RU2444571C2 - Titanium dioxide nanocomposites for intracellular viral genome inactivation, method for making them - Google Patents
Titanium dioxide nanocomposites for intracellular viral genome inactivation, method for making them Download PDFInfo
- Publication number
- RU2444571C2 RU2444571C2 RU2008121609/10A RU2008121609A RU2444571C2 RU 2444571 C2 RU2444571 C2 RU 2444571C2 RU 2008121609/10 A RU2008121609/10 A RU 2008121609/10A RU 2008121609 A RU2008121609 A RU 2008121609A RU 2444571 C2 RU2444571 C2 RU 2444571C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- titanium dioxide
- nanocomposites
- conjugates
- dioxide nanoparticles
- tio
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к области молекулярной биологии, биоорганической химии и медицины. Нанокомпозиты состоят из наночастиц диоксида титана, на которые иммобилизуются полиаминовые производные олигонуклеотидов (PA-oligo) и предназначены для воздействия на вирусный геном внутри клеток и подавления его дальнейшего функционирования.The invention relates to the field of molecular biology, bioorganic chemistry and medicine. Nanocomposites consist of titanium dioxide nanoparticles onto which polyamine derivatives of oligonucleotides (PA-oligo) are immobilized and are intended to influence the viral genome inside cells and suppress its further functioning.
Воздействие на внутриклеточные нуклеиновые кислоты является одной из важнейших проблем современной биологии и фундаментальной медицины и по праву принадлежит к числу стратегических направлений развития науки, в случае решения этой проблемы открывается широкое использование этого подхода в практической медицине. Первые работы в этом направлении были сделаны в России [Belikova A.M., Zarytova V.F., Grineva N.I. Tetrahedron Lett., 1967, 3557-3562]. В настоящее время такие исследования проводятся во всех развитых странах мира. Магистральным направлением этих исследований является использование антисенс- и антиген-подходов. В первом варианте используют антисенс-олигонуклеотиды, их производные, малые интерферирующие РНК (siRNA), направленные на подавление функций мРНК. В рамках антиген-подхода, активно развиваемого в последние десятилетия, используют синтетические триплексформирующие олигонуклеотиды (ТФО), способные взаимодействовать непосредственно с двухцепочечными участками ДНК. Возможность реализации этих подходов продемонстрирована в ряде публикаций, например [Crooke S.T., Ann. Rev. Med., 2004, v.55, p.61-95; Giuseppina M. Carbone et al. Nucl.Acids Res. 2004, v.32, p.4358-4367]. Однако в полной мере эти подходы пока не реализованы. Одной из наиболее значимых, но пока до конца не решенных проблем является слабая проницаемость олигонуклеотидов, их аналогов и siRNA в клетки.The impact on intracellular nucleic acids is one of the most important problems of modern biology and fundamental medicine and rightfully belongs to the number of strategic directions in the development of science, if this problem is solved, widespread use of this approach in practical medicine opens up. The first works in this direction were made in Russia [Belikova A.M., Zarytova V.F., Grineva N.I. Tetrahedron Lett., 1967, 3557-3562]. Currently, such studies are conducted in all developed countries of the world. The main direction of these studies is the use of antisense and antigen approaches. In the first embodiment, antisense oligonucleotides, their derivatives, small interfering RNAs (siRNAs), aimed at suppressing mRNA functions, are used. In the framework of the antigen approach, which has been actively developed in recent decades, synthetic triplex-forming oligonucleotides (TFOs) capable of interacting directly with double-stranded DNA are used. The feasibility of these approaches has been demonstrated in a number of publications, for example [Crooke S.T., Ann. Rev. Med., 2004, v. 55, p. 61-95; Giuseppina M. Carbone et al. Nucl. Acids Res. 2004, v.32, p. 4358-4367]. However, these approaches have not yet been fully implemented. One of the most significant, but still not completely resolved problems is the low permeability of oligonucleotides, their analogues, and siRNA into cells.
В свете последних данных [например, Mario Ferrari, Nature Reviews Cancer, 2005, v.5, p.161-171; Paunesku Т. Nano Lett. 2007, v.7, p.596-601] проблема проницаемости может быть решена с помощью нанобиотехнологии, которая нацелена, в первую очередь, на разработку принципиально новых методов лечения, на создание новых лекарств и способов их доставки.In light of recent data [eg, Mario Ferrari, Nature Reviews Cancer, 2005, v.5, p. 161-171; Paunesku T. Nano Lett. 2007, v.7, p.596-601] the problem of permeability can be solved with the help of nanobiotechnology, which is aimed, first of all, at the development of fundamentally new methods of treatment, at the creation of new drugs and methods of their delivery.
Мы предлагаем создать нанокомпозиты, состоящие из наночастиц TiO2, способных проникать в клетки, и олигонуклеотидов, способных взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами, в частности с вирусным геномом.We propose creating nanocomposites consisting of TiO 2 nanoparticles capable of penetrating into cells and oligonucleotides capable of interacting with nucleic acids, in particular with the viral genome.
Следует отметить, что ТiO2-наночастицы в составе нанокомпозитов могут выступать в качестве фотоактивируемого лиганда. В работах [Kim В., Kim D., Cho D., Cho S. Bactericidal effect of ТiO2 photocatalyst on selected food-borne pathogenic bacteria. (2003) Chemosphere, 52, 277-281 <> Suketa N., Sawase Т., Kitaura H., Naito M., Baba K., Nakayama K., Wennerberg A., Atsuta M. An antibacterial surface on dental implants, based on the photocatalytic bactericidal effect. (2005) Clin. Implant Dent Relat Res. 7, 105-111] показан фотокаталитический бактерицидный эффект ТiO2-наночастиц для патогенных бактерий и подавление роста раковых опухолей на культуре клеток чловека Ls-174-t [Zhang A.P., Sun Y.P. Photocatalytic killing effect of TiO2 nanoparticles on Ls-174-t human colon carcinoma cells. (2004) World J.Gastroenterol. 10, 3191-3193].It should be noted that TiO 2 nanoparticles in the composition of nanocomposites can act as a photoactivated ligand. In [Kim B., Kim D., Cho D., Cho S. Bactericidal effect of TiO 2 photocatalyst on selected food-borne pathogenic bacteria. (2003) Chemosphere, 52, 277-281 <> Suketa N., Sawase T., Kitaura H., Naito M., Baba K., Nakayama K., Wennerberg A., Atsuta M. An antibacterial surface on dental implants, based on the photocatalytic bactericidal effect. (2005) Clin. Implant Dent Relat Res. 7, 105-111] shows the photocatalytic bactericidal effect of TiO 2 nanoparticles for pathogenic bacteria and the suppression of the growth of cancerous tumors in human cell culture Ls-174-t [Zhang AP, Sun YP Photocatalytic killing effect of TiO 2 nanoparticles on Ls-174-t human colon carcinoma cells. (2004) World J. Gastroenterol. 10, 3191-3193].
Наиболее близкой к заявляемому объекту изобретения является работа Paunesku Т., Rajh Т., Wiederrecht G., Maser J., Vogt S., Stojicevic N., Protic M., Lai В., Oryhon J., Thumauer M. and Woloschak G. Biology of TiO2-oligonucleotide nanocomposites. (2003) Nature materials, 2, 343-346. В работе обнаружена способность наночастиц TiO2-олигонуклеотид проникать в клетки млекопитающих, а также возможность отщепления связанного олигонуклеотида от частиц под действием света.Closest to the claimed subject matter is the work of Paunesku T., Rajh T., Wiederrecht G., Maser J., Vogt S., Stojicevic N., Protic M., Lai B., Oryhon J., Thumauer M. and Woloschak G Biology of TiO 2 -oligonucleotide nanocomposites. (2003) Nature materials, 2, 343-346. The work revealed the ability of nanoparticles of a TiO 2 oligonucleotide to penetrate mammalian cells, as well as the possibility of cleavage of the bound oligonucleotide from particles under the action of light.
Наночастицы диоксида титана, используемые авторами для приготовления нанокомпозитов с олигонуклеотидами, получали путем гидролиза тетрахлорида титана в кислой среде при рН 3.5 в газовой атмосфере аргона или азота. Полученный коллоид с рН 3.5 и концентрацией 0.1-0.6 М по TiO2 разбавляли до концентрации 0.015 М и смешивали с глицидилизопропиловым эфиром для предотвращения нежелательных реакций гидроксильных групп TiO2 с фосфатными группами олигонуклеотида. Коллоидный раствор диоксида титана обрабатывали раствором LiOH до рН 9.5. Размер частиц диоксида титана составлял 45 Å (1500 молекул TiO2 в одной частице). Затем коллоид подвергали диализу против раствора NaH2PO4 до достижения рН 6.5.The titanium dioxide nanoparticles used by the authors for the preparation of nanocomposites with oligonucleotides were obtained by hydrolysis of titanium tetrachloride in an acidic medium at pH 3.5 in a gas atmosphere of argon or nitrogen. The resulting colloid with a pH of 3.5 and a concentration of 0.1-0.6 M on TiO 2 was diluted to a concentration of 0.015 M and mixed with glycidyl isopropyl ether to prevent undesirable reactions of the hydroxyl groups of TiO 2 with the phosphate groups of the oligonucleotide. A colloidal solution of titanium dioxide was treated with a solution of LiOH to a pH of 9.5. The particle size of titanium dioxide was 45 Å (1,500 TiO 2 molecules in one particle). Then the colloid was dialyzed against a solution of NaH 2 PO 4 to achieve a pH of 6.5.
Конъюгат олигонуклеотида с допамином получали по реакции активированной N-гидроксисукцинимидным эфиром карбоксильной группы на 5'-конце олигонуклеотида с аминогруппой допамина. Для удаления свободного несвязанного с олигонуклеотидом допамина раствор подвергали диализу против воды. Затем конъюгат допамин-олигонуклеотид связывали с частицами TiO2, модифицированными глицидилизопропиловым эфиром. При связывании допамина (свободного или в составе конъюгата с олигонуклеотидом) с коллоидными частицами TiO2 при 8>pH>2.5 образуется комплекс с переносом заряда между допамином и ТiO2. В результате получены нанокомпозиты, в которых, как правило, к одной частице ТiO2 присоединяется 2 олигонуклеотида. Трансфекцию клеток нанокомпозитами проводили с помощью SuperFect или электропорации.An oligonucleotide-dopamine conjugate was prepared by reacting an activated N-hydroxysuccinimide ester of a carboxyl group at the 5'-end of the oligonucleotide with an amino group of dopamine. To remove free dopamine unbound from the oligonucleotide, the solution was dialyzed against water. Then the conjugate dopamine-oligonucleotide was associated with particles of TiO 2 modified with glycidyl isopropyl ether. When dopamine is bound (free or as part of a conjugate with an oligonucleotide) with colloidal particles of TiO 2 at 8>pH> 2.5, a charge-transfer complex is formed between dopamine and TiO 2 . As a result, nanocomposites were obtained in which, as a rule, 2 oligonucleotides are attached to one TiO 2 particle. Cell transfection with nanocomposites was performed using SuperFect or electroporation.
Недостатком метода является сложная методика приготовления нанокомпозитов, включающая метод получения наночастиц диоксида титана в инертной газовой атмосфере реакционной среды, требующий специального аппаратурного оформления и длительной операции диализа для нейтрализации наночастиц. Связь допамин-ТiO2 в конъюгате олигонуклеотид-допамин-ТiO2 достаточно прочная в выбранных условиях, однако она частично разрушается в более жестких условиях (например, при отмывке нанокомпозитов растворами с высокой ионной силой). Отсутствует возможность введения дополнительных реакционноспособных групп в нанокомпозиты. Использование трансфектанта SuperFect или электропорации для трансфекции клеток также нежелательно, т.к. эти методы сопровождаются нарушением целостности клеточной мембраны.The disadvantage of this method is the complex method of preparing nanocomposites, including the method of obtaining titanium dioxide nanoparticles in an inert gas atmosphere of the reaction medium, requiring special hardware design and a long dialysis operation to neutralize the nanoparticles. The dopamine-TiO 2 bond in the oligonucleotide-dopamine-TiO 2 conjugate is quite strong under the selected conditions, however, it partially breaks down under more severe conditions (for example, when nanocomposites are washed with solutions with high ionic strength). There is no possibility of introducing additional reactive groups into nanocomposites. Using SuperFect transfectant or electroporation for cell transfection is also undesirable, because these methods are accompanied by a violation of the integrity of the cell membrane.
Изобретение решает задачу упрощения метода приготовления нанокомпозитов при сохранении высокой плотности иммобилизации олигонуклеотидных конъюгатов на наночастицы диоксида титана и высокой прочности их связывания с поверхностью и повышения функциональных возможностей нанокомпозитов в отношении проникновения их в клетки, а также в отношении получения нанокомпозитов, содержащих дополнительные, в том числе множественные, метки (флуоресцеин, феназиний), необходимые для детектирования нанокомпозитов.The invention solves the problem of simplifying the method of preparing nanocomposites while maintaining a high density of immobilization of oligonucleotide conjugates on titanium dioxide nanoparticles and a high strength of their binding to the surface and increasing the functionality of nanocomposites with respect to their penetration into cells, as well as with respect to obtaining nanocomposites containing additional ones, including multiple labels (fluorescein, phenazinium) necessary for the detection of nanocomposites.
Нанокомпозиты состоят из наночастицы диоксида титана, на которые иммобилизуют конъюгаты - полиаминовые производные олигонуклеотидов (PA-oligo), и предназначены для инактивации вирусного генома внутри клеток.Nanocomposites consist of titanium dioxide nanoparticles onto which conjugates - polyamine derivatives of oligonucleotides (PA-oligo) are immobilized, and are designed to inactivate the viral genome inside cells.
Наночастицы диоксида титана, используемые для приготовления нанокомпозитов, представляют собой коллоидные растворы, в которых диоксид титана присутствует в виде отдельных частиц размером 3-10 нм, преимущественно 3-5 нм, или агрегатов из этих частиц в кристаллической модификации анатаз или анатаз и брукит, или в аморфном состоянии. В качестве полиаминовых линкеров в конъюгатах PA-oligo используют полилизин, спермин и другие полиамины. В некоторых случаях в полилизиновом компоненте аминогруппы блокируют ацетатными группами во избежание неспецифического взаимодействия аминогрупп с ДНК и РНК-мишенями. Длинный полиаминовый линкер обеспечивает прочное необратимое связывание олигонуклеотида с поверхностью наночастицы. При этом обеспечивается достаточное расстояние между олигонуклеотидом и поверхностью частиц, для того чтобы иммобилизованные олигонуклеотиды могли взаимодействовть с молекулами ДНК или РНК, находящимися в растворе. Соотношение аминогрупп полиамина и олигонуклеотида составляет 100:1.The titanium dioxide nanoparticles used to prepare the nanocomposites are colloidal solutions in which titanium dioxide is present in the form of individual particles of 3-10 nm, preferably 3-5 nm, or aggregates of these particles in the crystalline modification of anatase or anatase and brookite, or in an amorphous state. Polyalysine, spermine and other polyamines are used as polyamine linkers in PA-oligo conjugates. In some cases, in the polylysine component, amino groups are blocked by acetate groups to avoid non-specific interaction of amino groups with DNA and target RNAs. A long polyamine linker provides strong irreversible binding of the oligonucleotide to the surface of the nanoparticle. This ensures a sufficient distance between the oligonucleotide and the surface of the particles so that the immobilized oligonucleotides can interact with DNA or RNA molecules in solution. The ratio of the amino groups of the polyamine and oligonucleotide is 100: 1.
Для приготовления нанокомпозитов синтезируют отдельно наночастицы диоксида титана путем гидролиза тетрахлорида титана или тетраизопропоксида титана и конъюгаты, затем проводят иммобилизацию конъюгатов на наночастицы.To prepare nanocomposites, titanium dioxide nanoparticles are separately synthesized by hydrolysis of titanium tetrachloride or titanium tetraisopropoxide and conjugates, then conjugates are immobilized onto nanoparticles.
Гидролиз тетрахлорида титана проводят на воздухе:The hydrolysis of titanium tetrachloride is carried out in air:
1) добавлением тетрахлорида титана в воду в условиях постоянного значения рН, равного 3-4, 6-7 и 9-10, которое поддерживается добавлением НСl и NH4OH (или NaOH) при температуре 4-70°С;1) by adding titanium tetrachloride to water under conditions of a constant pH value of 3-4, 6-7 and 9-10, which is supported by the addition of Hcl and NH 4 OH (or NaOH) at a temperature of 4-70 ° C;
2) добавлением раствора NaOH к водному раствору тетрахлорида титана в условиях переменного значения рН до нейтральной среды.2) by adding a solution of NaOH to an aqueous solution of titanium tetrachloride under conditions of variable pH to a neutral medium.
Гидролиз тетраизопропоксида титана проводят на воздухе:The hydrolysis of titanium tetraisopropoxide is carried out in air:
1) добавлением его смеси с изопропиловым спиртом в воду, содержащую кислотный катализатор, при температуре 20-95°С;1) adding its mixture with isopropyl alcohol to water containing an acid catalyst at a temperature of 20-95 ° C;
2) смешением ацетилацетонатного комплекса тетраизопропоксида титана с водой, содержащей кислотный катализатор, при температуре 40-70°С. В качестве кислотного катализатора используют 70%-ную азотную кислоту в количестве [H+]/[Ti]=0.2.2) by mixing an acetylacetonate complex of titanium tetraisopropoxide with water containing an acid catalyst at a temperature of 40-70 ° C. As the acid catalyst, 70% nitric acid is used in an amount of [H + ] / [Ti] = 0.2.
Полученные коллоидные растворы содержат 0.2-0.55 М ТiO2, которые перед иммобилизацией конъюгата PA-oligo разбавляют до концентрации 0.0125 М и нейтрализуют с помощью 0.5 М NaOH.The obtained colloidal solutions contain 0.2-0.55 M TiO 2 , which are diluted to a concentration of 0.0125 M and neutralized with 0.5 M NaOH before immobilization of the PA-oligo conjugate.
Синтез конъюгатов PA-oligo проводят по известному методу (патент РФ 2236467, C12Q 1/68, 20.09.04), основанном на активации 5'- или 3'-концевой фосфатной группы незащищенного олигонуклеотида с помощью пары трифенилфосфин-дипиридилдисульфид в присутствии нуклеофильного катализатора в абсолютном органическом растворителе. После этого образующееся активное производное инкубируют с полиамином в подходящем растворителе (диметилсульфоксид, диметилформамид или вода). В качестве нуклеофильного катализатора используют преимущественно метилимидазол, диметиламинопиридин или N-окись диметиламинопиридина. В качестве полиамина используют различные полиамины, содержащие от 3 до 1000 аминогрупп в молекуле. Полученный раствор конъюгата PA-oligo разбавляют до необходимой концентрации, равной 1·10-7-1·10-4 М, добавляют NaOH до конечной концентрации 0.01-0.001 М. Предложенный метод позволяет получать конъюгаты олигонуклеотидов с полиаминами с выходом 90-100%.The synthesis of PA-oligo conjugates is carried out according to the known method (RF patent 2236467,
Иммобилизацию конъюгатов PA-oligo на наночастицы диоксида титана проводят следующим образом. Конъюгаты PA-oligo в концентрации 10-5 М (по олигонуклеотиду) смешивают с наночастицами ТiO2 в соотношении 1-50 нмоль PA-oligo на 1 мг наночастиц и выдерживают смесь при перемешивании в течение 1 (или более) часа при 20-50°С. Несвязавшийся конъюгат PA-oligo отмывают последовательно растворами 0.1-0.5 М КН2РO4 и NaCl с концентрацией не менее 0.1 М. Наночастицы диоксида титана используют как в аморфной, так и в кристаллической (анатаз, брукит) форме.The immobilization of PA-oligo conjugates on titanium dioxide nanoparticles is carried out as follows. Conjugates of PA-oligo at a concentration of 10 -5 M (according to the oligonucleotide) are mixed with TiO 2 nanoparticles in the ratio of 1-50 nmol PA-oligo per 1 mg of nanoparticles and the mixture is kept under stirring for 1 (or more) hours at 20-50 ° FROM. Unbound PA-oligo conjugate is washed sequentially with solutions of 0.1-0.5 M KH 2 PO 4 and NaCl with a concentration of at least 0.1 M. Titanium dioxide nanoparticles are used both in amorphous and crystalline (anatase, brookite) forms.
Доставку нанокомпозитов в клетки осуществляют путем обычного эндоцитоза.Nanocomposites are delivered to cells by conventional endocytosis.
Задача решается составом нанокомпозитов для инактивации внутриклеточного генетического материала, содержащим наночастицы диоксида титана, на которые иммобилизованы конъюгаты олигонуклеотидов с линкером, в качестве линкера используют полиамины, содержащие от 3 до 1000 аминогрупп в молекуле, преимущественно полилизин, полиэтиленимин или спермин.The problem is solved by the composition of nanocomposites for inactivation of intracellular genetic material containing titanium dioxide nanoparticles onto which conjugates of oligonucleotides with a linker are immobilized. Polyamines containing from 3 to 1000 amino groups in the molecule, mainly polylysine, polyethyleneimine or spermine, are used as a linker.
Наночастицы диоксида титана имеют размер 3-10 нм, преимущественно 3-5 нм, и находятся в аморфном состоянии или в кристаллической модификации анатаз и/или брукит.Titanium dioxide nanoparticles have a size of 3-10 nm, mainly 3-5 nm, and are in an amorphous state or in a crystalline modification of anatase and / or brookite.
В качестве олигонуклеотидного компонента в конъюгатах используют олигонуклеотиды длиной 10-40 звеньев.As the oligonucleotide component in the conjugates, oligonucleotides of 10-40 units in length are used.
Задача решается также способом приготовления нанокомпозитов для инактивации вирусного генома внутри клеток, который включает синтез наночастиц диоксида титана, синтез конъюгатов олигонуклеотида с соответствующим линкером, иммобилизацию конъюгатов на наночастицы диоксида титана, иммобилизацию конъюгатов олигонуклеотида с полиаминовым линкером проводят в водном растворе при комнатной температуре, а несвязавшийся с частицами конъюгат отмывают последовательно растворами КН2РO4 и NaCl.The problem is also solved by the method of preparing nanocomposites for inactivation of the viral genome inside the cells, which includes the synthesis of titanium dioxide nanoparticles, the synthesis of oligonucleotide conjugates with an appropriate linker, the conjugates immobilization on titanium dioxide nanoparticles, the immobilization of the oligonucleotide conjugates with a polyamine linker is carried out at room temperature, and the solution is carried out in room temperature with particles, the conjugate is washed sequentially with solutions of KH 2 PO 4 and NaCl.
Наночастицы диоксида титана имеют размер 3-10 нм, преимущественно 3-5 нм, и находятся в аморфном состоянии или в кристаллической модификации анатаз и/или брукит.Titanium dioxide nanoparticles have a size of 3-10 nm, mainly 3-5 nm, and are in an amorphous state or in a crystalline modification of anatase and / or brookite.
В качестве линкера используют полиамины, содержащие от 3 до 1000 аминогрупп в молекуле, преимущественно полилизин, полиэтиленимин или спермин.As the linker, polyamines containing from 3 to 1000 amino groups in the molecule, mainly polylysine, polyethyleneimine or spermine, are used.
В качестве олигонуклеотидного компонента в конъюгатах используют олигонуклеотиды длиной 10-40 звеньев.As the oligonucleotide component in the conjugates, oligonucleotides of 10-40 units in length are used.
Иммобилизацию конъюгатов проводят в течение не менее 1 ч.The conjugates are immobilized for at least 1 hour.
Концентрация раствора КН2РO4 составляет 0.1-0.5 М, концентрация раствора NaCl составляет не менее 0.1 М.The concentration of the KH 2 PO 4 solution is 0.1-0.5 M, the concentration of NaCl solution is at least 0.1 M.
Наночастицы диоксида титана получают гидролизом тетрахлорида титана в присутствии НСl и NH4ON или NaOH в условиях переменного или постоянного значения рН 3-10, при температуре 4-70°С на воздухе или гидролизом тетраизопропоксида титана при температуре 20-95°С на воздухе. Гидролиз тетраизопропоксида титана проводят в присутствии комплексообразователя, ацетилацетона.Titanium dioxide nanoparticles are obtained by hydrolysis of titanium tetrachloride in the presence of HCl and NH 4 ON or NaOH under conditions of variable or constant pH 3-10 at a temperature of 4-70 ° C in air or by hydrolysis of titanium tetraisopropoxide at a temperature of 20-95 ° C in air. Hydrolysis of titanium tetraisopropoxide is carried out in the presence of a complexing agent, acetylacetone.
Синтез наночастиц диоксида титана из различных предшественников (тетрахлорид титана, тетраизопропоксид титана), позволяет получать наночастицы с требуемым размером 4-5 нм на воздухе в различной кристаллической модификации, что является важным для проникающей способности нанокомпозитов и их дальнейшего использования для адресной инактивации внутриклеточного генетического материала, в том числе для инактивации вирусного генома.The synthesis of titanium dioxide nanoparticles from various precursors (titanium tetrachloride, titanium tetraisopropoxide) allows one to obtain nanoparticles with the required size of 4-5 nm in air in various crystalline modifications, which is important for the penetration of nanocomposites and their further use for targeted inactivation of intracellular genetic material, including for inactivation of the viral genome.
Синтез конъюгатов олигонуклеотидов с полиаминовыми линкерами и разработка способа их иммобилизации на наночастицы диоксида титана (аморфные, анатаз, брукит), не требует трудоемкой операции диализа коллоидных растворов и предварительной модификации поверхности диоксида титана глицидилизопропиловым эфиром.The synthesis of conjugates of oligonucleotides with polyamine linkers and the development of a method for their immobilization on titanium dioxide nanoparticles (amorphous, anatase, brookite) does not require the laborious operation of dialysis of colloidal solutions and preliminary modification of the surface of titanium dioxide with glycidyl isopropyl ether.
Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.
Примеры 1-15 иллюстрируют способ приготовления наночастиц диоксида титана.Examples 1-15 illustrate a method for preparing titanium dioxide nanoparticles.
Примеры 16-29 иллюстрируют способ приготовления нанокомпозитов.Examples 16-29 illustrate a method for preparing nanocomposites.
Примеры 30, 31 иллюстрируют проникновение нанокомпозитов в клетки.Examples 30, 31 illustrate the penetration of nanocomposites into cells.
Пример 32 иллюстрирует противовирусную активность предлагаемых нанокомпозитов.Example 32 illustrates the antiviral activity of the proposed nanocomposites.
Пример 1Example 1
Коллоидный диоксид титана получают при температуре 4°С и постоянном значении рН=3-4. К 50 мл воды по каплям добавляют смесь 5.34 г TiCl4 в 28 мл НСl (5 М). Одновременно из другой капельной воронки по каплям добавляют аммиак, смешанный с дистиллированной водой в соотношении 1:1. Скорость смешения двух растворов подбирают таким образом, чтобы в реакционном сосуде поддерживался рН=3-4. Реакцию проводят при постоянном интенсивном перемешивании электрической мешалкой до полного расходования смеси, содержащей TiCl4. По окончании реакции коллоидный раствор перемешивают в течение 1 ч и подвергают старению в течение 5 ч при комнатной температуре. В результате получают коллоидный раствор белого цвета с концентрацией 0.23 М в пересчете на TiO2 Colloidal titanium dioxide is obtained at a temperature of 4 ° C and a constant pH = 3-4. A mixture of 5.34 g of TiCl 4 in 28 ml of HCl (5 M) was added dropwise to 50 ml of water. At the same time, ammonia mixed with distilled water in a 1: 1 ratio is added dropwise from another dropping funnel. The mixing rate of the two solutions is selected so that pH = 3-4 is maintained in the reaction vessel. The reaction is carried out with constant vigorous stirring with an electric stirrer until the mixture containing TiCl 4 is completely consumed. At the end of the reaction, the colloidal solution is stirred for 1 hour and aged for 5 hours at room temperature. The result is a white colloidal solution with a concentration of 0.23 M in terms of TiO 2
Пример 2Example 2
Способ аналогичен примеру 1, отличается тем, что синтез проводят при комнатной температуре. Концентрация TiO2 в коллоидном растворе составляет 0.25 М.The method is similar to example 1, characterized in that the synthesis is carried out at room temperature. The concentration of TiO 2 in the colloidal solution is 0.25 M.
Пример 3Example 3
Способ аналогичен примеру 1, отличается тем, что синтез проводят при температуре 70°С. Концентрация TiO2 в коллоидном растворе составляет 0.25 М.The method is similar to example 1, characterized in that the synthesis is carried out at a temperature of 70 ° C. The concentration of TiO 2 in the colloidal solution is 0.25 M.
Пример 4Example 4
Коллоидный диоксид титана получают при температуре 4°С и постоянном значении рН=6-7. К 50 мл воды по каплям добавляют смесь 5.75 г TiCl4 и 23 мл НСl (2.5 М). Одновременно из другой капельной воронки по каплям добавляют концентрированный аммиак, смешанный с дистиллированной водой в соотношении 1:1. Скорость смешения двух растворов подбирают таким образом, чтобы в реакционном сосуде поддерживался рН=6-7. Реакцию проводят до полного расходования смеси, содержащей TiCl4, при постоянном интенсивном перемешивании электрической мешалкой. По окончании реакции коллоидный раствор перемешивают в течение 1 ч и подвергают старению в течение 5 ч при комнатной температуре. Концентрация TiO2 в коллоидном растворе составляет 0.23 М.Colloidal titanium dioxide is obtained at a temperature of 4 ° C and a constant pH = 6-7. A mixture of 5.75 g of TiCl 4 and 23 ml of HCl (2.5 M) was added dropwise to 50 ml of water. At the same time, concentrated ammonia mixed with distilled water in a 1: 1 ratio is added dropwise from another dropping funnel. The mixing rate of the two solutions is selected so that a pH of 6-7 is maintained in the reaction vessel. The reaction is carried out until the mixture containing TiCl 4 is completely consumed with constant intensive stirring with an electric stirrer. At the end of the reaction, the colloidal solution is stirred for 1 hour and aged for 5 hours at room temperature. The concentration of TiO 2 in the colloidal solution is 0.23 M.
Пример 5Example 5
Способ аналогичен примеру 4, отличается тем, что синтез проводят при комнатной температуре. Концентрация TiO2 в коллоидном растворе составляет 0.22 М.The method is similar to example 4, characterized in that the synthesis is carried out at room temperature. The concentration of TiO 2 in the colloidal solution is 0.22 M.
Пример 6Example 6
Способ аналогичен примеру 4, отличается тем, что синтез проводят при температуре 70°С. Концентрация TiO2 в коллоидном растворе составляет 0.25 М.The method is similar to example 4, characterized in that the synthesis is carried out at a temperature of 70 ° C. The concentration of TiO 2 in the colloidal solution is 0.25 M.
Пример 7Example 7
Коллоидный диоксид титана получают при температуре 4°С и постоянном значении рН=9-10. К 50 мл воды по каплям добавляют смесь 5.9 г TiCl4 и 24 мл НСl (1 М). Одновременно из другой капельной воронки по каплям добавляют концентрированный аммиак, смешанный с дистиллированной водой в соотношении 1:1. Скорость смешения двух растворов подбирают таким образом, чтобы в реакционном сосуде поддерживалось рН=9-10. Реакцию проводят до полного расходования смеси, содержащей TiCl4, при постоянном интенсивном перемешивании электрической мешалкой. По окончании реакции коллоидный раствор перемешивают в течение 1 ч и подвергают старению в течение 5 ч при комнатной температуре. Концентрация TiO2 в коллоидном растворе составляет 0.22 М.Colloidal titanium dioxide is obtained at a temperature of 4 ° C and a constant pH = 9-10. A mixture of 5.9 g of TiCl 4 and 24 ml of HCl (1 M) was added dropwise to 50 ml of water. At the same time, concentrated ammonia mixed with distilled water in a 1: 1 ratio is added dropwise from another dropping funnel. The mixing rate of the two solutions is selected so that a pH of 9–10 is maintained in the reaction vessel. The reaction is carried out until the mixture containing TiCl 4 is completely consumed with constant intensive stirring with an electric stirrer. At the end of the reaction, the colloidal solution is stirred for 1 hour and aged for 5 hours at room temperature. The concentration of TiO 2 in the colloidal solution is 0.22 M.
Пример 8Example 8
Способ аналогичен примеру 7, отличается тем, что синтез проводят при комнатной температуре. Концентрация TiО2 в коллоидном растворе составляет 0.23 М.The method is similar to example 7, characterized in that the synthesis is carried out at room temperature. The concentration of TiO 2 in the colloidal solution is 0.23 M.
Пример 9Example 9
Способ аналогичен примеру 7, отличается тем, что синтез проводят при температуре 70°С. Концентрация ТiO2 в коллоидном растворе составляет 0.26 М.The method is similar to example 7, characterized in that the synthesis is carried out at a temperature of 70 ° C. The concentration of TiO 2 in the colloidal solution is 0.26 M.
Пример 10Example 10
Коллоидный диоксид титана получают при комнатной температуре. Вначале осторожно смешивают 7.2 г TiCl4 с 7 мл НСl (5 М) и добавляют 60 мл дистиллированной воды. Смесь перемешивают в течение 10 мин. Затем в реакционный сосуд по каплям добавляют водный раствор NaOH с концентрацией 2.5 М до достижения рН=6.7. По окончании реакции коллоидный раствор перемешивают в течение 1 ч и подвергают старению в течение 5 ч при комнатной температуре. Концентрация ТiO2 в коллоидном растворе составляет 0.32 М.Colloidal titanium dioxide is obtained at room temperature. First, 7.2 g of TiCl 4 are carefully mixed with 7 ml of Hcl (5 M) and 60 ml of distilled water are added. The mixture is stirred for 10 minutes. Then, an aqueous NaOH solution with a concentration of 2.5 M was added dropwise to the reaction vessel until a pH of 6.7 was reached. At the end of the reaction, the colloidal solution is stirred for 1 hour and aged for 5 hours at room temperature. The concentration of TiO 2 in the colloidal solution is 0.32 M.
Пример 11Example 11
Коллоидный диоксид титана получают при комнатной температуре смешением 11.9 г тетраизопропоксида титана (TIP) с 2 мл изопропилового спирта. При интенсивном перемешивании в смесь по каплям добавляют в 150 мл дистиллированной воды, содержащей 1.4 мл 70%-ной НNО3. В процессе синтеза появляются крупные хлопья осадка, которые исчезают после перемешивания смеси в течение ночи. В результате получают прозрачный коллоидный раствор (золь) с концентрацией 0.27 М в пересчете на ТiO2.Colloidal titanium dioxide is obtained at room temperature by mixing 11.9 g of titanium tetraisopropoxide (TIP) with 2 ml of isopropyl alcohol. With vigorous stirring, 150 ml of distilled water containing 1.4 ml of 70% HNO 3 are added dropwise to the mixture. In the process of synthesis, large flakes of sediment appear, which disappear after mixing the mixture overnight. The result is a clear colloidal solution (sol) with a concentration of 0.27 M in terms of TiO 2 .
Пример 12Example 12
Способ аналогичен примеру 11, отличается тем, что гидролиз проводят при 50°С в течение 6 ч. Концентрация TiO2 в коллоидном растворе составляет 0.3 М.The method is similar to example 11, characterized in that the hydrolysis is carried out at 50 ° C for 6 hours. The concentration of TiO 2 in the colloidal solution is 0.3 M.
Пример 13Example 13
Способ аналогичен примеру 11, отличается тем, что гидролиз проводят при 75°С в течение 6 ч. Концентрация TiO2 в коллоидном растворе составляет 0.35 М.The method is similar to example 11, characterized in that the hydrolysis is carried out at 75 ° C for 6 hours. The concentration of TiO 2 in the colloidal solution is 0.35 M.
Пример 14Example 14
Способ аналогичен примеру 11, отличается тем, что гидролиз проводят при 95°С в течение 6 ч. Концентрация TiO2 в коллоидном растворе составляет 0.4 М.The method is similar to example 11, characterized in that the hydrolysis is carried out at 95 ° C for 6 hours. The concentration of TiO 2 in the colloidal solution is 0.4 M.
Пример 15Example 15
Коллоидный диоксид титана получают смешением 6.9 мл ацетилацетона (АсАс) с 5 мл изопропилового спирта. К смеси по каплям добавляют 9.5 г тетраизопропоксида титана [AcAc]/[Ti]=2. Образовавшийся комплекс ярко-желтого цвета перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем к комплексу по каплям добавляют 60 мл дистиллированной воды, в которой растворено 0.5 мл 70%-ной HNO3, [H+]/[Ti]=0.2; [H2O]/[Ti]=100. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч, затем нагревают до 60°С и перемешивают смесь при этой температуре в течение 7 ч. В конце получают прозрачный золь желтого цвета с концентрацией 0.55 М в пересчете на TiO2.Colloidal titanium dioxide is prepared by mixing 6.9 ml of acetylacetone (AcAc) with 5 ml of isopropyl alcohol. To the mixture, 9.5 g of titanium tetraisopropoxide [AcAc] / [Ti] = 2 are added dropwise. The resulting bright yellow complex was stirred at room temperature for 30 minutes. Then, 60 ml of distilled water are added dropwise to the complex, in which 0.5 ml of 70% HNO 3 is dissolved, [H + ] / [Ti] = 0.2; [H 2 O] / [Ti] = 100. The mixture was stirred at room temperature for 1 h, then heated to 60 ° C and the mixture was stirred at this temperature for 7 h. Finally, a yellow transparent sol was obtained with a concentration of 0.55 M in terms of TiO 2 .
Размер частиц диоксида титана и его фазовое состояние по примерам 1-15 приведены в таблице 1.The particle size of titanium dioxide and its phase state according to examples 1-15 are shown in table 1.
Размер частиц диоксида титана определяют с использованием методов малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР), рентгенофазового анализа (РФА), просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения (ПЭМВР). Фазовый состав диоксида титана исследуют методами РФА и ПЭМВР.The particle size of titanium dioxide is determined using small angle X-ray scattering (SAXS), X-ray phase analysis (XRD), high resolution transmission electron microscopy (PEMVR). The phase composition of titanium dioxide is studied by the methods of XRD and TEMP.
Все измерения рентгенограмм МУРР от анализируемых образцов проводят на малоугловом рентгеновском дифрактометре совместного производства фирм Siemens (Германия), Anton Paar и Hecus-Braun (Австрия) с малоугловой камерой Кратки, дающей возможность термостатирования жидких образцов от 0 до 70°C с точностью до ±0.1°С. Используют рентгеновскую трубку с медным анодом (λCuКα=1.54 Å). Для анализа образец коллоидного раствора TiO2 помещают в специальную герметичную кювету из кварцевого капилляра с толщиной слоя образца 1.0 мм и со стенками 0.01 мм. В качестве фонового рассеяния измеряют рассеяние от кювет, заполненных жидкой фазой, по составу близкой к маточному раствору исследуемого образца. Измерения рентгенограмм МУРР проводят в интервале углов 2Θ=0.17÷2.34° при 24°С. Из полученных экспериментальных данных МУРР от образцов после процедур аппаратной коррекции вычисляют значения функций распределений наночастиц (неоднородностей электронной плотности) на основе TiO2 по размерам (Dv(R)) в образцах (как решения обратных задач рассеяния) в виде усредненных значений интегральных дисперсных характеристик распределений наночастиц.All measurements of X-ray diffraction patterns of SAXS from the analyzed samples are carried out on a small-angle X-ray diffractometer of the joint production of Siemens (Germany), Anton Paar and Hecus-Braun (Austria) with a small-angle camera Kratka, which makes it possible to thermostat liquid samples from 0 to 70 ° C with an accuracy of ± 0.1 ° C. Use an X-ray tube with a copper anode (λ CuKα = 1.54 Å). For analysis, a sample of a colloidal solution of TiO 2 is placed in a special sealed cell made of a quartz capillary with a sample layer thickness of 1.0 mm and with walls of 0.01 mm. As background scattering, scattering from cuvettes filled with a liquid phase is measured in composition similar to the mother liquor of the test sample. X-ray diffraction measurements of SAXS are carried out in the range of
Рентгенографические исследования (РФА) проводят на приборе HZG-4 (производства Германии) на монохроматизированном кобальтовом излучении. Фазовый анализ проводят с использованием рентгенографической базы данных Международного союза кристаллографов (JCPDS). Размер частиц оценивают в соответствии с формулой Шеррера:X-ray diffraction studies (XRD) are carried out on an HZG-4 device (manufactured in Germany) using monochromatized cobalt radiation. Phase analysis is performed using the X-ray database of the International Union of Crystallographers (JCPDS). The particle size is estimated in accordance with the Scherrer formula:
D=kλ/β cos θ, где k - коэффициент формы, λ - длина волны (1.79021 Å, β - полуширина линии, θ - положение линии.D = kλ / β cos θ, where k is the shape coefficient, λ is the wavelength (1.79021 Å, β is the half-width of the line, θ is the position of the line.
Снимки просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения (ПЭМВР) получают на электронном микроскопе JEM 2010 (JEOL, Япония) с разрешением по решетке 0.14 нм при ускоряющем напряжении 200 кВ. Образцы для исследований наносят ультразвуковым диспергатором на стандартные медные сетки с углеродным покрытием, которые помещают в держатель и вводят в камеру образцов электронного микроскопа.High resolution transmission electron microscopy (HRTEM) images were obtained on a JEM 2010 electron microscope (JEOL, Japan) with a lattice resolution of 0.14 nm at an accelerating voltage of 200 kV. Samples for research are applied by ultrasonic dispersant to standard carbon-coated copper grids, which are placed in a holder and introduced into the chamber of the electron microscope samples.
по данным методаThe particle size of TiO 2 nm
according to the method
Пример 16Example 16
Синтез конъюгата олигонуклеотида с полиламинами, содержащими первичную аминогруппу общей формулы R-NH2 (где R-NH2 - алкиламины, алкилендиамины, полиаминокислоты с лизиновьми звеньями, полиалкиленполиамины) или вторичную аминогруппу общей формулы R',R''-NH (где R',R''-NH - диалкиламины, полиэтиленимин) (см. схему 1), осуществляют следующим образом. К раствору олигонуклеотида, содержащего фосфатную группу на 3' или 5'-конце (10-100 нмоль), в 40 мкл диметилсульфоксида (DMSO) добавляют по 10 мг трифенилфосфина (Рh3Р) и дипиридилдисульфида (Ру2S2) и 20 мкл раствора DMSO, содержащего 1 мг N-окиси диметиламинопиридина (DMAPO). Реакционную смесь перемешивают при 37°С в течение 15 мин, после чего активированный олигонуклеотид осаждают эфиром и переосаждают 2 раза эфиром из DMSO. Остаток растворяют в DMSO (100-1000 мкл) и добавляют соответственно 10-100 мкл 0.1 М раствора PA-oligo в DMSO (концентрации полиамина рассчитывается на мономерное звено, содержащее одну аминогруппу). Реакционную смесь оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Образование конъюгата полиамин-олигонуклеотид (PA-oligo) проверяют с помощью ТСХ в системе изопропанол-аммиак-вода (6:1:3). Продукт имеет меньшую подвижность по сравнению с исходным олигонуклеотидом (в случае протяженных полиаминов - нулевую подвижность). Концентрация конъюгата PL-oligo в конечном растворе составляет 0.5-1.0·10-4 М по олигонуклеотиду. Реакционную смесь, содержащую конъюгат PL-oligo, используют для иммобилизации на наночастицы диоксида титана. Раствор PL-oligo может храниться в течение нескольких месяцев перед использованием.Synthesis of a conjugate of an oligonucleotide with polylamines containing a primary amino group of the general formula R-NH 2 (where R-NH 2 are alkylamines, alkylenediamines, polyamino acids with lysine units, polyalkylene polyamines) or a secondary amino group of the general formula R ', R''- NH (where R' - NH , R '' - NH - dialkylamines, polyethyleneimine) (see. Scheme 1), is carried out as follows. To a solution of an oligonucleotide containing a phosphate group at the 3 'or 5' end (10-100 nmol) in 40 μl of dimethyl sulfoxide (DMSO) is added 10 mg of triphenylphosphine (Ph 3 P) and dipyridyl disulfide (Py 2 S 2 ) and 20 μl a DMSO solution containing 1 mg of dimethylaminopyridine N-oxide (DMAPO). The reaction mixture was stirred at 37 ° C for 15 min, after which the activated oligonucleotide was precipitated with ether and reprecipitated 2 times with ether from DMSO. The residue was dissolved in DMSO (100-1000 μl) and 10-100 μl of a 0.1 M solution of PA-oligo in DMSO was added respectively (the polyamine concentration was calculated for a monomer unit containing one amino group). The reaction mixture was left for 1 h at room temperature. The formation of a polyamine oligonucleotide (PA-oligo) conjugate was checked by TLC in an isopropanol-ammonia-water system (6: 1: 3). The product has less mobility compared to the original oligonucleotide (in the case of extended polyamines - zero mobility). The concentration of the conjugate PL-oligo in the final solution is 0.5-1.0 · 10 -4 M oligonucleotide. The reaction mixture containing the PL-oligo conjugate is used to immobilize titanium dioxide nanoparticles. PL-oligo solution can be stored for several months before use.
Пример 17Example 17
Синтез конъюгата олигонуклеотида с полиаминами (PA-oligo) аналогичен примеру 16, отличается тем, что в качестве полиамина используют полилизин (PL), полиэтиленимин (PEI), поли(лизин, фенилаланин) (PLPh), спермин (Sp), спермидин (Sd) или олигонуклеотид, несущий аминопропиленовый линкер (NH2). Молярное отношение аминогрупп к олигонуклеотиду в конъюгате PA-oligo составляет 100:1, 100:1, 100:1, 3:1, 2:1 и 1:1 соответственно.The synthesis of the conjugate of the oligonucleotide with polyamines (PA-oligo) is similar to example 16, characterized in that polyamine is polyisine (PL), polyethyleneimine (PEI), poly (lysine, phenylalanine) (PLPh), spermine (Sp), spermidine (Sd ) or an oligonucleotide bearing an aminopropylene linker (NH 2 ). The molar ratio of amino groups to oligonucleotide in the PA-oligo conjugate is 100: 1, 100: 1, 100: 1, 3: 1, 2: 1 and 1: 1, respectively.
Пример 18Example 18
Получение нанокомпозита TiO2-PL-oligo, состоящего из наночастиц диоксида титана в кристаллической форме (анатаз), проводят, добавляя 10 мкл 10-5 М раствора полилизинсодержащего олигонуклеотида CAATTCCATGTGCCATp-PL (1 нмоль) к 0.5 мл суспензии наночастиц (2 мг/мл). Смесь выдерживают при встряхивании в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего центрифугируют и отделяют супернатант. К осадку нанокомпозита добавляют 0.5 мл 0.5 М КН2РO4 (рН 7), выдерживают 5-10 мин при встряхивании и снова центрифугируют. Процедуру повторяют, используя в качестве раствора 0.1 М NaCl. Осадок суспендируют в 0.5 мл 0.1 М NaCl. Количество конъюгата PA-oligo, присоединившегося к наночастицам диоксида титана, определяют по разности оптического поглощения раствора конъюгата перед добавлением к частицам и промывных растворов после иммобилизации. Концентрация частиц в суспензии нанокомпозита 2 мг/мл, соотношение PL-oligo/TiO2=~0.9 нмоль/мг.The preparation of the TiO 2 -PL-oligo nanocomposite, consisting of titanium dioxide nanoparticles in crystalline form (anatase), is carried out by adding 10 μl of a 10 -5 M solution of the polylysine-containing oligonucleotide CAATTCCATGTGCCATp-PL (1 nmol) to 0.5 ml of a suspension of nanoparticles (2 mg / ml ) The mixture was kept under shaking for 1 h at room temperature, after which it was centrifuged and the supernatant was separated. To the precipitate of the nanocomposite add 0.5 ml of 0.5 M KN 2 PO 4 (pH 7), incubated for 5-10 minutes with shaking and centrifuged again. The procedure is repeated using 0.1 M NaCl as a solution. The precipitate was suspended in 0.5 ml of 0.1 M NaCl. The amount of PA-oligo conjugate attached to titanium dioxide nanoparticles is determined by the difference in optical absorption of the conjugate solution before being added to the particles and washing solutions after immobilization. The concentration of particles in the suspension of the nanocomposite is 2 mg / ml, the ratio of PL-oligo / TiO 2 = ~ 0.9 nmol / mg.
Схема 1
Пример 19Example 19
Способ аналогичен примеру 16, отличается тем, что к 0.1 мл суспензии наночастиц (10 мг/мл) добавляют 0.4 мл 10-5 М раствора PL-oligo (40 нмоль). Концентрация частиц в суспензии нанокомпозита 2 мг/мл, соотношение PL-oligo/TiO2=35-40 нмоль/мг.The method is similar to example 16, characterized in that to 0.1 ml of a suspension of nanoparticles (10 mg / ml) add 0.4 ml of a 10 -5 M solution of PL-oligo (40 nmol). The concentration of particles in the suspension of the nanocomposite is 2 mg / ml, the ratio of PL-oligo / TiO 2 = 35-40 nmol / mg.
Пример 20Example 20
Способ аналогичен примеру 16, отличается тем, что в качестве наночастиц используют диоксид титана в аморфном состоянии. Концентрация частиц в суспензии нанокомпозита 2 мг/мл, соотношение PL-oligo/TiQ2=~0.9 нмоль/мг.The method is similar to example 16, characterized in that titanium dioxide in an amorphous state is used as nanoparticles. The concentration of particles in the suspension of the nanocomposite is 2 mg / ml, the ratio PL-oligo / TiQ 2 = ~ 0.9 nmol / mg.
Пример 21Example 21
Способ аналогичен примеру 17, отличается тем, что в качестве наночастиц используют диоксид титана в аморфном состоянии. Концентрация частиц в суспензии нанокомпозита 2 мг/мл, соотношение PL-oligo/TiO2=35-40 нмоль/мг.The method is similar to example 17, characterized in that titanium dioxide in an amorphous state is used as nanoparticles. The concentration of particles in the suspension of the nanocomposite is 2 mg / ml, the ratio of PL-oligo / TiO 2 = 35-40 nmol / mg.
Пример 22Example 22
Способ аналогичен примеру 16, отличается тем, что вместо PL-oligo используют полиэтилениминсодержащий олигонуклеотид (PEI-oligo). Концентрация частиц в суспензии нанокомпозита 2 мг/мл, соотношение PEI-oligo/TiO2=~0.6 нмоль/мг.The method is similar to example 16, characterized in that instead of PL-oligo, a polyethyleneimine-containing oligonucleotide (PEI-oligo) is used. The concentration of particles in the suspension of the nanocomposite is 2 mg / ml, the ratio PEI-oligo / TiO 2 = ~ 0.6 nmol / mg.
Пример 23Example 23
Способ аналогичен примеру 16, отличается тем, что вместо PL-oligo используют сперминсодержащий олигонуклеотид (Sp-oligo). Концентрация частиц в суспензии нанокомпозита 2 мг/мл, соотношение Sp-oligo/TiO2=~0.1 нмоль/мг.The method is similar to example 16, characterized in that instead of PL-oligo, a spermine-containing oligonucleotide (Sp-oligo) is used. The concentration of particles in the suspension of the nanocomposite is 2 mg / ml, the ratio Sp-oligo / TiO 2 = ~ 0.1 nmol / mg.
Пример 24Example 24
Способ аналогичен примеру 16, отличается тем, что вместо PL-oligo используют олигонуклеотид, несущий аминопропиленовый линкер (NH2-oligo). Концентрация частиц в суспензии нанокомпозита 2 мг/мл, соотношение NH2-oligo/TiO2=~0.1 нмоль/мг.The method is similar to example 16, characterized in that instead of PL-oligo, an oligonucleotide carrying an aminopropylene linker (NH 2 -oligo) is used. The concentration of particles in the suspension of the nanocomposite is 2 mg / ml, the ratio of NH 2 -oligo / TiO 2 = ~ 0.1 nmol / mg.
Пример 25Example 25
Способ аналогичен примеру 16, отличается тем, что иммобилизацию проводят, упаривая реакционную смесь до минимального объема при 45°С. Концентрация частиц в суспензии нанокомпозита 2 мг/мл, соотношение PL-oligo/TiO2=~0.9 нмоль/мг.The method is similar to example 16, characterized in that the immobilization is carried out by evaporating the reaction mixture to a minimum volume at 45 ° C. The concentration of particles in the suspension of the nanocomposite is 2 mg / ml, the ratio of PL-oligo / TiO 2 = ~ 0.9 nmol / mg.
Пример 26Example 26
Способ аналогичен примеру 16, отличается тем, что иммобилизацию проводят, выдерживая реакционную смесь при встряхивании в течение 16 ч при комнатной температуре. Концентрация частиц в суспензии нанокомпозита 2 мг/мл, соотношение PL-oligo/TiO2=~0.9 нмоль/мг.The method is similar to example 16, characterized in that the immobilization is carried out by keeping the reaction mixture with shaking for 16 hours at room temperature. The concentration of particles in the suspension of the nanocomposite is 2 mg / ml, the ratio of PL-oligo / TiO 2 = ~ 0.9 nmol / mg.
Пример 27Example 27
Способ аналогичен примеру 16, отличается тем, что вместо PL-oligo используют радиоактивно меченный [32P]PL-oligo. Для синтеза [32P]PL-oligo в качестве исходного олигонуклеотида использовали [32P]-меченный по 5'-концевому фосфату олигонуклеотид [32P]pCAATTCCATGTGCCATp. К 10 мкл суспензии наночастиц (5 мг/мл) добавляют различное количество [32P]PL-oligo (0.05-2 нмоль), что соответствует соотношению PL-oligo к TiO2 от 1 до 40 нмоль/мг. После отмывания частиц, как описано в примере 17, радиоактивность частиц и промывных растворов измеряют по Черенкову в воде на счетчике Mark II (Nuclear Chicago, США). Количество присоединившегося PL-oligo линейно зависит от количества добавленного конъюгата (Фиг.1). Выход иммобилизации, рассчитанный как отношение Ip/(Ip+Iw), где Iр и Iw - радиоактивности частиц и промывок, соответственно, составляет 90-100%. На Фиг.2 представлена гистограмма иммобилизации различных полиаминсодержащих олигонуклеотидов (PA-oligo) на наночастицы диоксида титана в кристаллической форме (анатаз) при использовании радиоактивно меченных конъюгатов [32P]-PA-oligo. Соотношение добавленного [32P]-PA-oligo к ТiO2 составляло 1 нмоль/мг (1) или 5 нмоль/мг (2). PA=PL (остаток полилизина), PEI (остаток полиэтиленимина), Sp (остаток спермина), Sd (остаток спермидина), NH2 (аминопропил).The method is similar to example 16, characterized in that instead of PL-oligo, radioactively labeled [ 32 P] PL-oligo is used. For the synthesis of [32 P] PL-oligo as the starting oligonucleotide was [32 P] -labeled at the 5'-terminal phosphate of the oligonucleotide [32 P] pCAATTCCATGTGCCATp. A different amount of [ 32 P] PL-oligo (0.05-2 nmol) is added to 10 μl of a suspension of nanoparticles (5 mg / ml), which corresponds to the ratio of PL-oligo to TiO 2 from 1 to 40 nmol / mg. After washing the particles, as described in example 17, the radioactivity of the particles and washing solutions was measured according to Cherenkov in water on a Mark II counter (Nuclear Chicago, USA). The amount of adhered PL-oligo linearly depends on the amount of conjugate added (Figure 1). The immobilization yield, calculated as the ratio of I p / (I p + I w ), where I p and I w are the radioactivity of particles and washes, respectively, is 90-100%. Figure 2 presents a histogram of the immobilization of various polyamine-containing oligonucleotides (PA-oligo) onto crystalline titanium dioxide nanoparticles (anatase) using radioactively labeled [ 32 P] -PA-oligo conjugates. The ratio of the added [ 32 P] -PA-oligo to TiO 2 was 1 nmol / mg (1) or 5 nmol / mg (2). PA = PL (polylysine residue), PEI (polyethyleneimine residue), Sp (spermine residue), Sd (spermidine residue), NH 2 (aminopropyl).
Пример 28Example 28
Нанокомпозит TiO2-PL-oligo(Flu) (0.1 мг в 200 мкл 0.1 М NaCl), содержащий остаток флуоресцеина на 3'-конце олигонуклеотидного фрагмента, полученный, как описано в примере 20, центрифугируют, отделяют супернатант, к частицам добавляют раствор флуоресцеинизотиоцианата (FITC, 0.7 мг в 20 мкл 0.2 М Nа2СО3) и смесь выдерживают при встряхивании в течение 1 ч при 60°С. Нанокомпозит с присоединившимися остатками флуоресцеина (TiO2-PL(Flu)n-oligo(Flu) отмывают от избытка FITC с помощью 0.2 М Na2СО3 (3×100 мкл). Частицы суспендируют в 0.1 М NaCl, сканируют на сканере PowerLook 1000 (UMAX, USA) (Фиг.3а) и записывают спектры электронного поглощения. Отношение поглощения суспензий TiO2-PL(Flu)n-oligo(Flu) и TiO2-PL-oligo(Flu) на 493 нм (максимум для флуоресцеина) составляет 10:1.The nanocomposite TiO 2 -PL-oligo (Flu) (0.1 mg in 200 μl 0.1 M NaCl) containing the fluorescein residue at the 3'-end of the oligonucleotide fragment, obtained as described in Example 20, is centrifuged, the supernatant is separated, a fluorescein isothiocyanate solution is added to the particles (FITC, 0.7 mg in 20 μl 0.2 M Na 2 CO 3 ) and the mixture was kept under shaking for 1 h at 60 ° C. The nanocomposite with the joined fluorescein residues (TiO 2 -PL (Flu) n- oligo (Flu) is washed from the excess FITC with 0.2 M Na 2 CO 3 (3 × 100 μl). The particles are suspended in 0.1 M NaCl, scanned on a PowerLook 1000 scanner (UMAX, USA) (Fig. 3a) and electron absorption spectra are recorded: Absorption ratio of suspensions of TiO 2 -PL (Flu) n- oligo (Flu) and TiO 2 -PL-oligo (Flu) at 493 nm (maximum for fluorescein) is 10: 1.
Пример 29Example 29
Нанокомпозит TiO2-PL-oligo(Phn) (0.1 мг в 200 мкл 0.1 М NaCl), содержащий остаток N-(2-оксиэтил)феназиния на 3'-конце олигонуклеотидного фрагмента, полученный, как описано в примере 20, центрифугируют, отделяют супернатант, к частицам добавляют раствор хлорида N-(2-оксиэтил)феназиния 0.5 мг в 20 мкл 0.2 М Nа2СО3) и смесь выдерживают при встряхивании в течение 10 мин при комнатной температуре. Нанокомпозит с присоединившимися остатками Phn (TiO2-PL(Phn)n-oligo(Phn) отмывают от избытка Phn с помощью 0.2 М Na2CO3 (3×100 мкл). Частицы суспендируют в 0.1 М NaCl, сканируют на сканере PowerLook 1000 (UMAX, USA) (Фиг.3б) и записывают спектры электронного поглощения. Отношение поглощения суспензий TiO2-PL(Phn)n-oligo(Phn) и TiO2-PL-oligo(Phn) на 530 нм (максимум для Phn) составляет 25:1.The nanocomposite TiO 2 -PL-oligo (Phn) (0.1 mg in 200 μl 0.1 M NaCl) containing the residue N- (2-hydroxyethyl) phenazinium at the 3'-end of the oligonucleotide fragment, obtained as described in example 20, centrifuged, separated supernatant, a solution of N- (2-hydroxyethyl) phenazinium chloride 0.5 mg in 20 μl 0.2 M Na 2 CO 3 ) is added to the particles and the mixture is kept under shaking for 10 min at room temperature. The nanocomposite with attached Phn residues (TiO 2 -PL (Phn) n- oligo (Phn) is washed from excess Phn with 0.2 M Na 2 CO 3 (3 × 100 μl). The particles are suspended in 0.1 M NaCl, scanned on a PowerLook 1000 scanner (UMAX, USA) (Fig. 3b) and electron absorption spectra are recorded: Absorption Ratio of Suspensions of TiO 2 -PL (Phn) n -oligo (Phn) and TiO 2 -PL-oligo (Phn) at 530 nm (maximum for Phn) is 25: 1.
Пример 30Example 30
Для проведения экспериментов по проникновению в клетки наночастиц ТiO2 и нанокомпозитов, приготовленных на их основе по примерам 18-21, используют клетки линий Vero, KCT, MDCK. Клетки получают из коллекции культур клеток ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (п.Кольцово, Новосибирская обл.). Клетки выращивают на среде Игла ДМЕМ в присутствии 5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (КРС) с добавлением пенициллина (100 МЕ/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл). Клетки инкубируют с нанокомпозитами-наночастицами диоксида титана, на которых иммобилизованы конъюгаты полилизин-олигонуклеотид.For experiments on the penetration into the cells of TiO 2 nanoparticles and nanocomposites prepared on their basis according to examples 18-21, cells of the Vero, KCT, MDCK lines are used. Cells are obtained from the collection of cell cultures of the Federal State Institution Scientific Center of the WB "Vector" Rospotrebnadzor (Koltsovo, Novosibirsk region). Cells are grown on DMLE Needle medium in the presence of 5% fetal bovine serum (cattle) supplemented with penicillin (100 IU / ml) and streptomycin (100 μg / ml). Cells are incubated with nanocomposites-nanoparticles of titanium dioxide on which polylysine-oligonucleotide conjugates are immobilized.
Проникновение нанокомпозитов в клетки контролируют методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Для ПЭМ исследований образцы готовят следующим образом. После инкубации с нанокомпозитами клетки отмывают от среды и фиксируют 2.5% раствором глутарового альдегида в буфере PBS, рН 7.2, в течение 1 ч на льду. Дофиксацию проводят 1% раствором четырехокиси осмия в буфере PBS, рН 7.2, в течение 1 ч при комнатной температуре. После дегидратации в этаноле клетки заключают в эпоксидную смолу Аралдит. Ультратонкие срезы готовят на ультрамикротоме Leica UCT, контрастируют уранилацетатом и цитратом свинца и исследуют на электронном микроскопе LEO 910 (Zeiss). Результаты экспериментов по проникновению ТiO2-наночастиц приведены на Фиг.4 (а, на клетках VERO; б, на клетках КСТ; в, на клетках MDCK), на которых проиллюстрировано, что наночастицы попадают в клетку и локализуются в ней в виде скоплений в вакуолях, фагосомах и в цитоплазме. Фиг.4г демонстрирует проникновение нанокомпозита TiO2-PL-oligo в клетки MDCK. На Фиг.4д представлен контроль - клетки Vero без обработки нанокомпозитами. Я - ядро клетки, Ядр - ядрышко, М - митохондрии. Стрелками на рисунках показаны единичные частицы или их скопления.The penetration of nanocomposites into cells is controlled by transmission electron microscopy (TEM). For TEM studies, samples are prepared as follows. After incubation with nanocomposites, the cells are washed from the medium and fixed with a 2.5% solution of glutaraldehyde in PBS buffer, pH 7.2, for 1 h on ice. Dofixation is carried out with a 1% solution of osmium tetroxide in PBS buffer, pH 7.2, for 1 h at room temperature. After dehydration in ethanol, the cells are enclosed in an Araldit epoxy resin. Ultrathin sections were prepared on a Leica UCT ultramicrootome, contrasted with uranyl acetate and lead citrate and examined on a LEO 910 electron microscope (Zeiss). The results of experiments on the penetration of TiO 2 nanoparticles are shown in Figure 4 (a, on VERO cells; b, on KST cells; c, on MDCK cells), which illustrate that the nanoparticles enter the cell and are localized in it in the form of clusters in vacuoles, phagosomes and in the cytoplasm. Fig. 4g shows the penetration of the TiO 2 -PL-oligo nanocomposite into MDCK cells. On fig.4d presents the control - Vero cells without treatment with nanocomposites. I am the nucleus of the cell, Nucleus is the nucleolus, M is the mitochondria. The arrows in the figures show single particles or their clusters.
Пример 31Example 31
Для визуализации нанокомпозитов с использованием лазерной конфокальной микроскопии синтезируют нанокомпозиты TiO2-PL(Flu)n-oligo(Flu) (см. пример 28), меченные флуоресцентной меткой.To visualize nanocomposites using laser confocal microscopy, TiO 2 -PL (Flu) n -oligo (Flu) nanocomposites are synthesized (see Example 28) labeled with a fluorescent label.
Эксперименты с культурами клеток проводят на клетках линий Vero, КСТ, MDCK и MDBK. Клетки получают из коллекции культур клеток ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (п.Кольцово, Новосибирская обл.). Клетки выращивают на среде Игла ДМЕМ в присутствии 5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (КРС) с добавлением пенициллина (100 МЕ/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл).Cell culture experiments were performed on Vero, KST, MDCK, and MDBK cells. Cells are obtained from the collection of cell cultures of the Federal State Institution Scientific Center of the WB "Vector" Rospotrebnadzor (Koltsovo, Novosibirsk region). Cells are grown on DMLE Needle medium in the presence of 5% fetal bovine serum (cattle) supplemented with penicillin (100 IU / ml) and streptomycin (100 μg / ml).
Клетки, растущие на покровных стеклах, инкубируют с нанокомпозитами TiO2-PL(Flu)n-oligo(Flu) в течение суток; затем клетки фиксируют смесью 0.4% формалина и 0.1% Triton X-100 (10 мин), обрабатывают 0.5% Triton X-100 (10 мин) и дофиксируют 2% формалином (10 мин). Все растворы готовят в буфере PBS, рН 7.2. Стекла с клетками помещают на предметные стекла клетками вниз в заключающую среду с антифейдом и DAPI. Препараты исследуют на лазерном сканирующем микроскопе LSM 510 МЕТА (Zeiss). Для обнаружения метки используют две лазерные линии с длиной волны 405 (для DAPI - ядра клеток) и 488 (для нанокомпозитов, меченных флуоресцеином). На Фиг.5 приведена фотография образца клеток MDCK после инкубации с нанокомпозитом TiO2-PL(Flu)n-oligo(Flu).Cells growing on coverslips are incubated with TiO 2 -PL (Flu) n -oligo (Flu) nanocomposites for 24 hours; then the cells are fixed with a mixture of 0.4% formalin and 0.1% Triton X-100 (10 min), treated with 0.5% Triton X-100 (10 min) and fixed with 2% formalin (10 min). All solutions are prepared in PBS buffer, pH 7.2. Glasses with cells are placed on slides with the cells down into the enclosing medium with antipheid and DAPI. The drugs are examined on a laser scanning microscope LSM 510 META (Zeiss). To detect the label, two laser lines with a wavelength of 405 (for DAPI - the nucleus of cells) and 488 (for nanocomposites labeled with fluorescein) are used. Figure 5 shows a photograph of a sample of MDCK cells after incubation with a nanocomposite TiO 2 -PL (Flu) n -oligo (Flu).
Пример 32Example 32
Для определения противовирусной активности препаратов используют культуру клеток КСТ (коронарные сосуды теленка), полученную из коллекции культур клеток Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН и которая культивировалась с использованием сыворотки лошадей. Монослой клеток КСТ инфицируют вирусом BVDV, штамм БК-1, с множественностью 0.01 БОЕ/клетку. После адсорбции в течение 1 ч инокулят удаляют, монослой клеток отмывают двукратно, вносят поддерживающую культуральную среду без сыворотки, наносят препараты TiO2-наночастиц и облучают УФ с расстояния 1.5 см в течение 16 мин (расчетная удельная мощность светового потока 4 мВт/см2.To determine the antiviral activity of the preparations, a CTF cell culture (calf coronary vessels) obtained from the collection of cell cultures of the Institute of Experimental Veterinary Medicine of Siberia and the Far East of the Siberian Branch of the Russian Academy of Agricultural Sciences and which was cultured using horse serum was used. A monolayer of CTC cells is infected with the BVDV virus, strain BK-1, with a multiplicity of 0.01 PFU / cell. After adsorption for 1 h, the inoculum is removed, the cell monolayer is washed twice, a maintenance culture medium without serum is added, preparations of TiO 2 nanoparticles are applied and UV is irradiated from a distance of 1.5 cm for 16 min (calculated specific luminous flux power of 4 mW / cm 2 .
Полученные данные по определению противовирусной активности препаратов на основе ТiO2-наночастиц приведены в таблице 2.The obtained data on the determination of the antiviral activity of drugs based on TiO 2 nanoparticles are shown in table 2.
Можно видеть, что оптическая плотность монослоя клеток, инфицированных вирусом, при использовании конъюгатов на основе аморфных наночастиц TiO2-PL-oligo имеет явно выраженную тенденцию к повышению и через 2-3 часа после инфицирования превышает оптическую плотность контролей примерно в 1.5 раза, то есть данные конъюгаты обладают противовирусной активностью, тогда как контрольные препараты без олигонуклеотидов такой активностью не обладали. Противовирусная активность конъюгатов наиболее выражена при УФ облучении в период образования репликативных комплексов, через 2-3 часа после инфицирования.It can be seen that the optical density of the monolayer of virus-infected cells, when using conjugates based on amorphous TiO 2 -PL-oligo nanoparticles, has a pronounced tendency to increase and 2-3 hours after infection exceeds the optical density of the controls by about 1.5 times, i.e. these conjugates have antiviral activity, whereas control preparations without oligonucleotides did not have such activity. The antiviral activity of the conjugates is most pronounced during UV irradiation during the formation of replicative complexes, 2-3 hours after infection.
Предложен более эффективный и удобный способ получения полиаминсодержащих олигонуклеотидов (PA-oligo), основанный на активации концевой фосфатной группы с помощью Рh3Р/Ру2S2 в присутствии нуклеофильного катализатора с последующей реакцией с аминогруппой полиамина. Предложенный метод позволяет получать конъюгаты олигонуклеотидов с полиаминами с выходом 90-100%. Полиаминсодержащие олигонуклеотиды (PA-oligo: полилизин-олигонуклеотид, спермин-олигонуклеотид) для иммобилизации на наночастицы двуокиси титана, т.е. для создания нанокомпозитов TiO2-PA-oligo, были использованы впервые. Показана возможность использования наночастиц как аморфных, так и окристаллизованных (анатаз, брукит) без их предварительной модификации, что в значительной степени упрощает процесс приготовления нанокомпозитов. Проведенные эксперименты по проникновению нанокомпозитов в клетки демонстрируют возможность проникновения подобных конъюгатов в клетки путем обычного эндоцитоза без применения электропорации и других методов, нарушающих целостность клеточной мембраны. Электронно-микроскопическое исследование клеток различных линий (КСТ, VERO, MDCK), обработанных растворами нанокомпозитов с концентрацией 20 мкг/мкл, показало, что наночастицы попадают в цитоплазму клеток и локализуются в ней в виде скоплений в вакуолях, фагосомах и в виде небольших скоплений в цитоплазме клеток. Показана возможность введения множественных меток в полученные нанокомпозиты. Показано, что созданные нанокомпозиты обладают противовирусной активностью.A more efficient and convenient method for producing polyamine-containing oligonucleotides (PA-oligo) is proposed, based on the activation of the terminal phosphate group using Ph 3 P / Py 2 S 2 in the presence of a nucleophilic catalyst followed by reaction with the amino group of the polyamine. The proposed method allows to obtain conjugates of oligonucleotides with polyamines with a yield of 90-100%. Polyamine-containing oligonucleotides (PA-oligo: polylysine-oligonucleotide, spermine-oligonucleotide) for immobilization of titanium dioxide nanoparticles, i.e. To create TiO 2 -PA-oligo nanocomposites, they were used for the first time. The possibility of using both amorphous and crystallized nanoparticles (anatase, brookite) without their preliminary modification is shown, which greatly simplifies the process of preparing nanocomposites. The experiments on the penetration of nanocomposites into cells demonstrate the possibility of penetration of such conjugates into cells by conventional endocytosis without the use of electroporation and other methods that violate the integrity of the cell membrane. Electron microscopic examination of cells of various lines (CCT, VERO, MDCK) treated with nanocomposites solutions with a concentration of 20 μg / μl showed that the nanoparticles enter the cytoplasm of cells and are localized in it in the form of clusters in vacuoles, phagosomes and in the form of small clusters in cytoplasm of cells. The possibility of introducing multiple labels into the obtained nanocomposites is shown. It was shown that the created nanocomposites possess antiviral activity.
Claims (12)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008121609/10A RU2444571C2 (en) | 2008-05-28 | 2008-05-28 | Titanium dioxide nanocomposites for intracellular viral genome inactivation, method for making them |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008121609/10A RU2444571C2 (en) | 2008-05-28 | 2008-05-28 | Titanium dioxide nanocomposites for intracellular viral genome inactivation, method for making them |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2008121609A RU2008121609A (en) | 2009-12-10 |
| RU2444571C2 true RU2444571C2 (en) | 2012-03-10 |
Family
ID=41488981
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008121609/10A RU2444571C2 (en) | 2008-05-28 | 2008-05-28 | Titanium dioxide nanocomposites for intracellular viral genome inactivation, method for making them |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2444571C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2496878C1 (en) * | 2012-05-04 | 2013-10-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | Nanocomposite with active ligand, method of its preparation and method of address inactivation of flu virus inside cell |
| RU2499045C1 (en) * | 2012-03-05 | 2013-11-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Новосибирский национальный исследовательский государственный университет" (Новосибирский государственный университет (НГУ)) | Method for obtaining nanosized delivery system of fragments of nucleic acids and their analogues to cells of mammals |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2458705C1 (en) * | 2011-06-17 | 2012-08-20 | Учреждение Российской академии наук Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН (ИХБФМ СО РАН) | Method for making nanosized system of antibiotic bleomycin delivery into mammal cells |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6986989B2 (en) * | 1996-07-29 | 2006-01-17 | Nanosphere, Inc. | Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor |
| US7332586B2 (en) * | 2001-07-10 | 2008-02-19 | North Carolina State University | Nanoparticle delivery vehicle |
-
2008
- 2008-05-28 RU RU2008121609/10A patent/RU2444571C2/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6986989B2 (en) * | 1996-07-29 | 2006-01-17 | Nanosphere, Inc. | Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor |
| US7332586B2 (en) * | 2001-07-10 | 2008-02-19 | North Carolina State University | Nanoparticle delivery vehicle |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PAUNESKU Т. ЕТ AL. biology of TiO 2 - oligonucleotide nanocomposites, nature materials, 2003, v.2, p.343-346. PAUNESKU T. ЕТ AL. Development of TiO 2 - DNA nanocomposites as a therapeutic anticancer agent. Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 2006, v.47, abstract#1100, найден в интернет <URL: http://aacrmeetingabstracts.org/cgi/content/abstract/2006/1/259-b, 15.06.2010. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2499045C1 (en) * | 2012-03-05 | 2013-11-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Новосибирский национальный исследовательский государственный университет" (Новосибирский государственный университет (НГУ)) | Method for obtaining nanosized delivery system of fragments of nucleic acids and their analogues to cells of mammals |
| RU2496878C1 (en) * | 2012-05-04 | 2013-10-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | Nanocomposite with active ligand, method of its preparation and method of address inactivation of flu virus inside cell |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2008121609A (en) | 2009-12-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhao et al. | In situ synthesis of fluorescent mesoporous silica–carbon dot nanohybrids featuring folate receptor-overexpressing cancer cell targeting and drug delivery | |
| Zhou et al. | Cationic carbon quantum dots derived from alginate for gene delivery: one-step synthesis and cellular uptake | |
| Jiang et al. | NIR-to-visible upconversion nanoparticles for fluorescent labeling and targeted delivery of siRNA | |
| Hasanzadeh Kafshgari et al. | Insights into theranostic properties of titanium dioxide for nanomedicine | |
| Song et al. | Fluorescent carbon nanodots conjugated with folic acid for distinguishing folate-receptor-positive cancer cells from normal cells | |
| Chen et al. | Nanodiamond-mediated delivery of water-insoluble therapeutics | |
| Zheng et al. | Highly efficient nuclear delivery of anti-cancer drugs using a bio-functionalized reduced graphene oxide | |
| Kostiv et al. | RGDS-and TAT-conjugated upconversion of NaYF4: Yb3+/Er3+ &SiO2 nanoparticles: in vitro human epithelioid cervix carcinoma cellular uptake, imaging, and targeting | |
| Nairi et al. | Mesoporous silica nanoparticles functionalized with hyaluronic acid. Effect of the biopolymer chain length on cell internalization | |
| Shu et al. | Dual-targeted therapy in HER2-positive breast cancer cells with the combination of carbon dots/HER3 siRNA and trastuzumab | |
| ES2856058T3 (en) | Methods | |
| Kollenda et al. | A pH-sensitive fluorescent protein sensor to follow the pathway of calcium phosphate nanoparticles into cells | |
| Holden et al. | Surface engineering of macrophages with nanoparticles to generate a cell–nanoparticle hybrid vehicle for hypoxia-targeted drug delivery | |
| Sette et al. | Development of novel anti-Kv 11.1 antibody-conjugated PEG–TiO 2 nanoparticles for targeting pancreatic ductal adenocarcinoma cells | |
| Li et al. | Biomimetic inorganic-organic hybrid nanoparticles from magnesium-substituted amorphous calcium phosphate clusters and polyacrylic acid molecules | |
| CN111303868B (en) | Near-infrared luminescent polypeptide self-assembled gold nano material and preparation method and application thereof | |
| Wang et al. | Increasing cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles in human embryonic kidney cell line 293T cells by using lipofectamine 2000 | |
| RU2444571C2 (en) | Titanium dioxide nanocomposites for intracellular viral genome inactivation, method for making them | |
| US20180125976A1 (en) | Conjugated Porphyrin Carbon Quantum Dots for Targeted Photodynamic Therapy | |
| Chung et al. | Microwave-assisted synthesis of carbon dot–iron oxide nanoparticles for fluorescence imaging and therapy | |
| Gupta et al. | Myconanotechnology and application of nanoparticles in biology | |
| Mansur et al. | Bioengineered carboxymethylcellulose–peptide hybrid nanozyme cascade for targeted intracellular biocatalytic–magnetothermal therapy of brain cancer cells | |
| Croce et al. | Nanocomposites of polyoxometalates and chitosan‐based polymers as tuneable anticancer agents | |
| CN108578427B (en) | Folic acid modified gold nanoparticle, preparation method thereof and application of gold nanoparticle in preparation of radiosensitization treatment drug | |
| Guo et al. | Biomimetic synthesis of needle-like fluorescent calcium phosphate/carbon dot hybrid composites for cell labeling and copper ion detection |