RU2451292C2 - Method for detecting human endogenous blood plasma steroids - Google Patents
Method for detecting human endogenous blood plasma steroids Download PDFInfo
- Publication number
- RU2451292C2 RU2451292C2 RU2010104106/28A RU2010104106A RU2451292C2 RU 2451292 C2 RU2451292 C2 RU 2451292C2 RU 2010104106/28 A RU2010104106/28 A RU 2010104106/28A RU 2010104106 A RU2010104106 A RU 2010104106A RU 2451292 C2 RU2451292 C2 RU 2451292C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- steroids
- sample
- blood plasma
- modified
- extract
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, а точнее к клинической химии, в частности к способам определения уровня содержания эндогенных стероидов в организме.The invention relates to medicine, and more specifically to clinical chemistry, in particular to methods for determining the level of endogenous steroids in the body.
Известны способы определения органических веществ, в том числе и стероидов, методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией, например [1-3].Known methods for the determination of organic substances, including steroids, by gas chromatography in combination with mass spectrometry, for example [1-3].
Общим недостатком таких методов является трудоемкая и продолжительная во времени стадия получения летучих производных, для стероидов, что существенно усложняет ход анализа и увеличивает его продолжительность.A common drawback of such methods is the time-consuming and time-consuming stage of obtaining volatile derivatives for steroids, which significantly complicates the analysis and increases its duration.
Наиболее близким по своей технической сущности и достигаемому результату к заявляемому способу является способ определения стероидов в плазме крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС) [4].The closest in technical essence and the achieved result to the claimed method is a method for determining steroids in blood plasma by high performance liquid chromatography in combination with mass spectrometry (HPLC-MS) [4].
По указанному способу готовят стандартные растворы веществ-эталонов, снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики указанных растворов и исследуемой пробы плазмы крови в режиме сканирования в выбранном диапазоне и определяют наличие эндогенных стероидов путем сравнения зарегистрированных времени удержания и соотношений интенсивности характеристичных ионов веществ-эталонов и пробы.Using the specified method, standard solutions of reference substances are prepared, chromatographic and mass spectrometric characteristics of the indicated solutions and the studied blood plasma sample are recorded and recorded in the scanning mode in the selected range and the presence of endogenous steroids is determined by comparing the recorded retention time and intensity ratios of characteristic ions of reference substances and samples.
Недостатком указанного способа является высокий порог чувствительности определения стероидов, что требует анализа больших объемов плазмы крови и соответственно забора больших объемов крови, а это естественно травмирует пациента как физически, так и психологически. Кроме того, пробоподготовка требует большого времени (до 1,5 час).The disadvantage of this method is the high sensitivity threshold for determining steroids, which requires analysis of large volumes of blood plasma and, accordingly, the collection of large volumes of blood, and this naturally injures the patient both physically and psychologically. In addition, sample preparation requires a lot of time (up to 1.5 hours).
Техническим результатом, на достижение которого направлено создание данного изобретения, является снижение травмируемости пациента при заборе образца крови на исследование за счет снижения количества плазмы крови необходимого для проведения анализа (как результата понижения предела детектирования стероидов) и одновременно сокращение продолжительности проведения анализа.The technical result, the achievement of which the creation of this invention is directed, is to reduce the patient's injuries when taking a blood sample for examination by reducing the amount of blood plasma necessary for analysis (as a result of lowering the detection limit of steroids) and at the same time reducing the duration of the analysis.
Поставленный технический результат достигается тем, что в процессе пробоподготовки в образец исследуемой плазмы крови после экстрагирования добавляют внутренний стандарт, делят на две аликвоты, одну из которых химически модифицируют гидроксиламином в кислой среде и вторую ангидридным реагентом в виде раствора 4-диметиламинопиридина, триэтиламина и 2-метил-6-нитробензойного ангидрида в тетрагидрофуране, органические слои обоих модифицированных аликвот количественно отделяют, упаривают в токе азота, перерастворяют сухие остатки в мобильной фазе и далее вводят в систему ВЭЖХ-МС/МС с электрораспылительной ионизацией в режиме регистрации положительных ионов с последующей оценкой полученных результатов.The technical result achieved is achieved by the fact that in the process of sample preparation, an internal standard is added to the sample of blood plasma after extraction, it is divided into two aliquots, one of which is chemically modified with hydroxylamine in an acidic medium and the second with an anhydride reagent in the form of a solution of 4-dimethylaminopyridine, triethylamine and 2- methyl 6-nitrobenzoic anhydride in tetrahydrofuran, the organic layers of both modified aliquots are quantitatively separated, evaporated in a stream of nitrogen, redissolved dry residues in a mob Flax phase and then injected in the HPLC-MS / MS using electrospray ionization in the positive ion mode registration with subsequent evaluation of the results.
Известно, что стероиды химически достаточно инертны и поэтому они слабо ионизируются в процессе проведения ВЭЖХ-МС/МС анализа с электрораспылительной ионизацией. Указанное обстоятельство приводит к тому, что для получения достоверных результатов анализа приходится исследовать большие объемы плазмы крови (1,5-2,5 мл). Кроме того, пределы детектирования стероидов при проведении вышеуказанного анализа составляют от 10 нг/мл до 2,0 нг/мл. В то же время содержание стероидов у детей пубертального возраста и у женщин постклимактерического возраста составляет <10,0 и до 2,0 пг/мл.It is known that steroids are chemically inert enough and therefore they are weakly ionized during the HPLC-MS / MS analysis with electrospray ionization. This circumstance leads to the fact that in order to obtain reliable analysis results, it is necessary to study large volumes of blood plasma (1.5-2.5 ml). In addition, the detection limits of steroids during the above analysis are from 10 ng / ml to 2.0 ng / ml. At the same time, the content of steroids in children of puberty and women of postmenopausal age is <10.0 and up to 2.0 pg / ml.
Авторами найдено неожиданное решение: если химически модифицировать стероиды - ввести в молекулу дополнительные, но известные заместители, то такие модифицированные стероиды будут легко ионизироваться и соответственно детектирование их не представит затруднений, при этом существенно снизятся пределы детектирования.The authors found an unexpected solution: if chemically modifying steroids - introducing additional but known substituents into the molecule, then such modified steroids will be easily ionized and, accordingly, detecting them will not present any difficulties, while the detection limits will be significantly reduced.
Следует заметить, что в нашем случае стероиды модифицируются по гидроксильной (пиколиновые) и кетогруппам (оксимы), причем одни модифицируются, например тестостерон, обоими системами, другие по одной, как, например, кортизол (оксимы) и эстрадиол (пиколинаты). Для определения эндогенных стероидов в качестве таковых могут быть выбраны, например, андрогены (тестостерон, дегидроэпиандростерон, андростерон и т.п.); эстрогены (эстрон, эстрадиол, эстриол и т.п.); кортикостероиды (кортизол, кортизон, тетрагидро кортизол и т.п.) В том числе могут быть выбраны прегненолон, прегнандиол, прегнантриол, дигидротестостерон, 6β-ОН-кортизол, альдостерон и т.п.It should be noted that in our case, steroids are modified by hydroxyl (picolinic) and keto groups (oximes), some of which are modified, for example, testosterone, by both systems, others one by one, such as cortisol (oximes) and estradiol (picolinates). To determine endogenous steroids, for example, androgens (testosterone, dehydroepiandrosterone, androsterone, etc.) can be selected as such; estrogens (estrone, estradiol, estriol, etc.); corticosteroids (cortisol, cortisone, tetrahydro cortisol, etc.), including pregnenolone, pregnandiol, pregnantriol, dihydrotestosterone, 6β-OH-cortisol, aldosterone, etc. can be selected.
Стандартные растворы аналитов могут быть приготовлены растворением точных навесок в точном объеме растворителя, например метанола. Рабочие растворы могут быть получены разбавлением до соответствующей концентрации.Standard analyte solutions can be prepared by dissolving the exact weights in the exact volume of a solvent, such as methanol. Working solutions can be obtained by dilution to an appropriate concentration.
В качестве химических модификаторов могут быть использованы гидроксиламин и ангидридный реагент - раствор 4-диметиламинопиридина, триэтиламина и 2-метил-6-нитробензойного ангидрида в тетрагидрофуране.Hydroxylamine and anhydride reagent — a solution of 4-dimethylaminopyridine, triethylamine and 2-methyl-6-nitrobenzoic anhydride in tetrahydrofuran, can be used as chemical modifiers.
В качестве элюента могут быть использованы, например, смеси метанола, ацетата аммония и муравьиной кислоты.Mixtures of methanol, ammonium acetate and formic acid, for example, can be used as eluent.
В качестве экстрагента для ЖЖЭ может быть использован метилтретбутиловый эфир (МТБЭ).Methyl tert-butyl ether (MTBE) can be used as an extractant for LCE.
В качестве регуляторов рН могут быть использованы гидрокарбонат натрия и карбонат калия.Sodium bicarbonate and potassium carbonate can be used as pH adjusters.
В качестве системы ВЭЖХ-МС/МС могут быть использованы хромато-масс-спектрометр с тройным квадрупольным анализатором TSQ Quantum фирмы Thermo Finnigan (США), соединенным с высокоэффективным жидкостным хроматографом модели Surveyor, оснащенным автосамплером, насосом высокого давления и дегазатором фирмы Thermo Finnigan (США).As an HPLC-MS / MS system, a TSQ Quantum triple quadrupole analyzer (Thermo Finnigan (USA)) coupled to a Surveyor high-performance liquid chromatograph equipped with an autosampler, high-pressure pump and degasser (Thermo Finnigan (USA) can be used). )
В качестве вспомогательного оборудования могут быть использованы:As auxiliary equipment can be used:
- автоматический шейкер фирмы Glas-Col®, США - для ЖЖЭ;- automatic shaker from Glas-Col®, USA - for ZhEZh;
- центрифуга марки Rotina 46R фирмы Hettich, (ФРГ) - для получения контрастной поверхности раздела между органической и водной фазами;- a centrifuge brand Rotina 46R company Hettich, (Germany) - to obtain a contrasting interface between the organic and aqueous phases;
- упариватель фирмы Barnstead Inc.(ClilA), совмещенный с генератором азота марки Mistral-4 фирмы Schmidlin-DBS AG (Чехия) - для упаривания органического экстракта;- an evaporator manufactured by Barnstead Inc. (ClilA), combined with a nitrogen generator of the Mistral-4 brand from Schmidlin-DBS AG (Czech Republic) - for evaporation of the organic extract;
- колонка Eclipse XDB-C18, 150×2.1 мм, размер частиц 5 мкм, размер пор 100 Å, фирмы Agilent (США) - для хроматографического разделения.- Eclipse XDB-C18 column, 150 × 2.1 mm, particle size 5 μm,
В качестве мобильной фазы может быть использована система: 0,05% раствор муравьиной кислоты с 20 мМ раствором ацетата аммония (рН 3.0) (А) и метанол (В).As the mobile phase, the system can be used: a 0.05% solution of formic acid with a 20 mM solution of ammonium acetate (pH 3.0) (A) and methanol (B).
В качестве внутренних стандартов (ISTD) могут быть использованы например D3-тестостерон и метилтестостерон.As internal standards (ISTDs), for example, D 3 -testosterone and methyltestosterone can be used.
Изобретение может быть осуществлено следующим образом.The invention can be implemented as follows.
Растворяют точные навески веществ-эталонов в органических растворителях, разделяют каждый раствор на две аликвоты, одну из которых модифицируют гидроксиламином в кислой среде и вторую ангидридным реагентом в виде раствора 4-диметиламинопиридина, триэтиламина иThe exact weights of reference substances are dissolved in organic solvents, each solution is divided into two aliquots, one of which is modified with hydroxylamine in an acidic medium and the other with an anhydride reagent in the form of a solution of 4-dimethylaminopyridine, triethylamine and
2-метил-6-нитробензойного ангидрида в тетрагидрофуране, органические компоненты каждой модифицированной аликвоты количественно отделяют, упаривают в токе азота, перерастворяют сухие остатки в мобильной фазе и далее вводят в систему ВЭЖХ-МС/МС с электрораспылительной ионизацией в режиме регистрации положительных ионов. Снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики веществ-эталонов (детектируют не менее трех характеристических ионов каждого эталонного вещества, определяют время удержания, молекулярную массу, прекурсор-ионы, характеристичные ионы, нижний предел обнаружения) и полученные результаты вводят в программное обеспечение, например Xcalibur версии 1.3 фирмы Thermo Finnigan, США.2-methyl-6-nitrobenzoic anhydride in tetrahydrofuran, the organic components of each modified aliquot are quantitatively separated, evaporated in a nitrogen stream, re-dissolved dry residues in the mobile phase and then introduced into the HPLC-MS / MS system with electrospray ionization in the mode of registration of positive ions. The chromatographic and mass spectrometric characteristics of the reference substances are recorded and recorded (at least three characteristic ions of each reference substance are detected, the retention time, molecular weight, precursor ions, characteristic ions, and the lower detection limit are determined) and the results are entered into software, for example Xcalibur version 1.3 from Thermo Finnigan, USA.
Далее проводят пробоподготовку, при которой к образцу исследуемой плазмы крови добавляют внутренний стандарт, экстрагируют МТБЭ и делят экстракт на две аликвоты, одну из которых модифицируют гидроксиламином в кислой среде и вторую ангидридным реагентом в виде раствора 4-диметиламинопиридина, триэтиламина и 2-метил-6-нитробензойного ангидрида в тетрагидрофуране, органические слои обоих модифицированных аликвот количественно отделяют, упаривают в токе азота, перерастворяют сухой остаток в мобильной фазе и далее каждую аликвоту вводят в систему ВЭЖХ-МС/МС с электрораспылительной ионизацией в режиме регистрации положительных ионов с последующей оценкой полученных результатов путем сравнения зарегистрированных показателей времени удержания и соотношения интенсивности характеристичных ионов во всех растворах и пробах.Next, sample preparation is carried out in which an internal standard is added to the sample of the studied blood plasma, MTBE is extracted and the extract is divided into two aliquots, one of which is modified with hydroxylamine in an acidic medium and the second with an anhydride reagent in the form of a solution of 4-dimethylaminopyridine, triethylamine and 2-methyl-6 of nitrobenzoic anhydride in tetrahydrofuran, the organic layers of both modified aliquots are quantitatively separated, evaporated in a stream of nitrogen, the dry residue is redissolved in the mobile phase, and then each aliquot is introduced into HPLC-MS / MS system with electrospray ionization in the mode of registration of positive ions with subsequent evaluation of the results by comparing the recorded retention times and the intensity ratios of characteristic ions in all solutions and samples.
Следует отметить, что заявляемый способ определения эндогенных стероидов позволяет сократить продолжительность проведения анализа в 1,5-2,0 раза по сравнению с прототипом.It should be noted that the inventive method for determining endogenous steroids can reduce the duration of the analysis in 1.5-2.0 times compared with the prototype.
Для лучшего понимания изобретение может быть проиллюстрировано, но не исчерпано следующими примерами его конкретного осуществления.For a better understanding, the invention can be illustrated, but not exhausted by the following examples of its specific implementation.
Пример 1Example 1
А. Получение масс-спектров, определение характеристических ионов, времени удержания и пределов детектирования исследуемых стероидовA. Acquisition of mass spectra, determination of characteristic ions, retention time and detection limits of the studied steroids
Готовят стандартные растворы аналитов (1 мг/мл): кортизола, кортизона, тестостерона, дегидроэпиандростерона, андростерона, эстрона, эстрадиола, эстриола, кортизола, кортизона, тетрагидрокортизола, прегненолона, прегнандиола, прегнантриола, дигидротестостерона, 6β-ОН-кортизола и альдостерона (естественно разумеется, что из имеющегося массива известных стероидов вышеперечисленые стероиды выбраны по случайной схеме). Рабочие растворы готовят растворением точной навески стероидов-эталонов в метаноле. Далее получают рабочие растворы стероидов разбавлением стандартных растворов до содержания 10 мкг/мл. Из каждого рабочего раствора отбирают по две аликвоты объемом 100 мкл, вводят внутренний стандарт (D3-тестостерон и метилтестостерон) и химически модифицируют их. Параметры модификации: гидроксиламином в кислой (HCl) среде - 30-35 мин, 60-70°C; ангидридным реагентом в виде раствора 4-диметиламинопиридина, триэтиламина и 2-метил-6-нитробензойного ангидрида в тетрагидрофуране - 35-40 мин, температура комнатная. Органические слои обоих модифицированных аликвот количественно отделяют, упаривают в токе азота, перерастворяют сухой остаток в мобильной фазе состава: 0,05% раствор муравьиной кислоты с 20 мМ раствором ацетата аммония (рН 3.0).Prepare standard analyte solutions (1 mg / ml): cortisol, cortisone, testosterone, dehydroepiandrosterone, androsterone, estrone, estradiol, estriol, cortisol, cortisone, tetrahydrocortisol, pregnenolone, pregnanediol, pregnentiolone-dihydrotestosterone (dihydrotestosterone) Of course, from the existing array of known steroids, the aforementioned steroids were selected at random). Working solutions are prepared by dissolving the exact weight of reference steroids in methanol. Further, steroid working solutions are obtained by diluting standard solutions to a content of 10 μg / ml. Two aliquots of 100 μl were taken from each working solution, an internal standard (D 3 -testosterone and methyltestosterone) was introduced and chemically modified. Modification parameters: hydroxylamine in an acidic (HCl) medium - 30-35 min, 60-70 ° C; an anhydride reagent in the form of a solution of 4-dimethylaminopyridine, triethylamine and 2-methyl-6-nitrobenzoic anhydride in tetrahydrofuran - 35-40 min, room temperature. The organic layers of both modified aliquots are quantitatively separated, evaporated in a stream of nitrogen, and the dry residue is redissolved in the mobile phase of the composition: 0.05% formic acid solution with 20 mM ammonium acetate solution (pH 3.0).
Приготовленные таким образом рабочие растворы вводят в систему ВЭЖХ-МС/МС (хромато-масс-спектрометр с тройным квадрупольным анализатором TSQ Quantum фирмы Thermo Finnigan (США), соединенным с высокоэффективным жидкостным хроматографом модели Surveyor, оснащенным автосамплером, насосом высокого давления и дегазатором фирмы Thermo Finnigan (США). Анализ ведут при скорости потока подвижной фазы 0.2 мл/мин. Определяемые вещества разделяют градиентным элюированием при условиях: 0 мин - 40% В; 8-9 мин - 90% В; 12-18 мин - 40% В; общее время анализа с учетом стабилизации системы перед вводом следующего образца составляет 18 мин. Ионизацию при атмосферном давлении осуществляют электрораспылением в режиме регистрации положительных ионов. Напряжение на капилляре - 3.8 кВ; температура капилляра 245°C; скорость потока осушающего газа (азот) - 0.45 л/мин; скорость потока газа (аргон) в камере соударения - 0.075 л/мин; температура в камере ионизации 200°C; давление на распылителе - 2 атм.The working solutions thus prepared are introduced into an HPLC-MS / MS system (a TSQ Quantum Triple Quadrupole Analyzer (US) chromatograph-mass spectrometer connected to a Surveyor high-performance liquid chromatograph equipped with an autosampler, a high pressure pump and a Thermo degasser Finnigan (USA). The analysis is carried out at a flow rate of the mobile phase of 0.2 ml / min, The determined substances are separated by gradient elution under the conditions: 0 min - 40% B; 8-9 min - 90% B; 12-18 min - 40% B; total analysis time taking into account the stabilization of the per d the introduction of the next sample is 18 minutes, Ionization at atmospheric pressure is carried out by electrospray in the registration mode of positive ions.The voltage on the capillary is 3.8 kV; the temperature of the capillary is 245 ° C; the flow rate of the drying gas (nitrogen) is 0.45 l / min; the gas flow rate ( argon) in the impact chamber - 0.075 l / min; temperature in the
Детектирование определяемых веществ проводят в режиме регистрации селективных реакций (SRM). Ширина пика для прекурсор-ионов и соответствующих характерных ионов на первом квадруполе (Q1) и третьем квадруполе (Q3) составляет 0.5 а.е.м, (на половине высоты), время задержки - 5 мс. Обработку полученных данных (масс-спектры, характеристические ионы, время удержания и пределы детектирования исследуемых стероидов) проводят с применением программного обеспечения Xcalibur версии 1.3 фирмы Thermo Finnigan, США. Результаты анализа стероидов-эталонов (выборочно) представлены в Таблице 1.Detection of analytes is carried out in the mode of registration of selective reactions (SRM). The peak width for the precursor ions and the corresponding characteristic ions on the first quadrupole (Q1) and the third quadrupole (Q3) is 0.5 amu (at half height), the delay time is 5 ms. Processing of the obtained data (mass spectra, characteristic ions, retention time and detection limits of the studied steroids) is carried out using Xcalibur software version 1.3 of Thermo Finnigan, USA. The results of the analysis of reference steroids (optional) are presented in Table 1.
На Фиг.1 представлен МС/МС спектр немодифицированного тестостерона.Figure 1 presents the MS / MS spectrum of unmodified testosterone.
На Фиг.2 представлен МС/МС спектр оксим-производного тестостерона.Figure 2 presents the MS / MS spectrum of the oxime derivative testosterone.
На Фиг.3 представлен МС/МС спектр кето-производного тестостерона.Figure 3 presents the MS / MS spectrum of the keto-derivative testosterone.
Результаты анализа немодифицированных стероидов (выборочно) представлены в Таблице 2.Unmodified steroid analysis results (selectively) are presented in Table 2.
Б. Подготовка пробы и анализ исследуемой плазмы крови.B. Sample preparation and analysis of the studied blood plasma.
У пациента (мужчина, 35 лет) получают образец крови забором из вены (6,5 мл), отделяют плазму, разделяют ее на три части: объемом 1,5 мл, объемом 200 мкл и 100 мкл. В первую часть добавляют 50 мкл раствора внутреннего стандарта, содержащего D3-тестостерон (10 нг/мкл) и метилтестостерон (10 нг/мкл), подщелачивают до рН 9.5-10.0 смесью гидрокарбоната натрия и карбоната калия (1:2), добавляют 5 г сульфата аммония и далее экстрагируют с 5 мл МТБЭ в течение 10 мин на автоматическом экстракторе. Центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин, органический экстракт упаривают досуха в токе азота. Сухой остаток растворяют в 100 мкл метанола, затем 15 мкл раствора вводят в систему ВЭЖХ-МС/МС с электрораспылительной ионизацией при атмосферном давлении в режиме регистрации положительных ионов. Анализ ведут при следующих параметрах. Скорость потока подвижной фазы 0,2 мл/мин. Определяемые вещества разделяют градиентным элюированием при условиях: 0 мин - 40% В; 8-9 мин - 90% В; 12-18 мин - 40% В, общее время анализа с учетом стабилизации системы перед вводом следующего образца составляет 18 мин. Ионизацию при атмосферном давлении осуществляют электрораспылением в режиме регистрации положительных ионов. Напряжение на капилляре - 3.8 кВ; температура капилляра - 245°C; скорость потока осушающего газа (азот) - 0.45 л/мин; скорость потока газа (аргон) в камере соударения - 0.075 л/мин; температура в камере ионизации 200°C; давление на распылителе - 2 атм. Детектирование определяемых веществ проводят в режиме регистрации селективных реакций (SRM). Ширина пика для прекурсор-ионов и соответствующих характерных ионов на первом квадруполе (Q1) и третьем квадруполе (Q3) составляет 0.5 а.е.м. (на половине высоты), время задержки 5 мс. В Таблице 3 представлены обнаруженные вещества (стероиды) и найденные пределы детектирования определяемых в плазме крови веществ.A blood sample is taken from a patient (male, 35 years old) from a vein (6.5 ml), the plasma is separated, it is divided into three parts: a volume of 1.5 ml, a volume of 200 μl and 100 μl. In the first part, 50 μl of an internal standard solution containing D 3 -testosterone (10 ng / μl) and methyltestosterone (10 ng / μl) is added, alkalized to pH 9.5-10.0 with a mixture of sodium hydrogen carbonate and potassium carbonate (1: 2), 5 g of ammonium sulfate and then extracted with 5 ml of MTBE for 10 min on an automatic extractor. It is centrifuged at 2000 rpm for 5 minutes, the organic extract is evaporated to dryness in a stream of nitrogen. The dry residue is dissolved in 100 μl of methanol, then 15 μl of the solution is introduced into the HPLC-MS / MS system with electrospray ionization at atmospheric pressure in the mode of registration of positive ions. The analysis is carried out with the following parameters. The flow rate of the mobile phase is 0.2 ml / min. The substances to be determined are separated by gradient elution under the conditions: 0 min - 40% B; 8-9 min - 90% B; 12-18 min - 40% V, the total analysis time, taking into account the stabilization of the system before entering the next sample, is 18 min. Ionization at atmospheric pressure is carried out by electrospray in the mode of registration of positive ions. The voltage on the capillary is 3.8 kV; capillary temperature - 245 ° C; flow rate of the drying gas (nitrogen) - 0.45 l / min; gas flow rate (argon) in the collision chamber - 0.075 l / min; temperature in the
Вторую часть плазмы крови (200 мкл) разделяют на две аликвоты по 100 мкл, вводят в них внутренний стандарт как указано выше и химически модифицируют их. Параметры модификации те же, что и при приготовлении растворов стероидов-эталонов. Органические слои модифицированных аликвот количественно отделяют экстракцией ДМТБЭ, упаривают в токе азота, перерастворяют сухие остатки в 100 мкл мобильной фазы состава: 0,05% раствор муравьиной кислоты с 20 мМ раствором ацетата аммония (рН 3.0), далее 15 мкл раствора вводят в систему ВЭЖХ-МС/МС с электрораспылительной ионизацией при атмосферном давлении в режиме регистрации положительных ионов. Анализ ведут при тех же параметрах, что и в части «Б» описываемого примера. В Таблице 4 представлены характеристики стероидов, обнаруженных в пробе плазмы.The second part of the blood plasma (200 μl) is divided into two aliquots of 100 μl, the internal standard is introduced into them as described above and chemically modify them. The modification parameters are the same as in the preparation of standard steroid solutions. The organic layers of the modified aliquots are quantitatively separated by extraction with DMTBE, evaporated in a nitrogen stream, the solids are redissolved in 100 μl of the mobile phase of the composition: 0.05% formic acid solution with 20 mM ammonium acetate solution (pH 3.0), then 15 μl of the solution is introduced into the HPLC system -MS / MS with electrospray ionization at atmospheric pressure in the mode of registration of positive ions. The analysis is carried out with the same parameters as in part “B” of the described example. Table 4 shows the characteristics of steroids found in a plasma sample.
Установлено, что в исследуемом образце плазмы крови содержатся тестостерон оксим, тестостерон пиколинат, дегидроэпиандростерон пиколинат и андростендион диоксим.It was established that the test sample of blood plasma contains testosterone oxime, testosterone picolinate, dehydroepiandrosterone picolinate and androstenedione dioxime.
Далее третью часть плазмы крови (100 мкл) подвергают анализу как в первом абзаце части Б Примера 1 (без химической модификации). Результаты анализа отрицательные - ни один стероид не был обнаружен.Next, the third part of the blood plasma (100 μl) is subjected to analysis as in the first paragraph of part B of Example 1 (without chemical modification). The results of the analysis are negative - no steroid was detected.
Из сопоставления данных Таблиц 1-4 со всей очевидностью вытекает, что, во-первых, двойная химическая модификация стероидов обеспечивает снижение порога детектирования стероидов с 2000-10000 пг для немодифицированных до 2,0-5,0 пг для модифицированных гидроксиламином и до 2-5 пг для карбоксилатных производных; во-вторых, существенно (в 15-20 раз) уменьшается количество плазмы крови, необходимой для проведения анализа.From a comparison of the data in Tables 1-4, it clearly follows that, firstly, the double chemical modification of steroids reduces the threshold for detecting steroids from 2000-10000 pg for unmodified to 2.0-5.0 pg for modified with hydroxylamine and to 2- 5 pg for carboxylate derivatives; secondly, the amount of blood plasma necessary for the analysis is significantly (15-20 times) reduced.
Примеры 2-4Examples 2-4
Забирают по 100 мкл крови из безымянного пальца у трех пациентов: а) женщина постклимактерического возраста (67 лет), б) ребенок пубертального возраста (мальчик 12,5 лет) и в) ребенок пубертального возраста (девочка, 12,5 лет); из каждого образца крови отделяют плазму, разделяют ее на две равные части, добавляют внутренний стандарт, далее обе части химически модифицируют как в Примере 1, далее экстрагируют МТБЭ. Затем оба экстракта упаривают досуха в токе азота, перерастворяют в 50 мкл мобильной фазы состава 40/60 метанол/0,02% р-р муравьиной кислоты с 20 мМ р-ром ацетата аммония и далее каждую аликвоту вводят в систему ВЭЖХ-МС/МС с электрораспылительной ионизацией в режиме регистрации положительных ионов (параметры процесса осуществления анализа такие же, как в Примере 1). Результаты анализа представлены в Таблицах 5, 6 и 7 (по порядку пациентов - женщина 67 лет, мальчик 12,5 лет и девочка 12,5 лет соответственно).100 μl of blood from the ring finger are taken from three patients: a) a postmenopausal woman (67 years old), b) a puberty child (12.5 years old boy) and c) a puberty child (girl, 12.5 years old); plasma is separated from each blood sample, divided into two equal parts, an internal standard is added, then both parts are chemically modified as in Example 1, then MTBE is extracted. Then both extracts are evaporated to dryness in a stream of nitrogen, redissolved in 50 μl of the mobile phase of 40/60 methanol / 0.02% formic acid solution with 20 mM ammonium acetate solution, and then each aliquot is introduced into the HPLC-MS / MS system with electrospray ionization in the mode of registration of positive ions (the parameters of the analysis process are the same as in Example 1). The results of the analysis are presented in Tables 5, 6 and 7 (in order of patients - a woman of 67 years, a boy of 12.5 years and a girl of 12.5 years, respectively).
Как видно из описания и приведенных примеров осуществления способа, заявляемое изобретение обеспечивает высокую точность определения стероидов, снижает порог детектирования, позволяет уменьшить количество плазмы крови, необходимое для проведения анализа при одновременном сокращении времени проведения анализа.As can be seen from the description and examples of the implementation of the method, the claimed invention provides high accuracy in determining steroids, lowers the detection threshold, reduces the amount of blood plasma required for analysis while reducing analysis time.
Источники информацииInformation sources
1. Хим. фарм. Журнал, 1988, т.22, с.622.1. Chem. farm. Journal, 1988, v. 22, p. 622.
2. RU 2313086 C2, G01N 30/72, 2007.2. RU 2313086 C2,
3. J. Anal. Toxicol., 2005, v.29, №4, p.217.3. J. Anal. Toxicol., 2005, v.29, No. 4, p. 217.
4. Rapid Communications in Mass Spectroscopy, 20(22), p.3465-3476 - прототип.4. Rapid Communications in Mass Spectroscopy, 20 (22), p. 3465-3476 - prototype.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010104106/28A RU2451292C2 (en) | 2010-02-09 | 2010-02-09 | Method for detecting human endogenous blood plasma steroids |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010104106/28A RU2451292C2 (en) | 2010-02-09 | 2010-02-09 | Method for detecting human endogenous blood plasma steroids |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2010104106A RU2010104106A (en) | 2011-08-20 |
| RU2451292C2 true RU2451292C2 (en) | 2012-05-20 |
Family
ID=44755277
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010104106/28A RU2451292C2 (en) | 2010-02-09 | 2010-02-09 | Method for detecting human endogenous blood plasma steroids |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2451292C2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2483309C1 (en) * | 2012-03-05 | 2013-05-27 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Антидопинговый центр" | Method for detecting exogenicous steroids in human biological fluid |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1490650A1 (en) * | 1987-04-06 | 1989-06-30 | Институт биологической физики АН СССР | Method for quantitative analysis of steroid hormones |
| RU2095000C1 (en) * | 1995-07-19 | 1997-11-10 | Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр | Method for producing hydrolyzate from hydrobionts, method for producing cultured milk product, and method for determining quantity of triterpene glycosides |
| RU2183123C1 (en) * | 2001-03-26 | 2002-06-10 | Институт молекулярной генетики РАН | 5α- AND 5β-[4,5-α]-PREGNANE-3,20-DIONES HIGHLY LABELED WITH TRITIUM AND METHOD OF THEIR DETERMINATION IN BLOOD PLASMA |
| EA004300B1 (en) * | 1997-07-16 | 2004-02-26 | Энститю Насьональ Де Ля Санте Э Де Ля Решерш Медикаль | Cellular vesicle called "texosome", preparation and use thereof in immune stimulation |
| RU2380704C2 (en) * | 2007-09-26 | 2010-01-27 | Учреждение Российской академии наук Ордена Трудового Красного Знамени Институт нефтехимического синтеза им. А.В.Топчиева РАН (ИНХС РАН) | Method for simultaneous detection of clinically significant steroids in human biological fluid |
-
2010
- 2010-02-09 RU RU2010104106/28A patent/RU2451292C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1490650A1 (en) * | 1987-04-06 | 1989-06-30 | Институт биологической физики АН СССР | Method for quantitative analysis of steroid hormones |
| RU2095000C1 (en) * | 1995-07-19 | 1997-11-10 | Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр | Method for producing hydrolyzate from hydrobionts, method for producing cultured milk product, and method for determining quantity of triterpene glycosides |
| EA004300B1 (en) * | 1997-07-16 | 2004-02-26 | Энститю Насьональ Де Ля Санте Э Де Ля Решерш Медикаль | Cellular vesicle called "texosome", preparation and use thereof in immune stimulation |
| RU2183123C1 (en) * | 2001-03-26 | 2002-06-10 | Институт молекулярной генетики РАН | 5α- AND 5β-[4,5-α]-PREGNANE-3,20-DIONES HIGHLY LABELED WITH TRITIUM AND METHOD OF THEIR DETERMINATION IN BLOOD PLASMA |
| RU2380704C2 (en) * | 2007-09-26 | 2010-01-27 | Учреждение Российской академии наук Ордена Трудового Красного Знамени Институт нефтехимического синтеза им. А.В.Топчиева РАН (ИНХС РАН) | Method for simultaneous detection of clinically significant steroids in human biological fluid |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| М.MAZZARINO, F.BOTRÈ A fast liquid chromatographic/mass spectrometric screening method for the simultaneous detection of synthetic glucocorticoids, some stimulants, anti-oestrogen drugs and synthetic anabolic steroids, Rapid Commun Mass Spectrom. 20(22): 3465-76, 2006. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2010104106A (en) | 2011-08-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Aguilera et al. | Improved method of detection of testosterone abuse by gas chromatography/combustion/isotope ratio mass spectrometry analysis of urinary steroids | |
| Marcos et al. | Derivatization of steroids in biological samples for GC–MS and LC–MS analyses | |
| Touber et al. | Multi-detection of corticosteroids in sports doping and veterinary control using high-resolution liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry | |
| Giese | Measurement of endogenous estrogens: analytical challenges and recent advances | |
| Doué et al. | Analysis of glucuronide and sulfate steroids in urine by ultra-high-performance supercritical-fluid chromatography hyphenated tandem mass spectrometry | |
| Gouveia et al. | Mass spectrometry techniques in the survey of steroid metabolites as potential disease biomarkers: a review | |
| Pozo et al. | Comparison between triple quadrupole, time of flight and hybrid quadrupole time of flight analysers coupled to liquid chromatography for the detection of anabolic steroids in doping control analysis | |
| Choi et al. | Determination of estrone and 17β-estradiol in human hair by gas chromatography–mass spectrometry | |
| US7807472B2 (en) | Methods for separation and detection of ketosteroids and other carbonyl-containing compounds | |
| Khedr et al. | Liquid chromatography–tandem mass spectrometric analysis of ten estrogen metabolites at sub-picogram levels in breast cancer women | |
| Wozniak et al. | LC-MS/MS fast analysis of androgenic steroids in urine | |
| Regal et al. | Quantitative LC–MS/MS method for the sensitive and simultaneous determination of natural hormones in bovine serum | |
| Wang et al. | Improvement and extension of the application scope for matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis-oriented N-alkylpyridinium isotope quaternization | |
| Gravitte et al. | Liquid chromatography–mass spectrometry applications for quantification of endogenous sex hormones | |
| US11536733B2 (en) | Methods and systems for the detection of 11-oxo androgens by LC-MS/MS | |
| Zhang et al. | Rapid screening and quantification of glucocorticoids in essential oils using direct analysis in real time mass spectrometry | |
| RU2451292C2 (en) | Method for detecting human endogenous blood plasma steroids | |
| RU2390773C2 (en) | Method of detecting xenobiotics in human urine during doping tests | |
| JP3774888B2 (en) | Highly sensitive detection method for steroid compounds by LC-MS | |
| RU2764363C1 (en) | Method for determination of steroid hormone derivatives in urine | |
| CN109633014B (en) | Method for measuring contents of 21 terpenoids in tobacco leaves and application thereof | |
| RU2384846C1 (en) | Method of determining use of corticotropins for during doping tests in athletes | |
| Mardens et al. | Comparison of two extraction procedures for urinary organic acids prior to gas chromatography—mass spectrometry | |
| WO2008045323A2 (en) | Method for determination of dht levels in tissue samples | |
| Ke et al. | Impact of sample extraction on the accurate measurement of progesterone in human serum by liquid chromatography tandem mass spectrometry |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20120210 |