can be inoculated with coniferous seedlings to reduce damage by pests of colonized hosts. When identifying toxicogenic endophytes according to the invention, the inventors took fungal strains from the existing literature, from public collections and tested additional collections of more than 1000 endophyte strains. Cultured endophytic strains from needles of randomly selected spruce trees and developed an antibody that allows detection. Analysis with antibody allowed the detection of successful inoculations. One aspect of the invention relates to a method for identifying new toxicogenic endophytes that can be used with the methods and compositions of the invention.

Способ скрининга для выделения токсикогенного эндофита из донорного растения включает в себя:A screening method for isolating a toxicogenic endophyte from a donor plant includes:

a) выделение медленно растущего эндофита-кандидата из игл хвойных донорного растения (например, донорного хвойного);a) the selection of a slowly growing candidate endophyte from the needles of coniferous donor plants (for example, donor conifers);

b) анализ токсичности эндофита-кандидата для вредителя в анализе токсичности для роста вредителей для определения, является ли эндофит-кандидат токсикогенным эндофитом.b) a pest endophyte toxicity analysis for a pest in a pest growth toxicity analysis to determine if the candidate endophyte is a toxicogenic endophyte.

Если эндофит-кандидат является токсикогенным эндофитом, способ, необязательно, дополнительно включает в себя инокуляцию сеянцев хвойных;If the candidate endophyte is a toxicogenic endophyte, the method optionally further includes inoculating coniferous seedlings;

a) инокуляцию реципиентного сеянца хвойного штаммами эндофита-кандидата, определенными как токсикогенный эндофит;a) inoculation of a recipient seedling of coniferous strains of candidate endophyte, defined as a toxicogenic endophyte;

b) получение образца инокулированного сеянца и детекцию присутствия намеченного эндофита (т.е. колонизации эндофитом) и/или токсина эндофита.b) obtaining a sample of the inoculated seedling and detecting the presence of the intended endophyte (i.e. colonization by endophyte) and / or endophyte toxin.

Как упомянуто, авторы изобретения секвенировали область ITS идентифицированных токсикогенных эндофитов. Соответственно в одном варианте осуществления изобретение относится к выделенным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3-28.As mentioned, the inventors sequenced the ITS region of the identified toxicogenic endophytes. Accordingly, in one embodiment, the invention relates to isolated nucleic acids comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3-28.

В одном варианте осуществления изобретение относится к выделенной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей:In one embodiment, the invention relates to an isolated nucleic acid sequence comprising:

(a) последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:3-28;(a) a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3-28;

(b) последовательность нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты из (a);(b) a nucleic acid sequence that is complementary to the nucleic acid sequence of (a);

(c) последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую значительной гомологией последовательности с последовательностью нуклеиновой кислоты из (a) или (b);(c) a nucleic acid sequence having significant sequence homology with the nucleic acid sequence of (a) or (b);

(d) последовательность нуклеиновой кислоты, которая представляет собой аналог последовательности нуклеиновой кислоты из (a), (b) или (c); или(d) a nucleic acid sequence that is an analog of a nucleic acid sequence from (a), (b) or (c); or

(e) последовательность нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с последовательностью нуклеиновой кислоты из (a), (b), (c) или (d) в строгих условиях гибридизации.(e) a nucleic acid sequence that hybridizes to the nucleic acid sequence of (a), (b), (c) or (d) under stringent hybridization conditions.

Термин «последовательность, обладающая значительной гомологией последовательности», обозначает те последовательности нуклеиновой кислоты, которые обладают слабыми или несущественными отличиями последовательности от последовательностей из (a) или (b). Отличия могут относиться к локальным мутациям или структурным модификациям. Последовательности нуклеиновой кислоты, обладающие значительной гомологией, включают в себя последовательности нуклеиновой кислоты, обладающие по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, и наиболее предпочтительно 90-95% идентичностью с последовательностями нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO:3-28.The term “sequence having significant sequence homology” means those nucleic acid sequences that exhibit weak or insignificant differences in sequence from sequences from (a) or (b). Differences may relate to local mutations or structural modifications. Nucleic acid sequences having significant homology include nucleic acid sequences having at least 65%, more preferably at least 85%, and most preferably 90-95% identity with the nucleic acid sequences of SEQ ID NO: 3-28 .

Нуклеиновые кислоты, содержащие последовательности, являются применимыми в качестве зондов или для дизайна зондов для идентификации родственных и токсикогенных эндофитов. Соответственно один вариант осуществления относится к способу выделения токсикогенного эндофита-кандидата, включающему в себя приведение в контакт нуклеиновой кислоты эндофита, такой как ДНК, с зондом, где зонд содержит последовательности, соответствующие по меньшей мере 50 нуклеотидам из последовательности, выбранной из группы, содержащей SEQ ID NO 3-28, где эндофиты с идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, 85%, 90% или 95% представляют собой токсикогенные эндофиты-кандидаты.Nucleic acids containing sequences are useful as probes or for the design of probes for the identification of related and toxicogenic endophytes. Accordingly, one embodiment relates to a method for isolating a toxigenic candidate endophyte comprising contacting an endophyte nucleic acid, such as DNA, with a probe, wherein the probe contains sequences corresponding to at least 50 nucleotides from a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO 3-28, where endophytes with sequence identity of at least 80%, 85%, 90% or 95% are toxicogenic candidate endophytes.

Токсикогенный эндофит-кандидат, необязательно, далее анализируют по его способности ингибировать рост вредителя. Токсикогенный эндофит-кандидат, который при введении в сеянец согласно способу по изобретению, описанному здесь, контролирует, снижает, уменьшает, предупреждает или отпугивает вредителей, и/или уменьшает рост вредителей, и/или повреждает вредителей, представляет собой токсикогенный эндофит.The toxicogenic endophyte candidate is optionally further analyzed for its ability to inhibit pest growth. A toxicogenic endophyte candidate that, when introduced into a seedling according to the method of the invention described herein, controls, reduces, reduces, prevents or repels pests and / or reduces the growth of pests and / or damages the pests, is a toxicogenic endophyte.

Термин «зонд», как применяют здесь, относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая будет гибридизоваться с последовательностью-мишенью нуклеиновой кислоты. В одном примере зонд гибридизуется с ДНК токсикогенного эндофита-кандидата. Конкретно в одном варианте осуществления зонд гибридизуется с последовательностью внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) рибосомальной ДНК токсикогенного эндофита-кандидата. Длина зонда зависит от условий гибридизации и последовательностей зонда и нуклеиновой кислоты-мишени. В одном варианте осуществления зонд имеет длину по меньшей мере 8, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 400 или более нуклеотидов.The term “probe,” as used herein, refers to a nucleic acid sequence that will hybridize to a target nucleic acid sequence. In one example, the probe hybridizes with the DNA of a toxigenic candidate endophyte. Specifically, in one embodiment, the probe hybridizes to the sequence of the internal transcribed spacer (ITS) of the toxigenic candidate endophyte ribosomal DNA. The length of the probe depends on the hybridization conditions and the sequences of the probe and the target nucleic acid. In one embodiment, the probe has a length of at least 8, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 400 or more nucleotides.

Термин «выделенная последовательность нуклеиновой кислоты», как применяют здесь, относится к нуклеиновой кислоте, по существу свободной от клеточного материала или культуральной среды при получении способами рекомбинантной ДНК, или химических предшественников, или других химических веществ при химическом синтезе. Подразумевают, что термин «нуклеиновая кислота» включает в себя ДНК и РНК и может являться двухцепочечной или одноцепочечной.The term "isolated nucleic acid sequence", as used here, refers to a nucleic acid essentially free of cellular material or culture medium when produced by recombinant DNA methods, or chemical precursors, or other chemicals in chemical synthesis. The term “nucleic acid” is intended to include DNA and RNA and may be double-stranded or single-stranded.

Термин «гибридизоваться» относится к специфическому взаимодействию нековалентного связывания последовательности с комплементарной нуклеиновой кислотой. Один аспект изобретения относится к выделенной нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется с ДНК токсикогенного эндофита. В предпочтительном варианте осуществления гибридизация происходит в условиях высокой строгости. Подходящие условия строгости, способствующие гибридизации, известны специалистам в данной области или их можно найти в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 6.3.6. Например, можно использовать 6,0 × хлорид натрия/цитрат натрия (SSC) при приблизительно 45°C, с последующей промывкой 2,0×SSC при 50°C в течение 15 мин.The term “hybridize” refers to the specific interaction of non-covalent binding of a sequence with a complementary nucleic acid. One aspect of the invention relates to an isolated nucleotide sequence that hybridizes with toxicogenic endophyte DNA. In a preferred embodiment, hybridization occurs under high stringency conditions. Suitable stringency conditions promoting hybridization are known to those skilled in the art or can be found in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 6.3.6. For example, you can use 6.0 × sodium chloride / sodium citrate (SSC) at approximately 45 ° C, followed by washing with 2.0 × SSC at 50 ° C for 15 minutes.

Строгость можно выбирать на основании условий, используемых на стадии отмывки. Например, концентрацию соли на стадии промывки можно выбирать из высокой строгости приблизительно 0,2×SSC при 50°C в течение 15 мин. Кроме того, температура на стадии отмывки может быть в условиях высокой строгости при приблизительно 65°C.Severity can be selected based on the conditions used in the washing step. For example, the salt concentration in the washing step can be selected from a high stringency of approximately 0.2 × SSC at 50 ° C for 15 minutes. In addition, the temperature at the stage of washing can be in conditions of high stringency at approximately 65 ° C.

Под «условиями гибридизации по меньшей мере умеренной строгости» понимают, что выбирают условия, способствующие избирательной гибридизации между двумя комплементарными молекулами нуклеиновой кислоты в растворе. Гибридизация может происходить для всей или для части последовательности молекулы нуклеиновой кислоты. Гибридизующаяся часть, как правило, имеет длину по меньшей мере 15 (например 20, 25, 30, 40 или 50) нуклеотидов. Специалистам в данной области понятно, что стабильность дуплекса, или гибридов нуклеиновой кислоты, определяется Tm, которая в содержащих натрий буферах является функцией от концентрации иона натрия и температуры (Tm = 81,5°C - 16,6 (Log10 [Na+]) + 0,41 (%(G+C)-600/I), или подобное уравнение). Соответственно параметрами условий отмывки, определяющими стабильность гибрида, являются концентрация ионов натрия и температура. Чтобы идентифицировать молекулы, которые являются сходными, но не идентичными, с известной молекулой нуклеиновой кислоты, можно предполагать, что 1% несовпадение приводит к уменьшению Tm приблизительно на 1°C, например, если считают, что молекулы нуклеиновой кислоты обладают >95% идентичностью, температуру конечной отмывки будут понижать приблизительно на 5°C. На основании этих соображений специалисты в данной области будут способны легко выбирать подходящие условия гибридизации. В предпочтительных вариантах осуществления выбирают строгие условия гибридизации. Например, следующие условия можно использовать для достижения строгой гибридизации: гибридизация в 5× хлориде натрия/цитрате натрия (SSC)/5x раствор Денхардта/1,0% SDS при Tm - 5°C на основании указанного выше уравнения, с последующей отмывкой 0,2× SSC/0,1% SDS при 60°C в течение 15 мин. Умеренно строгие условия гибридизации включают в себя стадию промывки в 3× SSC при 42° C в течение 15 мин. Понятно, однако, что эквивалентной строгости можно достигать с использованием альтернативных буферов, солей и температур. Дополнительное руководство относительно условий гибридизации можно найти в: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1989, 6.3.1-6.3.6 и в: Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000, Third Edition.By “hybridization conditions of at least moderate stringency” is meant that conditions are selected that promote selective hybridization between two complementary nucleic acid molecules in solution. Hybridization can occur for all or part of the sequence of a nucleic acid molecule. The hybridizing portion typically has a length of at least 15 (e.g., 20, 25, 30, 40, or 50) nucleotides. It will be understood by those skilled in the art that the stability of the duplex, or nucleic acid hybrids, is determined by Tm, which in sodium-containing buffers is a function of sodium ion concentration and temperature (Tm = 81.5 ° C - 16.6 (Log10 [Na +]) + 0.41 (% (G + C) -600 / I), or a similar equation). Accordingly, the parameters of the washing conditions that determine the stability of the hybrid are the concentration of sodium ions and temperature. To identify molecules that are similar, but not identical, with a known nucleic acid molecule, it can be assumed that 1% mismatch leads to a decrease in Tm by about 1 ° C, for example, if it is believed that the nucleic acid molecules have> 95% identity, the final wash temperature will be reduced by approximately 5 ° C. Based on these considerations, those skilled in the art will be able to easily select suitable hybridization conditions. In preferred embodiments, stringent hybridization conditions are selected. For example, the following conditions can be used to achieve strict hybridization: hybridization in 5 × sodium chloride / sodium citrate (SSC) / 5x Denhardt's solution / 1.0% SDS at Tm - 5 ° C based on the above equation, followed by washing with 0, 2 × SSC / 0.1% SDS at 60 ° C for 15 minutes Moderately stringent hybridization conditions include a washing step in 3 × SSC at 42 ° C. for 15 minutes. It is understood, however, that equivalent stringency can be achieved using alternative buffers, salts, and temperatures. Further guidance on hybridization conditions can be found in: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY 1989, 6.3.1-6.3.6 and Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000, Third Edition.

В другом варианте осуществления токсин токсикогенного эндофита секвенировали и зонд конструировали на основании последовательности. Зонд использовали для идентификации других токсикогенных эндофитов, продуцирующих токсин для применения в способах по изобретению. Специалист в данной области будет способен легко секвенировать гены или продукты генов токсина и конструировать зонды на основании последовательности.In another embodiment, the toxigenic endophyte toxin is sequenced and the probe is constructed based on the sequence. The probe was used to identify other toxicogenic endophytes producing toxin for use in the methods of the invention. One of skill in the art will be able to easily sequence genes or toxin gene products and construct probes based on the sequence.

Следующие неограничивающие примеры иллюстрируют настоящее изобретение.The following non-limiting examples illustrate the present invention.

Пример 1Example 1

Обнаружили, что иглы, колонизированные продуцирующим ругулозин эндофитом, содержат ругулозин в концентрациях, которые являются эффективными in vitro для задержки роста личинок гусеницы листовертки-почкоеда елового. Личинки, представленные на инфицированных эндофитом иглах, содержащих ругулозин, не набирали так много массы, как личинки, поедавшие неколонизированные иглы. Влияние на гусеницу листовертки-почкоеда являлось намного большим, чем ожидали. Один из штаммов, 5WS22E1, являлся наиболее успешным антагонистом роста личинок. Иглы 17 из 22 сеянцев, колонизированных продуцирующим ругулозин штаммами, являлись токсичными для насекомых. Иглы, инфицированные другим семейством штаммов, продуцирующих вермикулин, также являлись токсичными для насекомых.The needles colonized by the rugulosin-producing endophyte were found to contain rugulosin in concentrations that are effective in vitro to inhibit the growth of the larvae of the spider bud-leaf beetle. The larvae presented on endophyte-infected needles containing rugulosin did not gain as much mass as the larvae that ate non-colonized needles. The impact on the caterpillar of the bud-leaf beetle was much greater than expected. One of the strains, 5WS22E1, was the most successful larval growth antagonist. Needles 17 of the 22 seedlings colonized by the rugulosin-producing strains were toxic to insects. Needles infected with another family of vermiculin producing strains were also toxic to insects.

Ругулозин однозначно присутствовал на иглах, инфицированных продуцирующими ругулозин штаммами, и не обнаружен ни в контроле, ни в сеянцах, колонизированных продуцирующим вермикулин эндофитом. В иглах, которые значительно влияли на массу гусениц листовертки-почкоеда, концентрации ругулозина составляли в среднем 8 мкг/г. Это составляло >15 раз, чем средняя концентрация, обнаруженная в иглах, которые не влияют на рост гусеницы листовертки-почкоеда. In vitro, ругулозин при 1 мкг/г влияет на рост и развитие гусеницы листовертки-почкоеда, и это значение довольно близко к 8 мкг/г, обнаруженным в иглах.Rugulosin was clearly present on needles infected with rugulosin-producing strains, and was not found in either the control or seedlings colonized by the vermiculin-producing endophyte. In the needles, which significantly affected the mass of caterpillars of the leaf-bud-beetle, the concentrations of rugulosin averaged 8 μg / g. This was> 15 times the average concentration found in the needles, which did not affect the growth of the caterpillar of the leaf bud-beetle. In vitro , rugulosin at 1 μg / g affects the growth and development of the caterpillar of the leaf bud-beetle, and this value is quite close to 8 μg / g found in needles.

Пример 2Example 2

Анализ с антителом для детекции эндофитаEndophyte antibody test

Нижеследующее описывает (1) разработку поликлонального антитела для продуцирующего ругулозин эндофита 5WS22E1; (2) инокуляцию 1235 сеянцев и последующее выращивание на открытом воздухе в условиях коммерческого питомника; (3) анализ этих образов игл с использованием способа культивирования, применяемого ранее, и способа с антителом; и (4) анализ ВЭЖХ на присутствие ругулозина в ~10% положительных образцов.The following describes (1) the development of a polyclonal antibody for the rugulosin-producing endophyte 5WS22E1; (2) inoculation of 1235 seedlings and subsequent outdoor growth in a commercial nursery; (3) analysis of these needle images using the culture method used previously and the antibody method; and (4) HPLC analysis for the presence of rugulosin in ~ 10% of positive samples.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫMATERIALS AND METHODS

ИнокуляцияInoculation

Используемый штамм, 5WS22E1 (DAOM 229536; продуцент ругулозина), описан в Miller et al. (2002). Для инокуляции получили семьи белой ели с контролируемым опылением, с полными сибсами. Используемые семьи выбирали для обеспечения разнообразного набора генотипов. Использовали девять семей белой ели, происходящих от неродственных родителей. Родителей выбирали по программе генетического улучшения J. D. Irving Limited, и они происходили из пределов 45 N - 47,5 N широты и 65 W - 70 W долготы в Нью-Брансуике и Мэне. Минимальное расстояние между деревьями, выбранными в лесу, составляло 200 м. Семена получали из замороженного хранилища при -5° C, высаживали в пластиковые контейнеры для сеянцев в среду, содержащую 3:1 торфяного мха/вермикулита, и помещали в теплицу. Подкормку удобрениями посредством воды для орошения начинали через один месяц после посева (10-52-10 в течение двух недель, затем 8-20-30 в течение одной недели, затем 20-8-20 при 100 мкг/л и увеличение до максимума 125 мкг/л).The strain used, 5WS22E1 (DAOM 229536; producer of rugulosin), is described in Miller et al. (2002). For inoculation received families of white spruce with controlled pollination, with full siblings. The families used were chosen to provide a diverse set of genotypes. Used nine families of white spruce, descending from unrelated parents. Parents were selected for the J. D. Irving Limited genetic enhancement program, and they came from 45 N - 47.5 N latitudes and 65 W - 70 W longitudes in New Brunswick and Maine. The minimum distance between trees selected in the forest was 200 m. Seeds were obtained from a frozen storage at -5 ° C, planted in plastic seedling containers in an environment containing 3: 1 peat moss / vermiculite, and placed in a greenhouse. Fertilizing fertilizers with water for irrigation began one month after sowing (10-52-10 for two weeks, then 8-20-30 for one week, then 20-8-20 at 100 μg / l and increase to a maximum of 125 μg / L).

Культуры 5WS22E1 (DAOM 229536) выращивали на 9 см чашках, содержащих 2% агар с экстрактом солода (Difco) при 25°C в течение 8 недель. После инкубационного периода 5 мл стерильной воды наливали на поверхность агара, которую затем осторожно растирали стерильной палочкой из гнутого стекла. Полученную суспензию забирали в стерильную пипетку, измельчали и разводили стерильной водой для доставки в среднем 3 фрагментов грибковых гиф на каплю (6 мкл) из стерильного 1 мл шприца с иглой 0,45 мм (B-D #309597), как определяли подсчетом на гемоцитометре. Раневую инокуляцию 1235 сеянцев проводили в ламинарном шкафу посредством инъекции 6 мкл в нелигнифицированную ткань стебля, как правило, на 10 мм дальше от верхушечного побега (Miller et al., 2002). Это выполняли в лесном питомнике Суссекса 16 апреля 2001 г. Он расположен 45° 43' N, 65° 31' W; высота 21,30 м. Среднегодовая температура составляет 5,8 C (Январь -8,5, Июль 19,0 C) со средним выпадением осадков 245 см снега и 915 мм дождя.Cultures 5WS22E1 (DAOM 229536) were grown on 9 cm plates containing 2% agar with malt extract (Difco) at 25 ° C. for 8 weeks. After an incubation period, 5 ml of sterile water was poured onto the surface of the agar, which was then carefully triturated with a sterile bent glass stick. The resulting suspension was taken into a sterile pipette, crushed and diluted with sterile water to deliver an average of 3 fragments of fungal hyphae per drop (6 μl) from a sterile 1 ml syringe with a 0.45 mm needle (B-D # 309597), as determined by counting on a hemocytometer. Wound inoculation of 1235 seedlings was carried out in a laminar cabinet by injection of 6 μl into the non-lignified stem tissue, usually 10 mm further from the apical shoot (Miller et al., 2002). This was done at the Sussex Forest Nursery on April 16, 2001. It is located 45 ° 43 'N, 65 ° 31' W; altitude 21.30 m. The average annual temperature is 5.8 C (January-8.5, July 19.0 C) with an average rainfall of 245 cm of snow and 915 mm of rain.

Деревьям позволяли расти в поддонах в течение 6 месяцев в теплице, в этой точке их высаживали в горшки и оставляли в затененной области с орошением до забора образцов в середине сентября 2002 г.The trees were allowed to grow in pallets for 6 months in the greenhouse, at this point they were planted in pots and left in the shaded area with irrigation until sampling in mid-September 2002.

Разработка ELISAELISA development

Клетки 5WS22E1 выращивали на двух типах жидкой среды и на облученных, молодых инокулированных игл белой ели. Иглы облучали 25 кГр (MDS Nordion, Montreal, PQ), и 200 мг образца помещали в стерильную стеклянную чашку Петри, содержащую фильтровальную бумагу, с последующим добавлением 1 мл стерильной воды. Через 24 часа культуру инокулировали небольшой частью культуры, взятой из рабочей стороны чашки с 2% агаром с экстрактом солода. Первая используемая жидкая среда представляла собой среду с глюкозой/сахарозой и минеральными солями (1 г/л KH₂PO₄, 1 г/л KNO₃, 0,5 г/л MgSO₄ • 7H₂O, 0,5 г/л KCl, 0,2 г/л глюкозы, 0,2 г/л сахарозы), а вторая - 2% экстракт солода. Аликвоту (50 мл) каждой среды разливали в 250 мл колбы Эрленмейера, соответственно, и автоклавировали. Культуру на агаре измельчали в 100 мл стерильной воды в асептических условиях. Аликвоту (2,5 мл) использовали для инокуляции колб. Все культуры инкубировали при 18°C в течение приблизительно трех месяцев. В конце инкубационного периода клетки, растущие на иглах, осторожно соскребали скальпелем и лиофилизировали. Клетки из жидких культур фильтровали и промывали несколько раз стерильной дистиллированной водой и лиофилизировали.5WS22E1 cells were grown on two types of liquid medium and on irradiated, young inoculated needles of white spruce. The needles were irradiated with 25 kGy (MDS Nordion, Montreal, PQ), and 200 mg of the sample was placed in a sterile glass Petri dish containing filter paper, followed by the addition of 1 ml of sterile water. After 24 hours, the culture was inoculated with a small part of the culture, taken from the working side of a cup with 2% agar with malt extract. The first liquid medium used was a medium with glucose / sucrose and mineral salts (1 g / l KH ₂ PO ₄ , 1 g / l KNO ₃ , 0.5 g / l MgSO ₄ • 7H ₂ O, 0.5 g / l KCl, 0.2 g / l glucose, 0.2 g / l sucrose), and the second - 2% malt extract. An aliquot (50 ml) of each medium was poured into a 250 ml Erlenmeyer flask, respectively, and autoclaved. The agar culture was ground in 100 ml of sterile water under aseptic conditions. An aliquot (2.5 ml) was used to inoculate the flasks. All cultures were incubated at 18 ° C for approximately three months. At the end of the incubation period, the cells growing on the needles were carefully scraped off with a scalpel and lyophilized. Cells from liquid cultures were filtered and washed several times with sterile distilled water and lyophilized.

Продукцию поликлонального антитела проводили в козах в Cedarlane® Laboratories Limited Hornby, Ontario. Лиофилизированные клетки из каждой среды измельчали, и каждые разводили в стерильном PBS до концентрации 20 мг/мл для раствора антигена. 0,5 мл этого раствора эмульгировали в 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда (Brenntag Biosector, Denmark) для первичной иммунизации. 0,5 мл неполного адъюванта использовали для последующих бустер-иммунизаций. Преиммунный образец получали из яремной вены каждой козы с использованием иглы и вакуумного контейнера перед первичной иммунизацией. Затем каждую козу инъецировали с использованием иглы 21 калибра внутримышечно в заднюю часть в 4 различных участках 0,25 мл эмульгированного раствора антигена на участок инъекции. Через 28 суток козам вводили первую бустер-иммунизацию, как описано выше, вторую бустер-иммунизацию на сутки 53, и тестовый забор крови проводили на сутки 66.Polyclonal antibody production was performed in goats at Cedarlane® Laboratories Limited Hornby, Ontario. Lyophilized cells from each medium were ground, and each was diluted in sterile PBS to a concentration of 20 mg / ml for antigen solution. 0.5 ml of this solution was emulsified in 0.5 ml of complete Freund's adjuvant (Brenntag Biosector, Denmark) for primary immunization. 0.5 ml of an incomplete adjuvant was used for subsequent booster immunizations. An advantageous sample was obtained from the jugular vein of each goat using a needle and a vacuum container before primary immunization. Each goat was then injected using a 21 gauge needle intramuscularly into the back in 4 different sections of 0.25 ml of an emulsified antigen solution per injection site. After 28 days, the goats were given the first booster immunization as described above, the second booster immunization on day 53, and a blood test was performed on day 66.

Антитела, полученные от 3 различных коз, тестировали для определения их авидности и перекрестной реактивности с порошкообразными, лиофилизированными клетками неинокулированных молодых игл ели, так же как с клетками наиболее распространенных на поверхности игл грибков филлопланы игл, выделенных из этих игл (Alternaria alternata, Phoma herbarum, Cladosporium cladosporioides и Aspergillus fumigatus; Miller et al., 2002; Miller et al., 1985), и других эндофитов хвойных для белой ели: 5WS11/1 (DAOM 229535; продуцент вермикулина) и 5WS331L1 (продуцент ругулозина). Кроме того, тестировали ряд эндофитов бальзамической пихты. Один выделенный эндофит из бальзамической пихты представляет собой BF 36H1 (Findlay et al., 1995).Antibodies obtained from 3 different goats were tested to determine their avidity and cross-reactivity with powdered, lyophilized cells of uninoculated young spruce needles, as well as with the cells of the most common needles on the surface of the fungi of the phylloplan needles isolated from these needles ( Alternaria alternata , Phoma herbarum , Cladosporium cladosporioides and Aspergillus fumigatus ; Miller et al., 2002; Miller et al., 1985), and other coniferous endophytes for white spruce: 5WS11 / 1 (DAOM 229535; producer of vermiculin) and 5WS331L1 (producer of rugulosin). In addition, a number of balsamic fir endophytes were tested. One isolated endophyte from balsamic fir is BF 36H1 (Findlay et al., 1995).

В случае эндофитов игл клетки получали на облученных иглах, как выше. Тестируемые виды филлопланы выращивали в культуре с встряхиванием с использованием среды с мальтозой, дрожжевым экстрактом, пептоном (Miller & Mackenzie, 2000), фильтровали, промывали и лиофилизировали, как выше. Показано, что этот способ подходит для продукции антигена такими грибками в неродственных исследованиях. Клетки измельчали в тонкий порошок в маленькой ступке и осторожно взвешивали. Суспензии известной концентрации получали в TBS (0,8 г/л NaCl, 0,2 г/л KCl, 1,89 г/л Tris-HCl, и 1,57 г/л Tris-основания) в пробирках и перемешивали с встряхиванием.In the case of needle endophytes, cells were obtained on irradiated needles as above. Test species phylloplans were grown in culture with shaking using media with maltose, yeast extract, peptone (Miller & Mackenzie, 2000), filtered, washed and lyophilized as above. This method has been shown to be suitable for antigen production by such fungi in unrelated studies. The cells were ground into a fine powder in a small mortar and carefully weighed. Suspensions of known concentration were obtained in TBS (0.8 g / L NaCl, 0.2 g / L KCl, 1.89 g / L Tris-HCl, and 1.57 g / L Tris-base) in tubes and mixed with shaking. .

Эксперименты по авидности и перекрестной реактивности проводили на сыворотке от коз, обработанных различными иммуногенами подобным образом, сначала оптимизируя добавления клеток/разведения сыворотки, и затем проводя эксперименты по перекрестной реактивности. Как необходимо, аликвоты клеток разводили в 0,1 M карбонатном буфере pH 9,6 (Sigma) - буфере для покрытия, до определенных концентраций и пипетировали в 96-луночные микропланшеты марки Nunc. Планшет покрывали ацетатной пленкой для герметизации и помещали в ротационный встряхиватель на 4 час при комнатной температуре. Планшет вынимали, поворачивали вверх дном и встряхивали, чтобы удалить весь покрывающий раствор в слив. Затем 200 мкл Blotto (10 г нежирного сухого молока на 1 л TBS) добавляли в каждую лунку, накрывали и помещали в холодильник при 5°C на ночь. Затем планшет вынимали и промывали с использованием Molecular Devices Skan Washer 400 для удаления всего раствора Blotto. Используемый раствор для промывки представлял собой TTBS (0,5 мл tween-20 /л TBS) с программой промывки из 3 циклов смачивания, промывки и ополаскивания. Получали различные разведения сыворотки козы в Blotto, из которых 100 мкл добавляли в лунки микропланшета. Планшет накрывали и помещали в ротационный встряхиватель на 1 час при комнатной температуре, его вынимали и промывали с использованием TTBS, как описано выше. Затем 100 мкл конъюгата антител против IgG козы с пероксидазой хрена (Sigma), разведенного в 5000 раз в Blotto, добавляли в каждую лунку микропланшета. Планшет накрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Планшет промывали последний раз и добавляли субстрат. 100 мкл TMB (тетраметилбензидин, Sigma) добавляли в каждую лунку. Планшет накрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Реакцию останавливали с использованием 50 мкл 0,5 M серной кислоты. Планшет немедленно считывали при 450 нм с вычитанием 630 нм на считывателе Molecular Devices Spectra Max 340PC.Avidity and cross-reactivity experiments were performed on serum from goats treated with various immunogens in a similar fashion, first optimizing cell additions / dilution of serum, and then conducting cross-reactivity experiments. As necessary, aliquots of the cells were diluted in 0.1 M carbonate pH 9.6 buffer (Sigma), a coating buffer, to certain concentrations, and pipetted into 96-well Nunc microplates. The tablet was coated with an acetate film for sealing and placed in a rotary shaker for 4 hours at room temperature. The tablet was removed, turned upside down and shaken to remove all coating solution into the drain. Then 200 μl of Blotto (10 g of non-skimmed milk powder per 1 L of TBS) was added to each well, covered and refrigerated at 5 ° C overnight. The plate was then removed and washed using a Molecular Devices Skan Washer 400 to remove the entire Blotto solution. The washing solution used was TTBS (0.5 ml tween-20 / L TBS) with a washing program of 3 cycles of wetting, washing and rinsing. Various dilutions of goat serum were obtained in Blotto, of which 100 μl was added to the wells of the microplate. The plate was covered and placed in a rotary shaker for 1 hour at room temperature, it was removed and washed using TTBS, as described above. Then, 100 μl of the anti-goat IgG antibody conjugate with horseradish peroxidase (Sigma) diluted 5,000 times in Blotto was added to each well of the microplate. The tablet was covered and incubated at room temperature for 1 hour. The plate was washed last time and the substrate was added. 100 μl of TMB (tetramethylbenzidine, Sigma) was added to each well. The tablet was covered and incubated at room temperature for 30 minutes. The reaction was stopped using 50 μl of 0.5 M sulfuric acid. The tablet was immediately read at 450 nm with a subtraction of 630 nm on a Molecular Devices Spectra Max 340PC reader.

Поликлональное антитело, продуцируемое клетками 5WS22E1, выращенными на определенной среде, обладало низкой авидностью, и его далее не исследовали. Антитело из среды 2% MEA обладало приемлемой авидностью, но неприемлемой перекрестной реактивностью. Поликлональное антитело против клеток, культивированных на облученных иглах, использовали во всех дальнейших исследованиях. 4000-кратное разведение последней сыворотки с 5000-кратным разведением вторичного антитела определили как оптимальное для тестов с клетками 5WS22E1, позволяющее предварительное определение чувствительности подлежащего разработке анализа. Тесты с этим и другими эндофитами хвойных проводили с использованием масс клеток от 15 до 240 нг для 5-кратного диапазона концентрации антитела. С использованием разведения сыворотки 4000 определили ответ на 15, 30, 60, 120 и 240 нг клеток видов филлопланы и на 60, 100 и 500 нг лиофилизированных игл белой ели. Затем добавляли порошкообразные лиофилизированные иглы белой ели (500 нг/лунку) с добавлениями клеток 5WS22E1 во всем вышеуказанном диапазоне.The polyclonal antibody produced by 5WS22E1 cells grown on a specific medium had low avidity and was not investigated further. An antibody from 2% MEA medium had acceptable avidity, but unacceptable cross-reactivity. A polyclonal antibody against cells cultured on irradiated needles was used in all further studies. A 4000-fold dilution of the last serum with a 5000-fold dilution of the secondary antibody was determined as optimal for tests with 5WS22E1 cells, allowing preliminary determination of the sensitivity of the analysis to be developed. Tests with this and other coniferous endophytes were performed using cell masses from 15 to 240 ng for a 5-fold range of antibody concentration. Using dilution of serum 4000, we determined the response to 15, 30, 60, 120, and 240 ng of cells of the phylloplan species and to 60, 100, and 500 ng of lyophilized needles of white spruce. Then, powdered lyophilized white spruce needles (500 ng / well) were added with 5WS22E1 cells added over the entire range above.

Анализы игл на 5WS22E1Needle analyzes on 5WS22E1

Способ рассеваScreening Method

На время забора образцов средняя высота дерева составляла 12,9 см. Иглы от каждого дерева осторожно удаляли по радиусам от точки инокуляции, помещали в стерильные пластиковые пакеты и немедленно замораживали для транспортировки в лабораторию. Каждый пакет вынимали из морозильной камеры и вынимали приблизительно 20 игл. Поверхность каждой иглы дезинфицировали погружением в 70% этанол на 1 мин, ополаскивали стерильной дистиллированной водой в течение 1 мин и промокали досуха стерильной салфеткой. Иглу помещали в стерильную чашку Петри и разрезали на 2 фрагмента, половину иглы, которая была присоединена к стеблю, высевали на 2% агар с экстрактом солода. Чашки инкубировали при 18°C в течение 6 недель и регулярно проверяли микроскопией рост 5WS22E1 (Miller et al., 2002).At the time of sampling, the average tree height was 12.9 cm. The needles from each tree were carefully removed along the radii from the inoculation point, placed in sterile plastic bags and immediately frozen for transportation to the laboratory. Each bag was taken out of the freezer and approximately 20 needles were taken out. The surface of each needle was disinfected by immersion in 70% ethanol for 1 min, rinsed with sterile distilled water for 1 min and blotted dry with a sterile cloth. The needle was placed in a sterile Petri dish and cut into 2 fragments, half of the needle that was attached to the stem was seeded on 2% agar with malt extract. The plates were incubated at 18 ° C for 6 weeks and regularly examined by microscopy for the growth of 5WS22E1 (Miller et al., 2002).

ELISAELISA

Оставшиеся иглы лиофилизировали. Приблизительно 20 игл из каждого замороженного образца игл отбирали, измельчали в тонкий порошок в пробирке с использованием измельчителя-мешалки Spex-Certiprep (модель 5100) и отвешивали 10 мг. Один мл TBS (0,8 г/л NaCl, 0,2 г/л KCl, 1,89 г/л Tris-HCl и 1,57 г/л Tris-основания) добавляли в каждую пробирку и помещали в встряхиватель до полного перемешивания (приблизительно 1 мин). Образцам назначали коды, независимые от кодов деревьев, и распределяли случайным образом, чтобы обеспечить анализ образцов от отдельных деревьев на многих планшетах. Все разводили в 0,1 M карбонатном буфере pH 9,6 (Sigma) - буфере для покрытия, до концентраций 100 и 500 нг игл на 100 мкл лунку, и пипетировали в двух параллелях в 96-луночный микропланшет. Оставшиеся стадии анализа являлись такими, как описано выше. В каждом испытании 60 нг клеток 5WS22E1 использовали в качестве положительного контроля для оценки производительности анализа; относительное стандартное отклонение чистого значения из 25 репрезентативных экспериментов составляло 8,7%. Если не получали приемлемого результата для положительного контроля, результаты для отдельных планшетов переделывали. Образцы с высокими значениями поглощения в тестах как 100 нг, так и 500 нг, отбрасывали как указывающие на проблемы при разведении. Результаты оценивали как положительные, когда поглощение образца 500 нг превышало самое низкое значение поглощения выше единицы (1,000) плюс среднее значение поглощения 30 нг намеченного эндофита в образце на этом планшете.The remaining needles were lyophilized. Approximately 20 needles were taken from each frozen needle sample, pulverized into a fine powder in a test tube using a Spex-Certiprep mixer grinder (Model 5100), and 10 mg was weighed. One ml of TBS (0.8 g / L NaCl, 0.2 g / L KCl, 1.89 g / L Tris-HCl and 1.57 g / L Tris-base) was added to each tube and placed in a shaker until complete. stirring (approximately 1 min). Samples were assigned codes independent of tree codes and randomly assigned to allow analysis of samples from individual trees on many tablets. All were diluted in 0.1 M pH 9.6 carbonate buffer (Sigma) —coating buffer, to concentrations of 100 and 500 ng needles per 100 μl well, and pipetted in duplicate into a 96-well microplate. The remaining stages of the analysis were as described above. In each trial, 60 ng of 5WS22E1 cells were used as a positive control to evaluate assay performance; the relative standard deviation of the net value from 25 representative experiments was 8.7%. If you did not get an acceptable result for a positive control, the results for individual tablets were redone. Samples with high absorbance values in the tests of both 100 ng and 500 ng were discarded as indicating dilution problems. The results were evaluated as positive when the absorption of the 500 ng sample exceeded the lowest absorption value above unity (1,000) plus the average absorption value of 30 ng of the intended endophyte in the sample on this plate.

Химические анализыChemical analyzes

Ругулозин с чистотой >95% использовали для стандартов. Затем следовало определить присутствие ругулозина в сокращенной выборке из 113 случайным образом выбранных деревьев из 330 деревьев, определенных как положительные по эндофиту посредством антитела. 100 мг образца лиофилизированных игл измельчали в тонкий порошок, как описано выше, и экстрагировали 10 мл ледяного петролейного эфира посредством перемешивания в течение 45 мин в условиях низкой освещенности. Колбу сохраняли на льду во время экстракции и накрывали алюминиевой фольгой для предотвращения деградации светом. Суспензию отфильтровывали отсасыванием и выбрасывали. Иглы возвращали в колбу и экстрагировали 10 мл хлороформа в течение 45 мин, как выше в случае петролейного эфира. Затем новую суспензию отфильтровывали отсасыванием и сохраняли, в то время как иглы выбрасывали. Экстракт после хлороформа промывали 10 мл 5% NaHCO₃ в делительной воронке. Затем первый слой хлороформа выбрасывали, pH подкисляли до pH 3 с использованием 1 Н HCl, и новую аликвоту 10 мл хлороформа добавляли в делительную воронку и экстрагировали. Хлороформ удаляли и высушивали в желтой пробирке под слабым потоком азота.Rugulosin with a purity> 95% was used for standards. Then it was necessary to determine the presence of rugulosin in a reduced sample of 113 randomly selected trees from 330 trees, identified as positive for endophyte by antibody. A 100 mg sample of lyophilized needles was ground into a fine powder as described above, and 10 ml of ice-cold petroleum ether was extracted by stirring for 45 minutes under low light conditions. The flask was kept on ice during extraction and covered with aluminum foil to prevent light degradation. The suspension was filtered off with suction and discarded. The needles were returned to the flask and extracted with 10 ml of chloroform for 45 minutes, as above in the case of petroleum ether. Then the new suspension was filtered by suction and stored, while the needles were discarded. The extract after chloroform was washed with 10 ml of 5% NaHCO ₃ in a separatory funnel. Then the first layer of chloroform was discarded, the pH was acidified to pH 3 using 1 N HCl, and a new aliquot of 10 ml of chloroform was added to the separatory funnel and extracted. Chloroform was removed and dried in a yellow tube under a gentle stream of nitrogen.

Высушенные экстракты перерастворяли в 50 мкл ацетонитрила, 10 мкл отбирали и инъецировали в Agilent Technologies HPLC-DAD серии 1100, с использованием колонки Synergi Max RP 8OA, 250 x 4,6 (Phenomonex) и градиентного способа, адаптированного из Frisvad (1987). Градиент начинали при 90% воды с 0,05% TFA и 10% ацетонитрила и изменяли до 10% воды с 0,05% TFA и 90% ацетонитрила в течение 20 мин прогона. Образцы анализировали при 389 нм, максимальное поглощение UV/VIS для ругулозина и идентичность пика подтверждали данными полного спектра из детектора с диодной матрицей. Предел количественного определения составлял 150 нг/г лиофилизированного порошкообразного материала; выделение из добавленных игл составляло в среднем 75%.The dried extracts were redissolved in 50 μl of acetonitrile, 10 μl were collected and injected into an Agilent Technologies HPLC-DAD 1100 series using a Synergi Max RP 8OA, 250 x 4.6 (Phenomonex) column and a gradient method adapted from Frisvad (1987). The gradient was started at 90% water with 0.05% TFA and 10% acetonitrile and changed to 10% water with 0.05% TFA and 90% acetonitrile over a 20 min run. Samples were analyzed at 389 nm, the maximum UV / VIS absorption for rugulosin and the identity of the peak were confirmed by the full spectrum data from a diode array detector. The quantification limit was 150 ng / g of lyophilized powder material; the release of added needles averaged 75%.

Статистические анализы проводили с использованием SYSTAT в. 10.2 (Point Richmond, CA).Statistical analyzes were performed using SYSTAT's. 10.2 (Point Richmond, CA).

РЕЗУЛЬТАТЫRESULTS

Разработка инокуляции и ELISADevelopment of inoculation and ELISA

В описанных условиях предел количественного определения для намеченного эндофита 5WS22E1 составлял между 30 и 60 нг клеток на лунку; предел детекции составлял 30 нг. На протяжении диапазона концентраций один log для антитела показали линейный ответ на 60 нг намеченного эндофита (фигура 1; представлены результаты экспериментов в трех параллелях). Относительная перекрестная реактивность на 15, 30, 60, 120 и 240 нг клеток видов филлопланы являлась умеренной (8%). В том же самом диапазоне присутствовала немного большая перекрестная реактивность с клетками двух тестированных эндофитов белой ели (~15%), один из которых продуцировал ругулозин.Under the conditions described, the quantification limit for the target 5WS22E1 endophyte was between 30 and 60 ng cells per well; the detection limit was 30 ng. Over a range of concentrations, one log for the antibody showed a linear response to 60 ng of the intended endophyte (Figure 1; experimental results are presented in three parallels). The relative cross-reactivity of 15, 30, 60, 120, and 240 ng cells of the phylloplane species was moderate (8%). In the same range, slightly greater cross-reactivity was present with the cells of two tested white spruce endophytes (~ 15%), one of which produced rugulosin.

Даже для 240 нг клеток ответ был ниже используемого порога 1 единица поглощения. Ответ поликлонального антитела на вышеуказанный диапазон не являющихся мишенью грибковых клеток являлся нелинейным в диапазоне концентраций антитела. Ответ на 60, 100 и 500 нг клеток белой ели снова в диапазоне концентраций антитела являлся умеренным (~6%) и также нелинейным. Сравнение ответа на 60 нг не являющихся мишенью клеток с ответом на намеченный эндофит приведено на фигуре 1; среднее относительное стандартное отклонение для параллелей, включенных в эти данные, составляло 6,3%.Even for 240 ng cells, the response was below the threshold used, 1 unit of absorption. The response of the polyclonal antibody to the above range of non-target fungal cells was non-linear in the range of antibody concentrations. The response to 60, 100 and 500 ng white spruce cells again in the antibody concentration range was moderate (~ 6%) and also non-linear. Comparison of the response to 60 ng of non-target cells with the response to the intended endophyte is shown in figure 1; the average relative standard deviation for the parallels included in this data was 6.3%.

На количественное определение намеченного эндофита не влияло присутствие больших количеств порошкообразных лиофилизированных игл (~2-18 x). По ANOVA с тестом LSD Фишера ответ на 500 нг материала игл плюс 30 нг намеченного эндофита значимо превышал ответ на комбинацию с 15 нг (p=0,008). Значения для 30 и 60 нг значимо не отличались (p=0,312), указывая, что предел количественного определения находился между этими значениями в присутствии материала игл. Все оставшиеся значения p между добавлениями клеток эндофита игл составляли >0,003. Значения поглощения для 30, 60, 120 и 240 нг намеченного эндофита плюс материал игл и для одного грибка высоко коррелировали r=0,951 (p >0,000), показывая, что присутствие игл не влияет на линейность анализа (фигура 2; представлены результаты экспериментов в трех параллелях).The quantification of the intended endophyte was not affected by the presence of large quantities of powdery lyophilized needles (~ 2-18 x). According to ANOVA with the Fisher LSD test, the response to 500 ng of needle material plus 30 ng of the intended endophyte significantly exceeded the response to the combination with 15 ng (p = 0.008). The values for 30 and 60 ng did not significantly differ (p = 0.312), indicating that the limit of quantification was between these values in the presence of needle material. All remaining p values between needle endophyte cell additions were> 0.003. Absorption values for 30, 60, 120, and 240 ng of the intended endophyte plus needle material and for one fungus were highly correlated r = 0.951 (p> 0.000), showing that the presence of needles did not affect the linearity of the analysis (Figure 2; the results of experiments in three parallels).

Иглы и химические анализыNeedles and chemical analyzes

Из 1235 тестированных деревьев только 40 являлись явно положительными по 5WS22E1 по анализу рассева, т.е. грибки выросли из срезанного конца >15/20 игл. Для большинства из приблизительно 25000 фрагментов игл с дезинфицированной поверхностью показали рост не относящихся к эндофиту грибков, включая описанные ранее (Miller et al., 2002). Как и ранее, колонии этих таксонов, как правило, возникали из сторон игл, а не из срезанных концов.Of the 1235 trees tested, only 40 were clearly positive according to 5WS22E1 for sieving analysis, i.e. fungi grew from the cut end> 15/20 needles. For most of the approximately 25,000 fragments of surface-disinfected needles, growth of non-endophytic fungi showed growth, including those previously described (Miller et al., 2002). As before, colonies of these taxa, as a rule, arose from the sides of the needles, and not from the cut ends.

Когда те же самые образцы анализировали способом с антителом, 330 или 27% являлись положительными. Все образцы, где грибок наблюдали в культуре, являлись положительными по анализу с антителом. Из 113 образцов, тестированных по ругулозину посредством ВЭЖХ из 330 положительных по антителу игл, 101 (90%) являлись положительными на пределе количественного определения. Диапазон обнаруженных концентраций составлял 0,15-24,8 мкг/г игл. Распределение значений (принимая половину предела детекции за отсутствие детекции) показано на фигуре 3. Среднее геометрическое концентрации ругулозина составляло 1,02 мкг/г.When the same samples were analyzed by the antibody method, 330 or 27% were positive. All samples where the fungus was observed in culture were positive for antibody assay. Of 113 samples tested by rugulosin by HPLC from 330 antibody-positive needles, 101 (90%) were positive at the limit of quantification. The range of detected concentrations was 0.15-24.8 μg / g needles. The distribution of values (taking half the detection limit for lack of detection) is shown in Figure 3. The geometric mean concentration of rugulosin was 1.02 μg / g.

Средняя замороженная масса 100 репрезентативных игл составляла 2,6 мг/иглу. Лиофилизированная масса составляла 1,08 мг/иглу.The average frozen weight of 100 representative needles was 2.6 mg / needle. The lyophilized mass was 1.08 mg / needle.

Поликлональный анализ, разработанный для намеченного эндофита 5WS22E1, обладал сравнимой чувствительностью с подобными анализами для эндофитов травы (Gwinn et al., 1991; Johnson et al., 1982; Reddick & Collins, 1998. Этого достигали несмотря на большие трудности с матриксом игл хвойных по сравнению с листьями травы. Нарезку последних можно помещать непосредственно в микропланшеты, в то время как жесткие, гидрофобные иглы хвойных необходимо измельчать, чтобы экспонировать грибковые клетки для антитела. Перекрестная реактивность для потенциально конкурирующих грибов являлась приемлемой (фигура 1). Эпифитная биомасса является, как правило, небольшой в молодых иглах (Carroll, 1979) и состоит преимущественно из грибков (Swisher & Carroll, 1980). На основании экстраполяции данных авторов настоящего изобретения на данные других исследователей (Swisher & Carroll, 1980; Таблица 2) грибковая эпифитная биомасса на этих иглах в возрасте 19 месяцев будет составлять <3 мкг/г. Это означает, что присутствие таких грибов на образцах игл авторов настоящего изобретения не оказывает эффект на ответ антитела в этих анализах. Кроме того, относительно большие количества порошкообразных игл белой ели по сравнению с грибковыми клетками не влияют на надежную детекцию 30-60 нг клеток намеченного эндофита (фигура 2).The polyclonal analysis developed for the target endophyte 5WS22E1 was comparable in sensitivity to similar analyzes for grass endophytes (Gwinn et al., 1991; Johnson et al., 1982; Reddick & Collins, 1998. This was achieved despite the great difficulties with the matrix of conifers needles). compared to grass leaves, slicing the latter can be placed directly on microplates, while stiff, hydrophobic conifer needles need to be minced to expose fungal cells for the antibody. Cross-reactivity for potentially competing fungi was acceptable (Figure 1). Epiphytic biomass is generally small in young needles (Carroll, 1979) and consists mainly of fungi (Swisher & Carroll, 1980). Based on extrapolation of the data of the authors of the present invention to the data of other researchers (Swisher & Carroll, 1980; Table 2) the fungal epiphytic biomass on these needles at the age of 19 months will be <3 μg / g, which means that the presence of such fungi on the needle samples of the authors of the present invention does not affect the antibody response in these analyzes. In addition, the relatively large amounts of powdered white spruce needles compared with fungal cells do not affect the reliable detection of 30-60 ng of the cells of the intended endophyte (figure 2).

Большинство (90%) игл, показанных как положительные по эндофиту способом с антителом, содержали концентрации ругулозина выше предела детекции. Это обеспечивает дополнительное доказательство надежности способа с антителом. Среднее (1 мкг/г) диапазон и распределение концентраций ругулозина в этих иглах (фигура 3) являлись сходными с обнаруженными в выращенных в вегетационной камере сеянцах (Miller et al., 2002). Аналитический способ, применяемый в настоящем исследовании, включает в себя проверку полного сканирования УФ-спектра на пик ругулозина. Это обеспечивает дополнительное подтверждение присутствия этого соединения по сравнению с предшествующими анализами HPLC UV и TLC (Miller et al., 2002).Most (90%) of the needles shown as endophytic positive by the antibody method contained rugulosin concentrations above the detection limit. This provides additional evidence of the reliability of the method with the antibody. The average (1 μg / g) range and distribution of the concentrations of rugulosin in these needles (Figure 3) were similar to those found in seedlings grown in a growing chamber (Miller et al., 2002). The analytical method used in this study includes checking the full scan of the UV spectrum for the peak of rugulosin. This provides further confirmation of the presence of this compound compared to previous HPLC UV and TLC assays (Miller et al., 2002).

Анализы проводили с использованием дублирующих сокращенных выборок по 500 нг, полученных из образца 20 игл. Осторожное допущение, используемое в оценке 330 положительных сеянцев, заключалось в том, что они содержали предел количественного определения. С использованием этого осторожного допущения, каждая игла будет содержать 60 мкг биомассы эндофита на 1 г иглы или ~6%. Для сравнения, Swisher and Carroll (1980) опубликовали, что иглы Дугласовой пихты в возрасте 1-4 лет обладают ~10 мкг эпифитной биомассы на 1 г игл. Она в основном состоит из грибков, но содержит водоросли и бактерии на более старших иглах. Эти измерения позволяют сделать другое сравнение: количество ругулозина на массу грибковых клеток.Analyzes were carried out using duplicate shortened samples of 500 ng obtained from a sample of 20 needles. The cautious assumption used in evaluating 330 positive seedlings was that they contained a quantification limit. Using this cautious assumption, each needle will contain 60 μg of endophyte biomass per 1 g of needle or ~ 6%. In comparison, Swisher and Carroll (1980) reported that Douglas fir needles 1-4 years old possess ~ 10 μg of epiphytic biomass per 1 g of needles. It mainly consists of fungi, but contains algae and bacteria on older needles. These measurements allow us to make another comparison: the amount of rugulosin per mass of fungal cells.

Провели несколько исследований по продукции микотоксинов в живых растениях с использованием культивирования и эргостерола для оценки грибковой биомассы. Репрезентативным примером является исследование дезоксиниваленола в экспериментально инокулированных зернах до жатвы с соответствующими измерениями эргостерола и жизнеспособных грибков среди других данных (Miller et al., 1983). С использованием эргостерол-грибкового переноса биомассы, обсуждаемой в Gessner & Newell (2002), можно определить, что in planta концентрация дезоксиниваленола соответствует ~ 3% грибковой биомассы. С использованием средней концентрации ругулозина соотношение в этом случае составляло ~2%.Conducted several studies on the production of mycotoxins in living plants using cultivation and ergosterol to evaluate fungal biomass. A representative example is the study of deoxynivalenol in experimentally inoculated pre-harvest grains with appropriate measurements of ergosterol and viable fungi among other data (Miller et al., 1983). Using ergosterol-fungal biomass transfer, discussed in Gessner & Newell (2002), it can be determined that in planta deoxynivalenol concentration corresponds to ~ 3% fungal biomass. Using the average concentration of rugulosin, the ratio in this case was ~ 2%.

Таким образом, поликлональный анализ, разработанный для намеченного эндофита 5WS22E1, надежно детектировал грибок в 500 нг сокращенных выборок колонизированных игл. Через девятнадцать месяцев после инокуляции детектированные скорости колонизации являлись высокими. Анализы показали, что большинство колонизированных игл (90%) содержали поддающиеся детекции концентрации обладающего активностью против насекомых соединения ругулозина 5WS22E1.Thus, the polyclonal analysis developed for the targeted 5WS22E1 endophyte reliably detected a fungus of 500 ng of reduced samples of colonized needles. Nineteen months after inoculation, the detected colonization rates were high. Analyzes showed that most of the colonized needles (90%) contained detectable concentrations of the anti-insect compound 5 rugsulosin 5WS22E1.

Пример 3Example 3

Коллекции грибковFungus collections

Из приблизительно 12 участков в Нью-Брансуик, Новой Шотландии, Квебеке и Мэне собирали ветви старших деревьев белой ели, красной ели и бальзамической пихты в различных древостоях, в первую очередь в относительно нетронутых природных лесных лесостоях, но также на плантациях возраста 20-30 лет. Это проводили с 1985 по 2005 гг. Ветви собирали либо непосредственно в полевых условиях, либо из ветвей деревьев, которые прививали из полевых селекций и выращивали на плантации - банке клонов в Суссексе, Нью-Брансуик. Поверхность игл из ветвей стерилизовали и рассевали для общих процедур, разработанных Carroll и соавторами (например, Carroll and Carroll, 1978). Кратко, как правило, 20 здоровых игл собирали с каждой ветви. Их поверхность стерилизовали погружением в 70% этанол, затем 6% гипохлорит натрия в течение 10 мин с последующим ополаскиванием стерильной деионизированной водой, промокали досуха стерильной салфеткой и высевали на 2% агар с экстрактом солода. Чашки инкубировали при 18°C в течение ~6 недель. Целью этой поверхностной дезинфекции являлось уничтожение грибков филлопланы, перекрывающих медленно растущие эндофиты игл (Carroll and Carroll, 1978; Clark et al., 1989). Все фрагменты игл проверяли с помощью стереомикроскопа. Колонии не очевидные для Cladosporium или Alternaria, проверяли при высокой мощности для диагностики эндофита.Of the approximately 12 sites in New Brunswick, Nova Scotia, Quebec, and Maine, the branches of older trees of white spruce, red spruce, and balsam fir were harvested in various stands, primarily in relatively untouched natural forest stands, but also on plantations aged 20-30 years . This was carried out from 1985 to 2005. The branches were harvested either directly in the field or from tree branches that were grafted from field selection and grown on a plantation - a bank of clones in Sussex, New Brunswick. The surface of the needles from the branches was sterilized and scattered for general procedures developed by Carroll et al (e.g. Carroll and Carroll, 1978). Briefly, as a rule, 20 healthy needles were collected from each branch. Their surface was sterilized by immersion in 70% ethanol, then 6% sodium hypochlorite for 10 min, followed by rinsing with sterile deionized water, blotted dry with a sterile napkin and sown on 2% agar with malt extract. The plates were incubated at 18 ° C for ~ 6 weeks. The purpose of this surface disinfection was to kill the phylloplans, covering the slowly growing endophytes of the needles (Carroll and Carroll, 1978; Clark et al., 1989). All needle fragments were checked with a stereo microscope. Colonies not obvious to Cladosporium or Alternaria were tested at high power for the diagnosis of endophyte.

Медленно растущие культуры переносили в косяки 2% агара с экстрактом солода или культуральные флаконы, инкубировали при 16-18°C, заклеивали, инвентаризовали по внешнему виду культуры и подробностям сбора и сохраняли при 5°C. Несколько тысяч штаммов, которые были собраны, сортировали по локализации, участку и морфологии колоний и отбирали случайную выборку для дальнейшего исследования.Slowly growing cultures were transferred to shoals of 2% agar with malt extract or culture bottles, incubated at 16-18 ° C, glued, inventoried according to the appearance of the culture and collection details and stored at 5 ° C. The several thousand strains that were collected were sorted by location, plot and morphology of the colonies and a random sample was selected for further research.

Скрининг грибковой коллекции по токсинам против патогенов (например, против насекомых)Screening of the fungal collection for toxins against pathogens (e.g., against insects)

Выбранные изоляты выращивали либо во флаконах Glaxo, либо в других сосудах, позволяющих культивирование с большим соотношением площади поверхности к объему с пониженным давлением кислорода. Используемая среда представляла собой 2% экстракт солода в деионизированной воде. Культуры инокулировали посредством измельчения конуса 2% агара с экстрактом солода в стерильной деионизированной воде в асептических условиях и добавления полученной суспензии 5% об./об. либо непосредственно в более мелкие культуральные сосуды (Clark et al., 1989), либо в 250 мл колбы Эрленмейера, содержащие 2% экстракт солода в деионизированной воде, на 2 недели при 25°C. Их в свою очередь измельчали и инокулировали во флаконы Glaxo и Roux и инкубировали в течение 6-8 недель при 16-18°C.Selected isolates were grown either in Glaxo vials or in other vessels allowing cultivation with a large ratio of surface area to volume with reduced oxygen pressure. The medium used was a 2% malt extract in deionized water. The cultures were inoculated by grinding a cone of 2% agar with malt extract in sterile deionized water under aseptic conditions and adding the resulting suspension of 5% v / v. either directly into smaller culture vessels (Clark et al., 1989), or in 250 ml Erlenmeyer flasks containing 2% malt extract in deionized water for 2 weeks at 25 ° C. They, in turn, were crushed and inoculated into Glaxo and Roux vials and incubated for 6-8 weeks at 16-18 ° C.

Полученные культуры фильтровали. Мицелий замораживали и лиофилизировали. Фильтраты культур экстрагировали этилацетатом и проверяли для доказательств продукции метаболитов тонкослойной хроматографией, ЯМР и высокоэффективной жидкостной хроматографией с детектором с двойной диодной матрицей. На основании этих доказательств проводили скрининг экстрактов по токсичности в рационе для личинок гусеницы листовертки-почкоеда елового. Принципиальные токсины против насекомых таким образом выделяли и идентифицировали с использованием общепринятых способов органической химии, включая, в качестве неограничивающих примеров, препаративную TLC, колоночную хроматографию, ЯМР и высокоразрешающую масс-спектроскопию.The resulting culture was filtered. The mycelium was frozen and lyophilized. Culture filtrates were extracted with ethyl acetate and checked for evidence of metabolite production by thin layer chromatography, NMR and high performance liquid chromatography with a dual diode array detector. Based on this evidence, extracts were screened for toxicity in the diet for the larvae of the spruce bud-leaf bud caterpillar. Essential insect toxins were thus isolated and identified using conventional methods of organic chemistry, including, but not limited to, preparative TLC, column chromatography, NMR and high-resolution mass spectroscopy.

Идентификация штаммовStrain identification

Информация о морфологии колоний для 5WS22E1 и SWS11/1, двух хорошо изученных штаммов, является следующей: штаммы выращивали на 2% агаре с экстрактом солода при 25°C в темноте. 5WS22E1 рос 0,5 мм сутки^-1. Мицелий являлся в основном погруженным, колонии являлись рыжевато-бурыми с растворимым рыжеватым пигментом; обратная сторона являлась бурой, становясь рыжевато-бурой с возрастом. Мицелий являлся темно-бурым с загрубевшими толстыми стенками диаметром 1-2 мкм, септированным, с редкими ответвлениями, возникающим под прямыми углами от мицелия. 5WS11/1 рос 0,4 мм сутки^-1. Колонии и обратная сторона являлись зеленовато-коричневыми без растворимого пигмента, и мицелий являлся как погруженным, так и воздушным. Мицелий являлся зеленовато-коричневым с загрубевшими стенками диаметром 1-2 мкм, септированным, без ответвлений (Miller et al., 2002).Information on colony morphology for 5WS22E1 and SWS11 / 1, two well-studied strains, is as follows: the strains were grown on 2% agar with malt extract at 25 ° C in the dark. 5WS22E1 grew 0.5 mm day ^-1 . The mycelium was mostly submerged, the colonies were reddish-brown with soluble reddish pigment; the reverse side was brown, becoming reddish brown with age. The mycelium was dark brown with coarsened thick walls with a diameter of 1-2 microns, septic, with rare branches arising at right angles from the mycelium. 5WS11 / 1 grew 0.4 mm day ^-1 . The colonies and the reverse were greenish brown without soluble pigment, and the mycelium was both submerged and airy. Mycelium was greenish-brown with coarsened walls with a diameter of 1-2 μm, septic, without branches (Miller et al., 2002).

Молекулярную характеризацию пяти интересующих штаммов выполняли с использованием праймеров из Glass & Donaldson (1995), что является признанным общепринятым способом для нитевидных Ascomycetes в настоящее время. Клетки эндофитов выращивали в жидкой культуре, фильтровали и промывали, и затем выделяли ДНК с использованием набора для выделения ДНК микроорганизмов Ultraclean (Mo Bio Laboratories, #12224-250), и для полученных последовательностей проверяли в общедоступных базах данных родственные последовательности. Ни один из штаммов ранее не депонирован в GenBank®. На основании сходства последовательностей штаммы 5WS22E1 и 5WS11/1 предварительно являются видами Phialocephala, который включает виды, являющиеся эндофитами на ели. Штамм 05-037A выделен из игл P. glauca в St. George, NB. Ограниченные последовательности ДНК доступны для родственных грибов, однако, доступные данные показывают, что он принадлежит к порядку Xylariales, семейству Xylariaceae и близок, но не идентичен Hypoxylon/Nemania serpens (98% сходство последовательности ITS) (Vasiliauskas, 2005, Sanchez-Ballesteros, 2000). Другие штаммы белой ели, 06-486D и 06-485A, выделены из игл в Суссекс, NB. Данные секвенирования показывают, что они являются наиболее близко родственными неидентифицированными видами грибков, выделенных из деревьев черной ели в Квебеке, Канада. Оба представляли собой виды Lophodermium (94% и 98% сходства ITS, соответственно), где 06-486D наиболее похож на Rhytistimataceae (Higgins et al., 2007, Ganley & Newcombe, 2006).The molecular characterization of the five strains of interest was performed using primers from Glass & Donaldson (1995), which is a recognized generally accepted method for filamentous Ascomycetes at present. Endophyte cells were grown in liquid culture, filtered and washed, and then DNA was isolated using the Ultraclean microorganism DNA isolation kit (Mo Bio Laboratories, # 12224-250), and related sequences were checked in public databases. None of the strains previously deposited in GenBank®. Based on sequence similarity, strains 5WS22E1 and 5WS11 / 1 are previously Phialocephala species, which includes species that are endophytes on spruce. Strain 05-037A isolated from P. glauca needles in St. George, NB. Limited DNA sequences are available for related fungi, however, the available data show that it belongs to the Xylariales order, the Xylariaceae family , and is close but not identical to Hypoxylon / Nemania serpens (98% similarity to the ITS sequence) (Vasiliauskas, 2005, Sanchez-Ballesteros, 2000 ) Other strains of white spruce, 06-486D and 06-485A, are isolated from needles in Sussex, NB. Sequencing data indicates that they are the most closely related unidentified species of fungi isolated from black spruce trees in Quebec, Canada. Both were Lophodermium species (94% and 98% similarity of ITS, respectively), where 06-486D is most similar to Rhytistimataceae (Higgins et al., 2007, Ganley & Newcombe, 2006).

Идентификация эффективных штаммовIdentification of Effective Strains

Эффективные штаммы представляют собой такие, которые (a) продуцируют соединения против насекомых, токсичные для гусениц листовертки-почкоеда елового in vitro, (b) колонизируют сеянцы белой ели, (c) продуцируют их токсин(ы) in planta (d) для насекомых, потребляющих колонизированные эндофитом иглы показали сниженные скорости роста.Effective strains are those that (a) produce anti-insect compounds that are toxic to spruce bud-leaf caterpillars in vitro , (b) colonize white spruce seedlings, (c) produce their toxin (s) in planta (d) for insects, endophytic colonized needles showed reduced growth rates.

a) Тесты на насекомых проводили посредством добавления чистого соединения в синтетический рационa) Insect tests were performed by adding pure compound to the synthetic diet

Личинок гусеницы листовертки-почкоеда елового (Choristoneura fumiferana) получили из колоний в Natural Resources Canada, Canadian Forest Service Laboratory в Sault Ste. Marie, Ontario и сохраняли при 5°C. Для каждого теста личинок на второй личиночной стадии помещали в молочники, содержащие приблизительно 15 мл искусственного рациона, который получали на предыдущие сутки, и оставляли располагаться в течение ночи. Используемый рацион основан на McMorran (1965), как модифицировано Forestry Canada. Молочники помещали в вегетационную камеру при 22°C, 55% RH с 16 час света/сутки пока они не достигали 4-5 личиночной стадии, как определяли визуальной оценкой. Получали партии рациона и отмеряли подходящие части для добавления экстрактов, фракций или чистых соединений. Через 4 суток на тестируемом рационе гусениц листовертки-почкоеда замораживали, взвешивали и измеряли. Данные анализировали по уменьшениям сухой массы по сравнению с контролями и по изменениям в распределении насекомых по различным личиночным стадиям по сравнению с контролями. Choristoneura fumiferana larvae of the spider buds ( Choristoneura fumiferana ) were obtained from colonies in Natural Resources Canada, Canadian Forest Service Laboratory in Sault Ste. Marie, Ontario and kept at 5 ° C. For each test, the larvae in the second larval stage were placed in milk jugs containing approximately 15 ml of the artificial diet, which was obtained on the previous day, and left to settle overnight. The ration used is based on McMorran (1965), as modified by Forestry Canada. Milkworms were placed in a growing chamber at 22 ° C, 55% RH from 16 hours of light / day until they reached the 4-5 larval stage, as determined by visual assessment. Received batches of the diet and measured the appropriate parts to add extracts, fractions or pure compounds. After 4 days on the test diet of the caterpillars of the bud-leaf beetle, they were frozen, weighed and measured. The data were analyzed by dry weight reduction compared to controls and changes in the distribution of insects at different larval stages compared to controls.

Для гусениц листовертки-почкоеда елового предварительный тест показал, что эффективная приблизительная концентрация ругулозина для ограничения роста составляла 10 мкМ (Calhoun et al., 1992). В дополнительных тестах получили сходное значение 25 мкМ ругулозин со значением p 0,027 мкМ для ассоциации с уменьшением массы (см. фигуру 8).For spruce bud-caterpillar caterpillars, a preliminary test showed that the effective approximate concentration of rugulosin for limiting growth was 10 μM (Calhoun et al., 1992). In additional tests, a similar value of 25 μM rugulosin was obtained with a p value of 0.027 μM for association with weight reduction (see figure 8).

Штаммы 5WS22E1, 5WS11/1, 05-037A, 06-486D, 06-485A являлись активными в подобных тестах экстрактов in vitro.Strains 5WS22E1, 5WS11 / 1, 05-037A, 06-486D, 06-485A were active in similar in vitro extract assays .

(b) Колонизация сеянцев белой ели(b) Colonization of white spruce seedlings

Колонизацию сеянцев после экспериментальной инокуляции проводили для 5WS22E1 и оценивали по присутствию по морфологии колоний, положительному тесту с антителом и анализу токсина in planta (Miller et al., 2002, Sumarah et al., 2005). Показали персистенцию колонизации с продукцией эффективных концентраций ругулозина в полевых условиях в течение ≥5 лет для 5WS22E1.Colonization of seedlings after experimental inoculation was carried out for 5WS22E1 and assessed by the presence of colony morphology, positive antibody test and in planta toxin analysis (Miller et al., 2002, Sumarah et al., 2005). The persistence of colonization with the production of effective concentrations of rugulosin in the field for ≥5 years for 5WS22E1 was shown.

Анализы ELISAELISA Assays

Продукцию антитела осуществляли с использованием клеток 5WS22E1, выращенных на облученных, молодых инокулированных иглах белой ели. Иглы облучали 25 кГр (MDS Nordion, Montreal, PQ) и 200 мг помещали в стерильную стеклянную чашку Петри, содержащую фильтровальную бумагу, с последующим добавлением 1 мл стерильной воды. Через 24 часа культуру инокулировали небольшой частью культуры, взятой из рабочей стороны чашки с 2% агаром с экстрактом солода. В конце инкубационного периода клетки, растущие на иглах, осторожно соскребали скальпелем и лиофилизировали.Antibody production was performed using 5WS22E1 cells grown on irradiated, young inoculated white spruce needles. The needles were irradiated with 25 kGy (MDS Nordion, Montreal, PQ) and 200 mg was placed in a sterile glass Petri dish containing filter paper, followed by the addition of 1 ml of sterile water. After 24 hours, the culture was inoculated with a small part of the culture, taken from the working side of a cup with 2% agar with malt extract. At the end of the incubation period, the cells growing on the needles were carefully scraped off with a scalpel and lyophilized.

Продукцию поликлонального антитела проводили в козах в Cedarlane® Laboratories Limited, Hornby, Ontario. Эта лаборатория соответствует требованиям Canadian Council on Animal Care. Лиофилизированные клетки из каждой среды измельчали, и каждые разводили в стерильном PBS до концентрации 20 мг/мл для раствора антигена. 0,5 мл этого раствора эмульгировали в 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда (Brenntag Biosector, Denmark) для первичной иммунизации. 0,5 мл неполного адъюванта использовали для последующих бустер-иммунизаций. Преиммунный образец получали из яремной вены каждой козы с использованием иглы и вакуумного контейнера перед первичной иммунизацией. Затем каждую козу инъецировали с использованием иглы 21 калибра внутримышечно в заднюю часть в 4 различных участках с 0,25 мл эмульгированного раствора антигена на участок инъекции. Через 28 суток козам вводили первую бустер-иммунизацию, как описано выше, вторую бустер-иммунизацию на 53 сутки и тестовый забор крови проводили на 66 сутки.Polyclonal antibody production was performed in goats at Cedarlane® Laboratories Limited, Hornby, Ontario. This laboratory meets Canadian Council on Animal Care requirements. Lyophilized cells from each medium were ground, and each was diluted in sterile PBS to a concentration of 20 mg / ml for antigen solution. 0.5 ml of this solution was emulsified in 0.5 ml of complete Freund's adjuvant (Brenntag Biosector, Denmark) for primary immunization. 0.5 ml of an incomplete adjuvant was used for subsequent booster immunizations. An advantageous sample was obtained from the jugular vein of each goat using a needle and a vacuum container before primary immunization. Then, each goat was injected using a 21 gauge needle intramuscularly into the back at 4 different sites with 0.25 ml of emulsified antigen solution per injection site. After 28 days, the goats were given the first booster immunization as described above, the second booster immunization on day 53 and the test blood sampling was performed on day 66.

Антитела, полученные от 3 различных коз, тестировали для определения их авидности и перекрестной реактивности с порошкообразными, лиофилизированными клетками неинокулированных молодых игл ели, так же как с клетками наиболее распространенных в филлоплане игл грибков, выделенных из этих игл (Alternaria alternata, Phoma herbarum, Cladosporium cladosporioides и Aspergillus fumigatus), и других эндофитов хвойных для белой ели: 5WS11/1 (DAOM 229535; продуцент вермикулина) и 5WS331 L1 (продуцент ругулозина). Кроме того, тестировали ряд эндофитов бальзамической пихты. В случае эндофитов игл клетки получали на облученных иглах, как выше. Тестируемые виды филлопланы выращивали в культуре с встряхиванием с использованием среды с мальтозой, дрожжевым экстрактом, пептоном, фильтровали, промывали и лиофилизировали, как выше. Показано, что этот способ подходит для продукции антигена такими грибами в неродственных исследованиях. Клетки измельчали в тонкий порошок в маленькой ступке и осторожно взвешивали. Суспензии известной концентрации получали в TBS (0,8 г/л NaCl, 0,2 г/л KCl, 1,89 г/л Tris-HCl, и 1,57 г/л Tris-основания) в пробирках и перемешивали с встряхиванием.Antibodies obtained from 3 different goats were tested to determine their avidity and cross-reactivity with powdery, lyophilized cells of uninoculated young spruce needles, as well as with cells of the most common fungal needle needles isolated from these needles ( Alternaria alternata , Phoma herbarum , Cladosporium cladosporioides and Aspergillus fumigatus ), and other coniferous endophytes for white spruce: 5WS11 / 1 (DAOM 229535; producer of vermiculin) and 5WS331 L1 (producer of rugulosin). In addition, a number of balsamic fir endophytes were tested. In the case of needle endophytes, cells were obtained on irradiated needles as above. Test species phylloplans were grown in culture with shaking using a medium with maltose, yeast extract, peptone, filtered, washed and lyophilized as above. This method has been shown to be suitable for antigen production by such fungi in unrelated studies. The cells were ground into a fine powder in a small mortar and carefully weighed. Suspensions of known concentration were obtained in TBS (0.8 g / L NaCl, 0.2 g / L KCl, 1.89 g / L Tris-HCl, and 1.57 g / L Tris-base) in tubes and mixed with shaking. .

Эксперименты по авидности и перекрестной реактивности проводили на сыворотке от коз, обработанных различными иммуногенами подобным образом, сначала оптимизируя добавления клеток/разведения сыворотки, затем проводя эксперименты по перекрестной реактивности. Как необходимо, аликвоты клеток разводили в 0,1 M карбонатном буфере pH 9,6 (Sigma) - буфере для покрытия, до определенных концентраций и пипетировали в 96-луночные микропланшеты марки Nunc. Планшет покрывали ацетатной пленкой для герметизации и помещали в ротационный встряхиватель на 4 час при комнатной температуре. Планшет вынимали, поворачивали вверх дном и встряхивали, чтобы удалить весь покрывающий раствор в слив. Затем 200 мкл Blotto (10 г нежирного сухого молока на 1 л TBS) добавляли в каждую лунку, накрывали и помещали в холодильник при 5°C на ночь. Затем планшет вынимали и промывали с использованием Molecular Devices Skan Washer 400 для удаления всего раствора Blotto. Используемый раствор для промывки представлял собой TTBS (0,5 мл tween-20 /л TBS) с программой промывки из 3 циклов смачивания, промывки и ополаскивания. Получали различные разведения сыворотки козы в Blotto, из которых 100 мкл добавляли в лунки микропланшета. Планшет накрывали и помещали в ротационный встряхиватель на 1 час при комнатной температуре, затем вынимали и промывали с использованием TTBS, как описано выше. 100 мкл конъюгата антител против IgG козы с пероксидазой хрена (Sigma), разведенного в 5000 раз в Blotto, добавляли в каждую лунку микропланшета. Планшет накрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Планшет промывали последний раз и добавляли субстрат. 100 мкл TMB (тетраметилбензидин, Sigma) добавляли в каждую лунку. Планшет накрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Реакцию останавливали с использованием 50 мкл 0,5 M серной кислоты. Планшет немедленно считывали при 450 нм с вычитанием 630 нм на считывателе Molecular Devices Spectra Max 340PC.Avidity and cross-reactivity experiments were performed on serum from goats treated with various immunogens in a similar manner, first optimizing cell additions / serum dilutions, then conducting cross-reactivity experiments. As necessary, aliquots of the cells were diluted in 0.1 M carbonate pH 9.6 buffer (Sigma), a coating buffer, to certain concentrations, and pipetted into 96-well Nunc microplates. The tablet was coated with an acetate film for sealing and placed in a rotary shaker for 4 hours at room temperature. The tablet was removed, turned upside down and shaken to remove all coating solution into the drain. Then 200 μl of Blotto (10 g of non-skimmed milk powder per 1 L of TBS) was added to each well, covered and refrigerated at 5 ° C overnight. The plate was then removed and washed using a Molecular Devices Skan Washer 400 to remove the entire Blotto solution. The washing solution used was TTBS (0.5 ml tween-20 / L TBS) with a washing program of 3 cycles of wetting, washing and rinsing. Various dilutions of goat serum were obtained in Blotto, of which 100 μl was added to the wells of the microplate. The plate was covered and placed in a rotary shaker for 1 hour at room temperature, then removed and washed using TTBS, as described above. 100 μl of the anti-goat IgG antibody conjugate with horseradish peroxidase (Sigma) diluted 5,000 times in Blotto was added to each well of the microplate. The tablet was covered and incubated at room temperature for 1 hour. The plate was washed last time and the substrate was added. 100 μl of TMB (tetramethylbenzidine, Sigma) was added to each well. The tablet was covered and incubated at room temperature for 30 minutes. The reaction was stopped using 50 μl of 0.5 M sulfuric acid. The tablet was immediately read at 450 nm with a subtraction of 630 nm on a Molecular Devices Spectra Max 340PC reader.

Поликлональное антитело, продуцируемое клетками 5WS22E1, выращенными на определенной среде, обладало низкой авидностью, и его далее не исследовали. Антитело из среды 2% MEA обладало приемлемой авидностью, но неприемлемой перекрестной реактивностью. Поликлональное антитело против клеток, культивированных на облученных иглах, использовали во всех дальнейших исследованиях. 4000-кратное разведение последней сыворотки с 5000-кратным разведением вторичного антитела определили как оптимальное для тестов с клетками 5WS22E1, позволяющее предварительное определение чувствительности подлежащего разработке анализа. Тесты с этим и другими эндофитами хвойных проводили с использованием масс клеток от 15 до 240 нг для 5-кратного диапазона концентрации антитела. С использованием разведения сыворотки 4000 определили ответ на 15, 30, 60, 120 и 240 нг клеток видов филлопланы и на 60, 100 и 500 нг лиофилизированных игл белой ели. Затем добавляли порошкообразные лиофилизированные иглы белой ели (500 нг/лунку) с добавлениями клеток 5WS22E1 во всем вышеуказанном диапазоне.The polyclonal antibody produced by 5WS22E1 cells grown on a specific medium had low avidity and was not investigated further. An antibody from 2% MEA medium had acceptable avidity, but unacceptable cross-reactivity. A polyclonal antibody against cells cultured on irradiated needles was used in all further studies. A 4000-fold dilution of the last serum with a 5000-fold dilution of the secondary antibody was determined as optimal for tests with 5WS22E1 cells, allowing preliminary determination of the sensitivity of the analysis to be developed. Tests with this and other coniferous endophytes were performed using cell masses from 15 to 240 ng for a 5-fold range of antibody concentration. Using dilution of serum 4000, we determined the response to 15, 30, 60, 120, and 240 ng of cells of the phylloplan species and to 60, 100, and 500 ng of lyophilized needles of white spruce. Then, powdered lyophilized white spruce needles (500 ng / well) were added with 5WS22E1 cells added over the entire range above.

(c) продуцируют их токсин(ы) in planta (c) produce their toxin (s) in planta

Анализ ругулозинаRugulosin analysis

Как правило, 100 мг образца лиофилизированных игл измельчали в тонкий порошок, как описано выше, и экстрагировали 10 мл ледяного петролейного эфира посредством перемешивания в течение 45 мин в условиях низкой освещенности. Колбу сохраняли на льду во время экстракции и накрывали алюминиевой фольгой для предотвращения деградации светом. Суспензию фильтровали отсасыванием и выбрасывали. Иглы возвращали в колбу и экстрагировали 10 мл хлороформа в течение 45 мин, как выше в случае петролейного эфира. Затем новую суспензию отфильтровывали отсасыванием и сохраняли, в то время как иглы выбрасывали. Экстракт после хлороформа промывали 10 мл 5% NaHCO₃ в делительной воронке. Затем первый слой хлороформа выбрасывали, pH подкисляли до pH 3 с использованием 1 Н HCl, новую аликвоту 10 мл хлороформа добавляли в делительную воронку и экстрагировали. Хлороформ удаляли и высушивали в желтой пробирке под слабым потоком азота.Typically, 100 mg of a sample of lyophilized needles was ground into a fine powder as described above, and 10 ml of ice-cold petroleum ether was extracted by stirring for 45 minutes under low light conditions. The flask was kept on ice during extraction and covered with aluminum foil to prevent light degradation. The suspension was filtered by suction and discarded. The needles were returned to the flask and extracted with 10 ml of chloroform for 45 minutes, as above in the case of petroleum ether. Then the new suspension was filtered by suction and stored, while the needles were discarded. The extract after chloroform was washed with 10 ml of 5% NaHCO ₃ in a separatory funnel. Then the first layer of chloroform was discarded, the pH was acidified to pH 3 using 1 N HCl, a new aliquot of 10 ml of chloroform was added to the separatory funnel and extracted. Chloroform was removed and dried in a yellow tube under a gentle stream of nitrogen.

Высушенные экстракты перерастворяли в 50 мкл ацетонитрила, и 10 мкл отбирали и инъецировали в Agilent Technologies HPLC-DAD серии 1100, с использованием колонки Synergi Max RP 8OA, 250 x 4,6 (Phenomonex) и градиентного способа, адаптированного из Frisvad (1987). Градиент начинали при 90% воды с 0,05% TFA и 10% ацетонитрила и изменяли до 10% воды с 0,05% TFA и 90% ацетонитрил в течение 20 мин прогона. Образцы анализировали при 389 нм, максимальное поглощение UV/VIS для ругулозина и идентичность пика подтверждали данными полного спектра из детектора с диодной матрицей (Фигура 7). Предел количественного определения составлял 150 нг/г лиофилизированного порошкообразного материала; выделение из добавленных игл составляло в среднем 75%.The dried extracts were redissolved in 50 μl of acetonitrile, and 10 μl was collected and injected into an Agilent Technologies HPLC-DAD 1100 series using a Synergi Max RP 8OA, 250 x 4.6 (Phenomonex) column and a gradient method adapted from Frisvad (1987). The gradient was started at 90% water with 0.05% TFA and 10% acetonitrile and changed to 10% water with 0.05% TFA and 90% acetonitrile over a 20 min run. Samples were analyzed at 389 nm, the maximum UV / VIS absorption for rugulosin and the identity of the peak were confirmed by the full spectrum data from the diode array detector (Figure 7). The quantification limit was 150 ng / g of lyophilized powder material; the release of added needles averaged 75%.

Анализ вермикулинаVermiculin Analysis

Колонизацию 5WS11/1 после экспериментальной инокуляции показали по морфологии колоний (Miller et al., 2002), посредством положительного теста с антителом и по присутствию токсина in planta. Разработку антитела проводили так же, как выше.Colonization of 5WS11 / 1 after experimental inoculation was shown by colony morphology (Miller et al., 2002), by a positive antibody test and by the presence of toxin in planta . The development of antibodies was carried out as above.

Принципиальный токсин 5WS11/1, вермикулин, определяли следующим образом. Десять миллилитров ледяного петролейного эфира добавляли к каждому образцу измельченных игл и оставляли для экстракции от 45 мин до часа на льду во время перемешивания на магнитной мешалке. Затем растворы фильтровали с помощью фильтровальной бумаги Whatman #1 и воронки Бюхнера. Десять миллилитров этилацетата добавляли к иглам и фильтровальной бумаге. Растворы оставляли для экстракции в течение от 45 минут до 1 часа во время перемешивания на магнитной мешалке и снова фильтровали через фильтровальную бумагу Whatman #1 на воронке Бюхнера. Фильтрат собирали и высушивали под слабым потоком азота. Приблизительно один миллилитр ацетонитрила добавляли к высушенным экстрактам и полученный в результате раствор встряхивали, фильтровали через фильтр Acrodisk 0,22 мкм или 0,45 мкм, снова высушивали под азотом и перерастворяли в небольшом количестве (100-300 мкл) ацетонитрила. Эти экстракты инъецировали в ВЭЖХ. Пик вермикулина детектировали на УФ-хроматограмме при 224 нм, его максимуме УФ на полном спектре сканограммы.The principal 5WS11 / 1 toxin, vermiculin, was determined as follows. Ten milliliters of ice-cold petroleum ether was added to each sample of ground needles and allowed to extract for 45 minutes to an hour on ice while stirring on a magnetic stirrer. The solutions were then filtered using Whatman # 1 filter paper and a Buchner funnel. Ten milliliters of ethyl acetate was added to the needles and filter paper. The solutions were left to extract for 45 minutes to 1 hour while stirring on a magnetic stirrer and again filtered through Whatman # 1 filter paper on a Buchner funnel. The filtrate was collected and dried under a weak stream of nitrogen. About one milliliter of acetonitrile was added to the dried extracts and the resulting solution was shaken, filtered through an Acrodisk filter of 0.22 μm or 0.45 μm, dried again under nitrogen and re-dissolved in a small amount (100-300 μl) of acetonitrile. These extracts were injected into HPLC. The peak of vermiculin was detected on a UV chromatogram at 224 nm, its maximum UV on the full spectrum of the scan.

Тесты для выделенного продуцирующего вермикулин эндофита описаны в Miller et al., 2002.Tests for an isolated vermiculin-producing endophyte are described in Miller et al., 2002.

(d) для насекомых, потребляющих колонизированные эндофитом иглы, показали сниженные скорости роста(d) for insects consuming endophyte-colonized needles showed reduced growth rates

Систему тестирования, используемую для оценки 5WS22E1 и 5WS11/1 (Miller et al., 2002), адаптировали из системы Thomas (1983) для сравнения активности гусеницы листовертки-почкоеда елового на листве различных возрастов и видов деревьев. Система состояла из 4 мл конусовидных пластиковых чашек для образцов с крышками, каждая с просверленным через центр 0,5 мм отверстием и куском пены Oasis™, вырезанной по размеру узкого основания пробирок (10 мм диаметр × 15 мм). Непосредственно перед использованием добавляли 0,5 мл стерильной воды. Это позволяло поддерживать индивидуальные иглы вертикально и подвергать воздействию отдельной гусеницы листовертки-почкоеда елового, причем основание иглы контактирует с увлажнителем. Иглу брали из морозильной камеры и вставляли в перегородку непосредственно перед добавлением гусеницы листовертки-почкоеда. Гладкая поверхность перегородки позволяла собирать несъеденные части иглы. Затем пробирки поддерживали вертикально в группах по 30 в деревянных штативах.The testing system used to evaluate 5WS22E1 and 5WS11 / 1 (Miller et al., 2002) was adapted from the Thomas (1983) system to compare the activity of the spruce bud-caterpillar caterpillar on foliage of different ages and tree species. The system consisted of 4 ml cone-shaped plastic sample cups with lids, each with a 0.5 mm hole drilled through the center and a piece of Oasis ™ foam cut to the size of the narrow base of the tubes (10 mm diameter × 15 mm). Immediately before use, 0.5 ml of sterile water was added. This made it possible to support individual needles vertically and expose a separate caterpillar of a spruce bud-leaf beetle, the base of the needle in contact with the humidifier. The needle was taken from the freezer and inserted into the septum immediately before the addition of the caterpillar of the leaf bud-beetle. The smooth surface of the septum made it possible to collect the uneaten parts of the needle. Then the tubes were maintained vertically in groups of 30 in wooden racks.

Гусениц листовертки-почкоеда елового на второй личиночной стадии помещали в пробирки, содержащие искусственный рацион (McMorran, 1965). Их поддерживали в вегетационных камерах при 22°C, 55% RH с 16 час света/сутки в течение 1-2 суток, пока они не достигали ширины головной капсулы 0,4±0,1 мм (3^я личиночная стадия). Это стадия, на которой они будут потреблять иглы суккулентов. Партии по 60-70 личинок объединяли и осторожно перемешивали вручную для случайного распределения животных из их исходных пробирок для роста. Затем отдельную гусеницу листовертки-почкоеда помещали в каждую пробирку. Из хорошо перемешанного пула замороженных игл тестировали 100 сходного размера и массы, собранных вблизи точки инокуляции тестируемого сеянца, плюс 100 контрольных игл на генотип. Как правило, 600 насекомых тестировали за один раз. Один генотип контрольного растения тестировали 4 раза. Каждую пробирку помечали так, чтобы это не указывало на происхождение иглы. Пробирки помещали в камеру с контролируемыми внешними условиями (22°C, 55% RH, 16 час день) на 48 час, до времени, в которое деревянные штативы помещали в морозильную камеру. Измеряли количество несъеденных игл, ширину головной капсулы и массы замороженных личинок. Определяли массы гусениц листовертки-почкоеда и остатков игл, и ширину головных капсул гусениц листовертки-почкоеда.Caterpillars of spruce bud-leaf buds at the second larval stage were placed in test tubes containing an artificial diet (McMorran, 1965). They were maintained in a growth chamber at 22 ° C, 55% RH with a 16 hour light / day for 1-2 days until they reached the head capsule width 0.4 ± 0.1 mm ^(3rd larval stage). This is the stage at which they will consume succulent needles. Lots of 60-70 larvae were combined and carefully mixed manually to randomly distribute animals from their original growth tubes. Then, a separate caterpillar of the kidney-leaf beetle was placed in each tube. From a well-mixed pool of frozen needles, 100 of similar size and weight collected near the inoculation point of the test seedling were tested, plus 100 control needles per genotype. Typically, 600 insects were tested at a time. One genotype of the control plant was tested 4 times. Each tube was labeled so that it did not indicate the origin of the needle. The tubes were placed in a chamber with controlled environmental conditions (22 ° C, 55% RH, 16 hours a day) for 48 hours, before the time at which the wooden racks were placed in the freezer. The number of uneaten needles, the width of the head capsule, and the mass of frozen larvae were measured. The weights of the caterpillars of the kidney-leaf beetle and the remains of the needles, and the width of the head capsules of the caterpillars of the leaf-beetle were determined.

Для эндофита деревьев 5WS22E1 на деревьях в возрасте как 2, так и 3 года, проводили тесты по росту выращенных на рационе свободных от заболеваний личинок гусеницы листовертки-почкоеда елового на второй личиночной стадии следующим образом. Определенное количество гусениц листовертки-почкоеда помещали вручную на боковые ветви с почками и затем покрывали сеткой как положительные, так и отрицательные по эндофитам деревья. Датчики температуры помещали в зону содержания, и прогресс мониторировали, пока гусеница листовертки-почкоеда не превышала шестой личиночной стадии. По окончании насекомых собирали, замораживали для последующих определений ширины головной капсулы и замороженной массы. Собирали образцы для анализа токсина, чтобы убедиться, что не присутствовало ошибочной классификации деревьев по их эндофитному статусу. Масса гусениц листовертки-почкоеда на инфицированных деревьях являлась значительно сниженной по сравнению с массой на контрольных деревьях.For the endophyte of 5WS22E1 trees on trees aged 2 and 3 years old, tests were carried out on the growth of larvae of the spider leaf bud-caterpillar spruce caterpillar grown on the diet free of diseases at the second larval stage as follows. A certain number of caterpillars of the kidney-leaf beetle were placed manually on the lateral branches with buds and then covered with a net both positive and negative for endophytes trees. Temperature sensors were placed in the containment zone, and progress was monitored until the caterpillar of the leaf bud-beetle eater did not exceed the sixth larval stage. At the end of the insects were collected, frozen for subsequent determinations of the width of the head capsule and frozen mass. Samples were collected for toxin analysis to ensure that there was no erroneous classification of trees by their endophytic status. The mass of caterpillars of the kidney-leaf beetle on infected trees was significantly reduced compared to the mass on control trees.

Пример 4Example 4

Детекция эндофита 5WS11/1Endophyte Detection 5WS11 / 1

Поликлональное антитело, используемое для детекции эндофита 5WS1111, получали, как описано выше для 5WS22E1.The polyclonal antibody used to detect 5WS1111 endophyte was prepared as described above for 5WS22E1.

В условиях анализа, описанных выше, предел количественного определения и предел детекции намеченного эндофита 5WS11/1 оба составляли 30 нг клеток на лунку. На протяжении диапазона концентраций один log, для антитела показали линейный ответ на 60 нг намеченного эндофита (фигура 1; представлены результаты экспериментов в трех параллелях). Относительная перекрестная реактивность на 15, 30, 60, 120 и 240 нг клеток видов филлопланы являлась умеренной (>10%). В том же самом диапазоне присутствовала немного большая перекрестная реактивность с клетками двух тестированных эндофитов белой ели (~5%). Даже для 240 нг клеток ответ был ≥ используемого порога 1 единица поглощения. Ответ поликлонального антитела на вышеуказанный диапазон не являющихся мишенью грибковых клеток являлся нелинейным в диапазоне концентраций антитела. Ответ на 60, 100 и 500 нг клеток белой ели снова в диапазоне концентраций антитела являлся умеренным (>10%) и также нелинейным. Сравнение ответа на 60 нг не являющихся мишенью клеток с ответом на намеченный эндофит приведено на фигуре 1; среднее относительное стандартное отклонение для параллелей, включенных в эти данные, составляло 6%.Under the assay conditions described above, the quantification limit and the detection limit of the target 5WS11 / 1 endophyte were both 30 ng cells per well. Over a single log concentration range, the antibodies showed a linear response to 60 ng of the intended endophyte (Figure 1; experimental results are presented in three parallels). The relative cross-reactivity of 15, 30, 60, 120, and 240 ng cells of the phylloplan species was moderate (> 10%). In the same range, slightly greater cross-reactivity was present with the cells of two tested white spruce endophytes (~ 5%). Even for 240 ng cells, the response was ≥ used threshold of 1 unit of absorption. The response of the polyclonal antibody to the above range of non-target fungal cells was non-linear in the range of antibody concentrations. The response to 60, 100 and 500 ng white spruce cells again in the antibody concentration range was moderate (> 10%) and also non-linear. Comparison of the response to 60 ng of non-target cells with the response to the intended endophyte is shown in figure 1; the average relative standard deviation for the parallels included in this data was 6%.

На фигуре 4 показано, что на количественное определение намеченного эндофита не влияло присутствие больших количеств порошкообразных лиофилизированных игл (~2-18 x). По ANOVA с тестом LSD Фишера ответ на 500 нг материала игл плюс 30 нг намеченного эндофита значимо превышал ответ на комбинацию с 15 нг (p=0,000), так же как все значения выше. Все оставшиеся значения p между добавлениями клеток эндофита игл составляли >0,003. Значения поглощения для 30, 60, 120 и 240 нг намеченного эндофита плюс материал игл и для одного грибка высоко коррелировали r=0,973 (p>0,000), показывая, что присутствие игл не влияет на линейность анализа (фигура 5; представлены результаты экспериментов в трех параллелях).Figure 4 shows that the quantification of the intended endophyte was not affected by the presence of large quantities of powdered lyophilized needles (~ 2-18 x). According to ANOVA with the Fisher LSD test, the response to 500 ng of needle material plus 30 ng of the intended endophyte significantly exceeded the response to the combination with 15 ng (p = 0,000), as well as all values above. All remaining p values between needle endophyte cell additions were> 0.003. Absorption values for 30, 60, 120, and 240 ng of the intended endophyte plus needle material and for one fungus were highly correlated r = 0.973 (p> 0.000), showing that the presence of needles does not affect the linearity of the analysis (Figure 5; the results of experiments in three parallels).

Пример 5Example 5

Получение инокулята эндофитаGetting endophyte inoculum

Культуры инокулировали посредством измельчения конуса 2% агара с экстрактом солода в стерильной деионизированной воде в асептических условиях и добавления полученной суспензии 5% об./об. в 250 мл колбы Эрленмейера, содержащие 2% экстракт солода в деионизированной воде. Их инкубировали в течение 2 недель при 25°C в встряхивателе (проход 3,81 см, 220 об/мин). Их в свою очередь измельчали и добавляли в ферментер с перемешиваемым баком, адаптированный для роста мицелиальных грибов, содержащий среду с 1% экстрактом солода, аэрируемый при 0,1 об./об. в минуту при перемешивании 280 об/мин и 21°C в течение 7 суток. Число клеток рассчитывали для обеспечения того, чтобы каждый сеянец получил 10 пропагул, как вводят в теплице на стадии восприимчивости растения, вводимых в условиях внешней среды, которые поддерживают влажность игл.The cultures were inoculated by grinding a cone of 2% agar with malt extract in sterile deionized water under aseptic conditions and adding the resulting suspension of 5% v / v. in a 250 ml Erlenmeyer flask containing 2% malt extract in deionized water. They were incubated for 2 weeks at 25 ° C in a shaker (3.81 cm passage, 220 rpm). They, in turn, were crushed and added to a fermenter with a stirred tank, adapted for the growth of mycelial fungi, containing medium with 1% malt extract, aerated at 0.1 vol./about. per minute with stirring 280 rpm and 21 ° C for 7 days. The number of cells was calculated to ensure that each seedling received 10 propagules, as introduced into the greenhouse at the susceptibility stage of the plant, introduced in the environment, which maintain the humidity of the needles.

При условии, что их вводят во время стадии восприимчивости сеянца - окна времени чувствительности, такие инокуляции являются эффективными, являются ли сеянцы легко пораненными или нетронутыми.Provided that they are introduced during the susceptibility stage of the seedling — the sensitivity time window, such inoculations are effective whether the seedlings are lightly wounded or intact.

В случае 5WS22E1 и 5WS11/1 добавление малых количеств (мг на сеянец) облученных игл, колонизированных, как описано выше, в почву на делянках, используемых для коммерческого получения сеянцев, является эффективным для создания непрямого контакта между иглами и сеянцами для инокуляции сеянцев, при условии, что инокуляция и сеянцы находятся в стадии восприимчивости.In the case of 5WS22E1 and 5WS11 / 1, the addition of small amounts (mg per seedling) of irradiated needles, colonized as described above, to the soil on plots used for the commercial production of seedlings, is effective for creating indirect contact between the needles and seedlings to inoculate seedlings, provided that inoculation and seedlings are susceptible.

Пример 6Example 6

Способ инокуляции - стратификация семянInoculation Method - Seed Stratification

Способ инокуляции сеянцев включает в себя добавление клеток к семенам во время процесса стратификации. Это процесс, при котором семена деревьев замачивают в воде до прорастания для впитывания воды и подготовки к прорастанию семян. Способ включает в себя добавление промытых клеток токсикогенного эндофита, полученных при ферментации, как выше, т.е. добавление грибковых клеток, собранных из ферментера, центрифугированных и ресуспендированных в стерильной воде с последующим немедленным добавлением в пакеты для стратификации семян на стадии замачивания в питомнике. В одном варианте осуществления семена замачивают в воде, содержащей инокулят, перед высеванием в теплицу во время стратификации семян.A method of inoculating seedlings involves adding cells to the seeds during the stratification process. This is a process in which tree seeds are soaked in water before germination to absorb water and prepare for seed germination. The method includes adding washed toxicogenic endophyte cells obtained by fermentation, as above, i.e. the addition of fungal cells collected from the fermenter, centrifuged and resuspended in sterile water, followed by immediate addition to the seed stratification bags at the stage of soaking in the nursery. In one embodiment, the seeds are soaked in water containing the inoculum before sowing in the greenhouse during stratification of the seeds.

Пример 7Example 7

Инокуляция эндофитом с использованием ограниченного окна времениEndophyte Inoculation Using a Limited Time Window

Репродукция инфицированных сеянцевReproduction of infected seedlings

Сеянцы, полученные для всех испытаний в питомнике, выращивали с использованием общепринятых контейнерных способов получения сеянцев. Каждый пластиковый контейнер с твердыми стенками содержал 726 см² с 67 лунками на контейнер. Отдельные лунки составляли 65 см³ по объему. Поддоны заполняли смесью 3:1 сфагнума и вермикулита, и семена высевали поверх этой среды. Семена покрывали тонким слоем песка из доломитового известняка, и поддоны слегка смачивали до насыщения. Теплицу затуманивали с помощью тонких сопл в поливочной штанге для поддержания поверхности среды влажной. Семена прорастают в течение двух недель. Внесение растворимого сбалансированного удобрения производится, когда начинают формироваться боковые корни (3 недели после посева). Сеянцы ели будут, как правило, составлять 3 см в высоту через 8 недель после посева (см. фигуру 6).Seedlings obtained for all trials in the nursery were grown using conventional container methods for producing seedlings. Each plastic container with solid walls contained 726 cm ² with 67 wells per container. Individual wells were 65 cm ³ by volume. The trays were filled with a 3: 1 mixture of sphagnum and vermiculite, and seeds were sown on top of this medium. Seeds were covered with a thin layer of dolomite limestone sand, and the trays were slightly wetted until saturated. The greenhouse was fogged with thin nozzles in a watering rod to keep the surface of the environment moist. Seeds germinate within two weeks. A soluble balanced fertilizer is applied when the lateral roots begin to form (3 weeks after sowing). Spruce seedlings will usually be 3 cm tall 8 weeks after sowing (see Figure 6).

Экспериментальную инокуляцию опрыскиванием (для 50 контейнеров с сеянцами) осуществляли смешиванием 350 мл культур грибов с 175 мл стерильной воды в течение 10 секунд. Полученный раствор добавляли в стерильный аэрозольный баллон со спусковым механизмом. Всю смесь распыляли равномерно над 50 контейнерами. Функциональное введение в пилотном масштабе проводили с использованием общепринятого в теплице передвижного штангового опрыскивателя и инжекторного насоса для инъекции раствора культуры грибков на линию орошения. Штанга была шириной 28 футов и имела 22 сопла T Jet 11004VH. Культуру инъецировали с использованием инжектора Dosatron (Dosatron International Inc. Florida) с производительностью 11 галлонов/минуту. Коэффициент инжекции составлял 1:64 при 35 psi. Введение проводили вечером, так что листва оставалась влажной в течение наиболее длинного периода времени. Введения проводили в два последовательных вечера с 3 проходами, выполненными штангой через всю теплицу каждый вечер. Предпринимали шаги, чтобы убедиться, что влажность игл поддерживается 12 час после инокуляции без смывания инокулята с игл.Experimental inoculation by spraying (for 50 containers with seedlings) was carried out by mixing 350 ml of mushroom cultures with 175 ml of sterile water for 10 seconds. The resulting solution was added to a sterile aerosol can with a trigger. The entire mixture was sprayed evenly over 50 containers. Functional introduction on a pilot scale was carried out using a commonly used mobile boom sprayer and an injection pump for injecting a fungal culture solution onto an irrigation line. The boom was 28 feet wide and had 22 T Jet 11004VH nozzles. The culture was injected using a Dosatron injector (Dosatron International Inc. Florida) at a rate of 11 gallons / minute. The injection ratio was 1:64 at 35 psi. The administration was carried out in the evening, so that the foliage remained moist for the longest period of time. Introductions were carried out on two consecutive evenings with 3 passes made by a barbell through the entire greenhouse every evening. Steps were taken to ensure that the humidity of the needles was maintained 12 hours after inoculation without rinsing the inoculum from the needles.

С 2000 г. проводили серию тестов среднего масштаба для определения оптимального времени для инокуляции. Инокуляцию осуществляли с использованием сеянцев с ранениями или без с использованием культивированных клеток или клеток на облученных иглах, как выше. Объединенные данные из многих испытаний 5WS22E1 показали, что существует период максимальной восприимчивости, независимо от способа введения инокулята (Фигура 6), который тестировали через 3 месяца после инокуляции, или в случаях, где существует больше данных, через 6 месяцев, когда поддающаяся детекции колонизация приблизительно удваивается (Sumarah et al., 2005).Since 2000, a series of medium-scale tests have been performed to determine the optimal time for inoculation. Inoculation was carried out using seedlings with or without wounds, using cultured cells or cells on irradiated needles, as above. The combined data from many of the 5WS22E1 tests showed that there is a period of maximum susceptibility, regardless of the method of administration of the inoculum (Figure 6), which was tested 3 months after inoculation, or in cases where there is more data, after 6 months, when a detectable colonization is approximately doubles (Sumarah et al., 2005).

Пример 8Example 8

Инокуляция в массовом масштабеMass inoculation

Сеянцы в масштабе тысяч можно инокулировать вручную. Растения порядка 30 миллионов сеянцев в год нельзя легко инокулировать вручную. Проверенный способ для инфекции игл эндофитом, хотя с низкой степенью успешности, представлял собой раневую инокуляцию молодых сеянцев. Эндофиты травы переносят посредством семян, так что способы, применимые для трав, неприменимы для инокуляции сеянцев хвойных.Thousands of seedlings can be inoculated manually. Plants of the order of 30 million seedlings per year cannot be easily inoculated manually. A proven method for needle infection with endophyte, although with a low degree of success, was wound inoculation of young seedlings. Grass endophytes are transported through seeds, so the methods applicable to herbs are not applicable for inoculation of coniferous seedlings.

Данные анализировали следующим образом. Из сохраняемых образцов игл с 340 деревьев, положительных по культивированию и ELISA, случайную выборку из 113 положительных по ELISA сеянцев анализировали по ругулозину; большинство (90%) содержали поддающиеся детекции концентрации ругулозина. Диапазон и распределение концентраций ругулозина являлось сходным с обнаруженными в более ранних тестах, выполненных в вегетационных камерах (Measurement of a rugulosin-producing endophyte in white spruce seedlings (Sumarah et al., 2005).The data were analyzed as follows. From stored needle samples from 340 trees positive for cultivation and ELISA, a random sample of 113 seedlings positive for ELISA was analyzed by rugulosin; most (90%) contained detectable concentrations of rugulosin. The range and distribution of rugulosin concentrations was similar to that found in earlier tests performed in vegetation chambers (Measurement of a rugulosin-producing endophyte in white spruce seedlings (Sumarah et al., 2005).

Поскольку полный анализ распределения эндофита нельзя провести на деревьях в полевых условиях, 10 инокулированных сеянцев, которые тестировали как положительные в испытании инокуляции 2003 г., и 10 инокулированных сеянцев, которые являлись отрицательными по ELISA через 3 месяца, оставили в горшках в питомнике для роста в течение дополнительного года. Каждую ветвь собирали отдельно для анализа ругулозина посредством ELISA. Присутствовало меняющееся число ветвей (11-20), которые тщательно помечали в соответствии с их положением на каждом из 20 деревьев, и все анализировали по ругулозину (~160 образцов). Все инокулированные деревья, которые являлись отрицательными по ELISA, являлись положительными через приблизительно 1 год. Это показывает, что действительный успех инокуляции значительно занижен при анализе через 3 месяца. Некоторую степень ложноотрицательных результатов из испытаний инокуляции отметили как проблему со времени исходных исследований инокуляции в 1999-2002 гг. Эти данные также придают лучший смысл скорости распространения и, как наблюдали на деревьях в полевых условиях, подтверждают его персистенцию. Показано, что эндофит и его токсин хорошо распределяются между ветвями нового и старого роста.Since a complete analysis of the distribution of endophyte cannot be performed on trees under field conditions, 10 inoculated seedlings, which were tested as positive in the 2003 inoculation test, and 10 inoculated seedlings, which were negative by ELISA after 3 months, were left in pots in the nursery for growth in for an extra year. Each branch was collected separately for analysis of rugulosin by ELISA. There was a changing number of branches (11–20), which were carefully labeled according to their position on each of the 20 trees, and all were analyzed by rugulosin (~ 160 samples). All inoculated trees that were negative by ELISA were positive after approximately 1 year. This shows that the actual success of inoculation is significantly underestimated when analyzed after 3 months. Some degree of false negative results from inoculation tests was noted as a problem since the initial inoculation studies in 1999-2002. These data also give a better sense of the propagation speed and, as observed on trees in the field, confirm its persistence. It was shown that endophyte and its toxin are well distributed between the branches of new and old growth.

Анализ показал присутствие ругулозина, так же как производного ругулозина. Это либо продукт деградации ругулозина, либо модифицированная растением форма ругулозина. В подобных ситуациях известно, что растения модифицируют грибковые метаболиты in vivo для защиты их собственных клеток от повреждения без влияния на токсичность соединения.Analysis revealed the presence of rugulosin, as well as a derivative of rugulosin. This is either a degradation product of rugulosin, or a plant-modified form of rugulosin. In such situations, it is known that plants modify fungal metabolites in vivo to protect their own cells from damage without affecting the toxicity of the compound.

Проведены испытания 5WS22E1, включающие в себя последовательные инокуляции игл и/или последовательные инокуляции с нарезанием и опрыскиванием, т.е. от 10 мм, 20 мм, 30 мм, 40 мм и 50 мм высоты или подобного прорастания до нескольких недель (см. фигуру 6). В каждом испытании получали свежий инокулят и транспортировали в Суссекс, поскольку существовало доказательство, что сохранение инокулята после получения при 5°C приводило к сниженной жизнеспособности со временем хранения. Образцы игл анализировали (~2500 образцов). Анализ данных подтвердил, что либо инокуляции посредством нарезания и опрыскивания, либо добавление игл, колонизированных намеченным грибком, в контейнеры с сеянцами, либо только опрыскивание приводят к положительным результатам. Скорость колонизации за три месяца являлась наиболее высокой при первых двух обработках, но не намного меньше в тестах одного опрыскивания. В конечном счете в нескольких исследованиях по данному вопросу, возвращаясь к периоду 1999-2002 гг., степень успешности по высоте сеянца падала после пика между >3 см и 4 см. Поскольку присутствовали измерения сеянцев скорее с наиболее высокой исходной инфекцией, чем общая скорость, в настоящее время существуют небольшие сомнения относительно скорости для эндофита 5WS22E1.5WS22E1 tests were carried out, including sequential inoculations of needles and / or sequential inoculations with cutting and spraying, i.e. from 10 mm, 20 mm, 30 mm, 40 mm and 50 mm in height or similar germination up to several weeks (see figure 6). In each test, a fresh inoculum was obtained and transported to Sussex, as there was evidence that maintaining the inoculum after preparation at 5 ° C led to reduced viability over time. Needle samples were analyzed (~ 2500 samples). An analysis of the data confirmed that either inoculation by cutting and spraying, or by adding needles colonized by the intended fungus to containers with seedlings, or only spraying lead to positive results. The colonization rate over three months was the highest in the first two treatments, but not much less in single spray tests. Ultimately, in several studies on this issue, returning to the period 1999-2002, the degree of success in seedling height fell after a peak between> 3 cm and 4 cm. Since measurements of seedlings were present with the highest initial infection rather than the total rate, There is currently little doubt about speed for the 5WS22E1 endophyte.

Испытания инокуляции второго штамма эндофита 5WS11/1 проведены, но доступны для анализа только с последней четверти 2004 г. Они включали в себя способы нарезания и опрыскивания, и инокуляции колонизированных игл. Их анализировали (700 образцов) и теоретические показатели успеха колонизации являлись сходными с показателями для 5WS22E1 (вид, для которого существовали >6 лет опыта), т.е. ~1/3 положительных. Подобным образом подтвердили эффект возраста (высоты) сеянца.Tests of inoculation of the second strain of endophyte 5WS11 / 1 have been conducted, but are available for analysis only from the last quarter of 2004. They included methods of cutting and spraying, and inoculation of colonized needles. They were analyzed (700 samples) and theoretical success rates of colonization were similar to those for 5WS22E1 (a species for which> 6 years of experience existed), i.e. ~ 1/3 positive. Similarly, the effect of the seedling's age (height) was confirmed.

Пример 9Example 9

Распространение инокулированных штаммовDistribution of inoculated strains

В качестве необходимого условия использования этого способа в полевых условиях необходим тестовый участок, где развитие инокулированных деревьев можно повторно тестировать в течение периода 5 лет.As a necessary condition for using this method in the field, a test site is needed where the development of inoculated trees can be retested for a period of 5 years.

Считают, что эти эндофиты переносятся в природе при сбрасывании игл с колонизированных деревьев. Чтобы ответить на этот вопрос, молодые сеянцы будут посажены вблизи колонизированных развивающихся деревьев.It is believed that these endophytes are transported in nature when dropping needles from colonized trees. To answer this question, young seedlings will be planted near colonized developing trees.

Весной 2000 г. ~1200 сеянцев инокулировали 5WS22E1. Из всей этой работы 340 деревьев являлись колонизированными эндофитами. Деревья инокулировали и культивировали в питомнике Суссекса в нормальных условиях. Их пересаживали и сохраняли на запасном участке. В августе 2003 г. 300 деревьев в возрасте четырех лет высаживали с большими промежутками, чем обычно. В июле 2004 г. 5 маленьких сеянцев высаживали вблизи 50 положительных по 5WS22E1 деревьев. Сетки помещали вблизи дополнительных 50 тестируемых деревьев для сбора опадающих игл.In the spring of 2000, ~ 1200 seedlings were inoculated with 5WS22E1. Of all this work, 340 trees were colonized endophytes. Trees were inoculated and cultivated in a Sussex nursery under normal conditions. They were transplanted and kept on a spare site. In August 2003, 300 trees at the age of four were planted at longer intervals than usual. In July 2004, 5 small seedlings were planted near 50 positive 5WS22E1 trees. Nets were placed near an additional 50 test trees to collect falling needles.

Приблизительно 300 мг (сухая масса) игл удаляли из каждой из ветвей в возрасте одного, двух и трех лет, так же как две дополнительные ветви тестировали на присутствие эндофита 5WS22E1 посредством ELISA и ругулозина посредством ВЭЖХ. Эти образцы игл анализировали в 2005 г. Все деревья являлись положительными для грибов и токсинов в пределах каждого из классов возраста игл на дереве. В соответствующих пределах детекции (30 нг для эндофита; 150 нг/г для токсина), 63% образцов из индивидуальных ветвей являлись положительными для эндофита по ELISA, и 89% являлись положительными либо для ругулозина, либо для продукта его деградации, и только 1 ветвь являлась отрицательной для обоих. Концентрация ругулозина являлась несколько более высокой в деревьях в полевых условиях, чем в предыдущих исследованиях, однако, деревья были старше и более адаптированными. Средняя концентрация была точно на уровне эффекта для гусеницы листовертки-почкоеда елового и варьировала между деревьями, но отклонений по отношению к либо более старым, либо более новым ветвям не обнаружили. Опавшие иглы, собранные в сетки вблизи этих деревьев, тестировали и не обнаружили какого-либо присутствующего токсина.Approximately 300 mg (dry weight) needles were removed from each of the branches at the age of one, two and three years, just as two additional branches were tested for the presence of 5WS22E1 endophyte by ELISA and rugulosin by HPLC. These needle samples were analyzed in 2005. All trees were positive for fungi and toxins within each of the needle age classes on the tree. Within the corresponding detection limits (30 ng for endophyte; 150 ng / g for toxin), 63% of samples from individual branches were positive for endophyte by ELISA, and 89% were positive for either rugulosin or its degradation product, and only 1 branch was negative for both. The concentration of rugulosin was somewhat higher in trees under field conditions than in previous studies, however, the trees were older and more adapted. The average concentration was exactly at the level of the effect for the caterpillar of the spruce bud-leaves, and varied between trees, but no deviations were found with respect to either the older or newer branches. Fallen needles collected in nets near these trees were tested and did not detect any toxin present.

Пример 10Example 10

Инокуляция продуцирующим вермикулин штаммом 5WS11/1Inoculation with a producing vermiculin strain 5WS11 / 1

Продуцирующий вермикулин штамм 5WS11/1 выбрали в качестве второго штамма-кандидата (Mycological Research 106:47). Разработали поликлональное антитело для определения грибка. Весной 2004 г. сеянцы инокулировали.Vermiculin-producing strain 5WS11 / 1 was selected as the second candidate strain (Mycological Research 106: 47). A polyclonal antibody was developed to determine the fungus. In the spring of 2004, seedlings were inoculated.

Испытания инокуляции с использованием продуцирующего вермикулин эндофита обладали трехмесячной долей успешных попыток по ELISA, приблизительно на 30% сходной с эндофитом 5WS22E1. Из опыта, вероятно, что 6-8-месячная доля успешных попыток будет намного большей, снова из-за того, что распространение эндофитов является медленным.Inoculation tests using a vermiculin-producing endophyte had a three-month success rate by ELISA, approximately 30% similar to the 5WS22E1 endophyte. From experience, it is likely that the 6–8-month success rate will be much higher, again because the spread of endophytes is slow.

Поскольку вермикулин обладает непримечательным УФ-спектром, количественное определение этого химического вещества является более трудным, чем определение для ругулозина. В ходе этой работы являлись необходимыми улучшения аналитического способа, так как естественным образом контаминированные образцы стали доступными в первый раз (эксперименты по развитию предыдущего способа проведены по необходимости с добавлением контрольных игл). Это означает, что некоторое обнаружение действительной концентрации вермикулина в естественным образом контаминированном материале получены впервые. Более ранние эксперименты с добавлением игл проведены по необходимости в диапазоне концентраций, которые имеют смысл по сравнению с концентрациями ругулозина, которые, как оказалось, являлись немного слишком высокими.Since vermiculin has an unremarkable UV spectrum, quantifying this chemical is more difficult than determining for rugulosin. In the course of this work, it was necessary to improve the analytical method, since naturally contaminated samples became available for the first time (experiments on the development of the previous method were carried out as necessary with the addition of control needles). This means that some detection of the actual concentration of vermiculin in a naturally contaminated material was obtained for the first time. Earlier experiments with the addition of needles were carried out, if necessary, in a range of concentrations that make sense compared to the concentrations of rugulosin, which, as it turned out, were a little too high.

Через три месяца после инокуляции являлось невозможным детектировать вермикулин в отрицательных по ELISA образцах. Из положительных по ELISA сеянцев 30% содержали вермикулин. Этим впервые показали, что этот токсин продуцируется in vivo и может представлять собой один из эндофитов, используемых для инокуляции.Three months after inoculation, it was not possible to detect vermiculin in ELISA negative samples. Of the ELISA positive seedlings, 30% contained vermiculin. This was the first to show that this toxin is produced in vivo and may be one of the endophytes used for inoculation.

По существу все из эндофитов белой ели, выделенных в настоящем проекте в лаборатории Суссекса, культивировали и анализировали посредством ВЭЖХ по продукции метаболита. Из них 30 обладали интересными профилями на основании ответа детектора с диодной матрицей (измеряет УФ-спектр каждого соединения, проходящего через детектор). Экстракты с наиболее высоким общим количеством соединения подвергали скринингу с использованием Оксфордовского анализа для токсичности против дрожжей. Хотя дрожжи не являются насекомыми, Saccharomyces cerevisiae являются эукариотами. Из них пять продуцировали соединения с разумной активностью. Посредством ВЭЖХ, масс-спектроскопии и ЯМР показано, что соединения являются комплексными. Одно из них, 05-037A, являлось наиболее активным в анализе на дрожжах, и показано, что обнаруженные соединения являются комплексными и неродственными другим токсинам эндофитов, обнаруженным до настоящего времени. Их выращивали в крупномасштабной ферментации (5 л), экстрагировали и выделяли метаболиты с использованием различных способов, включая препаративную тонкослойную хроматографию, препаративную ВЭЖХ и колоночную хроматографию. Соединения все, как правило, являлись небольшими по молекулярной массе <350 (233, 237, 309, 221, 154, 218) и лежали в диапазоне от умеренно полярных до неполярных. Последняя необходимая стадия представляла собой дополнительную очистку для получения выделенного метаболита для полного определения структуры. Этот штамм выращивали в культуре в достаточном масштабе, чтобы позволять выделение и характеризацию его метаболитов.Essentially, all of the white spruce endophytes isolated in this project in the Sussex laboratory were cultured and analyzed by HPLC for metabolite production. Of these, 30 had interesting profiles based on the response of a diode array detector (it measures the UV spectrum of each compound passing through the detector). The extracts with the highest total amount of the compound were screened using the Oxford analysis for toxicity against yeast. Although yeast is not an insect, Saccharomyces cerevisiae are eukaryotes. Of these, five produced compounds with reasonable activity. By means of HPLC, mass spectroscopy and NMR, it was shown that the compounds are complex. One of them, 05-037A, was the most active in the analysis on yeast, and it was shown that the detected compounds are complex and unrelated to other endophyte toxins found to date. They were grown in large-scale fermentation (5 L), extracted and metabolites were isolated using various methods, including preparative thin layer chromatography, preparative HPLC and column chromatography. All compounds, as a rule, were small in molecular weight <350 (233, 237, 309, 221, 154, 218) and ranged from moderately polar to nonpolar. The last necessary step was an additional purification to obtain an isolated metabolite to fully determine the structure. This strain was grown in culture on a sufficient scale to allow the isolation and characterization of its metabolites.

Пример 11Example 11

Частота инокуляции и персистенция грибковых эндофитовThe frequency of inoculation and persistence of fungal endophytes

Десять инокулированных сеянцев, протестированных как положительные в испытании инокуляции в 2003 г., и 10 инокулированных сеянцев, которые являлись отрицательными по ELISA через 3 месяца, оставляли в горшках в питомнике для роста в течение дополнительного года. Каждую ветвь собирали отдельно для анализа посредством ELISA по ругулозину. Присутствовало вариабельное число ветвей (11-20), которые тщательно помечали в соответствии с их положением на каждом из 20 деревьев, и все анализировали по ругулозину (~160 образцов). Все инокулированные деревья, которые являлись отрицательными по ELISA, являлись положительными спустя приблизительно 1 год. Это показывает, что действительный успех инокуляции значительно занижен при анализе через 3 месяца. Эти данные также придают лучший смысл скорости распространения и, как наблюдали на деревьях в полевых условиях, подтверждают его персистенцию. Это являлось очень полезным, чтобы показать, что эндофит и его токсин хорошо распределяются между ветвями нового и старого роста.Ten inoculated seedlings tested as positive in the inoculation test in 2003 and 10 inoculated seedlings that were negative by ELISA after 3 months were left in pots in the nursery for growth for an additional year. Each branch was collected separately for analysis by ELISA for rugulosin. There was a variable number of branches (11–20), which were carefully labeled according to their position on each of the 20 trees, and all were analyzed by rugulosin (~ 160 samples). All inoculated trees that were negative by ELISA were positive after approximately 1 year. This shows that the actual success of inoculation is significantly underestimated when analyzed after 3 months. These data also give a better sense of the propagation speed and, as observed on trees in the field, confirm its persistence. This was very useful to show that the endophyte and its toxin are well distributed between the branches of new and old growth.

Пример 12Example 12

Выделение токсикогенных эндофитов красной елиIsolation of Toxicogenic Red Spruce Endophytes

Множество токсикогенных эндофитов, которые инфицируют белую ель, идентифицировали и частично секвенировали. Они включают в себя штаммы, идентифицированные в таблице 1. Кроме того, идентифицировали другие эндофиты белой ели и некоторые эндофиты красной ели, которые продуцируют токсины против насекомых. Целью являлось получить сравнительную коллекцию эндофитов красной ели и провести их скрининг по метаболитам против насекомых. Культивировали приблизительно 70 эндофитов и подвергали предварительному скринингу метаболитов. Получали фракции для гусениц листовертки-почкоеда и дополнительных химических анализов.Many toxicogenic endophytes that infect white spruce have been identified and partially sequenced. They include the strains identified in Table 1. In addition, other white spruce endophytes and some red spruce endophytes that produce insect toxins have been identified. The aim was to obtain a comparative collection of endophytes of red spruce and screen them for metabolites against insects. About 70 endophytes were cultured and pre-screened for metabolites. Fractions were obtained for caterpillars of the leaf bud-beetle and additional chemical analyzes.

Экстракты из 70 штаммов эндофитов красной ели, так же как и некоторых штаммов эндофитов белой ели, для которых проводили качественный скрининг по продукции потенциальных метаболитов против насекомых и для которых существовали данные последовательности ДНК, включали в синтетический рацион. Их по отдельности наливали в небольшие контейнеры (молочники) и позволяли затвердеть. Гусениц листовертки-почкоеда елового на второй личиночной стадии добавляли в небольшие контейнеры, содержащие экстракты эндофитов, так же как содержащие контроли, и ругулозин использовали в качестве положительного контроля.Extracts from 70 strains of red spruce endophytes, as well as some strains of white spruce endophytes, for which qualitative screening was carried out for the production of potential metabolites against insects and for which these DNA sequences existed, were included in the synthetic diet. They were individually poured into small containers (milk jugs) and allowed to harden. Spruce bud-leaf beetle caterpillars in the second larval stage were added to small containers containing endophyte extracts as well as controls, and rugulosin was used as a positive control.

Тестированиями с использованием анализа гусениц листовертки-почкоеда елового обнаружили, что некоторые выделенные штаммы эндофитов являлись токсичными. Выделенные штаммы эндофитов, для которых обнаружили токсичность с использованием этого анализа, включают в себя 06-264A, 06-332A, 08-011D, 06-268A, 07-013D, 01-002A, 06-268A, 03-020B, 04-012A, 06-063D, 06-073C, 02-002C, 06-094E, 06-219A, 06-264A и 06-255A.Tests using analysis of spruce bud-leaf beetle caterpillars revealed that some isolated endophyte strains were toxic. Isolated endophyte strains for which toxicity was detected using this assay include 06-264A, 06-332A, 08-011D, 06-268A, 07-013D, 01-002A, 06-268A, 03-020B, 04- 012A, 06-063D, 06-073C, 02-002C, 06-094E, 06-219A, 06-264A and 06-255A.

Пример 13Example 13

Выделение токсикогенных эндофитовIsolation of Toxicogenic Endophytes

Эндофиты белой ели культивировали и анализировали посредством ВЭЖХ по продукции метаболита. Из них 30 обладали хорошими профилями на основании ответа детектора с диодной матрицей (измеряет УФ-спектр каждого соединения, проходящего через детектор). Экстракты с наиболее высоким общим количеством соединения подвергали скринингу с использованием Оксфордовского анализа для токсичности против дрожжей. Хотя дрожжи не являются насекомыми, Saccharomyces cerevisiae являются эукариотами. Из них пять продуцировали активные соединения. Посредством ВЭЖХ, масс-спектроскопии и ЯМР показано, что соединения являются комплексными. Одно из них, 05-037A, являлось наиболее активным в анализе на дрожжах (Vincent and Vicent, 1944, за исключением использования Saccharomyces cerevisiae) и показано, что обнаруженные соединения являются комплексными и неродственными другим токсинам эндофитов, обнаруженным до настоящего времени. Их выращивали в крупномасштабной ферментации (5 л), экстрагировали и выделяли метаболиты с использованием различных способов, включая препаративную тонкослойную хроматографию, препаративную ВЭЖХ и колоночную хроматографию. Соединения все, как правило, являлись небольшими по молекулярной массе <350 (233, 237, 309, 221, 154, 218) и лежали в диапазоне от умеренно полярных до неполярных. Последняя необходимая стадия представляла собой дополнительную очистку для получения выделенного метаболита для полного определения структуры. Этот штамм выращивали в культуре в достаточном масштабе, чтобы позволять выделение и характеризацию его метаболитов.White spruce endophytes were cultured and analyzed by HPLC for metabolite production. Of these, 30 had good profiles based on the response of a diode array detector (it measures the UV spectrum of each compound passing through the detector). The extracts with the highest total amount of the compound were screened using the Oxford analysis for toxicity against yeast. Although yeast is not an insect, Saccharomyces cerevisiae are eukaryotes. Of these, five produced active compounds. By means of HPLC, mass spectroscopy and NMR, it was shown that the compounds are complex. One of them, 05-037A, was the most active in the analysis on yeast (Vincent and Vicent, 1944, except for the use of Saccharomyces cerevisiae ) and it was shown that the compounds found were complex and unrelated to other endophyte toxins found to date. They were grown in large-scale fermentation (5 L), extracted and metabolites were isolated using various methods, including preparative thin layer chromatography, preparative HPLC and column chromatography. All compounds, as a rule, were small in molecular weight <350 (233, 237, 309, 221, 154, 218) and ranged from moderately polar to nonpolar. The last necessary step was an additional purification to obtain an isolated metabolite to fully determine the structure. This strain was grown in culture on a sufficient scale to allow the isolation and characterization of its metabolites.

Всего 62 экстракта тестировали в анализе на гусеницах листовертки-почкоеда елового плюс большое число контролей для каждого набора. Из них 11 экстрактов для белой ели являлись токсичными для гусениц листовертки-почкоеда елового (т.е. статистически отличались от контролей либо по уменьшению массы (наиболее распространено), по ширине головной капсулы, либо по обоим параметрам). В случае экстрактов красной ели, 21 являлись токсичными для гусениц листовертки-почкоеда елового. Последовательность ДНК для выделенных токсикогенных изолятов красной ели перечислена в SEQ ID NO: 6-28.A total of 62 extracts were tested in the analysis on the tracks of the spruce bud-leaf beetle plus a large number of controls for each set. Of these, 11 extracts for white spruce were toxic for spruce bud-beetle caterpillars (i.e., they statistically differed from the controls either in weight reduction (most common), in the width of the head capsule, or in both parameters). In the case of extracts of red spruce, 21 were toxic to caterpillars of spruce budworm. The DNA sequence for the isolated toxicogenic red spruce isolates is listed in SEQ ID NO: 6-28.

Пример 14Example 14

Выделение и инокуляция токсикогенных эндофитов сосныIsolation and inoculation of toxicogenic pine endophytes

Иглы сосны собирали с сосновых деревьев. Медленно растущие эндофиты культивировали из игл и проводили скрининг по присутствию токсикогенных эндофитов. Получили антитела против токсикогенных эндофитов-кандидатов. Токсикогенные эндофиты-кандидаты тестировали in vitro по их эффекту на вредителей, включая вызывающие заболевание грибки, включая серянку сосны веймутовой. Эндофиты, которые являются токсикогенными in vitro, выбирали для тестов in vivo. Получали инокулят, содержащий токсикогенный эндофит. Сеянцы сосны инокулировали инокулятом в течение окна времени чувствительности. Колонизацию позднее подтверждали с использованием теста со специфическим антителом.Pine needles were collected from pine trees. Slowly growing endophytes were cultured from needles and screened for the presence of toxicogenic endophytes. Got antibodies against toxicogenic candidate endophytes. Candidate toxigenic endophytes were tested in vitro for their effect on pests, including disease-causing fungi, including weymouth pine graysulfan. Endophytes, which are toxicogenic in vitro , were selected for in vivo tests. Received an inoculum containing toxicogenic endophyte. Pine seedlings were inoculated with the inoculum during the sensitivity time window. Colonization was later confirmed using a specific antibody test.

Пример 15Example 15

Сеянцы веймутовой сосны инокулировали токсикогенным эндофитом и колонизацию подтверждали, как описано в других местах. Колонизированные и контрольные иглы веймутовой сосны подвергали воздействию серянки сосны веймутовой. Повреждение оценивали и сравнивали с контролем. Колонизированные токсикогенным эндофитом сеянцы веймутовой сосны являлись устойчивыми к росту серянки сосны веймутовой и повреждению ею.Weymouth pine seedlings were inoculated with toxicogenic endophyte and colonization was confirmed as described elsewhere. Colonized and control needles of weymouth pine were exposed to weymouth pine grays. Damage was evaluated and compared with the control. Seedlings of weymouth pine colonized by toxicogenic endophyte were resistant to the growth of weymouth pine grays and damage by it.

Пример 16Example 16

Авторы изобретения показали роль, которую играют эндофитные грибы для ограничения пасущихся на иглах хвойных.The inventors have shown the role that endophytic fungi play in limiting conifers grazing on needles.

Успешную экспериментальную инокуляцию сеянцев P. glauca продуцирующими токсин против насекомых эндофитами игл показали в предшествующих исследованиях, проводимых в вегетационных камерах и в условиях питомника с использованием раневой инокуляции (Miller et al., 2002; Sumarah et al., 2005). В предшествующих исследованиях присутствие грибка и его токсина на иглах уменьшало скорость роста C. fumiferana. Ряд исследований проведен с тех пор авторами изобретения с продуцирующим ругулозин эндофитом 5WS22E1 (DAOM 229536, CBS 120377), сначала опубликованным как продуцирующий (+) ругулозин Calhoun et al. (1992). На основании информации о последовательности ДНК этот грибок представляет собой вид Phialocephala, родственный штаммам, ранее опубликованным как эндофитные для ели европейской (Gruenig et al., 2002).Successful experimental inoculation of P. glauca seedlings producing needle endophytes toxin against insects was shown in previous studies conducted in vegetation chambers and in a nursery using wound inoculation (Miller et al., 2002; Sumarah et al., 2005). In previous studies, the presence of the fungus and its toxin on the needles reduced the growth rate of C. fumiferana . A number of studies have since been carried out by the inventors with the rugulosin-producing endophyte 5WS22E1 (DAOM 229536, CBS 120377) first published as (+) rugulosin-producing Calhoun et al. (1992). Based on DNA sequence information, this fungus is a Phialocephala species related to strains previously published as endophytic for European spruce (Gruenig et al., 2002).

Ругулозин выделен из разнообразных грибов, включая штаммы хвойных эндофитов из штаммов, собранных авторами изобретения из Aschersonia samoensis P. Henn. (Watts et al., 2003), так же как из организма, ругулозин из которого опубликован впервые, Penicillium rugulosum Thom (Bouhet et al., 1976; Breen et al., 1955). Он является токсичным для личинок C. fumiferana на искусственном рационе (Calhoun et al., 1992) и в иглах (Miller et al., 2002). Ругулозин опубликован как токсичный для Drosophila melanogaster (Dobias et al., 1980) и для клеток яичника совки травяной, Spodoptera frugiperda (Watts et al., 2003). На основании ограниченных исследований ругулозин обладает очень низкой токсичностью для млекопитающих (LD₅₀ 55 мг кг^-1 BW ip у мышей и 44 мг кг^-1 BW у крыс; Ueno et al., 1971). Ругулозин не являлся цитотоксическим для клеток HepG2 (клетки гепатомы человека; Watts et al., 2003). Он опубликован многими авторами как антибиотик против как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий (например, Stark et al., 1978) и является умеренно противогрибковым (Breen et al., 1955).Rugulosin was isolated from a variety of fungi, including coniferous endophyte strains from strains collected by the inventors from Aschersonia samoensis P. Henn. (Watts et al., 2003), as well as from the organism from which rugulosin was first published, Penicillium rugulosum Thom (Bouhet et al., 1976; Breen et al., 1955). It is toxic to C. fumiferana larvae on an artificial diet (Calhoun et al., 1992) and on needles (Miller et al., 2002). Rugulosin has been published as toxic to Drosophila melanogaster (Dobias et al., 1980) and to the ovarian cells of the grassworm, Spodoptera frugiperda (Watts et al., 2003). Based on limited studies, rugulosin has a very low toxicity to mammals (LD ₅₀ 55 mg kg ^-1 BW ip in mice and 44 mg kg ^-1 BW in rats; Ueno et al., 1971). Rugulosin was not cytotoxic for HepG2 cells (human hepatoma cells; Watts et al., 2003). It has been published by many authors as an antibiotic against both gram-positive and gram-negative bacteria (e.g., Stark et al., 1978) and is moderately antifungal (Breen et al., 1955).

Авторы изобретения исследовали распространение и персистенцию эндофита и его токсина в деревьях, поддерживаемых в питомнике, так же как в полевых условиях. Кроме того, показаны некоторые данные о токсичности ругулозина для некоторых других видов растительноядных насекомых на P. glauca.The inventors investigated the distribution and persistence of endophyte and its toxin in trees maintained in the nursery, as well as in the field. In addition, some evidence of the toxicity of rugulosin for some other species of herbivorous insects on P. glauca is shown.

Материалы и методыMaterials and methods

Эффекты ругулозина в рационе на личинки различных насекомыхThe effects of rugulosin in the diet on the larvae of various insects

Личинки C. fumiferana (гусеница листовертки-почкоеда елового) получили из Insect Production Services, Forestry Canada (Sault Ste. Marie, ON) и хранили при 5°C. Для каждого теста выводили достаточное число личинок и помещали в молочники, содержащие 15 мл искусственного рациона. Рацион получали собственного производства (McMorran, 1965). Молочники помещали в вегетационную камеру при 22°C, 55% RH с 16 час света/сутки, пока личинки не достигали второй/третьей личиночной стадии (McGugan, 1954). Получали подходящее количество рациона, и 4 аликвоты разливали в колбы. Получали разведения чистого ругулозина в 95% этаноле для получения необходимых концентраций (540 мкл раствора в этаноле плюс контроль - носитель) и добавляли в колбы, соответственно. Рацион перемешивали с помощью мешалки и посредством пипетки, используемой для разливания среды. Две капли горячего жидкого рациона добавляли с помощью 10 мл стерильной пипетки (0,1 г сухой массы) в 4-мл конусовидные пластиковые чашки для образцов (Fisher Scientific #025444, #25444A). Пробирки, содержащие рацион и токсин, лиофилизировали для удаления этанола и регидратировали с помощью 60 мкл стерильной воды. Одну личинку помещали в каждую пробирку, которую возвращали в вегетационную камеру для кормления в течение 4 сут. Спустя 4 суток всех личинок замораживали и взвешивали на аналитических весах Mettler 163 (±0,02 мг). Предыдущие исследования показали, что замороженная масса во влажном состоянии коррелировала с сухой массой (p<0,001). Ширину головных капсул определяли с использованием стереомикроскопа при 40 × с окуляром и многоступенчатым микрометром. C. fumiferana тестировали в двух обработках, первая с концентрациями 5, 10 и 50 мкМ (75 насекомых на тестируемую концентрацию), а вторая с концентрациями ругулозина 25, 50 и 100 мкМ (75 насекомых на тестируемую концентрацию), которые повторяли.The larvae of C. fumiferana (spruce bud caterpillar caterpillar) were obtained from Insect Production Services, Forestry Canada (Sault Ste. Marie, ON) and stored at 5 ° C. For each test, a sufficient number of larvae were removed and placed in milk jugs containing 15 ml of artificial diet. Diet received their own production (McMorran, 1965). Milkworms were placed in a growing chamber at 22 ° C, 55% RH from 16 hours of light / day until the larvae reached the second / third larval stage (McGugan, 1954). A suitable diet was obtained and 4 aliquots were poured into flasks. Dilutions of pure rugulosin in 95% ethanol were obtained to obtain the necessary concentrations (540 μl of a solution in ethanol plus a control vehicle) and added to the flasks, respectively. The diet was mixed with a stirrer and with a pipette used to dispense the medium. Two drops of a hot liquid diet were added using a 10 ml sterile pipette (0.1 g dry weight) into 4 ml cone-shaped plastic sample cups (Fisher Scientific # 025444, # 25444A). Tubes containing diet and toxin were lyophilized to remove ethanol and rehydrated with 60 μl of sterile water. One larva was placed in each tube, which was returned to the vegetation chamber for feeding for 4 days. After 4 days, all larvae were frozen and weighed on a Mettler 163 analytical balance (± 0.02 mg). Previous studies have shown that frozen wet mass correlated with dry mass (p <0.001). The width of the head capsules was determined using a stereo microscope at 40 × with an eyepiece and a multi-stage micrometer. C. fumiferana was tested in two treatments, the first with concentrations of 5, 10 and 50 μM (75 insects per test concentration), and the second with concentrations of rugulosin 25, 50 and 100 μM (75 insects per test concentration), which were repeated.

Яйца Lambdina fiscellaria (пяденицы гемлоковой) закупали из Forestry Canada в трех партиях. Яйца инкубировали при комнатной температуре в течение 10 сут до появления личинок. Личинки из каждой партии появлялись в пределах двух суток друг от друга, и их немедленно помещали на рацион в молочниках, как выше. После того, как они вырастали до второй личиночной стадии (~1 неделя), личинки помещали в тестовые пробирки, следуя такому же способу, как для C. fumiferana в диапазоне концентраций 5, 10 и 50 мкМ ругулозина для первого теста и 10, 50, 100 и 150 мкМ для второго теста, которые повторяли (~67 личинок на концентрацию). После 1 недели на тестируемых рационах личинок замораживали, взвешивали и определяли ширину головной капсулы. Lambdina fiscellaria ( hemlock moth) eggs were purchased from Forestry Canada in three lots. Eggs were incubated at room temperature for 10 days until larvae appeared. Larvae from each batch appeared within two days of each other, and they were immediately placed on the diet in milk jugs, as above. After they grew to the second larval stage (~ 1 week), the larvae were placed in test tubes following the same method as for C. fumiferana in the concentration range of 5, 10 and 50 μM of rugulosin for the first test and 10, 50, 100 and 150 μM for the second test, which was repeated (~ 67 larvae per concentration). After 1 week, on the test rations, the larvae were frozen, weighed, and the width of the head capsule was determined.

Личинки Zeiraphera canadensis (листовертки-почкоеда елового) собирали из дикой природы около Суссекса в середине июня. Их немедленно помещали в тестовые пробирки и тестировали при концентрациях ругулозина 10, 50, 100 и 150 мкМ (75 на концентрацию). Через семь суток выживших личинок замораживали и измеряли.The larvae of Zeiraphera canadensis (spruce bud-leaf beetle) were collected from the wild near Sussex in mid-June. They were immediately placed in test tubes and tested at 10, 50, 100, and 150 μM rugulosin concentrations (75 per concentration). After seven days, the surviving larvae were frozen and measured.

Подготовка деревьев и испытательного участкаPreparation of trees and test site

Описание деревьев и способов инокуляции, используемых в этих экспериментах, приведены в Sumarah et al. (2005). Триста (некоторые из исходных 330 положительных погибли) положительных по эндофиту/токсину деревьев от Sumarah et al. (2005) рассевали с большими промежутками, чем обычно, на опытном участке приблизительно 30 км от Суссекс, NB, Канада. Участок обладал отличными характеристиками почвы и однородностью. Исходный тип древостоя представлял собой смешанный лес с красной елью, бальзамической пихтой, березой белой, березой желтой и кленом сахарным. Участок подготавливали для посадки с использованием одного прохода катушечного высевающего аппарата Marden и другого прохода с анкерными цепями и барабанами с лопастями в виде акульих плавников. Половину сеянцев высаживали в часть вспаханного массива, который хорошо просушивали, а другую половину высаживали в более влажную область с некоторым просачиванием воды.The trees and inoculation methods used in these experiments are described in Sumarah et al. (2005). Three hundred (some of the original 330 positive died) endophyte / toxin positive trees from Sumarah et al. (2005) scattered at wider intervals than usual at a test site approximately 30 km from Sussex, NB, Canada. The site had excellent soil characteristics and uniformity. The initial type of stand was a mixed forest with red spruce, balsamic fir, white birch, yellow birch and sugar maple. The site was prepared for planting using one passage of the Marden reel metering unit and another passage with anchor chains and shark drums with blades. Half of the seedlings were planted in part of the plowed massif, which was well dried, and the other half was planted in a more humid area with some seepage of water.

Один год спустя 250 (в возрасте пятнадцати месяцев) неинокулированных сеянцев получали, как описано ранее, из программы генетического улучшения J. D. Irving Ltd. (Sumarah et al., 2005). Их выращивали в теплице и затем перемещали в зону ожидания на открытом воздухе, где они перезимовывали. Пять из этих неинокулированных сеянцев (высотой 20-30 мм) высаживали вблизи каждого из 50 случайно выбранных деревьев из 300 высаженных в этом участке поля. После этого сетки из стекловолокна, содержащие площадь 0,25 м², помещали вблизи следующих 50 тестируемых деревьев для сбора опадающих игл.One year later, 250 (at the age of fifteen months) uninoculated seedlings were obtained, as previously described, from the genetic improvement program JD Irving Ltd. (Sumarah et al., 2005). They were grown in a greenhouse and then moved to a waiting area in the open air, where they wintered. Five of these uninoculated seedlings (20-30 mm high) were planted near each of 50 randomly selected trees from 300 trees planted in this section of the field. After that, fiberglass nets containing an area of 0.25 m ² were placed near the next 50 test trees to collect the falling needles.

Позже целые ветви, представляющие каждый класс возраста игл, собирали и замораживали от 8 случайно выбранных деревьев из исходных 300, высаженных в участке поля. В листопад следующего года собирали сходные образцы и замораживали из 8 различных деревьев из участка поля, включая ветви из классов игл от одного до трех лет (деревья были больше). Кроме того, два из маленьких сеянцев, высаженных вблизи области деревьев предыдущего года, собирали из окружения трех отобранных тестируемых деревьев. Опадающие иглы из всех доступных сеток собирали в оба года как пулированные образцы, из которых инородные материалы (камни, листья и т.д.) удаляли вручную.Later, whole branches representing each age class of needles were collected and frozen from 8 randomly selected trees from the initial 300 trees planted in the field. Similar samples were collected in the foliage next year and frozen from 8 different trees from a field site, including branches from needle classes from one to three years (the trees were larger). In addition, two of the small seedlings planted near the area of trees of the previous year were collected from the surroundings of three selected test trees. Falling needles from all available nets were collected in both years as bullet samples, from which foreign materials (stones, leaves, etc.) were manually removed.

Распределение эндофита внутри дереваEndophyte distribution within the tree

Отдельный набор из 1100 сеянцев (ранее не опубликованный) инокулировали по Sumarah et al. (2005). Через восемь месяцев их тестировали на колонизацию эндофитами по ELISA, как описано ранее. Затем эти деревья переносили в горшки и позволяли расти в питомнике Суссекса. Приблизительно через семь месяцев каждую ветвь из 10 положительных по эндофиту сеянцев и 10 отрицательных по эндофиту деревьев (на основании ранее проведенного теста ELISA) собирали, помещали в стерильные пластиковые пакеты, тщательно помечали в соответствии с высотой и направлением по компасу и замораживали.A separate set of 1,100 seedlings (not previously published) was inoculated by Sumarah et al. (2005). After eight months, they were tested for endophyte colonization by ELISA, as described previously. Then these trees were transferred to pots and allowed to grow in the Sussex nursery. After approximately seven months, each branch of 10 endophyte-positive seedlings and 10 endophyte-negative trees (based on a previous ELISA test) was collected, placed in sterile plastic bags, carefully labeled in accordance with the height and direction of the compass, and frozen.

ELISA и анализы ругулозинаELISA and analyzes of rugulosin

Иглы удаляли с ветвей, лиофилизировали и использовали как для анализа с антителом, так и для анализа токсина по Sumarah et al. (2005). Относительное стандартное отклонение положительного контроля составляло ~9%. Предел способа детекции (LOD) клеточной массы (например, для детекции антителом) составлял 60 нг г^-1, и предел количественного определения (LOQ), т.е., положительный, составлял 120 нг г^-1 сухой массы иглы. LOD и LOQ для ругулозина оба составляли 150 нг г^-1 (Sumarah et al., 2005).The needles were removed from the branches, lyophilized, and used for both antibody analysis and toxin analysis according to Sumarah et al. (2005). The relative standard deviation of the positive control was ~ 9%. The limit of the detection method (LOD) of the cell mass (for example, for antibody detection) was 60 ng g ^-1 , and the limit of quantitation (LOQ), i.e., positive, was 120 ng g ^-1 dry weight of the needle. LOD and LOQ for rugulosin were both 150 ng g ^-1 (Sumarah et al., 2005).

По окончании большого числа анализов игл обнаружили, что некоторые образцы содержали стехиометрически полученный (1:1) продукт деградации, возникающий как функция от задержки высушивания (100% превращение через одну неделю). В условиях ВЭЖХ, описанных выше, это соединение элюировалось за 30 сек (УФ макс.: 210, 240, 275, 326 нм) до ругулозина (УФ макс.: 210, 254, 389 нм). Материал анализировали масс-спектрометрией с использованием тройного квадрупольного масс-спектрометра с прямой инъекцией и электрораспылением (Micromass), LC/MS с использованием времяпролетного масс-спектрометра LCT (Micromass) и LC/MS на QTOF (Micromass). Не достигли консенсуса относительно молекулярной массы, поскольку молекула не ионизировалась систематически ни на одном из используемых аппаратов. Анализы ЯМР проводили на спектрофотометре Bruker Advance 700 МГц (COSY, HSQC и HMBC). Эти данные показали, что соединение содержало кольцо с 4 соседними атомами водорода и двумя O-метильными группами, что химически согласуется с тем, что ругулозин распадается на два и подвергается перегруппировке. При возникновении продукта деградации значение добавляли к общему значению.At the end of a large number of needle analyzes, it was found that some samples contained a stoichiometrically obtained (1: 1) degradation product arising as a function of the delay in drying (100% conversion after one week). Under the HPLC conditions described above, this compound was eluted 30 seconds (UV max: 210, 240, 275, 326 nm) before rugulosin (UV max: 210, 254, 389 nm). The material was analyzed by mass spectrometry using a direct injection and electrospray triple quadrupole mass spectrometer (Micromass), LC / MS using an LCT time-of-flight mass spectrometer (Micromass) and LC / MS on a QTOF (Micromass). There was no consensus on molecular weight, since the molecule was not systematically ionized on any of the devices used. NMR analyzes were performed on a 700 MHz Bruker Advance spectrophotometer (COSY, HSQC and HMBC). These data showed that the compound contained a ring with 4 adjacent hydrogen atoms and two O-methyl groups, which is chemically consistent with the fact that rugulosin decomposes into two and undergoes rearrangement. When a degradation product occurs, the value is added to the total value.

Статистические анализы проводили с помощью SYSTAT в. 10.2 (San Jose, CA). Для статистических целей иглы, которые являлись отрицательными по ругулозину, но положительными по ELISA, вводили как предел детекции. Отрицательные значения вводили как половину предела детекции.Statistical analyzes were performed using SYSTAT c. 10.2 (San Jose, CA). For statistical purposes, needles that were negative for rugulosin but positive for ELISA were introduced as the limit of detection. Negative values were entered as half the detection limit.

РЕЗУЛЬТАТЫRESULTS

Тестирование насекомыхInsect testing

Личинки C. fumiferana, питавшиеся >25 мкМ ругулозином, весили значимо меньше, чем соответствующие контроли по ANOVA (25 мкМ: p=0,027, 50 мкМ: p=0,001 и 100 мкМ: p<0,001). Личинки, питавшиеся 100мкМ ругулозином в рационе, также обладали значимо уменьшенной головной капсулой (p=0,008). Данные уровни значимости приведены для второго испытания и являлись сходными с повторами. Larvae of C. fumiferana feeding on> 25 μM rugulosin weighed significantly less than the corresponding ANOVA controls (25 μM: p = 0.027, 50 μM: p = 0.001 and 100 μM: p <0.001). Larvae that fed 100 μM of rugulosin in the diet also had a significantly reduced head capsule (p = 0.008). These significance levels are given for the second test and were similar to repetitions.

Личинки L. fiscellaria, питавшиеся ≥50 мкМ, весили значимо меньше, чем соответствующие контроли. Во время второго теста массы L. Fiscellaria, питавшихся ругулозином, являлись значимо ниже контрольных (ANOVA, 50 мкМ: p=0,030, 100 мкМ: p=0,081 и 150 мкМ: p=0,001). Для третьего испытания результаты являлись сходными (50 мкМ: p=0,034, 100 мкМ: p=0,046 и 150 мкМ: p=0,001). Личинки, питавшиеся 150 мкМ ругулозина в рационе, также обладали значимо уменьшенной головной капсулой (p=0,028). Larvae of L. fiscellaria , feeding on ≥50 μM, weighed significantly less than the corresponding controls. During the second test, the masses of L. Fiscellaria fed with rugulosin were significantly lower than the control (ANOVA, 50 μM: p = 0.030, 100 μM: p = 0.081 and 150 μM: p = 0.001). For the third test, the results were similar (50 μM: p = 0.034, 100 μM: p = 0.046 and 150 μM: p = 0.001). Larvae that fed 150 μM of rugulosin in the diet also had a significantly reduced head capsule (p = 0.028).

Личинки Z. canadensis не представлены систематически, поскольку их собирали в дикой природе. Многие (60%) погибли от грибковых инфекций (Aspergillus fumigatus) и других неизвестных причин в ходе культивирования. Массы личинок между группами контроля и обработки (10, 50, 100 и 150 мкМ ругулозина) не различались значимо по ANOVA (LSD, Тьюки). Однако с использованием теста знакового рангового критерия Уилкоксона для согласованных пар личинки, питавшиеся 100 или 150 мкМ ругулозина в рационе, являлись более легкими, чем личинки, питавшиеся 10 мкМ ругулозином и контрольными рационами (p<0,10). Из-за высокого процента контаминированных A. fumigatus личинок в эксперименте неожиданным результатом являлась противогрибковая активность, наблюдаемая выше 50 мкМ, в немногих пробирках присутствовал рост грибков в тестах при 100 мкМ и 150 мкМ ругулозине. Breen et al. (1955) опубликовали, что ругулозин является умеренно противогрибковым. Larvae of Z. canadensis are not systematically represented, as they were collected in the wild. Many (60%) died from fungal infections ( Aspergillus fumigatus ) and other unknown causes during cultivation. The masses of larvae between the control and treatment groups (10, 50, 100, and 150 μM of rugulosin) did not differ significantly by ANOVA (LSD, Tukey). However, using the Wilcoxon sign rank test for matched pairs, the larvae fed 100 or 150 μM rugulosin in the diet were lighter than the larvae fed 10 μM rugulosin and control diets (p <0.10). Due to the high percentage of A. fumigatus contaminated larvae in the experiment, the antifungal activity observed above 50 μM was an unexpected result, fungal growth was observed in few tests at 100 μM and 150 μM rugulosin in a few tubes. Breen et al. (1955) published that rugulosin is moderately antifungal.

Результаты образцов с тестируемых полевых участковThe results of samples from the tested field sites

Образцы отбирали приблизительно через 3,5 и 4,5 года после инокуляции, как раз более одного и двух лет в полевых условиях, соответственно. На это время деревья составляли в высоту 1-1,25 м и 1,5-1,75 м. С каждого из восьми деревьев выбирали ветвь с каждым из классов игл в возрасте одного, двух и трех лет (всего 24 ветви). Все образцы игл с 24 ветвей являлись положительными по ELISA, и 96% содержали поддающийся детекции ругулозин через один год в полевых условиях и 3,5 года после инокуляции. Средняя концентрация, с поправкой на восстановление структуры, составляла 1,0 мкг г^-1, и концентрации ругулозина из игл каждого класса возраста являлись фактически идентичными. Из 8 различных деревьев, собранных, как выше, через 4,5 года после инокуляции (всего 24 ветви), 40% образцов являлись положительными по ELISA, однако 100% содержали ругулозин. Средняя концентрация с поправкой на восстановление структуры составляла 0,7 мкг г^-1, и концентрации ругулозина из игл каждого класса возраста снова являлись фактически идентичными. Все шесть из образцов игл из неинокулированных сеянцев, которые высаживали непосредственно под тремя положительными деревьями в полевых условиях, являлись положительными по ругулозину со средней концентрацией с поправкой на восстановление структуры 1,1 мкг г^-1 (5/6 являлись положительными по ELISA).Samples were taken approximately 3.5 and 4.5 years after inoculation, just more than one and two years in the field, respectively. At this time, the trees were 1-1.25 m and 1.5-1.75 m high. A branch with each of the needle classes at the age of one, two and three years (a total of 24 branches) was selected from each of the eight trees. All needle samples from 24 branches were ELISA positive, and 96% contained detectable rugulosin one year under field conditions and 3.5 years after inoculation. The average concentration, adjusted for restoration of the structure, was 1.0 μg g ^-1 , and the concentrations of rugulosin from the needles of each age class were virtually identical. Of the 8 different trees collected as above, 4.5 years after inoculation (24 branches in total), 40% of the samples were ELISA positive, but 100% contained rugulosin. The average concentration adjusted for restoration of the structure was 0.7 μg g ^-1 , and the concentrations of rugulosin from the needles of each age class were again virtually identical. All six of the needle samples from uninoculated seedlings, which were planted directly under three positive trees in the field, were rugulosin positive with an average concentration adjusted for restoration of the structure of 1.1 μg g ^-1 (5/6 were positive by ELISA).

Не детектировали ругулозин в опавших иглах, собранных в сетях вблизи этих деревьев, отобранных в какой-либо год. Образцы, отобранные от деревьев после первого года, являлись положительными по ELISA, и на второй год, они являлись отрицательными.Rugulosin was not detected in fallen needles collected in nets near these trees selected in any year. Samples taken from trees after the first year were ELISA positive, and in the second year, they were negative.

Распределение эндофита внутри дереваEndophyte distribution within the tree

От 11 до 20 ветвей извлекали для каждого из 20 деревьев через 15 месяцев после инокуляции. Приблизительно 90% ветвей от 10 положительных по ELISA деревьев протестировали как положительные по грибку и/или токсину. Из сеянцев, которые тестировали как отрицательные за 11 месяцев перед этим, через 4 месяца после инокуляции, 75% ветвей являлись положительными по грибку и/или токсину через 15 месяцев. Существовало различие в доле ложноотрицательных по ELISA по сравнению с присутствием ругулозина по анализу токсина между двумя группами. Доля составляла приблизительно 2x долю в неинокулированных деревьях, которые исходно тестировали по ELISA как отрицательные, по сравнению с теми, которые тестировали как положительные (p>0,036). Поскольку все деревья являлись колонизированными, данные объединяли. Среднее арифметическое концентрации ругулозина (с поправкой на восстановление структуры) составляло 0,6 мкг г^-1 и среднее геометрическое составляло 0,8 мкг г^-1 (фигура 9).From 11 to 20 branches were extracted for each of the 20 trees 15 months after inoculation. Approximately 90% of the branches of 10 ELISA positive trees were tested as fungal and / or toxin positive. Of the seedlings that were tested as negative 11 months before, 4 months after inoculation, 75% of the branches were positive for fungus and / or toxin after 15 months. There was a difference in the proportion of false negative by ELISA compared with the presence of rugulosin in the toxin analysis between the two groups. The proportion was approximately 2x in uninoculated trees that were initially tested as negative by ELISA compared to those tested as positive (p> 0.036). Since all trees were colonized, data was pooled. The arithmetic average of the concentration of rugulosin (adjusted for restoration of the structure) was 0.6 μg g ^-1 and the geometric mean was 0.8 μg g ^-1 (figure 9).

ОбсуждениеDiscussion

Авторы изобретения показали эффекты ругулозина из эндофита видов Phialocephala на растительноядных насекомых, распределение внутри дерева инокулированных эндофитов, персистенцию эндофита и токсина и распределение эндофитов на соседние сеянцы.The inventors showed the effects of rugulosin from the endophyte of Phialocephala species on herbivorous insects, the distribution of inoculated endophytes within the tree, the persistence of endophyte and toxin, and the distribution of endophytes to neighboring seedlings.

Этот анализ подтвердил токсичность ругулозина для C. fumiferana и других насекомых, помещая эффективную концентрацию на 25 мкМ (p=0,027 для уменьшения массы по сравнению с контролями). В используемых условиях L. fiscellaria являлись пораженными при концентрациях ругулозина в рационе между 25 и 50 мкМ. Тесты с собранными в дикой природе Z. canadensis являлись незаконченными, поскольку высокий процент собранных в дикой природе личинок являлся инфицированным A. fumigatus. Однако это насекомое также являлось пораженным ругулозином в таком же порядке диапазона концентраций, как и другие виды насекомых. Как отмечено, токсичность в рационе ругулозина для D. melanogaster лежала в таком же диапазоне (50 мкМ; Dobias et al., 1980). Ругулозин будет также оказывать желательный токсичный эффект на ряд лесных вредителей изнутри колонизированных игл.This analysis confirmed the toxicity of rugulosin to C. fumiferana and other insects by placing an effective concentration of 25 μM (p = 0.027 to reduce weight compared to controls). Under the conditions used, L. fiscellaria were affected at concentrations of rugulosin in the diet between 25 and 50 μM. Tests with wild-collected Z. canadensis were incomplete because a high percentage of wild-collected larvae were infected with A. fumigatus . However, this insect was also affected by rugulosin in the same order of concentration range as other types of insects. As noted, toxicity in the diet of rugulosin for D. melanogaster was in the same range (50 μM; Dobias et al., 1980). Rugulosin will also have the desired toxic effect on a number of forest pests from within the colonized needles.

Результаты настоящего эксперимента, проведенного в питомнике, показали ряд важных обнаружений. Через 15 месяцев после инокуляции деревья являлись основательно колонизированными, где только 32 ветви из 320 протестировали как отрицательные по пределам детекции двух способов. Однако, оказалось также, что подавляющее большинство (75%) деревьев, протестированных как отрицательные по ELISA через три месяца после инокуляции, также являлись положительными после более длительного периода в питомнике. Кроме того, присутствовали признаки существования различий в производительности ELISA из-за различий поглощающих УФ-соединений в иглах. Цвет игл может меняться из-за внешних условий или по генетическим причинам. Настоящее исследование обеспечивает качественную перспективу. Однако доминирующий эффект относится к чувствительности двух способов, которая тем не менее составляла 100 ppb (60 и 150 нг г^-1) по отношению к степени колонизации. Таким образом, показано, что эндофит и его токсин хорошо распространены между ветвями через 15 месяцев после инокуляции.The results of this experiment conducted in the nursery showed a number of important findings. Fifteen months after inoculation, the trees were thoroughly colonized, where only 32 branches out of 320 were tested as negative in the detection limits of the two methods. However, it also turned out that the vast majority (75%) of trees tested as negative by ELISA three months after inoculation were also positive after a longer period in the nursery. In addition, there were signs of differences in ELISA performance due to differences in the absorbing UV compounds in the needles. The color of the needles may vary due to environmental conditions or for genetic reasons. This study provides a qualitative perspective. However, the dominant effect relates to the sensitivity of the two methods, which nevertheless amounted to 100 ppb (60 and 150 ng g ^-1 ) with respect to the degree of colonization. Thus, it was shown that endophyte and its toxin are well distributed between the branches 15 months after inoculation.

Деревья, высаженные в полевых условиях, выбирали для высаживания на основании ответа по ругулозину и ELISA. Через три с половиной года никакие иглы не будут образовываться из тканей, присутствующих на время инокуляции. Обнаружено, что фактически все образцы игл из трех классов возраста игл из двух различных групп деревьев содержали ругулозин.Trees planted in the field were selected for planting based on the response of rugulosin and ELISA. After three and a half years, no needles will form from the tissues present at the time of inoculation. It was found that virtually all needle samples from three age classes of needles from two different tree groups contained rugulosin.

Через один год после высаживания ограниченная выборка из маленьких сеянцев, высаженных непосредственно под деревьями (т.е. в зоне, где будут опадать иглы), вся являлась колонизированной. Изобретение предоставляет первое доказательство, что эндофиты игл хвойных переносятся вертикально.One year after planting, a limited selection of small seedlings planted directly under the trees (i.e., in the area where the needles will fall) was all colonized. The invention provides the first evidence that endophytes of conifer needles are carried vertically.

Во всех трех группах деревьев концентрации ругулозина в иглах составляли приблизительно 1 мкг г^-1. Теоретически это концентрация порядка 10 мкМ. По сравнению с данными по эффективным концентрациям in vitro это концентрация приблизительно правильного порядка величины для предсказанного эффекта роста насекомых, сопоставимая с результатами, полученными в вегетационных камерах (Miller et al., 2002). В искусственном рационе присутствует неограниченный запас питательных веществ, который обычно является защитным от токсичных эффектов низкого уровня в любой модели на животных. Трудно узнать распределение токсина in planta. Сканирующие электронные микрофотографии показывают, что мицелий эндофита широко занимает межклеточное пространство игл бальзамической пихты (Johnson & Whitney, 1989). Известно, что концентрации экскретированных токсинов являются наибольшими около мицелия (например, Morita et al., 1984). Это позволяет предполагать, что концентрации, с которыми насекомые сталкиваются в перевариваемом материале, могут являться немного более высокими. Низкие концентрации в иглах могут являться достаточными для уменьшения роста вредителей.In all three groups of trees, the concentration of rugulosin in the needles was approximately 1 μg g ^-1 . Theoretically, this concentration is about 10 μM. Compared to the data on effective in vitro concentrations, this is a concentration of approximately the right order of magnitude for the predicted effect of insect growth, comparable to the results obtained in growing chambers (Miller et al., 2002). An artificial diet contains an unlimited supply of nutrients, which is usually protective against the toxic effects of low levels in any animal model. It is difficult to know the distribution of toxin in planta . Scanning electron micrographs show that endophyte mycelium widely occupies the intercellular space of balsamic fir needles (Johnson & Whitney, 1989). The concentrations of excreted toxins are known to be highest near the mycelium (e.g., Morita et al., 1984). This suggests that the concentrations that insects encounter in the digestible material may be slightly higher. Low needle concentrations may be sufficient to reduce pest growth.

Отсутствие поддающегося детекции токсина в опадающих иглах соответствовало ожиданиям. Поскольку микотоксины представляют собой природные продукты, они быстро деградируют при контакте с почвой (например Binder et al., 1996; Mortensen et al., 2006). Опавшие иглы сохраняют токсикогенных эндофитов в течение достаточного времени, чтобы позволить вертикальную передачу.The absence of a detectable toxin in the falling needles was in line with expectations. Since mycotoxins are natural products, they quickly degrade upon contact with soil (e.g. Binder et al., 1996; Mortensen et al., 2006). Fallen needles retain toxicogenic endophytes for sufficient time to allow vertical transmission.

Таким образом, авторы изобретения показали, что медленный рост эндофитов хвойных ограничивает раннюю детекцию после колонизации. После инокуляции тестируемый эндофит распространяется по развивающемуся дереву, персистирует в полевых условиях по меньшей мере в течение четырех лет. Кроме того, авторы изобретения показали уменьшение массы тела как для C. fumiferana, так и для L. fiscellaria при 25 и 50 мкМ ругулозина, соответственно, и головные капсулы являлись уменьшенными при 100 и 150 мкМ. Z. canadensis являлись более легкими при тестировании с 100 и 150 мкМ ругулозина по сравнению с контролями.Thus, the inventors have shown that the slow growth of coniferous endophytes limits early detection after colonization. After inoculation, the tested endophyte spreads over the developing tree and persists in the field for at least four years. In addition, the inventors showed a decrease in body weight for both C. fumiferana and L. fiscellaria at 25 and 50 μM of rugulosin, respectively, and head capsules were reduced at 100 and 150 μM. Z. canadensis were lighter when tested with 100 and 150 μM of rugulosin compared to controls.

Пример 17Example 17

Токсичные метаболиты, продуцируемые эндофитными грибками (виды Epichloë и Neotyphodium) в овсянице сильно уменьшают популяции связанных растительноядных насекомых. Это оказывает значительный благоприятный эффект на приспособленность растения. Эти грибы продуцируют различные алкалоиды, влияющие на рост травоядных (насекомых, млекопитающих; Clay and Schardl, 2002) и их обнаружили в тканях растений в диапазоне 1-30 мкг г^-1 (Rottinghaus et al., 1991; Spiering et al., 2005). Существуют некоторые доказательства для передвижения токсинов, так же как для возможной роли ферментов растений в изменении их структур (Spiering et al., 2005). Существует также одно сообщение, что присутствие эндофита напрямую влияет на рост нематоды, которая повреждает один вид травы, независимо от токсинов (Panaccione et al., 2006).Toxic metabolites produced by endophytic fungi ( Epichloë and Neotyphodium species ) in fescue greatly reduce populations of related herbivorous insects. This has a significant beneficial effect on the fitness of the plant. These fungi produce various alkaloids that affect the growth of herbivores (insects, mammals; Clay and Schardl, 2002) and are found in plant tissues in the range of 1-30 μg g ^-1 (Rottinghaus et al., 1991; Spiering et al., 2005 ) There is some evidence for the movement of toxins, as well as for the possible role of plant enzymes in changing their structures (Spiering et al., 2005). There is also one report that the presence of endophyte directly affects the growth of the nematode, which damages one species of grass, regardless of toxins (Panaccione et al., 2006).

Авторы изобретения исследовали роль эндофитов в P. glauca (белая ель) для ограничения пасущихся на иглах хвойных C. fumiferana и некоторых других видов насекомых. C. fumerana является главным циклическим вредителем деревьев ели и пихты, особенно на северо-востоке США и Канады (Royama et al., 2005). В течение двух десятилетий авторы изобретения собирали эндофитов листвы хвойных из леса Акадии и исследовали их по способности продуцировать соединения, токсичные для личинок C. fumerana.The inventors investigated the role of endophytes in P. glauca (white spruce) to limit conifers C. fumiferana and some other insect species grazing on needles. C. fumerana is the main cyclic pest of spruce and fir trees, especially in the northeastern United States and Canada (Royama et al., 2005). For two decades, the inventors collected endophytes of conifers from the Acadia forest and examined them for their ability to produce compounds toxic to C. fumerana larvae.

Успешную экспериментальную инокуляцию сеянцев P. glauca эндофитом игл 5WS22E1 (DAOM 229536, CBS 120377), который продуцирует ругулозин, авторы изобретения показали в исследованиях, проводимых в вегетационных камерах и в условиях питомника с использованием раневой инокуляции. На основании информации о последовательности ДНК этот гриб представляет собой вид Phialocephala, родственный штаммам, ранее опубликованным как эндофитные для ели европейской (Grunig et al., 2002). Выращенные в условиях питомника, образцы игл от инфицированных деревьев в возрасте двух лет содержали 0,15-24,8 мкг г^-1 ругулозина со средней геометрической концентрацией 1 мкг г^-1. Авторы изобретения показали, что молодые деревья обладали равномерным распределением токсина, с разницей в концентрации преимущественно между индивидуумами. Со старением деревьев присутствовала разница между ветвями по концентрации ругулозина. После однократной инокуляции в виде сеянцев деревья в тестируемом участке поддерживали сходные концентрации ругулозина в иглах через 5 лет после инокуляции.The successful experimental inoculation of P. glauca seedlings with 5WS22E1 needle endophyte (DAOM 229536, CBS 120377), which produces rugulosin, the authors of the invention showed in studies conducted in vegetation chambers and in a nursery using wound inoculation. Based on DNA sequence information, this fungus is a Phialocephala species related to strains previously published as endophytic for European spruce (Grunig et al., 2002). Grown in a nursery, needle samples from infected trees at the age of two years contained 0.15-24.8 μg g ^{-1 of} rugulosin with an average geometric concentration of 1 μg g ^-1 . The inventors showed that young trees had a uniform distribution of toxin, with a difference in concentration mainly between individuals. With aging trees, there was a difference between the branches according to the concentration of rugulosin. After a single inoculation in the form of seedlings, the trees in the test site maintained similar concentrations of rugulosin in the needles 5 years after inoculation.

При исследованиях в вегетационной камере наличие грибка и его токсина в иглах уменьшало скорость роста C. fumerana. In vitro ругулозин уменьшал массу тела и/или влиял на развитие личиночной стадии у C. fumerana (Calhoun et al., 1992), Lambdina fiscellaria и Zeiraphera canadensis при концентрациях в рационе в диапазоне 50 мкМ. Исследование показало, что сходные концентрации ругулозина в иглах уменьшали рост C. fumerana в выращенных в питомнике деревьях.In studies in the growing chamber, the presence of the fungus and its toxin in the needles reduced the growth rate of C. fumerana . In vitro, rugulosin reduced body weight and / or influenced the development of the larval stage in C. fumerana (Calhoun et al., 1992), Lambdina fiscellaria, and Zeiraphera canadensis at concentrations in the diet in the range of 50 μM. The study showed that similar concentrations of rugulosin in the needles reduced the growth of C. fumerana in the trees grown in the nursery.

Материалы и методыMaterials and methods

Эксперименты в питомнике: Тесты проводили в лесном питомнике Суссекса J. D. Irving, Limited в Нью-Брансуик, Канада (45° 43' N, 65° 31' W; высота 21,30 м). В два последовательных года несколько сотен сеянцев, выращенных в контейнерных кассетах в контейнерах блоков горшков для 67 сеянцев, инокулировали продуцирующим ругулозин эндофитом 5WS22E1 (DAOM 229536; CBS 120377). Описание популяций, высаживания и способы инокуляции P. glauca, используемые в этих экспериментах, даны в Sumarah et al. (2005). Все деревья помечали 9-значными кодами, и все измерения проводили со слепыми образцами. Nursery Experiments : Tests were conducted at the Sussex Forest Nursery JD Irving, Limited in New Brunswick, Canada (45 ° 43 'N, 65 ° 31'W; height 21.30 m). In two consecutive years, several hundred seedlings grown in container cassettes in containers of pot units for 67 seedlings were inoculated with Rugulosin-producing endophyte 5WS22E1 (DAOM 229536; CBS 120377). The description of populations, planting and methods of inoculation of P. glauca used in these experiments are given in Sumarah et al. (2005). All trees were marked with 9-digit codes, and all measurements were performed with blind samples.

Сеянцы в возрасте трех лет: Первую группу высевали и инокулировали приблизительно два месяца спустя. После четырех месяцев в теплице их тестировали по колонизации эндофитом посредством ELISA (Sumarah et al., 2005) и сегрегировали. Вместе со свободными от 5WS22E1 сеянцами из того же посева положительную по эндофитам группу поддерживали в коммерческих условиях, как известно в данной области. Через один год все сеянцы пересаживали в пластиковые горшки и содержали в участке питомника в течение еще одного года после инокуляции. Seedlings at the age of three : The first group was sown and inoculated approximately two months later. After four months in the greenhouse, they were tested for endophyte colonization by ELISA (Sumarah et al., 2005) and segregated. Together with seedlings free from 5WS22E1 from the same sowing, the endophyte-positive group was maintained under commercial conditions, as is known in the art. After one year, all seedlings were transplanted into plastic pots and kept in the nursery for another year after inoculation.

Сеянцы в возрасте четырех лет: Вторая группа была из тестового посева и инокулирована приблизительно 12 недель спустя. Их тестировали по инфекции эндофитом через 4 месяца роста посредством ELISA. Сеянцы переносили в горшки через один год и содержали, как выше. Seedlings at the age of four : The second group was from a test culture and inoculated about 12 weeks later. They were tested for endophyte infection after 4 months of growth by ELISA. Seedlings were transferred to the pots after one year and kept as above.

Эксперимент 1 с более молодыми деревьями : Он включал в себя 100 деревьев, 50 из которых инфицировали эндофитом, и сходную контрольную группу. Пять личинок на второй личиночной стадии помещали на боковую ветвь первого года на побегах с почками на каждом дереве с использованием тонкой художественной кисти (нейлон #5). Почки набухали, когда вводили личинок. Насекомых получали в виде личинок на второй личиночной стадии из Insect Production Services, Natural Resources Canada, Canadian Forest Service (Sault Ste. Marie, ON) и сохраняли при 5°C до использования. Все дерево (экспериментальную единицу) покрывали мешком из сетки (нарезанный материал полиэфирных драпировок), полученным по Parsons et al. (2005), как для положительных, так и для отрицательных по эндофиту деревьев. Experiment 1 with younger trees : It included 100 trees, 50 of which were infected with endophyte, and a similar control group. Five larvae in the second larval stage were placed on the lateral branch of the first year on shoots with buds on each tree using a thin art brush (nylon # 5). The buds swelled when larvae were introduced. Insects were obtained as larvae in the second larval stage from Insect Production Services, Natural Resources Canada, Canadian Forest Service (Sault Ste. Marie, ON) and kept at 5 ° C until use. The whole tree (experimental unit) was covered with a mesh bag (cut polyester drapery material) obtained by Parsons et al. (2005) for both positive and negative endophytic trees.

Эксперимент Experiment 2 с более старшими деревьями 2 with older trees

Двух гусениц листовертки-почкоеда помещали, как выше, на каждую из ветвей в возрасте 3 или 4 лет на побегах с почками на каждом из 48 деревьев в возрасте четырех лет. Затем каждую ветвь (экспериментальную единицу) покрывали мешком из сетки (фигура 10). Этот эксперимент позволял факторный анализ вариаций концентрации ругулозина между деревьями (различия в химическом составе игл из-за истории освещенности, класса игл и т.д.) и между ветвями.Two caterpillars of the bud-leaf beetle were placed, as above, on each of the branches at the age of 3 or 4 years on shoots with buds on each of the 48 trees at the age of four years. Then, each branch (experimental unit) was covered with a mesh bag (Figure 10). This experiment allowed a factor analysis of variations in the concentration of rugulosin between trees (differences in the chemical composition of the needles due to the history of illumination, class of needles, etc.) and between the branches.

Двух гусениц листовертки-почкоеда помещали, как выше, на каждую из ветвей в возрасте 3 или 4 лет на побегах с почками на каждом из 48 деревьев в возрасте четырех лет. Затем каждую ветвь (экспериментальную единицу) покрывали мешком из сетки (фигура 10). Этот эксперимент позволял факторный анализ вариаций концентрации ругулозина между деревьями (различия в химическом составе игл из-за истории освещенности, класса игл и т.д.) и между ветвями.Two caterpillars of the bud-leaf beetle were placed, as above, on each of the branches at the age of 3 or 4 years on shoots with buds on each of the 48 trees at the age of four years. Then, each branch (experimental unit) was covered with a mesh bag (Figure 10). This experiment allowed a factor analysis of variations in the concentration of rugulosin between trees (differences in the chemical composition of the needles due to the history of illumination, class of needles, etc.) and between the branches.

Использование слишком многих насекомых будет приводить к дефолиации деревьев независимо от присутствия токсина, в большинстве, если не во всех обработках. Число гусениц листовертки-почкоеда на деревьях двух размеров в настоящем исследовании основано на данных от Parsons et al. (2005). Они показали, что наименьшее поддающееся детекции повреждение бальзамической пихты личинками пилильщика на ранней личиночной стадии происходило при плотности 50 личинок/м² ветви.Using too many insects will lead to defoliation of the trees, regardless of the presence of the toxin, in most, if not all treatments. The number of caterpillars of the bud-leaf beetle on two-sized trees in this study is based on data from Parsons et al. (2005). They showed that the least detectable damage to balsamic fir by sawfly larvae at an early larval stage occurred at a density of 50 larvae / m ² branches.

Датчики температуры (Hobo Dataloggers, Onset Computer Corporation, Pocasset, MA) помещали в область содержания, и мониторировали прогрессирование, пока гусеницы листовертки-почкоеда не становились старше, чем шестая личиночная стадия. При завершении всех насекомых, которых удалось найти, собирали и замораживали индивидуально. Их взвешивали на аналитических весах Mettler PJ360 (±0,02 мг). Предыдущие исследования показали, что замороженная масса во влажном состоянии коррелировала с лиофилизированной массой (n=134 животных, корреляция Пирсона r=0,841, P с коррекцией по Бонферрони <0,0001). Ширину головных капсул определяли с использованием стереомикроскопа при 40 × с окуляром и многоступенчатым микрометром. После сбора гусениц листовертки-почкоеда деревья опрыскивали инсектицидом, чтобы убедиться, что не выжило личинок, способных убежать.Temperature sensors (Hobo Dataloggers, Onset Computer Corporation, Pocasset, MA) were placed in the containment area, and progression was monitored until the caterpillars of the bud-leaf beetle grew older than the sixth larval stage. At the end of all the insects that were found, they were collected and frozen individually. They were weighed on a Mettler PJ360 analytical balance (± 0.02 mg). Previous studies have shown that wet frozen mass correlated with freeze-dried mass (n = 134 animals, Pearson correlation r = 0.841, P with Bonferroni correction <0.0001). The width of the head capsules was determined using a stereo microscope at 40 × with an eyepiece and a multi-stage micrometer. After collecting the caterpillars of the kidney leaf beetle, the trees were sprayed with an insecticide to ensure that no larvae capable of escaping survived.

Оба эксперимента останавливали 1 месяц спустя и 5-6 боковых ветвей извлекали из деревьев в возрасте трех лет и замораживали. Ветви, где гусениц листовертки-почкоеда собирали с деревьев в возрасте четыре года, извлекали и замораживали по отдельности. Иглы удаляли со всех ветвей по отдельности, лиофилизировали и использовали для определения инфекции посредством ELISA и ругулозина по Sumarah et al. (2005). Предел детекции способа (LOD) для клеточной массы составлял 60 нг г^-1, предел количественного определения (LOQ), т.е. положительный, составлял 120 нг г^-1 сухой массы иглы для детектора антитела. The LOD и LOQ для ругулозина оба составляли 150 нг г^-1.Both experiments were stopped 1 month later and 5-6 lateral branches were removed from the trees at the age of three years and frozen. The branches where the caterpillars of the bud-leaf beetle were collected from the trees at the age of four were removed and frozen separately. Needles were removed from all branches individually, lyophilized and used to determine infection by ELISA and rugulosin according to Sumarah et al. (2005). The detection limit of the method (LOD) for the cell mass was 60 ng g ^-1 , the limit of quantitation (LOQ), i.e. positive, was 120 ng g ^-1 dry weight of the needle for the antibody detector. The LOD and LOQ for rugulosin were both 150 ng g ^-1 .

ANOVA с тестом Тьюки-Крамера проводили для массы и ширины головной капсулы насекомых с деревьев в возрасте трех лет с использованием программного обеспечения NCSS 2004 (Kaysville, UT). T-тест с равными дисперсиями также проводили для масс с использованием того же программного обеспечения.ANOVA with the Tukey-Cramer test was performed for the mass and width of the insect head capsule from trees at the age of three years using NCSS 2004 software (Kaysville, UT). An equal dispersion T-test was also performed for the masses using the same software.

Для деревьев в возрасте четырех лет насекомых стратифицировали на собранных с игл с концентрациями токсина ниже уровня эффекта токсичности в рационе, для ругулозина 0,5 мкг г^-1, и насекомых с игл с концентрациями >0,5 мкг г^-1. Это основано на низком наблюдаемом уровне эффекта ругулозина в рационе для C. fumerana в синтетическом рационе (приблизительно 50 мкМ; Calhoun et al., 1992), скорректированном на среднее соотношение сухая масса : масса во влажном состоянии для игл. Для статистических целей иглы, которые являлись отрицательными по ругулозину, но положительными по ELISA, вводили как предел детекции. Значения ниже предела детекции вводили как половину предела детекции. Общепринятые статистические тесты для оставшихся данных, так же как парные t-тесты, знаковый ранговый критерий Уилкоксона и ANOVA проводили для данных для деревьев в возрасте четырех лет с использованием SYSTAT в. 10.2 (San Jose, CA).For trees at the age of four, insects were stratified on collected from needles with toxin concentrations below the level of the toxicity effect in the diet, for rugulosin 0.5 μg g ^-1 , and insects with needles with concentrations> 0.5 μg g ^-1 . This is based on the low observed level of the effect of rugulosin in the diet for C. fumerana in the synthetic diet (approximately 50 μM; Calhoun et al., 1992), adjusted for the average dry weight: wet weight ratio for needles. For statistical purposes, needles that were negative for rugulosin but positive for ELISA were introduced as the limit of detection. Values below the detection limit were entered as half the detection limit. Conventional statistical tests for the remaining data, as well as paired t-tests, Wilcoxon's signed rank test and ANOVA, were performed for data for trees aged four years using SYSTAT's. 10.2 (San Jose, CA).

Средняя температура составляла 18,4±2,2°C, начинаясь с 15-17°C и поднимаясь до 23°C в последние несколько суток эксперимента. Не присутствовало значимой разницы между средними температурами с мониторов, помещенных с деревьями в возрасте трех или четырех лет (P=0,05). Минимальные температуры являлись сходными, однако, средние максимальные температуры являлись немного более высокими (P=0,05) для монитора среди деревьев в возрасте трех лет по сравнению с более старшими деревьями. Фактически все собранные насекомые были на 6^й личиночной стадии.The average temperature was 18.4 ± 2.2 ° C, starting from 15-17 ° C and rising to 23 ° C in the last few days of the experiment. There was no significant difference between the average temperatures from monitors placed with trees at the age of three or four years (P = 0.05). The minimum temperatures were similar, however, the average maximum temperatures were slightly higher (P = 0.05) for the monitor among trees aged three years compared to older trees. In fact, all of the collected insects were on ^{the 6th} larval stage.

Деревья в возрасте трех лет : Анализ ELISA контрольной группы выявил, что 5 из отрицательных по эндофиту деревьев являлись положительными через 36 месяцев, т.е. являлись ложноотрицательными при предварительном тестировании. Эти шесть исключены из анализа. Среднее геометрическое концентрации токсина с поправкой на восстановление структуры в положительной по эндофиту группе составляло 0,85 мкг/г. Число гусениц листовертки-почкоеда, выделенных на дерево, составляло 3,3 для инфицированных (всего 161) и 3,5 для неинфицированных деревьев (всего 152). Анализ переменных показал, что массы обработанных и контрольных гусениц листовертки-почкоеда являлись значимо различными (P=0,018; DF=1; F-отношение 5,64). Распределение масс насекомых между инфицированными и неинфицированными эндофитом деревьями в возрасте трех лет показано на фигуре 11. Средняя масса при завершении составляла для контролей 0,061±0,02 мг и 0,055±0,02 мг для собранных на инфицированных деревьях. Это различие являлось статистически различным (P=0,009, t-тест с равными дисперсиями). Средняя ширина головных капсул для контролей составляла 1,89±0,21 мм и 1,90±0,18 мм. Это значимо не отличалось по ANOVA. Trees at the age of three : An ELISA analysis of the control group revealed that 5 of the negative for endophyte trees were positive after 36 months, i.e. were false negative during preliminary testing. These six are excluded from the analysis. The geometric mean concentration of the toxin adjusted for restoration of the structure in the endophyte-positive group was 0.85 μg / g. The number of caterpillars of the kidney-leaf beetle isolated on the tree was 3.3 for infected (161 in total) and 3.5 for uninfected trees (152 in total). An analysis of the variables showed that the weights of the treated and control buds of the leaf bud-beetle were significantly different (P = 0.018; DF = 1; F-ratio 5.64). The distribution of insect masses between the infected and uninfected endophyte trees at the age of three years is shown in Figure 11. The average weight at the end was 0.061 ± 0.02 mg for the controls and 0.055 ± 0.02 mg for the collected trees. This difference was statistically different (P = 0.009, t-test with equal variances). The average width of the head capsules for the controls was 1.89 ± 0.21 mm and 1.90 ± 0.18 mm. This did not significantly differ in ANOVA.

Деревья в возрасте трех лет : Среднее геометрическое концентрации ругулозина с поправкой на восстановление структуры составляло 0,8 мкг г^-1 во всех образцах, и среднее для положительных ≥0,5 мкг г^-1 составляло 1,3 мкг г^-1. По ANOVA не присутствовало значимого взаимодействия между деревом и массой насекомых, или деревом и концентрацией ругулозина. Средняя масса для 166 насекомых, собранных с деревьев в возрасте четырех дет, составляла 0,072±0,02 мг. С учетом ветвей выше и ниже 0,5 мкг г^-1 существовала обратная связь между концентрацией ругулозина и массой гусениц листовертки-почкоеда (корреляция Пирсона -0,288; P с коррекцией по Бонферрони = 0,023). Ширина головной капсулы в среднем составляла 1,95±0,15 мг. Trees at the age of three : The geometric mean concentration of rugulosin, adjusted for structural restoration, was 0.8 μg g ^-1 in all samples, and the average for positive ≥0.5 μg g ^-1 was 1.3 μg g ^-1 . According to ANOVA, there was no significant interaction between the tree and the mass of insects, or the tree and the concentration of rugulosin. The average weight for 166 insects collected from trees at the age of four children was 0.072 ± 0.02 mg. Given the branches above and below 0.5 μg g ^-1, there was an inverse relationship between the concentration of rugulosin and the mass of caterpillars of the leaf bud-beetle (Pearson correlation -0.288; P with Bonferroni correction = 0.023). The width of the head capsule averaged 1.95 ± 0.15 mg.

В среднем выделяли 1,4 гусеницы листовертки-почкоеда из двух исходных, помещенных на каждую ветвь. Когда ветви стратифицировали на квартили по концентрации ругулозина (40 в каждой), доля ветвей с одной гусеницей листовертки-почкоеда являлась более низкой между нижней и тремя верхними квартилями (знаковый ранговый критерий Уилкоксона, P=0,025).On average, 1.4 caterpillars of the bud-leaf beetle were isolated from two source caterpillars placed on each branch. When the branches were stratified by quartiles according to the concentration of rugulosin (40 each), the proportion of branches with one caterpillar of the leaf bud-beetle was lower between the lower and three upper quartiles (Wilcoxon's sign rank test, P = 0.025).

Если не принимать во внимание несколько деревьев, где гусениц листовертки-почкоеда собирали только с одной ветви, деревья попадали в одно из трех распределений. Наибольший процент (38%) включал ситуацию, где все ветви находились выше порога токсичности ругулозина, и 16% все находились ниже порога. Ни в том, ни в другом случае не присутствовало вариаций внутри дерева для исследования. Остальные обладали отдельными ветвями выше и ниже порога. Типичные данные для деревьев с множеством анализированных ветвей показаны в таблице 4. Все три ветви, анализированные на дереве 1034, обладали концентрациями далеко сверх порога токсичности. Выделили только одну гусеницу листовертки-почкоеда на ветвь, и животное с ветви с самой низкой концентрацией обладало наибольшей массой, выше среднего, указанного выше. Одна ветвь с дерева 1360 находилась далеко сверх порога токсичности. В этом случае масса собранного насекомого являлась средней. С двух оставшихся ветвей собрали двух насекомых со средней массой как среднее. Сходную картину можно было наблюдать для дерева 2022.If you do not take into account several trees where the caterpillars of the leaf-bud-beetle were collected from only one branch, the trees fell into one of three distributions. The largest percentage (38%) included a situation where all branches were above the threshold of toxicity of rugulosin, and 16% were all below the threshold. In neither case was there any variation within the tree for research. The rest had separate branches above and below the threshold. Typical data for trees with many analyzed branches are shown in Table 4. All three branches analyzed on tree 1034 had concentrations well above the toxicity threshold. Only one caterpillar of the bud-leaf beetle was allocated per branch, and the animal from the branch with the lowest concentration had the largest mass, above the average indicated above. One branch from 1360 tree was far above the toxicity threshold. In this case, the mass of the collected insect was medium. Two insects were collected from the two remaining branches with an average weight as average. A similar picture could be observed for tree 2022.

ОбсуждениеDiscussion

Авторы изобретения исследовали два аспекта эффекта ругулозина на рост C. fumerana на иглах в условиях питомника на открытом воздухе. Первый представлял собой сравнение влияния на рост гусеницы листовертки-почкоеда на инфицированных деревьях и неинфицированных деревьях. Второй представлял собой использование группы более старших деревьев, так что иглы с инфицированного дерева служили контролем. Этот способ, как правило, используют в токсикологии для исключения возможных смешанных переменных, возникающих из-за вариаций внутри индивидуума. Этого можно ожидать в результате потенциальных изменений в химическом составе игл из-за вариаций, включая возраст и затенение игл, и сам грибок. Авторы изобретения показали зависимый от дозы ответ на ругулозин.The inventors investigated two aspects of the effect of rugulosin on the growth of C. fumerana on needles in an open air nursery. The first was a comparison of the influence on the growth of the caterpillar of the leaf-bud-beetle on infected trees and uninfected trees. The second was the use of a group of older trees, so the needles from the infected tree served as a control. This method is typically used in toxicology to rule out possible mixed variables arising from variations within an individual. This can be expected as a result of potential changes in the chemical composition of the needles due to variations, including age and shading of the needles, and the fungus itself. The inventors showed a dose-dependent response to rugulosin.

Известно, что затенение (Lhotakova et al., 2007) и возраст игл, так же как условия почвы влияют на состав листвы, и это, в свою очередь, может влиять на рост гусениц листовертки-почкоеда (Carisey and Bauce, 1997; Clancy et al., 2004; Nealis and Nault, 2005). Деревья, используемые в настоящих исследованиях, представляют собой разнообразную генетическую популяцию, используемую для возобновления лесонасаждений в восточной Канаде и Мэне. В исследованиях в вегетационной камере присутствие грибка и его токсина на иглах уменьшало рост C. fumerana. Эти последние эксперименты проводили с использованием нетронутых игл с сеянцев в возрасте четырех месяцев с использованием разработанного способа для скрининга изменений в устойчивости листвы (Miller et al., 2002). Настоящие эксперименты проводили посредством помещения гусениц листовертки-почкоеда на деревья, растущие на открытом воздухе.Shading is known (Lhotakova et al., 2007) and the age of the needles, as well as soil conditions affect the composition of the foliage, and this, in turn, can affect the growth of caterpillars of the leaf bud-beetle (Carisey and Bauce, 1997; Clancy et al., 2004; Nealis and Nault, 2005). The trees used in these studies represent a diverse genetic population used to reforestation in eastern Canada and Maine. In studies in the growing chamber, the presence of the fungus and its toxin on the needles reduced the growth of C. fumerana . These recent experiments were carried out using pristine needles from seedlings four months old using the developed method to screen for changes in foliage resistance (Miller et al., 2002). The present experiments were carried out by placing caterpillars of the bud-leaf beetle on trees growing outdoors.

Хотя предпринята попытка остановить эксперимент, так чтобы приблизительно 20% находилось на 6-й личиночной стадии, чтобы присутствовало распределение личиночных стадий, фактически все находились на 6-й личиночной стадии. Это имело место, возможно, из-за более высоких температур в последние 24 часа экспериментов по сравнению с предыдущей неделей. Средняя ширина головных капсул составляла ~1,94 мм. Это значение находится на верхней границе значения, обнаруженного в природе. McGugan (1954) опубликовал, что средняя ширина головных капсул по эпидемическим данным в природе в северо-западном Онтарио составляла 1,63 мм для самцов и 1,79 мм для самок. Опубликовано, что сборы в полевых условиях из Нью-Брансуика составляли 1,66 мм, без указания пола (Anon. 1981. Data Fact Sheet, Determination of spruce budworm larval stage; CANUSA Spruce Budworm Program). Это различие может являться связанным с фактом, что животные, используемые в этом эксперименте, являлись свободными от паразитов и заболеваний в отличие от ситуации в природе (см. нижеследующее).Although an attempt was made to stop the experiment so that approximately 20% were at the 6th larval stage, so that the distribution of the larval stages was present, virtually all were at the 6th larval stage. This was probably due to higher temperatures in the last 24 hours of the experiments compared to the previous week. The average width of the head capsules was ~ 1.94 mm. This value is at the upper limit of the value found in nature. McGugan (1954) published that the average capsule width according to epidemiological data in nature in northwestern Ontario was 1.63 mm for males and 1.79 mm for females. It was reported that field charges from New Brunswick were 1.66 mm without gender (Anon. 1981. Data Fact Sheet, Determination of spruce budworm larval stage; CANUSA Spruce Budworm Program). This difference may be due to the fact that the animals used in this experiment were free from parasites and diseases, unlike the situation in nature (see below).

Распределение масс животных, собранных на инфицированных иглах, при окончании являлось отличным от соответствующих контролей (фигура 11). Присутствовала также статистически значимая разница в массах гусениц листовертки-почкоеда между двумя группами. Как и в вегетационной камере, присутствие грибка и его токсина снижало рост C. fumerana. Подобные эксперименты для инфицированных и неинфицированных эндофитов травы приводили в результате к сходным обнаружениям, так же как к эффектам на развитие (например, Hardy et al., 1986).The mass distribution of animals collected on infected needles at the end was different from the corresponding controls (Figure 11). There was also a statistically significant difference in the mass of caterpillars of the leaf bud-beetle between two groups. As in the growing chamber, the presence of the fungus and its toxin reduced the growth of C. fumerana . Similar experiments for infected and uninfected grass endophytes led to similar findings, as well as developmental effects (e.g., Hardy et al., 1986).

Вторым аспектом настоящих экспериментов являлось использование более старших деревьев, для которых можно наблюдать эффект на рост гусениц листовертки-почкоеда на множестве ветвей с одного и того же одного инфицированного дерева. Это являлось возможным, поскольку как в настоящем, так и в предыдущем экспериментах, наблюдали различия в концентрации ругулозина между индивидуальными ветвями в пределах отдельных деревьев. Как обнаружено ранее, концентрация ругулозина на молярной основе, как правило, превышала концентрацию, влияющую на рост C. fumerana, Lambdina fiscellaria и Zeiraphera canadensis in vitro. Для этого компонента исследования наблюдали два эффекта.The second aspect of these experiments was the use of older trees, for which you can observe the effect on the growth of caterpillars of the leaf-bud-beetle on many branches from the same infected tree. This was possible, since both in the present and in the previous experiments, differences in the concentration of rugulosin between individual branches within individual trees were observed. As previously discovered, the concentration of rugulosin on a molar basis, as a rule, exceeded the concentration that affects the growth of C. fumerana , Lambdina fiscellaria and Zeiraphera canadensis in vitro . Two effects were observed for this component of the study.

Сравнение этих ветвей с концентрациями выше и ниже порога токсичности ругулозина показало, что присутствовала обратная связь между массой гусениц листовертки-почкоеда и концентрацией ругулозина (-0,288; P=0,023). Дополнительная поддержка этого заключения поступает из факта, что на ветвях с наиболее высокими концентрациями ругулозина выживаемость являлась значительно более низкой, чем на ветвях с более низкими концентрациями. Кроме того, присутствовало небольшое, но значимое увеличение массы в популяции выживших, обнаруженных на ветвях в квартили ветвей с наиболее высокой концентрацией ругулозина. Известно, что когда C. fumerana находятся при ограничениях питательных веществ, они будут прибегать к каннибализму, который предоставляет правдоподобное объяснение последнему наблюдению. Тем не менее, еще существовало доказательство зависимости от дозы ругулозина, где собирали отдельных животных (например, дерево 1034B).Comparison of these branches with concentrations above and below the threshold of toxicity of rugulosin showed that there was an inverse relationship between the mass of caterpillars of the leaf-bud-beetle and the concentration of rugulosin (-0.288; P = 0.023). Additional support for this conclusion comes from the fact that on the branches with the highest concentrations of rugulosin, survival was significantly lower than on the branches with the lower concentrations. In addition, there was a small but significant increase in mass in the population of survivors found on branches in quartiles of branches with the highest concentration of rugulosin. It is known that when C. fumerana is under nutrient restrictions, they will resort to cannibalism, which provides a plausible explanation for the latest observation. However, there was still evidence of a dose-dependent dose of rugulosin where individual animals were collected (e.g., tree 1034B).

На синтетическом рационе (Calhoun et al., 1992) присутствие ругулозина при приблизительно 50 мкМ приводит к снижению скорости роста C. fumerana. С использованием правила совокупности доказательств в токсикологии эффекты, наблюдаемые в этом исследовании, большей частью объясняются посредством токсина и согласуются с другими взаимодействиями эндофитов, которые изучали.On a synthetic diet (Calhoun et al., 1992), the presence of rugulosin at approximately 50 μM leads to a decrease in the growth rate of C. fumerana . Using the evidence-based rule in toxicology, the effects observed in this study are largely explained by the toxin and are consistent with other endophyte interactions that have been studied.

Таким образом, впервые авторы изобретения показали, что присутствие эндофита листьев хвойных и его токсина, ругулозина, в деревьях, выращенных в условиях продукции, приводят к уменьшенному росту C. fumerana зависимым от дозы образом. Кроме того, эти эксперименты показывают, что эффект в первую очередь объясняется ругулозином.Thus, for the first time, the inventors have shown that the presence of endophyte of coniferous leaves and its toxin, rugulosin, in trees grown under production conditions leads to reduced growth of C. fumerana in a dose-dependent manner. In addition, these experiments show that the effect is primarily explained by rugulosin.

Полное содержание всех публикаций, патентов и патентных заявок приведено здесь в качестве ссылки в той же степени, как если бы полное содержание каждой отдельной публикации, патента или патентной заявки являлось конкретно и индивидуально приведенным здесь в качестве ссылки.The entire contents of all publications, patents and patent applications are hereby incorporated by reference to the same extent as if the entire contents of each individual publication, patent or patent application was specifically and individually incorporated by reference.

Claims (18)

1. Способ получения проростка хвойного растения с повышенной устойчивостью к вредителям, предусматривающий: инокуляцию семени хвойного растения или интактного проростка хвойного выделенным токсикогенным эндофитом в течение временного интервала чувствительности, когда семя хвойного или проросток хвойного чувствителен к колонизации токсикогенным эндофитом, где временной интервал чувствительности для семени во время стратификации семени и для проростка хвойного является интервал от стадии послевсхода до периода полного образования кутикулы, где стадия инокуляции предусматривает приведение семени хвойного или проростка хвойного в контакт с композицией инокулята, содержащей токсикогенный эндофит, где токсикогенный эндофит необязательно находится в форме фрагментов гиф токсикогенного эндофита, и композиция инокулята содержит по меньшей мере 1-25 фрагментов гиф токсикогенного эндофита/6 микролитров, необязательно, по меньшей мере 1-4 фрагмента гиф токсикогенного эндофита/микролитр, и/или, необязательно, по меньшей мере 0,2-4 фрагмента гиф токсикогенного эндофита/микролитр, в частности, где композиция инокулята содержит по меньшей мере 3 фрагмента гиф токсикогенного эндофита на 6 микролитров, необязательно, где композиция инокулята суспендирована в разбавителе; и
выращивание указанного семени хвойного или проростка хвойного с получением проростка хвойного с повышенной устойчивостью к вредителям.1. A method of obtaining a coniferous plant seedling with increased resistance to pests, comprising: inoculating a coniferous seed or intact coniferous seedlings with an isolated toxicogenic endophyte during the time interval of sensitivity, when the coniferous seed or coniferous seedling is sensitive to colonization with toxicogenic endophyte, where the time interval of sensitivity for the seed during stratification of the seed and for coniferous seedlings, there is an interval from the stage of after emergence to the period of complete formation cuticles, where the inoculation step involves bringing coniferous seed or coniferous seedling into contact with a toxigenic endophyte inoculum composition, where the toxigenic endophyte is optionally in the form of toxigenic endophyte hyphae fragments, and the inoculum composition contains at least 1-25 toxigenic endophyte hyphae fragments / 6 microliters, optionally at least 1-4 toxigenic endophyte hyphae fragments / microliter, and / or optionally at least 0.2-4 toxicogenic endophyte hyphae fragments / micro TDI, particularly where an inoculum composition contains at least 3 fragments hyphae toxigenic endophyte 6 microliters, optionally, wherein the composition of inoculum suspended in the diluent; and
growing said coniferous seed or coniferous seedling to produce a coniferous seedling with increased resistance to pests. 2. Способ по п.1, где стадия инокуляции включает приведение проростка в контакт с токсикогенным эндофитом посредством i) приведения в контакт поверхности проростка с токсикогенным эндофитом и/или композицией инокулята или ii) приведения в контакт среды для роста проростка, обеспечивающей проросток токсикогенным эндофитом и/или композицией инокулята, в частности, где стадия инокуляции включает опрыскивание проростка токсикогенным эндофитом и/или композицией инокулята, например, где опрыскивание включает способ опрыскивания, выбранный из группы, состоящей из затуманивания, опрыскивания почвы, опрыскивания из баллона, штангового опрыскивания, воздуходувного опрыскивания и веерообразного распыления, в частности, где способ опрыскивания включает штанговое опрыскивание или опрыскивание из баллона, например, где штанговое опрыскивание предусматривает наличие штангового опрыскивателя, линии орошения, соединенной со штанговым опрыскивателем, и инжекторного насоса, где инжекторный насос инъецирует выделенный токсикогенный эндофит на линию орошения, и штанговый опрыскиватель распыляет выделенный токсикогенный эндофит на проросток, необязательно, где среда для роста представляет собой горшечную смесь.2. The method according to claim 1, where the inoculation step comprises bringing the seedling into contact with the toxicogenic endophyte by i) contacting the surface of the seedling with the toxicogenic endophyte and / or the inoculum composition, or ii) contacting the seedling growth medium providing the seedling with the toxicogenic endophyte and / or the inoculum composition, in particular, where the inoculation step includes spraying the seedling with a toxicogenic endophyte and / or the inoculum composition, for example, where the spraying includes a spraying method selected from a group consisting of misting, spraying the soil, spraying from a cylinder, boom spraying, blowing spraying and fan-shaped spraying, in particular, where the spraying method includes booster spraying or spraying from a cylinder, for example, where boom spraying involves the presence of a boom spraying line, with a boom sprayer and an injection pump, where the injection pump injects the selected toxicogenic endophyte onto the irrigation line, and the boom sprayer l sprays selected toxigenic endofit on seedling optionally, wherein growth medium is potting mix. 3. Способ по п.1 или 2, где инокулируемая композиция содержит токсикогенный эндофит и носитель, и носитель содержит иглу хвойного, где игла хвойного содержит токсикогенный эндофит, необязательно, содержащую токсикогенный эндофит на поверхности иглы хвойного или внутри иглы хвойного.3. The method according to claim 1 or 2, where the inoculable composition contains a toxicogenic endophyte and a carrier, and the carrier contains a conifer needle, where the conifer needle contains a toxicogenic endophyte, optionally containing a toxicogenic endophyte on the surface of a conifer needle or inside a conifer needle. 4. Способ по п.1, где стадия инокуляции предусматривает приведение семени хвойного в контакт с выделенным токсикогенным эндофитом посредством замачивания семени в растворе, содержащем токсикогенный эндофит, необязательно, где семя замачивают в растворе в течение ночи, высушивают и замораживают предпочтительно при 2-6°С.4. The method according to claim 1, where the inoculation step involves bringing the coniferous seed into contact with the isolated toxicogenic endophyte by soaking the seed in a solution containing the toxicogenic endophyte, optionally where the seed is soaked in the solution overnight, dried and frozen, preferably at 2-6 ° C. 5. Способ по п.1, включающий повторение стадии инокуляции, необязательно, предусматривающий инокуляцию семени хвойного или проростка с помощью по меньшей мере двух стадий инокуляции, где способ инокуляции выбран из группы, состоящей из опрыскивания, проростка хвойного, замачивания семени хвойного вместе с токсикогенным эндофитом, и/или их сочетания, необязательно, инокуляции семени, когда семя находится на стадии стратификации семени, и снова инокуляции, когда проросток дорастает до стадии послевсхода.5. The method according to claim 1, comprising repeating the inoculation step, optionally providing for inoculating coniferous seed or seedling using at least two inoculation steps, wherein the inoculation method is selected from the group consisting of spraying, coniferous seedling, soaking coniferous seed together with toxicogenic endophyte, and / or their combination, optionally, inoculation of the seed, when the seed is at the stage of stratification of the seed, and again inoculation, when the seedling grows to the stage of post-emergence. 6. Способ по п.1, дополнительно включающий определение, колонизирован ли проросток хвойного эндофитом, посредством приведения образца проростка хвойного в контакт со средством для детекции, направленным против токсикогенного эндофита или токсина, продуцируемого токсикогенным эндофитом, где специфическое связывание средства для детекции в образце указывает на колонизацию, необязательно, где колонизация включает наличие токсикогенного эндофита, присутствующего в количестве, адекватном для уменьшения скорости роста вредителя, развития вредителя и/или уменьшения набора массы вредителя по сравнению с ростом вредителя на неинокулированном проростке хвойного, необязательно, где колонизация включает распространение токсикогенного эндофита на проростке-хозяине в количестве, адекватном для уменьшения скорости роста, развития вредителя и/или уменьшения набора массы вредителя для личинок гусеницы листовертки-почкоеда елового в анализе личинок гусеницы листовертки-почкоеда елового по сравнению с ростом гусеницы листовертки-почкоеда елового на неинокулированном проростке хвойного.6. The method according to claim 1, further comprising determining whether the coniferous seedlings are colonized by contacting the coniferous seedling sample with a detection agent directed against a toxicogenic endophyte or a toxin produced by a toxicogenic endophyte, where the specific binding of the detection agent in the sample indicates colonization, optionally, where the colonization includes the presence of toxicogenic endophyte present in an amount adequate to reduce the growth rate of the pest, development the pest and / or reduce the gain of the pest mass compared to the growth of the pest on an uninoculated coniferous seedling, optionally where the colonization includes the spread of the toxicogenic endophyte on the host seedling in an amount adequate to reduce the growth rate, develop the pest and / or reduce the gain of the pest mass for the larvae spruce leaf-bud caterpillar tracks in the analysis of larvae of the spruce bud-leaf bud-caterpillar compared to the growth of the spruce bud-leaf bud caterpillar track on an uninoculated sprout e pine. 7. Способ по п.1, где эндофит продуцирует по меньшей мере одно соединение токсина, выбранное из группы, состоящей из ругулозина, вермикулина, 5-метоксикарбонилмеллеина, 5-формилмеллеина, 5-метилмеллеина, 3-бутил-4-метилфуран-2(5Н)-он-бутиролактонтирозола, меллеина, 8-гидрокси-6-метокси-3-пропил-3,4-дигидроизокумарина или 3-метил-5,7-диметоксифталида, их вариантов и модифицированных растением форм, в частности, где соединение токсина присутствует в игле хвойного в количестве по меньшей мере 0,15 микрограмм на грамм иглы, например, где соединение токсина представляет собой ругулозин и присутствует в игле хвойного в количестве по меньшей мере 0,15 микрограмм на грамм иглы, предпочтительно, где соединение токсина присутствует в игле хвойного в количестве по меньшей мере 10 микромоль, например, где ругулозин присутствует в игле хвойного в количестве по меньшей мере 10 микромоль или где вермикулин присутствует в игле хвойного в количестве по меньшей мере 10 микромоль.7. The method according to claim 1, where the endophyte produces at least one toxin compound selected from the group consisting of rugulosin, vermiculin, 5-methoxycarbonylmelein, 5-formylmelein, 5-methylmelein, 3-butyl-4-methylfuran-2 ( 5H) -on-butyrolactone tyrosol, melein, 8-hydroxy-6-methoxy-3-propyl-3,4-dihydroisocoumarin or 3-methyl-5,7-dimethoxyphthalide, variants thereof and plant-modified forms, in particular, where the toxin compound present in the conifer needle in an amount of at least 0.15 micrograms per gram needle, for example, where the toxin compound represents rugulosin and is present in the conifer needle in an amount of at least 0.15 micrograms per gram of needle, preferably where the toxin compound is present in the conifer needle in an amount of at least 10 micromoles, for example, where rugulosin is present in the conifer needle in an amount of at least at least 10 micromoles or where vermiculin is present in the conifer needle in an amount of at least 10 micromoles. 8. Способ по п.1, где токсикогенный эндофит включает эндофит Phialocephala, эндофит Xylariaceae, эндофит Lophodermium или колонизирующий эндофит Picea, необязательно, где токсикогенный эндофит содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 50, по меньшей мере 100 или по меньшей мере 200 нуклеотидами из последовательности, выбранной из группы из SEQ ID NO:1-28, или содержащую эту последовательность, например, где токсикогенный эндофит выбран из группы, состоящей из 5WS22E1, 5WS11/1, 05-37A, 06-486D, 06-485А, 04-052В, 06-011В, 06-011D, 06-012C, 06-013А, 06-014С, 08-040В, 06-264А, 06-332A, 06-268A, 07-013D, 08-011D, 01-002A, 04-002G, 03-020B, 04-012A, 06-063D, 02-002C, 06-073C, 06-094E, 06-255A, 06-097D и 08-018A, предпочтительно, где токсикогенный эндофит представляет собой 5WS22E1, или где токсикогенный эндофит представляет собой 5WS11/1, или где токсикогенный эндофит представляет собой 05-37A, или где токсикогенный эндофит представляет собой 06-486D, или где токсикогенный эндофит представляет собой 06-485А.8. The method according to claim 1, where the toxicogenic endophyte comprises a Phialocephala endophyte, Xylariaceae endophyte, Lophodermium endophyte, or Picea colonizing endophyte, optionally, where the toxicogenic endophyte contains a nucleic acid sequence having at least 50, at least 100, or at least 200 nucleotides from the sequence selected from the group of SEQ ID NO: 1-28, or containing this sequence, for example, where the toxicogenic endophyte is selected from the group consisting of 5WS22E1, 5WS11 / 1, 05-37A, 06-486D, 06-485A, 04-052V, 06-011V, 06-011D, 06-012C, 06-013A, 06-014C, 08-040V, 06-264A, 06-332A, 06-268A, 07- 013D, 08-011D, 01-002A, 04-002G, 03-020B, 04-012A, 06-063D, 02-002C, 06-073C, 06-094E, 06-255A, 06-097D and 08-018A, preferably, where the toxicogenic endophyte is 5WS22E1, or where the toxicogenic endophyte is 5WS11 / 1, or where the toxicogenic endophyte is 05-37A, or where the toxicogenic endophyte is 06-486D, or where the toxicogenic endophyte is 06-485A. 9. Способ по п.1, где проросток хвойного инокулируют в период непрерывного удлинения верхушки побега, необязательно, когда длина побега составляет более 10 мм и менее 100 мм, или до полного формирования кутикулы игл, или когда присутствующий процент игл с промежуточной дифференцировкой больше, чем процент полностью дифференцированных игл.9. The method according to claim 1, where the seedlings of conifers are inoculated during continuous elongation of the apex of the shoot, optionally, when the shoot length is more than 10 mm and less than 100 mm, or until the needle cuticle is completely formed, or when the percentage of needles with intermediate differentiation is greater, than the percentage of fully differentiated needles. 10. Способ по п.3, где распыление включает распыление на проросток хвойного каплей жидкости инокулята, содержащих выделенный токсикогенный эндофит хвойных и воду, так, что по меньшей мере порция токсикогенных эндофитов и вода контактируют с проростком хвойного в условиях непрерывной влажности в течение по меньшей мере 12 ч.10. The method according to claim 3, where the spraying involves spraying on the seedlings of a coniferous drop of inoculum fluid containing isolated toxicogenic endophytes of conifers and water, so that at least a portion of the toxicogenic endophytes and water are in contact with the seedlings of the conifers under conditions of continuous humidity for at least at least 12 hours 11. Способ по п.1, где проросток хвойного представляет собой проросток ели, такой как проросток белой ели или проросток красной ели, проросток пихты или проросток сосны.11. The method according to claim 1, where the coniferous seedling is a spruce seedling, such as a white spruce seedling or a red spruce seedling, a fir seedling or a pine seedling. 12. Способ по п.9, где проросток хвойного инокулируют, если проросток обладает высотой по меньшей мере 1 см и высотой менее 10 см, в частности, где проросток обладает высотой по меньшей мере 1 см и высотой менее 6 см, более конкретно, где проросток обладает высотой по меньшей мере 2 см и высотой менее 5 см, где проросток обладает высотой по меньшей мере 3 см и высотой менее 5 см, необязательно, где проросток обладает высотой по меньшей мере 4 см и высотой менее 5 см, где проросток обладает высотой по меньшей мере 3 см и высотой менее 4 см или где проросток обладает высотой 1-2 см, высотой 2-3 см, высотой 3-4 см, высотой 4-5 см, высотой 5-6 см, высотой 6-7 см, высотой 7-8 см, высотой 8-9 см, высотой 9-10 см; или где проросток насчитывает от 2 недель до 16 недель после прорастания, в частности, где проросток насчитывает от 6 недель до 10 недель после прорастания, более конкретно, где проросток насчитывает 7-9 недель после прорастания, или где проросток насчитывает 8 недель после прорастания.12. The method according to claim 9, where the sprout of coniferous is inoculated if the sprout has a height of at least 1 cm and a height of less than 10 cm, in particular, where the sprout has a height of at least 1 cm and a height of less than 6 cm, more specifically, where the sprout has a height of at least 2 cm and a height of less than 5 cm, where the sprout has a height of at least 3 cm and a height of less than 5 cm, optionally where the sprout has a height of at least 4 cm and a height of less than 5 cm, where the sprout has a height at least 3 cm and a height of less than 4 cm or where the seedling is about it has a height of 1-2 cm, a height of 2-3 cm, a height of 3-4 cm, a height of 4-5 cm, a height of 5-6 cm, a height of 6-7 cm, a height of 7-8 cm, a height of 8-9 cm, a height 9-10 cm; or where the seedling is from 2 weeks to 16 weeks after germination, in particular where the seedling is from 6 weeks to 10 weeks after germination, more specifically, where the seedling is 7-9 weeks after germination, or where the seedling is 8 weeks after germination. 13. Способ по п.11, где проросток белой ели инокулируют токсикогенным эндофитом белой ели, выбранным из группы, содержащей 5WS22E1, 5WS11/1, 05-037A, 06-486D, 06-485А, 04-052В, 06-011В, 06-011D, 06-012C, 06-013А, 06-014С и 08-040В, или где проросток красной ели инокулируют токсикогенным эндофитом красной ели, выбранным из группы, содержащей 06-264А, 06-332А, 06-268А, 07-013D, 08-011D, 01-002A, 04-002G, 03-020В, 04-012А, 06-063D, 02-002С, 06-073С, 06-094Е, 06-255А, 06-097D и 08-018А, или где проросток пихты инокулируют токсикогенным эндофитом BF36H1.13. The method according to claim 11, where the spruce of white spruce is inoculated with toxicogenic endophyte of white spruce, selected from the group consisting of 5WS22E1, 5WS11 / 1, 05-037A, 06-486D, 06-485A, 04-052B, 06-011B, 06 -011D, 06-012C, 06-013A, 06-014C and 08-040B, or where the red spruce seedlings are inoculated with the toxicogenic red spruce endophyte selected from the group consisting of 06-264A, 06-332A, 06-268A, 07-013D , 08-011D, 01-002A, 04-002G, 03-020V, 04-012A, 06-063D, 02-002C, 06-073C, 06-094E, 06-255A, 06-097D and 08-018A, or where fir seedlings are inoculated with the toxicogenic endophyte BF36H1. 14. Способ по п.1, где вредитель выбран из группы, состоящей из гусеницы листовертки-почкоеда елового, пяденицы гемлоковой, листовертки-почкоеда елового, пилильщиков, гусеницы листовертки-почкоеда сосны Банкса, в частности, где вредитель представляет собой гусеницу листовертки-почкоеда елового или где вредитель представляет собой пяденицу гемлоковую или листовертку-почкоеда елового, или пилильщиков, и вызывающего заболевание грибкового патогенна, такого как вызывающий заболевание грибок-вредитель, выбранный из группы, содержащей серянку сосны веймутовой и виды возбудителей фузариоза.14. The method according to claim 1, where the pest is selected from the group consisting of a caterpillar of the spruce leaf bud, haemlock moth, spruce leaf bud, sawflies, caterpillar of the Banks pine leaf bud, in particular where the pest is a caterpillar of the bud leaf bud spruce, or where the pest is a hemlock moth or spruce bud, or sawfly, and a disease-causing fungal pathogen, such as a disease-causing pest fungus selected from the group of Seryanka Weimutian pine and species of causative agents of Fusarium. 15. Способ по п.1, где стадии инокуляции предшествует выделение токсикогенного эндофита из донорного растения и культивирование токсикогенного эндофита, необязательно, где стадия выделения токсикогенного эндофита из донорного растения включает: выделение токсикогенного эндофита-кандидата из игл донорного растения;
необязательно, анализ токсичности эндофита-кандидата для вредителя в анализе токсичности для вредителя, где токсичность эндофита-кандидата является показателем того, что токсикогенный эндофит-кандидат является токсикогенным эндофитом.15. The method according to claim 1, where the stage of inoculation is preceded by the isolation of the toxicogenic endophyte from the donor plant and the cultivation of the toxicogenic endophyte, optionally, where the step of isolating the toxicogenic endophyte from the donor plant includes: the isolation of the toxicogenic endophyte candidate from the needles of the donor plant;
optionally, an analysis of the toxicity of the candidate endophyte for the pest in a toxicity analysis for the pest, where the toxicity of the candidate endophyte is an indication that the toxicogenic endophyte candidate is a toxicogenic endophyte. 16. Способ по п.1, дополнительно включающий детекцию токсикогенного эндофита или токсина токсикогенного эндофита в образце инокулированного проростка посредством приведения образца в контакт со средством для детекции, направленным против токсикогенного эндофита или токсина токсикогенного эндофита, продуцируемого эндофитом, где детекция специфического связывания средства для детекции в образце указывает на колонизацию.16. The method according to claim 1, further comprising detecting a toxicogenic endophyte or toxigenic endophyte toxin in a sample of the inoculated seedling by bringing the sample into contact with a detection agent directed against the toxicogenic endophyte or toxicogenic endophyte toxin produced by the endophyte, where the detection of specific binding of the detection agent in the sample indicates colonization. 17. Хвойное растение, колонизированное выделенным токсикогенным эндофитом, где хвойное растение выращено из семени хвойного растения или проростка хвойного, полученного способом по любому из пп.1-16, где хвойное растение продуцирует токсин, замедляющий рост вредителей, в частности, где хвойное растение представляет собой хвойное дерево, проросток, куст или живую изгородь, более конкретно, проросток хвойного, необязательно, где токсин включает ругулозин, вермикулин или
5-метокси-карбонилмеллеин, например, где хвойное растение колонизировано токсикогенным эндофитом, выбранным из группы 05-37А, 06-486D, 06-485А, 04-052В, 06-011В, 06-011D, 06-012C, 06-013А, 06-014С, 08-040В, 06-264А, 06-332А, 06-268А, 07-013D, 08-011D, 01-002A, 04-002G, 03-020B, 04-012A, 06-063D, 02-002C, 06-073C, 06-094E, 06-255A, 06-097D и 08-018А, или где хвойное растение колонизировано токсикогенным эндофитом, содержащим по меньшей мере 50, по меньшей мере 100 или по меньшей мере 200 нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:3-28.17. A coniferous plant colonized by isolated toxicogenic endophyte, where the coniferous plant is grown from the seed of a coniferous plant or coniferous seedling obtained by the method according to any one of claims 1 to 16, where the coniferous plant produces a toxin that slows down the growth of pests, in particular, where the coniferous plant represents a coniferous tree, a sprout, a bush or a hedge, more specifically, a coniferous sprout, optionally where the toxin includes rugulosin, vermiculin or
5-methoxy-carbonylmellein, for example, where the coniferous plant is colonized with a toxicogenic endophyte selected from the group 05-37A, 06-486D, 06-485A, 04-052B, 06-011B, 06-011D, 06-012C, 06-013A, 06-014C, 08-040V, 06-264A, 06-332A, 06-268A, 07-013D, 08-011D, 01-002A, 04-002G, 03-020B, 04-012A, 06-063D, 02- 002C, 06-073C, 06-094E, 06-255A, 06-097D and 08-018A, or where the coniferous plant is colonized with a toxicogenic endophyte containing at least 50, at least 100, or at least 200 nucleotides of a sequence selected from a group consisting of SEQ ID NO: 3-28. 18. Хвойное растение по п.17, где вредитель включает гусеницу листовертки-почкоеда елового, и рост личинок гусеницы листовертки-почкоеда елового замедлен по меньшей мере на 5%, необязательно, на 10%, необязательно, на 10-30%, в анализе токсичности для вредителя, необязательно, в анализе личинок гусеницы листовертки-почкоеда елового. 18. The coniferous plant of claim 17, wherein the pest includes a spruce leaf bud-caterpillar caterpillar and the growth of spruce leaf-bud caterpillar larvae is slowed by at least 5%, optionally, 10%, optionally, 10-30%, in the analysis toxicity to the pest, optionally, in the analysis of the larvae of the caterpillar of the spruce budworm.

Images