RU2451086C1 - Method for detecting specific nucleotide sequences and nucleotide replacements by real-time pcr with effect of probe fluorescence quenching shown by primer - Google Patents
Method for detecting specific nucleotide sequences and nucleotide replacements by real-time pcr with effect of probe fluorescence quenching shown by primer Download PDFInfo
- Publication number
- RU2451086C1 RU2451086C1 RU2010149524/10A RU2010149524A RU2451086C1 RU 2451086 C1 RU2451086 C1 RU 2451086C1 RU 2010149524/10 A RU2010149524/10 A RU 2010149524/10A RU 2010149524 A RU2010149524 A RU 2010149524A RU 2451086 C1 RU2451086 C1 RU 2451086C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- probe
- primer
- nucleotide
- fluorescence
- primers
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области молекулярной биологии, биотехнологии, генной инженерии и медицинской молекулярной диагностики, генодиагностики, а именно к выявлению специфических нуклеотидных последовательностей и нуклеотидных замен в известных последовательностях нуклеиновых кислот с использованием метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с эффектом гашения флуоресценции зонда праймером. Изобретение может быть использовано для детекции специфических нуклеотидных последовательностей, нуклеотидных замен (полиморфизмов) в известных нуклеотидных последовательностях и других природных или инженерных генных мутаций в сложном генетическом окружении.The invention relates to the field of molecular biology, biotechnology, genetic engineering and medical molecular diagnostics, gene diagnostics, namely the identification of specific nucleotide sequences and nucleotide substitutions in known nucleic acid sequences using the real-time polymerase chain reaction method (PCR-RV) with the effect quenching of fluorescence probe with primer. The invention can be used to detect specific nucleotide sequences, nucleotide substitutions (polymorphisms) in known nucleotide sequences and other natural or engineering gene mutations in a complex genetic environment.
Известны различные способы детекции специфических нуклеотидных последовательностей и нуклеотидных замен в исследуемых последовательностях нуклеиновых кислот с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами. Наиболее широко используется 5'-экзонуклеазный метод, основанный на эффекте пространственного разделения флуорофора и гасителя флуоресценции вследствие расщепления Taq ДНК-полимеразой зонда, связанного с амплифицируемой последовательностью ДНК (Heid, С.A., J.Stevens, К.J.Livak, and Р.М.Williams. 1996. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6:986-994).Various methods are known for detecting specific nucleotide sequences and nucleotide substitutions in the studied nucleic acid sequences using real-time polymerase chain reaction (PCR-RV) with fluorescently-labeled oligonucleotide probes. The most widely used 5'-exonuclease method, based on the effect of spatial separation of the fluorophore and fluorescence quencher due to Taq cleavage with the DNA polymerase of the probe associated with the amplified DNA sequence (Heid, C. A., J. Stevens, K. J. Livak, and R. M. Williams. 1996. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6: 986-994).
Основные недостатки этого способа:The main disadvantages of this method:
1) Необходимость использования отдельных зондов для каждой детектируемой нуклеотидной последовательности (или нуклеотидной замены) и вытекающее из этого ограничение возможности одновременного обнаружения множества последовательностей (или вариантов одной последовательности) в одной реакции. При этом максимальное число одновременно определяемых последовательностей соответствует числу используемых флуоресцентно-меченых зондов, сигнал которых может быть разделен детектирующим устройством.1) The need to use separate probes for each detected nucleotide sequence (or nucleotide substitution) and the consequent limitation on the possibility of simultaneous detection of multiple sequences (or variants of one sequence) in one reaction. Moreover, the maximum number of simultaneously determined sequences corresponds to the number of fluorescently-labeled probes used, the signal of which can be separated by a detecting device.
2) Невозможность выявления новых (неизвестных) нуклеотидных полиморфизмов в заданном участке последовательности.2) The inability to identify new (unknown) nucleotide polymorphisms in a given section of the sequence.
Существуют альтернативные способы ПЦР-РВ, позволяющие частично преодолеть вышеуказанные ограничения благодаря использованию анализа кривых плавления зондов (Lyon, E. 2001. Mutation detection using fluorescent hybridization probes and melting curve analysis. Expert. Rev. Mol. Diagn. 1:92-101) после завершения амплификации. К их числу относятся: ПЦР-РВ с парными зондами с резонансным переносом энергии (FRET) (Cardullo, R.A., S.Agrawal, С.Flores, P.С.Zamecnik and D.E.Wolf. 1988. Detection of nucleic acid hybridization by nonradiative fluorescence resonance energy transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 85:8790-8794. Didenko, V.V. 2001. DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications. Biotechniques 31:1106-1), ПЦР-РВ с резонансным переносом энергии между неспецифическим ДНК-связывающим флуорофором SYBR Green I и флуоресцентно-меченым зондом (iFRET) (Howell, W.M., M.Jobs, and A.J.Brookes. 2002. iFRET: an improved fluorescence system for DNA-melting analysis. Genome Res. 12:1401-1407), ПЦР-РВ с зондами, содержащими комплементарные концевые последовательности (Molecular Beacons) (Tyagi, S. and F.R.Kramer. 1996. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat. Biotechnol. 14:303-308), ПЦР-РВ с зондами, содержащими ДНК-лиганд и гаситель флуоресценции на 5'-конце и флуорофор на 3'-конце (MGB Eclipse) (Afonina, I.A., M.W.Reed, E.Lusby, I.G.Shishkina, and Y.S.Belousov. 2002. Minor groove binder-conjugated DNA probes for quantitative DNA detection by hybridization-triggered fluorescence. Biotechniques 32:940-949) и ПЦР-РВ с переносом энергии флуоресценции между донорным и акцепторным флуорофорами, расположенными на зонде и праймере (Lay, M.J. and С.Т.Wittwer. 1997. Real-time fluorescence genotyping of factor V Leiden during rapid-cycle PCR. Clin. Chem. 43:2262-2267. Wittwer, С.Т., Rasmussen, R.P., and Lay, M. Monitoring amplification with FRET probes. University of Utah Research Foundation, US. (US Patent 7160998). 09-01-2007). Во всех перечисленных случаях анализ кривых плавления предполагает использование зондов, флуоресценция которых отличается в свободном и связанном (с ДНК-мишенью) состоянии. Анализ осуществляется путем регистрации флуоресценции (F) при постепенном повышении температуры (Т) смеси, в которой находятся зонд и комплементарная ДНК. При связывании зонда с полностью комплементарной последовательностью образуется дуплекс с максимально высокой температурой плавления (Тm), тогда как связывание зонда с частично несовпадающей (мутантной) последовательностью приводит к образованию менее стабильного комплекса с более низкой Тm. Таким образом, анализ кривой флуоресценции зонда в зависимости от температуры реакционной смеси (dF/dT) позволяет определять значения Тm дуплексов и идентифицировать последовательности ДНК, как полностью комплементарные зонду, так и отличающиеся единичными нуклеотидными заменами. Возможно одновременное определение полностью комплементарной и мутантной последовательности (например, анализ гетерозиготности) с помощью одного зонда. Основным недостатком перечисленных выше подходов является сложность детекции определенных нуклеотидных замен в вариабельных последовательностях ДНК, где интересующие мутации находятся в окружении других (сателлитных) полиморфизмов. Использование всех перечисленных вариантов ПЦР-РВ является принципиально невозможным во всех случаях, когда минимальная длина зонда или его фрагмента, участвующего в связывании с ДНК мишенью, превышает расстояние между сателлитными полиморфизмами.There are alternative PCR-PB methods that can partially overcome the above limitations by using probe melting curve analysis (Lyon, E. 2001. Mutation detection using fluorescent hybridization probes and melting curve analysis. Expert. Rev. Mol. Diagn. 1: 92-101) after amplification is completed. These include: PCR-RV with paired probes with resonant energy transfer (FRET) (Cardullo, RA, S. Agrawal, C. Flores, P. C. Zamecnik and DEWolf. 1988. Detection of nucleic acid hybridization by nonradiative fluorescence Resonance energy transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8790-8794. Didenko, VV 2001. DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications. Biotechniques 31: 1106-1), PCR-RV with resonant energy transfer between the non-specific SYBR Green I DNA-binding fluorophore and the fluorescently-labeled probe (iFRET) (Howell, WM, M. Jobs, and AJBrookes. 2002. iFRET: an improved fluorescence system for DNA-melting analysis. Genome Res . 12: 1401-1407), PCR-RV with probes containing complementary terminal sequences Molecular Beacons (Tyagi, S. and FRKramer. 1996. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat. Biotechnol. 14: 303-308), PCR-RV with probes containing a DNA ligand and a fluorescence quencher on 5'-end and fluorophore at the 3'-end (MGB Eclipse) (Afonina, IA, MWReed, E. Lusby, IGShishkina, and YSBelousov. 2002. Minor groove binder-conjugated DNA probes for quantitative DNA detection by hybridization-triggered fluorescence. Biotechniques 32: 940-949) and PCR-RV with fluorescence energy transfer between donor and acceptor fluorophores located on the probe and primer (Lay, MJ and C. T. Wittwer. 1997. Real-time fluorescence genotyping of factor V Leiden during rapid -cycle PCR. Clin. Chem. 43: 2262-2267. Wittwer, S.T., Rasmussen, RP, and Lay, M. Monitoring amplification with FRET probes. University of Utah Research Foundation, US. (US Patent 7160998). 09-01-2007). In all these cases, the analysis of melting curves involves the use of probes whose fluorescence differs in the free and bound state (with the target DNA). The analysis is carried out by recording fluorescence (F) with a gradual increase in temperature (T) of the mixture in which the probe and complementary DNA are located. When the probe binds to a fully complementary sequence, a duplex with the highest melting point (Tm) is formed, while the binding of the probe with a partially mismatching (mutant) sequence leads to the formation of a less stable complex with a lower Tm. Thus, the analysis of the fluorescence curve of the probe depending on the temperature of the reaction mixture (dF / dT) allows one to determine the Tm values of duplexes and identify DNA sequences that are both completely complementary to the probe and differing in single nucleotide substitutions. It is possible to simultaneously determine a fully complementary and mutant sequence (for example, heterozygosity analysis) using one probe. The main disadvantage of the above approaches is the difficulty in detecting certain nucleotide substitutions in variable DNA sequences, where mutations of interest are surrounded by other (satellite) polymorphisms. The use of all these PCR-RV variants is fundamentally impossible in all cases when the minimum length of the probe or its fragment involved in binding to the target DNA exceeds the distance between satellite polymorphisms.
Наиболее близким аналогом изобретения можно считать вышеупомянутый способ ПЦР-РВ с переносом энергии флуоресценции между донорным и акцепторным флуорофорами, расположенными на зонде и праймере (Lay, M.J. and С.Т.Wittwer. 1997. Real-time fluorescence genotyping of factor V Leiden during rapid-cycle PCR. Clin. Chem. 43:2262-2267). В этом случае, так же как и в случае использования классических зондов FRET-типа (Didenko, V.V. 2001. DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications. Biotechniques 31:1106-1), применяются пары флуоресцентных красителей (донорный и акцепторный), между которыми возможен резонансный перенос энергии флуоресценции (Forster. 1948. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann. Physik. 437:55). Принципиальными недостатками обоих способов являются следующие:The closest analogue of the invention can be considered the aforementioned PCR-RV method with the transfer of fluorescence energy between donor and acceptor fluorophores located on the probe and primer (Lay, MJ and C. T. Wittwer. 1997. Real-time fluorescence genotyping of factor V Leiden during rapid -cycle PCR. Clin. Chem. 43: 2262-2267). In this case, as with classical FRET probes (Didenko, VV 2001. DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications. Biotechniques 31: 1106-1), pairs of fluorescent dyes are used ( donor and acceptor) between which resonance fluorescence energy transfer is possible (Forster. 1948. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann. Physik. 437: 55). The principal disadvantages of both methods are as follows:
1) Возможность частичного расщепления зондов в ходе ПНР за счет 5'-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы.1) The possibility of partial cleavage of probes during the NDP due to the 5'-exonuclease activity of DNA polymerase.
2) Невозможность проведения мультиплексного анализа для одновременной детекции нескольких ДНК-последовательностей в одной реакции из-за ограниченного набора пар донорных и акцепторных красителей, отличающихся по спектрам флуоресценции.2) The impossibility of conducting multiplex analysis for the simultaneous detection of several DNA sequences in one reaction due to the limited set of pairs of donor and acceptor dyes that differ in fluorescence spectra.
Недостатки описанных подходов устраняются в настоящем изобретении. Исходя из сказанного выше задача настоящего изобретения состоит в повышении эффективности и расширении возможностей анализа специфических нуклеотидных последовательностей и нуклеотидных полиморфизмов с помощью метода ПЦР-РВ за счет применения нового подхода, основанного на эффекте гашения флуоресценции зонда праймером, несущим нефлуоресцирующий гаситель флуоресценции.The disadvantages of the described approaches are eliminated in the present invention. Based on the foregoing, the objective of the present invention is to increase the efficiency and expand the capabilities of the analysis of specific nucleotide sequences and nucleotide polymorphisms using the PCR-RV method through the use of a new approach based on the quenching of fluorescence of the probe with a primer carrying a non-fluorescent fluorescence quencher.
Сущность изобретения состоит в том, что способ детекции специфических нуклеотидных последовательностей и нуклеотидных замен с помощью ПЦР в режиме реального времени с эффектом гашения флуоресценции зонда праймером включает выделение нуклеиновых кислот из исследуемых образцов, подбор соответствующих олигонуклеотидных зондов и праймеров, ПЦР-амплификацию одного или более необходимых (целевых) участков нуклеотидной последовательности, анализ кривых плавления зондов после проведения ПЦР, при этом для амплификации каждого из целевых участков нуклеотидной последовательности используют соответствующую пару праймеров, один из которых, а именно реверсный праймер, служит для образования цепи ДНК, комплементарной зонду, и содержит нефлуоресцирующий гаситель флуоресценции внутри нуклеотидной последовательности, ближе к 3' концу, а для детекции целевой нуклеотидной последовательности, находящейся между участками связывания праймеров, используют соответствующий 3'-флуоресцентно-меченый олигонуклеотидный зонд, участок связывания которого с одной стороны частично перекрывается с областью связывания немеченого (форвардного) праймера, а с другой стороны находится на расстоянии нескольких нуклеотидов от 3'-конца праймера, несущего гаситель флуоресценции, таким образом, что связывание зонда с цепью ДНК, образованной в результате элонгации реверсного праймера, приводит к сближению флуорофора и гасителя на расстояние, достаточное для эффективного гашения флуоресценции за счет флуоресцентно-резонансного переноса энергии (FRET) или образования стабильных комплексов между флуорофором и гасителем (статическое или контактное гашение).The essence of the invention lies in the fact that a method for detecting specific nucleotide sequences and nucleotide substitutions using real-time PCR with the effect of quenching the fluorescence of the probe with a primer includes the selection of nucleic acids from the samples to be studied, the selection of appropriate oligonucleotide probes and primers, PCR amplification of one or more necessary (target) sections of the nucleotide sequence, analysis of the melting curves of the probes after PCR, while for the amplification of each of the target The nucleotide sequence astringes use the corresponding pair of primers, one of which, namely, a reverse primer, serves to form a DNA strand complementary to the probe and contains a non-fluorescence fluorescence quencher inside the nucleotide sequence, closer to the 3 'end, and to detect the target nucleotide sequence located between sites of primer binding, use the appropriate 3'-fluorescently-labeled oligonucleotide probe, the binding site of which on one side is partially overlapped is associated with the binding region of the unlabeled (forward) primer, and on the other hand is located at a distance of several nucleotides from the 3'-end of the primer carrying the fluorescence quencher, so that the binding of the probe to the DNA chain formed as a result of elongation of the reverse primer leads to a convergence fluorophore and quencher at a distance sufficient to effectively quench fluorescence due to fluorescence resonance energy transfer (FRET) or the formation of stable complexes between the fluorophore and quencher (static silt quenching contact).
При этом имеется ряд вариантов осуществления предлагаемого способа.There are a number of embodiments of the proposed method.
Второй из них состоит в том, что детектируемые специфические нуклеотидные последовательности являются инвариантными, то есть не содержат нуклеотидных замен, делеций, инсерций и других генных мутаций.The second of them is that the detected specific nucleotide sequences are invariant, that is, they do not contain nucleotide substitutions, deletions, insertions and other gene mutations.
Третий вариант состоит в том, что, в отличие от второго варианта, он является способом детекции нуклеотидных замен, делеций, инсерций и других точечных генетических полиморфизмов (в первой нуклеиновой кислоте по сравнению со второй нуклеиновой кислотой).The third option is that, unlike the second option, it is a method for detecting nucleotide substitutions, deletions, insertions, and other point genetic polymorphisms (in the first nucleic acid compared to the second nucleic acid).
В четвертом варианте осуществления способа накопление продуктов ПЦР регистрируется по уменьшению исходного уровня флуоресценции зонда непосредственно в ходе амплификации.In a fourth embodiment of the method, the accumulation of PCR products is detected by decreasing the initial level of fluorescence of the probe directly during amplification.
В пятом варианте осуществления способа последовательности зонда и праймеров выбирают таким образом, чтобы Тm зонда была на 3-5°С выше Тm праймеров, а перекрывание последовательности зонда и немеченого праймера было минимальным, 1-3 нуклеотида.In a fifth embodiment of the method, the sequences of the probe and primers are selected so that the Tm of the probe is 3-5 ° C higher than the Tm of the primers, and the overlap of the sequence of the probe and unlabeled primer is minimal, 1-3 nucleotides.
В шестом варианте осуществления способа размер амплифицируемого участка нуклеотидной последовательности составляет 45-100 пн.In a sixth embodiment of the method, the size of the amplified portion of the nucleotide sequence is 45-100 bp.
В седьмом варианте осуществления способа длина участка перекрывания последовательностей зонда и немеченого праймера составляет один или несколько нуклеотидов.In a seventh embodiment of the method, the length of the overlapping portion of the probe and unlabeled primer sequences is one or more nucleotides.
В восьмом варианте осуществления способа последовательности зонда и реверсного праймера, несущего гаситель, выбирают таким образом, что связывание зонда с ДНК-мишенью осуществляется на расстоянии 0-20 нуклеотидов между 3' концами зонда и праймера.In an eighth embodiment of the method, the sequences of the probe and the reverse primer carrying the quencher are selected such that the probe is bound to the target DNA at a distance of 0-20 nucleotides between the 3 'ends of the probe and the primer.
В девятом варианте осуществления способа участок целевой нуклеотидной последовательности, комплементарный участку зонда, не перекрывающемуся с немеченым форвардным праймером, содержит одну или несколько анализируемых нуклеотидных позиций.In a ninth embodiment of the method, a portion of a target nucleotide sequence complementary to a portion of a probe that does not overlap with an unlabeled forward primer comprises one or more nucleotide positions to be analyzed.
Десятый вариант осуществления способа предполагает возможность связывания немеченого форвардного праймера с ДНК-мишенью непосредственно перед анализируемой нуклеотидной позицией, где могут присутствовать сателлитные полиморфизмы - несовпадающие нуклеотиды.The tenth embodiment of the method involves the possibility of binding an unlabeled forward primer to the target DNA immediately before the analyzed nucleotide position, where satellite polymorphisms - mismatched nucleotides - may be present.
Одиннадцатый вариант осуществления способа предполагает возможность наличия сателлетных полиморфизмов: нуклеотидных замен, коротких делеций, инсерций в участке нуклеотидной последовательности между 3' концом зонда и 3' концом реверсного праймера.The eleventh embodiment of the method suggests the possibility of satellite polymorphisms: nucleotide substitutions, short deletions, insertions in the region of the nucleotide sequence between the 3 'end of the probe and 3' end of the reverse primer.
Двенадцатый вариант осуществления способа состоит в том, что ПЦР в режиме реального времени является мультиплексной ПЦР в режиме реального времени.The twelfth embodiment of the method is that real-time PCR is real-time multiplex PCR.
Описанный выше дизайн ПЦР-РВ позволяет осуществлять идентификацию различных мутаций в области связывания зонда с помощью анализа кривых плавления после завершения амплификации. При полном соответствии последовательностей зонда и ДНК мишени Тm дуплекса является максимальной, а при наличии несовпадающих нуклеотидов - снижается в различной степени в зависимости от положения и характера мутации.The PCR-PB design described above allows the identification of various mutations in the binding region of the probe by analysis of the melting curves after amplification is completed. With complete match between the probe sequences and the target DNA, the Tm of the duplex is maximum, and in the presence of mismatched nucleotides it decreases to a different extent depending on the position and nature of the mutation.
Описанный способ отличается от наиболее близкого аналога (Lay, M.J. and С.Т.Wittwer. 1997. Real-time fluorescence genotyping of factor V Leiden during rapid-cycle PCR. Clin. Chem. 43:2262-2267) по следующим ключевым признакам:The described method differs from the closest analogue (Lay, M.J. and C.T. Wittwer. 1997. Real-time fluorescence genotyping of factor V Leiden during rapid-cycle PCR. Clin. Chem. 43: 2262-2267) in the following key ways:
1) Для мечения праймера используются не акцепторные флуорофоры, а неизлучающие гасители флуоресценции, такие как: BHQ1 (Black Hole Quencher-1, λmaxabs=534 нм, рабочий диапазон гашения 480-580 нм), BHQ2 (Black Hole Quencher-2, λmaxabs=579 нм, рабочий диапазон гашения 560-670 нм), BHQ3 (Black Hole Quencher-3, λmaxabs=672 нм, рабочий диапазон гашения 620-730 нм), RTQ1 (Real Time Quencher-1, λmaxabs=520 нм, рабочий диапазон гашения 470-570 нм), RTQ2 (Real Time Quencher-2, λmaxabs=625 нм, рабочий диапазон гашения 580-670 нм) и другие «темновые» гасители (Dark quenchers). Преимущество гасителей серий BHQ и RTQ состоит в том, что, обладая сходными физическими свойствами, они имеют разные спектральные характеристики и, следовательно, могут быть использованы в сочетании с различными флуорофорами, в том числе и для мультиплексной детекции. Предпочтительными флуорофорами, которые могут комбинироваться с гасителями серий BHQ и RTQ, являются, например, ксантиновые красители, включая флуоресцеины, цианины, родамины (Cook, R.M., Lyttle, M., and Dick, D. Dark quenchers for donor-acceptor energy transfer. Biosearch Technologies, Inc. (US Patent 7109312). 19-9-2006. Haugland, R.P., M. T.Z.Spence, and I.D.Johnson. 1996. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. Molecular Probes, Eugene, OR). Таким образом, предлагаемый нами способ обеспечивает широкие возможности выбора донорно-акцепторных пар (флуорофор-гаситель) и мультиплексного анализа (одновременной детекции нескольких ДНК-мишеней в одной реакции). Детекция продуктов амплификации осуществляется путем мониторинга флуоресценции красителя, связанного с зондом. О накоплении продуктов ПНР в ходе реакции амплификации можно судить по снижению уровня флуоресценции (если регистрация сигнала осуществляется при температуре ниже Тm дуплекса зонд-ДНК мишень). При проведении постамплификационного анализа кривых плавления диссоциация комплекса зонд-ДНК мишень сопровождается резким увеличением флуоресценции.1) Not acceptor fluorophores are used for primer labeling, but non-emitting fluorescence absorbers, such as: BHQ1 (Black Hole Quencher-1, λ max abs = 534 nm, quenching operating range 480-580 nm), BHQ2 (Black Hole Quencher-2, λ max abs = 579 nm, extinction range 560-670 nm), BHQ3 (Black Hole Quencher-3, λ max abs = 672 nm, extinction range 620-730 nm), RTQ1 (Real Time Quencher-1, λ max abs = 520 nm, the extinction range 470-570 nm), RTQ2 (Real Time Quencher-2, λ max abs = 625 nm, the extinction range 580-670 nm) and other “dark quenchers”. The advantage of the BHQ and RTQ series of absorbers is that, having similar physical properties, they have different spectral characteristics and, therefore, can be used in combination with various fluorophores, including for multiplex detection. Preferred fluorophores that can be combined with quenchers of the BHQ and RTQ series are, for example, xanthine dyes, including fluoresceins, cyanines, rhodamines (Cook, RM, Lyttle, M., and Dick, D. Dark quenchers for donor-acceptor energy transfer. Biosearch Technologies, Inc. (US Patent 7109312). 19-9-2006. Haugland, RP, MTZ Spence, and ID Johnson. 1996. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. Molecular Probes, Eugene, OR). Thus, our proposed method provides wide possibilities for the selection of donor-acceptor pairs (fluorophore-quencher) and multiplex analysis (simultaneous detection of several DNA targets in one reaction). Amplification products are detected by monitoring the fluorescence of the dye associated with the probe. The accumulation of PNR products during the amplification reaction can be judged by the decrease in the level of fluorescence (if the signal is recorded at a temperature below Tm of the probe-DNA duplex target). During post-amplification analysis of melting curves, the dissociation of the probe-DNA complex is accompanied by a sharp increase in fluorescence.
2) Используется частичное перекрывание областей связывания зонда и немеченого праймера, благодаря чему исключается возможность расщепления зонда полимеразой в процессе элонгации праймера, облегчается дизайн зондов для детекции мутаций в сложном генетическом окружении. Близкое расположение праймеров обеспечивает также высокую эффективность ПЦР.2) Partial overlapping of the binding sites of the probe and unlabeled primer is used, which eliminates the possibility of cleavage of the probe by polymerase during primer elongation, and the design of probes for detecting mutations in a complex genetic environment is facilitated. The close arrangement of the primers also provides high PCR efficiency.
Сущность изобретения поясняется чертежами.The invention is illustrated by drawings.
На фиг.1. представлена общая схема взаимного расположения праймеров и зонда, где 1 - зонд, 2 - праймер, 3 - участок прерывания последовательностей, 4 - флуорофор, 5 - гаситель флуоресценции.In figure 1. The general arrangement of primers and probe is presented, where 1 is a probe, 2 is a primer, 3 is a sequence interruption site, 4 is a fluorophore, 5 is a fluorescence quencher.
На фиг.2. представлено связывание зонда с комплементарной цепью ДНК.In figure 2. the binding of the probe to the complementary DNA strand is presented.
На фиг.3 представлена исходная последовательность, содержащая фланкирующие сателлитные полиморфизмы, где 6 - сателлитные полиморфизмы, 7 - анализируемая нуклеотидная позиция.Figure 3 presents the original sequence containing flanking satellite polymorphisms, where 6 are satellite polymorphisms, 7 is the analyzed nucleotide position.
На фиг.4 изображено связывание праймера с исходной последовательностью.Figure 4 shows the binding of the primer to the original sequence.
На фиг.5 представлен ПНР-продукт.Figure 5 presents the NDP product.
На фиг.6 показано связывание зонда.Figure 6 shows the binding of the probe.
На фиг.7 представлен анализ кривых плавления в случае гашения флуоресценции зонда при связывании с комплементарной цепью ДНК, для ПНР-продукта, содержащего нуклеотидную замену, - 8, ПНР-продукта, полностью комплементарного зонду, - 9, и для орицательного образца при отсутствии ПЦР-продукта - 10, где F - флуоресценция, Т - температура, dF/dT - производная флуоресценции по температуре, Tm1 - температура плавления зонда при связывании с полностью комплементарной последовательностью, Tm2 - температура плавления зонда при связывании с мутантной последовательностью.Figure 7 presents an analysis of the melting curves in the case of quenching the fluorescence of the probe upon binding to a complementary DNA chain, for a PNR product containing a nucleotide substitution, 8, a PNR product completely complementary to the probe, 9, and for an indicative sample in the absence of PCR -product - 10, where F is fluorescence, T is temperature, dF / dT is the derivative of fluorescence with respect to temperature, Tm1 is the melting temperature of the probe upon binding with a fully complementary sequence, Tm2 is the melting temperature of the probe upon binding with the mutant sequence lnostyu.
На фиг.8. представлен пример детекции мутаций: Glu104Lys, Arg164Cys/His/Ser, Ala237Thr, Gly238Ser и Glu240Lys, определяющих расширенный спектр активности ТЕМ β-лактамаз с помощью мультиплексной ПЦР-РВ с эффектом гашения флуоресценции зонда праймером и анализа кривых плавления, где FAM, ROX, Cy5, R6G - красители.On Fig. an example of mutation detection is presented: Glu104Lys, Arg164Cys / His / Ser, Ala237Thr, Gly238Ser and Glu240Lys, which determine the extended TEM β-lactamase activity spectrum using multiplex PCR-RV with the effect of quenching the fluorescence of the probe with a primer and analyzing the melting curves, X, where F5, where F , R6G - dyes.
На фиг.9. представлен пример детекции мутаций: Ser83Phe, Asp87Gly/Tyr/Asn в QRDR GyrA, определяющих резистентность к хинолонам у Salmonella enterica с помощью ПЦР-РВ с эффектом гашения флуоресценции зонда праймером и анализа кривых плавления.In Fig.9. presents an example of mutation detection: Ser83Phe, Asp87Gly / Tyr / Asn in QRDR GyrA, which determine the quinolone resistance in Salmonella enterica using PCR-RV with the effect of quenching probe fluorescence by primer and analysis of melting curves.
На фиг.10. представлен пример детекции аллельных вариантов VKORC1 и CYP2C9, ассоциированных с гиперчувствительностью к варфарину с помощью мультиплексной ПЦР-РВ с эффектом гашения флуоресценции зонда праймером и анализа кривых плавления.10. an example of detection of allelic variants of VKORC1 and CYP2C9 associated with hypersensitivity to warfarin using multiplex PCR-RV with the effect of quenching probe fluorescence by primer and analysis of melting curves is presented.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Способ осуществляется следующим образом:The method is as follows:
1) Осуществляют выбор последовательностей праймеров 1 (фиг.1, 2, 4, 5, 6) и зондов 2 (фиг.1, 2, 6) в соответствии со стандартными правилами, описанными в литературе (Peters, I.R., С.R.Helps, E.J.Hall, and M.J.Day. 2004. Real-time RT-PCR: considerations for efficient and sensitive assay design. J.Immunol.Methods 286:203-217) и с учетом следующих специфических требований:1) Carry out the selection of sequences of primers 1 (1, 2, 4, 5, 6) and probes 2 (1, 2, 6) in accordance with the standard rules described in the literature (Peters, IR, C.R. Helps, EJHall, and MJDay. 2004. Real-time RT-PCR: considerations for efficient and sensitive assay design. J.Immunol.Methods 286: 203-217) and taking into account the following specific requirements:
а) вначале осуществляют выбор зонда 2, комплементарного анализируемой последовательности ДНК. Затем подбирают амплификационные праймеры 1 таким образом, чтобы 3' конец праймера 1, несущего гаситель флуоресценции 3 (фиг.1, 2, 5, 6), находился на расстоянии 0-10 нуклеотидов от участка связывания зонда, а 3' и 5' концы немеченого праймера и зонда частично перекрывались;a) first, the choice of
б) при необходимости регистрации процесса накопления ПЦР-продуктов непосредственно в ходе амплификации (например, для проведения количественного анализа ДНК-мишени в исследуемых образцах) рекомендуется выбирать последовательности зонда и праймеров таким образом, чтобы Тm зонда была на 3-5°С выше Тm праймеров, а перекрывание последовательности зонда и немеченого праймера 4 (фиг.1, 2, 4, 5, 6) было минимальным и составляло 1-3 нуклеотида;b) if it is necessary to register the accumulation of PCR products directly during amplification (for example, for quantitative analysis of the target DNA in the studied samples), it is recommended to select the probe and primer sequences so that the probe Tm is 3-5 ° C higher than the Tm primers and the overlap of the sequence of the probe and unlabeled primer 4 (Figs. 1, 2, 4, 5, 6) was minimal and amounted to 1-3 nucleotides;
в) при отсутствии необходимости регистрации накопления ПЦР-продуктов в ходе амплификации Тm зонда и праймеров могут быть приблизительно одинаковы и могут варьировать в широком диапазоне;c) in the absence of the need to register the accumulation of PCR products during amplification of Tm probe and primers can be approximately the same and can vary over a wide range;
г) для выявления специфических нуклеотидных замен выбор цепи ДНК, комплементарной зонду, рекомендуется проводить таким образом, чтобы значения Тm зонда при связывании с полностью комплементарной и мутантной последовательностью отличались максимально.d) to identify specific nucleotide substitutions, the selection of a DNA strand complementary to the probe is recommended so that the values of Tm of the probe upon binding to a fully complementary and mutant sequence differ as much as possible.
2) Меченые олигонуклеотидные праймеры и зонды синтезируют путем химического присоединения флуорофора 5 (фиг.1, 2, 6) или гасителя к выбранной в соответствии с требованиями метода олигонуклеотидной последовательности. При создании зонда по данному изобретению флуоресцентная метка преимущественно присоединяется к 3'-концу олигонуклеотидной последовательности, хотя присоединение к внутренним сайтам также может быть использовано в некоторых конкретных случаях. При создании меченого праймера 4, в соответствии с данным изобретением, гаситель флуоресценции 3 присоединяется к внутренней позиции олигонуклеотидной цепи. Флуорофоры 5 (или гасители 3) вводятся в состав олигонуклеотидного зонда 2 (или праймера 1) преимущественно в виде производных амидитов. Альтернативно, флуорофоры 5 (или другие низкомолекулярные метки), содержащие реакционно-способные группировки (например, изотиоцианаты или активированные эфиры), могут вводиться с помощью реакции с реакционно-способной группировкой линкера, присоединенного к нуклеиновой кислоте (например, гексиламин). Кроме того, флуорофор 5 может быть прикреплен к 3'-концу олигонуклеотидной последовательности с использованием синтеза на модифицированном необходимыми реакционно-способными группировками (дериватизированном) твердом носителе (Cook, R.M., Lyttle, M., and Dick, D. Dark quenchers for donor-acceptor energy transfer. Biosearch Technologies, Inc. (US Patent 7109312). 19-9-2006).2) Labeled oligonucleotide primers and probes are synthesized by chemically attaching fluorophore 5 (FIGS. 1, 2, 6) or a quencher to an oligonucleotide sequence selected in accordance with the requirements of the method. When creating the probe of this invention, the fluorescent label is preferentially attached to the 3'-end of the oligonucleotide sequence, although attachment to internal sites can also be used in some specific cases. When creating labeled
3) Проводят выделение нуклеиновых кислот с использованием любых стандартных методов для последующего ПНР-анализа. Наличие в образцах потенциальных ингибиторов ПЦР оказывает минимальное влияние на результаты амплификации с помощью описанного подхода по сравнению с другими вариантами ПЦР-РВ вследствие небольшой длины ПНР-продуктов. При наличии в исследуемых образцах высокой исходной концентрации ДНК/РНК-мишени (>103-104 копий на реакцию) возможно использование методов быстрого лизиса клеток (с помощью повышенной температуры, щелочных и хаотропных реагентов и т.д.) без последующего удаления ингибиторов.3) Nucleic acids are isolated using any standard methods for subsequent PNR analysis. The presence of potential PCR inhibitors in the samples has a minimal effect on the amplification results using the described approach compared to other PCR-PB variants due to the short length of the PNR products. If the studied samples have a high initial concentration of the target DNA / RNA (> 10 3 -10 4 copies per reaction), it is possible to use methods of rapid cell lysis (using elevated temperature, alkaline and chaotropic reagents, etc.) without subsequent removal of inhibitors .
4) Проводят реакцию амплификации ДНК с помощью приборов для ПЦР в режиме реального времени. В реакции может использоваться эквимолярное соотношение праймеров 1, однако рекомендуется проведение ассиметричной ПЦР с соотношением немеченого и меченого праймеров 1: 1:2-1:10. Избыток праймера 1, несущего гаситель флуоресценции 3, способствует преимущественному накоплению в ходе ПЦР цепи ДНК, комплементарной зонду 2, что обеспечивает максимальную эффективность детекции. Рекомендуемые концентрации праймеров 1 в ПЦР смеси: 40-800 нМ; концентрация зонда 2: 80-400 нМ. В случае ассиметричной ПЦР количество циклов амплификации может быть увеличено по сравнению с обычной ПЦР. При проведении количественного ПЦР-анализа измерение уровня флуоресценции проводится на этапе отжига праймеров 1. Вследствие малой длины ПЦР-продуктов продолжительность этапов отжига и элонгации праймеров 1 может быть сокращена до нескольких секунд.4) Carry out a DNA amplification reaction using real-time PCR instruments. An equimolar ratio of
5) После завершения амплификации проводят анализ кривых плавления (фиг.3). Пространственное разделение флуорофора 5 и гасителя 3 в результате плавления комплекса зонд-ДНК-мишень приводит к увеличению флуоресценции. Идентификацию продуктов амплификации или выявление нуклеотидных замен в области связывания зонда осуществляют по значениям Тm, соответствующим пикам кривых плавления на графике dF/dT vs T.5) After amplification is completed, the melting curves are analyzed (FIG. 3). The spatial separation of
Пример 1. Мультиплексная детекция мутаций в генах ТЕМ β-лактамаз, определяющих расширенный спектр устойчивости к β-лактамным антибиотикам у клинических штаммов семейства EnterobacteriaceaeExample 1. Multiplex detection of mutations in TEM genes of β-lactamases, which determine the extended spectrum of resistance to β-lactam antibiotics in clinical strains of the Enterobacteriaceae family
β-Лактамазы ТЕМ-типа являются одними из наиболее распространенных ферментов, расщепляющих β-лактамные антибиотики и обуславливающих резистентность к ним грамотрицательных бактерий. Точечные мутации в генах blaTEM, соответствующие аминокислотным заменам Glul04→Lys, Arg164→Cys/His/Ser, Ala237→Thr, Gly238→Ser и Glu240→Lys, определяют расширенный спектр активности ТЕМ ферментов - способность гидролизовать все современные антибиотики группы цефалоспоринов.TEM-type β-lactamases are one of the most common enzymes that break down β-lactam antibiotics and cause their resistance to gram-negative bacteria. The point mutations in the bla TEM genes corresponding to the amino acid substitutions Glul04 → Lys, Arg164 → Cys / His / Ser, Ala237 → Thr, Gly238 → Ser and Glu240 → Lys determine the extended spectrum of TEM enzymes activity - the ability to hydrolyze all modern antibiotics of the cephalosporin group.
Для детекции 7 нуклеотидных замен в формате мультиплексной ПЦР-РВ использованы три пары праймеров, фланкирующих участки мутаций в кодонах 104, 164, 237-240, три зонда, комплементарных исходной (немутантной) последовательности blaTEM-1 меченных, соответственно, FAM, R6G, ROX, и один зонд, комплементарный мутантному варианту Lys240, меченный Су5 (табл.1, на которой представлены олигонуклеотидные праймеры и зонды, использованные для детекции мутаций в генах ТЕМ β-лактамаз).To detect 7 nucleotide substitutions in the PCR-PBX multiplex format, three pairs of primers flanking the mutation sites in
Состав ПЦР смеси общим объемом 25 мкл: праймеры и зонды в концентрации, указанной в таблице 1; 0,2 мМ дНТФ; 2 мМ MgCl2; 2,5 ед. Диа Так ДНК-полимеразы (ООО «ИнтерЛабСервис», Россия); 67 мМ Трис-НС1 (рН=8.3); 17 мМ (NH4)2SO4; 0,1% Твин-20; 0,12 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА); 8% глицерина и 5 мкл образца ДНК. Для обеспечения «горячего старта» ПЦР смесь праймеров, зондов и дНТФ вносили в реакционные пробирки отдельно, покрывали слоем легкоплавкого воска и после его застывания добавляли смеси остальных компонентов.The composition of the PCR mixture with a total volume of 25 μl: primers and probes in the concentration indicated in table 1; 0.2 mM dNTP; 2 mM MgCl 2 ; 2.5 units Dia Tak DNA polymerase (LLC InterLabService, Russia); 67 mM Tris-HC1 (pH = 8.3); 17 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; 0.1% Tween-20; 0.12 mg / ml bovine serum albumin (BSA); 8% glycerol and 5 μl of DNA sample. To ensure a “hot start” of PCR, a mixture of primers, probes, and dNTP was added to the reaction tubes separately, covered with a layer of low-melting wax, and after it solidified, mixtures of other components were added.
Выделение бактериальной ДНК: 2-3 колонии каждой культуры ресуспендировали в 100 мкл ТЕ буфера; инкубировали 20 мин при 99°С; центрифугировали 2 мин при 10000 g; 5 мкл надосадочной жидкости использовали в ПЦР.Isolation of bacterial DNA: 2-3 colonies of each culture were resuspended in 100 μl of TE buffer; incubated for 20 min at 99 ° C; centrifuged for 2 min at 10,000 g; 5 μl of supernatant was used in PCR.
Амплификацию и анализ кривых плавления проводили с помощью системы Rotor-Gene 2000 согласно следующему протоколу: начальная инкубация 15 мин при 80°С; денатурация 1 мин при 95°С; затем 40 циклов 15-сек денатурации при 95°С и 15-сек отжига-элонгации при 61°С c детекцией флуоресценции на каналах JOE и Су5; анализ кривых плавления с начальной инкубацией 2 мин при 45°С и последующим повышением температуры на 1°С каждые 10 сек до 80°С с постоянной детекцией флуоресценции на каналах FAM, JOE, ROX и Су5.Amplification and analysis of the melting curves was carried out using the Rotor-Gene 2000 system according to the following protocol: initial incubation for 15 minutes at 80 ° C; 1 min denaturation at 95 ° C; then 40 cycles of 15-second denaturation at 95 ° C and 15-second annealing-elongation at 61 ° C with fluorescence detection on JOE and Cy5 channels; analysis of melting curves with an initial incubation of 2 min at 45 ° C and a subsequent increase in temperature by 1 ° C every 10 seconds to 80 ° C with constant detection of fluorescence on the FAM, JOE, ROX and Cy5 channels.
Идентификацию последовательностей blaTEM «дикого типа» и мутаций в кодонах 104, 164 и 237-240 проводили в соответствии с температурой плавления зондов (фиг.4). В качестве контролей использовали штаммы энтеробактерий с известной нуклеотидной последовательностью генов blaTEM, включая 5 культур с генами «дикого типа», отличающимися только спектром молчащих мутаций, и 14 культур с мутациями, соответствующими амнокислотным заменам Glu104→Lys, Arg164→Cys/His/Ser, Ala237→Thr, Gly238→Ser, Glu240→Lys. Метод использован также для скрининга перечисленных мутаций у 718 клинических штаммов энтеробактерий-возбудителей нозокомиальных инфекций.Identification of wild type bla TEM sequences and mutations in
Для контрольных образцов показана возможность детекции и дифференциации всех перечисленных выше мутаций в любых комбинациях с помощью мультиплексной ПЦР-РВ и анализа кривых плавления зондов. Различия в значениях Тm зондов при связывании с полностью комплементарными и мутантными последовательностями ДНК-мишени составили от 4 до 10°С (фиг.4). Продемонстрирована возможность выявления ключевых мутаций (например, мутаций в кодоне 164) независимо от наличия расположенных в непосредственной близости сателлитных полиморфизмов 6 (фиг.3) (фланкирующих мутаций в кодонах 160 и 165). При анализе клинических штаммов у 533 (74,2%) культур обнаружены последовательности blaTEM «дикого типа», у 1 (0,1%) штамма - замена G/A (Arg164His), наличие которой подтверждено секвенированием гена.For control samples, the possibility of detection and differentiation of all the above mutations in any combination using multiplex PCR-RV and analysis of the melting curves of the probes is shown. Differences in the values of Tm probes upon binding to fully complementary and mutant target DNA sequences ranged from 4 to 10 ° C (Fig. 4). The possibility of detecting key mutations (for example, mutations in codon 164) was demonstrated regardless of the presence of
Пример 2. Анализ мутаций резистентности к хинолонам у Salmonella entericaExample 2. Analysis of mutations of resistance to quinolones in Salmonella enterica
Фторированные хинолоны являются основными антимикробным препаратами для лечения инвазивных сальмонеллезов. Устойчивость сальмонелл к хинолонам связна с мутациями мишени, А субъединицы ДНК-гиразы (GyrA), в области аминокислотных остатков 83-87, которые участвуют в связывании хинолонов и формируют так называемый QRDR участок (Quinolone Resistance Determining Region).Fluorinated quinolones are the main antimicrobial agents for the treatment of invasive salmonella. The resistance of salmonella to quinolones is associated with target mutations, A of the DNA gyrase subunit (GyrA), in the region of amino acid residues 83-87, which participate in the binding of quinolones and form the so-called QRDR site (Quinolone Resistance Determining Region).
Метод ПЦР-РВ с эффектом гашения флуоресценции зонда праймером использован для одновременной детекции нуклеотидных замен, соответствующих наиболее частым мутациям: Ser83→Phe, Asp87→Gly/Tyr/Asn, вызывающим хинолон-резистентность. В реакции использована одна пара праймеров, фланкирующих QRDR участок gyrA, и один зонд, последовательность которого совпадает с немутантным вариантом QRDR (табл.2, на которой представлены олигонуклеотидные праймеры и зонд, использованные для детекции мутаций в QRDR gyrA).The PCR-RV method with the effect of quenching the fluorescence of the probe with a primer was used to simultaneously detect nucleotide substitutions corresponding to the most frequent mutations: Ser83 → Phe, Asp87 → Gly / Tyr / Asn, causing quinolone resistance. The reaction used one pair of primers flanking the QRDR region of gyrA, and one probe, the sequence of which coincides with the non-mutant QRDR variant (Table 2, which shows the oligonucleotide primers and the probe used to detect mutations in QRDR gyrA).
Состав ПЦР смеси общим объемом 25 мкл: праймеры и зонды в концентрации, указанной в таблице 2; 0,2 мМ дНТФ; 2 мМ MgCl2; 2,5 ед. TaqF ДНК-полимеразы (ООО «ИнтерЛабСервис», Россия); 67 мМ Трис-НСl (рН=8.3); 17 мМ (NH4)2SO4; 0,1% Твин-20; 0,12 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА); 8% глицерина и 3 мкл образца ДНК.The composition of the PCR mixture with a total volume of 25 μl: primers and probes in the concentration indicated in table 2; 0.2 mM dNTP; 2 mM MgCl 2 ; 2.5 units TaqF DNA polymerase (LLC InterLabService, Russia); 67 mM Tris-Hcl (pH = 8.3); 17 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; 0.1% Tween-20; 0.12 mg / ml bovine serum albumin (BSA); 8% glycerol and 3 μl of DNA sample.
Выделение бактериальной ДНК: 2-3 колонии каждой культуры ресуспендировали в 100 мкл ТЕ буфера; инкубировали 20 мин при 99°С; центрифугировали 2 мин при 10000 g; 3 мкл надосадочной жидкости использовали в ПЦР.Isolation of bacterial DNA: 2-3 colonies of each culture were resuspended in 100 μl of TE buffer; incubated for 20 min at 99 ° C; centrifuged for 2 min at 10,000 g; 3 μl of supernatant was used in PCR.
Амплификацию и анализ кривых плавления проводили с помощью системы Rotor-Gene 2000 согласно следующему протоколу: начальная денатурация 15 мин при 95°С; затем 45 циклов 15-сек денатурации при 95°С и 20-сек отжига-элонгации при 55°С c детекцией флуоресценции на канале FAM; анализ кривых плавления с начальной инкубацией 3 мин при 35°С и последующим повышением температуры на 1°С каждые 10 сек до 75°С c постоянной детекцией флуоресценции на канале FАМ.Amplification and analysis of the melting curves was carried out using the Rotor-Gene 2000 system according to the following protocol:
Идентификацию мутаций проводили в соответствии с температурой плавления зонда: 59,2±0,05°С - для последовательности QRDR дикого типа, 53,8±0,14°С - для вариантов Gly83/Tyr83/Asn83 и 50,7±0,16°С - для Phe83 (фиг.5). В качестве контролей использовали штаммы S. enterica серотип Typhimurium с известными мутациями в QRDR gyrA. Метод применен для анализа структуры QRDR у 48 клинических штаммов сальмонелл, проявляющих чувствительность к хинолонам, и 32 изолятов, устойчивых к налидиксовой кислоте (минимальная подавляющая концентрация [МПК]≥128 мг/л). У чувствительных штаммов мутации в QRDR не выявлены; у 25 резистентных изолятов обнаружены мутации в позиции 87, у семи - замена Ser83→Phe. Результаты анализа подтверждены секвенированием участка gyrA в 100% случаев.Mutations were identified in accordance with the probe melting temperature: 59.2 ± 0.05 ° С for the wild-type QRDR sequence, 53.8 ± 0.14 ° С for the Gly83 / Tyr83 / Asn83 and 50.7 ± 0
Пример 3. Выявление генетических маркеров гиперчувствительности к пероральным антикоагулянтам у людейExample 3. Identification of genetic markers of hypersensitivity to oral anticoagulants in humans
Пероральные антикоагулятные препараты группы кумаринов (варфарин) широко используются в клинической практике для профилактики артериальных и венозных тромбозов. Фармакокинетика и фармакодинамика варфарина крайне вариабельны и зависят от множества факторов, включая генетически детерминированные различия в скорости метаболизма под действием цитохрома Р450, кодируемого геном CYP2C9, и различия в уровне экспрессии гена VKORC1, кодирующего мишень варфарина - витамин К-эпоксидредуктазу. Аллельные варианты CYP2C9*2 (-485Т→А; -484С→А), CYP2C9*3 (42614A→C) и VKORC1*2 (6484С→T), ассоциированы с гиперчувствительностью к варфарину. Выявление данных генетических маркеров рекомендуется с целью снижения риска передозировки и развития кровотечений при терапии варфарином у всех пациентов.Oral anticoagulant drugs of the coumarin group (warfarin) are widely used in clinical practice for the prevention of arterial and venous thrombosis. The pharmacokinetics and pharmacodynamics of warfarin are extremely variable and depend on many factors, including genetically determined differences in metabolic rate under the action of cytochrome P450 encoded by the CYP2C9 gene, and differences in the expression level of the VKORC1 gene encoding the warfarin target - vitamin K-epoxide reductase. Allelic variants CYP2C9 * 2 (-485Т → А; -484С → А), CYP2C9 * 3 (42614А → C) and VKORC1 * 2 (6484С → T) are associated with hypersensitivity to warfarin. Identification of these genetic markers is recommended in order to reduce the risk of overdose and bleeding during warfarin therapy in all patients.
Для детекции перечисленных полиморфизмов 6 в формате мультиплексной ПЦР-РВ использованы три пары праймеров, фланкирующих участки мутаций в нуклеотидных позициях -485/-484, 42614 CYP2C9 и 6484 VKORC1, и три зонда, комплементарных немутантным последовательностям CYP2C9*1 и VKORC1*1, меченных, соответственно, FAM, R6G и ROX (таблица 3, на которой представлены олигонуклеотидные праймеры и зонды, использованные для детекции аллельных вариантов VKORC1 и CYP2C9, ассоциированных с гиперчувствительностью к варфарину).To detect the listed
Состав ПЦР смеси общим объемом 25 мкл: праймеры и зонды в концентрации, указанной в таблице 3; 0,2 мМ дНТФ; 2 мМ MgCl2; 2,5 ед. TaqF ДНК-полимеразы (ООО «ИнтерЛабСервис», Россия); 67 мМ Трис-НСl (рН=8.3); 17 мМ (NH4)2SO4; 0,1% Твин-20; 0,12 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА); 8% глицерина и 5 мкл образца ДНК.The composition of the PCR mixture with a total volume of 25 μl: primers and probes in the concentration indicated in table 3; 0.2 mM dNTP; 2 mM MgCl 2 ; 2.5 units TaqF DNA polymerase (LLC InterLabService, Russia); 67 mM Tris-Hcl (pH = 8.3); 17 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; 0.1% Tween-20; 0.12 mg / ml bovine serum albumin (BSA); 8% glycerol and 5 μl of DNA sample.
Выделение ДНК проводили из 100 мкл цельной крови с помощью коммерческих наборов ДНК-сорб-Б (OOO «ИнтерЛабСервис», Россия).DNA was isolated from 100 μl of whole blood using commercial DNA-sorb-B kits (OOO InterLabService, Russia).
Амплификацию и анализ кривых плавления проводили с помощью системы Rotor-Gene 2000 согласно следующему протоколу: начальная денатурация 15 мин при 95°С; затем 55 циклов 15-сек денатурации при 95°С, 10-сек отжига при 58°С с детекцией флуоресценции на каналах FAM, JOE и ROX и 10-сек элонгации при 72°С; анализ кривых плавления с начальной инкубацией 3 мин при 45°С и последующим повышением температуры на 1°C каждые 10 сек до 80°С с постоянной детекцией флуоресценции на каналах FAM, JOE и ROX.Amplification and analysis of the melting curves was carried out using the Rotor-Gene 2000 system according to the following protocol:
Идентификацию аллельных вариантов CYP2C9 и VKORC1 проводили в соответствии с температурой плавления зондов: CYP2C9*3-Pb3: 57,6±0,10°C для CYP2C9*1 и 50,3±0,11°С для CYP2C9*2; CYP2C9*2-Pb-485: 66,8±0,15°C для CYP2C9*1 и 59,7±0,21°С для CYP2C9*3; VKORC1*2-Pb: 62,6±0,23°C для VKORC1*1 и 54,4±0,29°С для VKORC1*2 (фиг.6). В качестве контролей использовали образцы ДНК лиц обоего пола с известными генотипами: CYP2C9*1*1, CYP2C9*2*2, CYP2C9*3*3, CYP2C9*1*2 и CYP2C9*1*3, VKORC1*1*1, VKORC1*2*2 и VKORC1*1*2. Метод также применен для выявления маркеров гиперчувствительности к варфарину у 42 пациентов, нуждающихся в приеме непрямых антикоагулянтов. Полиморфизмы 6 в генах CYP2C9 и VKORC1 обнаружены у 26 (62%) пациентов. У 6 (14%) пациентов выявлены генотипы, предполагающие гиперчувствительность к варфарину и необходимость снижения стартовой дозы препарата: CYP2C9*1*1/VKORC1*2*2 (n=2), CYP2C9*1*2/VKORC1*2*2 (n=2) и CYP2C9*1*3/VKORC1*2*2 (n=2).Allelic variants of CYP2C9 and VKORC1 were identified according to the melting temperature of the probes: CYP2C9 * 3-Pb3: 57.6 ± 0.10 ° C for CYP2C9 * 1 and 50.3 ± 0.11 ° C for CYP2C9 * 2; CYP2C9 * 2-Pb-485: 66.8 ± 0.15 ° C for CYP2C9 * 1 and 59.7 ± 0.21 ° C for CYP2C9 * 3; VKORC1 * 2-Pb: 62.6 ± 0.23 ° C for VKORC1 * 1 and 54.4 ± 0.29 ° C for VKORC1 * 2 (Fig. 6). As controls, we used DNA samples of persons of both sexes with known genotypes: CYP2C9 * 1 * 1, CYP2C9 * 2 * 2, CYP2C9 * 3 * 3, CYP2C9 * 1 * 2 and CYP2C9 * 1 * 3, VKORC1 * 1 * 1, VKORC1 * 2 * 2 and VKORC1 * 1 * 2. The method is also used to identify markers of hypersensitivity to warfarin in 42 patients requiring indirect anticoagulants.
Основным преимуществом разработанного способа является возможность выявления специфических нуклеотидных последовательностей или анализа определенных нуклеотидных позиций в сложном генетическом окружении. Дизайн олигонуклеотидного зонда для связывания с участком последовательности ДНК, содержащим сателлитные полиморфизмы 6 по обе стороны от интересующей нуклеотидной позиции, обычно является затруднительным. В предлагаемом способе связывание праймера непосредственно перед интересующей нуклеотидной позицией (в участке одного из сателлитных полиморфизмов 6) позволяет получить ПЦР-продукт с константной последовательностью на 5' конце. Это обеспечивает возможность выбора зонда необходимой длины, последовательность которого на 5'-конце перекрывается с последовательностью праймера, а на 3' конце - включает анализируемые нуклеотидные позиции 7 (фиг.6). Нуклеотидные замены, находящиеся вне области связывания зонда, не влияют существенно на Тm дуплекса зонд-ДНК мишень.The main advantage of the developed method is the ability to identify specific nucleotide sequences or to analyze specific nucleotide positions in a complex genetic environment. The design of an oligonucleotide probe for binding to a portion of a DNA sequence containing
Claims (12)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010149524/10A RU2451086C1 (en) | 2010-12-03 | 2010-12-03 | Method for detecting specific nucleotide sequences and nucleotide replacements by real-time pcr with effect of probe fluorescence quenching shown by primer |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010149524/10A RU2451086C1 (en) | 2010-12-03 | 2010-12-03 | Method for detecting specific nucleotide sequences and nucleotide replacements by real-time pcr with effect of probe fluorescence quenching shown by primer |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2451086C1 true RU2451086C1 (en) | 2012-05-20 |
Family
ID=46230745
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010149524/10A RU2451086C1 (en) | 2010-12-03 | 2010-12-03 | Method for detecting specific nucleotide sequences and nucleotide replacements by real-time pcr with effect of probe fluorescence quenching shown by primer |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2451086C1 (en) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2644262C1 (en) * | 2017-04-17 | 2018-02-08 | Александр Юрьевич Криворучко | Method of detection of a set of nucleotide sequences in a sample by the method of coding amplicones in the containing polymerase chain reaction |
| RU2675378C1 (en) * | 2017-08-15 | 2018-12-19 | Александр Юрьевич Криворучко | Method for detecting sequences of nucleotides by polymerase chain reaction method in real time with universal probe |
| RU2691763C2 (en) * | 2016-06-21 | 2019-06-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт аналитического приборостроения Российской академии наук (ИАП РАН) | Device for simultaneous monitoring in real time scale of nucleic acid amplifications |
| US10337056B2 (en) | 2007-03-28 | 2019-07-02 | Fluoresentric, Inc. | Dynamic flux nucleic acid sequence amplification |
| US10370707B2 (en) | 2013-10-09 | 2019-08-06 | Fluoresentric, Inc. | Multiplex probes |
| US10669574B2 (en) | 2008-11-18 | 2020-06-02 | XCR Diagnostics, Inc. | DNA amplification technology |
| RU2804281C1 (en) * | 2022-12-14 | 2023-09-26 | Общество с ограниченной ответственностью "Люмипроб РУС" | Fluorescence quencher for increasing the sensitivity of the pcr method |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7160998B2 (en) * | 1996-06-04 | 2007-01-09 | University Of Utah Research Foundation | Monitoring amplification with fret probes |
-
2010
- 2010-12-03 RU RU2010149524/10A patent/RU2451086C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7160998B2 (en) * | 1996-06-04 | 2007-01-09 | University Of Utah Research Foundation | Monitoring amplification with fret probes |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DIDENKO V.V. ET AL., DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications, Biotechniques. 2001, v.31, №5, p.1106-1116, 1118, 1120, 1121. * |
| LAY M.J. ЕТ AL., Real-time fluorescence genotyping of factor V Leiden during rapid-cycle PCR, Clin Chem., 1997, v.43, №12, p.2262-2267. * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10337056B2 (en) | 2007-03-28 | 2019-07-02 | Fluoresentric, Inc. | Dynamic flux nucleic acid sequence amplification |
| US10669574B2 (en) | 2008-11-18 | 2020-06-02 | XCR Diagnostics, Inc. | DNA amplification technology |
| US10370707B2 (en) | 2013-10-09 | 2019-08-06 | Fluoresentric, Inc. | Multiplex probes |
| RU2691763C2 (en) * | 2016-06-21 | 2019-06-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт аналитического приборостроения Российской академии наук (ИАП РАН) | Device for simultaneous monitoring in real time scale of nucleic acid amplifications |
| RU2644262C1 (en) * | 2017-04-17 | 2018-02-08 | Александр Юрьевич Криворучко | Method of detection of a set of nucleotide sequences in a sample by the method of coding amplicones in the containing polymerase chain reaction |
| RU2675378C1 (en) * | 2017-08-15 | 2018-12-19 | Александр Юрьевич Криворучко | Method for detecting sequences of nucleotides by polymerase chain reaction method in real time with universal probe |
| RU2804281C1 (en) * | 2022-12-14 | 2023-09-26 | Общество с ограниченной ответственностью "Люмипроб РУС" | Fluorescence quencher for increasing the sensitivity of the pcr method |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4440469B2 (en) | PCR primer constructs for use in integrated signaling systems | |
| CA2318880C (en) | Determination of a genotype of an amplification product at multiple allelic sites | |
| RU2451086C1 (en) | Method for detecting specific nucleotide sequences and nucleotide replacements by real-time pcr with effect of probe fluorescence quenching shown by primer | |
| US11499199B2 (en) | Bordetella detection assay | |
| KR101171635B1 (en) | Method of detecting variation and kit to be used therein | |
| ES2549777T3 (en) | Methods to analyze single stranded nucleic acid sequences | |
| KR102371222B1 (en) | Target nucleic acid amplification method and composition for target nucleic acid amplification | |
| WO2014157377A1 (en) | Primer and probe set used in identifying gene polymorphism, and use thereof | |
| Steffensen et al. | Rapid genotyping of MBL2 gene mutations using real-time PCR with fluorescent hybridisation probes | |
| ES2776427T3 (en) | Strand Invasion Based DNA Amplification Method | |
| JP2003518924A (en) | Assays for detecting short sequence variants | |
| KR101147277B1 (en) | Probe for detecting mutation in jak2 gene and use thereof | |
| JP5239853B2 (en) | Mutant gene detection method | |
| US20190177771A1 (en) | Pna probe for discrimination of quinolone antibiotic resistant bacteria and method for discrimination of antibiotic resistant bacteria using the same | |
| EP2071041A1 (en) | Nucleic acid detection probe | |
| JP7391321B2 (en) | Oligonucleotide set and kit for determining the DNA type of P. acnes and method for determining the DNA type of P. acnes | |
| US9523119B2 (en) | Method of distinguishing genotypes | |
| KR102543156B1 (en) | Method and Kits for Amplifying Target Nucleic Acid with High Specificity | |
| KR102575618B1 (en) | Method and Composition for Amplifying Target Nucleic Acid using Guide Probe and Clamping probe | |
| US20030186259A1 (en) | Method , kit and dna probes for detecting a fungal species in clinical material | |
| US20110104762A1 (en) | Detection probe acting by molecular recognition | |
| JP2007282512A (en) | Method for inhibiting self-annealing formation and use thereof | |
| JP5504676B2 (en) | Genotype identification method | |
| ES2349090T3 (en) | MULTIPLEX TEST FOR DETECTION OF PATHOGENIC ORGANISMS. | |
| Zhang et al. | Detection of three common G6PD gene mutations in Chinese individuals by probe melting curves |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20121204 |
|
| BF4A | Cancelling a publication of earlier date [patents] |
Free format text: PUBLICATION IN JOURNAL SHOULD BE CANCELLED |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20141204 |